CZ285307B6 - Vakcina proti Bordetella bronchiseptica na bázi rekombinantního proteinu fimbrií těchto bakterií - Google Patents

Abstract

Vakcína pro potírání infekce Bordetella bronchiseptica u citlivých zvířat, jako jsou psi a prasata, která obsahuje proteiny nebo polypeptidy typické pro protein fimbrií bakterie Bordetella bronchiseptica, nebo obsahuje rekombinantní polynukleotid kodující uvedený protein nebo polypeptid. Popisuje se též příprava těchto proteinů, polypeptidů a polynukleotidů. ŕ

Description

Vynález popisuje vakcínu, která ochraňuje proti infekci způsobené bakterií Boordetella bronchiseptica u psů, dále popisuje polypeptidy charakteristické pro B. bronchiseptica a jejich přípravu pomocí technologie rekombinantní DNA.

Dosavadní stav techniky

Rod Bordetella se skládá ze čtyř druhů Bordetella pertussis (B. pertussis), Bordetella parapertussis (B. parapertussis), Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) a Bordetella avium (B. avium). Bordetelly jsou malé, ramnegativní, obligátně aerobní kokobacily, často bipolámě barvitelné i positivní na cytochromoxidasovou aktivitu. Kolonie, pěstované na médiu Bordet-Gengou, jsou kromě B. avium obklopeny hemolytickou zónou.

Všechny bakterie rodu Bordetella způsobují velmi podobná onemocnění s ohledem na jejich adhezi, proliferaci, klinických symptomů a histopathologii. Na infekce, způsobené bakteriemi druhu Bordetella jsou nejvíce citliví nedospělí jedinci člověka a zvířat. V těchto případech je nemoc nejtěžší a úmrtnost nejvyšší.

B. bronchoseptica je primárním pathogenem pro laboratorní, domácí a divoká zvířata a pouze příležitostně pro člověka. Často dochází k epidemickým infekcím u králíků, morčat, krys, primátů (kromě člověka), psů, prasat, koček, koní a lišek. Nejzávažnějšími onemocněními způsobenými bakterií Bordetella bronchiseptica jsou psí kašel (kennel cough) a atrofický zánět nosní sliznice u selat. U psů se infekce převážně omezuje na homí cesty dýchací a je charakterizována proliferaci bakterií v průdušnicovém epitelu. K proliferaci dochází po adhezi bakterie na povrch průdušnicového vlásnění (cilií). Nejtěžšími příznaky onemocnění jsou hromadění přebytečného průduškového hlenu, zvracení, plicní leze a úbytky na váze. U psů se vyskytuje hrubý přerývaný kašel. U selat je infekce způsobená bakterií Bordetella bronchiseptica charakterizována atrofií nosních částí lebky, deformacemi čumáku, pneumonií a snížením váhových přírůstků. Přestože se zdálo pevně dokázáno, že B. bronchiseptica je bakterií zodpovědnou za atrofílní zánět nosní sliznice, podstatné důkazy indukují, že hlavním pathogenem je Pasteurella multocida a B. bronchiseptica hraje roli možná jen oportunní a při vzniku infekce. Je popsáno velmi mnoho stavů bez klinických příznaků, kdy infikovaný pes, králík či vepř hraje pouze roli přenášeče.

U bakterií rodu Bordetellae bylo identifikováno několik virulentních faktorů. Jsou to pertussis toxin, filamentámí hemaglutinin, fimbrie, adenylát, cykláza, dermonekrotický toxin, tracheální toxin a hemolysin. Tyto virulentní faktory nejsou exprimovány u všech druhů, například gen kódující pertussis toxin v B. pertussis je u bakterií B. parapertussis a B. bronchiseptica přítomen v chromozómu jako mlčící gen. Kromě těchto virulentních faktorů pravděpodobně existují více faktorů podílejících se na pathogenicitě těchto bakterií, které však zatím nebyly identifikovány.

Infekce bakteriemi Bordetella začíná na řasnatých buňkách dýchacího traktu. Pro iniciaci infekce je nutná adheze bakterií k těmto buňkám. Bez této adheze by proudění způsobené kmitáním řasnatých buněk odstranilo bakterie spolu sjinými částicemi zprůdušnice. Adheze bakterií Bordetella k řasnatým buňkám je způsobena serologicky odlišnými fimriemi a filamentámím hemaglutininem (FHA), nicméně FHA nebyl nalezen u B. avium. Fimbrie jsou vláknité struktury,

- 1 CZ 285307 B6 složené z identických proteinových podjednotek, které vycházejí z povrchu bakterie. FHA je protein asociovaný k povrchu bakterií, který je však rovněž vylučován do extracelulámího prostředí a který je schopen aglutinovat množství různých erytrocytů. Exprese jak fimbrií tak FHA je regulována lokusem bvg. Exprese dnů pro podjednotku fimbrií je u B. pertussis rovněž ovlivněna délkou úseku třinácti až patnácti cytosinových zbytků před genem kódujícím pod jednotku fimbrií. Všechny virulentní bakterie rodu Bordetellae na svém povrchu exprimují adhezivní faktory, zatímco nevirulentní kmeny ne. Jelikož jsou tyto adhezivní faktory nezbytné pro iniciaci onemocnění, stávají se tak vhodnými složkami vakcíny.

Podstata vynálezu

Účelem vynálezu je připravit vakcínu proti infekci bakteriemi B. bronchiseptica na bázi rekombinantní DNA. Výzkum byl zaměřen na adhezivní faktory, protože prevence adheze bakterií na povrch hostitele, jakožto výsledek imunitní odpovědi namířené proti adhezivním faktorům, zabrání celkové infekci. V bakteriích B. bronchiseptica jsou za adhezi bakterie k řasnatým buňkám průdušnicového epitelu zodpovědné některé serologicky odlišné fimbrie a FHA. Má-li hostitel imunitní odpověď namířenou proti adhezivním faktorům mikrobiálního organismu, není možná kolonizace hostitele. Bakterie jsou usmrcena ještě předtím než proběhne produkce toxinů a klinické příznaky se nevyvinou.

Je výhodné, aby vakcíny podle vynálezu, zabraňující kolonizaci bakteriemi B. bronchiseptica obsahovala co možná největší množství komponentů nezbytných pro adhezi. Rekombinantní vakcína může být vytvořena jako podjednotková vakcína. Nicméně ještě není známo kolik serologicky odlišných fimbrií je redukováno a jaký je příspěvek jednotlivých faktorů (fimbrií a FHA) k adhezi bakterie. Pro vývoj vakcíny je nezbytné určit příspěvek k adhezi bakterie každé složky zvlášť. Vhodné proteiny mohou být použity jako podjednotková vakcína, poté co byly vyprodukovány ve vhodném mikrobiálním organismu.

Vynález popisuje izolaci a charakterizaci tří různých genů kódujících podjednotky adhezivních faktorů bakterie B. bronchiseptica.

Dále vynález popisuje přípravu vysoce čistého fimbriálního proteinu bakterií B. bronchiseptica nebo polypeptidových fragmentů fimbriálního proteinu (fimbriálních polypeptidů), které mají alespoň část z jedné aminokyselinové sekvence, které jsou popsány jako Sekvence id. č. 2, 4 nebo 6.

Dále vynález popisuje nejen protein fimbrií a polypeptidy, ale i DNA podle Sekvencí id. č. 1 až 3 a jejich fragmenty a polynukleotidy, které jsou schopny hybridizovat se zmíněnými DNA a jejich fragmenty a které kódují polypeptid s vlastnostmi fimbriálního proteinu B. bronchiseptica.

Vynález dále popisuje polynukleotid, který kóduje polypeptid s imunogeními vlastnostmi proteinu fimbrií B. bronchiseptica. N tomto polynukleotidu je alespoň část kordónů z DNA podle Sekvencí id. č. 1, 3 nebo 5, nebo jejich fragmentů a nebo je výše zmíněný hybridizující polynukleotid nahrazen alternativními kodóny pro tutéž aminokyselinu.

Protein fimbrií a polypeptidy z něj odvozené jsou schopny vyvolat imunitní odpověď proti

B. bronchiseptica.

Malé antigeny jsou často nepoužitelné jako imunogeny a proto může být protein fimbrií nebo polypeptidy připraveny jako homopolymery (několik kovalentně spojených identických fimbriálních polypeptidů) nebo jako heteropolymery (jeden nebo více fimbriálních polypeptidů kovalentně spojené s jedním nebo více odlišnými fimbriálními polypeptidy, nebo kovalentně spojené s jedním nebo více polypeptidy, které jsou charakteristické pro B. bronchiseptica nebo

-2 CZ 285307 B6 pro jiný pathogen). Fimbriální protein nebo polypeptidy mohou být rovněž navázány na jednu nebo více sloučenin za účelem zvýšení imunogenity.

