CZ286016B6 - Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje - Google Patents
Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ286016B6 CZ286016B6 CZ93948A CZ94893A CZ286016B6 CZ 286016 B6 CZ286016 B6 CZ 286016B6 CZ 93948 A CZ93948 A CZ 93948A CZ 94893 A CZ94893 A CZ 94893A CZ 286016 B6 CZ286016 B6 CZ 286016B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- human protein
- protein
- molecule
- residue
- replaced
- Prior art date
Links
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 title claims abstract description 92
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 36
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 24
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 20
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 12
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 19
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 abstract description 16
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 abstract description 16
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001407 anti-thrombic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 abstract 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 abstract 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 36
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 36
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 35
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 8
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 8
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 6
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 5
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241001125862 Tinca tinca Species 0.000 description 3
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000763314 Homo sapiens Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000013746 hereditary thrombophilia due to congenital protein C deficiency Diseases 0.000 description 2
- 102000051206 human THBD Human genes 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 2
- YYLQUHNPNCGKJQ-NHYDCYSISA-N (3R)-3-hydroxy-L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)[C@@H](O)C(O)=O YYLQUHNPNCGKJQ-NHYDCYSISA-N 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001365 aminolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000007819 clotting time assay Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000019 pro-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005380 purpura fulminans Diseases 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Deriváty lidské bílkoviny C s vysokou účinností a se sníženou závislosti na aktivaci thrombinem se liší od nativních forem lidské bílkoviny C zvýšenou aktivační mírou, funkčními účinnostmi a uhlohydrátovou strukturou. Těchto derivátů se proto může používat jakožto antithrombických činidel, nevykazujících antikoaguační účinnost s výjimkou přítomnosti výrazné generace thrombinu.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká derivátu lidské bílkoviny C, voleného ze souboru zahrnujícího tři deriváty lidské bílkoviny C, kde asparaginový zbytek v poloze 313 a alespoň ještě jeden jiný zbytek molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen zbytkem specifikovaným dále. Vynález se především týká oblasti lidské medicíny, zvláště ošetřování poruch koagulace krve.
Dosavadní stav techniky
Nativní lidská bílkovina C, jejíž aminokyselinová sekvence je na obr. 1, je na vitaminu K závislá bílkovina plazmy, která cirkuluje hlavně jakožto neaktivní disulfidicky vázaný heterodimer, sestávající z lehkého řetězce přibližně o molekulové hmotnosti 25 000 a z těžkého řetězce o molekulové hmotnosti přibližně 41 000. Těžký řetězec obsahuje serinovou proteázovou oblast s jejím N-koncovým aktivačním peptidem, zatím co lehký řetězec obsahuje oblast zbytků τkarboxyglutamové kyseliny, kterých je zapotřebí pro membránovou vazbu závislou na vápníku a pro funkční aktivitu. Nereaktivní lidský bílkovinový C zymogen se převádí na aktivovanou bílkovinu C působením komplexu thrombin/thrombomodulin, který štěpí aktivační peptid (zbytky 158 až 169 cirkulujícího zymogenu nebo zbytky 200 až 211 preprozymogenu) k vytvoření aktivované bílkoviny C.
Úloha bílkoviny C jakožto terapeutického činidla je dobře známá například US patentového spisu číslo 4 775 624 (Bang a kol.), kde se popisuje způsob přípravy aktivované lidské bílkoviny C.
Nativní lidskou bílkovinu C blíže objasňuje obr. 1, kde ♦ = glykosylační místa, * = katalytická triáda, β = β-hydroxyasparagová kyselina, δ = τ-karboxyglutamová kyselina, sekvence 156-157 odstraněná při procesu, T20 (aktivační peptid) se odstraní k převedení hPC zymogenu na aktivovaný enzym (aPC).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je derivát lidské bílkoviny C, volený ze souboru zahrnujícího derivát lidské bílkoviny C, ve kterém asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem, derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek
-1 CZ 286016 B6 v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
Tyto deriváty lidské bílkoviny C se mnohem snadněji aktivují thrombinem a jsou také funkčně účinnější ve srovnání s molekulou divokého typu lidské bílkoviny C podle obr. 1 nebo ve srovnání s jinými deriváty lidské bílkoviny C.
Vynález rovněž souvisí s deriváty rekombinantními DNA konstrukcemi, vektory a transformanty užitečnými při produkci nových derivátů lidské bílkoviny C. Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících účinné množství derivátů lidské bílkoviny C podle vynálezu spolu s alespoň jedním farmaceuticky vhodným excipientem, které jsou vhodné pro ošetřování a prevenci chorobných stavů.
Pro účely vynálezu se zde používá následujících zkratek:
Q313 - derivát lidské bílkoviny C, kde je asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen glutaminovým zbytkem.
