JPH08500734A

JPH08500734A - 気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ワクチン

Info

Publication number: JPH08500734A
Application number: JP6506121A
Authority: JP
Inventors: ハー．エム．サフェルコウル，パウル; ハーストラ，ウィレム
Original assignee: デュファルインターナショナルリサーチベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1992-08-18
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 1996-01-30
Also published as: CZ41095A3; EP0656948A1; EP0656948B1; RU2129611C1; NO950582L; RU95107705A; FI950740L; ATE263244T1; US6284256B1; SK281868B6; US5939064A; DE69333467D1; HUT70984A; SK21495A3; DE69333467T2; HU219819B; CA2142712A1; PL307505A1; FI113242B; WO1994004683A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、感受性動物（例えば、イヌ及びブタ）における気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）感染と戦うためのワクチンであって、気管支敗血症菌のふさタンパク質に典型的なタンパク質又はポリペプチドを含み、あるいはそのタンパク質又はポリペプチドをコーディングしているポリヌクレオチドをその一部としてもつ組換え体ポリヌクレオチドを含むワクチンに、そしてまた、そのタンパク質、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの調製に、関する。

Description

【発明の詳細な説明】気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）ワクチン本発明は、気管支敗血症菌（B.bronchiseptica）に特徴的なポリペプチドによる及び組換えDNA技術を使用したそれらの調製物による、イヌにおける気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）感染に対して保護的なワクチンに関する。ボルデテラ（Bordetella）属は、４つの種：ボルデテラ・ペルツシス百日咳菌(Bordetella pertussis(B.pertussis） )ボルデテラ・パラペルツシス（Bordetel la parapertussis(B.parapertussis ))、ボルデテラ・ブロンチセプチカ気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica(B.bronchiseptica))、及びボルデテラ・アビウム(Bordetella avium(B.avium))から成る。ボルデテラ(Bordetella)は、小さなグラム陰性球菌、偏性好気性、しばしば２極染色され、そしてチトクローム・オキシダーゼ陽性である。Bordet-Gengou培地上のコロニーは、バチルス・アビウムを除き溶血反応の領域により取り囲まれる。ボルデテラのすべての種は、癒着、増殖、臨床徴候、及び組織病因学に関して非常に類似した疾患を引き起こす。ヒト及び動物の小児は、ボルデテラによる感染に最もかかりやすい。ここでは、その疾患は、最も重症であり、そして死亡率は最も高い。気管支敗血症菌は、主に、実験動物、家畜及び野生動物並びにまれに場合によりヒトの病原体である。ウサギ、モルモット、ラット、非ヒト霊長類、イヌ、ブタ(swine)、ネコ、ウマ及びキツネは、しばしば、伝染して感染される。気管支敗血症菌は、最も顕著には、イヌにおいてケンネル咳、そして子豚における萎縮性鼻炎を引き起こす。イヌにおいては、この感染過程は、ほとんど、気管気管支の木に限定されており、そして線毛に接着した後の気管上皮上の増殖を特徴とする。この疾患の最も重度の徴候は、過剰気管粘液蓄積、嘔吐、肺病変及び体重の減少である。イヌは、乾いた、耳ざわりな空咳(dry,harsh hacking cough)をもつ。気管支敗血症菌による子豚の感染は、鼻甲介萎縮、鼻変形、肺炎及び体重増加量減少を特徴とする。気管支敗血症菌が萎縮性鼻炎の応答剤であるということが明らかに確立されているようであるが、かなりの証拠は、現在、パステウレラ・マルトシダ(P asteurella multocida )が主要な病原体であり、気管支敗血症菌はおそらく誘発又は日和見の役割を演じているということを示している。臨床徴候を伴わない報告されたキャリアの状態は、イヌ、ブタ及びウサギについて高い。幾つかの有害な因子がボルデテラ内で同定されている。これらは：百日咳毒素(pertussis toxin )、糸状血球凝集素(filamentoushemagglutinin)、ふさ(fimbri ae)、アデニレート・シクラーゼ(adenylate cyclase)、皮膚壊死毒素(dermonecr otic toxin)、気管毒素(tracheal toxin)、及び溶血素(hemolysin)を含む。これらの有害因子は、全ての種において発現されず、例えば、ボルデテラ・ペルツシスにおいて百日咳毒素をエンコードしている遺伝子は、ボルデテラ・パラペルツシス及び気管支敗血症菌の染色体のサイレント遺伝子として存在する。これらの有害な因子の他に、そのバクテリアの病因原性に関係するおそらくより多くの未だ同定されていない因子が存在する。ボルデテラ感染は、気管の線毛細胞に始まる。バクテリアの付着が感染の開始に前もって必要である。なぜなら、そうでなければ、その線毛のフラッシング作用が気管から他の粒子と共にそのバクテリアを除去するからである。線毛細胞へのボルデテラの付着は、血清学的に異なるふさ及び糸状血球凝集素（FHA）（しかしながら、FHAはボルデテラ・アビウムにおいて発見されていない。）により仲介物質される。ふさは、そのバクテリア細胞表面から延びる、同一サブユニット・タンパク質から成る毛様構造である。このFHAは、細胞外環境にも分泌される表面会合タンパク質であり、様々な赤血球を凝集させることができる。ふさ及びFHA発現の両方が、bvg座により調節される。但し、ベルデテラ・ペルツシスにおけるふさサブユニット遺伝子の発現は、そのふさサブユニット遺伝子の前の13-15シトシン残基のストレッチの長さのによっても影響される。有害なボルデテラのすべてが、それらの表面上に付着因子を発現し、一方、無害な株は発現しない。これらの付着が上記疾患の開始に不可欠であるので、これらは魅力的なワクチン成分である。本発明のもくていは、気管支敗血症菌感染に対する組換えDNAワクチンを提供することである。研究が付着因子(adhesion factors)に集中してきた。