UA47465C2 - Спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в метилтіоаденозинфосфорилаза-дефіцитних клітинах, спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в клітинах ссавців-хазяїв - Google Patents

Спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в метилтіоаденозинфосфорилаза-дефіцитних клітинах, спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в клітинах ссавців-хазяїв Download PDF

Info

Publication number
UA47465C2
UA47465C2 UA98105274A UA98105274A UA47465C2 UA 47465 C2 UA47465 C2 UA 47465C2 UA 98105274 A UA98105274 A UA 98105274A UA 98105274 A UA98105274 A UA 98105274A UA 47465 C2 UA47465 C2 UA 47465C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cells
mtase
deficient
host
phosphorylase
Prior art date
Application number
UA98105274A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Карлос Дж. Каррера
Денніс А. Карсон
Говард Б. Коттам
Цутому Ноборі
Original Assignee
Дзе Ріджентс Оф Дзе Юніверсіті Оф Каліфорнія
Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Ріджентс Оф Дзе Юніверсіті Оф Каліфорнія, Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния filed Critical Дзе Ріджентс Оф Дзе Юніверсіті Оф Каліфорнія
Publication of UA47465C2 publication Critical patent/UA47465C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Наведено спосіб звільнення in vivo клітин ссавців від аденозин 5'-монофосфату (АМФ), що є корисним при лікуванні певних видів раку. Згідно з цим способом популяцію клітин отримують з організму хазяїна та аналізуть на наявність метилтіоаденозинфосфорилазної (МТАза) активності. МТАза перетворює метилтіоаденозин на аденін для ендогенного включення у внутрішньоклітинний пул АМФ. Кращим способом аналізу на наявність активності МТАзи є спосіб гібридизації для визначення гомозиготної втрати гена, який кодує терапевтично ефективну кількість агента, що гальмує активність аденілсукцинатсинтетази, що перетворює інозин 5'-фосфат на АМФ, звільнюючи таким чином клітини пухлини від субстратів для синтезу de novo АМФ. L-аланозин є кращим АСС інгібітором для використання за способом винаходу.

Description

Опис винаходу
Це часткове продовження патентної заявки США Мо 08/176,855, зареєстрованої 29 грудня 1993 року, яка 2 розглядається зараз.
Винахід стосується фармацевтичних препаратів та способів їх використання при хіміотерапевтичному лікуванні раку. Більш конкретно, винахід стосується способів визначення ракових клітин, які не можуть перетворити метилтісзаденозинфосфорилазу на аденін під час відновлювального синтезу аденінових нуклеотидів, та використання І -аланозину для інгібування де помо синтезу аденозин 5'-'монофосфату (АМФ) в 710 таких ракових клітинах.
Метилтіоаденозин (МТА) розщеплюється в здорових клітинах ссавців метилтісаденозинфосфорилазою (МТАза) на аденін та метилтіорибозу-1-Ф, остання з яких є субстратом метаболічного синтезу метіоніну. Аденін утилізується в клітинному пулі аденозин 5-монофосфату (АМФ), з якого клітини одержують аденозин 5і-трифосфат (АТФ) для метаболічної енергії та 2'-дезоксиаденозин-5'--трифосфат (дАТФ) для синтезу ДНК. 12 Спираючись на дослідження іп міїго, І-ізомер бактеріального антибіотичного аланозину (одержаного з
Зігерютусез аіаповзіпісив; далі "І -аланозин") є придатним для використання як противірусний та протипухлинний агент. Зокрема вважається, що І-аланозин інгібує аденілосукцинатсинтетазне (АСС) перетворення інозин 5-монофосфату (ІМФ) на АМФ, таким чином звільнюючи клітини-мішені від АМФ та АТФ (у відсутності аденіну).
Проте клінічні дослідження терапевтичної ефективності І -аланозину у пацієнтів, що страждають на рак, не дали успішних результатів (див., наприклад, дані, наведені Туаді апа Соопеу, Аду. РІагтасоЇї. СПпетоїгіегару, 20:69-120, 1984 Ірезультати відносно ефективності І -аланозинів при лікуванні раку людини, отримані в той час, були оцінені як "короткочасна підтримка"); Стеадап, еї аї, Сапсег, 52:615-618, 1993 |на Етапі ІЇ досліджень загальний рівень відповіді становив лише 4 95); Стеадап, ей аії, Ат. У. Сіп. Опсої, 7:543-544, 1984 |на Етапі
ІП досліджень у пацієнтів з меланомою спостерігалася незначна терапевтична відповідь)|; МопНої, еї аї., с |пмеві, Мем Огидв, 9:87-88, 1991 Ініякої очевидної відповіді у пацієнтів з раком грудної залози)). В Ге) результаті в усіх клінічних випадках лікування раку від використання І -аланозину відмовились.
Іншим відомим інгібітором АСС активності є хадацидин. Проте хадацидин вважається більш токсичним для людини, ніж І-аланозин. Крім того, активність інших інгібіторів синтезу пурину де помо (таких як метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін та а-ідеазатетрагідрофолат), які блокують синтез ІМФ (та, таким чином, о теоретично видаляють ІМФ як джерело синтезу АМФ), було виявлено іп мімо за допомогою гіпоксантину, якого Ге) багато у плазмі, що використовується як субстрат для вироблення ІМФ. Отже, на сьогоднішній день характеристики агентів іп мімо, які блокують метаболічний шлях аденіну для вироблення внутрішньоклітинного З
АМФ, є незадовільними. ча
Однак з розвитком дуже чутливих тестів для визначення гомозиготної делеції гена, яка кодує МТАзу в певних 3о ракових клітинах людини (див., звичайно наведену основну заявку на патент США з серійним номером З 08/176,855) стало відомо, що пухлини, які клінічно лікуються І -аланозином, виробляють МТАзу та, таким чином, здатні забезпечити достатню кількість аденіну для підтримування пулу АМФ, незважаючи на інгібування синтезу
АМФ за допомогою ІМФ. Цей винахід, таким чином, передбачає спосіб визначення клітин, які не мають МТАзи, та « лікування таких клітин шляхом звільнення їх від АМФ. З 50 Було виявлено, що клітини, з яких був видалений ген, що кодує протеїн МТАзи, та які не здатні перетворити с МТА на аденін ("МТАза-дефіцитні клітини"), селективно знищуються іп мімо при контакті з терапевтичне
Із» ефективною дозою інгібітора синтезу АМФ де помо, такого як І -аланозин. Таким чином, незважаючи на те, що
І-аланозин не є терапевтичне ефективним проти всіх ракових клітин, він є терапевтичне ефективним проти
МТАза-дефіцитних клітин.