Q329 - derivát lidské bílkoviny C, kde je asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen glutaminovým zbytkem.
Deriváty bílkoviny C Q313 aQ329jsou popsány v evropské přihlášce vynálezu číslo EP-A0 443 874 (Gerlitz a kol.) a v časopise J. Biol. Chem., 1991, 226, str. 9778 až 9785 (Grinnell a kol.).
Q3Q9-derivát lidské bílkoviny C, kde je asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
F167 - deriváty lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninem.
Derivát bílkoviny F167je popsán v evropské přihlášce vynálezu číslo EP-A-0 323 149(Bang a kol.) a v časopise 1990, EMBO J. str. 2367 až 2373 (Ehrlich a kol.).
LIN - derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem.
FLIN-derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninovým zbytkem asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem.
Derivát bílkoviny C LIN a FLIN jsou popsány v evropské přihlášce vynálezu číslo EP-A0 443 875 (Grinnell a kol.) a v publikaci Protein C and Related Anticoagulants (Bílkovina C a příbuzné antikoagulanty) (vyd. Bruley, D. & Drohan, W.) str. 13 až 46 (Gulf Publishing Co., Houston, 1990).
FLIN-Q313-derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninovým zbytkem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
-2CZ 286016 B6
FLIN-Q3Q9 - derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninovým zbytkem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
GBMT transkripční jednotka - modifikovaná transkripční řídicí jednotka obsahující zesilovač transkripce P2 BK viru umístěného těsně ve směru regulátorového prvku adenoviru většího pozdního promotoru (MLTF) adenoviru-2 většího pozdního promotoru, póly GT prvku umístěného ke stimulaci tohoto promotoru a DNA sekvence obsahují střihovou tripartitní vedoucí sekvenci adenoviru.
Nascentní bílkovina - polypeptid produkovaný po translaci mRNA transkriptů před jakýmkoliv posttranslačními modifikacemi. Avšak posttranslační modifikace jako je gama-karboxylace zbytků kyseliny glutamové a hydroxylace zbytků kyseliny asparagové se mohou začít vyskytovat dříve než dojde k plné translaci bílkoviny z mRNA transkriptů.
Aktivita bílkoviny C-jakákoliv vlastnost lidské bílkoviny C zodpovědná za proteolytickou, aminolytickou, esterolytickou a biologickou (antikoagulační nebo profíbrinolytickou) účinnost. Způsoby zkoušení antikoagulačního působení bílkoviny jsou v oboru dobře známy a jsou popsány například v časopise 1987, Bio/Technology, 5, str. 1189 až 1192 (Grinnell a kol).
Zymogen - enzymaticky účinný prekurzor proteolytického enzymu. Výrazem bílkovinový C zymogen se zde míní skrytá, neaktivní forma buď jednoho nebo dvou řetězců bílkoviny C.
Všechny používané zkratky pro aminokyseliny jsou schváleny organizací United States Patent and Trademark Office podle ustanovení 37 C.F.R. § 1.822 (b) (2) (1990).
Vynález se týká derivátů lidské bílkoviny C, které mají obměněný glykosylační obrazec a které mají obměněné oblasti účinnosti. Obzvláště tyto deriváty zahrnují Q3Q9, FLIN-Q313 aFLINQ3Q9. Derivát Q3Q9 obsahuje glutaminové zbytky v polohách 313 a 329 molekuly bílkoviny C (místo asparaginových zbytků, které jsou normálně v těchto polohách). Derivát FLINQ313 obsahuje fenylalaninový zbytek v poloze 167 molekuly bílkoviny C a asparaginový zbytek v poloze 172 molekuly bílkoviny C (místo zbytků kyseliny asparagové, které jsou normálně v těchto polohách) a glutaminový zbytek v poloze 313 (místo asparaginového zbytku, který je normálně v této poloze). V derivátu FLIN-Q3Q9 je v poloze 167 kyselina asparagová vyměněna za fenylalanin, zbytek v poloze 172 je zaměněn z kyseliny asparagové na asparagin, zbytek v poloze 313 je zaměněn zasparaginu na glutasmin a zbytek v poloze 329 je zaměněn z asparaginu na glutamin.
Deriváty FLIN-Q313 a FLIN-Q3Q9 vykazují mimořádně vysoký stupeň aktivace samotným thrombinem. Kromě toho oba tyto deriváty FLIN-Q313 a FLIN-Q3Q9 mohou být na rozdíl od divokého typu lidské bílkoviny C aktivovány thrombinem generovaným ve srážející se lidské plazmě, což vede k inhibici dalšího vytváření shluků. Tento srážení aktivující proenzym má podstatně vyšší specifickou účinnost a delší poločas než aktivovaná forma přírodní bílkoviny C. Těchto derivátů podle vynálezu se proto může používat jakožto místně aktivovaných antithrombických činidel, nevykazujících antikoagulační účinnost a výjimkou přítomnosti výrazné generace thrombinu.
