CZ286698A3 - Použití činidla inhibujícího aktivitu syntetasy adenylsukcinátu - Google Patents

Použití činidla inhibujícího aktivitu syntetasy adenylsukcinátu Download PDF

Info

Publication number
CZ286698A3
CZ286698A3 CZ982866A CZ286698A CZ286698A3 CZ 286698 A3 CZ286698 A3 CZ 286698A3 CZ 982866 A CZ982866 A CZ 982866A CZ 286698 A CZ286698 A CZ 286698A CZ 286698 A3 CZ286698 A3 CZ 286698A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mtase
cells
alanosine
activity
deficient
Prior art date
Application number
CZ982866A
Other languages
English (en)
Inventor
Carlos J. Carrera
Dennis A. Carson
Howard B. Cottam
Tsutomu Nobori
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Regents Of The University Of California filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of CZ286698A3 publication Critical patent/CZ286698A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

TOUtipf' οΙλ/iDUÚ Í^HibUaPoQ^ /j^TH/)?\/y
Způsob-τ uh? hi <?e aktivity /úsýntetasy adenylsukcinátu , tr-bunéks—deficitem fosforylasy methyl^hioadenosi nuToto je částečná pokračovaci přihláška US patentové přihlášky pořadového č. 08/176,855 podané 29. prosince 1993, současné době v řízení.
Oblast techniky
Tento vynález se týká farmaceutických činidel a způsobů pro jejich užívání při chemoterapeutickém ošetřování rakoviny. Přesněji pak se vynález týká identifikace rakovinových buněk, které nemohou metabolisovat methylthioadeninfosforylasu na adenin pro opětnou syntézu adeninových nukleotidů, a použití L-alanosinu k inhibici de novo syntézy adenosin-5’-monofosfátu (AMP) v takových rakovinových buňkách.
Dosavadní stav techniky
Methythioadenosin (MTA) je ve zdravých buňkách savců štěpen methylthioadenosinfosforylasou (MTAsa) na adenin a methylthioribosu-l-P, z nichž poslední je substrátem pro metabolickou syntézu methioninu. Adenin je schraňován do celulární zásoby adenosin-5’-monofosfátu (AMP), ze kterého buňky získávají adenosin-5’-trifosfát (ATP) pro metabolickou energii a 2’-deoxyadenosin-5’-trifosfát (dATP) pro syntézu DNA.
Na základě dřívějších bakteriálního antibiotika Streptomyces alanosinicus a studií in vitro, L-isomer alanosinu (získaného ze odtud L-alanosin) se zdál slibovat použití jako protivirové a protinádorové činidlo. Věřilo se zejména, že L-alanosin inhibuje konversi inosin-5’-monofosfátu (IMP) na AMP adenylsukcinát syntetasou a tak zbavuje cílové buňky AMP a ATP (v nepřítomnosti adeninu). Avšak klinické studie terapeutické účinnosti L-alanosinu u lidských pacientů s rakovinou zklamaly (viz např. data shromážděná v Tyagi a Cooney, Adv. Pharmacol. Chemotherapy, 20:69-120, 1984 [výsledky pak dosud poskytly malé povzbuzení pokud se týká účinnosti L-alanosinu pro léčbu rakoviny u lidí]; Creagan a spol., Cancer, 52:615-618, 1993 [studie fáze II měly pouze 4%ní stupeň celkové odezvy]; Creagan a spol., Am. J. Clin. Oncol., 7:543-544, 1984 [při studii fáze II u pacientů s melanomem byla pozorována malá terapeutická odezva]; VonHoff a spol., ínvest. New Drugs, 9:87-88, 1991 [u pacientů s rakovinou prsu nebyly zaznamenány objektivní odezvy]). Nakonec byly všechny klinické pokusy o použití L-alanosinu k léčbě rakoviny opuštěny.
Jiný známý inhibitor ASS aktivity je hadacidin. Avšak u hadacidinu se má za to, že je pro lidi toxičtější než L-alanosin. Aktivita jiných inhibitorů de novo syntézy purinů (jako methotrexátu, 6-merkaptopurinu, 6-thioguaninu a dideazatetrahydrofolátu), které blokují syntézu IMP (a proto teoreticky eliminují IMP jako zdroj produkce AMP) se dále in vivo obešla využíváním hypoxanthinu, kterého je v plasmě hodně, jako substrátu pro produkci IMP. Proto až dosud bylo žalostně málo činidel působících in vivo, která by blokovala metabolickou cestu adeninu pro intracelulární produkci AMP.
Avšak s vývojem analýzy s dostatečnou sensitivitou pro identifikaci homozygotních delecí genu kódujícího MTAsu v určitých rakovinových buňkách u lidí (viz základní US patentovou přihlášku pořadového č. 08/176,855), se nyní objevuje, že tumory ošetřované v klinických pokusech L-alanosinem produkovaly MTAsu a byly tudíž schopné poskytnout dostatečně adenin, aby se udržela zásoba AMP • · • ·
navzdory inhibici produkce AMP z IMP. Předložený vynález tedy poskytuje způsob jak identifikovat buňky, které postrádají MTAsu a j ak takové buňky ošetřovat zbavováním AMP.
Podstata vynálezu
Bylo zjištěno, že buňky, ze kterých byl odstraněn gen, který kóduje protein MTAsy, a které tudíž nejsou schopny metabolisovat MTA na adenin (buňky s deficitem MTAsy) jsou in vivo selektivně usmrcovány kontaktem s terapeutickými dávkami inhibitoru de novo syntézy AMP jako je L-alanosin. Tedy zatímco L-alanosin není terapeuticky účinný proti všem rakovinovým buňkám, je terapeuticky účinný proti buňkám postrádajícím MTAsu.
Vynález z jednoho hlediska poskytuje způsob stanovení zda jednotlivé rakovinové buňky postrádají MTAsu tím, že poskytuje testy pro určení zda buňkám chybí MTAsový protein. Preferovaná analýza z hlediska tohoto použití je ta, která deteguje homozygotní deleci genu kódujícího protein MTAsy z buněk.
Z jiného hlediska poskytuje vynález způsob léčby rakovin s deficitní MTAsou tím, že buňky postrádající MTAsu uvádí do kontaktu s terapeuticky efektivním množstvím inhibitoru de novo syntézy purinu, který inhibuje aktivitu ASS, především s L-alanosinem. Inhibiční činidla pro ASS podle vynálezu mohou být podávána jakýmkoliv klinicky přijatelným způsobem, ale nej lepší je aplikace kontinuální infusí při koncentracích pod maximálně tolerovanou dávkou pro prolongování požadované inhibiční aktivity a minimalisování toxicity vůči hostitelské tkáni.