なぜなら、付着の防止が、付着因子に向けられる免疫応答の結果として、感染を防ぐであろうからである。気管支敗血症菌においては、幾つかの血清学的ふさ及びFHAが、そのバクテリアの、線毛気管上皮細胞への付着の原因である。宿主がその微生物の付着因子に対する免疫応答をもつとき、コロニー化が不可能となるであろう。これらのバクテリアは、いずれかの毒素が生産される前に殺されるであろうし、そして臨床徴候は顕出しないであろう。気管支敗血症菌のコロニー化を防ぐ本発明に係るワクチンは、好ましくは、できるかぎり多くの付着に必要な成分を含む。組換えワクチンは、サブユニット・ワクチンとして構築されることができる。しかしながら、多くの血清学的に異なるふさがどのように生産され、そしてそれぞれの因子（ふさ及びFHA）の付着における寄与が何であるかということは、知られていない。ワクチンの開発のために、すべての成分の付着に対する寄与を別々に調査する必要がある。問題のタンパク質は、好適な微生物内での過剰生産の後にサブユニット・ワクチンとして使用されるとができる。本発明に従って、気管支敗血症菌の付着因子をコーディングしている３つの異なるサブユニット遺伝子が単離され、そして特徴付けされる。従って、本発明は、配列番号２、４又は６から選ばれたアミノ酸配列の中の１の少なくとも一部をもつ、気管支敗血症菌のふさタンパク質又はポリペプチドふさタンパク質断片（ふさポリペプチド）の実質的に純粋な調製物に関する。さらに、本発明は、ふさタンパク質及びポリペプチドだけではなく、配列番号１−３のDNA及びそれらの断片、並びにそのＤＮＡ及びそれらの断片とハイブリダイズし且つ気管支敗血症菌のふさタンパク質の特性をもつポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、にも関する。本発明は、気管支敗血症菌のふさタンパク質の免疫原の特性をもつポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであって、配列番号１、３若しくは５の又はその断片のあるいは上記のハイブリダイズするポリヌクレオチドの、DNAのコドンの少なくとも一部が、同一アミノ酸のための別のコドンにより置換されているものにも関する。上記ふさタンパク質及びそれらの誘導だれたポリペプチドは、気管支敗血症菌に対して免疫応答を顕出させることができる。小さな抗原はしばしば免疫原として無効である。それ故、このふさタンパク質又はポリペプチドは、ヘモポリマー（多数の同一のふさタンパク質が結合したもの）として又はヘテロポリマー（１以上の異なるふさポリペプチドに結合した、又は気管支敗血症菌又は他の病原体に特徴的な１以上の異なるポリペプチドに結合した、１以上のふさポリペプチド）として調製されることができ、又は免疫原性を強化するために１以上の他の化合物に結合されることができる。本発明に従って、先に述べたような変更のいずれかにおける、ふさポリペプチドは、組換えDNA技術により調製されることができ、又は合成により、例えば、均質又は固体状態のポリペプチド合成により、調製されることができる。好適な免疫原性のふさポリペプチドの特定のアミノ酸配列は、配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列から、そして場合により、そのふさタンパク質の空間的な配置からも、誘導されることができる。多くの方法が、免疫学的に重要なタンパク質上エピトープの位置を予言するために開発されてきた。この組み合わせ予言の結果は、抗原部位の良好な予測を与える。好適なふさポリペプチドは、例えば、Hopp and Woods[T.P. Hoppand K.R.Wood s(1981): Proc.Natl.Acad.Sci, USA.78, 3824-3828]により記載された技術を応用することにより、そのふさタンパク質の最も親水性の部分から選択されることができる。このようなポリペプチドを選択するための他の好適な方法は、Chou a nd Fasman[P.Y.Chou and G.D.Fasman(1987)Advances in Enzymology47,45-148] により記載されている。様々な追加のアルゴリズム、例えば、そのポリペプチド鎖の柔軟性の予言[P.A .Karplus and G.E．Schultz,1985.Naturwissenshaften72,212-213]、P.Y.Chou an d G.D.Fasman,1979[Biophys.J.26,367-385]に記載の気管支敗血症菌ふさタンパク質のベーターターン可能性プロフィール、Gascuel,0 and J.L．Golmard,1988[ CABIOS4,357-365]に記載の気管支敗血症菌ふさタンパク質の配列についての３つの配置における可能性性プロフィール、J.Novotny and C. Auffray,1984[Nucleic Acids Research 12,243-255]に記載の気管支敗血症菌ふさタンパク質の配列の二次構造の予言が、気管支敗血症菌のふさタンパク質における抗原性として重要な領域を最終的に予言するために使用されることができる。関連エピトープの位置についての追加の情報は、Geysen andMeloen[H.M.Geyse n,R.H.Meloen and S.J.Barteling(1984): Proc.Natl.Acad.Sci.,81(13);3998-40 02]により開発されたPEPSCAN法を使用して得られることができる。この方法は、酵素結合イムノソルベント検定法において反応するのに十分な長さの合成ペプチドを使用する。これらのペプチドは、所定のDNA配列に従って合成される。それらは、第一ペプチドがアミノ酸番号1-9をカバーし、第二ペプチドがアミノ酸番号2-10等をカバーするという事実を特徴とする。それぞれのペプチドは、抗血清又はモノクロナール抗体とのその反応性についてテストされる。反応性ペプチドは次に免疫原性エピトープを表さなければならない。さらに、免疫反応性エピトープを同定するために（そしてそれらの反応性とそのふさタンパク質の物理的マップとを関連付けるために）そのふさタンパク質遺伝子からのDNA断片を好適なプラスミド、例えば、pEXプラスミド[K. Stanley and J. P. Luzio, 1984. EMBO J. 3，1429-1434，及びJ．G．Kusters，E．J．Jager and B．A．M．Van derZeijst，1989．Nucl．Acids Res．，17，8007］内で発現させることができる。この系においては、異種発現は、cro−β−ガラクトシダーゼ・ハイブリッド・タンパク質のＣ−末端伸長の合成を導く。ふさタンパク質 DNA配列内の制限エンドヌクレアーゼ部位は、pEXプラスミド内への挿入のためのそのふさタンパク質遺伝子の断片を得るために使用されることができる。このふさタンパク質の異なる重複領域から得られる融合タンパク質を合成するpEXクローンは次にさらなる特徴付けのために使用される。ふさタンパク質断片をエンコードしている pEXを精製し、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により分画し、そしてニトロセルロース膜にブロットする。