Vynález se rovněž týká DNA sloučenin, použitelných pro přípravu derivátů bílkoviny C. Tyto DNA sloučeniny obsahují kódující sekvenci pro lehlý řetězec lidské bílkoviny C, umístěný bezprostředně vedle ve směru a v translačním čtecím rámci s prepropeptidovou sekvencí
-3CZ 286016 B6 divokého typu zymogenu bílkoviny C. DNA sekvence zakódovává Lys-Arg dipeptid, který se zpracovává v průběhu zrání molekuly bílkoviny C, aktivace peptidu a těžkého řetězce molekuly bílkoviny C. Změny aminokyselinových zbytků v polohách 167, 172 a 313 mění aktivaci molekuly zatímco změny v aminokyselinových zbytcích v polohách 313 a 329 mění uhlohydrátový obsah molekuly.
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že v důsledku degenerace genetického kódu mohou varianty DNA sloučeniny zakódovávat shora popsané polypeptidy. V americkém patentovém spise číslo 4 775 624 (Bang a kol.) se popisuje v DNA sekvence kódující divoký typ formy molekuly lidské bílkoviny C. Pracovník v oboru může tedy snadno stanovit, kterých obměn DNA sekvence se může použít pro konstrukci jiných DNA sekvencí, které mohou zakódovávat přesné polypeptidy, jak zde uvedeno, přičemž však vynález není omezen na specifické DNA sekvence. Proto dále popsané konstrukce a v příkladech doložené výhodné DNA sloučeniny, vektory a transformanty vynález toliko blíže objasňují avšak nijak jeho rozsah neomezují. Kromě toho substituce GLn místo Asn v polohách 313 a 329 je ilustrativní a neomezuje rozsah vynálezu jako jiné substituce, kterých se může použít s výjimkou Cys nebo Pro.
Všechny DNA sloučeniny podle vynálezu se připravují místně řízenou mutagenezí genu lidské bílkoviny C. Mutované zymogenové kódující molekuly se pak včleňují do eukaryotických expresních vektorů, takže exprese zymogenových genů může probíhat působením transkripční jednotky GBMT. Tyto vektory se transformují do Escherichia coli K12 AG1 buněk a ukládají se a jsou trvalou zásobní kulturou sbírky organizace Northem Regional Research Laboratories vPeoria, Illinois 61604 od 14. Ledna 1992. Specifické kultury a jejich identifikační čísla jsou v tabulce I.
Tabulka I
Kultura
Identifikační číslo
E. coli K12 AGl/pGT-h-Q3Q9
E. coli K12 AGl/pGT-h-FLIN-Q313
E. coli K12 AGl/pGT-h-FLIN-Q3Q9
NRRLB-18938
NRRLB-18939
NRRLB-18940
Kultury se získají a plazmidy se izolují o sobě známými způsoby a pak se mohou přímo převádět do eukaryotických hostujících buněk pro produkci derivátů lidské bílkoviny C. Je výhodné převádět plazmidy do hostujících buněk, které vykazují expresi adenoviru El A bezprostředně před genovým produktem, takže zesilovač BK, zjištěný v GBMT transkripční řídicí jednotce, podporuje expresi účinněji v přítomnosti E1A. GBMT transkripční řídicí jednotka je úplněji popsána v evropské přihlášce vynálezu číslo 91301451.0 (Berg a kol.). Pracovníkům v oboru je jasné, že četné hostující buňky vykazují expresi nebo mohou vykazovat expresi bezprostředně dřívějšího genového produktu velkého DNA viru. Nejvýhodnější buněčnou řadou („cell line“) pro expresi derivátů lidské bílkoviny C podle vynálezu je buněčná řada 293 lidské ledviny, která je popsána v americkém patentovém spise číslo 4 992373 (Bang a kol.). Po expresi v buněčné řadě se deriváty čistí od buněčné kultury supematantu za použití způsobu popsaného v americkém patentovém spise číslo 4 981952 (Yan).
DNA sekvence podle vynálezu se mohou syntetizovat chemicky nebo kombinací restrikčních fragmentů nebo kombinací o sobě známých způsobů v tomto oboru. DNA syntetizující zařízení jsou dostupná a může se jich používat ke konstruování DNA sloučenin podle vynálezu.