В одному аспекті винахід передбачає спосіб визначення, чи є особливі ракові клітини МТАза-дефіцитними, за шк допомогою тестів на присутність у клітинах протеїну МТАзи. Кращим практичним тестом є визначення наявності -І у клітинах гомозиготних делецій гена, який кодує протеїн МТАзи.
У іншому аспекті, винахід передбачає спосіб лікування МТАза-дефіцитних ракових пухлин дією на шк МТАза-дефіцитні клітини терапевтичне ефективної кількості інгібітора синтезу пурину де помо, який інгібує
Ге»! 20 активність АСС, краще І-аланозина. Інгібітори АСС винаходу можуть бути введені будь-яким клінічно прийнятним шляхом, але краще їх вводити шляхом тривалої інфузії при концентрації препарату нижче сл максимальних пристосованих доз для того, щоб подовжити бажану активність інгібітора та зменшити токсичність щодо тканин хазяїна.
Також запропоновані комплекти препаратів для використання при застосуванні вищезгаданих способів 29 винаходу, які включають реагенти для виконання тесту винаходу на дефіцит МТАзи, а також фармацевтичні
ГФ) композиції інгібітора АСС, краще І -аланозину та/або його активного метаболіту, І -аланозинілу АІСОК. юю Фіг.1 - нуклеотидна послідовність геномної МТАзи (Посл. Ід. Мо 1), де екзони підкреслені.
Фіг2 - графік, що відображає вплив іп мімо І-аланозину після тривалої інфузії на відновлені
МТАза-компетентні та МТАза-дефіцитні великі клітини ксенотрансплантантів легеневих ракових пухлин людини у 60 оголених мишей.
Фіг3 - графік, що відображає іп хмімо вплив І-аланозину після тривалої інфузії на відновлені
МТАза-дефіцитні клітини ксенотрансплантантів людини з гострим лімфобластомним лейкозом у оголених мишей.
Фіг.4 та 5 (А-В) - графіки, що відображають вплив різних екзогенних субстратів МТАзи у МТАза-компетентні бо або МТАза-дефіцитні клітинні лінії після лікування І -дланозином.
Фіг.6 - схематичне зображення внутрішньоклітинних метаболічних шляхів вироблення АМФ.
Фіг.7 - графік, що відображає вплив іп хмімо І-аланозину після щоденної ін'єкції на відновлені
МТАза-дефіцитні великі клітини ксенотрансплантантів легеневих ракових пухлин людини у оголених мишей.
Ї. Метаболічні шляхи внутрішньоклітинного вироблення АМФ
Зрозуміти винахід допоможе схема, наведена у Фіг.б, що зображує внутрішньоклітинні метаболічні шляхи вироблення АМФ. Взагалі існує три принципових джерела субстратів для внутрішньоклітинного синтезу АМФ.
Першим є катаболізм метилтіосаденозину до аденіну за допомогою МТАзи. Цей шлях блокований у
МТАза-дефіцитних клітинах. 70 Другим є перетворення ІМФ на АМФ шляхом активного впливу АСС або аденілсукцинатліази (АСЛ). На наш час не існує інгібіторів АСЛ активності. Однак з втратою АСС активності ІМФ АМФ перетворення зникає.
Третім є утилізація гіпоксантину у АМФ. Проте, завдяки тому, що ІМФ АМФ перетворення відбувається окремо від утилізації гіпоксантину, інгібування АСС катаболізму ІМФ АМФ блокує шлях утилізації гіпоксантину,
І. Спосіб визначення МТАза-дефіцитних клітин у тестовому зразку пухлин ссавців
А. Полінуклеотидні реагенти, що використовуються для визначення МТАза-дефіцитних клітин
Кращим способом визначення, чи є особлива популяція клітин МТАза-дефіцитною, є тест на гібридизацію для виявлення гомозиготної делеції гена, який кодує МТАзу клітин. Процедури скринінгу, які основані на гібридизації нуклеїнових кислот, роблять можливим визначення будь-якої полінуклеотидної послідовності (та, як наслідок, будь-якого протеїну, що кодується такою полінуклеотидною послідовністю) у будь-якому організмі, з якого можна взяти відповідну пробу.
Повний опис способів гібридизації, придатних для використання у винаході, а також опис гена, який кодує
МТАзу, сформульовані у звичайно наведеній заявці на патент США з серійним номером 08/176,855, що також розглядається (зареєстровано 29 грудня 1993 року), опис якої включено сюди шляхом посилання разом з будь-якими поправками, які можуть бути тут зроблені. Для спрощення посилання полінуклеотидну послідовність с ов Гена, що кодує МТАзу, описано тут як Посл. Ід. Мо1 у Списку послідовностей та на Фіг.1, де кодуючи ділянки о гена підкреслені.
Геномний полінуклеотид МТАзи розташований на хромосомі 9 у ділянці р21. Цікаво, що більшість клітин (дуже велика їх частина у відсотках), які мають гомозиготну делецію гена, що кодує пухлинний супресор ріб, мають також гомозиготну делецію гена, що кодує МТАзу. Таким чином, альтернативними шляхами виявлення ю
Зо Гомозиготної делеції вищевказаного гена (М ТАза) є виявлення гомозиготної делеції попереднього гена (ріб). Для подальшого посилання, див. звичайно наведену заявку на патент США з серійним номером 08/227,800, що також со знаходиться в стадії розгляду, опис якої включено сюди шляхом посилання. «г
Штам Е. сої, який містить повну геномну ДНК для МТАзи щурів, був внесений в Американський банк типових культур, Роквілль, штат Мариленд, поштовим переказом до 29 грудня 1993 року та був відповідно помічений по ї- зв групам Позначками Мо 55536, 55537, 55538, 55539 та 55540. Не існує гарантій, що цей внесок не може бути, «г навмисне або випадково, кимось використаний для здійснення винаходу. Однак внесок буде підтриманий у життєздатній формі протягом будь-якого періоду, під час якого він може вимагатися патентними законами, згідно з якими розглядається цей опис.
Для визначення, чи був ген МТАзи гомозиготно делетований з клітин, тестований зразок клітин отримують з « організму хазяїна. Такий зразок може містити рідину або клітини, наприклад, з тканини хазяїна або його з с пухлини. Ці зразки отримують, застосовуючи способи, відомі у клінічний галузі, наприклад клітини пухлин . можуть бути отримані за допомогою біопсії або хірургічної резекції. Краще, якщо зразки клітин істотно вільні и?» від "забруднювачів", тобто інших клітин, протеїнів та схожих компонентів, які могли б фальсифікувати тест.
