NO311299B1 - Protein C derivater, rekombinant DNA molekyl, kodende dette samt fremgangsmåte for fremstilling av proteinene - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse hører inn under området human medi-sin, spesielt behandling av blodkoaguleringsforstyrrelser. Oppfinnelsen vedrører spesielt derivater av humant protein C molekyl, fremgangsmåte for anvendelse av disse derivatene og farmasøytiske sammensetninger omfattende disse protein C derivatene.

Protein C er et vitamin K avhengig plasmaprotein som sirkulerer hovedsakelig som en inaktiv disulfidbundet heterodimer bestående av en lettkjede på omtrent 25 kilodalton og en tungkjede på omtrent 41 kilodalton. Den tunge kjeden inneholder serin proteasedomenen med dets N-terminale aktiveringspeptid, mens den lette kjeden inneholder regionen av gamma-karboksyglutaminsyreresidiene som er nødvendige for kalsiium-avhengig membranbinding og funksjonell aktivitet. Det inaktive humane protein C zymogenet blir omdannet til aktivert protein C ved virkningen av trombin/trombomodulin komplekset som spalter aktiveringspeptidet (residiene 158 til 169 av det sirkulerende zymogenet eller residene 200 til og med 211 fra preprozymogenet) for å danne aktivert protein C.

Rollen til protein C som et terapeutisk middel er anerkjent (se for eksempel Bang et al., US-PS 4.775.624 som beskriver DNA-sekvensen kodende for humant proiten C zymogen og Bang et al., US-PS 4.992.373 som beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av aktivert humant protein C). Et humant protein C derivat betegnet FLIN ble beskrevet av Gerlitz et al. i europeisk patentsøknad serienr. 91301450.2. Dette FLIN derivatet inneholder et Phe residie istedenfor et Asp residie i posisjon 169 i aktiveringspeptidet (posisjon 206 i preprozymogenet) og et Asn residie istedenfor et Asp residie i posisjon 172 innenfor den tunge kjeden (posisjon 214 i preprozymogenet). FLIN derivatet blir lettere aktivert av trombin enn villtype human protein C zymogenet. Andre humane protein C derivater, betegnet Q313 og Q329 ble beskrevet av Gerlitz et al., i europeisk patentsøknad serienr. 91301446.0. Q313 derivatet inneholder et Gin residie istedenfor et Asn residie i posisjon 313 i villtype zymogenet, mens Q329 derivatet inneholder et Gin residie istedenfor et Asn residie i posisjon 329 i villtype zymogenet. Disse Q313 og Q329 derivatene mangler karbohydratstrukturene som normalt er assosiert med Asn residiet ved disse setene på villtype-molekylet og utviser derfor øket amidolytisk og funksjonelle aktiviteter.

Foreliggende oppfinnelse vedrører derivater av humant protein C modifisert ved forandring av aminosyrer 317 i nativt humant protein C molekyl fra asparagin til glutamin og ved forandring av aminosyren 167 i det native humane protein C molekylet fra asparaginsyre til fenylalanln og ved å forandre aminosyrene 172 i det native humane protein C molekylet fra asparaginsyre til asparagin. Disse molekylene kan også bli modifisert i posisjon 329 i det native humane protein C molekylet ved å forandre villtype asparaginresidiet til et glutaminresidie. Forandringene i residiet 329 kan bare bli utført i sammenheng med forandring av residiet 313 eller den kan også bli utført i sammenheng med forandringer i residiene 167 og 172. Nevnte humane protein C derivater blir lettere aktivert av trombin og er også mere funksjonelt aktive enn villtype humant protein C molekyl eller noen andre humane protein C derivater.

Også beskrevet og krevd i kravsettet er rekombinante DNA-konstruksjoner, vektorer og transformanter som er nyttige ved fremstilling av nye humane protein C derivater. Farmasøytiske sammensetninger som inneholder en effektiv mengde av et humant protein C derivat ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med et eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter er beskrevet og krevd i kravsettet, samt fremgangsmåter for anvendelse av derivatene for behandling og forhindring av sykdomstilstander.