Poskytují se také sady pro použití při způsobech podle vynálezu, které obsahují činidla pro provedení analýzy na nedostatek MTAsy podle vynálezu, právě tak jako farmaceutické • · • · • ·
komposice ASS inhibitoru, zejména L-alanosinu a/nebo jeho aktivního metabolitu, L-alanosinyl AICOR.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 je nukleotidová sekvence pro genomovou MTAsu (SEQ. ID. No 1), v níž jsou exony podtrženy.
Obrázek 2 je graf znázorňující in vivo efekt L-alanosinu po kontinuální infusi xenoštěpů tumorů vyvinuté lidské plicní, nemalobuněčné rakoviny s dostatkem MTAsy i deficitem MTAsy do holých myší.
Obrázek 3 je graf znázorňující in vivo efekt L-alanosinu po kontinuální infusi xenoštěpů tumorů vyvinuté lidské akutní lymfoblastické leukemie s deficitem MTAsy do holých myší.
Obrázky 4 a 5 (A,B) jsou grafy znázorňující efekt podávání různých exogenních MTAsových substrátů buněčným liním s dostatkem i deficitem MTAsy po ošetření L-alanosinem.
Obrázek 6 je schematické znázornění intracelulárních metabolických cest produkce AMP.
Obrázek 7 je graf znázorňující in vivo efekt L-alanosinu po denní injekci xenoštěpů tumorů vyvinuté lidské plicní, nemalobuněčné rakoviny s deficitem MTAsy do holých myší.
Popis preferovaných provedení
I. Metabolické cesty intracelulární produkce AMP
Aby se usnadnilo pochopení vynálezu, představuje obrázek 6 schéma, které znázorňuje intracelulární metabolické cesty, po kterých se ubírá produkce AMP. Jsou celkem tři hlavní zdroje substrátů pro intracelulární produkci AMP. Prvním je katabolismus methylthioadenosinu na adenin pomocí MTAsy. Tato cesta je blokována v buňkách s deficitem MTAsy.
· • ·
Druhým zdrojem je konverse IMP na AMP způsobená aktivitou ASS nebo lyasou adenylsukcinátu (ASL). Inhibitory aktivity ASL nejsou v současnosti známé. Avšak se ztrátou ASS aktivity je konverse IMP na AMP v podstatě eliminována.
Třetím zdrojem je shromažďování hypoxanthinu na AMP. Avšak protože konverse IMP na AMP probíhá vzdáleněji od shromažďování hypoxanthinu, inhibice ASS katabolismu IMP-AMP blokuje cestu shromažďování hypoxanthinu.
11. Metoda pro určení zda j sou buňky tumoru při analýze vzorku získaného ze savčího hostitele MTAsa deficientní
A. Polynukleotidová činidla pro identifikaci MTAsa deficientních buněk.
Preferovaný způsob pro určení, zda jednotlivá populace buněk je MTAsa deficientní, je hybridisační essay pro detegování homozygotní delece MTAsu kódujícího genu z buněk. Vyhledávací procedury, spočívající na hybridisaci nukleových kyselin umožňují detegovat jakoukoliv sekvenci polynukleotidů v jakémkoliv organismu (a díky interferenci jakýkoliv protein kódovaný takovou sekvencí polynukleotidů), pokud je k dispozici vhodná sonda.
Kompletní popis hybridisačních technik vhodných pro použití v tomto vynálezu, právě tak jako popis genu, který kóduje MTAsu, jsou dále uvedeny v současně projednávané US patentové přihlášce pod pořadovým číslem č. 08/176,855 (podané 29. prosince 1993), která je v současnosti v řízení, a její poznatky jsou zde zahrnovány tímto odkazem spolu s jakýmikoliv doplňky, které mohou být mimo to vytvořeny. Pro usnadnění odkazu, sekvence polynukleotidů genu, který kóduje MTAsu, je zde popisována jako SEQ.ID.No.1 v přiloženém sekvenčním protokolu a na Obrázku 1, v němž jsou kódující ···· ···· · · · · • ··· · · · · · ··· • · · · · · · ··· · ··· · · ···· ·· · ···
............
oblasti genu označeny podtržením.
Genomový MTAsa polynukleotid je umístěn na chromosomu 9 v oblasti p21. Je zajímavé, že vysoké procento buněk, které vykazují homozygotní delecí genu, který kóduje potlačovatele tumoru pló, vykazují také homozygotní delecí genu, který kóduje MTAsu. Alternativní způsob detegování homozygotních delecí naposled zmíněného genu pro MTAsu je tedy detegování homozygotní delece dříve zmíněného genu pro pló. Pro další odkazy v tomto ohledu viz současně projednávanou US patentovou přihlášku pod pořadovým č. 08/227,800 a na poznatky v ní uvedené se zde odkazuje.
Kmen E. coli obsahující genomovou DNA pro krysí MTAsu v plné délce byl uložen u American Type Culture Collection, Rockville, MD poštovní zásilkou před 29. prosincem 1993 a byla jim souhrnně udělena designační čísla 55536, 55537, 55538, 55539 a 55540. Není učiněno nebo zamýšleno žádné opatření, že uložený vzorek je nezbytný, aby umožnil provádět vynález. Vzorek bude ovšem udržován v živoucí formě po jakoukoliv dobu, která je nebo může být požadována patentovými zákony aplikovatelnými pro tento vynález.
Aby se určilo, zda gen MTAsy byl homozygotně odstraněn z daných buněk, získává se z hostitele vzorek buněk, který bude pro analýzu použit. Vzorek může například obsahovat tělní tekutinu nebo buňky např. z tkáně hostitele nebo tumoru. Takové vzorky se získávají metodami běžnými v klinické praxi, např. tumorové buňky mohou být získány biopsií nebo chirurgickou resekcí. Je nejvhodnější, aby buňky byly v podstatě prosté kontaminantů, tj. buněk, proteinů a podobných komponent, které by mohly zkreslovat výsledek analýzy. Například tam, kde zdrojem vzorku buněk pro essay j sou tuhé tumory, mohou být považovány za kontaminanty normální nemaligní buňky a MTAsa, která může být uvolňována z normálních buněk během procedury prováděné pro získání • · biologického vzorku. Takovéto kontaminanty mohou být odstraněny konvenčními čistícími procedurami, např. afinitní chromatografií s protilátkou proti MTAse.
