CZ285626B6 - Geny paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz, způsoby a prostředky pro biologickou kontrolu hmyzu - Google Patents
Geny paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz, způsoby a prostředky pro biologickou kontrolu hmyzu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ285626B6 CZ285626B6 CZ93573A CZ57393A CZ285626B6 CZ 285626 B6 CZ285626 B6 CZ 285626B6 CZ 93573 A CZ93573 A CZ 93573A CZ 57393 A CZ57393 A CZ 57393A CZ 285626 B6 CZ285626 B6 CZ 285626B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- insect
- neurotoxin
- paralytic neurotoxin
- specific
- specific paralytic
- Prior art date
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 609
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 title claims abstract description 278
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 265
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 265
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 256
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 177
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 title claims abstract description 120
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 57
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 title abstract description 65
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 title abstract description 65
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 241000238706 Pyemotes Species 0.000 claims abstract description 10
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 claims description 98
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 92
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 92
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 51
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 37
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 36
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 241000238709 Pyemotes tritici Species 0.000 claims description 21
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 21
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 20
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 19
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 120
- 241000238876 Acari Species 0.000 abstract description 19
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 146
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 102
- 101000658304 Pyemotes tritici Toxin TxP-I Proteins 0.000 description 99
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 76
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 58
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 56
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 45
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 45
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 39
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 30
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 29
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 28
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 208000021017 Weight Gain Diseases 0.000 description 16
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 16
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 15
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 12
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 241000545593 Scolytinae Species 0.000 description 8
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 6
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 5
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 230000000967 entomopathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000002919 insect venom Substances 0.000 description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 5
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-amino-3-carboxypropanoyl)amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001105153 Anobiidae Species 0.000 description 3
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 108010080576 juvenile hormone esterase Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- YZZUQHDYJXWFNG-VVEMGJRMSA-N (1S,2R,3S,3'S,5R,6S,7R,8S,9R,12R)-2,8-dihydroxy-3'-[(1S)-1-hydroxyethyl]-7-methyl-12-prop-1-en-2-ylspiro[4,10-dioxatetracyclo[7.2.1.02,7.03,5]dodecane-6,5'-oxolane]-2',11-dione Chemical compound C[C@@H]([C@@H]1C[C@]2([C@H]3[C@H](O3)[C@@]4([C@]2([C@@H]([C@H]5[C@H]([C@@H]4C(=O)O5)C(=C)C)O)C)O)OC1=O)O YZZUQHDYJXWFNG-VVEMGJRMSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 2
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 2
- 241000501044 Buprestidae Species 0.000 description 2
- 241001465828 Cecidomyiidae Species 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255896 Galleria mellonella Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000701372 Iridovirus Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- YZZUQHDYJXWFNG-UHFFFAOYSA-N Pretoxin Natural products CC(O)C1CC2(OC1=O)C1OC1C1(O)C3C(C(OC3=O)C(O)C21C)C(C)=C YZZUQHDYJXWFNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 230000028527 righting reflex Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 241000700570 unidentified entomopoxvirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000239238 Androctonus australis Species 0.000 description 1
- 101000648219 Anemonia viridis Delta-actitoxin-Avd2c Proteins 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241001481391 Apoidea Species 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000157874 Ascovirus Species 0.000 description 1
- ZCKYZTGLXIEOKS-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZCKYZTGLXIEOKS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241001147758 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Species 0.000 description 1
- 241000255791 Bombyx Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000347972 Caucasus prunus virus Species 0.000 description 1
- 241000256805 Chalcidoidea Species 0.000 description 1
- 241000131094 Cucujidae Species 0.000 description 1
- 241000256113 Culicidae Species 0.000 description 1
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 1
- 241000702662 Cypovirus Species 0.000 description 1
- 101150042515 DA26 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710158332 Diuretic hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000229249 Dryas <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- KAFZDWMZKGQDEE-SRVKXCTJSA-N His-His-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N KAFZDWMZKGQDEE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000204035 Kalotermitidae Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001177141 Lyctinae Species 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 241001481690 Mesobuthus eupeus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 101000986989 Naja kaouthia Acidic phospholipase A2 CM-II Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 241000723751 Nodamura virus Species 0.000 description 1
- 241000239299 Orthochirus scrobiculosus Species 0.000 description 1
- 241000116235 Pandanus emarginatus Species 0.000 description 1
- 241000912968 Periphykon beckeri Species 0.000 description 1
- 101710203175 Prothoracicotropic hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000352246 Pteropus tuberculatus Species 0.000 description 1
- 241000373822 Pterostichus ventricosus Species 0.000 description 1
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710181863 Structural DNA-binding protein p10 Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000916757 Tuberculatus Species 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004178 biological nitrogen fixation Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002089 crippling effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004634 feeding behavior Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 102000017941 granulin Human genes 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012194 insect media Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 231100000944 irritant response Toxicity 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- YIEDSISPYKQADU-UHFFFAOYSA-N n-acetyl-n-[2-methyl-4-[(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl]acetamide Chemical compound C1=C(C)C(N(C(C)=O)C(=O)C)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1C YIEDSISPYKQADU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100001184 nonphytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004476 plant protection product Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000003751 purification from natural source Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002795 scorpion venom Substances 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- XMWGSPLTTNCSMB-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O XMWGSPLTTNCSMB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)
Abstract
Geny kódující paralytické neurotoxiny specifické pro hmyz, zejména roztočů parazitujících na hmyzu, včetně Pyemotes, a též rekombinantní molekuly DNA, ve kterých jsou sekvence kódující neurotoxiny umístěny pod kontrolou heterologních promotorů. Tyto molekuly jsou vhodné pro vývoj činidel pro biologickou kontrolu hmyzu, která produkují neurotoxin v množstvích toxických pro hmyz. Konkrétně se popisují geneticky změněné baculoviry, které produkují paralytické neurotoxiny specifické pro hmyz a které vykazují zlepšené toxické účinky na hmyz. Zahrnuty jsou též prostředky toxické pro hmyz. Popisují se rovněž způsoby kontroly hmyzu za použití těchto genů neurotoxinů, způsoby výroby neurotoxinů v buňkách a způsoby výroby činidel pro kontrolu hmyzu.ŕ
Description
Vynález se týká rekombinantních molekul DNA, které obsahují gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici. Dále se týká rovněž geneticky. Změněných baculovirů, které produkují paralytické neurotoxiny specifické pro hmyz, prostředků, toxických pro hmyz, které tyto baculoviry obsahují, a způsobu kontroly, hmyzích škůdců za jejich použití. Vynález se rovněž týká způsobu přípravy paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici za použití této rekombinantní molekuly DNA.
Dosavadní stav techniky
Roztoč Pyemotes tritici je jedním z třinácti známých druhů roztočů rodu Pyemotes, které jsou všechny dravé a produkují jedy, které jsou mírně až extrémně toxické pro cílové druhy hmyzu. Třináct známých druhů lze rozdělit do dvou morfologických skupin, které se liší v okruhu hostitelů, způsobech šíření a toxicitě k jejích hostitelům, a v účincích jejich toxinů na hmyz a člověka. Skupiny scolyti a ventricosus jsou shrnuty v tabulce 1.
Tabulka 1
Toxicita a částečný seznam preferovaných hostitelů druhů roztočů rodu Pyemotes (modifikováno z Cross a Moser (1975) Ann. Entomol. Soc. Am. 68: 723-732)
| toxicita pro: | hostitelé | ||
| hmyz | člověka | ||
| skupina ventricosus | |||
| anobii | extrémní | (?) | Curculionidae Scolytidae Buprestidae Anobiidae |
| beckeri | extrémní | (?) | Lyctidae Scolytidae |
| emarginatus | mírná | mírná | Cecidomyiidae |
| schwerdtfegeri | extrémní | mírná | Anobiidae Buprestidae |
| tritici | extrémní | extrémní | Cucujidae Curculionidae Kalotermitidae Vespidae |
| tuberculatus | (?) | (?) | Anobiidae |
| ventricosus | extrémní | extrémní | Apoidea Chalcidoidea |
| zwoelferi | extrémní | extrémní | Cecidomyiidae |
| skupina scolyti | |||
| dimorphus | mírná | žádná | Scolytidae |
| dryas | mírná | žádná | Scolytidae |
- 1 CZ 285626 B6
Tabulka 1 - pokračování
| toxicita pro: | hostitelé | ||
| hmyz | člověka | ||
| giganticus | mírná | žádná | Scolytidae |
| parviscolyti | mírná | žádná | Scolytidae |
| scolyti | mírná | žádná | Scolytidae |
Většina druhů skupiny ventricosus má jedy extrémně toxické pro hmyz. Všichni roztoči skupiny scolyti jsou foretičtí, a obecně se nacházejí na lýkožroutech. Mohou exprimovat paralytické toxiny.
Životní cyklus roztočů trvá pouze 7-14 dnů, přičemž od jedné matky vzniká 100-300 nově narozených pohlavně dospělých roztočů. Po objevení se samice okamžitě páří a hledají nového hostitele. Doba pro ochromení hostitelského hmyzu je rozdílná, a zřejmě závisí na druhu, velikosti, vývojovém stadiu a množství atakujících roztočů. Roztoči mohou napadat všechna stadia hostitelského hmyzu, avšak dospělci jsou obecně méně citliví díky jejich více sklerotizované (tj. tvrdší) kutikule, kterou hůře pronikají ústní orgány roztočů.
Samotné jedy roztočů se nezdají být specifické pro jednotlivé druhy hmyzu, protože jsou tyto jedy toxické pro široké spektrum hostitelských a nehostitelských druhů hmyzu. Toxiny způsobují nevratné ochromení bez přerušení dýchacích mechanismů (Weiser a Slama (1964) Ann. Ent. Soc. Am. 57: 479).
Toxiny specifické pro hmyz v jedu P. tritici byly čištěny a charakterizovány (Tomalski a kol. (1988) Toxicon 26: 127-132, Tomalski a kol. (1989) Toxicon 27: 1151-1167). Tyto toxiny produkují samičky roztočů a vstřikují je do vyhledaného hmyzu jako součásti jedu. Výsledkem je ochromení cílového hmyzu. Ochromení umožňuje samičce roztoče živící se na hmyzu dosáhnout plné gravidity, a zajišťuje tak dostatek živin pro reprodukci. Složky toxinu o nízké molekulové hmotnosti způsobují rychlé ochromení stahovacích svalů, zatímco frakce toxinu o vysoké molekulové hmotnosti způsobují ochromení ohýbacích svalů.
Jedna složka toxinu, označená TxP-I, byla vyčištěna do zřejmé homogenity, a pomocí elektroforesy na polyakrylamidovém gelu SDS byla určena její molekulová hmotnost na 27 000. Analýza aminokyselinového složení TxP-I byla přítomna v Tomalski a kol. (1989) viz výše. Relativně vysoký obsah cysteinu může mít za následek vznik četných disulfidických vazeb v molekule toxinu. Byla publikována N-koncová sekvence TxP-I: N-asp-asn-gly-asn-val-gluser-val-arg-ala-val-val-ile-asp-tyr-/X/-asp-ile-arg-his-pro-. Bylo zjištěno, že tato N-koncová sekvence aminokyselin není homologní s žádnou proteinovou sekvencí v Protein Identification Resource (National Biomedical Foundation Release č. 13, 30. června 1987).
Dále byly analyzovány dvě další složky, které vykazují molekulovou hmotnost 28 000 a 29 000. Tyto dvě složky tvoří ΤχΡ-Π. Na základě mapování peptidů a imunoblotních pokusů bylo stanoveno, že proteinové složky TxP-I a ΤχΡ-Π jsou izoproteiny (Tomalski a kol. (1989), viz výše). Směs TxP-I a ΤχΡ-Π tvoří TxP-IH.
Testování na myších intraperitoneálním nebo intracerebrálním způsobem prokázalo, že přípravky toxinů P. tritici nejsou akutně toxické pro savce. Při testování s larvami zaviječe voskového (Galleria mellonella) jsou dávky způsobující ochromení 50 % jedinců testovaného hmyzu (PD5o) pro TxP-I, ΤχΡ-Π a TxP-HI 330, 550 respektive 500 mikrogramů na kilogram. TxP-I a ΤχΡ-Π způsobují rychlé ochromení stahování svalů.
-2CZ 285626 B6
Za použití vyčištěného TxP-I jako antigenu byla vyrobena polyklonální protilátka. Tato protilátka je reaktivní jak proti TxP-I, tak proti ΤχΡ-Π, a neutralizuje paralytickou aktivitu částečně vyčištěných přípravků TxP-ΠΙ (Tomalski a kol. (1989), viz výše).
Proteinové neurotoxiny specifické pro hmyz byly nalezeny v jedech dalších členovců včetně štírů, vos a pavouků (Zlotkin (1985) v Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. I. Insects, I. Kerkut a L.I. Gilbert (eds.) Pergamon Press, Oxford, GB, str. 499546). Některé peptidové toxiny štírů vykazují neurotoxické účinky specifické pro hmyz a byly sekvencovány. Tyto toxiny štírů mají relativně nízkou molekulovou hmotnost, tj. zhruba od 3000 do 8000 daltonů, což je značný rozdíl ve srovnání s toxiny roztočů. Zjevná sekvenční příbuznost mezi toxiny roztočů a štírů neexistuje, avšak jak toxiny roztočů tak štírů mají vysoký obsah cysteinu. Pevné struktury proteinů toxinů jsou stabilizovány disulfidickými vazbami.
Jako důsledek nevýhod konvenčních chemických pesticidů vzrostl zájem o biologickou kontrolu škodlivého hmyzu. Chemické pesticidy obecně ovlivňují užitečné stejně jako neužitečné druhy. Škodlivý hmyz získává rezistenci k těmto chemikáliím, takže se mohou rychle vyvíjet nové populace škodlivého hmyzu, které jsou k těmto pesticidům rezistentní. Chemická rezidua dále znamenají riziko pro životní prostředí a způsobují, případné zdravotní problémy. Biologická kontrola je alternativním způsobem kontroly škůdců, který může snížit závislost na chemických pesticidech.
Strategie biologické ochrany zahrnují využití přirozeně se vyskytujících organismů, které jsou patogenní pro hmyz (entomopatogenní) a vývoj plodin, které jsou více rezistentní ke škodlivému hmyzu. Provádí se identifikace a charakterizace genů hmyzu nebo produktů genů hmyzu, které mohou sloužit jako vhodné cíle pro činidla pro kontrolu hmyzu, identifikace a využití dříve nevyužívaných mikroorganismů (včetně modifikování přirozeně se vyskytujících nepatogenních mikroorganismů, kterým se mění na organismy patogenní pro hmyz), modifikování a vylepšování v současné době využívaných entomopatogenů, a pomocí genetického inženýrství vývoj plodin, které vykazují vyšší rezistenci k hmyzím škůdcům.
Mezi entomopatogeny, které byly vyvinuty jako biologické pesticidy, patří viry, které způsobují epizootické choroby v specifických populacích hmyzu. Mezi entomopatogenní viry patří baculoviry, entomopoxviry, reoviridae (cytoplazmatické polyhedrosní viry), iridoviry, parvoviry, rhabdoviry, picomaviry, nodaviry, ascoviry (dosud neklasifikované) a pravděpodobně určité retroviry.
Baculoviry jsou velkou skupinou evolučně příbuzných virů, které infikují pouze členovce (Miller, L.K. (1981) v Genetic Engineering in the Plant Sciences, ed. N. Panopoulous, Praeger Publ., New York, str. 203-224; Carstens (1980) Trends in Biochemical Science 52: 107-110; Harrap a Payne (1979) v Advances in Virus Research, svazek 25, eds. Lawfer a kol., Academie Press, New York, str. 273-355, Granados, R. R. a Federici, B. A. eds. (1986) The Biology of Baculoviruses, svazek 1, Biological Properties and Molecular Biology, CRC Press lne., Boča Raton, Florida). Některé baculoviry infikují pouze ty druhy hmyzu, které jsou škůdci komerčně důležitých zemědělských nebo lesnických plodin. Známé jsou též další baculoviry, které specificky infikují jiný škodlivý hmyz, například komáry a blechy. Tyto baculoviry jsou potenciálně významné jako činidla pro biologickou kontrolu. Potenciální výhodou baculovirů jako biologických pesticidů je jejich hostitelská specificita. Baculoviry jako skupina infikují pouze členovce, a jednotlivé kmeny baculovirů obvykle infikují pouze jeden nebo několik druhů hmyzu. Díky tomu znamenají malé nebo žádné riziko pro člověka nebo životní prostředí a mohou být užívány bez nepříznivého ovlivňování užitečných druhů hmyzu.
Mezi podskupiny baculovirů patří jaderné polyhedrosní viry (NPV-nuclear polyhedrosis viruses), granulosní viry (GV = granulosis viruses) a neokludované baculoviry. V okludované formě baculovirů jsou viriony (obalené nukleokapsidy) uloženy v krystalické proteinové hmotě. Tato
-3 CZ 285626 B6 struktura, označovaná jako inkluzní nebo okluzní tělísko, je formou, která se nachází v přírodě mimo organismy a je odpovědná za šíření infekce mezi organismy. Charakteristickým rysem skupiny NPV je, že je v každém okluzním tělísku, která jsou relativně velká (až 5 mikrometrů), uloženo více virionů. Okluzní tělíska skupiny GV jsou menší a každé obsahuje jeden virion. Krystalická proteinová hmota okluzních tělísek obou forem je tvořena zejména jednoduchým polypeptidem o velikosti 25 000 až 33 000 daltonů, který je znám jako polyhedrin nebo granulin. Neokludované baculoviry netvoří protein polyhedrin a netvoří okluzní tělíska. Například Groner a kol. v The Biology of Baculoviruses, svazek 1, viz výše, v kapitole 9, tabulkách 2 a 7 uvádějí rozsáhlý seznam hostitelů NPV a GV.
V přírodě je infekce zahajována v okamžiku, kdy hmyz přijme potravu kontaminovanou částečkami baculoviru, typicky ve formě okluzních tělísek. V alkalických podmínkách středního střeva hmyzu okluzní tělíska disociují, a uvolňují se viriony, které potom napadají epiteliální buňky lemující střevo. V hostitelské buňce baculovirus migruje k jádru, kde probíhá replikace. Nejprve jsou v infikované buňce tvořeny specifické virové proteiny prostřednictvím transkripce a translace takzvaných „časných genů“. Kromě jiných funkcí jsou tyto proteiny nutné pro replikaci virové DNA, která začíná 4 až 6 hodin po vniknutí viru do buňky. Replikace virové DNA pokračuje až do zhruba 24 hodin po infekci. Od zhruba 8 do 24 hodin po infekci, exprimují infikované buňky ve vysokých množstvích „pozdní geny“, které obsahují složky nukleokapsidy, která obklopuje virovou DNA během formování progenních virových částic. Tvorba progenních virových částic začíná přibližně 12 hodin po infekci. Nejprve progenní viry migrují k buněčné membráně, kde získávají obálku, jak se uvolňují z povrchu buňky. Neokludované virové částice mohou poté infikovat další buňky daného jedince hmyzu. Syntéza polyhedrinu začíná přibližně 18 hodin po infekci a vzrůstá na velmi vysokou úroveň 24 až 48 hodin po infekci. Zhruba od 24 hodin po infekci se snižuje podíl tvorby neokludovaných virů, a většina progenních virových částic je zabudována do okluzních tělísek. Tvorba okluzních tělisek pokračuje dokud buňka neodumře nebo nelyžuje. Některé baculoviry infikují skutečně všechny tkáně hostitelského hmyzu, takže na konci infekčního procesu je celé tělo hmyzu ztekuceno a uvolňuje extrémně velké množství okluzních tělísek, která poté mohou šířit infekci na další jedince hmyzu. (Uvedeno v The Biology of Baculoviruses, svazek I a II, eds. Granados a Federici, CRC Press, Boča Raton, Florida, 1986.)
Baculoviry, které jsou deriváty AcMNPV, jež jsou vhodné jako expresivní vektory byly popsány v americké patentové přihlášce č. 07/353.847, podané 17. května 1989; mezinárodní patentové přihlášce PCT/U590/02814, podané 17. května 1990; Rankin a kol. (1988) Gene 70: 39-49; Ooi a kol. (1989) J. Mol. Biol. 210: 721-736, Thiem a Miller (1990) Gene 91: 87-95. Obzvláště silné pozdní a velmi pozdní promotory jsou popsány, a patří mezi ně modifikovaný polyhedrinový promotor LSXTV, hybridní promotor Cap/Polh a syntetický promotor Syn.
Byly popsány baculoviry, které vykazují zlepšené insekticidní vlastnosti. Například AcMNPV, ve kterém byl inaktivován gen pro egt (ekdysonglukosyl-transferasu) způsobuje dřívější zastavení požeru a dřívější smrt larev ve srovnání s larvami infikovanými neupraveným typem AcMNPV (O’Reilly a Miller (1989) Science 245: 1110-1112; 0’Reilly a Miller (1990) J. Virol. 64: 1321-1328; americká patentová přihláška č. 07/373.952, podaná 29. června 1989).
EgťAcMNPV, který byl dále geneticky měněn tak, aby exprimoval protein ovlivňující ekdysi, může obsahovat další zlepšení v insekticidních vlastnostech (mezinárodní patentová přihláška PCT/U590/03758, podaná 29. června 1990). Byly zkonstruovány deriváty EgťAcMNPV, které exprimují esterasu juvenilního hormonu, svlékací hormon, nebo prothoracikotropní hormon. Doby požeru infikovaných larev byly sníženy a ke smrti došlo dříve než u larev infikovaných neupraveným typem egťAcMNPV.
Maeda (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1177-1183 též popsal geneticky zkonstruovaný baculovirus se zlepšenými pesticidními vlastnostmi. BmNPV, který infikuje bource
-4 CZ 285626 B6 morušového Bombyx moři, byl modifikován tak, aby exprimoval syntetický gen kódující diuretický hormon Manduca sexta. Tekutinová rovnováha infikovaného hmyzu byla narušena, a usmrcení bylo zhruba o 20 % lychlejší než u neupraveného typu viru.
Dee a spolupracovníci (1990) Bio/Technology 8: 339-342 klonovali a exprimovali v myších buňkách fibroblastech insekticidní toxin ze štíra Androctonus australis. Kódující sekvence byla spojena se sekvencí signálního peptidu interleukinu-2 člověka a syntéza byla řízena promotorovou sekvencí v dlouhé koncové repetici viru Moloneyova myšího sarkomu. Bylo uvedeno, že rekombinantní protein, který byl vylučován do mimobuněčného média, byl toxický pro larvy komáru, ale nikoliv pro myší buňky v kultuře nebo pro myši.