Fimbriální polypeptid může být podle vynálezu připraven v libovolné z výše zmíněných modifikací pomocí technik rekombinantní DNA, nebo může být připraven synteticky, např. homogenní syntézou polypeptidů nebo syntézou na pevné fázi.

Významné aminokyselinové sekvence fimbriálních polypeptidů o vhodné imunogenitě mohou být odvozeny od aminokyselinových Sekvencí id. č. 2, 4 nebo 6 a popřípadě také od prostorové konfigurace fímbriálního proteinu.

Bylo vyvinuto mnoho metod sloužících k predikci umístění imunogenně významných epitopů na proteinech. Shrnutí výsledků jednotlivých predikcí podává dobrou předpověď umístění antigenních míst.

Vhodné fimbriální polypeptidy mohou být vybrány z nejvíce hydrofilních částí proteinu fímbrií, např. pomocí techniky popsané v práci Hopp a Woods (T. P. Hopp a K. R. Woods (1981): Proč. Nati. Acad. Sci, USA 78, 3824 až 3828). Jiný způsob vhodný pro výběr takových polypeptidů popisuje Chou a Fasman (P. Y. Chou a G. D. Fasman (1987), Advances in Enzymology 47, 45 až 148). Pro konečnou predikci antigenně významných částí fímbriálního proteinu bakterie B. bronchiseptica mohou být použity různé další postupy, jako je např. předpověď pružnosti polypeptidového řetězce (P. A. Karplus a G. E. Schultz, 1985, Naturwissenschaften 72, 212 až 213) a pravděpodobnostní profil výskytu β-struktury v proteinu fímbrií bakterie B. bronchiseptica, podle práce P. Y. Chou a G. D. Fasman, 1979, Biophys, J. 26, 367 až 385 a pravděpodobnostní profily ve třech konformacích pro sekvenci proteinu fímbrií B. bronchiseptica podle práce O. Gascuel a J. L. Golmard, 1988, CABIOS 4, 357 až 385, predikce sekundární struktury sekvence proteinu fímbrií bakterie B. bronchiseptica podle práce J. Novotný a C. Auffray, 1984, (Nucleic acid research 12, 243 až 255.

Další informace o umístění důležitých epitopů může být získána pomocí metody PEPSCAN, která byla vyvinuta Geysenem a Meloenem (Η. M. Geysen a R. H. Meloen, S. J. Barteling, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., 81 (13), 3998 až 4002). Tato metoda používá syntetických peptidů o dostatečné délce k reakci v imunoenzymatickém testu ELIS A. Tyto peptidy se syntetizují podle dané sekvence DNA. Peptidy jsou určeny skutečností, že první peptid zahrnuje aminokyseliny č. 1 až 9, druhý peptid aminokyseliny č. 2 až 10 atd. Každý peptid se testuje na schopnost reagovat s antisérem nebo s monokonálními protilátkami. Reaktivní peptidy tak musí představovat imunogenní epitop.

Za účelem identidikovat imunoreaktivní epitopy (a za účelem korelovat tyto reaktivity s fyzickou mapou fímbriálního proteinu) mohou být ve vhodných plasmidech, jako jsou plasmidy pEX, exprimovány fragmenty DNA z genu kódujícího protein fímbrií (K. Stanley a J. p. Luzio, 1984, EMBO J. 3, 1429 až 1434 a J. G. Kusters, E. J. Jager a B. A. M. Van der Zeijst, 1989, Nucl. Acid Res., 17, 8007). V tomto systému vede heterologní exprese k syntéze C-koncového úseku hybridního proteinu cro-fJ-galaktosidasy. K získání fragmentů genu fímbriálního proteinu, vhodných pro inserci do plasmidů pEX, mohou být využita místa pro restrikční endonukleásy, která se nacházejí v sekvenci genu pro protein fímbrií. Pro další charakterizaci se dále používá klonů plasmidů pEX syntetizujících fúzní proteiny odvozené z různých, vzájemně se překrývajících částí fímbriálního proteinu. Plasmidy pEX kódující fragmenty fímbriálního proteinu se purifíkují, rozdělí elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a blotují na nitrocelulózové membrány. Tyto membrány se nechají reagovat se sérem prasat nebo psů imunních proti B. bronchiseptica. S těmito séry reagují pouze fragmenty, které obsahují imunoreaktivní epitopy. K určení minimální délky epitopů mohou být inserty DNA v reaktivních klonech postupně zkracovány štěpení Exonukleasou ΙΠ, nebo klonováním syntetických

-3 CZ 285307 B6 oligonukleotidů kódujících krátké, vzájemně se překrývající části fímbriálního proteinu (J. G. Kusters, G. Koch, J. A. Lenstra, W. P. A. Posthums, R. H. Meloen a B. A. M. Van der Zeijst, 1989, J. Immunol. 143, 2692 až 2698.) Tyto epitopy mohou být poté testovány na jejich ochranný efekt.

Podle významného provedení vynálezu se polypeptid specifický pro protein fimbrií produkuje expresí polynukleotidu, který obsahuje alespoň část polynukleotidů podle Sekvencí id. č. 1, 3 nebo 5. Je výhodné, je-li rekombinantní polynukleotid zkonstruován na bázi vektoru do něhož byl vložen polynukleotidový fragment specifický pro bakterii B. bronchiseptica. Vhodnými vektory jsou plasmidy, bakteriofágy, kosmidy, viry, minichromozomy nebo stabilní integrující se vektory. Posledně jmenované jsou vhodné pro rostlinné nebo živočišné buňky. Tyto vektory jsou vesměs schopny samostatné replikace, kromě stabilních integrujících se vektorů, které se samy uloží do genetického materiálu hostitelské buňky a replikují se spolu s hostitelským genetickým materiálem. Vhodné hostitelské buňky mohou být buď prokaryotické, nebo eukaryotické jako jsou bakterie, kvasinky, mykoplasmata, řasy, rostlinné nebo živočišné buňky. Rostlinné nebo živočišné buňky mohou být kultivovány in vitro nebo mohou být součástí intaktní rostliny respektive živočicha. Rekombinantní polynukleotid může jako insert obsahovat úplný polynukleotid kódující protein fimbrií nebo jeho fragment. Insertem může být jediná kódující sekvence, nebo několik kopií téže kódující sekvence, nebo hybridní polynukleotid, který obsahuje alespoň jednu sekvenci kódující fimbriální protein a alespoň jednu další sekvenci jako je jiná část sekvence kódující fimbriální protein nebo polynukleotid kódující protein charakteristický pro jiný pathogen a nebo pro inertní protein, který funguje jako nosič alespoň jednoho malého fímbriálního polypeptidů.

Specifickým provedením vynálezu jsou rekombinantní polynukleotidy s virovými vektory, které jsou přímo použitelné jako tzv. vektorové vakcíny. Viry vhodné k tomuto účelu by měly mít schopnost replikovat se ve zvířatech určených k imunizaci, tj. ve psech a nebo prasatech. Tyto viry by dále měly obsahovat oblast genomu vhodnou pro inserci cizího genu (např. kódující protein nebo polypeptid fimbrií B. bronchiseptica), který bude rovněž exprimován v očkovaném zvířeti. Viry vhodnými pro tento účel jsou např. střevní viry jako jsou určité adenoviry.

Proteiny a polypeptidy a rekombinantní polynukleotidy podle vynálezu jsou vhodné pro přípravu vakcín. Tyto vakcíny jsou také součástí vynálezu.

Významné provedení vynálezu se zabývá bakteriálními vektorovými vakcínami. Bakterie schopné kolonizovat psy a nebo prasata se transformují tak, aby byly schopny exprimovat protein nebo polypeptid fimbrií, a to takovým způsobem, který vede k imunitní odpovědi proti B. bronchiseptica. Bakterie vhodné k tomuto účelu jsou např. bakterie Salmonella.

Vakcína podle vynálezu může rovněž obsahovat pomocné složky jako jsou nosiče, pufry, stabilizátory, solubilizátoiy, adjuvans a konzervační látky. Výhodně lze tyto vakcíny vysušit vymražením a před vlastní aplikací rekonstituovat přidáním vhodné tekutiny (voda, pufr).

Vakcína může být aplikována například orálně, intranasálně nebo intramuskulámě.