Protože vynález je zaměřen na detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti tohoto genu ve vzorku buněk, o kterých se předpokládá, že jsou MTAsa negativní, bude výhodné nukleové kyseliny ve vzorku amplifikovat, aby se zvýšila sensitivita detekční metody. Této amplifikace se nejvýhodněji dosáhne reakce polymerásy v polymerisačním (PCR), i když využití stupni není absolutně pomoci retezove řetězové reakce nezbytné.
Nukleová kyselina, která má být ve vzorku amplifikována, se bude skládat z genomové DNA nebo DNA divokého typu, u níž se normálně očekává, že kóduje MTAsu, pokud je ve vzorku přítomna (viz SEQ.ID.Nol). 0 DNA kódující MTAsu (zde nadále cílová DNA), se uvažuje, že je přítomna ve všech normálních buňkách savců, včetně buněk lidských.
Genomová DNA kódující MTAsu pro použití jako kontrola nebo jako zdroj oligonukleotidových sond a primerů může být isolována pomocí metod v oboru běžných jako je metoda, kterou popsal Maniatis, a spol. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Je tam podán příklad provedení demonstrující isolaci genomového klonu lidského MTAsa genu, při čemž vyhledávání ve sbírce kosmidových genů se provádělo pomocí vzorku oligonukleotidové sondy cDNA MTAsy (viz Příklad III). Avšak těm, kteří mají v oboru zkušenosti je zřejmé, že pro získání DNA kódující MTAsu mohou být využity i jiné vhodné prostředky.
Například knihovna cDNA, o níž se ví, že obsahuje žádaný polynukleotid může být prohledána injektováním různých mRNA derivovaných z cDNA do oocytů, poskytujících dostatek času, aby proběhla exprese produktů cDNA genu a testování přítomnosti požadovaných produktů exprese cDNA, například • · použitím protilátky specifické pro peptid kódovaný žádaným polynukleotidem nebo použitím sond pro opakování motivů a typických příkladů exprese tkáně, charakteristických pro peptid kódovaný polynukleotidem, o který je zájem. Alternativně může být knihovna cDNA nepřímo prohledána na expresi peptidů, o něž je zájem (např. protein MTAsy), majících nejméně jeden epitop, za použití protilátek specifických pro peptidy. Takové protilátky derivovány buď polyklonálně nebo monoklonálně k detegování produktu exprese indikativního pro cDNA, o kterou je zájem (pro další odkaz mohou být a použity přítomnost viz Maniatis a spol., Molecular Cloning: A Laboratory manual (Cold Spring Harbor Lab., New York, 1982).
Polynukleotidy užívané jako kontroly, sondy nebo primery podle vynálezu mohou být syntetizovány pomocí technik a zařízení pro syntézu nukleových kyselin, které jsou v oboru obecně známé. Pro odkaz v tomto ohledu viz Ausubel a spol., Current Protocols in Molecular Biology, kapitola 2 a 4 (Viley Interscience, 1989).
B. Amplifikace MTAsu kódující genomové DNA a hybridisační essay pro ni
Aby se zvýšila citlivost při hybridisačních essay-ích podle vynálezu, je nejlépe, když se buněčný vzorek, který má být zkoumán, podrobí podmínkám, které favorisují selektivní amplifikaci nukleové kyseliny, jež je cílem. Nej lepší je, když cílová nukleová kyselina bude polynukleotidovou částí genu, který kóduje MTAsu (tj. cílový polynukleotid). Nejvhodnějším prostředkem amplifikace cílového polynukleotidu je PCR.
PCR je in vitro metoda pro enzymatickou syntézu specifických sekvencí DNA nebo RNA při použití • · • · • ·
Mullis-ovi a spol., a zahrnuty jako příklady oligonukleotidových primerů, které hybridisují se specifickými sekvencemi nukleové kyseliny a lemují oblast zájmu v cílové nukleové kyselině. Opakovaná serie cyklů denaturace templátu, napojování primerů a enzymatického prodlužování napojených primerů vyúsťuje v exponenciální akumulaci specifického fragmentu nukleové kyseliny definovaného na jeho zakončeních 5’konci primerů. Vzniklé produkty (PCR produkty) syntetizované v jednom cyklu působí jako templáty pro následující cyklus; následkem toho se počet kopií cílové nukleové kyseliny v každém cyklu přibližně zdvoj násobuj e.
Základní PCR techniky j sou popsány v US patentu 4,683,195 a 4,683,202 uděleného poznatky tam uvedené j sou zde konvenčních technik pro provedení PCR. Avšak není úmyslem omezovat tento vynález na PCR techniky, které j sou publikovány v patentu ’202 od Mullise a spol. Od té doby co byla vyvinuta technika Mullise a spol., byla vyvinuta řada analýz, které využívají modifikace této techniky. Tyto modifikace jsou v odborné veřejnosti běžně známy, a proto zde nebudou podrobně popisovány. Avšak vzhledem k ilustraci rozsahu techniky v tomto oboru jsou v následujícím některé z těchto modifikací popisovány.
PCR technika, která poskytuje vnitřní amplifikační standard využitím konkurenčního templátu, jenž se liší v sekvenci a velikosti od cílové nukleové kyseliny, je popsána v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87:2725-2729 (autoři Gilliland a spol.) Jiná technika pro provedení kompetitivní PCR, která využívá templátů, které se liší sekvencí, ne však velikostí, je popsána v Nuc. Acids. Res., 21:3469-3472. (1993), (autoři Kohsaka a spol.). Tato technika je zvlášť preferovanou technikou pro aplikaci v technologii enzymové imunoabsorpční analýzy (ELISA) pro analýzu • · • · • · amp1i f i kováné/ných nukleové/vých
kyseliny/kyselin.
Nekompetitivní PCR technika, která využívá místně specifické oligonukleotidy k detekci mutací nebo polymorfismů v genech, a která může být rovněž použita ve způsobu podle vynálezu je popsána v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1989), 86:6230-6234 (autoři Saiki a spol.). Každá z těchto technik má výhodu ve využití hybridisačních sond, které pomáhají při eliminaci klamně positivních výsledků, pocházejících z jakékoli nespecifické amplifikace, ke které může během PCR dojít.
Pro další rozhled je možné odkazovat znalce z oboru na Innis a spol., Optimization of PCR’s, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Acad. Press 1990). Tato publikace sumarizuje techniky ovlivňující specificitu, spolehlivost a výtěžky požadovaných PCR produktů.