Gen kódující hmyzí toxin z Buthus eupeus (středoasijský poddruh štíra) byl syntetizován, klonován do genomu AcMNPV (jaderný polyhedrosní virus z Autographa califomica) a exprimován za řízení polyhedrinovým promotorem. Byly též vytvořeny konstrukty, ve kterých byl toxin štírů exprimován ze syntetického genu obsahujícího sekvenci kódující toxin spojenou s sekvencí kódující, signální peptid nebo jako fúzní protein s 58 aminokyselinami polyhedrinu na N-konci. Jak bylo zjištěno radioaktivním značkováním pomocí /35S/-methioninu, elektroforesou na polyakrylamidovém gelu SDS a autoradiografií, ve všech případech docházelo k určité expresi, ale u žádných produktů exprese nebylo pozorováno způsobení ochromení hmyzu. Bylo tomu tak zřejmě zčásti kvůli nestabilitě proteinů, ale nemožnost detegovat biologickou aktivitu mohla být důsledkem nedostatečné citlivosti systému zkoušek nebo neschopnosti rekombinantních proteinů vytvořit funkční třírozměrnou strukturu (Carbonell a kol. (1988) Gene 73: 409418).
Hamock a kol. (1990) Nátuře 344: 458-461 popisuje expresi hmyzího genu kódujícího esterasu juvenilního hormonu (JHE), enzymu, který inaktivuje vývojový hormon, zprostředkovanou baculoviry.
Merryweather a kol. (1990) J. Gen. Virology 71: 1535-1544 informují o vytvoření baculoviru obsahujícího HD-73, delta endotoxin Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Gen pro BTk HD-73 endotoxin byl umístěn pod kontrolu polyhedrinového promotoru.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou rekombinantní molekuly DNA, které obsahují geny kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče parazitujícího na hmyzu, konkrétně roztoče Pyemotes tritici. Podle konkrétního provedení je genem toxinu paralytického pro hmyz gen Tox34 Pyemotes tritici, který je identifikován svojí nukleotidovou sekvencí uvedenou níže v tabulce 2 (nebo na obrázku 9). Druhým konkrétním provedením je neurotoxin paralytický pro hmyz a gen, který ho kóduje, jejichž sekvence nukleotidů a aminokyselin jsou uvedeny níže v tabulce 4 (nebo na obrázku 10), Tox21a Pyemotes tritici. Odborníkům je jasné, že mohou být izolovány další geny paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz a mohou být identifikovány pomocí homologie nukleotidových sekvencí, jak je uvedeno v hybridizačních pokusech (viz například Hames a Higgins (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Washington, D.C.), za použití zde popsané informace o sekvencích.
V souladu s tím je předmětem vynálezu rekombinantní molekula DNA, která obsahuje gen, kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici, přičemž tento gen má kódující sekvenci uvedenou na obrázku 9 od nukleotidu 118 po nukleotid 873 nebo kódující sekvenci, která je s ní alespoň ze 70 % homologická s podmínkou, že kódovaný protein si uchovává účinnost paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, nebo kódující sekvenci, která kóduje sekvenci aminokyselin, jak je uvedená na obrázku 10.
-5 CZ 285626 B6
Dalším předmětem vynálezu je baculovirus geneticky zkonstruovaný tak, že obsahuje a exprimuje výše uvedený gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, přičemž výhodně jím je baculovirus NPV nebo derivát AcMNPV. Výhodně je gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz získaný z roztoče Pyemotes tritici exprimován pomocí baculovirového 5 promotoru vybraného ze skupiny zahrnující velmi pozdní, časné, hybridní a syntetické promotory. Výhodnými baculoviry jsou vEV-Tox34, vETL-Tox34, vSp-Tox34, vCap/Polh-Tox34 a vSPXrVPCRTox21a.
Dalším předmětem vynálezu je prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje výše uvedený 10 baculovirus, v množství způsobujícím ochromení hmyzu, a způsob kontroly hmyzích škůdců, při kterém se aplikuje tento prostředek toxický pro hmyz na životní prostředí hmyzích škůdců.
Předmětem vynálezu je konečně rovněž způsob přípravy paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici v hostitelské buňce, jak je popsán níže, při kterém se 15 používají výše uvedené geny.
-6CZ 285626 B6
Tabulka 2
Sekvence DNA a odvozená sekvence aminokyselin Tox34
O
| o H 0. o < <n | o H > | Ο π L *Γ> < >. | O < 01 « u | O E· C Γ» < « -r < < | O < 3 η E- ϋ io H 4 | ||||
| O CM | 0 0 0 | ||||||||
| <N 0 | < | CJ | Ε* Ε» | v | < -> | ||||
| f- | a | Η >· | < >. | E- i. | < v> | < >> | |||
| < | « | 0 -> | 0 -μ | U a> | < > | 0 <-4 | |||
| 0 | < | O 0 | 0 0 | t· w | < J | U 0 | |||
| c | £ ® | Ε» ® | < a> | E- L. | H U> | ||||
| < | n | r· | E* ·· | < >. | < -« | ||||
| < | < | < Μ | ε- & | < >- | E- E- | O X | |||
| 0 | Q. | S-. φ | < η | < >» | < c | E-> C | |||
| O 0 | u | O | Ε* —< | ο | 2 >» | o | O -M | o < —< | o < w |
| CM | E« | co | < l~> | V | < J | o | 0 0 | O U 0 | Γ4 < < |
| CM | rw | ο | v | V | ΙΛ | ||||
| u | Ε- Q. | É- c | ř- O | < O | < L> | ||||
| >, | < « | < ν» | b - | U k, | 0 X | ||||
| Em Em | Ο < | < < | ř CL | U a. | < h | ||||
| < | u | Em β» | < □ | E- Cm | E- to | < >· | |||
| u | ® | Η X | < —< | 0 <u | 0 >· | 0 Ή | |||
| Em | 0 | r* CL | 0 0 | < « | E- 0 | 0 0 | |||
| tx | < > | < >» | < □ | < <5 | E-> u> | ||||
| < | « | 0 | 0 >Ή | < —< | U ·-* | 0 >> | |||
| O | < | Ο 0 | 0 0 | 0 0 | 0 < | H 0 | |||
| O | O | ο | 1 | o | O | o | |||
| r-í 0 | 4» | c* | < >» | ο | < W | at | < <0 | in < o | HE k |
| £-· | ťM | 0 -< | η | < >. | ΓΪ | < > | V ϋ k | tn < > | |
| < | M | υ υ | < J | < J | U a. | 6- b | |||
| 5 | 3 | e« u | < 10 | t. m | < 3 | E- U | |||
| < | < >» | 2 > | Γ ~ | < —< | < X | ||||
| 0 | 0 | Ε-> Ε-· | < J | E- o. | 0 0 | E- &4 | |||
| h | Φ | < -( | ε* -3 | E- Q. | E- 0. | E~ 0 | |||
| h | Ε> β | Η ω | < « | < w | 0 14 | ||||
| ί- | CL | Ο > | ο u | 0 < | 0 < | 0 CL | |||
| ο e> | O | < ta | Ο | < σ' | o | < σ> | Op Q. | O < 3 | |
| o < | Ό | 2 | <Ν | 0 lu | a | u u | ΤΓ < tO | O < —i | |
| CM CJ | w· | CM | 2 >4 | η | < < | n | < < | o· 0 < | m 0 0 |
| Λ | (0 | 0 10 | f-« <0 | < 3 | < >. | E-· c | |||
| 0 X | 0 | < «-· | 0 | < u | |||||
| ^4 | Η 0 | 6» 0 | 0 0 | 0 0 | < < | ||||
| < | « | < >> | < rl | r w | < « | E- w | |||
| 2 | 0 <-Ι | E* <c | c-· ® | < >» | 0 >> | ||||
| < | *4 | Ο ϋ | 0 > | 0 > | < >4 | E- 0 | |||
| Em | ta | ε* “ | Em14 | U Ul | E- c | < u | |||
| o 0 | O | ε« --< | ο | o c. | O | 0 >> | © < tn | o 2 x | |
| σ\ Η | o | *n | < >Η | ιΗ | < E-> | c* | E* U | n < < | Φ 2 »4 |
| r“i | e* | η | r> | MT | v | ||||
| < | 3 | £ C | < >, | &« c | ř< *4 | 0 X | |||
| e* | Φ | < (0 | 0 -* | < M | 0 Φ | 0 ^4 | |||
| e· | *4 | < < | O 0 | < < | E- w | 0 0 | |||
| ř* C | < 14 | l·» | < >. | ř* ® | E- k | ||||
| 5 | n | 0 JZ | e* » | 0 | E· Ή | < >» | |||
| < | < | <e* | 0 > | 0 0 | < M | H Em | |||
| E* C | Η <ΰ | ·£ m | 0 a | < >, | e· c | ||||
| ta | Γ -c | < >. | < >, | 0 Ή | < to | ||||
| 2 | < | Η 0. | *C >J | 0 0 | < < | ||||
| o | O | Ο | O | O | o | ||||
| 03 2 | OJ | Η 0 | Q | H O | u> | < m | ÍM < U | Ol· o | |
| ·-« 0 | M | CM | 0 >. | ο | b !U | n | O Q | «τ «ς >. | »? l·^ |
| 0 | 04 | Ε 0 | u 0. | e, m | 2 J | < M | |||
| “1 | ε* α | U $4 | ř* C | < v | 0 0. | ||||
| < | Ž3 | < V) | U £ | <e io | <-< | 0 14 | |||
| 0 | 55 | ο < | < | 2 < | < H | E-l·· | |||
| < | « | 0 1» | f-· β | E- n | •C <0 | 14 | |||
| 0 | 0 X | *c -· | O >< | 0 X | |||||
| < | <1 | < Ε* | U X | f, u | 2 4 | < Em |
-7CZ 285626 B6
Tabulka 2 - pokračování o < w σχ o o v. F 0 o f-> a> inř->£ Ό F o.
Of- L r* u O r- < <n
O ř- « r> F c <0 O >
O Q βΧ F CO F
| F C | F » | o w | F u | F *· |
| f & | < >> | < > | u £ | |
| F o. | 2 J | F F | < F | |
| f ia | F >. | < >. | F u | F — |
| o > | 0^ | Q —t | 0 O | F IQ |
| 0 | 0 0 | O 0 | < tn | 0 > |
| < (A | F > | F a | F CL | F CL F | |||||
| O | 2 | o 0 <-i | o < n | o | < IA | o | < tn | O | F |
| CO | < u | «Ό 0 | O 0 < | «0 | 0 < | CM | 0 < | a> | F |
| m | to | r· | c* | CO | CO | ||||
| < 3 | < u | < L· | F Φ | < CA | F | ||||
| O £ | u V | F £ | 2 >, | F | |||||
| 0 0 | < F | F W | F Λ | < J | < | ||||
| F > | < u | < 9 | < | F CL | < | ||||
| O f | 0 £ | F « | F c | < <A | |||||
| 0 0 | < F | FU | 0 > | 0 < | F |
| 0 CL | F W | F u | Λ <A | F CL | F « | |||||
| < IA | < -H | U £ | 2 >· | < tn | 0 >* | |||||
| 0 ·£ | u s | < F | 2 J | o < | F 0 | |||||
| O | O | o | O | o | o | |||||
| Γ» | < U | o | F « | σχ < «η | lA | F la | f o. | r- | 0 3 | |
| IA | O £ | v> | 0 | to F n | r-- | 0 <U | eo | < (A | co | F a> |
| <C F | F 0 | 0 > | F 0 | 0 < | 0 J | |||||
| u O | < 0» | O Φ | F L< | < 3 | < Ο» | |||||
| 0 u | 0 u | F «-· | 0 £ | < «Η | 0 U | |||||
| 0 CL | < < | < >-< | < F | 0 0 | < < | |||||
| F « | < > | < 3 | F 0 | F 0 | < U | |||||
| F £ | 0 Ή | 2 <-< | 0 h | M *4 | 0 V | |||||
| F 0» | 0 0 | 0 0 | 0 0. | < M | F « | |||||
| O | 0 U | o | < 3 | O 0 <-4 | o | < 3 | o | < tn | o | F CL |
| «0 tA | < >» F F | CM \0 | £5 | co F a XO 0 > | τ Γ' | ts | o co | < > < J | Ό co | < tn o < |
| F a | F U | F C | F C | 0 CL | F | ||||||
| < a | < >1 | λ m | < w | U | 0 | OJ | |||||
| 0 < | F F | < < | < < | F F | < | tn | |||||
| 0 3 | F W | < « | < « | F C | < | to | |||||
| F ω | 0 > | 3 >x | < to | < | >, | ||||||
| 0 «J | F 0 | < j | << | < | ►J | F | |||||
| < w | F<-« | F « | < ta | < | 0 | <c | |||||
| o | 5 | O | F A3 | o F « | O | o | 2 >» | O 0 | >4 | o | 2 |
| IA | w | 0 > | r- 0 > | «-» 0 X | σχ | < u | IA 0 | 0. | r4 | 0 | |
| IA | < ϋ» | 0 | to | c* | r* | CO | σχ | ||||
| 5 | £ · | < a | F 0 | F | a | F | |||||
| 0 Li | 0 w | F<H | 0 >4 | < | u | 0 | |||||
| < < | 0 < | < M | 2J | o a. | 0 | « | F |
| ř: h | < >» | F CL | < 3 | ||
| 0 £ | 0 <-« | < « | F « | ||
| <F | 0 0 | 0 < | F U | ||
| < > | < CO | F « | <C k | ||
| 0^ | 0 h | F | U £ | ||
| 0 0 | < < | < M | < F | ||
| o | o | O | O | o | |
| xo | F « | ct < 0* | <df a | v F c | o |
| w | F£ | <* 0 >4 | r* < W | co < ta | <h |
| F CL | < < | 0 < | < < |
Podtržené jsou aminokyseliny, které byly identifikovány jako N-koncové aminokyseliny 5 vyčištěného proteinu TxP-I.
První báze kódující sekvence TxP-I je označena 1.
- 8 CZ 285626 B6
Tabulka 4
Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence Tox21a
-110 -100 -90 -80 -70 -60
G AAT TCC AAC AAC AGT gcC TTT GGG CGG CCG CAC TGG TCT ΤΛΛ CTT TTT TCT CTT TTT TAG
| P u | E- Q> | < σ» | E- tu | |||
| E- £ | 0 u | Η £ | ||||
| r-l < S | E- 0. | < < | E- CL | |||
| o | o | o | ||||
| < | tO | E- | <N | < tn | co | E- li |
| O | 0 oj | r-1 | 2 >> | —4 | < > | |
| < | E- v) | 2 u | E- E- | |||
| 0 | E- c | 6- L> | <c a | |||
| f- | (A | o tu | 2 > | |||
| E- | -3 < | E- W | 2 U | |||
| < | 0 <U | u -4 | < m | |||
| Β- | E- £ | E-< 0 | 2 >. | |||
| ί- | E- CL | O > | 2 | |||
| ο | ||||||
| -1 Γ | o | E- O | O | E-< Φ | o | fit tn |
| i E- | tn | U U | r4 | H —4 | r· | 0 X |
| < | o cl | r-4 | < >-t | •-f | E-« U | |
| E- | « tn | E- a | 2 3 | |||
| ř- | < w | E- tu | ||||
| < | 2 *4 | o < | t- >4 | |||
| £ | H 0 | u cl | E·4 C | |||
| ř- | 0 <H | < Ul | 2 « | |||
| E- | © < | 0 < | 2 2 | |||
| o E- | < 0 | E·4 CL | Ε-» c | |||
| oí e- | o | O r-< | O | < U | O | |
| i E- | T | O < | o | 0 < | 0 | 2 < |
| «-< | r4 | |||||
| < 3 | o c | «< o | ||||
| 2 | Η (U | < « | O 14 | |||
| < | t4 U) | 2 < | U CL | |||
| 0 | E-< <U | U Q. | E-« 0 | |||
| < | H -4 | 2 <0 | < -< | |||
| e- | < H | 0 < | U X | |||
| e- | E-· U | E- | < θ' | |||
| o e- | 0 £ | E-« 0 | 0 k | |||
| o < | 0 > | < < | ||||
| 1 | o | o | O | |||
| f·4 | n | < 14 | <λ | < >, | tn | E- U |
| O 0 | 0 —< | —1 | U £ | |||
| 0 | E- w | 0 0 | < E- | |||
| ř* | E- Φ | 2 =5 | E-* CL | |||
| H | 2 | < 0 | ||||
| < | < M | 0 0 | 0 < | |||
| E- | B <D | ř* cl | E-« W | |||
| < | Γ Χ | < w | 0 >> | |||
| < | t-» CL | 0 2 | H O | |||
| o | ||||||
| «· ř* | O | Ε-» Φ | o | ř* « | o | H 14 |
| í t— | Cl | Η Λ. | a> | Η «Η | 0· | *C >> |
| H CL | < H | rt | H ř4 | |||
| < 2 | 2 3 | H Q. | ||||
| 2 | ř- 0 | < 0 | ||||
| E- U | t- u | 0 < | ||||
| 2 | É-ι ® | < li | A OJ | |||
| o | r & | U ® | H ·-< | |||
| e- | E- CL | E- ui | < M | |||
| o < | Η M | ř* 14 | (4 f-i | |||
| in o | o | < > | o | 0£ | O | t4 0 |
| 1 0 | r- | 2 Ei | n | 0 > | ||
| —t | ||||||
| 0 | 0 3 | 2 W | < «-4 | |||
| 0 | b | 2 >, | H 0 | |||
| u | r4 *4 | 2 »4 | 0 > | |||
| 0 | O c | ř4 C | < 0 | |||
| < | < w | < 0 | U «Η | |||
| 0 | 2 < | << | 0 < |
| ’ H «j 0 > | E- 5 E- 0 0 -□ O o < σ> | f- a. < w o < o o < © «η 0 L < < | ||
| o < Γ4 5 | V) >. u | |||
| o 0 < | u < | |||
| u | v> | E- | tn | < 3 |
| 0 | >. | 0 | >. | < —4 |
| E- | 0 | E- | u | 0 0 |
| < | >. | < | —4 | p- r-t |
| 0 | *-< | E- | <0 | é- « |
| 0 | 0 | 0 | > | 0 > |
| ° | Φ | O E- | 14 | o ο tn |
| rt E- | fft 0 | £ | tn o >, | |
| C4 < | <M < | E- | f» E- 0 | |
| E- | c | < | >» | E4 C |
| < | ω | 0 | < tt | |
| < | < | 0 | 0 | < < |
| < | 14 | E- | <y | < > |
| 0 £ | E- | r-4 | 0 -< | |
| < ř* | < | h-l | 0 0 | |
| Ei | <» | tn | < tn | |
| O E-. | £ | o 2 | >. | o < > |
| <M H | CL | co < | Ul | ’Τ < J |
| CM | <M | r> | ||
| É- | « | ř* | o | < U |
| 0 | 0 | u | O 0) | |
| E-r | 0 | 0 | CL | E- 0 |
| E- | a | Ě- | tu | E4 e |
| < | tn | 0 | ·“♦ | < tn |
| 0 | < | 0 | < | < < |
| 0 | u | < | é- tn | |
| U | < | >» | o > | |
| < H | 2 | E- O | ||
| O | o | O | ||
| H E- | CL | r* E-« | >4 | tn E- 14 |
| C4 < | tn | CM 0 | r» < >. | |
| 0 | < | 0 | 0 | E- E- |
| CL | E- | >4 | < > | |
| < | tn | 0 | 0 — | |
| 0 | < | 0 | 0 | 0 0 |
| c | Η | <y | E4 <U | |
| tn | É-4 | —4 | E- £ | |
| 2 | < | < | M | E4 Cl |
| O 0 | CL | © É·4 | tu | o < « |
| O 0 | 14 | Φ E-< | »—t | <M 2 >4 |
| CM E4 | E- | CM < | l-t | n < J |
| ř* | 14 | E- | CL | ř4 C |
| < | >, | < | <n | < « |
| E4 6* | Ό < | < < | ||
| 14 | Em | a | < Ul | |
| 0 | tu | Em | JZ | 2 >. |
| ř·4 | Ul | e-1 | CL | 2 u |
| ř* | CL | < | >4 | < >. |
| o < | M | O 0 | 0 0-4 | |
| σ» 0 | < | tn 0 | 0 | -t 0 0 |
| w | ΓΜ | O | ||
| 0 | «1 | < | >4 | < <0 |
| É·4 | —4 | 0 | r-1 | < >» |
| M | 0 | 0 | < J | |
| 3 | E-< | 14 | < Ul | |
| 2 | < | >4 | < >. | |
| 0 | 0 | t4 E- | < J |
-9CZ 285626 B6
Tabulka 4 - pokračování
370 380 390 400 410 420
ΤΤΤ ΑΤΤ GAA AGT ΤΤΤ GGA GTA TCT ΑΤΑ ΑΛΑ ΑΤΑ ΑΛΑ GGA ΑΤΤ TCT CAT AGA GGA GAT GAT Phe Xle Glu Ser Phe Gly Val Ser Ile Lys Ile Lys Gly Ile Ser His Arg Gly Asp Asp o co o in
O ra
O t cr
| H 0 | E- o | < X | b | v | u | Ε- | o | E- a | < | ||||||||
| O u | E-« X | o -« | l· | < | >» | υ | u | < 01 | E- | ||||||||
| U CL | E- Λ. | O <3 | < | •-H | < | J | u | CL | 43 < | < | |||||||
| O | o | O | O | O | o | O | |||||||||||
| < 3 | λΤ | O | o | < 9 | *0 | E« | u | Ai | < | >1 | CD | E- | CL | v | < >X | o | |
| 2 | tn | < X | ra | E-1 2 | ra | U | J2 | r- | 43 | i—» | r« | < | 01 | © | 43 | σ* | 2 |
| 43 o | e* F | E* 4 | < | E- | 43 | 43 | 43 | < | 43 43 | E- | |||||||
| E- C | H C | e- lí | < | >. | < | <P | H | O | p « | < | |||||||
| < 0 | «c tn | < χ | 13 | •1 | 43 | L> | E- | U | < | ||||||||
| 2 < | 2 < | e* t-> | 43 | 43 | < | < | < | w | 43 < | < | |||||||
| e- « | O 9 | E-> 0 | E- | a> | < | 0) | E-> | CL | E-> C | Ε- | |||||||
| o x | E-> <u | 13 X | E- | X | < | >. | < | <A | < 01 | κ-. | |||||||
| E-> U | <_> u | E- u | ř | a. | 2 | 43 | < | < < | l· | ||||||||
| < 0) | o | < w | o | < -< | o | < | □ | o | E* | Li | o | E- | li | o | o | E- | |
| 2 * | ΓΊ | 2 | σ> | Ε* «5 | lA | 2 | H | ·—< | U | O | r* | < | Oo | n | 2 | σ* | r |
| < 4 | tn | 2 4 | lA | 43 > | ra | 43 | 43 | A- | H | Ui | t* | E- | t- | CD | 43 43 | © | ř- |
| < X | < Ο» | E-> X | E* | Li | E- | Li | < | Φ | E-> n | E- | |||||||
| O r-l | <3 >« | 43 | O | a> | 43 | Φ | E- | ^4 | < —< | ||||||||
| 43 43 | < < | 43 <3 | < | <n | < | cn | < | U X | < | ||||||||
| E- L· | < w | U L« | h | ai | O | c | F- | >x | E- ·-* | 43 | |||||||
| < X | 2 X | < >» | í- | X | < | 01 | 43 | E-> 4 | E- | ||||||||
| e- e> | < 4 | E* E-> | E* | a. | < | < | <3 | 43 | 43 > | £ | |||||||
| e- c | υ c | < ai | í- | •-i | O | 01 | E- | C | E- Li | E- | |||||||
| < ω | o | o | E- w | o | H | <u | O | < | ?“ | o | < | 01 | O | O X | o | < | |
| < < | CM | ra | < M | w | 43 | > | O | < | ra | < < | CM | < ř- | © | t· | |||
| tn | |A | ra | Γ» | r* | © | © | |||||||||||
| < 10 | < ? | < | 9 | < | >. | E- | u | E- Φ | < | ||||||||
| r* -· | 4J <-· | < ·— | —H | 43 | 43 | a | E-< f-> | < | |||||||||
| < i-i | <3 < | 43 «3 | 43 | 43 | 43 | 43 | < | to | < '-i | < | |||||||
| (3 CL | e· u | E- u | F« | > | E- | CL | E- | r> | Η CL | £_ | |||||||
| 13 Li | < x | < X | <3 | < | 0> | < | (0 | < a | |||||||||
| E-> θ | É- E* | e- e- | 43 43 | 45 | < | 43 | < | 43 < | ř- | ||||||||
| E- Li | E* Φ | < 01 | E- c | < | L. | O | < 01 | E- | |||||||||
| U Λ | E- | 2 X | < | U | U | 0» | je | >< | |||||||||
| < E· | Η Cl | 2 4 | < < | ř- | CO | E- CL | 2 u | < | |||||||||
| o | O | o | O | o | O | o | |||||||||||
| E-< C | r-4 | < 3 | Γ- | < Li | <-> | < | Li | Ch | < | 9 | lA | < | ·—» | E-< a | r* | < | |
| 5 2 | m | ΙΑ | O Φ | ra | U | Φ | ra | Φ | Γ· | Γ* | a | © | < « | © | < |
$ o
E-1 < E·
Li ř o
E«
X i-í 43
Li
H ..