Vakcína může navíc obsahovat další imunogeny pro zvířata která jsou určena k imunizaci (psi a prasata). Takovým imunogenním materiálem mohou být viry jako např. pseudovirus vztekliny, influenza virus, virus přenosné gastro-enterititidy, parvo virus a virus endemického průjmu prasat, virus cholery prasat nebo imunogenní materiál charakteristický pro mykoplasmata jako jsou například coplasma hyopneumoniae a Mycoplasma lyorhinis nebo imunogenní materiál charakteristický pro bakterie jako jsou například Escherichia coli, Leptospira, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteruella multocida, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteriae..

Vynález je dále charakterizován v následujících příkladech.

-4CZ 285307 B6

Příklady provedení vynálezu

Popis obrázků:

Obr. 1: Na obrázku je schéma náhrady části genu fimX genem pro rezistenci ke kanamycinu. Vyznačena jsou cílová místa pro restrikční endonukleasy, fimX označuje gen pro podjednotku fímbrií fimX, KR značí gen pro rezistenci ke kanamycinu.

Obr. 2: Na obr. je SDS-PAGE purifikovaným fímbrií z bakterie B. bronchiseptica kmene 401 a mutantního kmene BbfX. Na ose y jsou uvedeny relativní molekulové hmotnosti použitých standardů.

Obr. 3. V horní části obrázku je schéma umístění genu fimX v plasmidu pTVB3-426. Vyznačena jsou cílová místa pro restrikční endonukleasy, šipkami a symbolem fXEv je označena sonda fXEv. V dolní části obrázku je schéma plasmidu pVIB 3-427, v němž byla část genu pro podjednotku fímbrií nahrazena genem pro rezistenci ke kanamycinu (KR).

Obr. 4: Na obrázku je schéma umístění genu fím3 v plasmidu pIVB3-430. Vyznačena jsou cílová místa pro restrikční endonukleasy, šipkami a symbolem f3SE je označena sonda f3SE.

Obr. 5: V horní části obrázku je schéma umístění genu fim2 v plasmidu pIVB3-417. Vyznačena jsou cílová místa pro restrikční endonukleasy, šipkami a symboly F2SE respektive F2Ev jsou označena sondy f2SE respektive f2Ev. V dolní části obrázku je schéma plasmidu pIVB 3—418, v němž byla část genu pro podjednotku fímbrií nahrazena genem pro rezistenci ke kanamycinu (KR). Sybol kan označuje rozsah sondy kan.

Obr. 6 a 7: Obrázky ukazují výsledky hybridizace DNA izolované zjednotlivých mutantních kmenů s použitými sondami (viz příklad 3).

Příklad 1: Charakterizace genu fimX.

Materiál a metody

Bakteriální kmeny, media a růstové podmínky.

Všechny použité bakteriální kmeny jsou popsány v tabulce 1.

Kmen bakterie	Zdroj	Získání od
Bordetella bronchiseptica kmen č. 401	klinický isolát ze psa (USA) č. 685	J. M. Musser, New York
Bordetella bronchiseptica kmen BbfX-	fimX negativní kmen, odvozen od kmene 401	P.H.M. Savelkoul, Ultrecht
Bordetella pertussis kmen Welcome 28	klinický isolát ze člověka	F.R. Mooi, Bilthoven
Bordetella avium kmen č. 182	klinický isolát z krocana	K.H. Hinz, Hannover
Escherichia coli kmene PC 2495 K12	hsd S, regA derivát kmene JM 101	Holandská sbírka kultur kultur mikroorganismů

Všechny kmeny bakterií Bordetella byly pěstovány na Bordet-Gengou agaru (Difco Laboratories, Detroit, MI) který byl doplněn 1 % glycerolu a 20 % defibrinované ovčí krve, nebo na médiu TPB (tryptose phosphate broth - tryptický masový vývar pufrovaný fosfátem, Difco Laboratories, Detroit, MI). Aby se potlačila exprese virulentních genů, byla média obohacena

-5CZ 285307 B6 mmol/1 MgSO₄. Pro přípravu DNA B. bronchiseptica byl použit kmen 401. Escherichia coli kmen PC 2495 byl použit pro propagaci vektoru Bluscript (Stratagene) a jeho derivátů. Kmen PC2495 byl pěstován na bujónu Lureano - Bertoni (LB) nebo na LB agaru. Při identifikaci kmenů které obsahují plazmid s požadovaným DNA insertem bylo použito ampicilinu (50 až 100 pg/ml), 50 gg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-|3-D-galaktopyronosidu (X-gal) a 20 pg/ml isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Všechny bakteriální kultury byly pěstovány při teplotě 37 °C po dobu 16 až 24 hodin.

Metody rekombinantní DNA

Chromozomální DNA byla izolována z kmenů bakterie Bordetella způsobem popsaným v práci T. Maniatis, E. F. Fritsch a J. Sambrook 1982, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Po naštěpení se provede elektroforéza DNA na 1 % agarosovém gelu v pufru TAE (40 mmol/1 Tris-acetát, 2 mmol/1 ethylen-diamin-tetraacetát sodný (EDTA)), který obsahoval 1 pg/ml ethidium bromidu. Pro izolaci fragmentů DNA z agarosového gelu byla použita souprava Geneclean (Bio lne. 101 Corp., La Jolla). Ke koncovému značení oligonukleotidů bylo použito [y-³²P]dATP, který byl navázán pomocí T4 polynukleotid kinisy (Maniatis a kol). Hybridizace se prováděla v 5 x SSPE (Salině sodium phosphate EDTA buffer-fysiologický roztok pufrovaný fosforečnanem sodným s přídavkem EDTA), 5 x Denhardtově roztoku, 0,1 % SDS (dodecyl sulfát sodný ) a 10 pg/ml DNA ze sledího spermatu při teplotě 55 °C. Blotovací ,-membrána byla promyta 5 x SSPE a 0,1 % SDS při teplotě 55 °C.

Analýza pomocí Southem blotu

Chromozomální DNA kmenů bakterií B. bronchiseptica kmene 401 se purifikuje a štěpí různými restrikčními enzymy. Fragmenty se elektroforeticky rozdělí, přenesou na nylonovou membránu a hybridizují se se sondou DNA odvozenou od genu pro protein podjednotky fimbrií fimX z bakterie B. pertussis. Hledané fragmenty DNA, identifikované hybridizačním signálem se izolují pomocí soupravy Gene Clean (Bio lne. 101 Corp., La Jolla). Po ligaci do vektoru Bluescript (Stratagene) se fragmenty chromozomální DNA transformují do Escherichia coli, kmen PC2495 pomocí CaCl₂ metody (Dagert M., Ehrlich S.D. 1979, Prolonged incubation in calcium chloride improves the Competence of Escherichia coli cells, Gene 6, str. 23 až 28. Po hybridizaci se identifikují positivní kolonie.

Určení nukleotidové sekvence

Plazmidy se izolují metodou alkalické lýzy (H.C. Bimboim a J.A. Doly 1979, A rapid alkaline extraction proceduře for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res. 7, 1513 až 1523). Nukleotidová sekvence klanovaných insertů se stanoví pomocí metody ukončení řetězce dideoxynukleotidy (F. Sanger. S. Nicklen, A.R. Coulson 1977, DNA sequencing wirh chainterminating inhibitor, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 74: 5463 až 5467) za použití soupravy spolemerázou T7 (Amersham). Analýza sekvenčních dat DNA se provádí pomocí software PC/Gene (verze 6.5, Genofit, Heidelberg S. A, Ženeva, Švýcarsko).

Částečná purifikace fimbrií

Kmen 401 B. bronchiseptica se pěstuje na Tiyptosa-fosfátovém agaru (Difco Laboratories, Detroit, MI). Bakterie se promyjí ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Peleta obsahující bakterie se suspenduje v 15 ml PBS doplněné 4 mol/1 močoviny. Tato suspenze se na 30 minut umístí do 40 °C. Bakterie se oddělí od suspenze centrifugací při 10 000 otáčkách/min (Beckman, rotor JA 20, 10 minut). Fimbrie se izolují ze supematantu centrifugám při 40 000 ot/min (Beckman, Rotor Ti 60, 16 hodin). Poté se peleta suspenduje v 5 ml PBS.

-6CZ 285307 B6

Koncentrace proteinu se stanoví pomocí bicinchonininové kyseliny (BCA, Pierce Chemical Company, USA). Proteinová analýza se provede elektroforézou na 15 % polyalkrylamidovém gelu v SDS.