Volí se primery oligonukleotidů (nejméně jeden pár primerů), které budou specificky hybridisovat s malým úsekem párů basí na každé straně (tj. 5’ a 3’) cílového polynukleotidu MTAsy (tj. lemující sekvence). Odborníci budou snadno schopni vybrat vhodné primery bez nepřiměřeného experimentování na základě informace o sekvenci polynukleotidu udávané v připojeném sekvenčním protokolu jako SEQ. ID. No.l a na obrázku 1.
Pro design primerů je důležité, aby primer neobsahoval komplementární base, takové, že by mohly hybridisovat samy se sebou. Aby se zamezila amplifikace jakéhokoliv komtaminujícího materiálu, který může být ve vzorku přítomen, je nej lepší, když jsou primery vytvořeny tak, aby pokrývaly exony (které jsou pro gen MTAsy na obrázku 1 podtrženy).
Jak je poznamenáno svrchu, nemusí být v tomto polymerisačním stupni nutné využívat řetězové reakce, aby byly adekvátně amplifikovány nukleové kyseliny ve vzorku. Například tam, kde se použije technika, kterou popsal Kohsaka a spol., jak uvedeno svrchu, tak se polymerisační stupeň
provádí na nosičích z pevné fáze, je následován hybridisací se specifickými sondami cílového polynukleotidu a citlivost essaye bude taková, že všechno co může být zapotřebí je jedinná polymerisace cílového polynukleotidu.
Jakmile je amplifikační stupeň dokončen, jsou PCR produkty podrobeny analýze, aby se tak určilo, zda ve vzorku je přítomen gen pro kódování MTAsy. Dvouřetězcové PCR produkty se výhodně navážou k pevné fázi tak, že jejich řetězce mohou být rozděleny denaturací, čímž se umožní vzorkům se specifickou sekvencí hybridisovat s vázaným positivním řetězcem PCR produktu, aby se detegoval gen v podstatě tak, jak popsal Kohsaka a spol. (viz svrchu). Alternativně se PCR produkty odstraňuj í z reakčního prostředí a oddělují z amplifikační směsi před přidáním sond pro hybridisací s dvouřetězcovými PCR produkty. Při tomto naposled zmíněném postupu se PCR produkty oddělují z amplifikační směsi pomocí v oboru známých metod s ohledem na jednotlivý způsob, který se volí pro detekci; např. gelové vylučování, elektroforesa nebo afinitní chromatografie.
Detekci amplifikovaného produktu lze uskutečnit pomocí hybridisačních sond, ke kterým jsou trvale připojeny detegovatelné značky. Značkou je substance, která může být kovalentně vázána nebo pevně připojena k sondě nukleové kyseliny, a jejíž vlastností bude, že umožňuje sondu detegovat. Značkou může být například radioisotop, enzymový substrát nebo inhibitor, enzym, pro záření neprostupná látka (včetně kolodidních kovů), fluorescenční činidla, chemiluminiscentni molekula, liposomy obsahující některou se shora zmíněných značek nebo člen specifického vazebného páru. Vhodná značka nesmí v průběhu amplifikace ztratit kvalitu, která ji činí detegovatelnou.
Odborníci zkušení v diagnostice budou dobře obeznámeni s vhodnými detegovatelnými značkami pro aplikování detekce • ·
4
4 4 ·
4 4 4
4 4 ·
4 4 4 při essayích in vitro. Například vhodnými radioisotopy pro použití in vitro jsou 3H, 12^I, 131I, 32P, 14C,
Amplifikované fragmenty značkované radioisotopem mohou být delegovány přímo gamma počítačem nebo densitometrií autoradiogramů, Southernovou hybridisací amplifikovaných fragmentů kombinovanou s densitometrií. Příklady vhodných chemiluminiscentních molekul jsou akridiny nebo luminol. Cílové sekvence hybridisované se sondami derivatisovanými akridinium esterem se před hydrolýzou chrání interkalací. Příklady vhodných fluorescenčních činidel jsou fluorecein, fykobiliprotein, cheláty vzácných zemin, dansyl nebo rhodamin.
Příklady vhodných enzymových substrátů nebo inhibitorů jsou sloučeniny, které se budou specificky vázat ke křenové peroxidase, oxidase glukosy, dehydrogenase glukosy-6-fosfátu, β-galaktosidase, pyruvát kinase nebo acetylcholinesterase alkalické fosfatasy. Příklady pro záření neprostupných látek jsou koloidní zlato nebo magnetické částice.
Specifický vazebný pár se skládá ze dvou molekul, kde jedna z molekul má na svém povrchu nebo v dutině oblast, která se váže k jednotlivému prostorovému nebo polárnímu uspořádání jiné molekuly. Členové specifického vazebného páru jsou často označováni jako ligand a receptor nebo jako ligand a antiligand. Například jestliže je receptorem protilátka, je ligandem odpovídající antigen. Jiné specifické vazebné páry zahrnují páry hormon-receptor, páry enzymu a substrátu, páry biotin-avidin a páry glykoproteinu s receptorem. Zahrnuty jsou fragmenty a části specifických vazebných párů, které uchovávají vazebnou specifičnost, jako fragmenty imunoglobulinů, včetně Fab fragmentů a jim podobných. Protilátky mohou být buď monoklonální nebo polyklonální. Jestliže je součást specifického vazebného páru užita jako
značka, nejvhodnějším separačním postupem bude afinitní chromatograf ie.
Pokud ve shora popsaném essayi nemůže být detegován žádný amplifikovaný produkt, je to indikace deficitu MTAsy v buňkách přítomných ve vzorku. Protože se vždy u normálních buněk (tj. nikoliv maligních) očekává, že je u nich přítomen gen kódující MTAsu v detegovatelných množstvích (i se ztrátou jedné alely), nález, že buňky postrádají gen kódující MTAsu (tj. mají homozygotní deleci genu), ukazuje, že zkoumané buňky postrádají jak katalyticky aktivní tak katalyticky inaktivní MTAsu.
Avšak, pokud se to žádá, může být vzorek předem prozkoumán na katalytickou aktivitu MTAsy pomocí metody, kterou popsal Seidenfeld a spol., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 95.:1861-1866 (1980); viz také níže Příklad 1. Potom se použije průzkumný essay, aby se určilo, zda je v buňkách vzorku přítomen gen kódující MTAsu. Vzorek může být také testován na přítomnost katalyticky aktivního nebo neaktivního proteinu za účelem vyhledání buněčných kontaminantů ve vzorku, který má být essayi podroben; tj. nemaligních buněk. Vhodný imunoessay pro alternativní využití v tomto ohledu (tj. místo hybridisačního essaye) popisuje Nobori a spol., Cancer Res. 53:1098-1101 (1991) a současně projednávaná US patentová přihláška pod pořadovým číslem č. 08/177,855, podaná 29. prosince 1993, a na objevy tam uvedené se zde odkazuj e.