Наприклад, у випадку, коли джерелом для тестованого клітинного зразка є тверді пухлини, нормальні незлоякісні Клітині та МтТАза, яка може бути виділена з нормальних клітин, отримані під час процедури отримання їх біологічного зразка, будуть вважатися забруднювачами. Такі забруднювачі можуть бути видалені загальновживаними способами очистки, наприклад афінною хроматографією з анти-МТАза антитілом. ш- Завдяки тому, що винахід направлений на визначення присутності або відсутності цього гена у зразку їх клітин, які вважаються МТАза-негативними, нуклеїнові кислоти у зразку краще ампліфікувати для підвищення 5ор чутливості способу. Ця ампліфікація краще виконується за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР),
Ме, хоча ланцюгова реакція на етапі полімеризації не є абсолютно необхідною. сп Нуклеїнова кислота, ампліфікована у зразку, буде складатися з геномної ДНК або ДНК природного типу, що, як очікується, буде нормально кодувати МТАзу, якщо вона присутня у зразку (див. Посл. Ід. Мо 1). Вважається, що ДНК, яка кодує МТАзу (далі - "ДНК-мішень"), є присутньою у всіх нормальних клітинах ссавців, включаючи клітини людини.
ДНК, що кодує геномну МТАзу та буде використовуватися як контроль або джерело олігонуклеотидних проб (Ф) та праймерів, може бути виділена згідно зі способом, відомим у галузі як спосіб, описаний Мапіаїйів, еї аї., ка МоїІесшіаг Сіопіпда: А Іарогагу Мапиа! (Со Зргіпд Нагрог Іарогаїгу, 1982). Приклад, наведений тут, демонструє виділення клону гена геномної МТАзи людини, в якому бібліотека генів космід піддається скринінгу бо за допомогою олігонуклеотидної проби кКДНК МТАзи (див. Приклад ІІ). Як відомо фахівцям у цій галузі, для одержання ДНК, яка кодує МТАзу, можуть бути використані інші придатні способи.
Наприклад, вважається, що бібліотека кДНК, що містить певний полінуклеотид, може піддаватися скринінгу ін'єкцією різних мРНК, що походять від кКДНК ооцитів, залишаючи достатньо часу для експресії генних продуктів
КДНК, та тестуванню на присутність бажаного кДНК-експресійного продукту, використовуючи, наприклад, 65 специфічні антитіла для пептиду, який кодується певним полінуклеотидом, або проби для повторного аналізу та тканинної експресії головних характеристик пептиду, що кодується певним полінуклеотидом. В альтернативному варіанті бібліотека кКДНК може побічно піддаватися скринінгу для експресії певних пептидів (наприклад, протеїну МТАзи), що мають принаймні один епітоп, використовуючи для цього антитіла, специфічні для таких пептидів. Такі антитіла можуть бути отримані поліклонально або моноклонально та використані для визначення експресії продукту, що вказує на присутність певної КДНК (див. посилання на Мапіаїйів, еї а|., Моїіесшаг
Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї (Соїа Зргіпд Нагброг І ар., Мем/ Хогк, 1982)).
Полінуклеотиди, які використовуються як контроль, проби або праймери у контексті цього винаходу, також можуть бути синтезовані способами та на устаткуванні для синтезу нуклеїнових кислот, які добре відомі у галузі Як посилання див. А!йзибреї, еї. аїЇ. Ситепі Ргоїосоіїв іп Моіесціаг Віоіоду, Спв. 2 та 4 (УМіеу 70 Іп(егесіепсе, 1989).
Б. Ампліфікація геномної ДНК, яка кодує МТАзу, та тест на гібридизацію
Для підвищення чутливості гібридизаційних тестів винаходу при тестуванні клітинного зразка краще створювати такі умови, які сприяють селективній ампліфікації нуклеїнової кислоти-мішені. Дуже добре, якщо нуклеїнова кислота-мішень є полінуклеотидною частиною гена, який кодує МТАзу (наприклад, 7/5 "полінуклеотид-мішень"). Кращим засобом ампліфікування полінуклеотиду-мішені є ПЛР.
ПЛР являє собою спосіб ферментативного синтезу іп міго специфічних послідовностей ДНК або РНК, використовуючи олігонуклеотидні праймери, що гібридизуються з послідовністю специфічної нуклеїнової кислоти, та розташовуються на кінцях певної ділянки нуклеїнової кислоті-мішені. Повторювані серії циклів матричної денатурації, гібридизації праймера та ферментативного видовження гібридизованих праймерів приводять до експоненційного накопичення фрагментів специфічної нуклеїнової кислоти, які можна визначити по праймерам на 5' кінці. Кінцеві продукти (ПЛР-продукти), що були синтезовані в одному циклі, є матрицями для слідуючих циклів; отже, кількість копій нуклеїнових кислот-мішеней приблизно подвоюється у кожному циклі.
Основні способи проведення ПЛР описані у Патенті США 4,683,195 та 4,683,202 у Миїїв, еї аЇ., описи яких включені сюди як приклади загальноприйнятих способів для виконання ПЛР. Проте винахід не обмежується сч об ВвИиКОористанням способів ПЛР, які розглядаються у патенті 202 Миїїв, ей а). З того часу, як почали застосовувати спосіб Миїйїв, еї аІ., було розроблено багато тестів, основаних на ПЛР, при виконанні яких і) використовують модифікації цього способу. Ці модифікації добре відомі у галузі та не будуть, таким чином, описані тут в деталях. Проте, з метою зображення обсягу способів у цій галузі, кілька цих модифікацій описані нижче. ю зо Способи ПЛР, які забезпечують внутрішній ампліфікаційний стандарт за допомогою конкурентної матриці, яка відрізняється від нуклеїнової кислоти-мішені послідовністю та розмірами, описані в Ргос. Май). Асай. Зсі. ОБА со (1990) 87:2725-2729 (сіШПШШапа, ек аї., ашійогв). Інший спосіб для виконання "конкурентної" ПЛР, для якого «г використовуються матриці, що відрізняються послідовністю, а не розміром, описано в Мис. Асідв. Кезв., 21:3469-3472, (1993), (Конзака, еї аї., ашійоге). Цей спосіб є найкращим способом для використання у ї- технології фермент-зв'язаного імуносорбентного тесту (ЕГІ5ЗА) для аналізу ампліфікованої нуклеїнової кислоти «Е (кислот). Неконкурентний спосіб ПЛР, який використовує сайт-специфічні олігонуклеотиди для визначення мутації або поліморфізму генів, який може також бути застосований до способу винаходу, описано в Ргос. Маї).
Асад. Зсі. ОБА (1989) 86:6230-6234 (Заїкі, ей аїЇ.,, ашйогв). Кожний з цих способів має переваги у використанні гібридизаційних проб, які допомагають уникнути фальшивих позитивних результатів, отриманих від « будь-якої неспецифічної ампліфікації, яка може відбуватися протягом ПЛР. з с Для більш глибшого ознайомлення з вказаною темою фахівці у цій галузі можуть за бажанням звернутися до
Іппів, еї аї, "Оріітігайоп РОС 8", РСК РгоїосоіЇв: А Сціде о Меїйодз апа Арріїсайопе (Асай. Ргевзв, 1990). ;» Ця публікація являє собою підсумок способів впливу на специфічність, точність та вихід бажаних продуктів ПЛР.