Ilustrativní vektory podle vynálezu zahrnují GBMT transkripční jednotku umístěnou k stimulaci transkripce kódujících sekvencí adenovirovým pozdním promotorem. Pracovníkům v oboru je jasné, že v oboru je znám velký počet eukariotických promotorů, zesilovačů a expresních vektorů
-4CZ 286016 B6 a že se jich může použít k expresi DNA sekvencí pro produkci derivátů bílkoviny C podle vynálezu. Pracovníkům v oboru je rovněž známo, že eukaryotický expresní vektor může fungovat bez zesilovacího prvku. Klíčové hledisko podle vynálezu není založeno na určitém zesilovači nebo promotoru, použitém k expresi derivátů, ale spíše na nových DNA sekvencích a odpovídajících bílkovinách pocházejících z takových sekvencí.
Vektory podle vynálezu se mohou transformovat do nejrůznějších eukaryotických, zvláště savčích hostujících buněk a mohou vykazovat expresi v takových buňkách. Všechny tyto vektory, uložené v NRRL, obsahují gen nesoucí hygromycinovou odolnost. Avšak vektory, které neobsahují žádný selektovatelný signální znak, se mohou snadno konstruovat a může se jich používat k provádění dočasných zkoušek nebo se mohou kontratransformovat do buněčných řad spolu šjinými vektory, které obsahují selektovatelné signální znaky. Tyto vektory podle vynálezu mohou zahrnovat sekvence, které umožňují replikaci E. coli, jelikož je zpravidla mnohem účinnější příprava plazmidů DNA v E. coli než v jiných hostujících organismech.
Jsou možné četné modifikace a variace ilustrativních DNA sekvencí a plazmidů. Například degenerace genetického kódu bere v úvahu substituci neukleotidů polypeptidovými kódujícími oblastmi, jakož také v translačním terminačním signálu bez změny zakódované polypeptidové kódující sekvence. Takové subtituovatelné sekvence se mohou odvozovat od známé aminokyseliny nebo DNA sekvence lidské bílkoviny C a mohou se konstruovat běžnými syntetickými postupy nebo běžnou místně řízenou mutagenezí. Syntetické postupy se mohou provádět v podstatě způsobem, který popsal Itakura a kol., 1977, Science 198, str. 1056 a Crea a kol., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75, str. 5765. Proto se vynález nijak neomezuje na DNA sekvence a plazmidy specificky doložené v příkladové části.
Způsoby aktivace zymogenových forem lidské bílkoviny C na aktivované deriváty lidské bílkoviny C jsou již dávno dobře známy. Bílkovina C se může aktivovat samotným thrombinem, komplexem throbin/thrombomodulin, Russell Viperovým jedem nebo nejrůznějšími jinými prostředky. Aktivita derivátů lidské bílkoviny se může měřit podle thrombinové aktivace buď totálními amidolytickými zkouškami, nebo antikoagulačními zkouškami. Aktivace thrombinu a zkoušky bílkoviny C (amidolytické a antikoagulační) se provádějí způsobem, který popsal Grinnell a kol., 1987 Bio/Technology 5, str. 1187 až 1192.
Rekombinantní deriváty lidské bílkoviny C podle vynálezu jsou užitečné pro prevenci a ošetřování nejrůznějších chorobných stavů zahrnujících intravaskulámí koagulaci včetně trombózy hloubkových žil, pulmonámího embolismu, periferální arteriální trombózy, embolie pocházející od srdečních nebo periferálních arterií, akutní mykardiální infarkce, thrombotických potíží, nestabilní angíny, periferální vaskulámí chirurgie, transplantace orgánů a rozptýlené intravaskulámí koagulace. Tyto deriváty bílkoviny C se také mohou účinně používat při ošetření značného počtu nemocných s heterozygosní nedostatečností bílkoviny C znamenající opakující se trombózu hloubkových žil a případů nemocných sdeficiencí homozygosní bílkoviny C s purpura fulminans. Ještě další terapeutickou indikací aktivovaných derivátů bílkoviny C je prevence trombózy hloubkových žil a pulmonámího embolismu běžně ošetřovaného nízkými dávkami heparinu.
Deriváty a aktivované protějšky podle vynálezu se formulují o sobě známými způsoby pro přípravu farmaceutických prostředků, přičemž se derivát lidské bílkoviny C nebo aktivovaný derivát lidské bílkoviny C podle vynálezu zpracovává ve směsi s farmaceuticky vhodným nosičovým pojidlem. Vhodná nosičová pojidla a jejich formulace včetně jiných lidských bílkovin, například lidského serumalbuminu, jsou popsány například v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, 1980, Mack Publishing Co., Osol a kol. Takové prostředky mají obsahovat účinné množství derivátu bílkoviny C nebo aktivovaného protějšku spolu se vhodným množstvím pojivového nosiče pro přípravu farmaceuticky vhodných prostředků pro
-5CZ 286016 B6 účinné podání ošetřovanému jedinci. Prostředky s derivátem bílkoviny C se mohou podávat parenterálně nebo jinými způsoby k zajištění uvolňování do krevního oběhu v účinné formě.
Následující příklady praktického provedení vynález toliko objasňují, nijak ho však neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Produkce derivátů lidské bílkoviny C
Expresní vektory podle vynálezu se izolují z buněk E. coli, pak se transformují na 293 buňky, transformanty se selektují při teplotě 37 °C, kultivují se pro získání derivátů lidské bílkoviny C způsobem podle amerického patentového spisu číslo 4 992373 (Bang a kol.). Deriváty se čištěním oddělí od supematantové buněčné kultury způsobem podle amerického patentového spisu číslo 4 981952 (Yan).
Příklad 2
Antikoagulační účinnost
Plně aktivovaná bílkovina C se získá působením aktivačního materiálu s 10 nM thrombinu v komplexu s rozpustným rekombinantním lidským thrombomodulinem TMD-75, jak popisuje Parkinson a kol., 1990, J. Biol. Chem. 265, str. 12602 až 12610. Antikoagulační účinnost aktivovaných molekul se měří aktivovanou parciální thromboplastinovou zkouškou doby srážení. Výsledky jsou uvedeny v tabulce II.
Tabulka II
Bílkovina C divoký typ
Q313
LIN
F167
FLIN
FLIN-Q313
Antikoagulační účinnost (jednotka/mg)
325 +/- 65
577+/- 17
289+/- 13
283 +/ - 27
313+/-65
552+/-37
Relativní účinnost
1,0
1,8
0,9
0,9
1,0
1,7
Příklad 3
Rychlosti aktivace
Rychlosti aktivace se stanoví za použití lidského thrombinu (10 nM) v reakční směsi obsahující 20 mM Tris, hodnota pH 7,4,0,15 M chloridu sodného, 0,1 mg/ml BSA a 3 mM chloridu vápenatého. Čištěná bílkovina jak divoký typ tak deriváty je v aktivační reakci v koncentraci 0,81 až 1,61 μΜ. Aktivační rychlosti se stanoví odebíráním podílů z aktivační reakční směsi v různé době do destičky s 96 důlky a přidáním chromogenního substrátu (S-2366) do konečné
-6CZ 286016 B6 koncentrace 0,75 mM, přičemž se měří amidolytická účinnost jakožto změna absorbančních jednotek za minutu při 405 nM v ThermoMax kinetickém mikrotitrovém destičkovém odečítači (Molecular Devices). Rychlosti se stanovují převedením změny v OD/min na množství generované aktivované bílkoviny C za použití specifických aktivit, stanovených pro každou bílkovinu a vynesením proti aktivační době. Množství aktivované bílkoviny C bylo menší než 10 % celkové výchozí látky ve všech zkouškách. Výsledky jsou uvedeny v tabulce III.
Tabulka III
| Bílkovina C | Míra aktivace thrombinem (ng/min) | Relativní rychlost aktivace |
| divoký typ | 0,53+/-0,1 | 1,0 |
| Q329 | 0,23a | 0,4 |
| Q313 | 1,10+/-0,2 | 2,0 |
| Q3Q9 | l,62a | 3,3 |
| LIN | 2,20+/-0,4 | 4,0 |
| F167 | 6,30+/-1,0 | 12,0 |
| FLIN | 15,90+/-4,0 | 30,0 |
| FLIN-Q313 | 32,30 +/ - 6,4 | 61,0 |
| FLIN-Q3Q9 | 45,00a | 84,0 |
a rychlostí bez směrodatné odchylky jsou ze studií, kde n = 2
Relativní rychlosti aktivace se rovněž stanoví stejným systémem zkoušek za použití thrombinu a thrombomodulinu. Thrombomodulinovou použitou molekulou je rozpustný lidský thrombomodulin podle Parkinsona a kol. (jak shora uvedeno). Výsledky jsou uvedeny v tabulce IV.
Tabulka IV
| Bílkovina C | Relativní rychlosti aktivace thrombinem a thrombomodulinem |
divoký typ
Q313
LIN
F167
FLIN
FLIN-Q313 la
2,6 +/ - 0,6
2,1 +/-0,2
3,5+/-0,8 2,7a
9,2+/-1,0 a rychlosti bez směrodatné odchylky jsou ze studií, kde n = 2
Příklad 4
Antikoagulační účinnost při srážení lidské plazmy
Divoký typ lidské bílkoviny C a derivát FLIN-Q313 se vnese do lidské plazmy v koncentraci 20 nM spolu s Helena standardním APTT činidlem a inkubující se po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Srážení plazmy se iniciuje přidáním chloridu vápenatého do konečné koncentrace 8 mM a měří se doba srážení. V současně prováděných pokusech se přidá monoclonální protilátka
-7CZ 286016 B6 schopná neutralizovat účinnost aktivované bílkoviny C do kontrolní plazmy a plazmy obsahující zymogenový divoký typ bílkoviny C nebo FLIN-Q313. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V.
Tabulka V
Bílkovina C žádná (kontrolní) divoký typ FLIN-Q313
Doba srážení (sekundy) +Ab -Ab
30+/-4
36+/-4
36+/-4
32+/-3
33+/-5
75+/-5
Míra srážení, navozená ve srážející se plazmě, se stanovuje jakožto funkce koncentrace divokého typu lidské bílkoviny C a derivátu FLIN-Q313 a hodnoty se vyjadřují jakožto prodloužená doba srážení. Základní doba srážení při zkoušce je 27 až 33 sekund. Výsledky jsou uvedeny v tabulce VI.
Tabulka VI
Prodloužení doby srážení (sekundy)
Bílkovina C
Dávka (nM)
| divoký typ | 8 | 0+/-3 |
| FLIN-Q313 | 8 | 20+/-6 |
| divoký typ | 16 | 0+/-5 |
| FLIN-Q313 | 16 | 37+/-6 |
| divoký typ | 32 | 0+/-5 |
| FLIN-Q313 | 32 | 77+/-6 |
| divoký typ | 64 | 0+/ -5 |
| FLIN-Q313 | 64 | 235 +/- 6 |
Příklad 5
Stanovení reaktivního poločasu
Inhibice lidské bílkoviny C v plazmě se stanovuje inkubací normální lidské plazmy (citrátované) 100 nM aktivované lidské bílkoviny C, aktivovaného FLIN-Q313 nebo zymogenového (neaktivovaného) FLIN-Q313. Koncentrace plazmy je 90% (objem/objem) v konečné reakční směsi se zbývajícím objemem sestávajícím z pufru obsahujícího 3 mM chloridu vápenatého, 150 mM chloridu sodného, 20 mM Tris, hodnota pH 7,4 a 1 mg/ml BSA. Ve vybraných intervalech se odebírají podíly a stanovuje se aktivita aktivované bílkoviny C podle amidolytické účinnosti za použití s-2366 v konečné koncentraci 1 mM nebo podle aktivované parciální thromboplastinové doby. Míra sraženinou aktivované účinnosti FLIN-Q313 se stanovuje způsobem podle příkladu 4. Aktivovaná bílkovina C a aktivovaný FLIN-Q313 oba vykazují větší než 50% ztrátu účinnosti po přibližně 25 minutách, zatímco zymogenový FLIN Q313 zachovává alespoň 80 % účinnosti po 45 minutách.
-8CZ 286016 B6
Průmyslová využitelnost
Deriváty lidské bílkoviny C s vysokou účinností a se sníženou závislosti na aktivaci thrombinem se liší od nativních forem lidské bílkoviny C zvýšenou aktivační mírou, funkčními účinnostmi a uhlohydrátovou strukturou. Těchto derivátů se proto může používat jakožto místně aktivovaných antithrombických činidel, nevykazujících antikoagulační účinnost s výjimkou přítomnosti výrazné generace thrombinu.
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Derivát lidské bílkoviny C, volený ze souboru zahrnujícího derivát lidské bílkoviny C, ve kterém asparaginový zbytek v poloze 313 molekul nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem, derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazena fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazena glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
- 2. Derivát lidské bílkoviny C podle nároku 1, ve kterém asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
- 3. Derivát lidské bílkoviny C podle nároku 1, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
- 4. Derivát lidské bílkoviny C podle nároku 1, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88719192A | 1992-05-21 | 1992-05-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ94893A3 CZ94893A3 (en) | 1994-01-19 |
| CZ286016B6 true CZ286016B6 (cs) | 1999-12-15 |
Family
ID=25390640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ93948A CZ286016B6 (cs) | 1992-05-21 | 1993-05-19 | Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5453373A (cs) |
| EP (1) | EP0575054B1 (cs) |
| JP (1) | JP3564150B2 (cs) |
| KR (1) | KR100291529B1 (cs) |
| CN (1) | CN1080658A (cs) |
| AT (1) | ATE286121T1 (cs) |
| AU (1) | AU661901B2 (cs) |
| BR (1) | BR9301944A (cs) |
| CA (1) | CA2096604C (cs) |
| CZ (1) | CZ286016B6 (cs) |
| DE (1) | DE69333727T2 (cs) |
| DK (1) | DK0575054T3 (cs) |
| ES (1) | ES2233925T3 (cs) |
| FI (1) | FI932282L (cs) |
| HU (1) | HU218408B (cs) |
| IL (1) | IL105757A0 (cs) |
| MX (1) | MX9302917A (cs) |
| MY (1) | MY110664A (cs) |
| NO (1) | NO311299B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ247651A (cs) |
| PH (1) | PH29911A (cs) |
| PT (1) | PT575054E (cs) |
| RU (1) | RU2122004C1 (cs) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2067525C (en) * | 1991-05-09 | 1998-09-15 | Helmut G. Alt | Organometallic fluorenyl compounds, preparation and use |
| AT402262B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c |
| US5716795A (en) * | 1991-10-04 | 1998-02-10 | Matschiner; John T. | Thrombomodulin-based coagulometric assay of the protein C system |
| WO1993007491A1 (en) * | 1991-10-04 | 1993-04-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | A soluble thrombomodulin-based one-stage assay for vitamin k-dependent coagulation-inhibiting proteins |
| DE4320294A1 (de) * | 1993-06-18 | 1994-12-22 | Immuno Ag | Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen |
| ZA983496B (en) | 1997-04-28 | 1999-10-25 | Lilly Co Eli | Methods for processing activated protein C. |
| US6630137B1 (en) * | 1997-04-28 | 2003-10-07 | Eli Lilly And Company | Activated protein C formulations |
| BR9809932A (pt) * | 1997-06-05 | 2000-08-01 | Lilly Co Eli | Métodos para tratamento de distúrbios trombóticos |
| HUP0001237A3 (en) * | 1997-10-20 | 2002-01-28 | Lilly Co Eli | Methods for treating vascular disorders |
| US6815533B1 (en) | 1998-07-31 | 2004-11-09 | Eli Lilly And Company | Cryogranulation of activated protein C |
| CA2338766A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Eli Lilly And Company | Cryogranulation of activated protein c |
| CN1324244A (zh) | 1998-10-22 | 2001-11-28 | 伊莱利利公司 | 治疗脓毒症的方法 |
| DE69930419T2 (de) | 1998-11-13 | 2006-09-07 | Eli Lilly And Co., Indianapolis | Verwendung von menschliche protein c zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von heparininduzierter thrombozytopenie |
| ATE235915T1 (de) | 1998-11-20 | 2003-04-15 | Lilly Co Eli | Behandlung von hämorrhagischem virusfieber mit protein c |
| BR9915572A (pt) | 1998-11-23 | 2001-08-14 | Lilly Co Eli | Processo de tratamento de doença de célula falciforme e talassemia |
| US6998122B1 (en) * | 1999-04-30 | 2006-02-14 | Eli Lilly And Company | Protein C derivatives |
| EP1237917A2 (en) * | 1999-11-19 | 2002-09-11 | Eli Lilly And Company | Protein c derivatives |
| US6841371B2 (en) * | 2000-02-02 | 2005-01-11 | Eli Lilly And Company | Protein C derivatives |
| JP2003521938A (ja) | 2000-02-11 | 2003-07-22 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | プロテインｃ誘導体 |
| US7204981B2 (en) * | 2000-03-28 | 2007-04-17 | Eli Lilly And Company | Methods of treating diseases with activated protein C |
| US6933367B2 (en) | 2000-10-18 | 2005-08-23 | Maxygen Aps | Protein C or activated protein C-like molecules |
| MXPA03003388A (es) * | 2000-10-18 | 2005-03-07 | Maxygen Aps | Moleculas de proteina c o similares a las de proteina c activadas. |
| IL154999A0 (en) * | 2000-10-18 | 2003-10-31 | Maxygen Aps | Protein c or activated protein c-like molecules |
| WO2002085117A1 (en) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Eisai Co., Ltd. | Methods and compositions for preventing and treating septic shock and endotoxemia |
| US20050143283A1 (en) * | 2002-03-08 | 2005-06-30 | Eli Lilly And Company | Activated protein c formulations |
| WO2003106666A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Maxygen Aps | Protein c variants with altered properties |
| US20070142272A1 (en) * | 2003-01-24 | 2007-06-21 | Zlokovic Berislav V | Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity |
| JP2008507561A (ja) * | 2004-07-23 | 2008-03-13 | ザ ユニバーシティ オブ ロチェスター | 活性化プロテインｃによる、脳内のプラスミノゲン活性化因子の不都合な作用の阻害 |
| WO2006110083A1 (en) * | 2005-04-13 | 2006-10-19 | Astrazeneca Ab | A host cell comprising a vector for production of proteins requiring gamma-carboxylation |
| US20090148458A1 (en) * | 2005-06-23 | 2009-06-11 | The University Of British Columbia | Coagulation factor iii polymorphisms associated with prediction of subject outcome and response to therapy |
| EP2041338A4 (en) * | 2006-06-09 | 2009-09-30 | Univ British Columbia | INTERFERON GAMMA POLYMORPHISMS AS INDICATORS OF RESULT IN SERIOUSLY SICK SUBJECTS |
| US20100184672A1 (en) * | 2007-06-18 | 2010-07-22 | Mccarty Owen J T | Protein c for use in maintaining hemostasis |
| CA2712057A1 (en) * | 2008-01-15 | 2009-07-23 | The University Of British Columbia | Protein c rs2069915 as a response predictor to survival and administration of activated protein c or protein c-like compound |
| ES2629099T3 (es) | 2008-12-19 | 2017-08-07 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Derivados de serin proteasa y usos en la prevención o el tratamiento de y trastornos de la coagulación sanguinea |
| WO2012068519A2 (en) | 2010-11-19 | 2012-05-24 | Sirius Genomics Inc. | Markers associated with response to activated protein c administration, and uses thereof |