これらの膜を次に気管支敗血症菌に対するブタ又はイヌ免疫からの血清と反応させる。免疫反応性エピトープを含む断片だけがこれらの血清と反応する。このエピトープの最小長さを線引きするために、それらの反応クローンのDNA挿入物をエンドヌクレアーゼ111消化により、又はそのふさタンパク質の小さい重複部分をエンコードしている合成オリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、だんだんに短くすることができる[J．G．Kusters， E．J．Jager，G．Koch，J．A．Lenstra，W．P．A．Posthumus，R．H．Meloen an d B．A．M．Van derZeijst，1989．J．Immunol．，143，2692-2698]。次にこれらのエピトープをそれらの保護的効果についてテストすることができる。本発明の特定の態様に従えば、ふさ−タンパク質−特異的ポリペプチドは、組換えポリヌクレオチドの部分を形成するポリヌクレオチド配列番号１、３又は５の少なくとも一部をもつポリヌクレオチドの発現により生産される。これらの組換えポリヌクレオチドは、好ましくは、その内に挿入された気管支敗血症菌−特異的ポリヌクレオチド断片をもつベクターに基くことができる。好適なベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルス、ミニクロモソーム又は安定組み込みベクター；特に植物又は動物細胞のための後者である。一般的に、これらのベクターは、宿主細胞の遺伝子材料内にそれらを挿入し且つその宿主の遺伝子材料と共に複製する安定組み込みベクターを除き、自己複製の特性をもつ。好適な宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれか、例えば、バクテリア、酵母、マイコプラズマ、藻類、植物細胞又は動物細胞であることができ；その植物細胞又は動物細胞はインビトロにおいて培養されることができ又はそれぞれ無傷の植物又は動物の部分を形成することができる。組換えポリヌクレオチドは、挿入物としてふさタンパク質をコーディングしている完全ポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。この挿入物は、単一のコーディング配列、又は同一のコーディング配列の多数のコピー、又は少なくとも１のふさタンパク質コーディング配列及び少なくとも１の第二配列、例えば、そのふさタンパク質コーディング配列の異なる部分を含むハイブリッド・ポリヌクレオチド又は他の病原体に特徴的なタンパク質を若しくは少なくとも１の小さなふさ-ポリペプチドのための担体として機能する不活性タンパク質をコーディングしているポリヌクレオチドを、含んで成ることができる。先の態様の特定のケースは、いわゆるベクター・ワクチンとして直接的に有用な、ウイルス・ベクターによる組換えポリヌクレオチドに関する。この目的のために利用できるウイルスは、免疫感作されるべき動物内、すなわちイヌ及び／又はブタ内で複製する能力をもたなければならない。さらにこれらのウイルスは、種痘された動物内でも発現されることができる（例えば、気管支敗血症菌−ふさタンパク質又はポリペプチドをコーディングしている）外来遺伝子の挿入に好適なゲノム領域を有していなけらばならない。この目的のために好適なウイルスは、例えば、腸内ウイルス、例えば、特定のアデノ・ウイルスである。先に示したように、本発明に係る、タンパク質及びポリペプチド、並びに組換えポリヌクレオチドは、ワクチンの調製において有用である。これ故、また、これらのワクチンは、本発明の一部を形成する。本発明の特定の用途は、バクテリア・ベクター・ワクチンに関する。ここで、イヌ及び／又はブタにコロニー化することができるバクテリアが、それが気管支敗血症菌に対する免疫原性応答を導くであろうような方法で、それらにふさタンパク質又はふさポリペプチドを発現せしめるために、形質転換される。この目的に好適なバクテリアは、例えば、サルモネラ菌である。本発明に係るワクチンは、補助的なワクチン構成成分、例えば、担体、バッファー、安定剤、可溶化剤、アジュバント及び保存剤をも含むことができる。有利には、これらのワクチンは、適用に先立って好適な液体（水、バッファー）の添加により再構築される凍結乾燥生成物である。このワクチンを、例えば、経口的に、鼻内に又は筋中に適用することができる。このワクチンは、さらに、免疫感作されるべき動物（イヌ及びブタ）のための他の免疫原、例えば、ウイルス、例えば、仮性狂犬病ウイルス(pseudorabies v irus)、インフルエンザ・ウイルス、伝播性胃腸炎ウイルス、パルボ・ウイルス( parvo virus)、ブタ伝染性下痢ウイルス、ブタ・コレラ・ウイルスに特徴的な免疫原性材料、又はマイコプラズマ、例えば、マイコプラズマ・ハイポニューモニアエ(Mycoplasma hypopneumoniae)及びマイコプラズマ・リオニリス（Mycopl asma lyorhinis)に特徴的な免疫原性材料、又はバクテリア、例えば、大腸菌(E scherichia coli)、レプトスピラ(leptospira)、アクチノバチルス・プレウロニューモニアエ(Actinobacilluspleuropneumoniae）、パスツーレラ・マルトシダ(Pasteurellamultocida)、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis )、トレポネマ・ヒオディセンテリアエ（Treponema hyodysenteriae）に特徴的な免疫原性材料を、含む。本発明を以下の作業実施例により説明する。実施例１FIMX遺伝子の特徴付け材料及び方法バクテリア株、培地及び培養条件使用したすべてのバクテリア株を表１中に列記する。すべてのボルデテラ株を、１%グリセロール及び20%脱フィブリン化ヒツジ血液を補ったBordet-Gengou寒天（Difco Laboratories，Detroit，MI）上又はトリプトース・ホスファネート・ブロス（TPB）（Difco Laboratories，Detroit，M I）中で増殖させた。有害遺伝子の発現を抑制するために、その培地に20mモル/l MgS0₄を補った。気管支敗血症菌株401をDNA調製のために使用する。大腸菌（E scherichia coli）株PC2495をベクターBluescript（Stratagene）及びその誘導体の増幅のために使用した。株PC2495をLureano-Bertoni（LB）ブイヨン又はLB 寒天上で増殖させた。アンピシリン（50-100μｇ／ｍlそれぞれ）、50μｇ／ｍl の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドールイル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal）及び20μｇ／ｍｌのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）をDNA挿入物を担持する株を含むプラスミドを同定するために使用した。すべてのバクテリア・カルチャーを16-24 時間37℃において増殖させた。