C. Buňky s deficitem MTAsy
Za využití technik shora uvedených rozborů bylo u následujících lidských primárních tumorů určeno, že mají deficit MTAsy. Je třeba pochopit, že tento seznam je representativní, ale nikoliv vyčerpávající pro typy rakoviny, ·· 00 00 00 ·· 00 • 000 0000 0000 • 000 0 00 · · 000 • 0 · 000 · 000 0 000 0 0 u kterých může být pomocí popsaných rozborů stanoveno, že mají deficit MTAsy.
- Akutní lymfoblastické leukemie (přibližně 80%-ni výskyt).
- Gliomy (přibližně 67%-ní výskyt).
- Nemalobuněčné rakoviny plic (přibližně 18%-ní výskyt).
- Urotheliální tumory (např. rakovina močového měchýře, incidence je různá podle typu tumoru).
Na základě těchto údajů by u pacientů trpícími těmito stavy mělo být silné podezření na deficit MTAsy. Buněčné vzorky od těchto pacientů by tedy měly být rutinně analyzovány na deficit MTAsy, aby se určilo, zda pacient by přicházel v úvahu, že bude mít z terapeutických metod podle vynálezu prospěch.
Buněčné vzorky jiných pacientů by měly být zkoumány na deficit MTAsy, když je klinická indikace. Konstatuje se, že u vzorků primárních tumorů od pacientů, kteří trpí následujícími stavy nebyl shledán deficit MTAsy (tj. rakoviny jsou MTAsa kompetentní:
- Rakovina prsu.
- Rakovina tlustého střeva.
- Rakovina hlavy a šíje.
- Melanom.
- Rakovina ledvin.
- Dospělé nelymfoblastické leukemie.
- Určité akutní leukemie (dospělé i juvenilní).
S použitím L-alanosinu k ošetřování shora vyjmenovaných rakovin s dostatkem MTAsy byly bez znatelného úspěchu provedeny klinické pokusy.
II. Způsoby ošetřování buněk s deficitem MTAse
A. Parametry farmakologie a toxicity pro L-alanosin
U primátů je přibližně 75% L-alanosinu vyměšováno v moči zhruba za 24 hodin, primárně jako nukleosidové formy L-alanosyl-IMP a L-alanosyl-AICOR. Odstranění z plasmy po intravenosním podání je dvoufázové s ti/2a = minut a t^/2b = ^9 minut (kde Je P°l°óas životnosti a časy (t) jsou přibližné).
V dřívějších klinických pokusech omezovala dávkování toxicita, včetně renální toxicity, stomatitidy, esofagitidy a s menší frekvencí myelosuprese, bolesti hlavy, nausey a hypo- nebo hypertense. K renální toxicitě dochází při
O jednotlivém bolusovém dávkování nad 4 g/m tělesné hmotnosti. Dále dva pediatričtí pacienti, kteří obdrželi vyšší dávky než kolem 350 mg/m tělesné hmotnosti za den v oddělených dávkách, utrpěli selhání jater. Stomatitida a esofagitida nastala po násobném bolusovém dávkování. J iné zaznamenané reakce byly specifické podle pacienta.
Jednofázový II pokus využívá kontinuální infuse při dávce kolem 125 mg/m tělesné hmotnosti u dospělců trpících akutní nelymfoblastickou dávkování byla mukositida.
leukémií
Toxicitou omezující
B. Podávání ASS inhibitorů hostiteli
Savčí hostitelé (např. lidé), u nichž bylo rozbory na deficit stanoveno, že jsou MTAsa deficientní se ošetřují terapeuticky efektivním dávkováním ASS inhibitoru jako L-alanosinu, L-alanosinyl-AICOR nebo hadacidinu, především pak prvním ze zmíněných. Z tohoto hlediska je terapeuticky efektivní kteří trpí rakovinami, MTAsy podle vynálezu · ·
44
4 4
4 4«
4 4
4 4 • 4 ·· 44 44
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 44
444 4 444 4 4
4 4 4 4 4 dávka ta, která u hodnocených pacientů vyvolá objektivní odezvu tumoru, při čemž odezvou tumoru je zastavení nebo regrese růstu stanovované proti klinicky přijatým standardům (viz např. Eagan a spol., Cancer, 44:1125-1128, 1979, jehož obsah je zde tímto odkazem zahrnován) a veřejně dostupné zprávy o aplikovaných parametrech (převážně Eaganem a spol.) v klinických pokusech prováděných pod IND č. 14,247 (Food and Drug Administration). S odkazem na tyto standardy může být snadno těmi, kteří znají běžnou onkologickou praxi, provedeno určení terapeuticky účinných dávek pro ASS inhibitory, které maj í být použity ve vynálezu pro vyčerpání intracelulárního AMP.
V terapeutických postupech se pro zvýšení antimetabolické aktivity léčiv všeobecně preferuje denní podávání nebo kontinuální infuse ASS inhibitorů v dávkách menších, než o kterých se ví, že způsobují toxicity. Díky jedinečné citlivosti buněk s deficitem MTAsy k tomuto způsobu ošetřování lze očekávat, že budou vyžadovány dávky nižší než ony testované v klinických pokusech L-alanosinu při ošetřování buněk s dostatkem MTAsy a tak snižující toxicitu vůči neproliferujícím buňkám.
Nemaligní buňky s dostatkem MTAsy mohou být také chráněny od jakéhokoliv účinku exposice vůči ASS inhibitorům podáváním MTA nebo vhodného analoga substrátu pro použití v syntéze adeninu. Vhodné sloučeniny pro používání v tomto smyslu zahrnují MTA, 2’,5’-dideoxyadenosin, 5’-deoxyadenosin, 2’-deoxy-5-deoxy-5’-methylthioadenosin (viz např. Příklad 2). Avšak lze oceňovat, že buňky s dostatkem MTAsy jsou schopny produkovat adenin z metabolismu methylthioadenosinu pro doplnění buněčné zásoby AMP, a proto se by nemělo očekávat, že ve stejné míře jako buňky s deficitem MTAsy, budou mít vyčerpaný AMP.