I foreliggende oppfinnelse er følgende betegnelser og forkortelser definert nedenfor.

Q313 - et humant protein C derivat hvor asparaginresidiet i posisjon 313 i det native humane protein C molekylet er blitt forandret til et glutaminresidie.

0329 - et humant protein C derivat hvor asparaginresidiet i posisjon 329 i nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til et glutaminresidie. Protein C derivatene Q313 og 0329 er beskrevet i Gerlitz et al., europeisk patentsøknad serienr. 91301446.0 og Grinnell et al., 1991, J. Biol. Chem. 226:9778-9785, og beskrivelsene er inkorporert heri som referanse.

03Q9 - et humant protein C derivat hvor asparaginresidiet i posisjon 313 i nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til et glutamin og asparaginresidiet i posisjon 329 i nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til glutaminsresidiet.

F167 - et humant protein C derivat hvor asparaginsyreresidiet i posisjon 167 til nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til en fenylalanin. Protein C derivatet F167 er beskrevet i Bang et al., europeisk patentsøknad serienr. 88312201.2 og Ehrlich et .al., 1990, EMBO J. 9:2367-2373, og beskrivelsene er inkorporert heri som referanse.

LIN - et humant protein C derivat hvor asparginresidiet i posisjon 172 til nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til et asparaginresidie.

FLIN - et humant protein C derivat hvor asparaginsyreresidiet i posisjon 167 til nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til et fenylalanin og asparaginsyreresidie i posisjon 172 til nativt protein C molekyl er blitt forandret til et asparaginresidie. Protein C derivatene LIN og FLIN er beskrevet i Gerlitz et al., europeisk patentsøknad serienr. 91301450.2, og Grinnell et al, in Protein C and Related Anticoagulants (eds. Bruley, D. & Drohan, W. ) 13-46 (Gulf Publishing Co., Houston, 1990), og beskrivelsene er in-koporert heri som referanse.

FLIN-0313 - et humant protein C derivat hvor asparaginsyreresidiet i posisjon 167 til nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til en fenylalanin, asparaginsyreresidie i posisjon 172 til nativt protein C molekyl er blitt forandret til et asparaginresidie og asparaginresidiet i posisjon 313 til nativt protein C molekyl er blitt forandret til et glutaminresidie.

FLIN-Q3Q9 - et humant protein C derivat hvor asparaginsyreresidiet i posisjon 167 til nativt humant protein C molekyl er blitt forandret til en fenylalanin, asparaginsyreresidiet i posisjon 172 til det native protein C molekylet er blitt forandret til et asparaginresidie, asparaginresidiet i posisjon 313 til det native protein C molekylet er blitt forandret til et glutaminresidie og asparaginresidiet i posisjon 329 til nativt protein C molekyl er blitt forandret til et glutaminresidie.

GBMT transkriptsjonsenhet - en modifisert transkriptsjons-kontrollenhet omfattende P2 enhanceren til BK viruset i nærhet til oppstrømsregulatoriske elementet til adenovirus major late promoter (MLTF), adenovirus-2 major late promoter, et poly GT element beliggende for å stimulere nevnte promoter og en DNA-sekvens inneholdende den spleisede tripartiti ledersekvensen til adenoviruset.

Vordende protein-polypeptid produsert ved translasjon av et mRNA transkript, før post-translasjonelle modifikasjoner. Post-translasjonelle modifikasjoner så som gamma-karboksy-lering av glutaminsyreresidiene og hydroksylering av asparaginsyreresidiene kan derimot begynne å oppstå før et protein er fullstendig translatert fra et mRNA transkript. Protein C aktivitet - en hvilken som helst egenskap til humant protein C ansvarlig for proteolytisk, amidolytisk, esterolytisk og biologisk (antikoaguleringsmiddel eller profibrinolytisk) aktiviteter. Metoder for testing for protein antikoagulantaktivitet er velkjent innenfor fagområdet, dvs. se Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192.

Zymogen - en enzymatisk inaktiv forløper til et proteolytisk enzym. Protein C zymogen, som anvendt heri, refererer til utskilte, inaktive former, enten med en eller to kjeder av protein C.