E« oi u _ X < E* < -* E* <o 43 >
>
< <
<
tj Eu>
O e< o <
H CL < a <
<
o. 0
E<
E· £
| °& 2 | O | t s | O | <C tt | O < X | O | E- | Φ | o | E- X | o | o | < θ’ | |
| V Κ e> | O | 5 2 | ra | cm 43 >-< | CO | E- | v | 43 -i | o | 2 »-< | ra | 43 Li | ||
| >r U *3 | m | 2 < | m | 2 «4 | ra 43 43 | ra | < | r* | 43 43 | a | 43 43 | o | < < | |
| < O | < Li | 5 s | < Li | < | 9 | E· M | E-< « | < U | ||||||
| 4J Lt | U X | ux | 2 | ·-« | <-1 | E« -< | U 4* | |||||||
| Q Cl | < H | O 43 | <ř- | <3 | 43 | U X | < M | E* 4fl | ||||||
| Ε-» « | < > | E* X | < X | 4J | < 9 | « 0 | E- 0. | |||||||
| 43 X | 43 <-» | 43 <-« | 15 -t | E | «0 | E- O | 2 x | < 0 | ||||||
| E* O | 43 43 | 43 43 | 43 43 | 43 | > | E- 4 | 24 | 43 < | ||||||
| < 4 | E* 0 | CJ C | E- w | E< | Q. | E- c | 43 CL | E- Li | ||||||
| O 4J ·-« | o | o | Λ 0 | O <-i | o | < | 0 | o | < w | o | 43 Li | o | 43 Φ | |
| <n 45 < | © | ř u | lA | 2 < | <-l O X | Γ» | 43 | < | Γ» | 2 < | 0« | E* E- | lA | < (Λ |
| ♦ | lA | ra | ra | Γ* | r» | ra | ||||||||
| Λ O | Η M | E- CL | E* 0 | < | 0 | < 0 | E* C | < 0 | ||||||
| O L< | *C~c | < M | 45 X | 2 | X | < X | Λ 0 | 2 x | ||||||
| U CL | U X | 43 < | H4J | < <4 | < 4 | 2 < | < 4 | |||||||
| 5 2 | E-· Li | h ? | O 43» | μ | 01 | E- 0 | < 0 | < O | ||||||
| < X | 43 Li | (3 Li | E- | X | < | 2 x | O Li | |||||||
| o u | E- t* | U CL | U < | Cl | 4j x | 24 | u CL |
-10CZ 285626 B6
Tabulka 4 - pokračování
| < < | < E | |||
| o | o | o | ||
| VD | u | U | ||
| σ» | o | O | 5- | o |
| o | o | |
| o | < | y? |
| o | o |
| < | ^4 | < | |||
| < | < | < | |||
| ř- | e* | < | < | ||
| < | < | ||||
| É-> Ž | 5 | o 5 | g | ||
| o h | o £ | O | < | O | |
| co h | v | < | o | ||
| cn < | <Λ ÉH | O | 6- | rH | 2 |
| r4 |
| O Λ | o h | O < | o o | |
| rlH | r· O | cn <5 | σ> | |
| Φ | O | o | ||
| O | < | ^4 | < | |
| 6·« | ξ- | O | ||
| 6* | < |
Polohy bází označených malými písmeny byly na sekvenačních gelech nejednoznačné. 5 Translace začíná bází č. 119.
Translace končí terminačním kodonem (báze č. 986).
Sekvence je uvedena od báze č. 1 do báze č. 1240.
Číslování sekvence začíná bází č. 119. Rozpoznávací místa EcoRI jsou podtržená.
-11CZ 285626 B6
Geny paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz, které mají alespoň zhruba 70% homologii nukleových kyselin s kódujícími sekvencemi Tox34 nebo Tox21a mohou být snadno izolovány za použití dobře známých hybridizačních zkoušek nebo vyhledávacích testů. Tyto postupy jsou vhodné zejména pro izolaci těchto genů neurotoxinů z roztočů parazitujících na hmyzu, a nejvíce z roztočů rodu Pyemotes. Funkčními ekvivalenty paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz podle vynálezu, jako jsou například Tox34 a Tox21a, jsou proteiny, které jsou biologicky aktivní jako Tox34 nebo/a Tox21a a jsou podstatně podobné ve struktuře, tj. v sekvenci aminokyselin, s Tox34 nebo/a Tox21a, jak jsou uvedeny v tabulce 2 respektive 4.
V souladu s tím vynález zahrnuje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, který je alespoň ze 70 % sekvenčně identický se sekvencí aminokyselin uvedenou v tabulce 4.
V souladu s tím vynález zahrnuje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, který je alespoň ze 70 % sekvenčně identický se sekvencí aminokyselin uvedenou v tabulce 4, přičemž tento neurotoxin má podstatně shodnou sekvenci aminokyselin jako v tabulce 4.
Mezi neurotoxiny podstatně podobné s Tox34 a Tox21a patří neurotoxiny, které jsou alespoň zhruba ze 70 % identické se sekvencí aminokyselin Tox34 nebo/a Tox21a. Mezi podstatně podobné neurotoxiny patří též neurotoxiny, které mají alespoň 70% podobnost sekvence aminokyselin s Tox34 nebo Tox21a, která umožňuje konzervativní aminokyselinovou substituci aminokyselin Tox34 a Tox21a. Odborníkům je jasné, že funkce proteinu může zůstat neovlivněna malými strukturními modifikacemi, zejména pokud jsou těmito strukturními modifikacemi substituce aminokyselin, které jsou si podobné svými chemickými a fyzikálními vlastnostmi. Strukturní modifikace, včetně delecí a inzercí aminokyselin, mohou být tolerovány bez vlivu na funkčnost.
Geny kódující neurotoxiny, které jsou funkčně ekvivalentní s Tox34 nebo/a Tox21a, mohou být izolovány a identifikovány nebo jinak připraveny libovolným o sobě známým způsobem, zejména na základě zde uvedených informací o sekvencích. Například, měření homologie sekvence aminokyselin nebo/a homologie sekvence nukleotidů hybridizačními metodami může být spojeno se zde popsanými postupy pro stanovení neurotoxicity pro hmyz, aby byly izolovány funkční neurotoxiny pro hmyz. K izolaci genů kódujících neurotoxiny, které jsou funkčně ekvivalentní s neurotoxiny podle vynálezu, mohou být použity například postupy PCR, v kombinaci s dalšími technikami známými v oboru a se zde uvedenými poznatky. Zde uvedené informace ve spojení s postupy týkajícími se syntézy proteinů a DNA, zachování vlastností mezi aminokyselinami a využití kodonů, umožňují odborníkům snadno vytvořit a syntetizovat neurotoxiny pro hmyz a geny neurotoxinů pro hmyz, které jsou funkčně ekvivalentní s Tox34 aTox21a.
V souladu s tím vynález zahrnuje rekombinantní molekulu DNA, obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento kódovaný paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň zhruba ze 70 % identickou sekvenci aminokyselin se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, která je uvedená v tabulce 2.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento kódovaný paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň zhruba z 83 % identickou sekvenci aminokyselin se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, která je uvedená v tabulce 2.
-12CZ 285626 B6
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň zhruba z 88 % podobnou sekvenci aminokyselin se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, která je uvedená v tabulce 2.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je uvedená v tabulce 2, zhruba od nukleotidu 118 do nukleotidu 873.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen má alespoň ze 70 % homologní sekvenci nukleotidů se sekvencí nukleotidů kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je uvedená v tabulce 2.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento kódovaný paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci aminokyselin, která je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má sekvenci aminokyselin alespoň ze 70 % identickou se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má sekvenci aminokyselin alespoň zhruba z 83 % identickou se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má sekvenci aminokyselin alespoň zhruba z 88 % podobnou se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen má alespoň zhruba ze 70 % homologní sekvenci nukleotidů se sekvencí nukleotidů kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče rodu Pyemotes.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče rodu Pyemotes a tímto roztočem je druh Pyemotes tritici.
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen má nukleotidovou sekvenci kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je uvedená v tabulce 4.
-13CZ 285626 B6
Vynález též zahrnuje rekombinantní molekulu DNA obsahující gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, který má sekvenci amynokyselin jak je uvedena v tabulce 4.
Dalším předmětem vynálezu je činidlo pro kontrolu hmyzu exprimující gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jako je baculovirus, např. AcMNPV, geneticky zkonstruovaný tak, aby exprimoval gen neurotoxinu, například gen neurotoxinu získaný z roztoče parazitujícího na hmyzu. V těchto činidlech je gen neurotoxinu specifického pro hmyz umístěn pod regulační kontrolu vhodných genově regulačních sekvencí, jako je promotor, tak, aby bylo v cílovém hmyzu vytvářeno takové množství neurotoxinu, které způsobuje toxický účinek, jako je ochromení. Mezi konkrétní provedení geneticky modifikovaného AcMNPV patří vETL-Tox34, vCap/Polh-Tox34, vEV-Tox34 a vSp-Tox34, ve kterých je pod kontrolou časného, silného pozdního nebo/a velmi pozdního promotoru exprimován gen Tox34. Zvláště výhodnými provedeními geneticky modifikovaného okludovaného AcMNPV jsou vSp-Tox34, kteiý patří mezi okludované viry, a vCap/Polh-Tox34, který je neokludovaný, ale umožňuje zlepšenou kontrolu hmyzu dříve než ostatní příklady. Odborníkovi je zřejmé, jak zkonstruovat analogický okludovaný virus. Odborníkovi je též jasné, že virus může být okludován koinfekcí buněk pomocným virem, který nahrazuje funkci genu pro polyhedrin.
Odborníkovi je též jasné, jak se zkonstruují rekombinantní viiy, ve kterých je gen toxinu vložen na další místa v genomu AcMNPV. Tyto viry mají gen toxinu spojený s vhodným promotorem vložený do libovolné nepodstatné oblasti genomu AcMNPV. Mezi nepodstatné oblasti patří oblast genu plO (Adang a Miller (1982) J. Virology 44: 782-793, Kuzio a kol. (1984) Virology 139: 414-418), oblast genu DA26 (O’Reilly a kol. (1990) J. Gen. Virology 71: 1029-1037), oblast ETL (Crawford a Miller (1988) J. Virology, 62: 2773-2781), oblast egt (O’Reilly a Miller (1990) J. Virology 64: 1321-1328), oblast otevřeného čtecího rámce 603 (Gearing a Possee (1990) J. Gen. Virology 71: 251-262), oblast otevřeného čtecího rámce p94 (Friesen a Miller (1987) J. Virology 61: 2264-2272) nebo další oblasti, které mohou být odborníkem snadno určeny. Vzhledem k podstatné homologii mezi některými geny různých baculovirů, je odborníkovi též jasné, jak vložit gen toxinu spojený s vhodným promotorem, do genomu jiných baculovirů v podobných nepodstatných místech.
V souladu s tím vynález zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz získaný z roztoče rodu Pyemotes.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz získaný z roztoče rodu Pyemotes a tímto roztočem je druh Pyemotes tritici.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž sekvence aminokyselin tohoto paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je alespoň zhruba ze 70 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
-14CZ 285626 B6
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž sekvence aminokyselin tohoto paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je zhruba alespoň z 83 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž sekvence aminokyselin tohoto paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je zhruba alespoň z 83 % podobná sekvenci aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873 v tabulce 2.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž sekvence nukleotidů tohoto genu je zhruba alespoň ze 70 % homologní se sekvencí nukleotidů kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 2, zhruba od nukleotidu 118 do nukleotidu 873.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento gen obsahuje sekvenci nukleotidů genu paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedena v tabulce 2, zhruba od nukleotidu 118 do nukleotidu 873.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento kódovaný paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že uvedený
-15CZ 285626 B6
AcMNPV exprimuje gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru, který působí velmi pozdě během infekce.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že uvedený AcMNPV exprimuje gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru, který působí velmi pozdě během infekce tímto AcMNPV je vEV-Tox34.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že uvedený AcMNPV exprimuje gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru, který je exprimován časně ve virové infekci.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že uvedený AcMNPV exprimuje gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru, který je exprimován časně ve virové infekci, a tímto AcMNPV je vETL-Tox34.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že je uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz exprimován pod regulační kontrolou syntetického promotoru.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že je uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz exprimován pod regulační kontrolou syntetického promotoru, a uvedeným AcMNPV je vSp-Tox34.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že je uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz exprimován pod regulační kontrolou hybridního promotoru.
Vynález též zahrnuje činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tímto činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně derivát baculoviru a tímto derivátem baculoviru je baculovirus NPV, konkrétně derivát AcMNPV, s tím, že je uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz exprimován pod regulační kontrolou hybridního promotoru, a uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je vCap/Polh-Tox34.
-16CZ 285626 B6
U konkrétního činidla pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, je sekvence aminokyselin tohoto kódovaného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz alespoň asi ze 70 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
U dalšího konkrétního činidla pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, je sekvence aminokyselin tohoto kódovaného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz alespoň asi z 83 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
U dalšího konkrétního činidla pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, je sekvence aminokyselin tohoto kódovaného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz alespoň asi z 88 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
U dalšího konkrétního činidla pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, obsahuje tento gen sekvenci nukleotidů paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4, zhruba od nukleotidu 118 do nukleotidu 873.
U dalšího konkrétního činidla pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, je nukleotidová sekvence tohoto genu alespoň asi ze 70 % homologní se sekvencí nukleotidů paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
U dalšího konkrétního činidla pro biologickou kontrolu hmyzu, které bylo geneticky modifikováno tak, aby obsahovalo a exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, má tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz sekvenci aminokyselin, která je uvedená v tabulce 4.
Dalším předmětem vynálezu je prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje virus hmyzu v množství toxickém pro hmyz, přičemž tímto virem může být například baculovirus geneticky zkonstruovaný tak, aby exprimoval paralytický neurotoxin specifický pro hmyz v takovém množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, a zemědělsky nebo jinak ekologicky upotřebitelný nosič. Takové prostředky mohou být použity k ochraně rostlin před hmyzími škůdci. Výhodnými činidly pro kontrolu hmyzu jsou činidla, která exprimují gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, který byl získán z roztočů parazitujících na hmyzu, a zejména z roztočů rodu Pyemotes. Pokud je virem hmyzu baculovirus skupiny GV nebo NPV, je výhodné, aby byly virové částice přítomné v okludované formě.
V souladu s tím vynález zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz,
-17CZ 285626 B6 a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že sekvence aminokyselin uvedeného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je alespoň asi ze 70 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že sekvence aminokyselin uvedeného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je alespoň asi z 83 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že sekvence aminokyselin uvedeného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je alespoň asi z 88 % podobná sekvenci aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 120 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že sekvence nukleotidů uvedeného genu kódujícího paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, je alespoň asi ze 70 % homologní se sekvencí nukleotidů paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz zhruba od nukleotidu 118 po nukleotid 873, jak je uvedeno v tabulce 2.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedený gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci nukleotidů, jak je uvedená v tabulce 2, zhruba od nukleotidu 118 po nukleotid 873.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, akteiý dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 2, od Asp kódovaného okolo nukleotidu 120 po Cys kódovaný okolo nukleotidu 873.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a kteiý dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že sekvence aminokyselin uvedeného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je alespoň asi ze 70 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
-18CZ 285626 B6
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že sekvence aminokyselin uvedeného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je alespoň asi z 83 % identická se sekvencí aminokyselin paralytického neurotoxinu specifické pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že sekvence aminokyselin uvedeného paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz je alespoň zhruba z 88 % podobná sekvenci aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedený gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci nukleotidů, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 4.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, kteiý obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu a konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru, a tento derivát baculoviru je derivátem AcMNPV.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru, a tento derivát baculoviru je derivátem AcMNPV, kterýžto AcMNPV exprimuje uvedený gen
-19CZ 285626 B6 paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru působícího velmi pozdě během infekce.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru, a tento derivát baculoviru je derivátem AcMNPV, přičemž tento AcMNPV exprimuje uvedený gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru působícího velmi pozdě během infekce, a uvedeným AcMNPV je vEV-Tox34.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru, a tento derivát baculoviru je derivátem AcMNPV, přičemž tento AcMNPV exprimuje uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru exprimovaného časně ve virové infekci.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru, a tento derivát baculoviru je derivátem AcMNPV, přičemž tento AcMNPV exprimuje uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz pod regulační kontrolou promotoru exprimovaného časně ve virové infekci, a uvedeným AcMNPV je vETL-Tox34.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru, přičemž tento derivát baculoviru je derivátem AcMNPV, a uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz je exprimován pod regulační kontrolou hybridního promotoru.
Vynález dále zahrnuje prostředek toxický pro hmyz, který obsahuje činidlo pro kontrolu hmyzu v množství, které má toxické účinky na cílový hmyz, přičemž toto činidlo bylo geneticky modifikováno tak, aby exprimovalo gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, a který dále obsahuje zemědělsky upotřebitelný nosič, s tím, že uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu je virus hmyzu, konkrétně je uvedeným činidlem pro kontrolu hmyzu derivát baculoviru, přičemž tento derivát baculoviru je derivátem AcMNPV, s tím, že uvedený paralytický neurotoxin specifický pro hmyz je exprimován pod regulační kontrolou hybridního promotoru, a uvedený AcMNPV je vybraný ze skupiny zahrnující vSp-Tox34 a vCap/Polh-Tox34.
Dalším předmětem vynálezu je způsob biologické kontroly hmyzích škůdců, zahrnující aplikaci prostředku toxického pro hmyz, který obsahuje v množství toxickém pro hmyz činidlo pro kontrolu hmyzu geneticky zkonstruované tak, aby exprimovalo gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz získaný z roztoče parazitujícího na hmyzu. Tento prostředek toxický pro hmyz se aplikuje do blízkosti cílového hmyzu, na životní prostředí hmyzu nebo na plochu, rostlinu nebo prostředí, které mají být chráněny před hmyzím škůdcem. Množství uvedeného činidla pro kontrolu v tomto prostředku a úroveň exprese uvedeného genu neurotoxinu v tomto
-20CZ 285626 B6 činidle pro kontrolu jsou takové, že prostředek má toxické účinky na cílový hmyz. Vhodnými činidly pro kontrolu hmyzu jsou viry hmyzu včetně baculovirů, zejména okludované viry, jako jsou viry ze skupin NPV a GV, a zvláště AcMNPV a jeho deriváty a blízce příbuzné viry. Podle vynálezu jsou nejvhodnější okludované formy geneticky změněných jaderných polyhedrosních virů. Odborníkovi je zřejmé, že geneticky změněný virus exprimující toxin hmyzu může být sám schopný okludovat, nebo že okludování může být dosaženo jinými způsoby, například koinfekcí s virem okluzně pozitivním.
V souladu s tím vynález zahrnuje způsob kontroly hmyzích škůdců, vyznačující se tím, že se aplikují činidla 16 a 42 v množství toxickém pro hmyz na životní prostředí uvedených hmyzích škůdců.
Vynález rovněž zahrnuje způsob kontroly hmyzích škůdců, vyznačující se tím, že se aplikují činidla 16 a 42 v množství toxickém pro hmyz na životní prostředí uvedených hmyzích škůdců, přičemž tímto životním prostředím hmyzu je rostlina.