Вибираються олігонуклеотидні праймери (принаймні одна пара праймерів), які будуть специфічно гібридизуватися до невеликої ділянки пар основ на кожному кінці (тобто 5' та 3) полінуклеотиду-мішені МТАзи ї5» (тобто "кінцевих послідовностей"). Фахівці у цій галузі можуть вибрати придатні праймери без зайвих експериментів, спираючись на інформацію про полінуклеотидні послідовності, визначені у Списку - послідовностей, що зазначений тут як Посл. Ід. Мо 1, та на Фіг.1. ї5» Щодо конструювання праймера, важливо, щоб праймери не мали в своєму складі такі комплементарні 5р основи, які можуть гібридизуватися самі з собою. Для того, щоб уникнути ампліфікації будь-якого забруднювача,
Ме. який може бути присутній у зразку, праймери краще конструювати так, щоб з'єднувати екзони (які для гена сп МТАзи підкреслені на Фіг.1).
Як відмічено вище, для того, щоб адекватно ампліфікувати нуклеїнову кислоту у зразку, зовсім необов'язково використовувати ланцюгову реакцію на цьому етапі полімеризації. Наприклад, якщо вищеописаний спосіб Козака, еї а!., реалізований так, що спочатку виконується етап полімеризації на твердій фазі, а потім гібридизація зі специфічною пробою полінуклеотиду-мішені, чутливість тесту буде така, що
Ф) достатньо буде простої полімеризації полінуклеотиду-мішені. ка Після етапу ампліфікації ПЛР-продукти тестують на присутність у зразку гена, який кодує МТАзу. Краще, якщо дволанцюгові ПЛР-продукти будуть зв'язані з твердою фазою, тоді їх ланцюги можуть бути відділені бо денатурацією, дозволяючи, таким чином, пробам із специфічними послідовностями гібридизуватися із зв'язаним "невизначеним" ланцюгом ПЛР-продукту для остаточного визначення гена, як це описано вище у Копзака, еї а/..
В альтернативному варіанті ПЛР-продукти можуть бути вилучені з реакційного середовища та відділені від ампліфікаційної суміші перед додаванням проб для гібридизації з дволанцюговими ПЛР-продуктами. При останньому підході ПЛР-продукти відділяють від ампліфікаційної суміші згідно зі способами, відомими у галузі, 65 що відповідають особливому способу визначення гена; застосовують, наприклад, гелеву ексклюзію, електрофорез або афінну хроматографію.
Виявити ампліфікований продукт можна за допомогою гібридизаційних проб, які стабільно зв'язані з міткою.
Мітка є речовиною, яка може бути ковалентно приєднана або міцно зв'язана з пробою нуклеїнової кислоти, що дасть можливість виявити пробу. Наприклад, міткою може бути радіоіїзотоп, ферментний субстрат або інгібітор, фермент, контрастна речовина (включаючи колоїдні метали), флуоресценти, хемілюмінесцентні молекули, ліпосоми, що містять будь-які вищевказані мітки, або специфічно зв'язані парні елементи. Придатна мітка не втрачає своїх властивостей під час ампліфікації.
Вченим-діагностам добре відомі придатні мітки, які легко можна визначити при виконанні тестів іп міго.
Наприклад, придатні радіоізотопи для використання іп міго включають ЗН, 71251, 191), З2р, 14, 358, Ампліфіковані 70 Фрагменти, мічені радіоїзотопом, можуть бути визначені безпосередньо гама-лічильником або авторадіографічною денситометрією, Саузерн-блоттингом ампліфікованих фрагментів, поєднаний з денсітометрією. Прикладами придатних хемілюмінесцентних молекул є акридини або люміноли.
Послідовності-мішені, гібридизовані з пробами, які є похідними акридинового естеру, захищені від гідролізу інтеркаляцією. Прикладами придатних флуоресцентів є флуоресцеїн, фікобіліпротеїн, рідкі земельні хелати, 75 дансил або родамін.
Прикладами придатних ферментних субстратів або інгібіторів є сполуки, які специфічно зв'язуються з пероксидазою хріну, глюкозоксидазою, глюкозо-б-фосфатдегідрогеназою, р-галактозидазою, піруваткіназою або лужною фосфатазою ацетилхолінестерази. Прикладами контрастних речовин є колоїдне золото або магнитні частинки.
Специфічна зв'язуюча пара складається з двох різних молекул, де одна з молекул має таку ділянку на поверхні або в порах, що специфічно зв'язується з певною площинною та полярною структурою іншої молекули.
Члени специфічної зв'язуючої пари часто відносяться як ліганд та рецептор, або ліганд та анти-ліганд.
Наприклад, якщо рецептор є антитілом, ліганд є відповідним антигеном. Інші специфічні зв'язуючі пари включають гормон-рецепторні пари, фермент-субстратні пари, біотин-авідинові пари та глікопротеїн-рецепторні СУ пари. Включення являють собою фрагменти та частини специфічних зв'язуючих пар, які підтримують зв'язуючу о специфічність, наприклад фрагменти імуноглобулінів, включаючи Рар-фрагменти та подібні до них. Антитіла можуть бути або моноклональні, або поліклональні. Якщо елемент специфічної зв'язуючої пари використовується як мітка, кращою процедурою виділення буде афінна хроматографія.
Якщо ніякий ампліфікований продукт не може бути визначений за допомогою тесту, описаного вище, це є юю показником присутності у зразку МТАза-дефіцитих клітин. Завдяки тому, що нормальні (тобто незлоякісні) клітини завжди мають ген, який кодує МТАзу, у визначних кількостях (навіть із втратою однієї алелі), можна іш зробити висновок, що якщо в клітинах не вистачає гена, який кодує МТАзу (тобто існує гомозиготна делеція ч;Е гена), тоді в цих клітинах також не вистачає як каталітично активної, так і каталітично неактивної МТАзи.
Проте, якщо потрібно, зразок може бути підданий прескринінгу на каталітичну активність МТАзи, - використовуючи спосіб, описаний ЗеїдепіеїЇд, еї а!І., Віоспет. Віорпуз. Кевз. Соітпип., 95:1861-1866 (1980); «Ж див. Також Приклад 1, нижче). Тест винаходу буде тоді використаний для визначення, чи є ген, який кодує
МТАзу, присутнім у клітинному зразку. Зразок також може бути тестованим у присутності каталітично активного або неактивного протеїну для скринінгу клітинних забруднювачів у зразку, тобто незлоякісних клітин. Придатний « імунотест для альтернативного використання (тобто замість гібридизаційного тесту), описаного у Морбогі, еї а1ї,, Сапсег Кев. 53:1098-1101 (1991) та сформульовані в звичайно наведеній основній Патентній заявці США, - с серія Мо 08/177,855, що також розглядається, зареєстрованій 29 грудня 1993 року, опис якої включено як ц посилання, ,» В. МТАза-дефіцитні клітини.
Використовуючи способи тестування, описані вище, такі наступні первинні пухлини людини були визначені як МТАза-дефіцитні. Зрозуміло, що цей список є ілюстративним, але не виключним, щодо типів раку, які можуть г» бути визначені як МТАза-дефіцитні, використовуючи способи, що застосовуються при виконанні описаних тестів. - Гострий лімфобластомний лейкоз (приблизно 8095 випадків) їв. - Гліома (приблизно 6795 випадків) г» -Злоякісна гігантоклітинна пухлина легенів (приблизно 1695 випадків)
Ф 50 - Пухлини оболонки сечовивідних органів (наприклад, рак сечового міхура; сфера розповсюдження залежить від типу пухлин) сл Спираючись на ці дані, МТАза-дефіцит варто очікувати від пацієнтів, що страждають на вказані захворювання. Таким чином, клітинні зразки, взяті у таких пацієнтів, повинні бути протестовані на
МТАза-дефіцитність для визначення ефективності терапевтичного лікування за способом цього винаходу.
Клітинні зразки, одержані від інших пацієнтів, що страждають на рак, повинні бути протестовані на
МТАза-дефіцитність для клінічного підтвердження діагнозу. Наприклад, зразки первинних пухлин виявились
ІФ) МТАза-дефіцитними (тобто рак є "МТАза-компетентним!") у пацієнтів, що страждають на: ко - Рак грудей - Рак товстої кишки 60 - Рак голови та шиї - Меланому - Рак нирок - Нелімфобластомний лейкоз дорослих - Деякі гострі лейкози (дорослих та дітей). 65 У клінічних випадках використовували І-аланозин для лікування вище-перелічених МТАза-компетентних злоякісних пухлин, але без особливого успіху.
ІП. Метод лікування МТАза-дефіцитних клітин
А. Фармакологічні та токсикологічні характеристики для І -аланозину
У приматів приблизно 7595 І -аланозину виділяється з сечею протягом 24 годин, головним чином у вигляді нуклеозидних форм І -аланозинілу-ІМФ та І-аланозинілу-"АІСОМК. У людини вивільнення з плазми після внутрішньовенного введення є двофазним, з 4/2 х - 14 хвилин та 5» В - 99 хвилин (де "/»" - це період напіввиведення, та час (І) дається наближено).
У попередніх клінічних випадках токсичність обмежувалася дозою і проявлялася впливом на нирки, стоматитом, езофагітом та, з меншою частотою, мієлосупресія, головний біль, нудота та гіпо- або гіпертензія. 70 Ниркова токсичність зустрічається при введенні одиничної дози у вигляді болюсу більше ніж 4г/м 2 ваги тіла.
Крім того, обидва педіатричні пацієнти, які отримали найвищі дози, тобто біля З5Омг/м 2 ваги тіла на день у окремих дозах, піддалися ушкодженню печінки. Стоматит та езофагіт трапляються після тривалого застосування болюсних доз. Інші реакції були специфічними для кожного пацієнта.
Під час першого етапу двофазного тесту дорослим, що страждають на гострий нелімфобластомний лейкоз, 75 призначали тривалу інфузію препарата у дозі приблизно 125мг/м2 ваги тіла протягом 5 днів. Дозообмежуючою токсичністю було запалення слизової оболонки.
Б. Введення АСС інгібіторів до організму хазяїна
Ссавців, наприклад людей, що страждають від раку, яких можна віднести до МТАза-дефіцитних згідно з тестом на дефіцит МТАзи винаходу, лікують терапевтичне ефективною дозою АСсС-інгібітора, такого як |-аланозин, І -аланозиніл-АІСОК або хадацидин, краще першим. Так "терапевтичне ефективна доза" викликає об'єктивну пухлинну відповідь у пацієнтів, де пухлинна відповідь є зупинкою або регресією у рості, що визначається за клінічно прийнятими стандартами (див., наприклад, Еавдап, еї аі!., Сапсег, 44:1125-1128, 1979 (опис якого включено сюди шляхом посилання) та Публічні звіти про результати проведених (особливо у Еадап, ей а!) в клінічних умовах тестів під ІМОЖ14,247 (БРоод апа Огид Аатіпівігайоп)). Використовуючи ці дані, СМ визначення терапевтичне ефективної дози АСс-інгібіторів, що використовуються у винаході для зменшення о кількості внутрішньоклітинної АМФ, може бути легко зроблено звичайними фахівцями в онкологічній галузі.
Взагалі щоденне введення або тривала інфузія АСС-інгібіторів в дозах, менших ніж ті, що викликають негативну реакцію, є найкращим терапевтичним призначенням для антиметаболічних ліків. Можна сподіватися, що завдяки особливій чутливості МТАза-дефіцитних клітин до цього способу лікування, будуть потрібні менші іс) дози, ніж ті, які клінічно тестувалися при застосуванні І -аланозину для лікування МТАза-компетентних клітин; «со через це зменшується токсичний вплив на неушкоджені клітини.
Незлоякісні МТАза-компетентні клітини також можуть бути захищені від будь-яких ефектів дії «
АСсС-інгібіторів через введення МТА або аналогічного придатного субстрату для використання у синтезі аденіну. їч-
До придатних сполук належать МТА, 2-Б'дидезоксіаденозин, 5'-дезоксіаденозин, 2'-дезокси-5-дезокси-б'метилтіосаденозин (див., наприклад, Приклад !!). Проте треба зазначити, що «
МТАза-компетентні клітини здатні виробляти аденін в результаті метаболізму метилтіоаденозину для поповнення клітинного пулу АМФ та, таким чином, не очікується зменшення АМФ до такого ж рівня, як і в
МТАза-дефіцитних клітинах. «
Винахід повністю описаний, його способи ілюстровані прикладами, наведеними нижче. Зрозуміло, що приклади не обмежують обсяг винаходу, який визначено формулою, яка додається. У прикладах використані т с стандартні абревіатури, такі як "мл" (мілілітр), "год" (година) та "мг" (міліграм). ч Приклад » Вплив І -аланозину іп мімо на МТАза-дефіцити і та МТАза-компетентні пухлинні ксенотрансплантанти людини після тривалої інфузії
Для оцінювання впливу І -аланозину іп мімо на відомі МТАза-дефіцитні пухлини людини після тривалої інфузії о у порівнянні з впливом цих ліків на відомі МТАза-компетентні пухлини людини 2 х 109 МТАза-дефіцитних Н2г92 -І МЗСЇ С клітин та МТАза-компетентних Саїц-6 клітин пухлин (у О,Змл носія з 5095 МАТКІСЕЇ тм) вводили у правий та лівий бік відповідно 8 Ваір/С оголеним мишам з видаленим тимусом. МАТКІСЕЇ тм приймає форму твердої ве матриці іп мімо, яку вимірювали у кожної миші в перший день інфузії для контролю за розміром пухлини (яка (о) 20 ресорбується через 14 діб) Для подальшого порівняння 170 7 СЕМ 1Т-АЦ (МТАза-дефіцитний гострий сл лімфобластомний лейкоз) клітин у носії з 5095 МАТКІСЕ "м вводили у правий бік 8 інших оголених мишей. Багато клітин були отримані з комерційне доступних клітинних ліній від АТСС, придбаних згідно з АТСС Ассезвіоп Мов.
СТІ -1848 та НТВ-56.
Наступного дня 4 мишам з двобічними М5СІС та 4 мишам з Т-АЇЇ. щепленнями імплантували під шкіру
АЇ7ЕтТтм 1007О0) за допомогою осмотичної інфузіонної помпи у спину на відстані від місця введення клітин (Ф) пухлин. Помпи заповнювали І -аланозином у концентрації бОмг/кг для щоденної тривалої інфузії. Оскільки після 7 ко днів при дозі бомг/кг ніякої токсичності не спостерігалося, помпи видаляли та замінювали помпами, які містили
Ї -аланозин у дозі 9Омг/кг на день з розрахунку на 7 додаткових днів. во Як показано на Фіг.2 та на Фіг.3, введений І -аланозин викликав зменшення сталих МТАза-дефіцитних МЗСІ С (Н292 І-аїап Тх"; Фіг2) та Т-АЇЇ ("Піддослідна миша"; Фіг.3) прищепленого ксенотрансплантанту у імунодефіцити их хазяїв-мишей та запобігання росту МТАза-дефіцитних МЗС С або Т-АЇ Ї. ксенотрансплантантів у імунодефіцитних хазяїв-мишей у порівнянні з піддослідними МТАза-компетентними М5СІ С клітинами та контрольними МТАза-дефіцитними клітинами. Зокрема, сталі МТАза-компетентні пухлини ростуть швидко, до незважаючи на ЇІ-аланозин, як у випадку з контрольними МТАР-дефіцитними М5ЗСІС або Т-АЇ ксенотрансплантантами.
Приклад ІІ
Захист МТАза-компетентних здорових клітин субстрата МТАзи
Вибіркова нездатність МТАза-дефіцитних МЗСІС клітин проліферувати у присутності І-аланозину (у 40Омкмоль), незважаючи на додавання до кожної культури субстрату МТАзи метилтіоаденозину (МТА), була підтвержена порівнянням двох клітинних ліній, МТАза-компетентних СаІш-б6 та МТАза-дефіцитних Н292 (Фіг.4).
Контрольні культури, які містять аденін (ІАде), проліферують незважаючи на І-аланозин, підтверджуючи, що вибіркова токсичність пояснюється нездатністю МТАза-дефіцитних клітин перетворювати МТА на аденін.
При подальшому порівнянні додавання МТА або МТА-субстратного аналога 5'-дезоксіаденозину призводить 7/0 до зменшення росту лише для МТАза-компетентних А427 клітин та МОЇ Т-4 клітин, де ріст МТАза-дефіцитних
А5Б49 та СЕМ клітин залишається інгібованим (Фіг.5А та 58). Завдяки тому, що МТА є зворотним інгібітором синтетази сперми, деякі клітинні лінії, такі як МОЇ Т-4, інгібуються при високих концентраціях. Це призводить до підвищення концентрації МТА у двофазній кривій відновлення росту (Фіг.5А).
Приклад ІІ
Клонування та часткова характеристика геномного клону МТАзи
Геномний клон МТАзи людини виділяли так. Банк космідних генів, побудованих з ДНК плаценти людини (Сіопіесі), піддавали скринінгу, використовуючи генну пробу кКДНК МТАзи, Мої І/ЕсокКі фрагмент з субклону
МТАР-7. Трансформовані клітини Е. соїї з банку висівали у ЇВ чашки, які містили ампіцилін (5Омг/л), з густиною колонії 1-2 х 107/135 х 15мм чашку.
Далі виконували такі процедури. З півмільйонної колонії, виділяли одиничну позитивну колонію, названу як
МТАР-10, та частково знімали характеристики аналізом ПЛР та прямим визначенням послідовності. Два праймери, "визначений" олігонуклеотид, розташований на 120 пар основ вище стоп-кодону, та "невизначений" олігонуклеотид, розташований на 20 пар основ нижче стоп-кодону, синтезували та використовували під час аналізу ПЛР. ПЛР проводили протягом 25 циклів, кожний цикл складався з денатурації (92"С, хв), гібридизації Ге (55"С, 2хв) та видовження (72"С, 5хв), ПЛР-продукти були відділені на 0,895 агарозному гелі. о
Розташування екзонів, визначене у генів МТАзи вищеописаним способом, позначається на Фіг.1 підкресленням.
Приклад ЇМ
Застосування послідовність-специфічних олігонуклеотидів МТАзи до злоякісних клітинних ліній для юю визначення присутності або відсутності в них МТАзи
Для визначення корисності олігонуклеотидних проб, отриманих від геномного клону МТАзи так, як описано у шо
Прикладі ІМ (Посл. Ід. Мо 1), ПЛР застосовували до кількох ракових легеневих клітинних ліній людини, про які чІ відомо, що вони містять МТАза-компетентні (Саіш-6; АТОС Оевзідпайоп Мо. НТВ-56) та МТАза-дефіцитні клітини (А549; АТСС Оезідпайоп Мо. ССІ-185). Геномну ДНК виділяли, як описано у Прикладі І, та 1 мікрограм її - використовували у ПЛР. ч;Е
Ампліфікацію проводили протягом 40 циклів, як описано вище, кожний цикл складався з денатурації (927С, хв), гібридизації (55"С, 1хв) та видовження (72"С, 1/2хв). ПЛР;-продукти аналізували на 1,595 агарозному гелі.
У клітинній лінії, яка відома як МТАза-дефіцитна, не було визначено МТАзи, в той час як у МТАза-компетентній « клітинній лінії МТАзу було визначено.
Приклад М - с Інгібування І-аланозину МТАР-дефіцитних пухлин після щоденної ін'єкції оголеним мишам із сталим ц пухлинним ксенотрансплантантом є» 107 АБ549 або А427 МЗСІ С клітин уводили підшкірно б-тижневим старим ВаїЇр/с оголеним мишам з видаленим тимусом. Коли пухлини досягали приблизно 0,4см у діаметрі, лікування починалося з І-аланозину або фізіологічного розчину інтраперитональною ін'єкцією кожні 12 годин. т. Миші отримували 15мг/кг на ін'єкцію протягом 7 днів, потім 22,5мг/кг протягом 5 днів. Розмір пухлини -1 вимірювали по перпендикулярним діаметрам. Результати для піддослідних мишей (п - 6 розмір зразка| для кожного типу клітин) проти контролю (п - 4 Ірозмір зразка) для кожного клітинного типу) показано на Фіг.7. т. При будь-якій дозі ніякої токсичності не спостерігали (піддослідні мали стабільну вагу протягом досліду).
Фу 50 І-аланозин, уведений подвійною щоденною болюсною ін'єкцією, призвів до зменшення у розмірі сталих
МТАР-дефіцитних пухлин, але ніяк не впливав на ріст МТАР-позитивних клітин. сл Огляд послідовностей
Послідовність Ід. Мо 1 є геномним клоном для метилтісаденозинфосфорилази (МТАза).
Список послідовністей (1) Загальна інформація: о (І) Подавець: Магістри Каліфорнійського університету (ПІ) Назва винаходу: Метод інгібування аденілсукцинатсинтетазної активності у злоякісних клітинах з ко дефіцитом метилтісаденозинфосфорилази. (ПІ) Номер послідовності: 1 бо (ІМ) Адреса для кореспонденції: (А) Адресат: Корріпв, Вегіїпег «5 Саггоп (В) Вулиця: 201 М. Рідцегоа 5ігееї, Бій Рісог (С) Місто: Лос-Анжелес (О) Штат: Каліфорнія 65 (Е) Країна: США (Р) Код: 90012-2628
(М) Комп'ютерна форма: (А) Тип носія: Гнучкий диск (В) Комп'ютер: ІВМ РС-сумісний (С) Операційна система: РО-ЮОБ/М5-БО5 (Ю) Програмне забезпечення: Раїепіїп КеІеазе "1.0, Мегвіоп 41.25 (МІ) Дані про сучасну заявку: (А) Номер заявки: (В) Дата реєстрації: 70 (С) Класифікація: (МІ) Інформація про повіреного/агента: (А) Ім'я: Вегііпег, Кобрегі (В) Регістраційний номер: 20,121 (С) Номер посилання/виписки: 5555-423 (ІХ) Телекомунікаційна інформація: (А) Телефон: (213) 977-1001 (В) Телефакс: (213) 977-1003 (2) Інформація про Посл.
Ід.
Мо 1: (І) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 2763 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюг: одиничний (ОБ) Топологія: лінійна (І) Тип молекули: ДНК (геномна) сч (МІЇ) Джерело: (В) Клон: Метиладенозинфосфатаза і) (ІХ) Властивість: (А) Ім'я/ключ: СО5 (В) Знаходження: 1.. 2763 ю «со

Claims (13)

Формула винаходу «
1. Спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в метилтісзаденозинфосфорилаза-дефіцитних в. 35 клітинах, який включає визначення того, чи є популяція клітин, отримана з клітин ссавців, « метилтіоаденозинфосфорилаза-дефіцитною, введення терапевтично ефективної кількості інгібітора аденілсукцинатсинтетази в організм хазяїна, звільнення в результаті зазначеного контакту метилтісаденозинфосфорилаза-дефіцитних клітин хазяїна від аденозин 5':монофосфату.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що перший етап складається з отримання зразка клітин, які можуть « бути метилтісаденозинфосфорилаза-дефіцитними, додавання до зразка олігонуклеотидних проб, які будуть з с специфічно сгібридизуватися з будь-якою присутньою у зразку нуклеїновою кислотою, яка кодує метилтіоаденозинфосфорилазу, за умов, які дозволятимуть пробам гібридизуватися до будь-якої нуклеїнової :з» кислоти, присутньої у зразку, та визначення присутності у зразку нуклеїнової кислоти, яка кодує метилтіоаденозинфосфорилазу, де присутність вищезгаданої нуклеїнової кислоти виявляє присутність протеїну метилтіоаденозинфосфорилази у зразку клітин. їз
3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що інгібітором аденілсукцинатсинтетази є І -аланозин.
4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хазяїном є людина.
-
5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що метилтісзаденозинфосфорилаза-дефіцитні клітини є клітинами їз первинної пухлини, вибраними з групи, яка складається з клітин недрібноклітинної карциноми легенів, клітин 5р Гострого лімфобластомного лейкозу, клітин гліоми та клітин пухлини оболонки сечовивідних органів. (2)
6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що інгібітор аденілсукцинатсинтетази вводять в організм хазяїна с дрібними дозами щоденно або шляхом тривалої інфузії.
7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що субстрат для внутрішньоклітинного продукування АМФ вводять в організм хазяїна після лікування згідно з другим етапом.
8. Спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в клітинах ссавців-хазяїв, про які відомо, що вони є метилтісзаденозинфосфорилаза-дефіцитними, який відрізняється тим, що складається з введення (Ф) терапевтично ефективної кількості інгібітора аденілсукцинатсинтетази в організм хазяїна, що звільнює ГІ метилтіосаденозинфосфорилаза-дефіцитні клітини хазяїна від аденозин 5'і-монофосфату.
9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що інгібітором аденілсукцинатсинтетази є І -аланозин. во
10. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що хазяїном є людина.
11. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що метилтісаденозинфосфорилаза-дефіцитні клітини хазяїна є клітинами немілкоклітинної карциноми легенів, клітинами гострого лімфобластомного лейкозу, клітинами гліоми.
12. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що інгібітор аденілсукцинатсинтетази вводять в організм хазяїна дрібними дозами щоденно або шляхом тривалої інфузії. 65
13. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що субстрат для внутрішньоклітинного вироблення АМФ вводиться в організм хазяїна після введення йому інгібітора аденілсукцинатсинтетази.