組換えDNA法染色体DNAをManiatis et al.［T. Maniatis, E.F. Fritsch andJ.Sambrook 1 982.Molecular cloning: A Laboratory Manual．Cold Spring Harbor，Ne w York： Cold Spring Harbor LaboratoryPress］により記載されたようにボルデテラ株から単離した。消化後、DNA電気泳動を１μg/mlの臭化エチジウムを含むTAEバッファー（40mモル/l Tris-アセテート、2mモル／l EDTA）中の1%アガロース・ゲル中で行った。Genecleanキットをアガロース・ゲルからDNA断片を単離するために使用した（Bio Inc．101 Corp.，La Jolla）。オリゴヌクレオチドの末端標識付けをT4ポリヌクレオチド・キナーゼ［Maniatis et al．］を使用して［ γ- ³²P］dATPにより行った。ハイブリダイゼーションを5 x S SPE、5 x Denhardt'ｓ溶液、0.1% SDS及び100μg/mlニシン精子DNA中で55℃において行った。ブロットを55℃において5 x SSPE及び0.1% SDSにより洗浄した。サザン・ブロット分析気管支敗血症菌株401の染色対するDNAを精製し、そして幾つかの制限酵素により消化した。断片を電気泳動により分離し、ナイロン膜に転移させ、そしてボルデテラ・ペルツシスのfim xふさサブユニット遺伝子から得られたDNAプローブとハイブリダイズさせたハイブリダイゼーション・シグナルから同定された問題の DNA断片をGene Cleanキット（Bio Inc．101 Corp.，La Jolla）により単離した。Bluescriptベクター（Stratagene）内へのライゲーションの後、その染色体DNA断片を大腸菌（Escherichia coli）株PC2495に、CaCl₂法［Dagert．M.，a nd Ehrlich，S．D．1979.塩化カルシウム中での延長インキュベーションは、大腸菌（Escherichia coli）細胞のコンピテンスを改善する。Gene 6:23-28］］に従って形質転換させた。陽性コロニーをハイブリダイゼーション後に同定した。ヌクレオチド配列決定プラスミドをアルカリ溶解法［H.C.Birnboim and J.A.Doly 1979.A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinantplasmid DNA ．Nucleic Acids Res．7:1513-1523］に従って単離した。クローン化された挿入物のヌクレオチド配列を、T7ポリメラーゼ配列決定キット（Amersham）を使用して、ジデオキシ鎖終止法［F．Sanger，S．Nicklen，A.R. Coulson 1977．DNA sequencing with chain-terminating inhibitors．Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 74:5463ー5467］により決定した。DNA配列データの分析をPC/Gene スフトウェア（release 6.5, Genofit，Heidelberg S.A.，Geneva, Switzerland）により行った。部分的ふさ精製気管支敗血症菌株401 をトリプトース・ホスフェート寒天（DifcoLaboratorie s，Detroit, MI）上で増殖させた。このバクテリアを燐酸塩バッファー生理食塩水（PBS）中で洗浄した。このバクテリアのペレットを４モル/l尿を補った15m lの燐酸塩バッファー生理食塩水中に懸濁させた。この懸濁液を30分間40℃に置いた。このバクテリアを10分間20,000rpm（Beckman, JA20 rotor）における遠心分離によりその懸濁液から取り出した。ふさを16時間40,000rpm（Beckmanultrac entrifuge, Ti60 rotor）における遠心分離の後その上清から単離した。次にこのペレットを5mlの燐酸塩バッファー生理食塩水中に懸濁させた。タンパク質濃度をビシンコニン酸（BCA）検定により測定した（Pierce Chemical Company, USA）。タンパク質分析を15%SDS- ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動装置上で行った。結果バルデテラ・ペルツシスのfim X遺伝子から得られたBamHl-EcoRlDNA断片をプローブとして使用し、fim 遺伝子を含む気管支敗血症菌の染色体DNA 断片を同定した。このfim Xプローブにハイブリダイズする気管支敗血症菌からの1.3kb Pts I DNAを単離し、そして配列決定した。この断片上に、その遺伝子の前にプロモーター配列を含む完全fim X遺伝子を単離した（配列番号１）。この完全fim X 遺伝子を含むプラスミドpIVB 3-420を含む大腸菌（E.coli）PC 2495を、寄託番号CBS 364.92の下、1992年8月13日にCentraalbureau voor Schi mmelcultures at Baarn, the Netherlandsに寄託した。気管支敗血症菌のfim X遺伝子の発現 fim X生成物を同定するために、このfim X 遺伝子を発現することができない欠失突然変異株を構築した。この突然変異株を遺伝子置換により構築した。この末端に、気管支敗血症菌fim X遺伝子の中心EcoRV断片をカナマイシン遺伝子により置き換え、そしてBluescriptベクター内でクローン化した。この構築物を気管支敗血症菌内の遺伝子置換のために使用した（図１）。カナマイシン耐性突然変異株を同定した。この株は、もはや上記EcoRV断片とはハイブリダイズしなかった。この突然変異株から、部分的に精製されたふさを調製した。野生型株に比べてfim X陰性株からのふさのこの精製は、そのfim X遺伝子が気管支敗血症菌において高いレベルにおいて発現されていることをはっきりと示している（図２）。実施例２気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）のfim2及びfim3ふさサブユニット遺伝子の特徴付け材料及び方法バクテリア株、プラスミド及び培養条件使用した野生型気管支敗血症菌株をケンネル咳を患うイヌから単離した。この株をDr.J.M.Musserから得て（株番号685）、そして第401号と命名した。この株をトリプトース・ホスフェート・ブロス又は寒天（Difco laboratories,Detroit ,MI）内で増殖させた。気管支敗血症菌株Wellcome 28[A.Robinson，L.A.E.Ashwo rth,A．Baskerville，and L.I.Irons.1085．Proceedings of the 4thInternatio nal Symposium on pertussis, Geneva, 1984. Dev. Biol.Stand. 61:165-17 2］をBordet Genou寒天（Difco Laboratories,Detroit, MI）上で増殖させた。