CZ287725B6

CZ287725B6 - Medicament for thrombin inhibition and for suppressing treated disease or a state where thrombin inhibition is needful

Info

Publication number: CZ287725B6
Application number: CZ19943226A
Authority: CZ
Inventors: Daniel Jon Sall; Gerald Floyd Smith
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1993-12-21
Filing date: 1994-12-19
Publication date: 2001-01-17
Also published as: HUT71344A; ES2102154T3; US5441965A; UA29446C2; RU94045846A; NO944932D0; DE69402173D1; KR950016744A; AU8155894A; NZ270185A; CN1107704A; US5508292A; ZA9410084B; IL112048A0; JPH07223947A; ATE150308T1; NO313081B1; CZ322694A3; CN1078070C; EP0664126A1

Description

Léčivo pro inhibici trombinu a pro utlumení ošetřovaného onemocnění nebo stavu, kdy je potřebná inhibice trombinu

Oblast techniky

Vynález se týká použití dále specifikovaných sloučenin nebo jejich farmaceuticky přijatelný solí nebo solvátů k přípravě farmaceutického prostředku pro inhibici trombinu a k přípravě farmaceutického prostředku pro utlumení ošetřovaného onemocnění nebo stavu, kdy je potřebná inhibice trombinu.

Dosavadní stav techniky

Proces srážení krve, trombóza, se spouští složitou proteolytickou kaskádou vedoucí k vytváření trombinu. Trombin proteolyticky odstraňuje aktivaci peptidů v Aa- a Ββ-řetězců fibrinogenu, který je rozpustný v krevní plazmě, což podněcuje vytváření nerozpustného fibrinu.

Nesrážlivosti se běžně dosahuje podáváním heparinů a kumarinů. Parenterální farmakologické ovládání srážení a trombózy je založeno na inhibici trombinu použitím heparinů. Hepariny působí na trombin nepřímo urychlováním inhibičního účinku endogenního antitrombinu III (hlavního fyziologického inhibitoru trombinu). Jelikož hladina antitrombinu III se v plazmě mění, a protože trombin, vázaný na povrch, se jeví jako rezistentní vůči tomuto nepřímému mechanismu, mohou být hepariny neúčinným lékem. Jelikož se má zato, že zkoušky srážlivosti jsou spojeny s účinností a bezpečností, musí být hladiny heparinu sledovány zkouškami srážlivosti (zejména zkouškou parciální doby aktivovaného tromboplastinu (APTT)). Kumariny zabraňují vzniku trombinu blokováním posttranslační gamma-karboxylace v syntéze protrombinu a jiných proteinů tohoto typu. Vzhledem kjejich mechanismu působení, se může účinek kumarinů vyvíjet jen pomalu, 6 až 24 hodin po podání. Kromě toho nejsou selektivními protisrážlivými látkami. Kumariny vyžadují také sledování zkouškami srážlivosti (zejména zkouškou doby protrombinu).

Tento vynález je založen na zjištění, že sloučeniny podle vynálezu, dále definované, jsou inhibitory trombinu, jež mají orální biologickou dostupnost.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití benzothiofenu obecného vzorce I

(I) ve kterém

R¹ a R³ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, methyl nebo skupinu vzorce

-1 CZ 287725 B6

O O

II II

-C-(Ci-C₆alkyl) nebo -C-Ar, kde Ar znamená fenyl nebo fenylovou skupinu substituovanou jednou nebo dvakrát alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupinou, atomem chloru, atomem fluoru nebo tri(chlor nebo fluor)methylovou skupinou,

R² je vybrán ze souboru sestávajícího z pyrrolidinoskupiny a piperidinoskupiny, nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu k přípravě farmaceutického prostředku pro inhibici trombinu.

Předmětem tohoto vynálezu také je použití výše vymezeného benzothiofenu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu k přípravě farmaceutického prostředku pro utlumení ošetřovaného onemocnění nebo stavu, kdy je potřebná inhibice trombinu.

Při výhodném provedení se používá uvedená sloučenina ve formě své hydrochloridové soli.

Jiné výhodné provedení spočívá v použití uvedené sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu k přípravě profylaktického farmaceutického prostředku pro inhibici trombinu nebo k přípravě farmaceutického prostředku pro utlumení ošetřovaného onemocnění nebo stavu, kdy je potřebná inhibice trombinu.

Účelně se jako benzothiofen používá sloučenina vzorce

nebo její hydrochloridová sůl.

Předmětný vynález je založen na zjištění, že vybrané deriváty 2-fenyl-3-aroylbenzothiofenu (benzothiofeny) obecného vzorce I jsou užitečné pro inhibici trombinu. Sloučenin obecného vzorce I se používá jakožto antikoagulantů pro profylaxi a pro ošetřování tromboembolických onemocnění, jako jsou trombóza žil, plicní embolie, arteriální trombóza, zvláště ischemie myokardu, infarkt myokardu, mozková trombóza, stavy obecné hyperkoagulace a stavy místní hyperkoagulace, jako po angioplastice a po operacích koronárního bypassu a při obecném poškození tkání, například v závislosti na zánětlivých procesech. Podle vynálezu se lidem nebo dalším savcům, kteří takové ošetření potřebují, podává dávka vybraného derivátu 2-fenyl-3aroylbenzothiofenu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky vhodných solí nebo solvátů, účinná k inhibici trombinu nebo s ním souvisejících nemocí a stavů.

Výraz „inhibice“ zde má obecně známý význam a zahrnuje předcházení, bránění, zpomalování, zastavení nebo zvrat postupu nebo závažnosti symptomů. Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou užitečné jak pro terapeutické, tak pro profylaktické ošetřování.

-2CZ 287725 B6

Raloxifen je sloučeninou obecného vzorce I, kde znamená R¹ a R³ vždy atom vodíku a R²1-piperidinylovou skupinu, ve formě hydrochloridové soli.

Obecně se sloučeniny zpracovávají s běžnými excipienty, ředidly nebo nosiči a lisují se na tablety nebo se zpracovávají na elixíry nebo roztoky pro běžné orální podání nebo pro intramuskulámí nebo intravenózní podání. Sloučeniny obecného vzorce I se také mohou podávat transdermálně a mohou se formulovat na farmaceutické prostředky s prodlouženým uvolňováním.

Deriváty 2-fenyl-3-aroylbenzothiofenu obecného vzorce I se mohou připravovat o sobě známými způsoby nebo způsoby podrobně popsanými v amerických patentových spisech číslo 4 133814,4 418068 a 4 380635. Obecně se vychází z benzo[b]thiofenu majícího v poloze 6 hydroxylovou skupinu a 2-(4-hydroxyfenyl)ovou skupinu. Do výchozí látky se zavádí chránící skupina, sloučenina se alkyluje, chránící skupina se odstraní za získání sloučeniny obecného vzorce I. Příklady způsobu přípravy takových sloučenin jsou popsány ve shora uvedených amerických patentových spisech. Jakožto substituovaná fenylová skupina se uvádějí fenylová skupina substituovaná jedním nebo dvěma substituenty ze souboru zahrnujícího alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupinu, nitroskupinu, atom chloru nebo fluoru nebo trichlormethylovou nebo trifluormethylovou skupinu.

Deriváty 2-fenyl-3-aroylbenzothiofenu (benzothiofeny) obecného vzorce I, používané podle vynálezu, vytvářejí farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinou nebo se zásadou s nejrůznějšími anorganickými a organickými kyselinami a zásadami a vynález se tedy také týká fyziologicky vhodných solí, běžně používaných ve farmaceutickém průmyslu.

Jakožto příklady farmaceuticky vhodných minerálních kyselin, použitelných pro přípravu farmaceuticky vhodných solí, se uvádějí příkladně kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, dusičná, fosforečná, fosfomá a sírová. Může se také používat solí odvozených od organických kyselin, jako jsou například alifatické monokarboxylové a dikarboxylové kyseliny, fenylovou skupinou substituované alkanové kyseliny, hydroxyalkanové a hydroxyalkandiové kyseliny, aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny.

Jakožto takové farmaceuticky vhodné soli, připravené za použití minerálních nebo organických kyselin, se uvádějí příkladně acetát, fenylacetát, trifluoracetát, akrylát, askorbát, benzoát, chlorbenzoát, methylbenzoát, methoxybenzoát, dinitrobenzoát, hydroxybenzoát, o-acetoxybenzoát, naftalen-2-benzoát, bromid, isobutyrát, fenylbutyrát, β-hydroxybutyrát, butin-1,4dioát, hexin-l,6-dioát, kaprát, kaprylát, chlorid, cinnamát, citrát, formát, fumarát, glykolát, heptanoát, hippurát, laktát, malát, maleát, hydroxymaleát, malonát, mandelát, mesylát, nikotinát, isonikotinát, nitrát, oxalát, ftalát, tereftalát, fosfát, monohydrogenfosfát, dihydrogenfosfát, metafosfát, pyrofosfát, propiolát, propionát, fenylpropionát, salicylát, sebakát, sukcinát, suberát, sulfát, hydrogensulfát, pyrosulfát, sulfit, hydrogensulfit, sulfonát, benzensulfonát, p-bromfenylsulfonát, chlorbenzensulfonát, ethansulfonát, 2-hydroxyethansulfonát, methansulfonát, naftalen-l-sulfonát, naftalen-2-sulfonát, p-toluensulfonát, xylensulfonát a tartrát. Výhodnou je hydrochloridová sůl.

Farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinou se zpravidla připravují reakcí sloučeniny obecného vzorce I s ekvimolámím nebo s nadbytečným množstvím kyseliny. Reakční složky se zpravidla mísí v rozpouštědle obou složek, jako jsou diethylether nebo benzen. Soli se zpravidla vysrážejí z roztoku v průběhu jedné hodiny až deseti dnů a mohou se izolovat filtrací nebo se rozpouštědlo může odehnat o sobě známými způsoby.

Jakožto zásady, používané pro přípravu adičních solí se zásadami, se uvádějí příkladně hydroxid amonný a hydroxidy, uhličitany a hydrogenuhličitany alkalických kovů a kovů alkalických zemin, jakož také alifatické a primární, sekundární a terciární aminy, alifatické diaminy

-3CZ 287725 B6 a hydroxyalkylaminy. Jakožto obzvláště vhodné zásady pro přípravu adičních solí se zásadou se uvádějí hydroxid amonný, uhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný, hydroxid vápenatý, methylamin, diethylamin, ethylendiamin, cyklohexylamin a ethanolamin.

Farmaceuticky vhodné adiční soli mají obecně zlepšenou rozpustnost ve srovnání se sloučeninou, od které jsou odvozeny a proto se jich s výhodou používá pro přípravu kapalin nebo emulzí.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se připravují o sobě známými způsoby. Například se sloučeniny obecného vzorce I mohou zpracovávat s běžnými excipienty, ředidly nebo nosiči na formu tablet, pilulek, kapslí, suspenzí a prášků.

Jakožto příklady vhodných nosičů, excipientů a ředidel se uvádějí plnidla a nastavovače, jako jsou škrob, cukry, mannitol a deriváty kyseliny křemičité; pojidla, jako jsou karboxymethylcelulóza a jiné deriváty celulózy, algináty, želatina a polyvinylpyrrolidon; zvlhčovadla, jako je glycerol; rozptylovací přísady, jako je uhličitan vápenatý a hydrogenuhličitan sodný; činidla, zpomalující rozpouštění, jako je parafin; činidla uiychlující resorpci, jako jsou kvartemí amoniové sloučeniny; povrchově aktivní činidla, jako je cetylalkohol, glycerolmonostearát; adsorpční nosiče, jako jsou kaolin a bentonit; a mazadla, jako je mastek, stearát vápenatý a hořečnatý a pevné polyethylenglykoly.

Sloučeniny obecného vzorce I se také mohou zpracovávat na elixíry a roztoky pro běžné orální podání nebo na roztoky vhodné pro parenterální podání, například intramuskulámí, subkutánní nebo intravenózní cestou. Kromě toho jsou sloučeniny obecného vzorce I velmi vhodné pro přípravu farmaceutických prostředků s pozdrženým uvolňováním účinné látky. Farmaceutické prostředky se mohou připravovat také tak, aby uvolňovaly účinnou látku pouze nebo výhodně v určité části zažívacího traktu, podle možnosti po určitou dobu. Povlaky, obaly a chránící matrice se mohou připravovat například z polymemích látek nebo z vosků.

Určitá dávka podávané sloučeniny obecného vzorce I, potřebná pro inhibici trombinu v odpovídajících nemocech a stavech, závisí na závažnosti stavu, na cestě podání a na podobných skutečnostech a stanovuje ji lékař. Zpravidla je denní dávka účinné látky přibližně 0,1 až přibližně 1000 mg/den a především přibližně 50 až přibližně 200 mg/den. Taková dávka se podává najednou nebo ve třech denních dávkách nebo i častěji podle potřeby efektivního ošetření.

Obecně je výhodné podávat sloučeninu obecného vzorce I ve formě adiční soli s kyselinou, jak je běžné pro sloučeniny, které mají zásaditou skupinu, například piperidinový kruh. Je výhodné podávat sloučeninu obecného vzorce I orální cestou. Pro takové účely jsou vhodné následující farmaceutické prostředky. Účinnou látkou se vždy myslí sloučenina obecného vzorce I.

Příklady provedení

Příklad farmaceutického prostředku 1 - želatinová kapsle

Tvrdé želatinové kapsle se připravují z následujících složek:

	Množství (mg/kapsle)
účinná látka	0,1 až 1000
škrob, NF	0 až 650
škrob, rozplývavý prášek	0 až 650
silikonová kapalina 350 mPas	0ažl5

-4CZ 287725 B6

Uvedené složky se smísí, vedou se sítem No.45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a plní se do tvrdých želatinových kapslí.

Jakožto příklady určitých farmaceutických prostředků ve formě kapslí se uvádějí prostředky obsahující účinnou látku obecného vzorce I, kde znamená R² piperidinoskupinu a R¹ a R³ atom vodíku (raloxifen). Takové kapsle mají následující složení:

Příklad farmaceutického prostředku 2 - raloxifenová kapsle

	Množství (mg/kapsle)
raloxifen	1,0
škrob, NF	112,0
škrob, rozplývavý prášek	225,3
silikonová kapalina 350 mPas	1,7

Příklad farmaceutického prostředku 3 - raloxifenová kapsle

	Množství (mg/kapsle)
raloxifen	5,0
škrob, NF	108,0
škrob, rozplývavý prášek	225,3
silikonová kapalina 350 mPas	1,7

Příklad farmaceutického prostředku 4 - raloxifenová kapsle

	Množství (mg/kapsle)
raloxifen	10,0
škrob, NF	103,0
škrob, rozplývavý prášek	225,3
silikonová kapalina 350 mPas	1,7

Příklad farmaceutického prostředku 5 - raloxifenová kapsle

	Množství (mg/kapsle)
raloxifen	50,0
škrob, NF	150,0
škrob, rozplývavý prášek	397,0
silikonová kapalina 350 mPas	3,0

Určité složení takových farmaceutických prostředků se může měnit podle účelu použití.

-5CZ 287725 B6

Příklad farmaceutického prostředku 6 - tablety

Tablety se připravují z následujících složek:

	Množství (mg/kapsle)
účinná látka	0,1 až 1000
celulóza, mikrokiystalická	0 až 650
oxid křemičitý, sublimovaný	0 až 650
kyselina stearová	0 až 15

Uvedené složky se smísí a lisují se o sobě známým způsobem na tablety.

Příklad farmaceutického prostředku 7 - tablety

Tablety, obsahující vždy 0,1 až 1000 mg účinné látky obecného vzorce I se také mohou připravovat následujícím způsobem:

	Množství (mg/tableta)
účinná látka	0,1 až 1000
škrob	45,0
celulóza, mikrokrystalická	35,0
polyvinylpyrrolidon (10% roztok ve vodě)	4,0
natriumkarboxymethylovaný škrob	4,5
stearát hořečnatý	0,5
mastek	1,0

Účinná látka, škrob a celulóza se vedou sítem No. 45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a důkladně se promísí. Se získaným práškem se smísí roztok polyvinylpyrrolidonu a směs se vede sítem No. 14 mesh U.S. (průměr ok 1400 mikrometrů). Takto získané granule se suší při teplotě 50 až 60 °C, vedou sítem No. 18 mesh U.S. (průměr ok 1000 mikrometrů). Natriumkarboxymethylovaný škrob, stearát hořečnatý a mastek se vedou sítem No. 60 mesh U.S.

(průměr ok 250 mikrometrů), přidají se do granulí, promísí se a směs se lisuje na tablety.

Příklad farmaceutického prostředku 8 - suspenze

Suspenze obsahující vždy 0, až 1000 mg účinné látky obecného vzorce I na 5ml dávku se připravuje následujícím způsobem:

účinná látka	0,1 až 1000 mg
natriumkarboxymethylcelulóza	50,00 mg
sirup	1,25 mg
roztok kyseliny benzoové	0,10 ml
chuťová přísada	q.v
barvivo	q.v.
čištěná voda do	5,0 ml

Účinná látka se vede sítem No. 45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a smísí se 30 s natriumkarboxymethylcelulózou a sirupem za vzniku hladké pasty. Přidá se za míchání roztok kyseliny benzoové, chuťové přísady a barviva, zředěné trochou vody. Pak se přidá dostatečné množství vody k dosažení požadovaného objemu.

-6CZ 287725 B6

V jednom ohledu poskytuje vynález způsob inhibice trombinu u savců, spočívající v podávání účinné (trombin inhibující) dávky sloučeniny obecného vzorce I savcům, kteří takové ošetření potřebují.

Inhibice, trombinu zprostředkovaná tímto postupem, zahrnuje medikální terapeutické a/nebo profylaktické ošetření podle potřeby.

Vynález se také týká léčení stavů u lidí i zvířat, kde se vyžaduje inhibice trombinu. Sloučeniny podle vynálezu jsou považovány za účinné u živočichů, včetně lidí při ošetřování a profylaxi trombózy a nadměrné srážlivosti krve ve tkáních. Sloučeniny obecného vzorce I jsou potenciálně účinné při terapeutickém nebo profylaktickém ošetřování trombózy a nadměrné srážlivosti krve ve tkáních. Mezi stavy onemocnění, pro něž mají sloučeniny podle vynález potenciální užitečnost, patří trombóza žil a plicní embolie, arteriální trombóza, jako je ischemie myokardu, infarkt myokardu, nestálá angína, mrtvice na základě trombózy a trombóza periferních arterií. Dále mají sloučeniny očekávanou užitečnost v ošetřování nebo profylaxi atherosklerotických onemocnění, jako je onemocnění koronárních arterií, cerebrálních arterií a periferálních arterií. Dále se očekává, že sloučeniny budou užitečné spolu s trombolytiky pří infarktu myokardu. Dále se předpokládá, že se sloučeniny podle vynálezu budou hodit k profylaxi kreokluzi po trombolýze, při podkožní transluminámí angioplastice (PTCA) a při koronárních obtokových operacích. Dále se očekává užitečnost sloučenin podle vynálezu při prevenci retrombózy po mikrochirurgii. Dále se očekává užitečnost sloučenin při protisrážlivém ošetřování ve spojení s umělými orgány a srdečními chlopněmi. Dále se očekává užitečnost sloučenin při protisrážlivém ošetřování u hemodialýzy a u roztroušené intravaskulámí koagulace. Další očekávaná užitečnost sloučenin je při proplachování katetrů a mechanických zařízení používaných u pacientů in vivo a jako protisrážlivých činidel k uchovávání krve, plasmy a jiných krevních produktů in vitro. Ještě dále se očekává užitečnost sloučenin u jiných potíží, kde srážení krve by mohlo být základním přispívajícím procesem nebo zdrojem sekundární patologie, jako u rakoviny včetně metastáz, zánětlivých onemocnění, včetně arthritidy a diabetes. Protisrážlivá sloučenina se podává orálně, parenterálně, například intravenózní infuzí (iv), intramuskulámími injekcemi (im) nebo subkutánně (sc).

Způsobu podle vynálezu se používá také ve spojení s činidly rozrušujícími sraženinu, například s aktivátorem tkáňového plasminogenu (tPA), s modifikovaným tPA, se streptokínázou nebo s urokinázou. V případech, kdy vznikne v tepně sraženina a tepna nebo žíla je ucpána, ať částečně, nebo úplně, používá se činidel rozrušujících sraženinu. Sloučenina podle vynálezu může být podávána před nebo spolu s rozrušujícím činidlem nebo následně po jeho podání samotného nebo spolu s činidlem rozrušujícím sraženinu a dále je výhodné její podávání spolu s aspirinem k prevenci nového vytváření sraženiny.

Způsob podle vynálezu se také praktikuje ve spojení s receptorovým antagonistem destičkového glykoproteinu lib až lila, který zabraňuje shlukování destiček. Sloučenina podle vynálezu může být podávána před, nebo spolu s receptorovým antagonistem destičkového glykoproteinu lib až lila, nebo následně po jeho použití k prevenci výskytu nebo nového vytváření sraženiny.

Způsob podle vynálezu se také praktikuje ve spojení s aspirinem. Sloučenina podle vynálezu může být podávána před nebo spolu s aspirinem nebo následně po jeho použití k prevenci výskytu nebo nového vytváření sraženiny. Jak bylo shora uvedeno, podává se sloučenina podle vynálezu s výhodou ve spojení s činidlem rozrušujícím sraženinu a aspirinem.

Schopnost sloučenin podle vynálezu účinně inhibovat trombin se vyhodnocuje jedním nebo několika následujícími testy.

-7CZ 287725 B6

Testy účinnosti

Sloučenina podle vynálezu (vzorce I) zabraňuje působení trombinu u savců. Inhibice trombinu může být demonstrována inhibicí amidázové aktivity trombinu in vitro při měření testem, při kterém trombin hydrolyzuje chromogenický substrát,

N-benzoyl-D-fenylalanyl-L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilid,

N-benzoyl-D-Phe-L-Val-L-Arg-p-nitroanilid.

Test se provádí smísením 50 μΐ pufru (0,03 Tris, 0,15M chloridu sodného, pH7,4) s 25 μΐ roztoku lidského trombinu (vyčištěný lidský trombin, Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana při 8 jednotkách NIH/ml) a 25 μΐ zkoušené sloučeniny v roztoku (50 % vody a 50% methanolu (viv). Pak se přidá 150 μΐ vodného roztoku chromogenické látky (při 0,25 mg/ml) a měří se rychlosti hydrolýzy látky sledováním reakcí při 405 nm na uvolňování nitroanilinu. Standardní křivky se zkonstruují vynesením koncentrací volného trombinu v závislosti na rychlosti hydrolýzy. Rychlosti hydrolýzy, pozorované u zkoušených sloučenin, se pak převedou na hodnoty „volného trombinu“ v příslušných testech pomocí standardních křivek. Vázaný trombin (vázaný na zkoušenou sloučeninu) se vypočte odečtením množství pozorovaného trombinu v každém testu od známého počátečního množství trombinu použitého v testu. Množství volného inhibitoru v každém testu se vypočte odečtením počtu molů vázaného trombinu od počtu molů přidaného inhibitoru (zkoušení sloučeniny).

Hodnota Kass je hypotetická rovnovážná konstanta pro reakci mezi trombinem a zkoušenou sloučeninou (I)

------------->

Trombin +1 Trombin -1 <-----------[Trombin -1]

Kass = --------------[(Trombin) x (I)]

Kass se vypočte pro řadu koncentrací zkoušených sloučenin a střední hodnota se udává v jednotkách litr na mol.

V podstatě stejným postupem, jak shora popsáno pro lidský trombin, a při použití jiných serinproteázových systémů koagulace lidské krve, se vhodnými, dále popsanými chromogenickými substráty zjišťuje selektivita sloučenin podle vynálezu se zřetelem na faktoru srážlivosti serinových proteáz.

Lidské faktory Xa, IXa, Xla a Xlla jsou obchodním produktem společnosti Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana, lidská urokináza je obchodním produktem společnosti Leo Pharmaceutical, Dánsko, a rekombinantně aktivovaný Protein C (aPC) připravuje společnost Eli Lilly a Co. v podstatě podle amerického patentového spisu číslo 4 981952. Chromogenní látky: N-benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (pro faktor Xa), N-Cbz-D-Arg-Gly-Arg-pnitroanilid (pro test faktoru IXa jako substrát faktoru Xa), pyroglutamyl-Pro-Arg-p-nitroanilid (pro faktor Xla a pro aPC), H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid (pro faktor Xlla), a pyroglutamylGly-Arg-p-nitroanilid (pro urokinázu) jsou obchodními produkty společnosti KabiVitrum, Stockholm, Švédsko, nebo společnosti Midwest Biotech, Fishers, Indiana. Hovězí trypsin je obchodním produktem společnosti Worthington Biochemicals, Freehold, New Jersey, a lidská plazma kallikrein je obchodním produktem společnosti KabiVitrum, Stockholm, Švédsko. Chromogenní substrát H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid pro plazmový kallikrein je obchodním

-8CZ 287725 B6 produktem společnosti KabiVitrum; Stockholm, Švédsko. N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-pnitroanilid, substrát pro trombin a pro trypsin se syntetizují způsobem popsaným shora pro sloučeniny podle vynálezu za použití známých způsobů kopulace peptidů z obchodně dostupných reagencií.

Lidský plazmin je obchodním produktem společnosti Boehringer Mannheim, Indianopolis, Indiana, nt-PA jako reference aktivity s jedním řetězcem je obchodním produktem společnosti Američan Diagnostica, Greenwich, Connecticut, modifikovaný t-PA6 (mt-PA6) připravuje společnost Eli Lilly o sobě známým způsobem (Burk a kol., J. Biol. Chem, 265, str. 5120 až 5177, 1990). Plazminový chromogenní substrát H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid a tkáňový plazmidový aktivátor (t-PA) H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid jsou obchodními produkty společnosti KabiVitrum, Stockholm, Švédsko.

V popsaných chromogenních substrátech je použito třípísmenných symbolů Ile, Glu, Gly, Pro, Arg, Phe, Val, Leu a Lys k vyznačení odpovídajících aminokyselinových skupin isoleucinu, kyseliny glutamové, glycinu, prolinu, argininu, phenylalaninu, valinu, leucinu a lysinu.

Inhibitory trombinu by měly s výhodou zabraňovat fibrinolýze vyvolané urokinázou, tkáňovým aktivátorem plazminogenu (t-PA) a streptokinázou. To by bylo významné pro terapeutické použití takových činidel jako adjunktů ke streptokinázové, t-Pa nebo urokinázové trombolytické terapii a k použití takových činidel jako endogenních fibrinolýze zabraňujících (vzhledem k t-PA a urokináze) antitrombotických činidel. Kromě toho může být studována chybějící interference s působením amidázy fibrinolytických proteáz jako fibrinolýze zabraňujících systémů pomocí sraženin lidské krve a jejich rozrušování příslušnými fibrinolytickými aktivátory plazminogenu.

Materiály

Psí plazma se získá ze psů záměrně různých ras jakéhokoli pohlaví (Hazelton-LRE, Kalamazoo, Michigan, USA) venipunkturou do 3,8% citrátu. Fibrinogen se připraví z čerstvé psí plazmy a lidský fibrinogen se připraví z lidské krve ACD při frakci 1-2 shora uvedeným způsobem a podle uvedených specifikací (Smith, Biochem. J. 185, str. 1 až 11, 1980; a Smith a kol. Biochemistry, 11 str. 2958 až 2967, 1972). Lidský fibrinogen (98% čistý, prostý plazminu) je obchodním produktem společnosti Američan Diagnostica, Greenwich, Connectitut. Radiologické značení preparátů fibrinogenu 1-2 se provede shora popsaným způsobem (Smith a kol. Biochemistry, 11 str. 2958 až 2967, 1972). Urokinázaje obchodním produktem společnosti Leo Pharmaceuticals, Denmark ve formě 2200 jednotek na fiolu. Streptokináza je obchodním produktem společnosti Hoechst-Roussel Pharmaceuticals, Somerville, New Jersey.

Způsoby - Účinek lysinu na sraženiny lidské krve působením t-PA

Ve zkušebních mikrozkumavkách se vytvoří sraženiny lidské krve přidáním 50 μΐ trombinu (73 NIH jednotek na ml) do 100 μΐ lidské plasmy, která obsahuje 0,0229 uCi fibrinogenu značeného izotopem jodu 125. Studuje se narušení sraženiny překiytím sraženin 50 μΐ urokinázy nebo streptokinázy (50, 100 nebo 1000 jednotek na ml) a inkubací po dobu 20 hodin při teplotě místnosti. Po inkubaci se zkumavky odstředí na Beckmanově mikroodstředivce. 25 μΐ supematantu se přidá do 1,0 ml pufru 0,03 M tris/0,15 M chloridu sodného k čítání gama pulzů. Získá se 100% narušení s vypuštěním trombinu (a substituujícího pufru). Inhibitory trombinu se vyhodnotí z hlediska možné interference s fíbrinolýzou začleněním sloučenin do překrývajících roztoků při koncentraci 1,5 a ΙΟμΙ/ml. Hrubá aproximace hodnot IC₅₀ se stanovení lineární extrapolací z dat na hodnotu, která by představovala 50% narušení pro příslušnou koncentraci fibrinolytického činidla.

-9CZ 287725 B6

Protisrážlivá aktivita

Materiály

Psí a krysí plazma se získá ze psů záměrně smíšených ras jakéhokoli pohlaví (Hazelton-LRE, Kalamazoo, Michigan, USA) a z anesteziovaných krysích samečků Sprague-Dawley (Harlan Sprague-Dawley, lne. Indianopolis, Indiana, USA) venipunkturou do 3,8% citrátu. Fibrinogen se připraví ze současné lidské krve ACO při frakci 1-2 shora uvedeným postupem a podle uvedených specifikací (Smith, Biochem. J. 185, str. 1 až 11, 1980); a Smith a kol. Biochemistry, 11 str. 2958 až 2967, 1972). Lidský fibrinogen ve formě 98% Čistého, plazminu prostého preparátu je také obchodním produktem společnosti Američan Diagnostica, Greenwich, Connecticut. Koagulační činidla ACTIN, Tromboplastin a lidská plazma jsou obchodními produkty společnosti Baxter Healthcare Corp., Dade Division, Miami, Florida. Ke zkouškám srážlivosti v plazmě se použije hovězí trombin, který je obchodním produktem společnosti Parke-Davis (Ann Detroit, Michigan).

Způsoby

Stanovení protisrážlivosti

Zkoušky srážlivosti se provedou shora popsaným způsobem (Smith a kol., Thrombosis Research, 50, str. 163 až 174 1988). Pro všechna měření srážlivosti se použije přístroj CoAScrenner (Američan Labor, lne.) Doba protrombinu (PT) se měří přidáním 0,05 ml solanky a 0,05 činidla Tromboplastin-C do 0,05 ml zkoušené plazmy. Parciální doba aktivovaného tromboplastinu (APTT) se měří inkubací 0,05 ml zkoušené plazmy s 0,05 ml reakčního činidla Actin po dobu 120 sekund s následným přidáním 0,05 ml chloridu vápenatého (0,02M). Doba trombinu (TT) se měří přidáním 0,05 ml solanky a 0,05 ml trombinu (10 NIH jednotek/ml) do 0,05 ml zkoušené plazmy. Sloučeniny obecného vzorce I se přidají do lidské nebo zvířecí plazmy v širokém oboru koncentrací ke zjištění prolongačních účinků na APTT, PT a TT. Ke zjištění potřebných koncentrací ke zdvojnásobení doby srážení při každé zkoušce se provede lineární extrapolace.

Zvířata

Krysí samci Sprague-Dawley (o hmotnosti 350 až 425 g, Harlan Sprague-Dawley, lne. Indianopolis, Indiana, USA) se anestezují xylazinem (20 mg/kg s.c.) a ketaminem (120mg/kg) a udržují se na vytápěném vodním polštáři (37 °C). K infúzím se kanyluje jugulámí céva.

Arteriovenózní obtokový model

Levá jugulámí céva a pravá karotidní tepna se kanylují v délce 20 cm polyethylenovými trubičkami PE 60. Šest cm dlouhá středová část větší trubičky (PE 190) s bavlněným vláknem (5 cm) v lumenu je třecím způsobem upevněna mezi delšími úseky k vytvoření úplného arteriovenózního obtoku. Krev se nechá cirkulovat obtokem 15 minut, než se vlákno opatrně vyjme a zváží. Hmotnost vlákna se odečte od celkové hmotnosti vlákna a trombu (J. R. Smith, Br. J. Pharmacol, ΊΊ, str. 29,1982).

Model narušení tepny chloridem železitým

Karotidní arterie se izolují osovou ventrální tepennou incisí. Pod každou tepnu se vloží termočlánek a teplota cévy se sleduje průběžně na páskovém zapisovači. Podélně rozříznutá manžeta trubičky (vnitřní průměr 0,058 x vnější průměr 0,077 x4 mm) se umístí kolem každé karotidní arterie přímo nad termočlánek. Hexahydrát chloridu železitého se rozpustí ve vodě a koncentrace (20%) se vyjádří v procentech okamžité hmotnosti samotného chloridu železitého. K narušení tepny a vyvolání trombózy se pipetou zavede 2,85 μΐ do manžety ke smočení tepny

-10CZ 287725 B6 nad termočlánkovou sondou. Tepenná okluze se projeví náhlým poklesem teploty. Doba do okluze se měří v minutách a představuje časový úsek mezi aplikací chloridu železitého a náhlým poklesem teploty cévy. (K. D. Kurz, Thromb. Res. 60, str. 269, 1990).

Model spontánní trombolýzy

Údaje zjištěné in vitro naznačují, že peptidové inhibitory trombinu zabraňují vzniku trombinu a jiných serinových proteáz, jako je plazmin a plazminogenní aktivátor tkáně. K posouzení, zda sloučeniny zabraňují fíbrinolýze in vitro se zjišťuje rychlost spontánní trombolýzy implantováním značené celé krevní sraženiny do plicního oběhu. Krysí krev (1 ml) se smísí rychle s hovězím trombinem (4IU, Parke Davis) a s izotopem ¹²⁵jodu značeným lidským fíbrinogenem (5 pCi, ICN), bezprostředně vpuštěným do silastikové trubičky a inkubovaným 1 hodinu při 37 °C. Vystárlý trombus se z trubičky vyjme, rozkrájí se na 1 cm dlouhé úseky, promyje se třikrát normální solankou a každý úsek se podrobí čítání pulzů na čítači gama-záření. Úsek se známým počtem pulzů se vtáhne do katetru, který se pak implantuje do jugulámí cévy. Špička katetru se zavede do sousedství pravé předkomory a usazenina se vypudí, aby veplula do plicního oběhu. Jednu hodinu po implantaci se srdce a plíce vyhodnotí a separátně vypočtou. Trombolýza je vyjádřena jako procento, kde (injektovaný cpm - plicní cpm) x 100 % trombolýzy = ----------------------------injektovaný cpm

Fibrinolytické rozpouštění implantované sraženiny probíhá v závislosti na čase (J. P. Clozel, Cardiovas. Pharmacol. 12, str. 520,1988).

Parametry sráživosti

Fibrometrem se měří čas plasmového trombinu (TT) a parciální doba aktivovaného tromboplastinu (APTT). Krev se navzorkuje zjugulámího katetru a shromáždí se v injekční stříkačce obsahující citrát sodný (3,8 %, 1 díl ku 9 dílům krve). Ke změření TT se smísí krysí plazma (0,1 ml) se solankou (0,1 ml) a hovězím trombinem (0,1 ml, 30 U/ml v TRIS-pufru, Prke Davis) při 37 °C. Pro APTT se inkubuje plazma (0,1 ml) a roztok APTT (0,2 ml, Organon Teknika) 5 minut (37 °C) a k započetí srážení se přidá chlorid vápenatý (0,025M). Zkoušky se provádějí dvojmo a zprůměrují se.

Index biologické dostupnosti

K měření bioaktivity slouží čas plazmového trombinu (TT) jako náhrada za test mateční sloučeniny za předpokladu, že přírůstky TT vyplynuly z inhibice trombinu pouze mateční sloučeninou. Uběhlá doba účinku inhibitoru trombinu na TT se zjistí po intravenózním podání léku anestetizovaným krysám a po orálním ošetření živých upoutaných krys. Vzhledem k omezenému objemu krve a vzhledem k počtu bodů nutných ke stanovení časového průběhu od doby ošetření do doby, kdy se odezva vrátí do hodnot před ošetřením, se použije dvou populací krys. Každý vzorek populace představuje střídavé následné časové úseky. K výpočtu se použije plocha pod křivkou (AUC) závislosti průměrné TT na čase.

Index biologické dostupnosti se vypočte podle následujícího vzorce a vyjádří se v procentech relativní aktivity.

-11 CZ 287725 B6

Zjistí se plocha pod křivkou (AUC) průběhu plazmového TT a ustaví se pro dávku. Tento index biologické dostupnosti se nazývá „procento relativní aktivity“ a vypočte se jako

AUC po Dávka iv % relativní aktivity =--------- x ---------- x 100

AUC iv Dávka po

Sloučeniny

Roztoky sloučenin se připravují denně čerstvé v normální solance a injektují se jako lék nebo se dávkují infuzí se započetím 15 minut předem a pokračuje se po celou dobu pokusu. Objem injekce léku je 1 ml/kg pro i.v. a 5 ml/kg pro p.o. a infuzní objem je 3 ml/h.

Statistika

Výsledky se vyjadřují jako průměry ± SEM. Ke zjištění statisticky významných rozdílů se použije jednocestné analýzy kolísání a Dunnettova testu se použije ke zjištění, který průměr je odlišný. Úroveň významnosti pro zamítnutí nulové hypotézy stejných průměrů je P<0,05.

Zvířata

Psí samci (Beagle, 18 měsíců až 2—letí, hmotnost 12 až 13 kg, Marshall Farms, North Rose, New York 14516) se přes noc uvážou a krmí se certifíkovanou předepsanou dietou Purina (Purina Mills, St. Louis, Missouri) 240 minut po dávkování. Voda je k dispozici podle libosti. Teplota místnosti se udržuje 18,9 až 23,3 °C, relativní vlhkost 45 až 50 % a osvětlení od 6,00 do 18,00 hodin.

Farmakokinetický model

Zkoušená sloučenina se připravuje bezprostředně před dávkováním rozpuštěním ve sterilní 0,9% solance k získání prostředku s 5 mg/ml. Psům se dává jediná orální dávka zkoušené sloučeniny 2 mg/kg. Vzorky krve se odebírají z cefalické cévy po 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4 a 6 hodinách po dávkování. Vzorky se sbírají do citrátových trubic Vacutainer a udržují se v ledu před převedením na plazmu odstředěním. Vzorky plazmy se derivatizují dinitrofenylhydrazinem a analyzují se HPLC (sloupec Zorbax SB-C8), za eluování systémem methanol/500 mM acetátu sodného, nastaveným na hodnotu pH 7 fosforečnanu kyselinou (hmotnostně 60 : 40). Koncentrace plazmy zkoušené sloučeniny se zaznamenává a použije se k výpočtu farmakokinetických parametrů: konstanty rychlosti eliminace, Ke, celkového vyčeření, Cit, objemu rozdělení. V_D, maxima koncentrace zkoušené sloučeniny Tmax, Cmax, poločasu životnosti plazmy, 10,5 a plochy pod křivkou A.U.C., podílu absorbované zkoušené sloučeniny, F.

Psí model trombózy koronární tepny

Chirurgická příprava psů a zavedení přístrojů je podle Jacksonova popisu (Jackson a kol. Circulation, 82, str. 930 až 940, 1990). Psi různých plemen (stáří 6 až 7 měsíců, jakéhokoli pohlaví Hazelton-LRE, Kalamazoo, MI, USA) se anestezují pentobarbitalem sodným (30 mg/kg intravenózně i.v.), intubují se a provětrávají vzduchem v místnosti. Objem respiračního vzduchu a rychlosti dýchání se nastaví na udržení krevního PO₂, PCO₂ a hodnoty pH v normálních mezích. Ke sledování vedoucí IIECG se zavedou subdermální jehlové elektrody.

Levou mediolaterální incisí šíje se izoluje levá jugulámí céva a společná karotidová tepna. Průběžně se měří tepenný tlak krve (ABP) předem cejchovaným Millarovým snímačem (model (MPC-500, Millar Instruments, Houston, TX, USA) zavedeným do karotidové tepny. Jugulámí

-12CZ 287725 B6 céva se kanyluje k odebírání vzorků krve v průběhu pokusu. Kromě toho se kanylují femorální cévy obou zadních končetin k podávání zkoušené sloučeniny.

Levý hrudník se perforuje v pátém mezižebemím prostoru a srdce se zavěsí do perikardiální kolébky. Blíže první hlavní diagonální ventrikulámí větve se izoluje 1 až 2 cm dlouhý úsek levé zakřivené koronární arterie (LCX). Jehlou velikosti 26 zakončený drát anody (povlečené teflonem z postříbřeného měděného drátu velikosti 30) o délce 3 až 4 mm se zavede do LCX a uvede se do styku s vnitřním povrchem arterie (potvrzeno na konci pokusu).

Stimulační okruh je zakončen umístěním katody do subkutánního místa (s.c.). Nad oblastí elektrody se umístí nastavitelný plastický uzávěr okolo LCX. Naproti anodě se umístí okolo LCX předem cejchovaná průtoková sonda (Carolina Medical Electronics, King, NC, USA) k měření koronárního průtoku krve (CBF). Uzávěr se nastaví na vytvoření 40 až 50% odezvy na zábranu průtoku hyperemické krve pozorované po 10 sekundách mechanického seškrcení LCX. Všechna hemodynamická měření se zaznamenávají a analyzují se systémem zpracování dat (model M3000, Modular Instruments, Malvem, PA, USA).

Vytváření trombu a režimy podávání sloučeniny

Elektrolytické narušení vnitřku LCX se vytvoří aplikací stejnosměrného proudu 100-μΑ (DC) do anody. Proud se udržuje po dobu 60 minut a pak se přerušuje podle toho, zda se céva uzavřela nebo ne. Vytváření trombu postupuje spontánně, dokud není LCX úplně uzavřena (což se zjistí jako nulový CBF a nárůstem v S-T segmentu). S přidáváním sloučeniny se započne poté, kdy se nechá seškrcený trombus vystámout 1 hodinu. Současně s infuzí trombotického činidla (například tkáňového plazminogenního aktivátoru, streptokinázy, APSAC) se započne s dvouhodinovou infuzí sloučenin podle vynálezu. Reperfuze následuje 3 hodiny po podání zkoušené sloučeniny. Nové seškrcení koronárních tepen po úspěšné trombolýze se definuje jako nulové CBF, které přetrvalo dobu > 30 minut.

Hematologie a stanovení templetové doby krvácení

Na 40 μΐ vzorku citrátované krve (3,8 %) (1 díl citrátu: 9 dílům krve) se provede kompletní krevní rozbor s počítáním krevních buněk, hemoglobulinu, hematokritových hodnot na hematologickém analyzátoru (Cell. Dyn 900, Sequoia-Tumer, Mont View, CA, USA). Pomocí přístroje Simplate II (Organo Teknika Durham, N.C., USA) k měření doby krvácení se stanoví gingivální templetové doby krvácení. Přístroje se použije k vytvoření dvou vodorovných incisí v gingivě na horní a dolní čelisti psa. Každá incise je 3 mm široká a 2 mm hluboká. Po incisích se použije stopek ke zjištění doby krvácení. K odsávání krve prosakující z incisí se použije bavlněného tamponu. Templetová doba krvácení je čas od incise do ukončení krvácení. Doby krvácení se zjistí těsně před podáním zkoušené sloučeniny (0 min), 60 minut při infuzí, na konci podávání zkoušené sloučeniny (120 min) a na konci pokusu.

Všechna data se analyzují jednocestnou analýzou kolísání (ANOVA) s následujícím StudentNeuman-Kuelsovým t-testem ke zjištění míry významnosti. Ke zjištění významných rozdílů mezi časovými úseky v průběhu pokusů se provedou opakovaná měření ANOVA. Za statisticky odlišné se považují hodnoty při úrovni nejméně p<0,05. Všechny hodnoty jsou průměry ± SEM. Všechny studie se provádějí v souladu s principy směrnic Američan Physiological Society. Další podrobnosti týkající se postupů popsali Jackson a kol., J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, str. 587 až 599(1993).

Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I se též hodnotí testem doby krvácení (Template Bleeding Time) při 0,25, 0,50 a 1,0 mg/kg.h.

Užitečnost sloučenin podle vynálezu je doložena pozitivním působením na trombin. nebo jeho charakteristiky při kterékoliv shora uvedené zkoušce.

-13CZ 287725 B6

Průmyslová využitelnost

Farmaceutický prostředek pro inhibici trombinu a pro ošetřování stavů, kdy je třeba inhibice trombinu, obsahující jako účinnou látku derivát 2-fenyl-3-aroylbenzothiofenu nebo jeho farmaceuticky vhodnou sůl nebo solvát.

Výsledky enzymatického profilu o

A - Inhibice proteázy: Kass x 10⁶1/mol

B - Test koagulace: 2x konc. (ng/ml)

Sloučenina vzorce

Číslo sloučeniny	117018	139481
Molekulová hmotnost	469,57	510,06
A:
Lidský trombin	0,02	0,02
Hovězí trypsin	0,00	0,00
Lidský Xa	0,006	0,009
Lidský plasmin	0,000	0,000
Lidská nt-PA	0,015	0,035
Lidský UK	0,000	0,000
B:
TT citrol	>44586	>44586
TTFgn	>44586	>44586
APTT	>44586	>44586
PT	>44586	>44586

Claims

NÁROKY

1. Použití sloučeniny obecného vzorce I

OR³

OCHjCHj—R² ve kterém

R¹ a R³ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, methyl nebo skupinu vzorce

O O

II II

-C-(Ci-C₆alkyl) nebo -C-Ar, kde Ar znamená fenyl nebo fenylovou skupinu substituovanou jednou nebo dvakrát alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupínou, atomem chloru, atomem fluoru nebo tri(chlor nebo fluor)methylovou skupinou,

R² je vybrán ze souboru sestávajícího z pyrrolidinoskupiny a piperidinoskupiny, nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu k přípravě farmaceutického prostředku pro inhibici trombinu.
2. Použití podle nároku 1, kde sloučenina je ve formě své hydrochloridové soli.
3. Použití podle nároku 1, sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu k přípravě profylaktického farmaceutického prostředku pro inhibici trombinu.
4. Použití podle nároku 1, kde sloučeninou je sloučenina vzorce

HO nebo její hydrochloridová sůl.

- 15CZ 287725 B6

R¹ a R³ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, methyl nebo skupinu vzorce

O O

II II

-C-(Ci-C6alkyl) nebo -C-Ar, kde Ar znamená popřípadě substituovanou fenylovou skupinu,

R² je vybrán ze souboru sestávajícího z pyrrolidinoskupiny a piperidinoskupiny, nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu k přípravě farmaceutického prostředku pro utlumení ošetřovaného onemocnění nebo stavu, kdy je potřebná inhibice trombinu.
6. Použití podle nároku 5, kde sloučenina je ve formě své hydrochloridové soli.
7. Použití podle nároku 5, sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu k přípravě profylaktického farmaceutického prostředku pro utlumení ošetřovaného onemocnění nebo stavu, kdy je potřebná inhibice trombinu.
8. Použití podle nároku 5, kde sloučeninou je sloučenina vzorce nebo její hydrochloridová sůl.