| ES2676422T3 (es) | 2012-07-04 | 2018-07-19 | Zz Biotech Llc | Proteína C activada para su uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios de la piel |
| ES2890675T3 (es) | 2014-04-16 | 2022-01-21 | Zz Biotech Llc | APC para uso en el tratamiento de cicatrices cutáneas anormales |
| PT3131572T (pt) | 2014-04-16 | 2021-09-24 | Zz Biotech Llc | Análogo de apc para utilização em cicatrização de feridas |
| WO2023119230A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | L'oreal | Coagulation pathway and nicotinamide-adenine dinucleotide pathway modulating compositions and methods of their use |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1637807A1 (ru) * | 1984-04-10 | 1991-03-30 | Полтавский медицинский стоматологический институт | Средство дл индивидуальной профилактики венерических заболеваний у мужчин |
| US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
| US4992373A (en) * | 1987-12-04 | 1991-02-12 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C |
| ZA889497B (en) * | 1987-12-28 | 1990-08-29 | Lilly Co Eli | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c |
| US4981952A (en) * | 1988-10-04 | 1991-01-01 | Eli Lilly And Company | Method for the purification of vitamin K-dependent proteins |
| US5270178A (en) * | 1990-02-23 | 1993-12-14 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C |
| IL97311A0 (en) * | 1990-02-23 | 1992-05-25 | Lilly Co Eli | Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein c |
-
1993
- 1993-05-18 MY MYPI93000913A patent/MY110664A/en unknown
- 1993-05-19 DK DK93303894T patent/DK0575054T3/da active
- 1993-05-19 PT PT93303894T patent/PT575054E/pt unknown
- 1993-05-19 RU RU93005089A patent/RU2122004C1/ru active
- 1993-05-19 DE DE69333727T patent/DE69333727T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-19 AT AT93303894T patent/ATE286121T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-05-19 ES ES93303894T patent/ES2233925T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-19 NO NO19931840A patent/NO311299B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-05-19 HU HU9301461A patent/HU218408B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-05-19 FI FI932282A patent/FI932282L/fi unknown
- 1993-05-19 EP EP93303894A patent/EP0575054B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-19 KR KR1019930008613A patent/KR100291529B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-19 NZ NZ247651A patent/NZ247651A/en unknown
- 1993-05-19 MX MX9302917A patent/MX9302917A/es unknown
- 1993-05-19 CA CA002096604A patent/CA2096604C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-19 CZ CZ93948A patent/CZ286016B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-05-20 CN CN93106214A patent/CN1080658A/zh active Pending
- 1993-05-20 PH PH46212A patent/PH29911A/en unknown
- 1993-05-20 JP JP11822393A patent/JP3564150B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-20 IL IL105757A patent/IL105757A0/xx unknown
- 1993-05-20 BR BR9301944A patent/BR9301944A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-05-20 AU AU38699/93A patent/AU661901B2/en not_active Ceased
- 1993-07-09 US US08/089,215 patent/US5453373A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0575054B1 (en) | Protein C derivative | |
| AU740753B2 (en) | Improved methods for processing activated protein C | |
| JP2003521938A (ja) | プロテインｃ誘導体 | |
| AU2007313715B2 (en) | Activated protein C variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity | |
| US7498305B2 (en) | Activated protein C variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity | |
| JPH05103678A (ja) | チモーゲン型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物 | |
| CZ298296B6 (cs) | Delecní mutanty faktoru X a jejich analogy | |
| JP3004375B2 (ja) | ヒトプロテインｃのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物 | |
| JP2851287B2 (ja) | 酵素前駆体型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物 | |
| KR20010053345A (ko) | 단백질 ｃ 유도체 | |
| JP2003521919A (ja) | プロテインｃ誘導体 | |
| JP2003514545A (ja) | プロテインｃ誘導体 | |
| KR20010005626A (ko) | 혈관 질환의 치료 방법 | |
| JPH07206704A (ja) | プロテインｃの分解を阻害する方法 | |
| US20040038288A1 (en) | Human protein C Polypeptide | |
| JPH10114796A (ja) | 腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片および該断片の調製方法 | |
| AU2003252774A1 (en) | Human Protein C Polypeptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20020519 |