Alle aminosyreforkortelsene anvendt i denne beskrivelsen er de som er akseptert av United Stated Patent and Trademark Office som angitt i 37 CF.R. <°1.822(b )(2 ) (1990).

Foreliggende oppfinnelse omfatter humant protein C derivat, kjennetegnet ved at det er valgt fra gruppen bestående av 0309, FLIN-0313 og FLIN-0309.

De humane protein C derivater som har endrede glykosylerings-mønstere og som også har endrede aktiveringsregioner. Disse derivatene innbefatter spesielt Q3Q9, FLIN-Q313, FLIN-0313 og FLIN-Q3Q9. Derivatet Q3Q9 inneholder glutaminresidier i posisjonene 313 og 329 av protein C molekylet (i stedenfor asparagin residiet som normalt finnes i disse posisjonene). Derivatet FLIN-0313 inneholder et fenylalaninresidie i posisjon 167 av molekylet og et asparaginresidie i posisjon 172 i molekylet (i stedet for asparaginsyreresidier som normalt finnes i disse posisjonene) samt et glutaminresidie i posisjon 313 (i stedet for asparaginresidiet som normalt finnes i denne posisjonen). I derivat FLIN-Q3Q3 er residiet i posisjon 167 blitt forandret fra et asparaginresidie til et fenylalanin, residiet i posisjon 172 er blitt forandret fra en asparaginsyre til en asparagin, residiet i posisjon 313 er blitt forandret fra asparagin til glutamin og residiet i posisjon 329 er blitt forandret fra asparagin til glutamin.

Derivatene FLIN-0313 og FLIN-03Q9 demonstrerer eksepsjonelt høye aktiveringsrater av trombin alene. Både derivat FLIN-0313 og FLIN-Q309 kan til forskjell fra villtype humant protein C bli aktivert av trombin dannet i koagulerende humant plasma som resulterer i inhibisjon av ytterligere koageldannelse. Dette koagel-aktiverte pro-enzymet har en vesentlig større spesifikk aktivitet og lengre halveringstid enn den aktiverte formen av naturlig protein C. Derivatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan derfor bli anvendt som sete-aktiverte anti-trombotiske midler som ikke har noen anti-koagulerings aktivitet unntatt tilstedeværelse av signifikant trombindannelse.

Oppfinnnelsen tilveiebringer også rekombinant DNA molekyl, kjennetegnet ved at det koder for et humant protein C derivat som tidligere nevnt.

Disse DNA forbindelsene omfatter den kodende sekvensen for rettkjede humant protein C beliggende rett ved siden av, nedstrøms for og i translasjonen leseramme med prepro-peptidsekvensen til villtype zymogen protein C. DNA-sekvensen koder også for Lys-Arg dipeptidet som blir prosessert i løpet av modningen av protein C molekylet, aktiveringspeptidet og den tunge kjeden til protein C molekylet. Forandringer i aminosyreresidiene i posisjonene 167 172 og 313 endrer aktiveringen av molekylet, mens forandringene i aminosyreresidiene i posisjonene 313 og 329 endrer karbohydratinn-holdet til molekylet.

Videre omfatter oppfinnelsen en vertcelle, kjennetegnet ved at den er transformert med et rekombinant DNA-plasmid.

Fagfolk vet at forskjellige DNA-forbindelser kan kode for polypeptidene beskrevet ovenfor på grunn av degenerasjonene til den genetiske koden. Bang et al., US-PS 4.775.624 beskriver og krever DNA-sekvensen kodende for vill-type formen av humant protein C molekyl og er inkorporert heri som referanse. Trenede fagfolk kan lett bestemme hvilke forandringer i DNA-sekvensen som kan bli anvendt for å konstruere de andre sekvensene som kan kode for de nøyaktige polypeptidene som beskrevet heri, men oppfinnelsen er ikke begrenset til spesifikke DNA-sekvenser beskrevet ved deponering. Konstruksjonene beskrevet nedenfor og i eks-emplene for foretrukne DNA forbindelser, vektorer og transformanter ifølge oppfinnelsen er bare illustrerende og skal ikke begrense rammen av oppfinnelsen. Substitusjonen av gelen istedenfor Asn i posisjonene 313 og 329 er videre Illustrerende og skal ikke begrense rammen av oppfinnelsen i det andre substitusjoner, med unntagelse av Cys eller Pro, kan bli anvendt.