無害気管支敗血症菌のために、培養培地に20mモル／ｌ MgS0 ₄を補った。大腸菌（E.coli）Kl2株PC2495をクローニング・ベクターpBluescriptのための宿主として使用した。この大腸菌（E.coli）株を、100μｇ／ml amp．；クローン化DNA 断片を含む組換え体株の同定のための50μｇ／ml X-Gal及び20μｇ／mlIPTGを補ったLB寒天又はLBブイヨン上で増殖させた。すべてのバクテリア・カルチャーを 16-48 時間37℃において増殖させた。 DNA単離及びヌクレオチド配列決定染色体DNAの単離をManiatis et alに従って行った。ラスミドの単離をBirnboi m and Dolyにより行った。染色体DNA断片を、GeneClean Kit（Bio Inc.101 Corp .,La Jolla）を使用してTAE（40mモル／1Tris-アセテート、2mモル／l EDTA）アガロース・ゲルから単離した。DNA 断片をすべてのクローニング目的のためにpBluescriptKS M13 +及びM13-（Stratagene,La Jolla,CA）内でライゲートした。ヌクレオチド配列決定を、T7ポリメラーゼ配列決定キット（Amersham）を使用して、Sanger et alのジデオキシ鎖終止法により行った。PC／Geneコンピューティング・ソフトウェア（release 6.5,Genofit，Heidelberg S.A., Geneva, Switze rland）をDNA配列データの分析のために使用した。制限酵素及びT4 DNAリガーゼをPharmaciaから購入し、そして製造者の指示に従って使用した。プラスミドをD agertand EhrichのCaCl₂ 法により大腸菌（E.coli）株PC2495に形質転換させた。サザン・ブロット分析サザン・ブロッティングをManiatis et alに従って行った。 SDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動及び免疫学的技術 SDS-PAGE及びウェスタン・ブロット分析のために、等量のバクテリアを使用した。バクテリアを燐酸塩バッファー生理食塩水（PBS）中に収穫し、そしてOD₆₀₀ ＝1.0まで希釈した。この懸濁液から、50μl を20μl のLaemmli バッファー中に溶解させ、Laemmli［Laemmli，U.K. 1970．バクテリオファージT4の頭部の組み立ての間の構造タンパク質の解裂Nａture 227:680-685］により記載された1 5%ポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動にかけた。ニトロセルロースへのタンパク質の転移を本質的に、van Embden et al［J.D.A. van Embden，H.J. van der Donk，H.J. van Eijk, H.G. van der Heide, J.A. deJong, M.F. van Olderen, A.D. Osterhaus, L.M. Schouls，1983.大腸菌（Escherichia coli)K12 内でのトレポネマ・パリダム（Treponema pallidum）の分子クローニング及び発現Infect. Immun．42:187-196］により記載されたように行った。ボルデテラ・ペルツシスからのSDS-変性血清型2又は3ふさサブユニット・タンパク質に対して作ったポリクロナール抗体を、気管支敗血症菌ふさサブユニット・タンパク質の検出のために使用した。ボルデテラ・ペルツシスに対して生じたfim2及びfim３特異的モノクロナール抗体を、全バクテリアによりコートされた平底マイクロタイター・プレート上の ELISAにおいて使用した（OD₆₀₀ ＝1.0、15mモル／l Na ₂ C0_３、35mモル／l Na co ₃ 、pH 9.6中1:10希釈）。結合したヤギ抗- マウスIgG-ペルオキシダーゼ結合体（Nordic）を2,2'-アジノ-bis（3- エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）（Sigma）により測定した。吸光度を405nｍにおいて測定した。電子顕微鏡電子顕微鏡のために、気管支敗血症菌カルチャーをPBSバッファー中に希釈した。Pilioformコートされた銅グリッドを５分間50μ１のバクテリア懸濁液上に置いた。グリッドをH ₂ O中で２回洗浄した。染色を1%TPA（タングストホスホン酸，Merck）中で２分間行った。このグリッドをPhilips EM201電子顕微鏡内で検査した。結果fim2及びfim3ふさサブユニット遺伝子のヌクレオチド配列気管支敗血症菌のfim2及びfim3サブユニット遺伝子はそれぞれ、ベルデテラ・ペルチシスとのそれらの相同性に基づき同定されることができた。1000塩基対のAccI-PstI DNA断片をfim2遺伝子のためのプローブとして使用した［I. Livey, C.J. Duggleby, and A.Robinson. 1987．ボルデテラ・ペルツシスの血清型２ふさサブユニット遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列Mol. Microb. 1:2 03-209］。900塩基対のSalI DNA断片をfim3遺伝子のためのプローブとひて使用した［Mooi,F.R.,,A.ter Avest,and H.G.J.van derHeide.1990.血清型３ふさサブユニットをコーディングしているボルデテラ・ペルツシスの構造FEMS Microb. Lett.66:327-332］。制限エンドヌクレアーゼPstIにより消化された気管支敗血症菌からの染色体DNAのハイブリダイゼーションは、この２つのプローブ間の相同性のために両方のプローブとの幾つかの陽性シグナルを作り出した。DNA 断片の２つの領域をfim2又はfim3プローブのいずれかにより最も強いシグナルを与える気管支敗血症菌の染色体DNAから単離した。約2.3kb及び2.8kbのこれらのP stI DNA断片を、それぞれBluescriptベクター内にクローン化した。形質転換及びコロニー拾いの後、２つのクローンをこれらのfimプローブのいずれかとのハイブリダイゼーションにより同定した。2.3kbの挿入物をもつ１つのクローンは、fim2（pIVB3-402）遺伝子をエンコードしていた。2.8kbの挿入物をもつ他のクローンは、気管支敗血症菌のfim3（pIVB3-430）遺伝子をエンコードしていた。両方の遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、そしてそれぞれ配列番号3（fim2）及び配列番号5（fim3）として表す。大腸菌（E.coli）バクテリアPC2495（pIVB3 -402）及びPC2495（pIVB3-430）をそれぞれ寄託番号CBS 362.92及びCBS 361.92 の下1992年8月13日にCentraalbureau voor Schimmelcultures atBaarn,The Neth erlandsに寄託した。実施例３ふさの１タイプの生産において欠陥のある２つの気管支敗血症菌（Bordetella b ronchiseptica）株の構築 FimXふさ（BbfX^-）又はFim2ふさ（Bbf2^-）の生産において欠陥をもつ気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）株を構築した。これを、相同的組換えの後のその破壊された遺伝子による遺伝子置換により得た。この破壊遺伝子をエレクトロポレーシヨンにより気管支敗血症菌に形質転換した。このふさサブユニット遺伝子内の欠失を、カナマイシン耐性遺伝子による野生型遺伝子内のEcoRV断片の置換により構築した。材料及び方法バクテリア株、プラスミド及び培養条件野生型気管支敗血症菌株401をすべての実験において使用した。このバクテリアをDr.J.M.Musserから得た（株番号685）。この株を、15%新鮮ヤギ赤血球を補ったトリプトース・ホスフェート寒天（TPA）（Difco laboratories）上又はBor det Genou（BG）寒天（DifcoLaboratories）上で24-48時間37℃において増殖させた。クローニング目的のために、大腸菌（Escherichia coli） Kl2株PC2495 をBluescript KS及びSKプラスミド（Stratagene）と共に使用した。大腸菌（E.c oli） PC2495を、適当な抗生物質を含むLuria Bertoni寒天上で16時間37℃において増殖させた。アンピシリン及び／又はカナマイシンのついて、100μｇ／mlの濃度を使用した。組換えDNA技術クローニング手順をManiatis et alにより記載されたように行った。隣接配列を含むそれぞれのふさサブユニット遺伝子をBluescriptベクター内でクローン化した。これらのベクターをBirnboim andDolyのアルカリ抽出法により単離した。サブユニット遺伝子内のDNA断片をカナマイシン耐性遺伝子により置き換えた［A .Labigne-Roussel,J.Harel，and L.Tompkins.1987,Gene transfer fromEscheric hia coli to Campylobactor species: Developmant ofshuttle vectors for g enetic analysis of Campylobactor jejuni,J.Bacteriol.169:5320-5323］。この後者の構築物をエレクトロポレーション実験において使用した。エレクトロポレーション実験エレクトロポレーシヨンを本質的に、Miller et al．［J.F.Miller,W.J.Dower ,and L.S.Tompkins．1988．High-voltage electroporationof bacteria： Gen etic transformation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:856-860］。野生型気管支敗血症菌株401をBG寒天上で16時間増殖させた。この細胞をlmlの15%グリセロール-27 2mモル／1シュクロース溶液（GlySuc）（0℃）中に収穫し、洗浄し、そして400 μl GlySuc中に再懸濁させた。この懸濁液から、50μlのアリコットを-80℃において凍結させた。これらのアリコットをアクア・デスト（aqua dest）中の1-3μ ｇ DNAにより気管支敗血症菌を形質転換するためのエレクトロポレーション実験において使用した。使用したエレクトロポレーシヨン条件は：0.7kV、25μF及び600Ω（Biorad Gene Pulser,using0.56mm gap cuvettes from Biotechnologie s and ExperimentalResearch Inc.,San Diego，CA）。測定した時間定数を3 .5-7msの間にあった。細胞を1mlのトリプトース・ホスフェート・ブロス（Difco Laboratories）中に90分間37℃において回収し、そして100μｇ／mlカナマイシンを含むTPA（Difco Laboratories）上にプレートした。組換え体株の配列決定を染色体DNA調製物上のサザン・ブロッティングにより行った。染色体DNA 精製及びサザン・ブロット分析染色体DNAをManiatis et alに従って精製した。サザン・ブロット分析を先に記載したように行った。ハイブリダイゼーション実験において使用されたDNAプローブfimX遺伝子に関するハイブリダイゼーション実験のために、２つのプローブを使用し、fXEv及びf3SEと命名した。プローブfXEvとして使用された450塩基対のDNA断片を制限エンドヌクレーゼEcoRVによるpIVB3-426の消化から単離した（図３）。プローブf3SE の 580塩基対のDNA断片を制限エンドヌクレアーゼSphl及びEcoRIによるpIVB3-430 の消化の後に得た（図４）。fim2遺伝子に関するハイブリダイゼーション実験のために、３つのプローブを使用し、f2Ev、 kana及びf2PEと命名した（図５）。プローブf2Evは、pIVB3-417から単離された9 00塩基対のEcoRV DNA断片であり、プロープkanaは、カナマイシン遺伝子内の90 0塩基対のEcoRV DNA断片であり、そしてプローブf2PEは、pIVB3-417の610塩基対のPstI-EcoRV DNA断片であった。結果 fimX又はfim2ふさサブユニット遺伝子を含むDNA断片をもつ２つのプラスミドをエレクトロポレーションにより気管支敗血症菌バクテリアを形質転換するために使用した。両方のサブユニットの遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子によるEc oRV DNA断片の置換により破壊された。これが行われることができる前に、Blue scriptベクターのポリリンカー内に存在する第三のEcoRV部位が除去されていた。これを、EcoRV Bluescriptベクター内にDNA断片をサブクローニングすることにより行い、fimXのためのpIVB3-426及びfim2のためのpIVB3-417をもたらした（図３、５）。次に両方のクローンを制限エンドヌクレアーゼEcoRVにより消化した。この消化により、450塩基対の断片をその５’プロモーター配列を含むfimX 遺伝子クローン（pIVB3-426）から除去した（図３）。このEcoRV断片を除去した後、残りのDNA配列をもつベクターを単離し、そしてカナマイシン耐性遺伝子を含む1.4kbのSmaI-HincII DNA断片をそのEcoRV部位内にクローン化した。大腸菌（E.coli） PC2495への形質転換その後のプラスミド単離は、クローンpIVB3-427 を産生した（図３）。同一の戦略をfim2ふさサブユニット遺伝子のために続けた。制限エンドヌクレーゼEcoRVによるクローンpIVB3-417の消化（図５）は、隣接配列と共にその遺伝子の３’部分に向かって900塩基対のDNA断片を除去した。この構築におけるカナマイシン耐性遺伝子のライゲーシヨンはクローンpIVB3-418 を産生した（図５）。両方のプラスミド（pIVB3-427及びpIVB3-418）を単離し、そして気管支敗血症菌を形質転換するためのエレクトロポレーシヨン実験において別々に使用した。それぞれのエレクトロポレーション実験の後、10²までのカナマイシン耐性気管支敗血症菌コロニーを観察した。プラスミドpIVB3-427（部分的fimXふさサブユニット遺伝子）によるエレクトロポレーションの後、４コロニーを分析した（fX I -IV）。プラスミドpIVB3-418（部分的fim2ふさサブユニット遺伝子）によるエレクトロポレーションの後、７コロニーを分析した（f2I-VII）。染色体DNAをカナマイシン耐性気管支敗血症菌株から単離し、そしてそれぞれPatI及びEcoRV制限エンドヌクレーゼにより消化した。サザン・ハイブリダイゼーションをその消化された染色体DNAにより行い、カナマイシン耐性株及び野生型気管支敗血症菌株から単離した。pIVB3-427によるエレクトロポレーションの後に単離された４株の消化染色体DNAをそれぞれfXEv及びf3SEとハイブリダイズした（図３、４）。pIVB3-418によるエレクトロポレーションの後に単離された７株の消化染色体D NAをそれぞれf2Ev及びf2SEとハイブリダイズした（図５）。プローブfXEv及びf2 Evとのハイブリダイゼーション・パターンから、fimX（図6A、6B）又はfim2（図 7A、7B）のふさサブユニット遺伝子の一部のいずれかが消失した組換え株が単離されたことが明らかであった。プローブとしてのカナマイシン遺伝子とのハイブリダイゼーション実験から、fim2遺伝子について、単離されたすべての株（f2I- VII）がカナマイシン遺伝子を含んでいたことが証明された（図7C）。カナマイシン遺伝子がすべてのfim2組換え体株内に存在するため、遺伝子置換がそのサブユニット内の相同性のために他のふさサブユニット遺伝子の中の１の内で生じることができた。これが、その原因であるかどうかを決定するために、ハイブリダイゼーシヨン実験を、それより交差ハイブリダイゼーションが他のサブユニット遺伝子から得られたプローブを使用して観察されることができるであろう低ストリンジェント条件下で行った。f3SEプローブ（fim3サブユニット遺伝子）とのfimXカナマイシン耐性気管支敗血症菌株（fＸI-IV）上のハイブリダイゼーション実験は、そのふさサブユニット遺伝子内の遺伝子置換が株BdFX⁻内でのみ生じたことを証明した。この株並びに他の組換え体株（fX II-IV）内で、fim3及びfim2遺伝子を含むDNA 断片とのハイブリダイゼーション・シグナルが存在していた（図6C）。これらの後者が野生型気管支敗血症菌内のものと同じであるため。他のサブユニット遺伝子の中の１の内の組換えは生じなかった（図6C）。f2PEプローブとのfim2突然変異体株のハイブリダイゼーションは、fim2遺伝子内の遺伝子置換が株BbF2⁻内でのみ生じたことを示した（図7D）。このプローブの使用により、すべての３つのサブユニット遺伝子とのハイブリダイゼーション・シグナルが観察された。PstI -EcoRV断片（プローブf2PE）がエレクトロポレーションにおいて使用されたpIVB 3-418内に存在するため、第四のハイブリダイゼーション・シグナルがその組換え体株（f2II-VII）内で観察されることができる。これは、プラスミドpIVB3-41 8がカナマイシン耐性株内に未だ存在することができるということを示している。おそらく、組換えは、ふさサブユニット遺伝子の外の同定されていない位置においてその染色体内の他の場所に生じている。実施例４マウスにおける気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）突然変異体Bb fX⁻及びBbf2⁻による種痘挑戦材料及び方法それぞれ80マウスの３つの群（生後６週間のBALB/Cマウス）を野生型気管支敗血症菌BbfX^-及びBbf2^-（後者の２つを実施例２に従って調製した。それぞれ（各2 x 10e7 cfu））により鼻から感染させた。８マウスの気管内の生きたバアクテリアの数を特定の時間間隔（０、１、３、７、11 及び36日目）において測定した。それぞれのマウスの中で、鼻咽喉、鼻、気管及び肺を生きた気管支敗血症菌の存在について検査した。マウスを感染の約１時間後（０日目という）及びその後の様々な日にバルビツレート注射により殺した。肺及び気管を取り出し、そして組織グラインダーによりPBS中で均質化した。鼻綿棒をカットグット（cat gut）により取り出した。このカットグットを0.5m P BS中に入れ、５分間回転させた。鼻咽喉をPBSにより、５滴（約0.5ml）を集めるまで、濯いだ。すべての均質物及び鼻咽喉の滴の希釈物をトリプトース・ホスフェート寒天上にプレートし、そしてCFUを接種２日後に計数した。種痘の52日後に、上記群を、BbfX^-及びBbf2^-により種痘し、そして非種痘対照群を有害な気管支敗血症菌株により挑戦させた。気管のコロニー化を挑戦の０、１、４及び14日後に測定した。結果野生型株による両方の突然変異体株の気管上部のコロニー化の結果を比較した。野生型株と比較してBbfX^-及びBbf2^-突然変異体株による挑戦後の気管上部の様々な臓器のコロニー化において差異は存在しなかった。 36日目に、BbfX^-及びBbf2^-群のマウスをボルデテラの存在についてスクリーンした。肺及び気管はボルデテラを含まず、一方、少量のボルデテラが鼻及び鼻咽喉内に未だ存在した。種痘の52日目に、BbfX^-及びBbf2^-突然変異体及び対照群により種痘されたマウスを有害な気管支敗血症菌株により挑戦させた。有害な気管支敗血症菌株による鼻咽喉（nasopharynx）のコロニー化は両方の種痘群において防止されることができなかった。種痘群における野生型の肺及び気管のコロニー化は挑戦１時間後にだけ証明されることができ、一方、対照群はかなりコロニー化された。上記突然変異体株により種痘されたマウスの鼻のコロニー化は、０日目において、そしていくつかのマウスにおいて１日目においてだけ検出されることができ、一方、対照群のマウスの鼻は重度にコロニー化された。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：Duphar International Research B.V. （Ｂ）街：C.J.van Houtenlaan 36 （Ｃ）市：Weesp （Ｅ）国：The Netherlands （Ｆ）郵便番号（ZIP）:1381 CP （Ｇ）電話：(0)2940-77352 （Ｆ）ファックス：(0)2940-80253 （ii）発明の名称：気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica） Vaccine （iii）配列の数：６（iv）コンピュータ読込み形態：（Ａ）媒体タイプ：フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピューター：IBM PC互換性（Ｃ）オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウエアー：Patentln Release #1.0 Version #1.25(EPO）（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1315塩基対（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖 :２本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA(genomic）（iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチセンス：無し（vi）起源：（Ａ）生物：Bordetella bronchiseptica （Ｂ）株：401 （vii）直接源：（Ｂ）クローン：E.coli PC2495(pIVB3-420）（ix）特徴：（Ａ）名称／キー：非コーディング領域（Ｂ）位置：1..539 （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS fimX （Ｂ）位置：540..1142 （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：非コーディング領域（Ｂ）位置：1143..1315 （xi）配列：（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：201アミノ酸（Ｂ）配列タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：タンパク質（xi）配列：（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：624塩基対（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖：２本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA(genomic) （iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチセンス：無し（vi）起源：（Ａ）生物：Bordetella bronchiseptica （Ｂ）株：401 （vii）直接源：（Ｂ）クローン：E.coli PC2495(pIVB3-402) （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS fim2 （Ｂ）位置： 1..624 （xi）配列：（２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：208アミノ酸（Ｂ）配列タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：タンパク質（xi）配列：（２）配列番号５の情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：621塩基対（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖：２本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA(genomic) （iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチセンス：無し（vi）起源：（Ａ）生物：Bordetella bronchiseptica （Ｂ）株：401 （vii）直接源：（Ｂ）クローン：E.coli PC2495(pIVB3-430) （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS fim3 （Ｂ）位置： 1..621 （xi）配列：（２）配列番号６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：207アミノ酸（Ｂ）配列タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：タンパク質（xi）配列：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月８日【補正内容】請求の範囲１．気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）のふさタンパク質（fimbr ial protein）の免疫原の特徴を有し且つ配列番号２、４又は６の中の１に一致するアミノ酸配列又はその機能的等価物を有するポリペプチド。２．請求項１に記載のポリペプチドを発現することができる組換え体ポリヌクレオチドであって、配列番号１、３又は５において表されたヌクレオチド配列を有するDNAから選ばれたヌクレオチド配列あるいはその機能的等価物を有する好適なベクター及びポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換え体ポリヌクレオチド。３．不活性担体並びに請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の組換え体ポリヌクレオチドの有効量を含む気管支敗血症菌感染と戦うためのワクチン。４．気管支敗血症菌感染との戦いにおける請求項３に記載のワクチンの使用。

Claims

【特許請求の範囲】１．気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）のふさタンパク質（fimbr ial protein）の少なくとも一部をコーディングするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。２．ａ．配列番号１、３又は５において表されたヌクレオチド配列の中の１の少なくとも一部をもつＤＮＡ；ｂ．上記ＤＮＡのいずれかとハイブリダイズし、そして気管支敗血症菌のふさタンパク質の免疫学的特性をもつポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；ｃ．その遺伝子コードの結果として（ａ）において定義したようなDNA又は（ｂ）において定義したようなポリヌクレオチドに縮重しており、そして気管支敗血症菌のふさタンパク質の特性をもつポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、から選ばれたポリヌクレオチド。３．気管支敗血症菌のふさタンパク質の少なくとも一部の発現をコーディングしている組換え体ポリヌクレオチドであって、それが好適なベクター及びその内に挿入された請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを包含することを特徴とするポリヌクレオチド。４．気管支敗血症菌のふさタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部をもつポリペプチド。５．配列番号２、４又は６において表されたアミノ酸配列の中の１の少なくとも一部をもつポリペプチド。６．請求項３に記載の組換え体ポリヌクレオチド又は請求項４若しくは５に記載のポリペプチドの有効量を含む気管支敗血症菌感染と戦うためのワクチン。７．気管支敗血症菌感染との戦いにおける請求項４又は５に記載のポリペプチドの使用。