Vynález rovněž zahrnuje způsob kontroly hmyzích škůdců, vyznačující se tím, že se distribuují návnady obsahující činidla 16 a 42 v množství toxickém pro hmyz.
Podobně jsou předmětem vynálezu činidla pro kontrolu hmyzu geneticky změněná tak, aby exprimovala gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, přičemž tato činidla jsou účinná proti jiným hmyzím škůdcům, než kteří napadají nebojsou škodliví pro rostliny. Takové činidlo může být začleněno do pro hmyz toxických, hmyz ochromujících nebo insekticidních prostředků, společně s ekologicky přijatelnými nosiči, jak jsou známy v oboru, a může být použito jako způsob kontroly cílového hmyzího škůdce, který je citlivý ke konkrétnímu použitému činidlu pro kontrolu hmyzu.
Kromě použití v insekticidních prostředcích na ochranu rostlin, mohou být činidla pro kontrolu hmyzu podle vynálezu použita pro kontrolu dalších hmyzích škůdců, podle výběru konkrétního organismu geneticky modifikovaného tak, aby exprimoval paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, vhodného pro cílového hmyzího škůdce. Jsou známy například baculoviiy, které specificky infikují komáry a blechy. (Viz Beard a kol. (1989) J.Invertebrate Path. 54: 128-131 aFederici (1980) Virology 100: 1-9.) Stejně jako v případě hmyzích škůdců napadajících rostliny, vybere odborník podle cílového hmyzu činidlo pro kontrolu hmyzu použité pro expresi paralytického toxinu. Odborníkovi je též jasné, jak vybrat vhodné regulační nebo/a promotorové sekvence, které jsou vhodné pro použití v případě daného činidla pro kontrolu hmyzu.
Dalším předmětem vynálezu je způsob produkce paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v buňce, ve které není přirozeně exprimován. Tento způsob zahrnuje zkonstruování rekombinantní molekuly DNA, ve které je kódující sekvence neurotoxinu specifického pro hmyz pod kontrolou regulační sekvence, která ovlivňuje expresi kódující sekvence ve vybrané hostitelské buňce, introdukci této rekombinantní molekuly DNA do vhodné hostitelské buňky, a pěstování výsledné rekombinantní hostitelské buňky v podmínkách, které umožňují expresi sekvence kódující hmyzí toxin. Sekvence kódující neurotoxin se vloží například downstream od promotoru expresibilního v hostitelské buňce nebo v infikované hostitelské buňce. Molekula DNA obsahující expresibilní neurotoxinovou sekvenci může být introdukována do hostitelské buňky za použití vektorových sekvencí, které usnadňují její introdukci. Kultivace hostitelské buňky může zahrnovat kultivaci jednotlivých buněk v kapalném prostředí, buněčnou tkáňovou kulturu, nebo propagaci buněk zkonstruovaných tak, aby exprimovaly gen neurotoxinu, v mnohobuněčném organismu, včetně vyšších organismů jako je hmyz. Obecně může být pro introdukci DNA do hostitelské buňky použito libovolného způsobu o sobě známého v oboru.
V oboru je známo, jak vybrat hostitelské buňky, plazmidové nebo virové vektorové sekvence, promotory a geny neurotoxinů vhodné pro tuto výrobu. Neurotoxiny specifické pro hmyz produkované v těchto kulturách geneticky změněných hostitelských buněk jsou, pokud jsou
-21CZ 285626 B6 vhodně aplikovány cílovému hmyzu, pro tento hmyz toxické. Mohou být využity neurotoxiny produkované v těchto kulturách.
V souladu s tím vynález zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou provést introdukci do hostitelské buňky a replikaci v ní, promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález též zahrnuje způsob výroby podstatně čistého paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, vyznačující se tím, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou provést introdukci do hostitelské buňky a replikaci v ní, promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz a dále zahrnuje čištění tohoto neurotoxinu po uvedené kultivaci.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, přičemž tato vektorová část je získána z viru hmyzu, dále promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
-22CZ 285626 B6
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, přičemž tato vektorová část je získána z viru hmyzu, přičemž uvedeným virem hmyzu je baculovirus, dále obsahuje promotor, kteiý funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, přičemž tato vektorová část je získána z viru hmyzu, přičemž uvedeným virem hmyzu je baculovirus, a tímto baculovirem je jaderný polyhedrosní virus, dále obsahuje promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, přičemž tato vektorová část je získána z víru hmyzu, přičemž uvedeným virem hmyzu je baculovirus, tímto baculovirem je jaderný polyhedrosní virus, a tímto jaderným polyhedrosním virem je AcMNPV, dále obsahuje promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
-23CZ 285626 B6
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, dále promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tato kódující sekvence pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz je z roztoče živícího se dravě na hmyzu, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, dále promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň asi 70% aminokyselinovou identitu se sekvencí aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 118 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a dále obsahuje kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň asi 83% aminokyselinovou identitu se sekvencí aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 118 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
-24CZ 285626 B6
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a dále obsahuje kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň asi 88% aminokyselinovou podobnost se sekvencí aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 118 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a dále obsahuje kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň asi 70% aminokyselinovou identitu se sekvencí aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 4, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní; promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a dále obsahuje kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň asi 83% aminokyselinovou identitu se sekvencí aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 4, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a
-25CZ 285626 B6 (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Vynález rovněž zahrnuje způsob výroby paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v hostitelské buňce, který spočívá v tom, že se:
(a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, která obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, promotor, který funguje v uvedené hostitelské buňce, a dále obsahuje kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz přičemž tento paralytický neurotoxin specifický pro hmyz má alespoň asi 88% aminokyselinovou identitu se sekvencí aminokyselin, jak je uvedená v tabulce 2, od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 118 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873, která je exprimovatelná v uvedené hostitelské buňce, přičemž jsou tento promotor a kódující sekvence umístěny v této molekule v rámci uvedené vektorové části, tak, že je v hostitelské buňce neurotoxin exprimován pod kontrolou tohoto promotoru, (b) introdukuje tato rekombinantní molekula DNA do hostitelské buňky, aby se vytvořila geneticky změněná hostitelská buňka, a (c) tento geneticky změněný hostitel kultivuje tak, aby byla exprimována uvedená kódující sekvence a produkován paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Popis obrázků
Obrázek 1 zobrazuje plazmid pEV-Tox34. Tento plazmid byl použit při konstruování rekombinantního AcMNPV vEV-Tox34 homologní rekombinací mezi neupraveným typem viru a polyhedrinovou sekvencí plazmidu. Fragment EcoRI o velikosti 933 bp obsahující Tox34 byl vložen do pEVmodXTV (viz americká patentová přihláška č. 353.847, podaná 17. května 1989). Plazmid obsahuje vektorovou sekvenci o délce 2,6 kbp (znázorněno jako prázdná oblast), oblast o délce 0,8 kbp genomu AcMNPV bezprostředně upstream od genu polyhedrinu, oblast o délce 1,5 kbp genomu AcMNPV od místa KpnI v genu polyhedrinu a rozprostírající se downstream od tohoto genu (sekvence AcMNPV jsou vyčárovány), a modifikovaný polyhedrinový promotor LSXTV, znázorněný jako vyplněná šipka mezi restrikčními místy EcoRV a BglU. Směr kódující sekvence Tox34 (vytečkováno) od promotoru LSXIV je znázorněn šipkou uvnitř kruhu.
Obrázek 2 porovnává vliv na hmotnostní přírůstky u larev hmyzu infikovaných injekcí buď neupraveného typu AcMNPV (L-l) nebo rekombinantního viru vEV-Tox34 jako funkci času po infekci (hodiny po infekci jsou znázorněny na ose označené H). Pokus zahrnoval též kontrolu (TC-100). První pozorování larev bylo provedeno 24 hodin po injekci (označeno jako 0 hodin po infekci). Larvy, které zemřely v důsledku fyzikálních vlivů injekce byly v této době ze studia vyloučeny. Počet larev v každé skupině je označen N. Larvy byly váženy a jejich průměrné hmotnosti, včetně standardní odchylky, znázorňují sloupce a rozpětí nad každým sloupcem (stupnice vlevo na ose označené x udává průměrnou hmotnost larvy v miligramech ± standardní odchylku). Procento ochromených v každé skupině larev v jednotlivých časech znázorňují černé středové sloupce v širších sloupcích znázorňujících průměrnou hmotnost (stupnice na pravé straně udává procento ochromených nebo mrtvých). % O znamená procento ochromených, Z znamená zakuklených, M znamená ochromených nebo mrtvých.
Obrázek 3 znázorňuje plazmid phc-dETL-pTox34, který byl použit pro konstruování rekombinantního viru vETL-Tox34, přičemž tento virus exprimuje TxP-I pod regulační kontrolou časného promotoru ETL z AcMNPV. Fragment BglH/Kpnl z pEV-Tox34 obsahující kódující sekvenci Tox34 (vytečkováno) byl vložen do míst BglII a KpnI plazmidu phc-dET, který byl získán z phcwt (Rankin a kol. (1988), viz výše) nahrazením polyhedrinového promotoru mezi
-26CZ 285626 B6 místy EcoRV a Bgin promotorovými sekvencemi ETL (Crawford a Miller (1988) J. Virology 62: 2773-2781) rozprostírajícími se od -300 do -6 (relativně k iniciačními kodonu translace ATG označenému +1, +2, +3). Promotor ETL je označen vyplněnou šipkou. Genomové sekvence AcMNPV, které řídí homologní rekombinace a nahrazování alel jsou znázorněny vyčárováním. Tyto sekvence obklopují fůzi promotor ETL/Tox34. Sekvence hr5 z AcMNPV byla původně vložena do phcwt pro nesouvisející účely. Je umístěna na fragmentu HindUI-SalI na spojení AcMNPV/vektor, znázorněném na levé straně diagramu. Vektorové sekvence jsou znázorněny jako prázdná část. Zobrazena jsou též rozpoznávací místa významných restrikčních endonukleas.
Obrázek 4 znázorňuje plazmid pSp-Tox34, který byl použit pro konstruování rekombinantního viru vSP-Tox34, který exprimuje kódující sekvenci Tox34 pod regulační kontrolou syntetického hybridního velmi pozdního promotoru (označeného SPLSXTV a popsaného v americké patentové přihlášce č. 353.847, podané 17. května 1989). pSp-Tox34 obsahuje celý gen polyhedrinu pod kontrolou jeho vlastního promotoru, a další sekvence AcMNPV, které obklopují gen polyhedrinu. Sekvence AcMNPV jsou znázorněny vyčárováním. Vektorové sekvence jsou znázorněny jako prázdná oblast. Fragment EcoRI obsahující kódující sekvenci Tox34 byl vložen do místa EcoRI downstream od promotoru SPLSXTV a v opačné orientaci než gen polyhedrinu. Exprese genu řízená hybridním promotorem je vyšší než v případě polyhedrinového promotoru. vSp-Tox34 má okludovaný fenotyp díky neporušenosti genu polyhedrinu.
Obrázek 5 znázorňuje plazmid pCap/Polh-Tox34, který je použit pro konstruování rekombinantního viru vCap/Polh-Tox34, který exprimuje kódující sekvenci Tox34 pod regulační kontrolou fuzního promotoru Cap/Polh, který popsali Thiem a kol. (1990) Gene 91: 87-95. Fragment BglII/KpnI z pEV-Tox34 obsahující sekvence Tox34 nahradil gen pro CAT v pCap/Polh-CAT (Thiem a kol. (1990), viz výše). Směr kódující sekvence Tox34 (vytečkováno) od promotoru Cap/Polh (vyznačeno křížky) je znázorněna šipkou. Sekvence neupraveného typu viru a vektoru pUCB jsou vyznačeny jako vyčárované, respektive prázdné oblasti.
Obrázek 6 porovnává přírůstky hmotnosti pozdního čtvrtého a raného pátého instaru larev Trichoplusia ni po orálním podání kultivačního média (TC-100) a okluzních tělísek buď neupraveného typu AcMNPV, nebo vSp-Tox34. Výška histogramů podél osy y (označené x představuje průměrnou hmotnost 30 larev na každý testovaný virus v miligramech, pokud není uveden jiný počet (N). V pozdějších obdobích byly stanovovány průměrné hmotnosti pouze u živého hmyzu. Sloupce odchylek udávají plus nebo minus dvakrát standardní odchylku. Obecně, průměr plus nebo minus dvě standardní odchylky obsahuje zhruba 95 % experimentálních měření v standardním rozdělení. Larvy byly drženy bez potravy po dobu 24 hodin předtím, než jim byl podán malý kousek potravy, která byla předtím ponořena do suspenze 2 x 108 okluzních tělísek na ml vody. Dřívější studia ukázala, že to je dávka LDioo- Po krmení infikovanou potravou po dobu 24 hodin byla larvám podána neinfikovaná potrava a larvy byly váženy každých 24 hodin. Dny po podání infikované potravy jsou vyznačeny na ose x (označené D). Den 0 je dnem, kdy byla larvám podána infikovaná potrava. Prázdné, vyčárované a křížky vyznačené histogramy vyjadřují neinfikované larvy, larvy infikované neupraveným typem AcMNPV, respektive larvy infikované vSp-Tox34. Sloupce uvnitř každého histogramového sloupce znázorňují procento larev, které byly ochromeny nebo odumřely (vyplněné sloupce, označení M), nebo se zakuklily (prázdné sloupce, označení Z).
Obrázek 7 porovnává hmotnostní přírůstky larev Trichoplusia ni ve stáří 12 hodin prvního larválního instaru, po injekci 4 x 105 plaky tvořících jednotek neokludovaného AcMNPV (L-l, stoupající čárování), vEV-Tox34 (prázdné sloupce), vCap/Polh-Tox34 (vystínované sloupce), vETL-Tox34 (vyznačeno křížky) nebo vSp-Tox34 (vytečkováno). Neinfikované larvy byly injektovány 2 mikrolitry kapaliny tkáňové kultury. Larvy byly nejprve zváženy, poté injektovány a byla jim podána potrava prostá virů. Sloupce odchylek znázorňují ± 2x standardní odchylku, která zahrnuje 95 % pokusných měření ve standardním rozdělení. Průměry, jejichž sloupce odchylek se nepřekrývají, mohou být bez dalších statistických analýz považovány za podstatně
-27CZ 285626 B6 rozdílné na hladině významnosti 0,05. V případech, kde se sloupce odchylek překrývají, byl prováděn Studentův t-test pro párové porovnání dvou průměrů (Student’s t test for the pair-wise comparison of two means (DECals-PLUS Routine Library, Digital Equipment Corp., Merrimack, New Hampshire) nebo Duncanův test pro vícenásobné třídění (Duncan’s Multiple Range test, SAS Base/Stat Release 6.04, SAS Institute, Cary, North Carolina). Průměrům, které nebyly statisticky rozdílné, byla přidělena písmena (A, B, C ...), která označují nejvyšší až nejnižší průměrnou hmotnost v daném dni měření, a jsou uvedena nad sloupci standardních odchylek. Na ose označené D jsou vyznačeny dny po infekci, na ose označené x pak průměrná hmotnost larev v miligramech. Počet zkoumaných larev byl 30 pro každé ošetření. M znamená ochromených nebo mrtvých, Z znamená zakuklených.
Obrázek 8 znázorňuje autoradiogramy polyakrylamidových gelů SDS, které zobrazují proteiny produkované buňkami S. frugiperda infikovanými wt-AcMNPV nebo vEV-Tox34 jako funkci času po infekci. Po jednohodinové adsorpci byly infikované buňky radioaktivně označeny /3sS/— cysteinem v době 6, 12, 24, 36 a 48 hodin po infekci (označeno H). Proteiny z kapaliny tkáňové kultury (intracelulámí, obrázek SA), a z buněčných lyzátů (extracelulámí, obrázek 8B) byly denaturovány, redukovány a byla provedena elektroforéza za použití 12% polyakrylamidových gelů. Gely byly impregnovány fluorem, vysušeny a použity k exponování filmu citlivého na paprsky X. Proteiny standardní velikosti byly použity pro elektroforézu v nejvíce levém pásu každého gelu a molekulové hmotnosti jsou vyznačeny. Proteiny z neinfikovaných buněk jsou separovány v pásu označeném MOCK. Původ zbylých proteinů je vyznačen na obou částech obrázku. Pruhy proteinů TxP-I, ΤχΡ-Π a polyhedrinu jsou označeny šipkami.
Na obrázku 9A-9B je znázorněna sekvence DNA a odvozená sekvence aminokyselin Tox34. Podtržené jsou aminokyseliny, které byly identifikovány jako N-koncové aminokyseliny vyčištěného proteinu TxP-I. První báze kódující sekvence TxP-I je označena 1.
Na obrázku 10A-10C je znázorněna nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence Tox21a. Polohy bází označených malými písmeny byly na sekvenačních gelech nejednoznačné. Translace začíná bází č. 119. Translace končí terminačním kodonem (báze č. 986). Sekvence je uvedena od báze č. 1 do báze č. 1240. Číslování sekvence začíná bází č. 119. Rozpoznávací místa EcoRI jsou podtržená.
Podrobný popis vynálezu
Činidlem pro biologickou kontrolu hmyzu je činidlo účinné při kontrole hmyzích škůdců. Mezi kontrolní činidla, která mohou být modifikována aby exprimovala paralytický neurotoxin specifický pro hmyz pro použití ve vynálezu patří viry hmyzu, entomopatogení bakterie a houby, bakterie tvořící kolonie na rostlinách, rostliny a viry rostlin, které jsou přenášeny nebo mohou být náhodně přijaty hmyzem. Kontrola může znamenat omezení požerového chování hmyzích škůdců nebo usmrcování hmyzích škůdců. Činidlo pro biologickou kontrolu hmyzu podle vynálezu musí mít toxické účinky na hmyz, které lze alespoň zčásti přičíst expresi sekvence kódující neurotoxin specifický pro hmyz. Toxické účinky na hmyz představují libovolné nepříznivé účinky na cílový hmyz a lze je pozorovat jako ochromení nebo/a usmrcování hmyzu nebo jako změnu v normálním chování cílového hmyzu, jako například v chování souvisejícím s požerem, odpovědi na podráždění nebo jiných stereotypních chováních.
Roztoči parazitujícími na hmyzu jsou roztoči, kteří se živý hmyzem. Mnoho z těchto roztočů vstřikuje jed do hmyzího hostitele, kterým se živí. Tento jed obsahuje paralytické neurotoxiny specifické pro hmyz, které imobilizují hostitelský hmyz. Mezi roztoče, kteří nej výhodněji exprimují geny paralytických toxinů specifických pro hmyz patří roztoči ze skupiny ventricosus, která zahrnuje P. anobii, P. beckeri, P. emerginatus, P. schwerdtfegeri, P. tuberculatus, P. tritici, P. ventricosus a P. zwoelferi.
-28CZ 285626 B6
Paralytickým neurotoxinem specifickým pro hmyz je polypeptid, který způsobuje ochromení citlivého hmyzu. Neurotoxinem paralytickým pro hmyz mohou být ovlivněny larvy nebo/a dospělý hmyz. Paralytické účinky neurotoxinu mohou být zpočátku pozorovány jako účinky na mobilitu nebo jiná chování hmyzu včetně chování souvisejícího s požerem. Neurotoxiny specifické pro hmyz jsou neurotoxiny, které nepříznivě ovlivňují hmyz, a mají zanedbatelné účinky na vyšší živočichy, zejména savce. Konkrétními příklady paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz jsou produkty genů Tox34 a Tox21a, a proteiny TxP-I a ΤχΡ-Π, produkované P. tritici. Odvozené sekvence aminokyselin dvou reprezentativních paralytických proteinů specifických pro hmyz jsou uvedeny v tabulkách 2 a 4. Za funkční ekvivalent proteinů Tox34 a Tox21a je považován libovolný protein se sekvencí aminokyselin, která je podstatně identická (alespoň zhruba ze 70 % identická nebo alespoň zhruba ze 70 % podobná) se sekvencí aminokyselin od aspartátu kódovaného okolo nukleotidu 118 po cystein kódovaný okolo nukleotidu 873 nebo je podstatně identická se sekvencí v tabulce 4, který má měřitelné toxické účinky na hmyz. S výhodou je sekvence aminokyselin paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz alespoň zhruba z 83 % identická (s tím, že na mezery v jednotlivé sekvenci se pohlíží jako na neidentické, nepodobné aminokyseliny ve srovnání se sekvencemi uvedenými v tabulce 2 nebo 4), nebo alespoň zhruba z 88 % podobná. Toxin, který je funkčně ekvivalentní s neurotoxinem podle vynálezu způsobuje podobné stahové ochromení svalů hmyzu jako způsobují Tox34 a Tox21a. Je dobře známo v oboru biologie, že v sekvencích proteinů mohou být provedeny určité substituce aminokyselin, aniž by ovlivnily funkci proteinu. Obecně jsou bez ovlivňování funkce proteinu tolerovány konzervativní substituce aminokyselin nebo substituce podobných aminokyselin. Podobnými aminokyselinami jsou takové aminokyseliny, které jsou si podobné velikostí nebo/a vlastnostmi, například oba páry aspartát a glutamát, a isoleucin a valin jsou podobnými aminokyselinami. Podobnost mezi aminokyselinovými páry může být v oboru stanovena řadou způsobů. Například, Dayhoff a kol. (1978) v Atlas of Protein Sequence and Structure, svazek 5, dodatek 3, kapitola 22, str. 345-352 poskytuje tabulky četností pro substituce aminokyselin, které mohou být použity jako měřítko podobnosti aminokyselin. Tabulky četností, které uvádějí Dayhoff a kol., jsou založeny na srovnáních sekvencí aminokyselin proteinů, které mají stejné funkce, z mnoha evolučně rozdílných zdrojů.
Mezi další funkční ekvivalenty paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz, jak jsou zde definovány, patří polypeptidy, části jejichž sekvencí aminokyselin jsou podstatně identické sTox34 nebo Tox21a, nebo polypeptidy které jsou samy částmi plné délky proteinu TxP-I či mají aminokyselinovou sekvenci proteinu Tox34 nebo Tox21a do které byla provedena inzerce, a které si zachovávají biologickou aktivitu paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, který způsobuje stahové ochromení svalů.
Geny paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz mohou být získány z roztočů živících se dravě na hmyzu, včetně roztočů uvedených v tabulce 1, která ovšem nijak neomezuje rozsah vynálezu, zejména ze skupiny ventricosus, nebo z jiných hmyzích parazitů nebo predátorů. Geny, které jsou homologní s geny Tox34 a Tox21a podle vynálezu, mohou být v roztočích nebo jiných zdrojích identifikovány hybridizací nukleových kyselin se sekvencemi uvedenými ve vynálezu či cross-reakcí molekul toxinu s protilátkou specifickou pro toxiny podle vynálezu, nebo libovolným jiným o sobě známým způsobem, včetně použití technologie PCR prováděné za použití nukleotidů odpovídajících konzervovaným nebo nedvojznačným oblastem toxinových genů, které jsou zde uvedeny jako příklady. V zásadě může být identifikován libovolný gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, a tento gen může být exprimován v baculovirovém vektoru. Biologická aktivita exprimovaného proteinu může být snadno určena, a podobně může být účinnost takovéhoto geneticky modifikovaného vektoru stanovena za použití poznatků ve vynálezu ve spojení s postupy o sobě známými v oboru.
Rekombinantní molekulou DNA je molekula, která byla vyrobena buď přirozenými pochody za použití známých metod a řízení člověkem s cílem vytvořit požadovaný výsledný produkt, nebo
-29CZ 285626 B6 byla uměle vytvořena z částí získaných z heterologních zdrojů, přičemž tyto části se mohou přirozeně vyskytovat nebo jimi mohou být chemicky syntetizované molekuly, a tyto části byly spojeny ligací nebo jiným o sobě známým způsobem.
Pojem geneticky modifikovaný(á) tak, aby obsahoval(a) a exprimoval(a) gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz znamená, že se do činidla pro biologickou kontrolu hmyzu nebo hostitelské buňky, která nebo který přirozeně neobsahuje takový gen, introdukují nukleotidové sekvence kódující shora uvedený protein a řídící jeho syntézu, takže modifikované činidlo nebo modifikovaná buňka může produkovat tento protein neurotoxin. K inzerci expresibilního 10 genu neurotoxinu do konkrétního kontrolního činidla nebo hostitelské buňky může být použit libovolný o sobě známý způsob.
K řízení transkripce a translace nukleotidové sekvence kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz mohou být použity libovolné v oboru známé regulační sekvence, promotorové nebo 15 s promotorem spojené sekvence, které řídí expresi genu v konkrétním infikovaném nebo neinfikovaném hostiteli či infikované nebo neinfikované hostitelské buňce.
Je samozřejmé, že výběr konkrétních regulačních sekvencí nebo promotorů určují cíle, kterých má být dosaženo. Například v případě, že je požadována vysoká úroveň exprese, mohou být 20 vhodnými promotory u viru hmyzu, například baculoviru, zejména silné pozdní nebo velmi pozdní promotory, syntetické promotory nebo hybridní promotory. Pokud je však cílem produkovat paralytický neurotoxin limitující požer hmyzích larev v co nejkratším možném čase nebo rozšířit účinné spektrum hostitelů viru hmyzu, je žádoucí umístit gen paralytického neurotoxinu pod regulační kontrolu baculovirového nebo nebaculovirového (například hmyzího) promotoru 25 exprimovaného časně v infekčním procesu.
Baculovirus NPV izolovaný z Autographa califomica (Lepidoptera: Noctuidae), zejména AcMNPV, je virus hmyzu uvedený v tomto textu jako příklad. Termíny AcMNPV a AcNPV byly používány pro stejné viry. Termín AcMNPV je v současnosti v oboru více uznávaný. Udává 30 se, že infektivita většiny NPV je omezena na rod nebo čeleď původních hostitelů. (Viz Groner (1986), viz výše.) Uvádí se, že baculoviry AcMNPV se replikují v několika čeledích Lepidoptera, ale jejich infektivita je tímto omezena. Mezi další entomopatogenní viry použitelné ve vynálezu patří další baculoviry, iridoviry, parvoviry, nodamuraviry, viry CPV, entomopoxviry, ascoviiy a retroviry, čímž ovšem nijak není omezen rozsah vynálezu. V oboru je známo, jak 35 vložit do virového genomu expresibilní gen na místo, které nesouvisí s virovými replikativními funkcemi. Podobně může odborník vybrat promotor požadované síly a času exprese, pro řízení exprese genu paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v požadovaném virovém vektoru. Cílový hmyz určuje výběr viru, a konkrétní virus, který má být zkonstruován, vede odborníka při výběru vhodného promotoru.
Činidlem pro kontrolu hmyzu, jak je zde tento termín užíván, je prostředek nebo účinná složka prostředku, který má nepříznivý vliv na hmyzí škůdce. Jako odpověď na činidlo pro kontrolu hmyzu je v důsledku exprese paralytického neurotoxinu snížen požer hmyzu nebojsou ovlivněna další chování, a následuje smrt hmyzu. Činidlem pro kontrolu hmyzu podle vynálezu je účelně 45 virus hmyzu geneticky zkonstruovaný tak, aby exprimoval heterologní gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, ale může jím být též entomopatogenní houba nebo bakterie, která byla geneticky zkonstruována tak, aby exprimovala heterologní gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz. S výhodou je toxin vylučován do hemolymfy hmyzu infikovaného geneticky zkonstruovaným entomopatogenem.
Insekticidní prostředky vhodné pro aplikaci na rostliny za účelem kontroly hmyzích škůdců obsahují zemědělsky upotřebitelný nosič a činidlo pro kontrolu hmyzu. Aplikace insekticidního prostředku podle vynálezu může chránit rostliny před hmyzími škůdci tím, že snižuje požer citlivého hmyzu nebo jej usmrcuje.
-30CZ 285626 B6
Odborníkovi je zřejmé, jak vybrat činidlo pro kontrolu hmyzu, například virus hmyzu, které je vhodné pro kontrolu konkrétního hmyzího škůdce. Odborníkovi je též jasné, jak řídit expresi paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v konkrétním činidle pro kontrolu hmyzu nebo hostitelské buňce.
Odborníkovi je zřejmé, že hmyzí škůdci mohou být vystaveni účinkům činidla pro kontrolu hmyzu podle vynálezu běžnými způsoby včetně požití, vdechnutí nebo přímého kontaktu s činidlem pro kontrolu hmyzu.
Geneticky modifikováni tak, aby exprimovali gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, mohou být též parazité hmyzu, včetně bakterií, virů, hub, roztočů, háďátek, prvoků a hmyzu. Napadení nebo infekce vhodného hmyzu takovými parazity hmyzu má za následek ochromení tohoto hmyzu, kromě příznaků normálně spojených s nemodifikovaným parazitem. Ochromení infikovaného hmyzu aktivuje chorobný stav hmyzu. Napadení a infekce hmyzího škůdce omezuje požer a urychluje smrt. Mezi konkrétní příklady těchto proteinů toxinů patří Tox34 a Tox21a, nikterak však neomezují rozsah vynálezu.
Sekvence DNA kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz, jak je zde popsán, exprimované pod regulační kontrolou promotoru vhodného pro daný organismus, lze použít ke genetickému modifikování organismu, aby bylo vytvořeno činidlo pro kontrolu hmyzu. Mezi cílové organismy takovéhoto genetického modifikování patří parazité hmyzu, rostliny a nefytopatogenní bakterie tvořící kolonie na rostlinách.
Základním použitím geneticky zkonstruovaných činidel pro kontrolu hmyzu, výhodně baculovirů, podle vynálezu, je jejich použití jako složek zemědělských prostředků pro aplikaci na rostliny, životní prostředí rostlin nebo distribuci v návnadách s cílem provést biologickou kontrolu hmyzích škůdců. Je též možné použít činidla pro kontrolu hmyzu podle vynálezu pro kontrolu jiného škodlivého hmyzu, s odpovídající volbou konkrétního organismu geneticky modifikovaného tak, aby exprimoval paralytický neurotoxin specifický pro hmyz. Jsou například známy baculoviry, které specificky infikují jak komáry, tak blechy. Výběr činidla pro kontrolu hmyzu, které exprimuje paralytický toxin, se řídí cílovým hmyzem, a konkrétní činidlo předurčuje výběr vhodné promotorové sekvence. V oboru je známo mnoho možností jak připravit takové zemědělsky vhodné nebo/a ekologicky upotřebitelné prostředky pro kontrolu hmyzu.
Koncentrace činidla pro kontrolu hmyzu, které je nutné pro výrobu insekticidně účinných prostředků pro kontrolu hmyzích škůdců závisí na použitém typu organismu a neurotoxinu a na formulaci přípravku. Insekticidně účinná koncentrace činidla pro kontrolu hmyzu v prostředku může být snadno určena experimentálně, jak je odborníkovi zřejmé. Například insekticidně účinná koncentrace viru může být snadno určena za použití o sobě známých postupů.
Zemědělské prostředky pro kontrolu hmyzích škůdců rostlin musí být vhodné pro zemědělské použití a aplikaci v polích. Podobně musí být prostředky pro kontrolu ostatních hmyzích škůdců ekologicky přijatelné. Obecně musí být složky prostředku nefytotoxické a nepoškozující integritu okludovaného viru. Prostředky pro listovou aplikaci nesmí poškozovat nebo zraňovat listy rostlin. Kromě vhodných pevných nebo výhodněji kapalných nosičů mohou zemědělské prostředky obsahovat adhezivní činidla, emulgátory a smáčedla, ale nikoliv složky, které potlačují příjem hmyzem nebo libovolné virové funkce. Může být též žádoucí přidat složky, které chrání činidlo pro kontrolu hmyzu před inaktivací UV-zářením nebo složky, které slouží jako pomocné látky, pro zvýšení účinnosti nebo/a virulence entomopatogenu. Zemědělské prostředky pro kontrolu hmyzích škůdců mohou též obsahovat činidla, která stimulují příjem hmyzem.
-31CZ 285626 B6
Práce popisující způsoby aplikace činidel pro biologickou kontrolu hmyzu a způsoby zemědělské aplikace přípravků jsou dostupné, viz například Couch a Ignoffo (1981) v Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970-1980, ed. Burges, kapitola 34, str. 621-634; Corke a Rishbeth, tamtéž, kapitola 39, str. 717-732; Brockwell (1980) v Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, ed. Bergersen, str. 417-488; Burton (1982) v Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, eds. Graham a Harris, str. 105-114; a Roughley (1982), tamtéž, str. 115127; The Biology of Baculoviruses, svazek Π, viz výše, a odkazy citované v těchto pracích.
Vynález je ilustrován následujícími příklady provedení vynálezu, které však rozsah vynálezu v žádném směru neomezují. Po přečtení tohoto popisu může odborník provést řadu dalších provedení, modifikací, alternativ a analogií konkrétně popsaných postupů, materiálů a technik, aniž by se odchýlil od povahy vynálezu nebo/a rozsahu připojených patentových nároků.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování genu TxP-I P. tritici
Ze směsi samiček roztočů hledajících hostitele a gravidních se izoluje zcela polyadenylovaná RNA za použití postupů, které popsali Davis a kol. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., New York, New York; Jacobson (1987) Meth. Enzymol. 152: 254. Za použití této polyadenylované RNA jako templátu se vyrobí cDNA. Přidají se linkeiy EcoRl a cDNA se klonují do lambda ZAP-II (od Stratagene, La Jolla, Califomia), aby se vytvořila cDNA knihovna.
S použitím postupu dodávaného výrobcem (Stratagene, La Jolla, Califomia) bylo testováno šest milionů plaků za použití výše popsané polyklonální protilátky proti TxP-I. Byla identifikována řada klonů, které vykazovaly významnou cross-reakci na tuto protilátku.
Počínaje nej silněji imunopozitivními klony cDNA, bylo osm různých protilátkově pozitivních inzertů cDNA subklonováno z fága lambda do plazmidů a sekvenováno. Předpokládané otevřené čtecí rámce byly použity pro hledání homologií proteinových sekvencí v GENBANK (release 60,0). Čtyři z těchto inzertů cDNA, včetně nejsilněji imunopozitivních cDNA, kódovaly proteiny, které byly podstatně homologické s myosinem, topoisomerasou Π, fosfoinositid specifickou fosfolipasou C a proteinem tepelného šoku 70. Jeden klon obsahoval více fragmentů EcoRl, a tudíž zřejmě obsahoval více inzertů cDNA. Pozornost byla zaměřena na jeden z fragmentů tohoto rekombinantního plazmidu, protože vykazoval slabou hybridizací s částečně degenerovanou sondou se 62 bázemi. Hybridizující fragment EcORI tohoto plazmidu byl downstream od dalších tří fragmentů EcoRl, a byl tedy v původním lambda klonu relativně daleko vzdálen od fágového promotoru, který v tomto vektorovém systému řídí expresi genů pro detekci protilátkami. Bylo proto překvapující, že tento původní lambda klon produkoval dostatek proteinu pro slabou cross-reakci s protilátkou anti-TxP-I, která byla pozorována, protože bylo očekáváno, že ze vzdáleného inzertu dojde pouze k malé nebo k žádné fágem řízené expresi. Hybridizující fragment EcoRl byl sekvenován, a bylo zjištěno, že obsahuje otevřený čtecí rámec, u kterého bylo předpokládáno, že kóduje protein se sekvencí aminokyselin identickou se sekvencí 21 N-koncových aminokyselin empiricky určenou pro maturovaný toxin TxP-I.
Fragment kódující toxin, označený Tox34, byl klonován a sekvenován za použití sekvenační soupravy a postupu dodávaného výrobcem (Sequenase™, U.S. Biochemical, Cleveland, Ohio). Nukleotidová sekvence prvního identifikovaného fragmentu EcoRl obsahujícího sekvenci homologní s TxP-I (označenou Tox34) je uvedená v tabulce 2 společně s odvozenou aminoky
-32CZ 285626 B6 selinovou sekvencí. Aminokyselinová sekvence odpovídající N-koncové aminokyselinové sekvenci maturovaného toxinu je podtržená. Otevřený čtecí rámec se rozprostírá upstream od podtržené sekvence, což naznačuje, že toxin je syntetizován jako pretoxin nebo preprotoxin. Syntéza TxP-I ve formě pretoxin nebo preprotoxinu může usnadňovat sekreci, vytvoření 5 prostorového uspořádání toxinu nebo/a aktivaci toxinu vně buňky. Srovnání empirického aminokyselinového složení a odvozeného aminokyselinového složení je uvedeno v tabulce 3. Odvozená aminokyselinová sekvence pro TxP-I nevykazovala podstatnou homologii s žádným jiným proteinem v GENBANK (release 60,0).
Tabulka 3
Porovnání empiricky získaného a předpokládaného aminokyselinového složení TxP-I.
| Empirické * | Předpokládané | |||
| Procento molekuly | Zbytků na molekulu | Procento molekuly | Zbytků na molekulu | |
| CYS | — | — | 5,56 | 14 |
| CYS** | 7,74 | 18,9 (19) | — | — |
| ASX | 25,67 | 61,2 (61) | 18,26 | 46 |
| THR | 4,47 | 10,6 (11) | 5,56 | 14 |
| SER | 6,22 | 14,8 (15) | 6,35 | 16 |
| GLX | 6,29 | 15,0 (15) | 5,16 | 13 |
| PRO | 1,71 | 4,1 ( 4) | 3,97 | 10 |
| GLY | 11,43 | 27,2 (27) | 9,13 | 23 |
| ALA | 2,16 | 5,1 ( 5) | 1,59 | 4 |
| ALA** | 2,13 | 5,2 ( 5) | — | — |
| VAL | 4,09 | 9,8 (10) | 5,95 | 15 |
| MET | 0,18 | 0,4 ( 1) | 0,00 | 0 |
| ILE | 4,74 | 11,3 (11) | 6,75 | 17 |
| LEU | 3,12 | 7,4 ( 7) | 3,57 | 9 |
| TYR | 5,41 | 12,9 (13) | 5,56 | 14 |
| PHE | 4,75 | 11,3 (11) | 4,76 | 12 |
| HIS | 2,95 | 7,0 ( 7) | 2,78 | 7 |
| TRP | — | — | 1,19 | 3 |
| LYS | 11,62 | 27,7 (28) | 10,32 | 26 |
| ARG | 4,89 | 11,6 (12) | 3,57 | 9 |
| TOTAL | 99,65 | 256,3 (257) | 100,00 | 252*** |
* Založeno na proteinu o molekulové hmotnosti 27 000, jak byl určen na SDS-polyakrylamidovém gelu.
** Hodnoty získané z TxP-I oxidovaného dimethylsulfoxid/HCl.
*** Vypočítaná molekulová hmotnost = 28 500.
U tohoto fragmentu EcoRI bylo považováno za pravděpodobné, že kóduje TxP-I z následujících důvodů: byl částí lambda klonu vykazujícího cross-reaktivitu s antisérem specifickým pro TxP-I, 25 obsahoval sekvenci DNA obsahující otevřený čtecí rámec pro protein jehož předpovězená molekulová hmotnost byla okolo 30 000 a otevřený čtecí rámec kódující sekvenci identickou s21 N-koncovými aminokyselinami TxP-I, a aminokyselinové složení bylo srovnatelné se složením TxP-I. Tento fragment byl označen Tox34. Odvozená aminokyselinová sekvence umožňuje stanovit, že šestnáctinu aminokyselin maturovaného toxinu tvoří cystein.
-33CZ 285626 B6
Příklad 2
Oligonukleotidové sondy a hybridizační pokusy
Byly syntetizovány dvě oligonukleotidové sondy, jejichž sekvence byly založeny na N-koncové sekvenci TxP-I, jak ji publikovali Tomalski a kol. (1989), viz výše, (viz tabulka 7).
o
Tabulka 7
Párování nukleotidů mezi oligonukleotidy Pt-N2, Pt-Nl a Tox34
| m | |||||
| 5 | X o | 1 | |||
| o | 6* | ||||
| bl | U | b | r> | ||
| o | X u | z | 1 U | 1 O | |
| < | < | CU u | 0 | ||
| > | 0 | o | o | ||
| <0 | H X | 0 | |||
| M | g- | ||||
| 5 | 6« | H | X u | o | |
| Z | E- | ||||
| < X | o | ||||
| o | o | z | 0 | u | |
| o | O | u | K < X | 0 | |
| o | o | U | u | ||
| < 0 | E* X 0 | ||||
| h | >-< | £· | < | ||
| b | M < | 6* | |||
| z | < | <0 | 6* | ||
| 6« | M | ||||
| < | E- | O 13 | b | ||
| O o | b | b | |||
| 1 | i | r | E- X | o | |
| * | • | • | O X | υ | |
| n | ťl | U 6« | < |
| N | r-< | C4 | ||
| n | Z | Z | n | Z |
| X | 1 | t | X | 1 |
| O | 4J | 4J | O | u |
| O. | 0. | 6< | cu |
-34CZ 285626 B6
Vrchní řada písmen představuje jednopísmenové označení aminokyselin pro prvních 21 aminokyselinových zbytků N-konce Tox34. Druhá řada, označená Tox34, udává 5’-3’ nukleotidovou sekvenci genu Tox34, a čtvrtá a pátá řada udává 3’-5’ nukleotidovou sekvenci, respektive degeneraci Pt-N2. Symboly x mezi nukleotidovými sekvencemi Tox34 a Pt-N2 označují 17 nepárujicích bází. Pod Pt-N2 je uvedena též nukleotidová sekvence Pt-Nl. Deoxyinosin je označen I, N označuje úplně degenerovaná místa.
Sonda Pt-Nl byla směsí 16 molekul o sedmnácti zbytcích, za použití částečně degenerované nukleotidové sekvence odvozené od šesti N-koncových aminokyselin, a obsahovala tři inosinové zbytky na degenerovaných místech kodonů. Sonda byla vytvořena tak, aby měla Td (teplota při které je polovina duplexů disociována) 38 až 43 °C, když platí:
Td = 2 °C (počet zbytků A + T) + 4 °C (počet zbytků G + C) pro duplexy dlouhé 11-23 bází v 1 M Na+. Z imunopozitivních plaků byl získán plazmid DNA za použití postupů, které dodává Stratagene, La Jolla, Califomia, byl rozštěpen EcoRI (která vyštěpí inzert cDNA z plazmidu), frakcionován elektroforesou na agarosovém gelu a poté přenesen na Zeta-Probe™ pozitivně nabitou membránu (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Califomia) alkalickým kapilárním přenosem 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl. Filtr byl krátce promyt v 2 x SSC (citrátový pufr s chloridem sodným)/0,l% SDS (dodecylsulfát sodný) při teplotě místnosti (RT), prehybridizován v hybridizačním pufru (6xSSC/5 xDenhardtův roztok/0,5% SDS/20 mikrogramů/ml DNA telecího brzlíku/5% dextran-sulfát) bez sondy po dobu 1 hodiny a hybridizován v čerstvém hybridizačním pufru obsahujícím radioaktivně označený oligonukleotid v dávce asi 1 x 106 pulzů za minutu (cpm) na mililitr po dobu 14 hodin při 28-30 °C (asi o 10 °C méně než byl vypočítaný odhad Td pro Pt-Nl). Blot byl poté dvakrát promyt v 2 x SSC/0,1% SDS pokaždé po dobu 15 minut při hybridizační teplotě a poté podroben autoradiografii při -80 °C v podmínkách zintenzivňujících obraz. Po expozici byl blot opět promyt ve stejném pufru při teplotě zvýšené na teplotu asi o 5 °C nižší než byla odhadovaná T a opět autoradiografován. Promývání bylo též opakováno za použití teploty, která byla odhadována jako minimální Td (38 °C) a teploty, která byla odhadována jako maximální Td (43 °C).
Inzertní fragmenty vykazující hybridizaci za nejpřísnějších podmínek byly sekvenovány jako potenciální sekvence kódující TxP-I. Určité nehybridizující inzerty byly též sekvenovány, protože neúplná cDNA TxP-I může postrádat sekvence homologní se sondou Pt-Nl. Byly získány i cDNA, které vykazovaly cross-reaktivitu na antiserum TxP-I a byly schopné hybridizovat se sondou Pt-Nl, ale nekódovaly TxP-I.
Byla zkonstruována delší sonda, protože delší a minimálně degenerované sondy mají větší specificitu než kratší sondy, a jsou tedy vhodnější pro zkoumání komplikovanějších sekvencí. Sonda Pt-N2 byla syntetizována jako směs 32 molekul o šedesáti dvou zbytcích, a představovala celou N-koncovou sekvenci 21 aminokyselin (viz tabulka 7). Při konstruování Pt-N2, byly v některých případech, kde existovala možnost výběru dvou kodonů, na nejednoznačná místa zavedeny degenerace. Tato omezená degenerace měla zabezpečit rozpětí homologie, která by zvýšila specifičnost sondy. Na nejednoznačných místech, kde byly tři nebo čtyři možnosti výběru, byl proveden odhad v souladu s preferovaným používáním kodonů u Drosophily. Hybridizační podmínky pro zkoumání buď lambda cDNA knihovny, nebo subklonovaných fragmentů cDNA jako plazmidových DNA sondou Pt-N2 byly jako podmínky popsané výše, s tou výjimkou, že byly použity vyšší teploty odpovídající větší délce sondy: 40-42 °C pro hybridizaci za málo přísných podmínek a počáteční promývání s následujícím promýváním při vyšších teplotách (52 °C a 68 °C) pro zvýšení přísnosti hybridizace.
Použití žádné ze sond pro testování lambda plakových liftů nebylo úspěšné. Hybridizace za nízké přísnosti dávaly bloty s vysokým pozadím, zatímco přísné podmínky dávaly špatné pozitivy.
-35CZ 285626 B6
Žádná ze sond úspěšně neidentifikovala lambda fága obsahujícího Tox34 buď v jeho čisté formě, nebo z cDNA knihovny. Sonda Pt-Nl hybridizovala s vektorovými sekvencemi Bluescript™, s některými klony při nízké přísnosti a s sekvencemi homologními s hsp70, stejně jako se sekvencí Tox34. Pt-N2 hybridizovala při relativně nízké přísnosti se sekvencí Tox34, stejně jako s vektorovou sekvencí Bluescript™. Tox34 byl sekvenován, přestože nebyly získány přesvědčivé hybridizační výsledky. Jak je uvedeno výše, Tox34 kóduje protein TxP-I.
Příklad 3
Klonování dalších genů příbuzných s TxP-I
Byla analyzována cDNA knihovna, aby bylo určeno, zda obsahuje další sekvence příbuzné se sekvencí Tox34. Fragment EcoRI nesoucí celý gen Tox34 byl gelově vyčištěn, radioaktivně označen na vysokou specifickou aktivitu (Feinberg a kol. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13, Addendum (1984) Anal. Biochem. 137: 266-267) a použit jako hybridizační sonda pro izolování dalších sekvencí homologních s TxP-1 z lambda ΖΑΡ-Π cDNA knihovny. Hybridizační podmínky byly identické s podmínkami používanými výše, s tou výjimkou, že hybridizace byla prováděna při 65-68 °C.
Bylo izolováno zhruba 40 dalších cDNA klonů, které vykazovaly podstatnou homologii se sondou TxP-I. Tyto inzerty cDNA byly analyzovány rozštěpením restrikční endonukleasou EcoRI a Southemovou hybridizací. Většina inzertů cDNA byla svou velikostí podobná EcoRI fragmentu Tox34 použitému jako sondy. Žádný z nich neměl stejné upstream fragmenty o délce 1,5 kbp jako byly nalezeny v počátečním lambda izolátu, což podporuje domněnku, že tyto upstream fragmenty EcoRI byly přítomny kvůli umělému klonování. Bylo však zjištěno, že několik nově izolovaných fragmentů EcoRI obsahujících inzerty cDNA, které hybridizovaly s fragmentem EcoRI obsahujícím cDNA Tox34, se lišilo svou velikostí od EcoRI fragmentu Tox34. Přítomnost menších cDNA mohla být teoreticky vysvětlena neúplnou syntézou cDNA, ale přítomnost větších cDNA nemůže být tak snadno vysvětlena.
5’ a 3’ konce cDNA byly sekvenovány jak je popsáno výše za použití plně párující sekvence oligonukleotidů blízko konců inzertu cDNA Tox34 jako primerů, aby byly charakterizovány inzerty cDNA větší než původní izolát TxP-I. 5’ konce čtyř větších inzertů cDNA byly sekvenovány za použití primeru umístěného na 5’ konci otevřeného čtecího rámce Tox34. 5’konec jednoho klonu cDNA byl podstatně identický svou velikostí a sekvencí nukleotidů s klonem cDNA Tox34 (postrádal jeden nukleotid v klonovacím místě, což je bezvýznamná odchylka). 5’ konce dalších tří klonů cDNA se lišily svou délkou a sekvencí od klonu cDNA Tox34. Dva z těchto tří klonů obsahovaly identických třináct N-koncových aminokyselin jako Tox34, ale lišily se v délce a sekvenci upstream nepřekládané vedoucí oblasti. Třetí z těchto klonů (klon Tox21a) se lišil jak N-koncovou sekvencí (rozebráno níže) tak upstream 5’ nepřekládanou vedoucí oblastí.
3’ konce sedmi cDNA příbuzných s toxinem bylo sekvenováno s použitím primeru umístěného na 3’ konci otevřeného čtecího rámce Tox34. 3’ konce všech klonů se lišily nejen ve velikosti ale i sekvencí. Sekvence inzertů se podstatně lišily přibližně 60 bp downstream od terminačního kodonu otevřeného čtecího rámce TxP-I, což nebylo kvůli polyadenylaci nebo rozdílům ve vektorových sekvencích. Spíše se zdá, že jsou geny příbuzné s TxP-I rozdílné kvůli genetické heterogenitě roztočů ze kterých byla RNA extrahována pro vytvoření cDNA knihovny, nebo kvůli existenci skupiny obsahující více genů toxinů v genomu roztočů. Tabulka 5 porovnává 3’ konce několika klonů cDNA příbuzných s toxinem, které byly identifikovány sondováním cDNA knihovny roztočů fragmentem Tox34.
-36CZ 285626 B6
Tabulka 5
Srovnání homologie 3’ koncových sekvencí cDNA s Tox34
| ř- í- e- iii | E< < < |
| £ | |
| £ | |
| £ g2 £ |
t· < $ £ u řH O
| O < e << | o < o | o < o < | o < o < |
| s £ | g £ | < o £ | < o EE- |
| < | < | < | < |
| o | t? | o | u |
φ Φ C\ Φ G1 H H rt Η H O co co od eo
II I I Λ
Μ Μ Μ Μ k< < < < < < Π ΟηπιΛ fCJ í o u H σι σι •Η <-» co α> Η ι ο,Η ι α.
n x O e* >~i h4 Q < σ» <μ <-* W
X << < < < Ονοηπιπ t* <“· ·^ ·**
Η ο < Η ο < υ fr· < ο
£ υ
<
ί<
υ υ
Β
| G) CA Qt | G* O CA | CA | ||
| CA cn | 0V Ol K Η H | www | w | w |
| W W | W W CO CD CD | CO co co | co | CO |
| <0 <0 | l | hb l | 1 | I |
| 1 1 | » i a. a. f-. | a cl h | ||
| ř* ř* | H l·· i i a. | 1 t CL | a | £ |
| a cu | Q. 0> Μ Μ M | W W W | w | w |
| W W | Μ Μ Μ Μ M | WWW | w | M |
| < < | < < < a < | X Q < | < | < |
| <H O | «-· rt ΙΛ <Λ | m o* w | w | w |
| W | W e« >-««« r« | www | w | CM |
1 Rozpoznávací místa EcoRI jsou podtržená 2 Sekvence Tox34 začíná +849, jak je uvedeno v tabulce 2 3 Sekvence Tox21a začíná +843, jak je uvedeno v tabulce 4. Identifikační číslo klonu je 21ΑΠΡΤ-819.
-37CZ 285626 B6
Sekvence jsou seřazeny relativně k sekvenci Tox34. Přibližně 50 bází downstream od konce kódující oblasti toxinu (+873 v Tox34) se sekvence rozcházejí.
Druhý inzert cDNA (Tox21a) byl zcela sekvenován kvůli dalšímu studiu podstaty diverzity 5 toxinových genů. Pro podporu sekvenačního postupu byly syntetizovány oligonukleotidové primery homologní s Tox34. Pro nukleotidovou diverzitu mezi těmito dvěma geny, byly syntetizovány primery specifické pro některé vnitřní oblasti inzertu Tox21a, aby bylo umožněno dohotovení sekvence. Tabulka 4 uvádí tyto údaje o sekvenci. V nukleotidové sekvenci Tox21a bylo mnoho odlišností ve srovnání s kódující sekvencí Tox34, což ukazuje, že existuje rozdílnost 10 mezi geny toxinů v cDNA knihovně, přičemž každý kóduje toxin příbuzný s TxP-I, ale lišící se poněkud v sekvenci aminokyselin. Tabulka 6 znázorňuje porovnání odvozených aminokyselinových sekvencí pro Tox34 a Tox21a.
Tabulka 6
Srovnání odvozených aminokyselinových sekvencí pro Tox34 a Tox21a
o o ťM ÍM
CM
-38CZ 285626 B6
Čárky mezi aminokyselinami (zkrácenými s použitím standardních jednopísmenových kódů) označují identitu. Uvozovky mezi aminokyselinami označují konzervativní substance aminokyselin, prázdná místa označují neidentické, nekonzervativní změny. Tečky v sekvenci Tox34 označují místa, kde byly ponechány mezery za účelem optimalizovat vyrovnanost sekvencí. Šipka nad sekvencí Tox34 označuje první aminokyselinu empiricky stanoveného N-konce TxP-I.
Sekvence jsou z 88,9 % podobné a z 82,8 % identické. Dvě sekvence po pěti aminokyselinách se jeví jako „vložené“ do sekvence Tox21a ve srovnání se sekvencí Tox34. Výsledkem je, že předpokládaná N-koncová sekvence maturovaného produktu genu Tox21a není stejná jako N-koncová sekvence zjištěná empiricky pro TxP-I. První ATG sekvence Tox21a v rámci je též vyrovnán s druhým ATG sekvence Tox34 v rámci. Může být tedy efektivní delece třinácti aminokyselin na N-konci předpokládané preprotoxinové formy Tox21a. Předpokládá se, že delece nebude mít vliv na sekvenci aminokyselin maturovaného toxinu, pokud první inzerce bude na úplném N-konci toxinu. Všechny cysteinové zbytky jsou zachovány mezi „maturovanými“ proteiny konzistentním s těmito aminokyselinami, jež hrají roli v skládání a třírozměrné struktuře maturovaného toxinu.
Příklad 4
Baculovirová exprese sekvence kódující Tox34
Aby bylo prokázáno, že klonovaný gen Tox34 skutečně kóduje hmyzí toxin, byla sekvence Tox34 vložena do genomu baculoviru (AcMNPV) pod kontrolu silného velmi pozdního promotoru LSXTV, jak je popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/U590/02814, podané 17. května 1990, a dále v Ooi a kol. (1989) J. Molec. Biol. 210: 721-736, Rankin a kol. (1988) Gene 70: 39-49.
Všechny viry jsou původně odvozeny od AcMNPV L-l (Lee a Miller (1978) J. Virol. 27: 754), a jsou plakově vyčištěny a propagovány v buňkách Spodoptera frugiperda IPLB-SF-21 (Sf buňky) (Vaughn a kol. (1977) In Vitro 13: 213-217) v médiu TC-100 (GIBCO, Grand Island, New York) jak bylo popsáno dříve (Lee a Miller (1978) viz výše, Miller a kol. (1986) v Genetic Engineering, Principles and Methods, svazek 8 (ed. J. Setlow a A. Hollaender), Plenům Press, New York, str. 277-298).
Nejprve byl zkonstruován plazmid pEV-pTox34 (zobrazen na obrázku 1). Tento plazmid umožňuje alelickou výměnu polyhedrinového genu AcMNPV s genem Tox34 pod regulační kontrolou silného promotoru LSXTV.
pEV-Tox34 byl zkonstruován vložením fragmentu EcoRl obsahujícího sekvenci kódující Tox34 do pEVmodXIV rozštěpeného EcoRl, který je zdrojem silného promotoru LSXIV a sekvencí obklopujících polyhedrinový gen AcMNPV. DNA neupraveného typu AcMNPV a pEV-Tox34 byly kontransfektovány do buněk hmyzu, jak popsali Miller a kol. (1986), viz výše, a rekombinantní virus byl izolován a označen vEv-Tox34 po selekci na základě jeho okluzně negativního fenotypu a testováni na správnou alelickou výměnu pomocí analýzy restrikčními endonukleasami a Southemovy hybridizace.
Exprese genu Tox34 v buňkách hmyzu infikovaných vEV-Tox34 byla testována následujícím způsobem. Sf buňky byly odděleně infikovány AcMNPV a vEV-Tox34, jak popsali Lee a kol. (1978) viz výše, Miller a kol. (1986) viz výše, a po 48 hodinách infekce byly odebrány kapaliny buněčné kultury z buněk kontroly (neinfíkovaných), infikovaných AcMNPV a infikovaných vEV-Tox34. Larvy zaviječe voskového (Galleria mellonella) byly injikovány kultivačními kapalinami v dávce 5 mikrolitrů na každou larvu. Larvy hmyzu injikované kultivační kapalinou
-39CZ 285626 B6 buněk infikovaných vEV-Tox34 byly ochromeny během dvou minut, zatímco larvy hmyzu injikované kapalinou buněk infikovaných neupraveným typem AcMNPV nevykazovaly během širokého časového období (několik dnů) ochromení. Ochromené larvy byly viditelně imobilní, postrádaly vzpřimovací odpověď (schopnost obrátit se do vzpřímené polohy poté, co byly otočeny na dorsální stranu) a nebyly schopné spřádat hedvábí pro omotání svých obydlí (stereotypní chování larev zaviječe voskového). Kontrolní larvy vykazovaly pohyb, vzpřimovací odpověď i chování související se spřádáním hedvábí. Tyto výsledky ukázaly, že neuroparalytický toxin byl produkován v buňkách infikovaných vEV-Tox34, ale nikoli v buňkách infikovaných neupraveným typem AcMNPV, prostřednictvím exprese cDNA kódující sekvence Tox34 a že tento toxin byl vylučován do mimobuněčného prostředí. Typ ochromení způsobený produktem genu Tox34 připomínal ochromení pozorované u larev, které byly injikovány TxP-I, ΤχΡ-Π nebo/a TxP-HI.
K testování schopnosti baculoviru nesoucího gen Tox34 kontrolovat během infekce chování larev hmyzu související s požerem, byl hmyz infikován vEV-Tox34 injekcí vyčištěného viru do hemolymfy testovaných larev. Larvy Trichoplusia ni zhruba v časném čtvrtém instaru byly injikovány médiem TC-100 (simulované infikovány) nebo médiem obsahujícím virové částice z buněčných kultur infikovaných buď neupraveným typem AcMNPV, nebo vEV-Tox34 (4 x 105 plaky tvořících jednotek viru na larvu). Mezi kontrolní larvy patřily larvy injikované kultivačním médiem nebo neupraveným typem AcMNPV. Hmyz injikovaný vEV-Tox34 byl ochromen (imobilizovaný a postrádající vzpřimovací odpověď) za 36 hodin po injekci.
Příklad 5
Podobnost proteinů kódovaných Tox34 a TxP-I a ΤχΡ-Π
Velikosti produktů genu Tox34 vytvářené Sf buňkami infikovanými vEv-Tox34 byly zkoumány autoradiografií po radioaktivním označení a elektroforese na SDS-polyakrylamidovém gelu. Po jednohodinovém období infekce nebo simulované infekce, byly buňky označeny /35S/-cysteinem 6, 12, 24, 36 a 48 hodin po infekci. Poté byl značkovací roztok odstraněn a buňky byly převrstveny nedoplněným hmyzím médiem TC-100 a inkubovány další dvě hodiny. Buňky (obsahující nitrobuněčné proteiny) a médium prosté buněk (obsahující sekretované proteiny) byly odděleně shromážděny. Buňky byly lyžovány. Nitrobuněčné a sekretované proteiny byly denaturovány a redukovány v pufru obsahujícím SDS a dithiothreitol, a poté separovány elektroforesou na SDS-polyakrylamidovém gelu za použití 12% polyakrylamidových gelů. Gely byly impregnovány fluorem, vysušeny a autoradiografovány. Výsledky jsou znázorněny na obrázku 8. Standardy proteinů byly podrobeny elektroforese v nejvíce levých pásech a jejich molekulové hmotnosti jsou uvedeny v kDa. Proteiny z neinfikovaných buněk jsou separovány v pásek označených „mock“. Kromě toho, je u produktů genu Tox34 pozorována stejná změna mobility zjištěná elektroforesou na SDS-polyakrylamidovém gelu, s redukcí, jak je pozorována u proteinů získaných vyčištěním z přírodních zdrojů. Přítomnost tří pruhů naznačuje, že TxP-I (asi 27 kDa) a Τχρ-Π (asi 28 kDa a 29 kDa) spolu souvisí jako molekuly maturovaného toxinu, protoxinu a preprotoxinu. Pruhy TxP-I, ΤχΡ-Π a proteinu polyhedrinu jsou v obrázku označeny šipkami. TxP-IĎ zahrnuje tři pruhy v rámci TxP-I a TxP-II. Obrázek 8 ukazuje, že tři proteiny produkované buňkami infikovanými vEV-Tox34 odpovídají velikostí třem proteinům příbuzným s toxinem, které popsali Tomalski a kol. (1988), viz výše, Tomalski a kol. (1989), viz výše. Exprese sekvence kódující Tox34 má tedy za následek tvorbu TxP-I a ΤχΡ-Π, které společně vytváří ΤχΡ-ΙΠ. Vzhledem k tomu, že Tox34 má dva methioninové kodony blízko 5’ konce kódující oblasti, z nichž jeden nebyl nalezen v sekvenci kódující Tox21a, je též možné, že dva pruhy proteinu ΤχΡ-Π mohou odrážet alternativní místa počátku translace. Tyto možnosti mohou být odlišeny N-koncovým sekvenováním každého proteinu tvořícího složky ΤχΡ-Π nebo místně řízenou mutagenezí buď jednoho, nebo obou odpovídajících kodonů ATG.
-40CZ 285626 B6
Příklad 6
Další deriváty AcMNPV geneticky zkonstruované tak, aby exprimovaly gen neurotoxinu roztoče
Pro stanovení, zda exprese sekvence kódující TxP-I zlepší AcMNPV jako pesticid, bylo porovnáváno ochromení a hmotnostní přírůstky u simulované infikovaného hmyzu (TC-100) a hmyzu infikovaného neupraveným typem AcMNPV (L-l) nebo vEV-Tox34. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 2. 24 hodin po injekci (čas považovaný v této studii jako 0 hodin po infekci) vážily larvy hmyzu z každé skupiny kontrolních nebo testovaných larev v průměru 60-80 miligramů. 24 hodin po infekci, se zvětšila hmotnost larev hmyzu infikovaných neupraveným typem AcMNPV podstatně více než u simulované infikovaných larev nebo larev infikovaných vEVTox34. Již dříve bylo pozorováno, že infekce neupraveným typem viru skutečně zvyšuje požer larev během prvních dnů infekce (americká patentová přihláška č. 373,952, podaná 29. června 1989). 36 hodin po infekci byli všichni jedinci ze skupiny infikované vEV-Tox34 ochromeni (imobilní, bez vzpřimovací odpovědi) a nebyla ochromena žádná z larev simulované infikovaných nebo infikovaných neupraveným typem AcMNPV. Hmotnost larev infikovaných vEV-Tox34 byla podstatně nižší než ostatních skupin, hmotnost larev infikovaných vEV-Tox34 v období od 24 do 36 hodin po infekci ve skutečnosti klesala, což může být důsledkem ztráty vody způsobené úbytkem požeru. Tento trend pokračoval 60 hodin po infekci. 96 hodin po infekci, byly všechny simulované infikované larvy zakuklené, zatímco larvy infikované neupraveným typem AcMNPV a infikované vEV-Tox34 byly mrtvé nebo ochromené. Všichni virově infikovaní jedinci hmyzu jevili v této době typické známky virové infekce. Exprese genu toxinu roztoče tedy zlepšila vlastnosti baculoviru AcMNPV jako pesticidu inhibici požeru během infekce. Exprese toxinu neblokuje virovou replikaci, protože všichni jedinci skupiny larev infikovaných vEV-Tox34 zemřeli na typickou virovou infekci.
Ve výše popsané konstrukci viru je sekvence kódující Tox34 exprimována pod regulační kontrolou velmi pozdního baculovirového promotoru, kteiý není exprimován až do 18 hodin po infekci v buňkách infikovaných při vysoké multiplicitě infekce (moi, tj. 10 virů na buňku) nebo až do 24-30 hodin po infekci v buňkách infikovaných při moi = 1. Nebylo proto neočekávané, že paralytické účinky baculovirem zprostředkované exprese Tox34 nebyly pozorovány dříve než 36 hodin po infekci.
Snaha zkrátit čas, za který lze pozorovat paralytické účinky produktu genu Tox34 vedla k tomu, že byl AcMNPV geneticky zkonstruován tak, aby exprimoval sekvenci kódující Tox34 pod kontrolou jiných promotorů AcMNPV.
Byl zkonstruován plazmid phc-ETL-Tox34 (viz obrázek 3) se sekvencí kódující Tox34 exprimovanou pod regulační kontrolou promotoru ETL AcMNPV (popsán v Crawford a kol. (1988) J. Virol. 62: 2773-2778). Fragment EcoRI obsahující Tox34 byl vložen do místa EcoRI phc-dET, kteiý byl získán z phcwt (Rankin a kol. (1988), viz výše) nahrazením polyhedrinového promotoru mezi místem EcoRV a místem Bgin promotorovou sekvencí ETL rozprostírající se od -6 (relativně ke kodonu iniciace translace ETL ATG na +1, +2, +3) do přibližně 300 bp upstream od sekvence kódující ETL. Tento plazmid a neupravený typ AcMNPV byly kontransfektovány a byly izolovány a charakterizovány vhodné neokludované rekombinanty. Obrázek 7 obsahuje údaje pro infekce hmyzu vETL-Tox34.
Promotor Cap/Polh popsali Thiem a Miller (1990) Gene 91: 87-95. Je to stejný promotor jako promotor označený vp39/LSXTV na obrázku 19 americké patentové přihlášky č. 07/353,847, podané 17. května 1989. Sekvence DNA promotoru Cap/Polh je uvedena v tabulce 8.
-41CZ 285626 B6
Tabulka 8
Sekvence fuze promotor Cap\polh/Tox34 v oblasti EcoRV-KpnI oblasti polyhedrinového genu AcMNPV < EO
O E<
c CL *
| E- | A | c | H | o | 0 | 0 | O | |
| o | o | u | 0 | < | E- | u | ||
| u | E- | < | E- | < | < | E- | ř- | |
| < | 0 | < | 0 | A | E- | E- | < | |
| E-· | < | o | < | A | < | H | 0 | |
| < | ř- | o | E- | 0 | E- | 0 | A | |
| C—. | E-t | < | 0 | < | < | b | ||
| E-> | 0 | < | 0 | A | 0 | O | ||
| < | E-t | < | E-t | 0 | < | h | ||
| < | u | 0 | 0 | < | < | E-t | t-t a | |
| u | 0 | < | 2 | Ε- | A | 0 | ||
| 0 | e-t | E-· | E-t | 0 | 0 | 0 | A | o ω |
| 2 | © | 0 | 0 | O H | 0 | |||
| o | < | E-t | E-t | < | < | |||
| H | H | O | 0 | E-t | H | P | • | |
| E-t | £ | H | < | £-· | E-t | < | ||
| E-t | E-t | 0 | E-t | < | E-t | z | ||
| k | fr« | E-t | 0 | 2 | 0 | Q | ||
| U | A | U | E-t | 0 | E-t | E-t | U | |
| < | u | o | E-t | A | < | U | •v | |
| u | A | ř< | E-« | 2 | A | m | ||
| E-< | ř« | b | E-t | < | 0 | E-t | X 0 | |
| O | <5 | E-t | Η | 2 | 0 | F-t | E-t | |
| Ε-» | O | O | < | © | 0 | k | * | |
| A | < | P | A | E-t | A | E-> | ||
| 2 | < | 0 | 0 | 0 | ||||
| u | A | H | O | H | 0 | H | ||
| h | < | < | O | 0 | © | H | M tí | |
| 0 | 0 | < | 0 | E-t | < | A | 0 | |
| © | 0 | Eh | < | O | 0 | < | < | u |
| k | k | Ej | © | E-t | E-t | © | 0 | |
| E-t | 0 | H | < | A | E-< | < | A | |
| 0 | < | 0 | A | 0 | ||||
| A | E-t | A | 0 | 0 | A | «< | O | |
| 0 | 0 | O | 0 | S | E-t | |||
| o | 0 | 0 | 0 | E-t | < | A | O | |
| 0 | 0 | H | A | Ei | M M | |||
| < | < | < | < | A | < | A | r-l | |
| < | k | < | < | O | © | 0» | ||
| o | f-t | H | < | 0 | A | ffi | ||
| o | e4 | 0 | ř+ | 9 | 0 | 0 | E-< | |
| r* | E-t | w | E-< | 0 | 0 | < | ||
| 0 | E-t | ÍJ | g | E-t | 0 ř-c | A | ||
| o | 2 | 0 | < | < | 2 | |||
| E-< | o | H | frt | k | < | £ | E-< | |
| A | u | 0 | 0 | < | < | © | A | |
| O | E-* | < | © | E-t | U | © | E-· | |
| o | H | 0 | ř | < | < | < | 0 | |
| o | < | < | E-< | 9 | E-< | < | U | |
| u | 9 | < | o | C-t | © | A | ||
| E-· | ř | A | 0 | E-t | O | u | A | |
| E-< | Ό | 0 | O | R | < | A | ||
| O | E-· | 0 | u | 0 | © | < | A | |
| E-* | < | 0 | A | 0 | O | < | A | |
| E-t | < | H | A | < | t. | A | A | |
| O | < | 0 | o | o | E-> | A | ||
| H | u | E-« | o | E-t | ř-t | k | E- | |
| > A | b | E- | < | Eh | E-t | E-< | < | |
| Ε- | 0 | o | © | A | A | |||
| o < o | Ο | < | 0 | E-t | 0 | A | ||
| U1 0 |
-42CZ 285626 B6
Fragment Bgin/Kpnl pEV-Tox34 obsahující sekvenci kódující Tox34 byl vložen na místo genu pro CAT v pCap/Polh-CAT (Thiem a Miller (1990), viz výše), odpovídajícím pEVvp39/ /LSXTVCAT. pCap/Polh-Tox34 byl kotramsfektován s vDA26Z (0’Reilly a kol. (1990), viz výše) do Sf buněk a virus který vznikl z homologní rekombinace mezi plazmidem a vDA26Z byl označen vCap/Polh-Tox34. Tento virus byl izolován a správnost jeho genetické struktury byla potvrzena analýzou pomocí restrikčních endonukleas.
Vlivy vCap/Polh-Tox34 na hmotnostní přírůstky byly zjištěny injekcí 4x 105 plaky tvořících jednotek do larev Trichoplusia ni v prvním dni pátého instaru nebo injekcí 2 mikrolitrů kapaliny tkáňové kultury bez viru. Larvy byly zváženy, injikovány a byla jim podána potrava prostá virů. Hmotnostní přírůstky larev infikovaných vCap/Polh-Tox34 byly podstatně nižší a tyto larvy vykazovaly ochromení dříve než larvy infikované jinými rekombinantními viry ve srovnávacím souboru. Maximální hmotnostní přírůstek larev injikovaných neupraveným typem AcMNPV byl téměř třikrát větší než maximální hmotnostní přírůstek larev infikovaných vCap/Polh-Tox34 v čase jeden den po infekci. 1 den po infekci bylo ochromeno přes 50 % testované populace injikované vCap/Polh-Tox34, zatímco u ostatních testovaných populací bylo v tomto čase po infekci ochromených nebo mrtvých 10 nebo méně. Larvy infikované vCap/Polh-Tox34 ztratily mezi prvním a druhým dnem po infekci, kdy bylo ochromení testované populace úplné, malou část hmotnosti, zřejmě kvůli dehydrataci paralyzovaných larev. Viz obrázek 7.
Obrázek 7 představuje srovnání vlivů neupraveného typu AcMNPV a rekombinantních virů exprimujících sekvenci kódující Tox34 na hmotnostní přírůstky infikovaných larev hmyzu a smrt nebo ochromení infikovaných larev. Jeden den po infekci byly hmotnostní přírůstky larev infikovaných AcMNPV a vETL-Tox34 zhruba stejné, zatímco larvy infikované vEV-Tox34, vSp-Tox34 a vCap/Polh-Tox34 měly nižší hmotnostní přírůstky.
Dva dny po infekci byly hmotnostní přírůstky infikovaného hmyzu v sestupném pořadí: AcMNPV, neinfikovaný hmyz, vETL-Tox34, pEV-Tox34 a vSp-Tox34-u obou shodné, a vCap/Polh-Tox34. V této době byly všechny larvy infikované vCap/Polh-Tox34, vEV-Tox34 a vSp-Tox34 ochromené nebo mrtvé, zatímco jen zhruba 10-15 % larev infikovaných AcMNPV nebo vETL-Tox34 bylo ochromených nebo mrtvých.
Tři dny po infekci se neinfikované larvy kuklily, a hmotnostní přírůstky larev infikovaných vETL-Tox34 byly podstatně nižší než larev infikovaných AcMNPV. Čtvrtého dne po infekci byly zbylé infikované larvy buď mrtvé nebo ochromené.
Obrázek 7 ukazuje, že vCap/Polh-Tox34 je nejúčinnější činidlo pro kontrolu hmyzu z testovaných činidel, z hlediska omezení hmotnostního přírůstku larev a z hlediska dřívějšího nástupu smrti nebo ochromení, což omezuje požer hmyzu. Ačkoli bylo očekáváno, že exprese sekvence kódující Tox34 bude v vETL-Tox34 dřívější než v ostatních rekombinantních virech produkujících toxin, zdá se, že síla promotoru není dostatečná pro dodání paralytické dávky toxinu infikovanému hmyzu brzy v době infekce. Pozdní/velmi pozdní hybridní promotor Cap/Polh se zdá být podstatně silnější, a je tedy z tohoto souboru výhodným promotorem pro řízení exprese paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz v baculovirovém vektoru.
Příklad 7
Exprese Tox34 řízená promotorem SPLSXTV v okluzně pozitivním baculoviru
Rekombinantními baculoviry exprimujícími Tox34 v příkladu 4 jsou neokludované viry, a proto jsou při orálním způsobu infekce pro hmyz slabě infekční. Okludovaný baculovirus exprimující sekvenci kódující Tox34 pod regulační kontrolou velmi pozdního promotoru a protein
-43CZ 285626 B6 polyhedrin pod kontrolou svého vlastního promotoru byl zkonstruován za použití plazmidu pSpTox34 zobrazeného v tabulce 4. Promotorové sekvence, označené zde Sp, jsou v americké patentové přihlášce č. 07/353,847, podané 17. května 1989, označovány SPLSXIV, a jsou v této přihlášce popsány. Sekvence promotoru Sp je uvedena v tabulce 9.
Tabulka 9
Sekvence promotoru SPLSXIV fúzovaného do místa EcoRV-92 upstream od otevřeného čtecího ío rámce polyhedrinu AcMNPV
w a o u ω u k
Φ W c
O H <
<
O
E O υ ω
-44CZ 285626 B6 pSp-Tox34 byl kotransfektován do Sf buněk společně s DNA z derivátu AcMNPV s genem pro beta-galaktosidasu vloženým do polyhedrinového genu (vSyvVI-gal). Tento virus má okluzně negativní fenotyp a vytváří modré plaky při umístění na chromogenní substrát pro betagalaktoxidasu 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galaktopyranosid (X-gal). Pro konstrukci rekombinantních virů jsou vhodné i další deriváty AcNPV s delecí v polyhedrinovém genu, protože polyhedrinová oblast je během alelické výměny v průběhu konstruování nahrazena sekvencemi pSp-Tox34. Po kotransfekci byl izolován rekombinantní virus vSp-Tox34, jako virus s okluzně pozitivním, beta-galaktoxidasově negativním fenotypem, a exprimuje TxP-I. Devatenáct z dvaceti larev Trichoplusia ni, které požily potravu kontaminovanou vSp-Tox34 během čtvrtého a pátého instaru, vykazovaly ochromení a zastavily požer 52 hodin od prvního kontaktu s kontaminovanou potravou, zatímco larvy, které požily potravu kontaminovanou neupraveným typem AcMNPV pokračovaly v požeru po dobu 5 dnů (120 hodin) po přijetí kontaminované potravy. Podobné výsledky znázorňující hmotnostní přírůstky pro testovanou populaci 30 larev jsou uvedeny na obrázku 6. Larvy, kterým byla podána potrava kontaminovaná vSp-Tox34 vykazovaly příznaky ochromení 2 dny po infekci, a jejich hmotnostní přírůstky byly velmi nižší při srovnání s larvami, kterým byl podán neupravený typ viru. Viry obsahující a exprimující gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, jako je sekvence kódující Tox34, mají tedy podstatně zlepšené pesticidní vlastnosti.
Příklad 8
Exprese sekvence kódující Tox34 řízená promotorem Cap/Polh v okluzně pozitivním baculoviru
Pro vytvoření okluzně pozitivního baculoviru, který exprimuje sekvenci kódující Tox34 pod kontrolou promotoru Cap/Polh, byl nejprve zkonstruován plazmid, který obsahuje mezi místy EcoRI a KpnI polylinkeru Bluescript plus ™ (BSKS+, Stratagene, LaJolla, Califomia) levý konec o délce 4,6 kbp fragmentu EcoRI-Ι neupraveného typu AcMNPV od místa EcoRI-Ι na 0.0 AcMPV mapových jednotkách do místa KpnI v polyhedrinovém genu. Tento plazmid (pERI-K) byl poté rozštěpen EcoRV za účelem linearizace plazmidu rozštěpením místa EcoRV upstream od polyhedrinového genu. Fúze promotor-gen Cap/Polh-Tox34 byla vyjmuta z pCap/Polh-Tox34 (viz obrázek 5) rozštěpením downstream od Tox34 KpnI (následovaným otupením konců) a poté rozštěpením upstream od promotoru Cap/Polh pomocí EcoRV. Fragment nesoucí fúzi Cap/PolhTox34 byl poté ligován natupo do místa EcoRV pERI-K rozštěpeného EcoRV. výhodná orientace genu toxinu je proti směru hodinových ručiček vzhledem k sekvencím AcMNPV. Výsledný plazmid byl označen pCap/Polh-Tox34VI+.
VCap/Polh-Tox34VI+ byl použit jako plazmid pro alelickou záměnu s okluzně negativním derivátem AcMNPV s deleční nebo substituční mutací v polyhedrinovém genu. Vhodným delečním mutantem je vSynVI-gal, jak je popsán v příkladu 7, nebo deleční mutant, který vznikl alelickou výměnou za použití plazmidu pEVmodXIV.
Rekombinantní viry byly vybrány na základě jejich okluzně pozitivního fenotypu a byly testovány na vhodnou alelickou výměnu analýzou pomocí restrikčních endonukleas.
Protože modifikované baculoviry z příkladů 5 a 8 jsou okludované, mohou být vloženy do insekticidně účinných, zemědělsky přijatelných prostředků, které mohou být aplikovány na infikované plodiny. Přijetí takových okludovaných virových částic má za následek propagaci těchto virů na poli a rozšiřování činidla pro kontrolu hmyzu. Infekce způsobuje smrt hmyzu a tím chrání rostliny před hmyzími škůdci. Je zřejmé, že rekombinantní virus, který sám není schopen řídit syntézu polyhedrinu, může být okludován jiným způsobem, například koinfekcí pomocným virem, který exprimuje polyhedrin ve vysokých množstvích. Pro stabilizaci neokludovaných virů
-45CZ 285626 B6 a tím zvýšení efektivnosti nebo účinnosti jejich použití mohou být použity libovolné o sobě známé způsoby.
Příklad 9
Exprese sekvence kódující Tox21a v derivátu AcMNPV
Rekombinantní AcMNPV schopný exprimovat sekvenci kódující Tox21a pod kontrolou silného promotoru LSXTV byl zkonstruován za použití následujícího postupu.
Nejprve byl cDNA fragment EcoRl obsahující Tox21a vyjmut z odpovídajícího lambda ZAPU fága a klonován do Bluescript plazmidu popsaného výše, čímž byl vytvořen pBSK-Tox21a.
Poté bylo žádoucí provést mutagenezi kodonu ATG (který řídí methioninem počátek translace) na -49, -48, -47, jak je uvedeno v tabulce 4. Tato místně řízená mutageneze byla provedena za použití postupu polymerasové řetězové reakce (eds. Innis a kol. (1990) PCR Protocols, Academie Press, San Diego, Califomia; ed. H. Erlich (1989) PCR Technology, Stockton Press, New York, New York) a následujících primerů:
| -50 | -40 | -30 | -20 |
| * | ★ | * | * |
Tox21a Primer 1
Tox21a Primer 2 ' -GGCCATGTTAATTTAATAATCTTATTTACAAATTT-3 * ’ -GGATCCGTTAATTTAATAATCTTATTTAC-3 ’ BamH I
280 290 300 310 * * * * · -CCTAAAATTGGAACTGTATGTAGACTTAAAAAAGGA-3 ' ' -GGATTTTAACCTTGACATACATCTG-5 '
Acc I
Polymerasové řetězové reakce bylo též použito pro amplifikaci fragmentu obsahujícího požadovanou mutaci AT na CC. Mutagenesí bylo vytvořeno místo BamHI v upstream oblasti sekvence Tox21a. Výsledný produkt byl rozštěpen BamHI a AccI, aby byl uvolněn restrikční fragment o délce zhruba 351 bp, který byl poté vyčištěn na gelu.
pBSK-Tox21a byl rozštěpen BamHI, která štěpí ve vektorové části, a částečně rozštěpen AccI, která štěpí okolo nukleotidu 300, jak je uvedeno v tabulce 4, v sekvenci Tox21a. Tím byla odstraněna N-koncová část sekvence Tox21a z pBSK-Tox21a. Požadovaný vektorový fragment, který postupuje zhruba 300-400 bp pod jednoduše rozštěpeným lineárním pBSK-Tox21a, byl vyčištěn na gelu.
Mutovaný produkt polymerasové řetězové reakce byl poté klonován do vyčištěného vektorového fragmentu pBSK—Tox21a za použití standardních postupů molekulární biologie, aby byl vytvořen pBSK-PCR21a. Modifikovaná sekvence Tox21a byla poté vyjmuta z pBSK-PCR21a rozštěpením BamHI a EcoRl, její konce byly otupeny, byla vyčištěna na gelu a klonována do plazmidu pSPXIVVI+X3, který byl rozštěpen EcoRl a jehož konce byly otupeny. Modifikovaná sekvence Tox21a byla vložena do pSPXIWTX3 ve správné orientaci vzhledem k promotoru LSXTV. Výsledný plazmid pSPXTVPCRTOx21A je ve skutečnosti identický s pSPTox34 na obrázku 4, s tou výjimkou, že genem toxinu je Tox21a místo Tox34. Plazmid
-46CZ 285626 B6 pSPXTVPCRTox21A byl poté použit pro alelickou výměnu do AcMNPV, jak je popsána v příkladu 7 pro konstrukci vSP-Tox34. Výsledný rekombinantní virus (vSPXTVPCRTox21A) exprimoval sekvenci kódující Tox21a, a produkoval tak paralytický protein Tox21a specifický pro hmyz.
Toxicita produktu exprese Tox21a byla testována v podstatě jak je popsáno v příkladu 6, s tou výjimkou, že místo vSPTox34 byl pro infikování hmyzu použit vSPXTVPCRTox21A. Byly získány podobné výsledky jako jsou uvedené na obrázku 7. Tox21a tedy kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz.
Odborníkovi je jasné, jaké procedurální modifikace je nutno provést, aby byl zkonstruován podobný okludovaný virus nebo viry, které exprimují Tox21a pod kontrolou jiných baculovirových promotorů pro použití v činidlech pro kontrolu hmyzu.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (16)
1. Rekombinantní molekula DNA, která obsahuje gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici, přičemž tento gen má kódující sekvenci uvedenou na obrázku 9A-9B od nukleotidu 118 po nukleotid 873 nebo kódující sekvenci, která je s ní alespoň ze 70 % homologická s podmínkou, že kódovaný protein si uchovává účinnost paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz, nebo kódující sekvenci, která kóduje sekvenci aminokyselin, jak je uvedená na obrázku 10A-10C.
2. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 1, která obsahuje gen kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče rodu Pyemotes, přičemž tento gen má kódující sekvenci uvedenou na obrázku 9A-9B od nukleotidu 118 do nukleotidu 873 nebo kódující sekvenci, která je s ní alespoň ze 70 % homologická s podmínkou, že kódovaný protein si uchovává účinnost paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz.
3. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 1, ve které uvedený gen kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahující sekvenci aminokyselin jak je uvedená na obrázku 9A-9B od aspartátu kódovaného nukleotidy 118-120 po cystein kódovaný nukleotidy 871-873.
4. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 1, ve které uvedený gen kóduje paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahující sekvenci aminokyselin, jak je uvedená na obrázku 10A-10C.
5. Baculovirus geneticky zkonstruovaný tak, že obsahuje a exprimuje gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz podle libovolného z nároků 1 až 4.
6. Baculovirus podle nároku 5, kterým je baculovirus NPV.
7. Baculovirus podle nároku 6, kterým je derivát AcMNPV.
8. Baculovirus podle nároku 7, ve kterém je gen paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz získaný z roztoče Pyemotes tritici exprimován pomocí baculovirového promotoru vybraného ze skupiny zahrnující velmi pozdní, časné, hybridní a syntetické promotory.
-47CZ 285626 B6
9. Baculovirus podle nároku 8, vybraný ze skupiny zahrnující vEV-Tox34, vETL-Tox34, vSp-Tox34, vCap/Polh-Tox34 a vSPXIVPCRTox21a.
10. Prostředek toxický pro hmyz, vyznačující se tím, že obsahuje baculovirus geneticky zkonstruovaný tak, že exprimuje sekvenci kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici, podle nároku 5, v množství způsobujícím ochromení hmyzu.
11. Prostředek toxický pro hmyz podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedená sekvence kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci uvedenou na obrázku 9A-9B od nukleotidu 118 po nukleotid 873.
12. Prostředek toxický pro hmyz podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedená sekvence kódující paralytický neurotoxin specifický pro hmyz obsahuje sekvenci uvedenou na obrázku 10A-10C.
13. Způsob kontroly hmyzích škůdců, vyznačující se tím, že se aplikuje prostředek toxický pro hmyz podle libovolného z nároků 10 až 12 na životní prostředí těchto hmyzích škůdců.
14. Způsob přípravy paralytického neurotoxinu specifického pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že se (a) zkonstruuje rekombinantní molekula DNA, přičemž tato molekula obsahuje vektorovou část schopnou introdukce do hostitelské buňky a replikace v ní, promotor, který funguje v této hostitelské buňce a kódující sekvenci pro paralytický neurotoxin specifický pro hmyz z roztoče Pyemotes tritici podle nároku 1, přičemž tato kódující sekvence je expresibilní v této hostitelské buňce, s tím, že tento promotor a tato kódující sekvence jsou v rekombinantní molekule DNA umístěny ve vektorové části tak, že neurotoxin je v hostitelské buňce exprimován pod kontrolou uvedeného promotoru, (b) tato rekombinantní molekula DNA se introdukuje do hostitelské buňky pro vytvoření geneticky změněné hostitelské buňky, a (c) tato geneticky, změněná hostitelská buňka se kultivuje tak, že je exprimována kódující sekvence uvedená v bodě (a) a produkován neurotoxin specifický pro hmyz.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že kódující sekvence kóduje neurotoxin se sekvencí aminokyselin jak je uvedená na obrázku 9A-9B od aspartátu kódovaného nukleotidy 118-120 po cystein kódovaný nukleotidy 871-873.