Po úplném popsání vynálezu ilustrují níže uvedené • 0 • 0
příklady provedení vynálezu jeho praktické provádění. Je však třeba chápat, že příklady provádění vynálezu neomezují rozsah vynálezu, který je definován připojenými patentovými nároky. V příkladech provedení jsou užívány standardní zkratky jako ml pro mililitr, h pro hodiny a mg pro miligram.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
In vi vo efekt L-alanosinu na xenoštěpy lidského tumoru s nedostatkem MTAsy a s dostakem MTAsy po kontinuální infusi
Pro zhodnocení in vivo efektu L-alanosinu na známé lidské tumory s nedostatkem MTAsy po kontinuální infusi a pro srovnání tohoto efektu s efektem léčiva na známé lidské tumory s dostatkem MTAsy, bylo injikováno 2 x 10^ H292 NSCL buněk s deficitem MTAsy a Calu-6 tumorové buňky s dostatken
MTAsy (v 0,3 ml pravého a levého MATRIGEL™ vytváří s 50% nosičem MATRIGEL™) jednotlivě do boku Balb/C athymických nahých myší. in vivo nejprve pevnou matrici, jež byla první den infuse u každé myši změřena pro kontrolu velikosti tumoru (který byl během 14-denní periody resorbován). Pro další srovnání bylo do pravého boku dalších 8 nahých myší injikováno 10 CEM T-ALL (akutní lymfoblastická leukemie s nedostatkem MTAsy) buněk v 50% MATRIGEL™ nosiči. Mnohé z buněk byly získány z komerčně dostupných buněčných linií z ATCC, prodávaných pod přírůstkovými čísly ATCC CRL-1848, resp. HTB-56.
Následující den byly 4 bilaterárně s NSCLC očkované myši a 4 s očkováním T-ALL subkutánně implantovány pomocí ALZET™
1007D osmotických infusních čerpadel do hřbetu ve vzdálenosti od míst, kde byly očkovány buňkami tumoru. Čerpadla byla • · » « • · naplněna L-alanosinem v koncentraci vypočtené tak, aby při kontinuální infusi denně poskytovala 60 mg/kg. Protože se po dnech při dávce 60 mg/kg neprojevovala toxicita, byla čerpadla odstraněna a nahrazena čerpadly obsahuj ícími
L-alanosin a poskytujícími 90 mg/kg denně po dalších 7 dní.
Jak ukazuje Obrázek 2 a Obrázek 3, podávaný L-alanosin způsobuje u myších imunodeficientních hostitelů úbytek vyvinutého, MTAsu postrádajícího NSCLC (H292 L-alan Tx; obrázek 2) a T-ALL ( ošetřené myši; obrázek 3) inokula xenoštěpu a zabraňuje růstu recentních, MTAsu postrádajících NSCLC nebo T-ALL inokul xenoštěpů u imunodeficientních myších hostitelů ve srovnání s ošetřenými NSCLC buňkami s dostatkem MTAsy a neošetřenými buňkami s deficitem MTAsy. Zejména vyvinuté tumory s dostatkem MTAsy rostou rychle navzdory L-alanosinu, jak to činily neošetřené MTAP deficientní NSCLC nebo T-ALL xenoštěpy.
Příklad 2
Ochrana zdravých buněk s dostatkem MTAsy pomocí substrátů MTAsy
Selektivní neschopnost NSCLC buněk s nedostatkem MTAsy proliferovat v přítomnosti L-alanosinu (při 40 μΜ) navzdory přidání methylthioadenosinu (MTA) ke každé kultuře substrátu MTAsy, byla potvrzena ve srovnávání dvou buněčných linií, Calu-6 s dostatkem MTAsy a H292 s deficitem MTAsy (Obrázek 4). Kontrolní kultury obsahující adenin (tAde) proliferují navzdory L-alanosinu a potvrzují, že selektivní toxicita je způsobena selháním buněk s nedostatkem MTAsy metabolisovat MTA na adenin.
Pro další srovnání, přidávání MTA nebo substrátu MTA analogického 5’-deoxyadenosinu mělo za následek obnovení • · • · · · · · « » · · · · · · · • ···· · · · · <
, · · · · « ·· ·· · · ·· růstu pouze pro buňky s dostatkem MTAsy, buňky A427 a MOLT-4 buňky, zatímco u buněk s deficitem MTAsy, A549 a CEM buněk zůstal růst inhibován (Obrázek 5A a B). Protože MTA je zpětnou vazbou inhibitoru sperminsyntetasy, některé buněčné linie jako MOLT-4 jsou při vysokých koncentracích inhibovány. To vyúsťuje do dvoufázové křivky obnovy růstu se stoupající koncentrací MTA (Obrázek 5A).
Příklad 3
Klonování a částečná charakterisace genomického klonu MTasy
Genomický klon lidské MTAsy byl isolován následovně. Knihovna kosmidového genu sestavená z DNA lidské placenty (Clontech) byla prozkoumána pomocí genové sondy cDNA MTAsy, Not I/EcoRi fragmentu ze subklonu MTAP-7. Transformovanými buňkami E. coli z knihovny byly pokryty LB plotny obsahující ampicilin (50 mg/1) s hustotou kolonie 1-2 x 104/135 x 15 mm na plotnu.
Byly provedeny následující procedury. Z půl milionu kolonií byla isolována jedinná positivní kolonie označená jako MTAP-10 a byla částečně charakterisována PCR analýzou a přímým sekvencováním. Byly syntetisovány dva primery, sense oligonukleotid umístěný 120 bp v protisměru od terminačního kodonu a antisense oligonukleotid umístěný 20 bp po směru od terminačního kodonu a byly použity pro PCR analýzu. PCR byla prováděna ve 25 cyklech, každý cyklus sestával z denaturace (92 °C, 1 min), teplotní hybridisace (55 °C, 2 min) a extense (72 °C, 5 min). PCR produkty byly rozděleny na 0,8% agarosovém gelu.
Umístění dosud identifikovaných exonů v genu MTAsy za použití shora popsaných technik je vyznačeno na Obrázku 1 podtržením.
• · • · • · • · · • · ·
Příklad 4
Aplikace MTAsa sekvenčně specifických oligonukleotidů na řadu maligních buněk pro detegování přítomnosti nebo nepřítomnosti MTAsy v nich
Pro testování použitelnosti oligonukleotidových sond vyvinutých z genomického klonu MTAsy identidikovaného jak je popsáno v příkladu 4 (SEQ.ID.No. 1), byla aplikována PCR na několik buněčných linií lidské plicní rakoviny, o kterých se vědělo, že obsahují buňky s dostatkem MTAsy (Calu-6; ATCC designační číslo HTB-56) a buňky s deficitem MTAsy (A549; designační číslo ATCC CCL-185). Genomická DNA byla isolována jak je popsáno v příkladu 3 a její 1 mikrogram byl použit pro PCR.