UA98105274A 1996-03-08 1997-01-27 Спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в метилтіоаденозинфосфорилаза-дефіцитних клітинах, спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в клітинах ссавців-хазяїв UA47465C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/612,542 US5840505A (en) 1993-12-29 1996-03-08 Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
PCT/US1997/001193 WO1997032994A1 (en) 1996-03-08 1997-01-27 Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity methylthioadenosine phosphorylase deficient cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA47465C2 true UA47465C2 (uk) 2002-07-15

Family

ID=24453611

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA98105274A UA47465C2 (uk) 1996-03-08 1997-01-27 Спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в метилтіоаденозинфосфорилаза-дефіцитних клітинах, спосіб гальмування активності аденілсукцинатсинтетази в клітинах ссавців-хазяїв

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5840505A (uk)
EP (1) EP0902839B1 (uk)
JP (1) JP2000509247A (uk)
KR (1) KR19990087627A (uk)
CN (1) CN1213406A (uk)
AT (1) ATE357223T1 (uk)
AU (1) AU722813B2 (uk)
BR (1) BR9708002A (uk)
CA (1) CA2244733A1 (uk)
CZ (1) CZ286698A3 (uk)
DE (1) DE69737499D1 (uk)
EA (1) EA001988B1 (uk)
HU (1) HUP9901858A3 (uk)
IL (1) IL126114A0 (uk)
NO (1) NO984124L (uk)
NZ (1) NZ331088A (uk)
PL (1) PL328810A1 (uk)
RO (1) RO118210B1 (uk)
UA (1) UA47465C2 (uk)
WO (1) WO1997032994A1 (uk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6911309B2 (en) * 1993-12-29 2005-06-28 The Regents Of The University Of Californnia Nucleic acids encoding MTAse
US6210917B1 (en) * 1993-12-29 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Method for suppressing multiple drug resistance in cancer cells
US6214571B1 (en) * 1993-12-29 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in malignant methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
WO2002081667A2 (en) * 2000-12-05 2002-10-17 Incyte Genomics, Inc. Ligases
US20040043959A1 (en) * 2002-03-04 2004-03-04 Bloom Laura A. Combination therapies for treating methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
AU2003261354A1 (en) * 2002-08-02 2004-02-23 The Regents Of The University Of California New uses for inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase
CA2516191A1 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Salmedix, Inc Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
WO2006023010A1 (en) * 2004-08-18 2006-03-02 Salmedix, Inc. Alanosine formulations and methods of use
WO2009014642A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-29 Amgen Inc. Combination of a de novo purine biosynthesis inhibitor and a cyclin dependent kinase inhibitor for the treatment of cancer
KR20190090824A (ko) * 2016-12-01 2019-08-02 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 암을 치료하는 방법
JP7016958B2 (ja) * 2017-12-21 2022-02-07 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム アデノシンおよび／またはメチルチオアデノシンの酵素媒介枯渇方法
CN110124038A (zh) * 2019-05-08 2019-08-16 山东大学齐鲁医院 腺苷酸琥珀酸合成酶基因和/或其编码的蛋白的新应用
WO2021260675A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Agents for sensitizing solid tumors to treatment

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4792520A (en) * 1984-02-16 1988-12-20 University Of Cincinnati Methods and kits for identifying mutagenic agents and molecular mutations in DNA in mammalian cells
US4822736A (en) * 1984-07-05 1989-04-18 Baylor College Of Medicine Amplification of adenosine deaminase genes in mammalian cells using adenosine, alanosine, uridine, and deoxycoformycin
US5118601A (en) * 1986-03-27 1992-06-02 The Regents Of The University Of California Method of screening purine nucleoside compounds or analogs for the ability to enhance the cellular synthesis and release of adenosine
US5030623A (en) * 1986-03-27 1991-07-09 The Regents Of The University Of California Methods for increasing extracellular adenosine and for stabilizing mast cells
WO1995018233A1 (en) * 1993-12-29 1995-07-06 The Regents Of The University Of California Method for detection of methylthioadenosine phosphorylase deficiency in mammalian cells

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9901858A3 (en) 1999-12-28
JP2000509247A (ja) 2000-07-25
CN1213406A (zh) 1999-04-07
CZ286698A3 (cs) 1999-03-17
EA001988B1 (ru) 2001-10-22
AU722813B2 (en) 2000-08-10
RO118210B1 (ro) 2003-03-28
ATE357223T1 (de) 2007-04-15
EP0902839B1 (en) 2007-03-21
DE69737499D1 (de) 2007-05-03
EP0902839A4 (en) 2004-06-30
BR9708002A (pt) 1999-07-27
HUP9901858A2 (hu) 1999-09-28
US5840505A (en) 1998-11-24
NO984124D0 (no) 1998-09-07
EA199800806A1 (ru) 1999-02-25
NO984124L (no) 1998-09-07
WO1997032994A1 (en) 1997-09-12
KR19990087627A (ko) 1999-12-27
IL126114A0 (en) 1999-05-09
AU1838897A (en) 1997-09-22
PL328810A1 (en) 1999-02-15
CA2244733A1 (en) 1997-09-12
EP0902839A1 (en) 1999-03-24
NZ331088A (en) 2000-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6472157B2 (en) Methods for detection of promoter polymorphism in a UGT gene promoter
Dottori et al. Cloning and characterization of EphA3 (Hek) gene promoter: DNA methylation regulates expression in hematopoietic tumor cells
AU736937B2 (en) Method for suppressing multiple drug resistance in cancer cells
US20040067234A1 (en) Isocitrate dehydrogenase and uses thereof
KR20240148940A (ko) Hsd17b13 변종 및 이것의 용도
PL181019B1 (pl) Składnik RNA ssaczej telomerazy i sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy
MX2008007650A (es) Metodo para diagnostico, pronostico y tratamiento de glioma.
EP3436601B1 (en) Cytidine deaminase expression level in cancer as a new therapeutic target
EP0902839B1 (en) Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
CN104126017A (zh) 对蛋白酶体抑制剂的反应的生物标记
CZ186996A3 (en) Method of selective provocation of methionine insufficiency for malignant cells of mammals
JP2015502137A (ja) Ｅ１酵素変異体およびその用途
Luss et al. Expression and detection of inducible nitric oxide synthase in experimental models of inflammation
US6214571B1 (en) Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in malignant methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
Horton et al. Reciprocal cross-resistance in human rhabdomyosarcomas selected in vivo for primary resistance to vincristine and L-phenylalanine mustard
Karp et al. Correlation of drug-perturbed marrow cell growth kinetics and intracellular 1-BD-arabinofuranosylcytosine metabolism with clinical response in adult acute myelogenous leukemia
Carmichael et al. Radiation sensitivity and study of glutathione and related enzymes in human colorectal cancer cell lines
Takizawa et al. In vitro sensitivity to platinum-derived drugs is associated with expression of thymidylate synthase and dihydropyrimidine dehydrogenase in human lung cancer
Valera et al. Drug-resistance in central nervous system tumors: from the traditional cell-resistance model to the genetically driven approaches on therapy
McCluskey Experimental determination of the optimal means of combining topotecan and (131 I) MIBG therapies for the treatment of neuroblastoma
HK1020201A (en) Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
Kato γ-H2AX foci and the measurement of variation in radiosensitivities of human and rodent cells
Johnson cDNA cloning and characterization of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene: An enzyme associated with 5-fluorouracil metabolism
WO1991010912A1 (en) Assay for inherited condition