Výsledky

Sekvenční analýza a umístění insertů

Jako sonda k identifikaci chromozomálních fragmentů DNA zB. bronchiseptica obsahujících geny fim byl použit fragment DNA BamHI - EcoRi odvozený od genu fimX z bakterie B. pertussis. Po štěpení genomu B. bronchiseptica enzymem Pstl byl izolován a sekvenován fragment DNA o délce 1,3 kb, který hybridizoval sDNA sondou fimX. V tomto fragmentu se nachází kompletní gen fimX včetně promotorových sekvencí před vlastním genem (Sekvence id. č.l).

Pod depozitním číslem CBS 364. 92 byla 13. srpna 1992 u Centraalbureau voor Schimelcultures at Baam v Holandsku uložena bakterie E. coli PC 2495 obsahující plazmid pIVB 3 - 420, který obsahuje úplný gen fimX.

Exprese genu fimX v bakteriích B. bronchiseptica

Za účelem identifikace produktu genu fimX byl zkonstruován kmen bakterií, které nebyly díky deleční mutaci schopny exprimovat gen fimX. Tento mutantní kmen byl zkonstruován přenosem genů. Centrální Exo RV fragment genu fimX bakterie B. bronchiseptica byl nahrazen genem pro rezistenci ke kanamycinu a klonován ve vektoru Bluescript. Tento konstrukt byl poté použit pro náhradu genů v B. bronchiseptica (obr. 1). Poté byly identifikovány mutantní kmeny rezistentní ke kanamycinu. Tyto kmeny již nehybridizovaly s EcoRV fragmentem. Z těchto mutantních kmenů byly připraveny částečně purifikované fimbrie. Purifíkace fímbrií z fimX negativních kmenů ve srovnání s divokými kmeny jasně dokazuje že gen fimx je exprimován v bakteriích B. bronchiseptica velmi silně (obr. 2).

Příklad 2: Charakterizace genů fim2 a fím3 kódujících podjednotky fímbrií bakterie Bordetella bronchiseptica

Materiál a metody

Bakteriální kmeny, plasmidy a kultivační podmínky

Divoký kmen bakterií B. bronchiseptica byl izolován ze psů trpících psím kašlem. Tento kmen byl získán od dr. J. M. Mussera (kmen č. 685) a označen č. 401. Tento kmen byl kultivován na Tryptosa-fosfátovém vývaru nebo agaru (Difco Laboratories, Detroit, MI). Kmen bakterie B. pertussis Wellcome 28 (A. Robinson, L.A.E. Asworth, A. Baskervlle a L.I. Irons 1085, Proceedings of the 4th Intemational Symposium on pertussis, Ženeva, 1984, Dev. Biol. Stand. 61:165 a 172) byl kultivován na agaru Bordet-Gengou (Difco Laboratories - Detroit, MI). Média pro kultivaci nevirulantních kmenů B. bronchiseptica byla obohace 20 mmol/1 MgSCL. Bakterie E. coli K12 kmene PC 2495 byla použita jako hostitel pro klonování vektoru pBluescript. Bakterie E. coli byly kultivovány na LB agaru nebo LB bujónu obohaceném 100 pg/ml ampicilinu, 50 pg/ml X-gal a 20 pg/ml IPTG pro identifikaci rekombinantních kmenů obsahujících klonovaný fragment DNA. Všechny bakteriální kultury byly kultivovány 16 až 48 hodin při teplotě 37 °C.

-7CZ 285307 B6

Izolace NA a stanovení nukleotidové sekvence

Izolace chromozomální DNA byla provedena podle Maniatise a kol. Izolace plasmidu byla provedena podle metody Bimboima a Dolyho. Fragmenty chromozomální DNA byly izolovány z TAE agarosových gelů (40 mmol/1 Tris-acetát, 2 mmol/1 EDTA) pomocí soupravy Gene Clean (Biol lne. 101 Corp, La Jolla). Fragmenty DNA byly ligovány do plasmidů pBluescript KSM 13+ a M13- (Stratagene, La Jolla, CA) pro všechny další účely klonování. Nukleotidová sekvence klanovaných insertů byla stanovena pomocí metody ukončení řetězce dideoxynukleotidy (F. Sanger a kol.) za použití soupravy s polymerázou T7 (Amersham). Analýza sekvenčních dat DNA se provádí pomocí software PC/Gene (verze 6.5, Genofit, Heidelberg S.A., Ženeva, Švýcarsko). Restrikční enzymy a T4 DNA ligasa byly získány od firmy Pharmacia a byly používány podle instrukcí výrobce. Plazmidy byly transformovány do bakterií E. coli kmene PC 2495 za použití CalCI₂ metody podle Dagerta a Ehrlicha.

Southemblot

Southemblot byl proveden podle Maniatise a kol.

Eletroforéza v SDS v polyakrylamidovém gelu a imunologické techniky

Pro SDS-PAGE a analýza pomocí Westemblotu byla použity shodná množství bakterií. Bakterie se přenesou do pufru PBS a naředí tak, aby OD₆₀o se rovnala 1,0. 50 1 této suspenze se lyžuje v Laemliho pufru a podrobí se elektroforese na 15% polyakrylamidovém gelu podle Laemmliho (Laemmli U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nátuře 227, 680 až 685). Přenos proteinu na nitrocelulózovou membránu byl proveden podle práce J.D.A. van Emben, H.J. van der Donk, H.J. van Eijk, H.G. van der Heide, J.A. de Jong, M.F. van Olderen, A.D. Osterhaus, L.M. Schouls, 1983, Molecular cloning and expression of Treponema pallidum in Escherichia coli K12, Infect. Immun. 42:187 až 196. Pro detekci podjednotkového proteinu fimbrií bakterií B. bronchiseptica se použijí polyklonální protilátky připravené proti serotypům 2 nebo 3 podjednotkového proteinu fimbrií z B. pertussis, který byl denaturován SDS.

Monoklonální protilátky specifické k fim2 a fím3, produkované proti B. bertusis byly použity v testu ELISA na mikrotitračních deskách s plochým dnem potaženým celými bakteriemi (OD6oo⁼0-L ředěno 1:10 v pufru 15 mmol/1 Na₂CO₃, 35 mmol/1 NaHCO₃, pH 9.6). Navázaný konjugát kozí anti-myší IgG/peroxidása (Nordic) byl stanoven 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthialzolin)-6-sulfonovou kyselinou (ABTS, Sigma). Absorbance byla měřena při vlnové délce 305 nm.

Elektronová mikroskopie

Pro účely elektronové mikroskopie se kultura B. bronchyseptica naředí v pufru PBS. Měděné síťky s vláknitým povrchem se umístí na 5 minut na 50 μΐ bakteriální suspenze. Síťky se promyjí dvakrát ve vodě. Poté se síťky 2 minuty barví v 1% TPA (wolframátofosforečná kyselina, Měrek). Síťky byly pozorovány v elektronovém mikroskopu Philips 201.

Výsledky

Geny fim2 a fim3 kódující podjednotku fimbrií bakterií B. bronchiseptica mohou být identifikovány na základě jejich homologie s geny fim2 a fim 3 bakterie B. pertussis. AccI Pstl fragment DNA o délce 1000 bp byl použit jako sonda (proba) pro gen fim2 (I. Livey, C.J. Duggleby a A. Robinson, 1987, Cloning and nucleotide sequence analysis of the serotype 2

- 8 CZ 285307 B6 fimbrial subunit gene of the bordetella pertussis, Mol. Microb. 1, 203 až 209). Sáli fragment DNA o délce 900 bp byl použit jako sonda pro gen fím3 (F.R.Mooi, A. ter. Avest a H, G, J, van der Heide, 1990, Structure of the Bordetella pertussis gene coding for the serotype 3 fimbrial subunit, FEMS Microb. Lett. 66, 327 až 332). Hybridizace chromozomální DNA z bakterie B. bronchiseptica rozštěpené pomocí restrikční endonukleasy Pstl dala s oběma sondami několik positivních signálů díky sekvenční homologii, která mezi sondami existuje. Z chromozomální DNA bakterie B. bronchiseptica se podařilo izolovat dvě oblasti fragmentů dávajících silný signál buď se sondou fim2, nebo se sondou fim3. Tyto Pstl fragmenty DNA o délce přibližně 2,3 kb a 2,8 kb byly nakloňovány do vektoru pBluescript. Po transformaci a napěstování kolonií byly identifikovány dva klony hybridizující s některou flm sondou. Jeden klon, obsahující insert o délce 2,3 kg, kóduje gen fím2 (pIVB 3-402). Druhý klon s insertem o délce 2,8 kb kóduje gen fím3 bakterie B. bronchiseptica (pIVB 3-430). Nukleotidová sekvence obou genů byla určena a je popsána jako sekvence id. č. 3 (fím2) respektive Sekvence id. č. 5 (fim3). Pod depozitními čísly CBS 362. 92 a CBS 361.92 byly 13. srpna 1992 u Centraalbureau voor Schimelcultures at Baam v Holandsku uloženy bakterie E. coli PC 2495 (pIVB 3—402) a PC 2495 (pIVB 3—430).

Příklad 3: Konstrukce dvou kmenů bakterie B. bronchiseptica deficitních v produkci jednoho typu fimbrií.

Byly zkonstruovány dva kmeny bakterií Bordetella bronchiseptica defícientních v produkci fimbrií FimX (BbfX’) nebo fimgrií Fim2 (Bbf2'). Toho bylo dosaženo pomocí náhrady původních genů geny poškozenými po homologní rekombinaci. Poškozené geny byly transformovány do bakterií B. bronchiseptica elektroporací. Delece genů pro podjednotku fimbrií bylo dosaženo nahrazení EcoRV fragmentu v genech divokého kmenu bakterií genem pro rezistenci ke kanamycinu.

Materiál a metody

Bakteriální kmeny, plasmidy a kultivační podmínky

Ve všech experimentech byl používán divoký kmen bakterie B. bronchiseptica č. 401. Bakterie byla získána od Dr. J. M. Mussera (kmen č. 685). Tento kmen byl kultivován na Tryptosafosfátovém agaru (TPA, Difco Laboratories) nebo na agaru Bordet-Gengou (BG, Difco Laboratories), který byl obohacen 15 % čerstvých ovčích erythrocytů. Kultivace probíhala při teplotě 37 °C po dobu 43 až 48 hodin. Pro účely klonování byla použita bakterie Escherichia coli K12 kmen PC 2495 spolu s plasmidy Bluescript KS a SK (Stratagene). E. coli PC 2495 byla kultivována na agaru Luriano Bertoni s vhodnými antibiotiky při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin. Pro experimenty byly použity koncentrace ampicilinu a/nebo kanamycinu 100 pg/ml.

Techniky rekombinantní DNA

Klonování byly provedeny podle Maniatise a kol. Každý gen pro podjednotku fimbrií, včetně přilehlých sekvencí se nakloňuje do vektoru pBluescript. Tyto vektory se poté izolují metodou alkalické extrakce podle Bimboima a Dolyho. Fragment DNA z genů pro podjednotku fimbrií byl nahrazen genem pro resistenci ke kanamycinu (A. Labigne-Roussel, J. Harel a L. Tompkins, 1987, Gene transfer from Escherichia coli to Campylobacter species: Development of shuttle vectors for genetic analysis of Campylobacter jejuni, J. Bacteriol. 169, 5390 až 5323). Tento posledně jmenovaný konstrukt byl použit v elektroporečních experimentech.

-9CZ 285307 B6

Elektroporeční experimenty

Elektroporace byla provedena tak, jak byla popsána Millerem a kol. (J.F. Miller, W.J. Dover a

L.S. Tomkins, 1988, High voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Campylobacter jejími with plasmid DNA, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 85: 856 až 850). Bakterie B. Bronchiseptica divokého kmenu 401 se kultivují na BG agaru po dobu 16 hodin. Buňky se sklidí v 1 ml 15% glycerolu v 272 mmol/1 roztoku sacharosy (GlySuc) při teplotě 0 °C. Poté se bakterie promyjí a resuspendují v 400 μΐ GlySuc. 500 μΐ alikvoty této směsi se odeberou a zmrazí na teplotu -80 °C. Tyto alikvoty se poté použijí v elektroporačních experimentech k transformaci bakterie B. bronchiseptica jedním až třemi g DNA, rozpuštěné v destilované vodě. Používají se tyto elektroporační podmínky: 0,7 kV, 25 pF a 600 Ω (v zařízení Biomat Gene Pulser) používá se kyvet s mezerou 0,56 mm od firmy Biotechnologies and Experimental Research Inc, San Diego CA). Naměřené časové konstanty byly v rozmezí 3,5 až Ί ms. Buňky se poté inkubují v 1 ml Tryptosa-fosfátového vývaru (Diofco laborataries) při teplotě 37 °C po dobu 90 minut a poté se umístí TPA (Difco Laboratories) s obsahem 100pg/ml kanamycinu. Vyhledávání rekombinantních kmenů se provádí pomocí Southemova přenosu a hybridizací s přípravky z chromozomální DNA.

Purifikace chromozomální DNA a analýza pomocí Southemblotu

Chromozomální DNA se purifikuje podle Manietise a kol,. Southemblot se provádí tak, jak bylo popsáno dříve.

Značená DNA používaná v hybridizačních experimentech

Pro hybridizační experimenty s genem fimX byly používány dvě sondy DNA označené jako fXEv a £3SE. Fragment DNA o délce 450 bp, který byl použit jako sonda fXEv byl izolován štěpením plasmidu pIVB 3-426 restrikční endonukleasou EcoRV (obr. 3). 580 bp dlouhý fragment DNA sloužící jako sonda f3SE byl získán štěpením plasmidů pIVB 3-430 restrikčními endonukleasami Sphl a ExoRI (obr. 4). Pro hybridizační experimenty s genem fim2 byly použity tři DNA sondy označené jako f2Ev, kana a f2PE (obr. 5). Fragment DNA o délce 900 bp, který byl použit jako sonda f2Ev byl izolován štěpením plasmidu pIVB 3-417 restrikční endonukleasou Eco RV, sonda kana jek 900 bp dlouhý Eco RV štěp a sonda £2PE je 610 bp dlouhý fragment DNA plasmidu pIVB 3-417, vzniklý jeho štěpením nukleasami Pstl a Eco RVI.

Výsledky

Dva plazmidy s fragmenty DNA obsahující geny pro podjednotky fimbrií fim X nebo fim2 byly použity pro elektroporační transformaci divokého kmene bakterie B. bronchiseptica. Geny obou podjednotek byly poškozeny nahrazeny EcoRV DNA fragmentu genem pro rezistenci ke kanamycinu. Před touto operací je nejprve nutno odstranit třetí cílové místo pro nukleasu ExoRV, které se nachází v polylinkeru vektoru Bluescript. Toho bylo dosaženo subklonováním fragmentů DNA do vektoru Bluescript štěpeného pomocí EcoRV, čímž vznikly plasmidy pIVB 3—426 pro gen Fim X a pIVB 3—417 pro gen fim2 (obr. 3 a 5). Oba klony byly poté naštěpeny restrikční endonukleasou EcoRV. Tímto štěpením byl odstraněn fragment o délce 450 bp z klonu pro gen fim X (pIVB 3-426) včetně 5 promotorových sekvencí (obr. 3). Poté co byl odstraněn EcoRV fragment byl vektor se zbývajícími sekvencemi DNA izolován a do míst EcoRV byl nakloňován 1,4 kb dlouhý Smál - HinCII fragment DNA obsahující gen pro resistenci ke kanamycinu. Transformace do bakterií E. coli kmene PC 2495, následovaná izolací plasmidů dala vzniknout klonu pIVB 3-427 (obr. 3). Stejný postup byl proveden i pro gen fimbriální podjednotky fim2. Štěpením klonu pIVB 3—417 restrikční endonukleasou EcoRV (obr. 5) ® se podařilo odstranit fragment DNA dlouhý 900 bp z 3 konce genu spolu s přilehlými sekvencemi.

-10CZ 285307 B6

Po ligaci genu pro existenci ke kanamycinu do tohoto konstruktu vznikl klon pIVB 3-418 (obr. 5).

Oba plasmidy (pIVB 3—427 a pIVB 3—418) byly odděleně použity pro elektroporační experimenty sloužící k transformaci B. bronchiseptica. Po každém elektroporačním experimentu bylo pozorováno až 10² kolonií B. bronchiseptica rezistentních ke kanamycinu. Po elektroporaci plasmidem pIVB 3-427 (částečný gen pro fimbriámí podjednotku FimX) byly analysovány 4 kolonie (fX I až IV). Po elektroporaci plasmidem pIVB 3-418 (částečný gen fimbriální podjednotky fím2) bylo analyzováno 7 kolonií (f2 I až IV). Chromozomální DNA z těchto kanamycin-rezistentních kmenů B. bronchiseptica byla izolována a štěpena pomocí restrikčních endonukleás Pstl respektive EcoRV. Southemova hybridizace byla provedena s naštěpenou chromozomální DNA, izolovanou z kmenů resistentních ke kanamycinu a z divokého kmenu B. bronchiseptica. Naštěpená chromozomální DNA izolovaná ze 4 kmenů, které byly elektroporovány plasmidem pIB 3—427 byla hybridizována se sondami fXEv respektive s f3Ev (obr. 3,4). Naštěpená chromozomální DNA izolovaná ze 7 kmenů, které byly elektroporovány plasmidem pIVB 3^418 byla hybridizována se sondami f2Ev, kana respektive sf3SE (obr. 5). Z výsledků hybridizace se sondami fXEv a f2Ev vyplývá, že byly izolovány rekombinantní kmeny postrádající buď část genu fimX (obr. 6A a 6B) nebo genu fím2 (obr. 7A a 7B). Z hybridizačních experimentů, ve kterých byl gen pro rezistenci ke kanamycinu použit jakožto sonda, vyplývá pro gen fim2, že všechny izolované kmeny (f2 I až VII) obsahují gen pro rezistenci ke kanamycinu (obr. 7C).

Zatímco gen pro rezistenci ke kanamycinu byl přítomen ve všech rekombinantních kmenech, mohlo dojít k záměně části genu pro fimbriální podjednotky s genem pro jinou podjednotku díky jejich sekvenční homologii. Došlo-li k takovéto záměně bylo určeno tak, že hybridizační experimenty se prováděly mírně nepříznivým podmínek, při kterých může být pozorována křížová hybridizace pomocí sond odvozených od jiných podjednotkových genů. Z hybridizačních experimentů se kmeny fimX resistentními ke kanamycinu (fX I až IV) se sondou f3SE (odvozena od genu podjednotky fim3) vyplývá, že k záměně části genu pro fimbriální podjednotku došlo pouze v rámci kmene BbFX. U tohoto kmene, jakož i u dalších rekombinantních kmenů (fXII až IV) se vyskytují hybridizační signály s fragmenty DNA genů fim3 a fim2 (obr. 6C). Protože tyto signály jsou totožné se signály divokého kmene B. bronchiseptica, lze říci, že nedošlo k rekombinanci v žádném dalším podjednotkovém genu (obr. 6C). Hybridizace mutantních kmenů fim2 se sondou f2PE dokazuje, že ke genové záměně v genu fim2 došlo pouze v rámci BbF2’ (obr. 7D). Tato sonda dala hybridizační signál se všemi třemi podjednotkovými geny. Protože grafment Pstl-EcoRV se nachází v plasmidu pIVB3-418, který byl použit při elektroporaci, může být u rekombinantních kmenů (f2 Π až VII) pozorován čtvrtý hybridizační signál. To naznačuje, že v kmenech resistentních ke kanamycinu se může stále vyskytovat plasmid pIVB3—418. K rekombinací došlo pravděpodobně na jiném místě chromozomu v neidentifikované lokaci mimo gen fimbriální podjednotky.

Příklad 4: Vakcinace myší mutantními kmeny BbfX' a Bbf2 bakterie Bordetella bronchiseptica

Materiál metody

Tři skupiny myší (6 týdnů starých samiček BALB/c) po 80 jedincích byly intranasálně infikovány divokým kmenem B. bronchiseptica, respektive kmeny BbfX’ Bbf2‘ (které byly připraveny podle příkladu 2). Infekční dávka činila 2 x 10⁷ cfu (colony forming unit - živá bakterie schopná vytvořit kolonii). Množství živých bakterií v dýchacím traktu 8 myší bylo stanoveno vdaných časových intervalech (0, 1, 3, 7, 11 a 36 dní). Podrobeny zkoumání na přítomnost živých bakterií B. bronchiseptica byly nosohltany, plíce, průdušky a nosní dutiny každé myši. Myši testované ve dni 0 byly usmrceny injekcí barbiturátu přibližně 1 hodinu po infekci a ostatní stejným způsobem ve stanovených dnech. Plíce a průdušky byly odebrány a

-11CZ 285307 B6 homogenizovány v PBS pomocí tkáňového homogenizátoru. Výtěry nosní sliznice byly odebrány pomocí kočičího střeva. Střeva se poté umístí do 0,5 ml PBS a vortexují se po dobu 5 minut. Nosohltan infikovaných myší se vypláchne 5 kapkami PBS (asi 0,5 ml). Jednotlivá zředění všech homogenátů a výplach z nosohltanu se přenese na Tryptosa-fosfátový vývar a po dvoudenní inkubaci se spočítají CFU.

dní po vakcinaci byly skupiny myší vakcinovaných BbfX' a Bbf2‘ a nevakcinovaná kontrolní skupina exponována virulentnímu kmeni B. bronchiseptica. Kolonizace dýchacích cest byla měřena ve dnech 0, 1, 4 a 14 po expozici.

Výsledky

Byly srovnány výsledky experimentů s kolonizací horních cest dýchacích mutantními kmeny a kmenem divokým. Z výsledků vyplývá, že není rozdíl v kolonizaci jednotlivých orgánů horních cest dýchacích po vystavení účinkům mutantních kmenů BbfX' nebo Bbf2' ve srovnání s divokým kmenem.

dne byly myši ze skupiny vystavené kmenům BbfX' a Bbf2‘ testovány na přítomnost bakterií Bordetella. N plicích a v průduškách nebyly detekovány žádné bakterie rodu Bordetella, zatímco malá množství bakterií Bordetella byla stále přítomna v nose a nosohltanu.

dní po vakcinaci byly myši vakcinované mutantními kmeny BbfX' a Bbf2' a kontrolní skupina vystaveny virulentnímu kmenu B. bronchiseptica. U obou vakcinovaných skupin nebylo zabráněno kolonizaci nosohltanu virulentním kmenem B. bronchiseptica.

Kolonizace virulentním kmenem B. bronchiseptica v plicích a nosohltanu u myší patřících do skupiny, která byla vakcinována divokým kmenem, mohla být prokázána pouze 1 hodinu po expozici, zatímco kontrolní skupiny byly velmi silně kolonizovány. Kolonizace ústní dutiny myší vakcinovaných mutantním genem mohla být detekována pouze dne 0 a u některých myších dne 1, zatímco ústní dutiny myší z kontrolní skupiny byly silně kolonizovány.

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1315 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Bordetella bronchiseptica (B) KMEN: 401 (vii) KONKRÉTNÍ ZDROJ:

(B) KLON: E. coli PC 2495 (pIVB 3-420) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMENO/KLÍČ: nekódující oblast (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 539

-12CZ 285307 B6 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS fimX (B) UMÍSTĚNÍ: 540 až 1142 (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 1:

CTGCAGCTCA AOGGATOCAG TATTCGTOGA GCGAICOCAA GACOCAGAOG GOGCAGATCT60

COGGCGCGAC CGAGACCACC GGOGIGCAGA TAOGCCICTC CAAOCIGAAC GACAGCAAGA120

TCACCATCGG CGCGAAOGAG CAGATGCAGC ACGCACAGGG CTICGAOOOG GTCGOCCňGG180

CATOGGGCGG CAAGAAGAGC CTGACCCTGA GCTACCTIGC TKCTATGIG OGCRAGAGCA240

GOGGCCGACG TGGACAGOGG CTCGATTACC ACCTAOGTCG CTICTCIGIG GTCTACCOCT300

AGOGGGGOGA ATGCAGCGGA TATCGAOGTC AGCTIGGGCC AAřTCCTMCA GGATCACGAA360

CAAGCCTCTC GAIGGOQGGC CGATIGCITA OCACGTAAGT GGITCCOGCC GTCGTCICTG420

CCTGATAIGG CGAAGGOGGG OCAAATTCCT AGATACCCAT GAGGOCOCCC OCOOCCCCTG4S0

AGGOGTCCAA TAATCTIGCA CACACATTCT CCCTGGATCC CTICTITACT CCAGCCTGT539

ATG CAA GCC AAA ACG TTC CTC CTG GGC GOG GOG CTC GCC GGC CTC GOG537

Met Gin Ala Lys Thr Phe Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala Gly val Ala 15 1015

CTC GCC GCC CAT GCC GAA GAC GGC AOC ΑΤΓ CTC ΑΤΓ ACC GGC ACG ATC635

Leu Ala Ala His Ala Glu Asp Gly Thr Ile Val Ile Thr Gly Thr Ile

2530

AOC GAC CAG ACC TGC ACG ATC GAG GAC COG AGC OCC GGT TAC ATC AAG633

Thr Asp Gin Thr Cys Thr Ile Glu Asp Pro Ser Pro Gly Tyr Ile Lys

4045

CTC CTG CAC CTG COC ACG ATC TCC AAG AGC GCG CTG AAG AAC GCC GGC731

Val Val His Leu Pro Thr Ile Ser Lys Ser Ala Leu Lys Asn Ala Gly

5560

GAC GIG GOG GGG OGC ACT OGC TTC GAT ATC AAG CTG AAG GAC TGC OOG779

Asp Val Ala Gly Arg Thr Arg Phe Asp Ile Lys Leu Lys Asp Cys Pro

-13CZ 285307 B6

ACC ACC GTC AAC ACT CTC AAG CIG TAC TTC GAG CCC GGC CCC ACC AOG827

Thr Thr Val Asn Thr Leu Lys Leu Tyr Phe Glu Pro Gly Pro Thr Thr 85 9095

GAT TAC GGC ACC AAG GAT CIG AAA GCC TAT AAG CAG GCT TGG TAC GTC875

Asp Tyr Gly Thr Lys Asp Leu Lys Ala Tyr Lys Gin Ala Trp TyrVal

100 105110

GAC GCC GCA AOG CIG CTC AAA TOG OOG CCC AGT GIG ACC GAA GCC AAG923

Asp Ala Ala Thr Leu Leu Lys Ser Pro Pro Ser Val Thr Glu AlaLys

115 120125

GGG GIG CAG ATC OGG CIG ATG AAC CIG AAC GGC AAG CAG ΑΤΓ COC ATG971

Gly Val Gin Ile Arg Leu Met Asn Leu Asn Gly Lys Gin Ile ProMet

130 135140

GGC GAG ACC GAG CCC AAC CAG CAT GCC GCG GCA ÍTT TOC GGC AOC ATG1019

Gly Glu Ihr Glu Pro Asn Gin His Ala Ala Ala Phe Ser Gly ThrMet

145 150 155160

CAA GCC GGC CAG GCG AAG AAA TCG TTC ACC TTG CAC TAC CIG GCC GGC1067

Gin Ala Gly Gin Ala Lys Lys Ser Phe Thr Leu His Tyr Leu Ala Gly

165 170175

TAC GIG AAG AAG GCC AGT GGA GAG GIG GAG GOG ACC ATG CIG ACC ACC1115

Tyr Val Lys Lys Ala Ser Gly Glu Val Glu Ala Thr Met Leu Thr Thr

180 185190

TAC GIG GGC ΤΤΓ TO3 GTC GTC TAC CCC TGA AAC GCA C AGGCCAIGGC1162

Tyr Val Gly Phe Ser Val Val Tyr Pro

195200

GGCOGGOGTT GCGOCCIGCG AACCCCGGCG ATCAGOGOGG CCGCnGTOG AIGAOGOGCC1222

GOGCCTIGCC OGTCAGGGTA OGCKGACGA AGCCOGIGTC GGCAAOCTGC ACGOGGGOGT1282

GAOGOOGATG TATGACTIGA OOGCATCCTC CAG1315 (2) INFROMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 201 aminokyselin

-14CZ 285307 B6 (B) TYP: aminokyselina (D) TOPLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 2:

Met Gin Ala 1

Lys

Thr Phe Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala Gly Val Ala

5

10

15

Leu Ala Ala

His Ala

Glu

Asp Gly

Thr

Ile

Val

Ile

Thr Gly

Thr

Ile

signální

20

25

30

peptid Thr Asp Gin

Thr

Cys

Thr

Ile

Glu

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly Tyr

Ile

Lys

35

40

45

val Val His

Leu

Pro

Thr

Ile

Ser

Lys

Ser

Ala

Leu

Lys Asn

Ala

Gly

50

55

60

Asp Val Ala

Gly Arg

Thr

Arg

Phe

Asp

Ile

Lys

Leu

Lys Asp Cys

Pro

65

70

75

80

1 Thr Thr Val Asn

Thr

Leu

Lys

Leu

Tyr

Phe

Glu

Pro

Gly Pro

Thr

Thr

85

90

95

Asp Tyr Gly

Thr

Lys Asp

Leu

Lys

Ala

Tyr

Lys

Gin

Ala Trp Tyr

Val

100

105

110

Asp Ala Ala

Thr

Leu

Leu

Lys

Ser

Pro

Pro

Ser

Val

Thr Glu Ala

Lys

115

120

125

Gly Val Gin

Ile

Arg

Leu

Met

Asn

Leu

Asn

Gly Lys

Gin Ile

Pro

Met

130

135

140

-15CZ 285307 B6

Gly

Glu

Thr

Glu

Pro

Asn

Gin

His

Ala

Ala

Ala

Phe

Ser

Gly

Thr

Met

145

150

155

160

Gin

Ala

Gly

Gin

Ala

Lys

Lys

Ser

Phe

Thr

Leu

His

Tyr

Leu

Ala

Gly

165

170

175

Tyr

Val

Lys

Lys

Ala

Ser

Gly

Glu

Val

Glu

Ala

Thr

Met

Leu

Thr

Thr

180

185

190

Tyr

Val

Gly

Phe

Ser

Val

Val

Tyr

Pro

195 200

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 624 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne , (iii) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMU: Bordetella bronchiseptica (B) KMEN: 401 (viii) KONKRÉTNÍ ZDROJ:

(B) KLON: E. coli PC 2495 (pIVB 3-402) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS fím2 (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 624 (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č: 3:

ATC CAA GTC CCT TTC CAA CGC GCC CIG COG CTC TCC TTC OGG GOC GCT

Met Gin Val Pro Phe Gin Arg Ala Leu Pro Leu Cys Leu Arg Ala Ala

10 15

CTC GCG GCC ATT GOG TOC GOG GOG CAC GCC GAC GAC GGC ACC ATC GTC

Leu Ala Ala Ile Ala Ser Ala Ala His Ala Asp Asp Gly Thr Ile Val

25 30

-16CZ 285307 B6

ATC ACC GGC ACC ATC ACC GAC ACC ACC TGC GTC ATC GAG GAC COG GCC144

Ile Ihr Gly Thr Ile Ihr Asp Thr Thr Cys Val Ile Glu Asp Pro Ala

4045

GGC OCC ACG CAC ACC AAG GTC GTC CAA TTC CCC AAG ALA TCC AAG AGC192

Gly Pro Ihr His Ihr Lys Val Val Gin Leu Pro Lys Ile Ser LysSer

5560

GOG CTG GCC AAG GAT GGA GAC GAA GCT GGC OCT ACG CCC TTC CTG ATC240

Ala Leu Ala Lys Asp Gly Asp Glu Ala Gly Arg Ihr Pro Phe LeuIle

70 7580

ACG CTC AAG GAC TGC CCC TCC TCC CTG AAC AAT GGC CTG AAA GOG TAC288

Ihr Leu Lys Asp Cys Pro Ser Ser Leu Asn Asn Gly Val Lys AlaTyr

9095

TTC GAG CCT GGG COG ACC ACC GAC TAC GCT ACC GGC GAC CLA AAG GOG336 fhe Glu Pro Gly Pro Thr Ihr Asp Tyr Ala Thr Gly Asp Leu LysAla

100 105110

TAT TCG ATC GCC TAC AAC AAC AAC OCC GCC ACC ACC CAA AAT GOG ATC384

Tyr Ser Ile Ala Tyr Asn Asn Asn Pro Ala Ihr Ihr Gin Asn AlaIle

115 120125

ATC GCT GCA AGC GAA GOG CAG GGC CTG CAA ATC OGC ATC TCC AAC CAG432

Ile Ala Ala Ser Glu Ala Gin Gly Val Gin Ile Arg Ile Ser AsnGin

130 135140

AAC GGC ACC AAG ATC CCC ATG GGC GTC GAC GCC GCC GCC CAG AAC GCC480

Asn Gly Ihr Lys Ile Pro Met Gly Val Asp Ala Ala Ala Gin Asn Ala

145 150 155160

CAG GCC TTC AAC CCC GTC ACC GAC ACC GCC GAC AAC GCC AAG AAG AAG528

Gin Ala Phe Asn Pro Val Ihr Asp Ihr Ala Asp Asn Ala Lys Lys Lys

-17CZ 285307 B6

CTC AOG TTG CGC TAC CTG GCA TOG TAC OTA AAG AAA TCC GGC AAC ΑΤΓ576

Val Thr Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Tyr Val Lys Lys Ser Gly Asn Ile

180 185190

ACT GCC GGG CAA CTC AOG ACA TAC CTC GGT TTT TCC ATG ATC ΤΆΤ OOG624

Thr Ala Gly Gin Leu Thr Thr Tyr Val Gly Phe ser Met Ile Tyr Pro

195 200205

INFORMACE O SEKVENCI ID. č. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE 4:

(A) DÉLKA: 208 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein io (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 4:

Met

Gin

Val

Pro

Phe Gin Arg Ala

Leu

Pro

Leu Cys Leu Arg

Ala

Ala

1

5

10

15

Leu

Ala

Ala

Ile Ala Ser Ala Ala

His

Ala

Asp Asp Gly

Thr

Ile

Val

20

25

30

axyricu.ni pepxio w

Ile

Thr

Gly

Thr

Ile Thr Asp

Thr

Thr

Cys Val

Ile

Glu

Asp

Pro

Ala

35

40

45

Gly

Pro

Thr

His

Thr Lys Val

Val

Gin

Leu

Pro

Lys

Ile

Ser

Lys

Ser

50

55

60

Ala

Leu

Ala

Lys

Asp Gly Asp

Glu

Ala

Gly Arg

Thr

Pro

Phe

Leu

Ile

65

70

75

80

Thr

Leu

Lys Asp

Cys Pro Ser

Ser

Leu

Asn

Asn

Gly

Val

Lys

Ala

Tyr

85

90

95

Phe

Glu

Pro Gly

Pro Thr Thr

Asp

Tyr

Ala

Thr

Gly Asp

Leu

Lys

Ala

100

105

110

-18CZ 285307 B6

Tyr Ser Ile Ala Tyr Asn Asn Asn Pro Ala Thr Thr Gin Asn Ala Ile

115 120 125

Ile Ala Ala Ser Glu Ala Gin Gly Val Gin Ile Arg Ile Ser Asn Gin

130 135 140

Asn

Gly

Thr

Lys Ile

Pro

Met

Gly

Val

Asp

Ala

Ala

Ala

Gin

Asn

Ala

145

150

155

160

Gin

Ala

Phe

Asn Pro

Val

Thr

Asp

Thr

Ala

Asp

Asn

Ala

Lys

Lys

Lys

165

170

175

Val

Thr

Leu

Arg Tyr

Leu

Ala

Ser

Tyr

Val

Lys Lys

Ser

Gly

Asn

Ile

180

185

190

Thr

Ala

Gly

Gin Leu

Thr

Thr Tyr

Val

Gly

Phe

Ser

Met

Ile

Tyr

Pro

195

200

205

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 621 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Bordetella bronchiseptica (B) KMEN: 401 (vii) KONKRÉTNÍ ZDROJ:

(B) KLON: E. coli PC 2495 (pIVB 3^430) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS fim3 (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 621 (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 5:

-19CZ 285307 B6

ATC TCC AAG TCT TCA TAC CCC GCC TTC OGC ACC GOG CIT ATC CIT GCC43

Met Ser Lys Phe Ser Tyr Pro Ala Leu Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala

1015

GCC TOG CCC GTC CIG COG GOG CAT GCC AAC GAT GGC ACC ATC GTC ATC96

Ala Ser Pro Val Leu Pro Ala His Ala Asn Asp Gly Thr Ile Val Ile

2530

ACC GGC AGC ATC TCC GAC CAG ACC TGC GTC ATC GAA GAG CCC AGC GCC144

Thr Gly Ser Ile Ser Asp Gin Thr Cys Val Ile Glu Glu Pro SerAla

4045

CCC AAC CAT ATC AAG GTC GIG CAA CIG CCC AAG ATT TCC AAG AAC GOG192

Pro Asn His Ile Lys Val Val Gin Leu Pro Lys Ile Ser Lys AsnAla

5560

CTC AGG AAC GAC GGC

GAC

ACC

GCC

GGC

GCC

AOG

CCC

TTC

GAC

ATC

AGG

240

Leu Arg Asn Asp Gly

Asp

Thr

Ala

Gly

Ala

Thr

Pro

Fhe

Asp

Ile

Arg

65

70 i

75

80

CIG AAG GAA TGC CCC

CAG

CTG

GGC

GOG

CTC

AAG

CIG

TAT

TTC

GAG

CCC

288

Leu Lys Glu Cys Pro

Gin

Leu

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

Tyr

Phe

Glu

Pro

85

90

95

GGC ATC ACC ACC AAC

TAC

GAC

ACC

GGC

GAT

CTG

ATC

GCC

TAC

AAG

CAG

336

Gly Ile Thr Thr Asn

Tyr

Asp

Thr

Gly

Asp

Leu

Ile

Ala

Tyr

Lys

Gin

100

105

110

GCC TAC AAC GCA TCC

GGC

AAC

GGC

AAC

CIG

AGC

ACC

GIG

TOG

TCC

GCC

384

Ala Tyr Asn Ala Ser

Gly

Asn

Gly

Asn

Leu

Ser

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

115 120 125

ACC AAG GCC AAG GGC GIG GAA TTC OGC CIG GCC AAC CTC AAC GGC CAG432

Thr Lys Ala Lys Gly Val Glu Phe Arg Leu Ala Asn Leu Asn GlyGin

130 135140

CAC ATC OGC ATG GGC ACC GAC GAA ACC AGG CAA GCC GOG CAA ACC TTC480

His Ile Arg Met Gly Thr Asp Glu Thr Thr Gin Ala Ala Gin ThrRie

145 150 155160

-20CZ 285307 B6

ATC GGC ACT GAT GTC ACC AAC GGC GGC AAC ACC ACC AAA AGC TAT ACC528

Thr Gly Ihr Asp Val Thr Asn Gly Gly Asn Thr Ihr Lys Ser iyr Thr

165 170175

CIG TCC TAT CTC GCC TTC TAC GTC AAG AAA CCC AAC GAA GAT GTC GAC576

Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Tyr Val Lys Lys Pro Asn Glu Asp Val Asp

180 185190

GTC GTC CAG ATG ACC AGC TAC GTC GGC TTT TCC GTC GTC TAT CCC

Ala Ala Gin Met Ihr Ser T/r Val Gly Phe Ser Val Val iyr Pro

195 200205

621

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6.

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 207 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ío (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 6:

Met

Ser Lys Phe Ser Tyr Pro Ala

Leu Arg

Thr Ala

Leu

Ile

Leu

Ala

1

5

10

15

Ala

Ser

Pro

Val Leu Pro Ala

His

Ala

Asn

Asp Gly

Thr

Ile

Val

Ile

20

25

30

signaxní

peptid <

Thr

Gly

Ser

Ile Ser Asp Gin

Thr

Cys

Val

Ile

Glu

Glu

Pro

Ser

Ala

35

40

45

Pro

Asn

His

Ile Lys Val Val

Gin

Leu

Pro

Lys

Ile

Ser

Lys

Asn

Ala

50

55

60

Leu

Arg

Asn

Asp Gly Asp Thr

Ala

Gly

Ala

Thr

Pro

Phe

Asp

Ile

Arg

65

70

75

80

Leu

Lys

Glu

Cys Pro Gin Leu

Gly Ala

Leu

Lys

Leu

Tyr

Phe

Glu

Pro

90 95

-21CZ 285307 B6

Gly Ile Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Gly Asp Leu Ile Ala Tyr Lys Gin

100 105110

Ala Tyr Asn Ala Ser Gly Asn Gly Asn Leu Ser Thr val Ser Ser Ala

115 120125

Thr Lys Ala Lys Gly Val Glu Phe Arg Leu Ala Asn Leu Asn Gly Gin 130 135

His Ile Arg Met Gly Thr Asp Glu Thr Thr Gin Ala Ala Gin Thr Phe

145 150 155160

Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Gly Gly Asn Thr Thr Lys Ser Tyr Thr

165 170175

Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Tyr Val Lys Lys Pro Asn Glu Asp Val Asp 180 185 190

Ala Ala Gin Met Thr Ser Tyr Val Gly Phe Ser Val Val Tyr Pro

195 200205

Claims (3)

1. Polypeptid mající imunogenní vlastnosti proteinu fímbrií Bordetella bronchiseptica a aminokyselinovou sekvenci odpovídající jedné ze sekvencí id. č. 2,4 nebo 6.

2. Rekombinantní polynukleotid schopný vyvolat expresi polypeptidu podle nároku 1, ktetý obsahuje vhodný vektor a polynukleotid, který má nukleotidovou sekvenci vybranou z DNA, jejíž nukleotidová sekvence odpovídá jedné ze sekvencí popsaných jako sekvence id. č. 1,3 nebo 5 nebo jejich funkčním ekvivalentům.

3. Vakcína proti infekci bakteriemi Bordetella bronchiseptica, vyznačující se tím, že obsahuje inertní nosič, jakož i efektivní množství polypeptidu podle nároku 1 nebo rekombinantního polynukleotidu podle nároku 2.