Amplifikace byla provedena ve 40 cyklech, jak je popsáno svrchu, každý cyklus sestával z denaturace (92 °C, 1 min), teplotní hybridisace (55 °C, 1 min) a extense (72 °C, % min). Produkty PCR byly analyzovány na 1,5% agarosovém gelu. V buněčných liniích, které měly deficit MTAsy, nebyla MTAsa detegována, zatímco MTAsa byla detegována u buněčné linie, kde měly buňky dostatek MTAsy.
Příklad 5
Inhibice tumorů s deficitem MTAP L-alanosinem po denní injekci xenoštěpů vyvinutých tumorů do nahých myší buněk A549 nebo A427 bylo subkutanně injikováno do 6 týdnů starých Balb/c athymických nahých myší. Když tumory dosáhly průměru přibližně 0,4 cm, bylo zahájeno každých 12 hodin ošetřování intraperitonální injekcí L-alanosinu nebo » · · • · « • · · fysiologického roztoku.
Myši dostaly 15 mg/kg v injekci po 7 dní a pak 22,5 mg/kg po 5 dní. Velikost tumoru byla výsledkem měření kolmých průměrů. Výsledky u ošetřených myší (n = 6 [velikost vzorku] pro každý buněčný typ) proti výsledkům kontrolních myší (n = 4 [velikost vzorku] pro každý buněčný typ) jsou uvedeny na Obrázku 7.
Na žádné testované úrovni dávkování (myši měly stabilní hmotnosti během testování) nebyl náznak toxicity. L-Alanosin podávaný dvakrát denně bolusovou injekcí způsobil zmenšení velikosti dobře vyvinutých tumorů s deficitem MTAP, avšak na růst MTAP positivních buněk vliv neměl.
SOUHRN SEKVENCÍ
SEQUENCE ID. NO. 1 je genomový klon pro fosforylasu methythioadenosinu (MTAsu).
SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNÁ INFORMACE:
(I) PŘIHLAŠOVATEL: The Regents of the University of California (II) NÁZEV VYNÁLEZU: Způsob inhibice aktivity syntetasy adenylsukcinátu u maligních buněk s deficitem fosforylasy methylthioadenosinu (III) POČET SEKVENCÍ: 1 (IV) ADRESA KORESPONDENCE:
(A) ADRESÁT: Robbins, Berliner & Carson
(B) ULICE: 201 N. Figueroa Street, 5th Floor
(C) MĚSTO: Los Angeles
(D) STÁT: California
(E) ZEMĚ: USA
(F) SMĚROVÉ ČÍSLO: 90012-2628
(V) FORMA POČÍTAČOVÉHO ZPRACOVÁNÍ:
(A) TYP MEDIA: Pružný disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (VI) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) KLASIFIKACE:
• · (VIII) INFORMACE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI/ZMOCNĚNCI:
(A) JMÉNO: Berliner Robert (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 20,121 (C) REFERENCE/ČÍSLO REJSTŘÍKU: 5555-423 (IX) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON: (213) 977-1001 (B) FAX: (213) 997-1003 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:1 :
(I) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2763 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: j ednořetězová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(II) DRUH MOLEKULY:
(VII) OKAMŽITÝ ZDROJ: (B) KLON:
(IX) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ:
(B) POSICE:
DNA (genomová) fosfatasa methyladenosinu
CDS
1..2763 (XI) POPIS SEKVENCE:
SEQ ID NO:1:
TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60 AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120 ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180 TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240 TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300 • · • ·
24 • · · · · 9 · · · « • · · · 1 · · · · · · · •
GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 360
TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA 420
CANNNNNNNN NNNNNNNNNN GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT 480
TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT 540
GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT 600
TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT 660
TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG 720
GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG 780
GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT 840
ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 900
AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC 960
TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG 1020
GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG 1080
GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA 1140
ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA 1200
GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTC CCAATAGGGT 1260
GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA 1320
AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA 1380
GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT 1440
TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNTACCCTAC 1500
ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG 1560
GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC 1620
AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1680
TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1740
AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1800
TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1860
GCCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920
AACTGAFTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGANNN NNNNNNNNNN NNAATAAACA 1980
ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG 2040
CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA 2100
AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT 2160
TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT AACAAACATC 2220
TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC 2280
• ·
CAGTTTTCTG
CATTCTAATT
ATGCAGCTTT
TGTATAGAGA
AGTAACATGT
CTCCCCCTAT
CCAAAGAATG
GTACAGTATT
TAC
TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CCAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA TAAATTTGCA ACAATAAAGG GIGGAGGGTA TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA • ·
CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA 2340
GAAAAAAATA TGGGAAAGAC 2400
AAGAAAGACA AGACATTGTG 2460
CAGAAGAAAA GCAAATGACT 2520
AAAAACCCCA CCATTCTCTT 2580
ATCTCTACTT TCCTATACTG 2640
ATTGATGCGA CTGTAAATTG 2700
AAGACTTAAA AATACGGACG 2760 2763

Claims (4)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití činidla inhibujícího aktivitu syntetasy adenylsukcinátu pro výrobu léčiva pro léčbu primárních rakovinných tumorů obsahujících buňky s deficitem methylthioadenosinfosforylasy u savčího hostitele.
  2. 2. Použití podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že činidlem inhibujícím aktivitu syntetasy adenylsukcinátu je L-alanosin.
  3. 3. Použití podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že hostitelem je člověk.
  4. 4. Použití podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že hostitelské buňky s deficitem methylthioadenosinfosforylasy jsou buňky primárního tumoru, vybrané ze skupiny zahrnuj ící buňky nemalobuněčné rakoviny plic, buňky akutní lymfoblastické leukemie, buňky gliomu a buňky urotheliálního tumoru.