16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že kódující sekvence kóduje neurotoxin se sekvencí aminokyselin jak je uvedená na obrázku 10A-10C.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/593,657 US5266317A (en) | 1990-10-04 | 1990-10-04 | Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions |
| PCT/US1991/007216 WO1992006181A1 (en) | 1990-10-04 | 1991-10-01 | Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ57393A3 CZ57393A3 (en) | 1994-01-19 |
| CZ285626B6 true CZ285626B6 (cs) | 1999-10-13 |
Family
ID=24375602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ93573A CZ285626B6 (cs) | 1990-10-04 | 1991-10-01 | Geny paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz, způsoby a prostředky pro biologickou kontrolu hmyzu |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5266317A (cs) |
| EP (1) | EP0566579B1 (cs) |
| JP (1) | JPH06501618A (cs) |
| KR (1) | KR100226241B1 (cs) |
| AT (1) | ATE174384T1 (cs) |
| AU (1) | AU655444B2 (cs) |
| BR (1) | BR9106948A (cs) |
| CA (1) | CA2093335C (cs) |
| CZ (1) | CZ285626B6 (cs) |
| DE (1) | DE69130617D1 (cs) |
| ES (1) | ES2125871T3 (cs) |
| GR (1) | GR3029323T3 (cs) |
| HU (1) | HU215253B (cs) |
| IE (1) | IE913480A1 (cs) |
| IL (1) | IL99644A (cs) |
| MX (1) | MX9101454A (cs) |
| RU (1) | RU2130968C1 (cs) |
| SK (1) | SK281251B6 (cs) |
| WO (1) | WO1992006181A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA917890B (cs) |
Families Citing this family (146)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643776A (en) * | 1988-11-01 | 1997-07-01 | The Regents Of The University Of California | Insect diagnostic and control compositions |
| US5674485A (en) * | 1988-11-01 | 1997-10-07 | The Regents Of The University Of California | Insect diagnostic and control compositions with truncated JHE |
| US6689356B1 (en) * | 1988-12-19 | 2004-02-10 | The Regents Of The Unviersity Of California | Recombinant baculoviruses producing insect toxins |
| US5707809A (en) * | 1990-09-21 | 1998-01-13 | The Perkin-Elmer Corporation | Avian sex identification probes |
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
| US5962765A (en) * | 1991-08-08 | 1999-10-05 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Molecular cloning of a complimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi |
| US6090379A (en) * | 1992-04-29 | 2000-07-18 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Stable pre-occluded virus particle for use in recombinant protein production and pesticides |
| US5593669A (en) * | 1992-04-29 | 1997-01-14 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Stable pre-occluded virus particle |
| DE69333051T2 (de) * | 1992-04-29 | 2004-04-29 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Mundinfektion der insektlarven mit prä-okkludierten bakuloviruspartikeln |
| US5547871A (en) * | 1993-01-25 | 1996-08-20 | American Cyanamid Company | Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling proteins |
| US6551618B2 (en) | 1994-03-15 | 2003-04-22 | University Of Birmingham | Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival |
| GB9405951D0 (en) * | 1994-03-25 | 1994-05-11 | Zeneca Ltd | Biological control agents |
| JPH10507065A (ja) | 1994-07-05 | 1998-07-14 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 遺伝子工学作出生物殺虫剤による昆虫の制御方法 |
| US6156309A (en) * | 1994-07-27 | 2000-12-05 | University Of Georgia Research Foundation | Insecticidal compositions and methods |
| US5662897A (en) * | 1994-07-27 | 1997-09-02 | U. Of Ga Research Foundation | Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use |
| US5576197A (en) * | 1995-04-07 | 1996-11-19 | Molecular Bio-Products | Polymerase chain reaction container and methods of using the same |
| US5756340A (en) * | 1995-05-08 | 1998-05-26 | The Regents Of The University Of California | Insect control with multiple toxins |
| US5925346A (en) * | 1995-06-01 | 1999-07-20 | Queen's University At Kingston | Antisense strategy for the production of species specific viral insecticides |
| US6355240B1 (en) * | 1995-07-26 | 2002-03-12 | Basf Aktiengellschaft | Enhanced insecticidal insect virus through the expression of heterologous proteins with early promoters |
| US6596271B2 (en) | 1996-07-12 | 2003-07-22 | The Regents Of The University Of California | Insect control method with genetically engineered biopesticides |
| JP2001501824A (ja) * | 1996-10-01 | 2001-02-13 | ユニバーシティー オブ ジョージア リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド | 昆虫特異的ダニ毒素遺伝子を発現する生物学的昆虫防除剤、方法および組成物 |
| US6391547B1 (en) * | 1997-09-09 | 2002-05-21 | Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US7087420B1 (en) | 1997-07-17 | 2006-08-08 | Cambia | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US5882913A (en) * | 1997-08-07 | 1999-03-16 | The United States Of American As Represented By The Secretary Of Agriculture | Strain of gypsy moth virus with enhanced polyhedra and budded virus production |
| US5853982A (en) * | 1997-10-03 | 1998-12-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method of isolating strains of the Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus |
| EP1925320A3 (en) | 1998-03-27 | 2008-09-03 | Prolume, Ltd. | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics |
| JP2002507410A (ja) | 1998-03-27 | 2002-03-12 | プロルーム・リミテッド | ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用 |
| US20030215421A1 (en) * | 1999-07-21 | 2003-11-20 | Mcdonald John R. | Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders |
| US7157418B1 (en) | 1998-07-22 | 2007-01-02 | Osprey Pharmaceuticals, Ltd. | Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders |
| US6911429B2 (en) * | 1999-04-01 | 2005-06-28 | Transition Therapeutics Inc. | Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans |
| US6864235B1 (en) | 1999-04-01 | 2005-03-08 | Eva A. Turley | Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans |
| US7109315B2 (en) | 2000-03-15 | 2006-09-19 | Bruce J. Bryan | Renilla reniformis fluorescent proteins, nucleic acids encoding the fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items |
| US7829084B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| RU2420537C2 (ru) | 2001-01-17 | 2011-06-10 | Трабьон Фармасьютикалз Инк. | Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин |
| US6948972B2 (en) * | 2002-03-27 | 2005-09-27 | Pent Technologies, Inc. | Overhead lighting splitter |
| US7119168B2 (en) * | 2002-11-18 | 2006-10-10 | Bioprospecting Nb Inc. | Paralytic peptide for use in neuromuscular therapy |
| US7880061B2 (en) | 2003-02-25 | 2011-02-01 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety SN97-6946 |
| AU2005299716B2 (en) * | 2004-10-22 | 2012-09-06 | Amgen Inc. | Methods for refolding of recombinant antibodies |
| AU2006242193A1 (en) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Purdue Research Foundation | Methods for increasing the yield of fermentable sugars from plant stover |
| WO2007015782A1 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne | Molecular variant fibrinogen fusion proteins |
| AU2006284922B2 (en) | 2005-08-30 | 2012-01-19 | University Of Miami | Immunomodulating tumor necrosis factor receptor 25 (TNFR25) agonists, antagonists and immunotoxins |
| US8445746B2 (en) * | 2007-02-23 | 2013-05-21 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for identifying genetic sequences with toxin resistance in plants |
| US7723580B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-05-25 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN040844 |
| US7728195B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-06-01 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN040856 |
| US7723581B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-05-25 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN040845 |
| US7723582B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-05-25 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN041100 |
| AU2008240142B2 (en) | 2007-04-12 | 2014-11-06 | Corteva Agriscience Llc | Novel canola cultivars having high yield and stabilized fatty acid profiles |
| US7723577B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-05-25 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN040847 |
| US7723578B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-05-25 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN040839 |
| US7718852B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-05-18 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN040241 |
| US7723579B2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-05-25 | Dow Agrosciences Llc | Canola cultivar DN040244 |
| US8945653B2 (en) * | 2007-06-21 | 2015-02-03 | Suntava, Llc | Extracted whole corn kernels and improved processed and processable corn produced thereby |
| US8153866B2 (en) * | 2007-06-21 | 2012-04-10 | Suntava Llc | Corn inbreds like FAR045 and hybrids thereof |
| ES3006441T3 (en) | 2007-09-14 | 2025-03-18 | Amgen Inc | Homogeneous antibody populations |
| EP2195438B1 (en) * | 2007-10-05 | 2013-01-23 | Dow AgroSciences LLC | Methods for transferring molecular substances into plant cells |
| ES2647767T3 (es) | 2007-12-03 | 2017-12-26 | Syngenta Participations Ag | Generación por ingeniería genética de proteínas enzimáticamente susceptibles |
| AR069917A1 (es) | 2007-12-20 | 2010-03-03 | Dow Agrosciences Llc | Girasol con bajo contenido de grasas saturadas y metodos relacionados |
| US7964774B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-06-21 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV384196 |
| US7935870B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-05-03 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV354718 |
| US8829282B2 (en) * | 2008-05-14 | 2014-09-09 | Monsanto Technology, Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV425044 |
| US7947877B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-05-24 | Monosanto Technology LLC | Plants and seeds of spring canola variety SCV328921 |
| JP2012507565A (ja) | 2008-10-30 | 2012-03-29 | グオ・ペイシュエン | Ｄｎａのシークエンシング及び他の用途のための、膜に組み込まれたウイルスｄｎａパッケージングモータタンパク質コネクタバイオセンサ |
| JP2012507286A (ja) * | 2008-11-04 | 2012-03-29 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | オメガ９品質カラシナ |
| US8373025B2 (en) | 2009-02-09 | 2013-02-12 | Chromatin Germplasm, Llc | Herbicide resistant sorghum |
| MX2011013224A (es) | 2009-06-09 | 2012-06-01 | Pioneer Hi Bred Int | Promotor de endospermo temprano y metodos de uso. |
| US8071848B2 (en) * | 2009-06-17 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV218328 |
| SG10201502330TA (en) | 2009-08-03 | 2015-05-28 | Univ Miami | Method for in vivo expansion of t regulatory cells |
| US8440891B2 (en) | 2009-09-22 | 2013-05-14 | Board of Trustees of the University of Akransas, N.A. | Rice cultivar CL 142-AR |
| US8440892B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-05-14 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, N.A. | Rice cultivar CL 181-AR |
| AU2010307119B2 (en) * | 2009-10-16 | 2015-04-30 | Corteva Agriscience Llc | Use of dendrimer nanotechnology for delivery of biomolecules into plant cells |
| BR112012009044A2 (pt) | 2009-10-26 | 2015-09-01 | Pioneer Hi Bred Int | Molécula de ácido nucléico isolada, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, semente transgênica, método para expressão de um polinucleotídeo em uma planta ou célula vegetal e método para expressão de um polinucleotídeo, preferencialmente em tecidos somáticos de óvulo de uma planta |
| US8138394B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-03-20 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV431158 |
| US8143488B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-03-27 | Monsanto Technoloy LLC | Plants and seeds of spring canola variety SCV470336 |
| US8148611B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-04-03 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV453784 |
| US8581048B2 (en) * | 2010-03-09 | 2013-11-12 | Monsanto Technology, Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV119103 |
| US8153865B2 (en) * | 2010-03-11 | 2012-04-10 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV152154 |
| NZ602139A (en) | 2010-03-31 | 2015-01-30 | Dow Agrosciences Llc | Plant peptide gamma-zein for delivery of biomolecules into plant cells |
| UA113046C2 (xx) | 2010-07-07 | 2016-12-12 | Спосіб введення лінійної молекули нуклеїнової кислоти в клітину рослини, яка має клітинну стінку, із застосуванням пегильованих напівпровідникових наночастинок | |
| MX358659B (es) | 2011-02-22 | 2018-08-30 | Agrigenetics Inc | Germoplasma de canola que exhibe atributos de composicion de semilla que suministran valor nutricional a la harina de canola mejorada. |
| EP2697379B1 (en) | 2011-03-23 | 2018-08-29 | Dow AgroSciences LLC | Quantum dot carrier peptide conjugates suitable for imaging and delivery applications in plants |
| US8513487B2 (en) | 2011-04-07 | 2013-08-20 | Zenon LISIECZKO | Plants and seeds of spring canola variety ND-662c |
| US8513494B2 (en) | 2011-04-08 | 2013-08-20 | Chunren Wu | Plants and seeds of spring canola variety SCV695971 |
| US8507761B2 (en) | 2011-05-05 | 2013-08-13 | Teresa Huskowska | Plants and seeds of spring canola variety SCV372145 |
| US8513495B2 (en) | 2011-05-10 | 2013-08-20 | Dale Burns | Plants and seeds of spring canola variety SCV291489 |
| WO2013067259A2 (en) | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Syngenta Participations Ag | Regulatory nucleic acids and methods of use |
| US20130167262A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11268 |
| US9204603B2 (en) | 2011-12-21 | 2015-12-08 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety S05-11482 |
| WO2013103365A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pollen preferred promoters and methods of use |
| EP2800816A1 (en) | 2012-01-06 | 2014-11-12 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Ovule specific promoter and methods of use |
| US8835720B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-09-16 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV967592 |
| US8802935B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-08-12 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV942568 |
| US8878009B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-11-04 | Monsanto Technology, LLP | Plants and seeds of spring canola variety SCV318181 |
| US8859857B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-10-14 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV259778 |
| US9914930B2 (en) | 2012-09-07 | 2018-03-13 | Dow Agrosciences Llc | FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks |
| UA118090C2 (uk) | 2012-09-07 | 2018-11-26 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив |
| WO2014059155A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Guard cell promoters and uses thereof |
| US20140193410A1 (en) | 2013-01-09 | 2014-07-10 | University Of Miami | Compositions and Methods for the Regulation of T Regulatory Cells Using TL1A-Ig Fusion Protein |
| EA028528B1 (ru) | 2013-03-13 | 2017-11-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Внесение глифосата для борьбы с сорняками у brassica |
| WO2014153254A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| CA2901316A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
| BR112016003225B1 (pt) | 2013-08-16 | 2022-10-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polipeptídeo pip-47, polipeptídeo pip-47 quimérico, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população de inseto-praga, método para inibir o crescimento ou matar um inseto-praga, construto de dna, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método de obtenção de uma planta transgênica e método para controlar infestação de inseto |
| BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
| CN106536545B (zh) | 2014-02-07 | 2026-03-03 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| BR112016018103B1 (pt) | 2014-02-07 | 2024-01-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polipeptídeo e seu uso, polinucleotídeo, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população, método para inibir o crescimento, método para controlar a infestação, método para obtenção de uma planta ou célula vegetal, construto |
| KR101656689B1 (ko) * | 2014-07-29 | 2016-09-12 | 창원대학교 산학협력단 | 권연벌레살이금좀벌을 이용한 권연벌레의 방제방법 |
| CA2955828A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
| WO2016044092A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Pioneer Hi Bred International Inc | Compositions and methods to control insect pests |
| WO2016049531A1 (en) | 2014-09-26 | 2016-03-31 | Purecircle Usa Inc. | Single nucleotide polymorphism (snp) markers for stevia |
| CN113372421B (zh) | 2014-10-16 | 2024-08-06 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| US20170359965A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-12-21 | E I Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
| CN114075267B (zh) | 2015-01-15 | 2025-03-18 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| CA2985198A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EP3310803A1 (en) | 2015-06-16 | 2018-04-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| WO2016205749A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
| BR112018002535A2 (pt) | 2015-08-06 | 2018-09-25 | Du Pont | polipeptídeo inseticida recombinante, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, planta transgênica ou célula de planta, composição, proteína de fusão, método para controlar uma praga, método para inibir crescimento ou para exterminar uma população de pragas ou uma praga e uso do polipeptídeo |
| CN108575091A (zh) | 2015-12-18 | 2018-09-25 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| CA3004056C (en) | 2015-12-22 | 2024-01-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
| CA3018384A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CN109661458B (zh) | 2016-06-16 | 2023-05-09 | 纽希得营养澳大利亚私人有限公司 | 近交转基因油菜品系ns-b50027-4及其种子 |
| EP3472281A4 (en) | 2016-06-16 | 2020-02-19 | Nuseed Pty Ltd | ELITE EVENT RAPS NS-B50027-4 |
| CA3022858A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| UA127388C2 (uk) | 2016-06-24 | 2023-08-09 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Регуляторний елемент рослини і спосіб його застосування |
| EP3478052B1 (en) | 2016-07-01 | 2021-08-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| WO2018013333A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| US12499971B2 (en) | 2016-09-28 | 2025-12-16 | The Broad Institute, Inc. | Systematic screening and mapping of regulatory elements in non-coding genomic regions, methods, compositions, and applications thereof |
| EP3535285B1 (en) | 2016-11-01 | 2022-04-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US20200407737A1 (en) | 2017-05-03 | 2020-12-31 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of crispr-cas endonucleases for plant genome engineering |
| US11591601B2 (en) | 2017-05-05 | 2023-02-28 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes |
| WO2018213726A1 (en) | 2017-05-18 | 2018-11-22 | The Broad Institute, Inc. | Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing |
| AU2018338318B2 (en) | 2017-09-21 | 2022-12-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing |
| CN111373046A (zh) | 2017-09-25 | 2020-07-03 | 先锋国际良种公司 | 组织偏好性启动子和使用方法 |
| WO2019126709A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | The Broad Institute, Inc. | Cas12b systems, methods, and compositions for targeted dna base editing |
| US11332752B2 (en) | 2018-03-12 | 2022-05-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Use of morphogenic factors for the improvement of gene editing |
| CA3092078A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| AU2019234562B2 (en) | 2018-03-14 | 2024-08-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| US10968257B2 (en) | 2018-04-03 | 2021-04-06 | The Broad Institute, Inc. | Target recognition motifs and uses thereof |
| WO2019226508A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| CA3097915A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for selecting transformed plants |
| US20210395758A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for ochrobactrum-mediated plant transformation |
| CN113544266A (zh) | 2018-12-17 | 2021-10-22 | 博德研究所 | Crispr相关转座酶系统和其使用方法 |
| US12604825B2 (en) | 2019-11-01 | 2026-04-21 | Purecircle Usa Inc. | Stevia cultivar ‘18136109’ |
| BR112022027035A2 (pt) | 2020-07-14 | 2023-04-11 | Pioneer Hi Bred Int | Proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas |
| EP4203677A1 (en) | 2020-08-26 | 2023-07-05 | Vindara, Inc. | Method and/or compositions for lettuce (lactuca sativa) breeding and/or varieties developed thereby |
| WO2024020360A1 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Pairwise Plants Services, Inc. | Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc' |
| EP4725303A1 (en) | 2024-10-11 | 2026-04-15 | Agrokray Limited Liability Company | Spelt, method of producing spelt plants, grain produced from spelt plant and food product produced therefrom |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
| US4745051A (en) * | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US4879236A (en) * | 1984-05-16 | 1989-11-07 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US5004687A (en) * | 1985-05-21 | 1991-04-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Insect virus vector with broadened host range |
| US5041379A (en) * | 1987-03-16 | 1991-08-20 | American Biogenetic Science, Inc. | Heliothis expression systems |
| EP0374753A3 (de) * | 1988-12-19 | 1991-05-29 | American Cyanamid Company | Insektizide Toxine, Gene, die diese Toxine kodieren, Antikörper, die sie binden, sowie transgene Pflanzenzellen und transgene Pflanzen, die diese Toxine exprimieren |
-
1990
- 1990-10-04 US US07/593,657 patent/US5266317A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-10-01 RU RU93005107/13A patent/RU2130968C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-10-01 HU HU9300975A patent/HU215253B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-10-01 WO PCT/US1991/007216 patent/WO1992006181A1/en not_active Ceased
- 1991-10-01 EP EP91919834A patent/EP0566579B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-01 BR BR919106948A patent/BR9106948A/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-10-01 AT AT91919834T patent/ATE174384T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-01 SK SK288-93A patent/SK281251B6/sk unknown
- 1991-10-01 JP JP3518061A patent/JPH06501618A/ja active Pending
- 1991-10-01 DE DE69130617T patent/DE69130617D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-01 CZ CZ93573A patent/CZ285626B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-10-01 CA CA002093335A patent/CA2093335C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-01 ES ES91919834T patent/ES2125871T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-01 AU AU89249/91A patent/AU655444B2/en not_active Ceased
- 1991-10-02 ZA ZA917890A patent/ZA917890B/xx unknown
- 1991-10-03 IE IE348091A patent/IE913480A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-10-03 IL IL9964491A patent/IL99644A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-04 MX MX9101454A patent/MX9101454A/es not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-04-01 KR KR1019930701026A patent/KR100226241B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-02-10 GR GR990400409T patent/GR3029323T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69130617D1 (de) | 1999-01-21 |
| SK281251B6 (sk) | 2001-01-18 |
| JPH06501618A (ja) | 1994-02-24 |
| ES2125871T3 (es) | 1999-03-16 |
| CA2093335C (en) | 1999-08-03 |
| IE913480A1 (en) | 1992-04-08 |
| WO1992006181A1 (en) | 1992-04-16 |
| EP0566579B1 (en) | 1998-12-09 |
| SK28893A3 (en) | 1993-07-07 |
| EP0566579A1 (en) | 1993-10-27 |
| KR930702513A (ko) | 1993-09-09 |
| AU655444B2 (en) | 1994-12-22 |
| ATE174384T1 (de) | 1998-12-15 |
| BR9106948A (pt) | 1993-08-17 |
| US5266317A (en) | 1993-11-30 |
| IL99644A0 (en) | 1992-08-18 |
| CA2093335A1 (en) | 1992-04-05 |
| IL99644A (en) | 1998-08-16 |
| GR3029323T3 (en) | 1999-05-28 |
| MX9101454A (es) | 1992-06-05 |
| HU215253B (hu) | 1998-11-30 |
| KR100226241B1 (ko) | 1999-10-15 |
| ZA917890B (en) | 1992-08-26 |
| AU8924991A (en) | 1992-04-28 |
| EP0566579A4 (en) | 1994-07-06 |
| HUT64393A (en) | 1993-12-28 |
| RU2130968C1 (ru) | 1999-05-27 |
| CZ57393A3 (en) | 1994-01-19 |
| HU9300975D0 (en) | 1993-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ285626B6 (cs) | Geny paralytických neurotoxinů specifických pro hmyz, způsoby a prostředky pro biologickou kontrolu hmyzu | |
| US5662897A (en) | Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use | |
| US6096304A (en) | Recombinant baculovirus insecticides | |
| JP2968997B2 (ja) | 改良された生物学的昆虫制御物質および使用方法 | |
| HU217569B (hu) | Rekombináns bakulovírust tartalmazó inszekticid készítmények, eljárás a hatóanyag előállítására és maga a hatóanyag | |
| AU722221B2 (en) | Biological insect control agents expressing insect-specific mite toxin genes, methods and compositions | |
| US5461032A (en) | Insecticidally effective peptides | |
| US5674485A (en) | Insect diagnostic and control compositions with truncated JHE | |
| HUP0101684A2 (hu) | Rekombináns bakulovírus-alapú inszekticid | |
| SK87093A3 (en) | Insecticidally effective peptides | |
| AU743526B2 (en) | Transgenic virus | |
| US6156309A (en) | Insecticidal compositions and methods | |
| US6090379A (en) | Stable pre-occluded virus particle for use in recombinant protein production and pesticides | |
| US5593669A (en) | Stable pre-occluded virus particle | |
| MXPA96000235A (en) | Viruses of insects, sequences, insecticidal compositions and methods of use of mis | |
| MXPA99002857A (en) | Biological insect control agents expressing insect-specific mite toxin genes, methods and compositions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20031001 |