Alle DNA forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ble fremstilt ved sete-rettet mutagense -av det humane protein C genet. De mutageniserte zymogenkodende molekylene ble deretter skutt inn i eukaryote ekspressjonsvektorer slik at ekspressjonen av zymogengenene kan bli drevet av GBMT transkriptsjonsenheten. Disse vektorene ble transformert i Escherichia coli K12 AG1 cellene og deponert og gjort del av den permanente stamkultursamlingen til Northern Regional Research laboratories i Peoria, Illinois 61604, januar 14, 1992. De spesifikke kulturene og aksessjonsnummerene er oppført i tabell I.

Kulturene er oppnådd og plasmidene er isolert ved anvendelse av konvensjonelle teknikker, og de kan deretter bli direkte transfektert i eukaryote vertsceller på produksjon av derivatene til humant protein C. Det er foretrukket å transfektere plasmidene inn i vertsceller som uttrykker adenovirus EIA immediate-early genproduktet, i det BK enhanceren som finnes i GBMT transkriptsjonskontrollenheten forsterker ekspressjonen mest effektivt i nærvær av EIA. GBMT transkriptsjonskontrollenheten er ytterligere beskrevet i Berg et al. eurpoeisk patentsøknad serienr. 91301451.0 og hele beskrivelsen er inkorporert heri som referanse. Fagfolk vet at et antall vertsceller uttrykker, eller kan bli påvirket til å uttrykke immediate early genprodukt til et stort DNA virus. Den mest foretrukne cellelinjen for ekspressjon på de hummane protein C derivatene ifølge foreliggende oppfinnelse er humane nyre 293 cellelinjen som er beskrevet i Bang et al., US-PS 4.992.373 og hele beskrivelsen er inkorporert heri som referanse. Etter ekspressjon i cellelinjen blir derivatene renset fra celle-kultur supernatanten ved anvendelse av prosedyren til Yan US-PS 4.981.952 og hele beskrivelsen er inkorporert heri som referanse.

DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen kan bli syntetisert kjemisk, eller ved kombinering av restriksjonsfragmenter, eller ved en kombinasjon av teknikkene kjent innenfor fagområdet. DNA-syntese maskiner er tilgjengelige og kan bli anvendt for å konstruere DNA-forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Illustrerende vektorer ifølge oppfinnelsen omfatter GBMT transkriptsjonsenheten posisjonert for å stimulere tran-skriptsjonen av de kodende sekvensene ved adenovirus sen promoter. Fagfolk innenfor dette området vet at et stort antall eukaryote promotere, enhancere og ekspressjonsvektorer er kjente innenfor fagområdet og kan bli anvendt for å uttrykke DNA-sekvensene for å produsere protein C derivatene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fagfolk innenfor området vet også at en eukaryot ekspressjonsvektor kan virke uten et enhancer element. Hovedaspektet i foreliggende oppfinnelse ligger ikke i den bestemte enhanceren eller promoteren anvendt for å uttrykke derivatene, men i de nye DNA-sekvensene og tilsvarende proteiner som blir dannet fra disse sekvensene .

Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli transformert inn i og uttrykt i forskjellige eukaryoter, spesielt vertsceller fra pattedyr. Vektorene deponert til NRRL inneholder alle det hygromycinresistensgivende genet. Vektorer som ikke inneholder noen selekterbar markør kan derimot lett bli konstruert og anvendt for å utføre forbi-gående analyser eller kan bli kotransformert inn i celle-linjer sammen med andre vektorer som inneholder selekterbare markører. Vektorene ifølge oppfinnelsen kan også omfatte sekvenser som muliggjør for replikasjon i E. coli, i det det vanligvis er mer effektivt å danne plasmid DNA i E. coli istedenfor i andre vertsorganismer.

Mange modifikasjoner og variasjoner ifølge foreliggende illustrerende DNA-sekvenser og plasmider er mulige. Degenera-sjonen til den genetiske koden muliggjør for eksempel for substitusjon av nukleotider i polypeptidkodende regioner, samt i det translasjonene stoppsignalet uten endring av den kodede polypeptidkodende sekvensen. Slike substituerbare sekvenser kan bli avledet fra den kjente aminosyre eller DNA-sekvensen til humant protein C og kan bli konstruert ved følgende konvensjonelle syntetiske eller sete-rettede mutagenseprosedyrer. Syntetiske metoder kan bli utført vesentlig ifølge fremgangsmåten til Itakura et al., 1977 Science 198:1056 og Crea et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:5765. Foreliggende oppfinnelse er derfor på ingen måte begrenset til DNA-sekvensene og plasmidene og er spesifikt eksemplifisert.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en farmasøytisk formulering, kjennetegnet ved at den omfatter som et aktivt ingrediens, et protein C derivat valgt fra gruppen bestående av Q3Q9, FLIN-Q313 og FLIN-Q3Q9, assosiert med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, eksipienter eller fortynningsmidler derav.

Omfattet er også en fremgangsmåte for fremstilling av et humant protein C derivat valgt fra gruppen bestående av Q3Q9, FLIN-0313 og FLIN-Q3Q9, kjennetegnet ved å

a) transformere eller transfektere en eukaryot vertscelle med en rekombinant DNA-vektor i det vektoren omfatter en DNA-sekvens kodende for et humant protein C derivat valgt fra gruppen bestående av Q3Q9, FLIN-0313 og FLIN-Q3Q9, b) dyrke nevnte transfekterte eukaryote vertsceller under betingelser egnede for produksjon av nevnte humane protein C derivater, og deretter c) isolere nevnte humane protein C derivat fra supernatanten til nevnte kultur.

Metoder for aktivering av zymogenformene til humant protein C for å aktivere humane protein C derivater er gamle og velkjente innenfor dette området. Protein C kan bli aktivert av trombinet alene, av et trombin/trombomodulin kompleks, av Russells Viper venom eller ved hjelp av forskjellige andre metoder. Aktiviteten til humane protein C derivater kan bli målt etter trombin aktivering ifølge enten totale amidolytiske analyser eller ved antikoaguleringsanalyser. Trombinaktivering og protein C analyse (amidolytisk og antikoagulerende) ble utført ifølge beskrivelsen til Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1187-1192, og hele beskrivelsen er inkorporert heri som referanse.

Rekombinante humane protein C derivater ifølge oppfinnelsen er nyttige for forhindring og behandling av forskjellige ervervede sykdomstilstander innbefattende intravaskulær koagulasjon, inkludert dyp venetrombose, lungeemboli, perifer arteriell trombose, emboli med opprinnelse fra hjertet eller perifere arterier, akutt myokardial infarkt, trombotiske slag, ustabile anginaer, perifer vaskulær kirurgi, organ transplantasjon og disseminert intravaskulær koagulasjon. Disse protein C derivatene kan også bli anvendt effektivt for behandling av signifikante antall pasienter med heterozygote protein C mangler som gir tilbakevendende dyp venetrombose og når det gjelder homozygot protein C manglende pasienter med purpura fulminans. En annen terapeutisk indikasjon på aktiverte protein C derivater er forhindring av dyp vene trombose og lungeemboli behandlet med lave doser av heparin.

Derivatene og aktiverte motparter, ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli formulert ifølge kjente metoder for å fremstille farmasøytiske nyttige sammensetninger, hvorved et humant protein C derivat eller aktivert protein C derivat ifølge foreliggende oppfinnelse blir kombinert sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Egnede bærere og formuleringer derav, i tillegg til andre humane proteiner, for eksempel humant serum albumin, er for eksempel beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., utgitt av Osol et al., som er inkorporert heri som referanse. Slike sammensetninger vil inneholde en effektiv mengde av et protein C derivat, eller aktivert motpart, sammen med en egnet mengde bærer for å fremstille farmasøytisk akseptable sammensetninger egnede for effektiv administrering til verten. Protein C derivat sammensetningen kan bli admini-strert parenteralt, eller ved andre metoder som forsikrer levering til blodstrømmen i effektiv form.

Følgende eksempler er gitt som en måte å illustrere foreliggende oppfinnelse på.

Eksempel 1

Produksjon av humane protein C derivater

Ekspressjonsvektorene ifølge foreliggende oppfinnelse blir isolert fra E. coli cellene og deretter transformert inn i 293 cellene, transformantene ble selektert ved 37°C og deretter dyrket for å produsere humane protein C derivater, vesentlig ifølge beskrivelsen til Bang et al. US-PS 4.992.-373, som er inkorporert heri som referanse. Derivatene blir renset ut av cellekultursupernatanten vesentlig i henhold til beskrivelsen til Yan i US-PS 4.981.952 som er inkorporert heri som referanse.

Eksempel 2

Antikoagulerende aktiviteter

Fullstendig aktivert protein C ble oppnådd ved aktivering av materialet med 10 nM trombin i kompleks med oppløselig rekombinant humant trombomodulin TMD-75 som beskrevet av Parkinson et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:12602-12610, og beskrivelsen er inkorporert heri"som referanse. Antikoaguleringsaktiviteten til de aktiverte molekylene ble målt med en aktivert delvis tromboplastintid koaguleringsanalyse. Resultatene er angitt i tabell II.

Eksempel 3

Aktiverlngsrater

Aktiveringsratene ble bestemt ved anvendelse av humant trombin (10 nM) i en reaksjonsblanding inneholdende 20 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,1 mg/ml BSA og 3 mM CaCl2. Renset protein C, både vill type og derivater, var i en konsentrasjon på fra 0,81 til 1,61 um i aktiverings-reaksjonen. Aktiveringsratene ble bestemt ved å fjerne alikvoter fra aktiveringsreaksjonsblandingen ved forskjellige tidspunkter til en 96-brønn plate og, etter tilsetning av kromogent substrat (S-2366) til en sluttkonsentrasjon på 0,75 mM ble den amidolytiske aktiviteten målt som forandring i absorbansenheter/minutt ved 405 nM i en ThermoMax kinetisk mikro-titer skål avleser (Molecular Devices). Ratene ble bestemt ved omdanning av forandring i OD/minutt til mengde aktivert protein C som er blitt dannet ved anvendelse av de spesifikke aktivitetene bestemt for hvert protein og plotting mot aktiveringstid. Mengde aktivert protein C som ble dannet var mindre enn 10% av det totale utgangsmaterialet i alle eksperimentene. Resultatene er angitt i tabell III.

Relative aktiveringsrater ble også bestemt med samme analysesystem ved anvendelse av trombin og trombomodulin. Trombomodulinmolekylet som ble anvendt var det stabile humane trombomodulin ifølge Parkinson et al, nedenfor. Resultatene er angitt i tabell IV.

Eksempel 4

Antikoaguleringsaktiviteten 1 koagulerende humant plasma Vill type humant protein C og derivatet FLIN-0313 ble tilsatt til human plasma i en konsentrasjon på 20 nM sammen med Helena standard APTT reagens og inkubert i 5 minutter ved 37°C. Koagulering av plasmaet ble initiert ved tilsetning av CaClg til en sluttkonsentrasjon på 8mM og koaguleringstidene ble målt. I samtidige eksperimenter ble monoklonalt antistoff med evne til nøytralisering av aktivert protein C aktivitet tilsatt til kontrollplasma og plasma inneholdende zymogen vill type protein C eller FLIN-0313. Resultatene er angitt i tabell V.

Nivået av koaguleringsaktiviteten indusert i koagulerende plasma ble bestemt som en funksjon av konsentrasjonen til vill type humant protein C og FLIN-Q313 derivatet og dataene ble uttrykt som forlenging av koaguleringstiden. Basale kaguleringstider i analysen var fra 27 til 33 sekunder. Resultatene er angitt i tabell VI.

Eksempel 5

Bestemmelse av relative halveringstider

Bestemmelse av humant protein C i plasma ble bestemt ved inkubering av normalt humant plasma (sitratbehandlet) med 100 nM aktivert humant protein C, aktivert FLIN-0313 eller zymogen (ikke-aktivert) FLIN-0313. Plasmakonsentrasjonen var 90% (v/v) i sluttreaksjonen i det gjenværende volum besto av buffer inneholdende 3 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4 og 1 mg/ml BSA. Ved valgte tidspunkter ble alikvoter fjernet og aktivert protein C aktivitet ble bestemt ved amindolytisk aktivitet ved anvendelse av S-2366 ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM eller ved aktivert partiell tromboplastintid. Nivået til koagel-aktivert aktivitet til FLIN-0313 ble bestemt som beskrevet i eksempel 4. Aktivert protein C og aktivert FLIN-0313 utviser begge høyere enn 50$ tap i aktivitet etter omtrent 25 minutter, mens zymogen FLIN-0313 fortsatt opprettholdt minst 80$ aktivitet etter 45 minutter.

Claims (14)

1. Humant protein C derivat,karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av Q309, FLIN-Q313 og FLIN-Q3Q9.

2. Humant protein C derivat ifølge krav 1,karakterisert vedat det er Q3Q9, FLIN-Q313 eller FLIN-Q309.

3. Rekombinant DNA-molekyl,karakterisert vedat det koder for et humant protein C derivat ifølge krav 1.

4 . Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 3,karakterisert vedat det koder for protein C derivatet Q3Q9, FLIN-Q313 eller FLIN-Q3Q9.

5 • Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 3,karakterisert vedat det er et plasmid.

6. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 5,karakterisert vedat det blir valgt fra gruppen bestående av plasmid pGT-h-Q3Q9 (NRRL B-18938), plasmid pGT-g-FLIN-0313 (NRRL B-18939) og plasmid pGT-h-FLIN-Q3Q9 (NRRL B-18940).

7 . Vertscelle,karakterisert vedat den er transformert med et rekombinant DNA-plasmid ifølge krav 5.

8. Vertscelle ifølge krav 7,karakterisert vedat den blir valgt fra gruppen bestående av en 293 celle og en E. coli celle.

9. Vertscelle ifølge krav 8,karakterisert vedat den er 293/pGT-h-Q3Q9, 2933/pGT-h-FLIN-Q313, 293/pGT-h-FLIN-Q3Q9, E. coli K12 AGl/pGT-h-Q3Q9 (NRRL B-18938), E. coli K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q3Q9 (NRRL B-18939) og E. coli K12 AGl/pGT-h-FLIN-Q3Q9 (NRRL B-18940 ).

10. Farmasøytisk formulering,karakterisert vedat den omfatter som et aktivt ingrediens, et protein C derivat valgt fra gruppen bestående av Q3Q9, FLIN-Q313 og FLIN-Q309, assosiert med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, eksipienter eller fortynningsmidler derav.

11. Protein C derivat ifølge et hvilke som helst av kravene 1 og 2,karakterisert vedat det er forbrukt som et antitrombotisk middel.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av et humant protein C derivat valgt fra gruppen bestående av Q3Q9, FLIN-Q313 og FLIN-Q3Q9,karakterisert vedå a) transformere eller transfektere en eukaryot vertscelle med en rekombinant DNA-vektor i det vektoren omfatter en DNA-sekvens kodende for et humant protein C derivat valgt fra gruppen bestående av Q3Q9, FLIN-Q313 og FLIN-Q3Q9, b) dyrke nevnte transfekterte eukaryote vertsceller under betingelser egnede for produksjon av nevnte humane protein C derivater, og deretter c) isolere nevnte humane protein C derivat fra supernatanten til nevnte kultur.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisertved at den eukaryote vertscellen er en human nyre 293 celle.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at det humane protein C derivatet er Q3Q9, FLIN-Q313 eller FLIN-Q3Q9.