CZ982866A 1996-03-08 1997-01-27 Použití činidla inhibujícího aktivitu syntetasy adenylsukcinátu CZ286698A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/612,542 US5840505A (en) 1993-12-29 1996-03-08 Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in methylthioadenosine phosphorylase deficient cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ286698A3 true CZ286698A3 (cs) 1999-03-17

Family

ID=24453611

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ982866A CZ286698A3 (cs) 1996-03-08 1997-01-27 Použití činidla inhibujícího aktivitu syntetasy adenylsukcinátu

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5840505A (cs)
EP (1) EP0902839B1 (cs)
JP (1) JP2000509247A (cs)
KR (1) KR19990087627A (cs)
CN (1) CN1213406A (cs)
AT (1) ATE357223T1 (cs)
AU (1) AU722813B2 (cs)
BR (1) BR9708002A (cs)
CA (1) CA2244733A1 (cs)
CZ (1) CZ286698A3 (cs)
DE (1) DE69737499D1 (cs)
EA (1) EA001988B1 (cs)
HU (1) HUP9901858A3 (cs)
IL (1) IL126114A0 (cs)
NO (1) NO984124L (cs)
NZ (1) NZ331088A (cs)
PL (1) PL328810A1 (cs)
RO (1) RO118210B1 (cs)
UA (1) UA47465C2 (cs)
WO (1) WO1997032994A1 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6911309B2 (en) * 1993-12-29 2005-06-28 The Regents Of The University Of Californnia Nucleic acids encoding MTAse
US6210917B1 (en) * 1993-12-29 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Method for suppressing multiple drug resistance in cancer cells
US6214571B1 (en) * 1993-12-29 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in malignant methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
WO2002081667A2 (en) * 2000-12-05 2002-10-17 Incyte Genomics, Inc. Ligases
US20040043959A1 (en) * 2002-03-04 2004-03-04 Bloom Laura A. Combination therapies for treating methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
AU2003261354A1 (en) * 2002-08-02 2004-02-23 The Regents Of The University Of California New uses for inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase
CA2516191A1 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Salmedix, Inc Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
WO2006023010A1 (en) * 2004-08-18 2006-03-02 Salmedix, Inc. Alanosine formulations and methods of use
WO2009014642A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-29 Amgen Inc. Combination of a de novo purine biosynthesis inhibitor and a cyclin dependent kinase inhibitor for the treatment of cancer
KR20190090824A (ko) * 2016-12-01 2019-08-02 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 암을 치료하는 방법
JP7016958B2 (ja) * 2017-12-21 2022-02-07 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム アデノシンおよび／またはメチルチオアデノシンの酵素媒介枯渇方法
CN110124038A (zh) * 2019-05-08 2019-08-16 山东大学齐鲁医院 腺苷酸琥珀酸合成酶基因和/或其编码的蛋白的新应用
WO2021260675A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Agents for sensitizing solid tumors to treatment

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4792520A (en) * 1984-02-16 1988-12-20 University Of Cincinnati Methods and kits for identifying mutagenic agents and molecular mutations in DNA in mammalian cells
US4822736A (en) * 1984-07-05 1989-04-18 Baylor College Of Medicine Amplification of adenosine deaminase genes in mammalian cells using adenosine, alanosine, uridine, and deoxycoformycin
US5118601A (en) * 1986-03-27 1992-06-02 The Regents Of The University Of California Method of screening purine nucleoside compounds or analogs for the ability to enhance the cellular synthesis and release of adenosine
US5030623A (en) * 1986-03-27 1991-07-09 The Regents Of The University Of California Methods for increasing extracellular adenosine and for stabilizing mast cells
WO1995018233A1 (en) * 1993-12-29 1995-07-06 The Regents Of The University Of California Method for detection of methylthioadenosine phosphorylase deficiency in mammalian cells

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9901858A3 (en) 1999-12-28
JP2000509247A (ja) 2000-07-25
CN1213406A (zh) 1999-04-07
EA001988B1 (ru) 2001-10-22
AU722813B2 (en) 2000-08-10
RO118210B1 (ro) 2003-03-28
ATE357223T1 (de) 2007-04-15
UA47465C2 (uk) 2002-07-15
EP0902839B1 (en) 2007-03-21
DE69737499D1 (de) 2007-05-03
EP0902839A4 (en) 2004-06-30
BR9708002A (pt) 1999-07-27
HUP9901858A2 (hu) 1999-09-28
US5840505A (en) 1998-11-24
NO984124D0 (no) 1998-09-07
EA199800806A1 (ru) 1999-02-25
NO984124L (no) 1998-09-07
WO1997032994A1 (en) 1997-09-12
KR19990087627A (ko) 1999-12-27
IL126114A0 (en) 1999-05-09
AU1838897A (en) 1997-09-22
PL328810A1 (en) 1999-02-15
CA2244733A1 (en) 1997-09-12
EP0902839A1 (en) 1999-03-24
NZ331088A (en) 2000-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
García-Cañaveras et al. SHMT inhibition is effective and synergizes with methotrexate in T-cell acute lymphoblastic leukemia
AU736937B2 (en) Method for suppressing multiple drug resistance in cancer cells
US6395481B1 (en) Methods for detection of promoter polymorphism in a UGT gene promoter
Shewach et al. Metabolism and selective cytotoxicity of 9-β-D-arabinofuranosylguanine in human lymphoblasts
Ullman et al. Genetic analysis of 2′, 3′-dideoxycytidine incorporation into cultured human T lymphoblasts.
AU722813B2 (en) Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
Tang et al. Defects in methylthioadenosine phosphorylase are associated with but not responsible for methionine-dependent tumor cell growth
CA2768338A1 (en) Method for predicting the utility of administering nicotinic acid or a precursor or prodrug thereof to reduce the severity of side-effects of cancer treatment with nicotinamide phosphoribosyltransferase inhibitors
Matsui et al. DNA damage and p53 induction do not cause ZD1694-induced cell cycle arrest in human colon carcinoma cells
CN115335059A (zh) 用于治疗idh1抑制剂抗性受试者的方法
US6214571B1 (en) Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in malignant methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
Bobola et al. Human glioma cell sensitivity to the sequence-specific alkylating agent methyl-lexitropsin
Yamauchi et al. A sensitive new method for clinically monitoring cytarabine concentrations at the DNA level in leukemic cells
Sun et al. Enhancement of DNA ligase I level by gemcitabine in human cancer cells
Fyrberg et al. Optimization and evaluation of electroporation delivery of siRNA in the human leukemic CEM cell line
Beck et al. Factors affecting bryostatin 1-enhanced 2-CdA cytotoxicity in resistant B-cell chronic lymphocytic leukemia
JP2022513375A (ja) ＮＡＭＰＴｉ感受性のバイオマーカーとしてのＰＰＭ１Ｄ変異の同定法
Hickson et al. Drug Resistance In Cancer Chemotherapy
TW202500152A (zh) 用於治療神經膠質瘤的藥物組合物
WO2022181514A1 (ja) 慢性骨髄性白血病幹細胞阻害剤
HK1020201A (en) Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
Ostruszka Studies directed toward the mechanism of radiosensitization by 2', 2'-difluoro-2'-deoxycytidine (gemcitabine)
Nyhan State of the Art Lectures

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic