CZ287995B6

CZ287995B6 - Vakcína proti dermatomykózám, způsob její výroby, její použití a kmeny mikroorganismů

Info

Publication number: CZ287995B6
Application number: CZ19931448A
Authority: CZ
Inventors: I. D. Dr. Polyakov; L. G. Dr. Ivanova
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date: 1991-10-21
Filing date: 1992-10-17
Publication date: 2001-03-14
Also published as: HUT68503A; US20080075743A1; SK280570B6; SG49872A1; NL300112I1; JPH06506476A; PL299982A1; EP0564620A1; HU9301798D0; HU219263B; US20020155134A1; RU2020959C1; MX9206000A; PT100989A; US20040202672A1; CZ144893A3; US7666440B2; HK1010682A1; DE19975045I2; US6872399B2

Abstract

Řešení se týká vakcíny proti dermatomykózám, kterou je možno použít k prevenci i léčení těchto onemocnění u domácích, hospodářských i divokých zvířat. Řešení se rovněž týká použití této vakcíny k výrobě farmaceutických prostředků pro uvedené účely, způsobu výroby této vakcíny a také jednotlivých kmenů mikroorganismů, z nichž se užívá antigenní materiál pro výrobu vakcíny. Při použití vakcíny není nutno omezovat volný pohyb zvířat při současné dostatečné účinnosti vakcíny proti infekci různými kmeny.ŕ

Description

Vakcína proti dermatomykózám, způsob její výroby, její použití a kmeny mikroorganismů

Oblast vynálezu

Vynález se týká vakcíny proti dermatomykózám a jejího použití k výrobě farmaceutických prostředků pro prevenci a léčení dermatomykóz.

Dosavadní stav techniky

Dermatomykózy u zvířat jsou antropozoonosy kůže a příbuzných tkání. Klinicky se tato onemocnění projevují ztrátou ochlupení v napadených oblastech, překrvením, olupováním a tvorbou strupů, podobných azbestu. Často dochází také k zánětlivým projevům, doprovázeným mokváním nebo hnisáním. Tato onemocnění je možno charakterizovat jako lokalizovanou infekci kůže.

Dermatomykózy u zvířat mají také důležité sociálně-ekonomické dopady. Nemocná zvířata vyžadují dlouhodobé léčení a mohou šířit infekci jak na další zvířata, tak také na člověka.

Až dosud bylo toto onemocnění léčeno různými typy farmaceutických prostředků, které byly nanášeny na postižené oblasti kůže. Šlo například o krémy a mazání YaM, Yuglon (I) a celou řadu dalších krémů, mazání, roztoků a jiných lékových forem, obsahujících fungicidní a fungistatické účinné látky.

Společnou nevýhodou uvedených prostředků bylo několik následujících skutečností:

- prostředky nebyly dostatečně účinné,

- bylo nutno dodržovat karanténní opatření a provádět dezinfekci v místě pobytu zvířat, tj. na pastvinách, ve viváriích, na statcích, v zoologických zahradách, cirkusech a podobně,

- bylo zapotřebí značných nákladů na přípravu farmaceutických prostředků a na veterinární ošetření,

- volný pohyb zvířat byl omezen, divoká zvířata musela být držena v zajetí.

Později byly vyrobeny vakcíny k léčení trichofytózy u skotu, například SU patentový spis č. 268 593, 1970, u kožešinových zvířat a králíků, například SU č. 835 446, 1980, u velbloudů, například SU č. 1 190 574, 1985, vakcíny byly popsány také v dalších publikacích.

Podobná vakcína byla vyvinuta také pro prevenci a léčení trichofytózy u koní, šlo o vakcínu SP-I, popsanou v SU č. 548 947, 1976 (2).

Vakcína S-P-I obsahuje kmen Trichophyton equinum č. 2251/71, který je uložen ve všesvazové sbírce kultur v SU ve Vědeckém kontrolním institutu veterinárních přípravků, kmen je pěstován na agaru se sledem 20 až 25 dnů při teplotě 26 až 28 °C. Pak se mikroorganismus oddělí od živného prostředím, smísí se se sterilovanou destilovanou vodou a homogenizuje a koncentrace buněk se upraví na 600 až 900 milionů/ml. Homogenát se pak přenese do oddělené nádoby a stabilizuje směsí, obsahující 2 až 8 % želatiny a 10 až 40 % sacharózy v poměru 1 : 1 (± 25 %), a pak se lyofilizuje.

K profylaktickým a léčebným účelům se vakcína vstřikuje do svalové tkáně na šíji hříbat i dospělých koní ve dvou dávkách po 1 až 2 ml v závislosti na věku koně, v rozmezí 10 až 14 dnů. K léčebným účelům se uvedená dávka zdvojnásobí.

Vakcíny, získané svrchu uvedeným způsobem mají tu nevýhodu, že nevyvolávají imunitu proti onemocnění jinými typy Micorsporum nebo Trichophyton.

-1 CZ 287995 B6

Bylo rovněž pozorováno, že v oblastech, v nichž byla užívána živá vakcína se mohou vyskytnout specifická ohniska, v nichž dochází k pomnožení kmenů, které byly užity pro výrobu vakcíny. Tyto kmeny mají ještě zbytek virulence. Vzhledem k tomu, že některé druhy domácích zvířat se dostávají do velmi častého styku s lidmi, je výskyt takových ohnisek u domácích zvířat zcela nepřijatelný.

Vynález si klade za úkol navrhnout univerzální vakcínu pro léčení a prevenci dermatomykóz u zvířat na bázi imunogenních fungálních kmenů.

V dalším textu jde při uvedení množství jakýchkoliv složek vždy o údaje hmotnostní.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří vakcína proti dermatomykózám na bázi následujících fungálních kmenů: Trichophyton verrucosum, zejména VKPGF-931/410, T. mentagrophytes, zejména VKPGF930/102, T. equinum, zejména VKPGF-929/381, T. sarkisovii, zejména VKPGF-551/68, Microsporum canis, zejména VKPGF-928/1393, M. canis var. obesum, zejména VKPGF727/1311, M. canis vad. distortum, zejména VKPGF-728/120, M. gypseum, zejména VKPGF729/59. Vakcíny je možno získat při použití různých kombinací antigenního materiálu ze svrchu uvedených kmenů spolu s vhodným nosičem.

Výhodná kombinace, zvláště pro použití u psů, koček a koní je tvořena materiálem z kmenů Trichophyton verrucosum VKPGF-931/410, Trichophyton mentagrophytes, VKPGF-930/1032, Trichophyton equinum VKPGF-929/381, Microsporum canis VKPGF-928/1393, Microsporum canis var. obesum VKPGF-727/1311, Microsporum canis var. distortum VKPGF-728/120 a Microsporum gypseum VKPGF-729/59.

Další výhodné kombinace kmenů ve vakcíně jsou tvořeny kmeny Trichophyton verrucosum VKPGF-931/410, Trichophyton mentagrophytes VKPGF-930/1032 a Trichophyton sarkisovii VKPGF-551/68, zvláště pro použití u skotu.

Antigenní materiál může obsahovat jediný antigen z alespoň jednoho, s výhodou všech svrchu uvedených kmenů nebo může jít o větší počet antigenů za předpokladu, že dojde k vyvolání dostatečné imunologické odpovědi za vzniku odolnosti proti infekci, způsobené dermatofyty. Antigenní materiál pro uvedené účely je možno připravit známými postupy, například homogenizací svrchu uvedených dermatofytů nebo jiných částí, frakcionací prostředků, připravených z těchto dermatofytů nebo je možno antigenní materiál získat při použití rekombinantní DNA a podobně. S výhodou se užije homogenizovaný materiál kultury, obsahující 40 až 120 milionů, s výhodou přibližně 90 milionů mikrokonidií v 1 ml.

Vhodným, fyziologicky přijatelným nosičem pro podávání vakcíny může být některý ze známých nosičů, které může obsahovat ještě pufiy, geny, mikročástice, implantovatelné pevné látky, roztoky a další pomocné složky.

K usmrcení dermatofytů je možno použít thiomersal C9H₉O₂SNaHg, formaldehyd nebo 2propiolakton.

K přípravě vakcíny je možno použít například následujícího postupu:

Kultury kmenů se homogenizují ve vodném prostředí, obsahujícím 0,2 až 2 % hmotnostní fermentované, hydrolyzované svalové bílkoviny PGM-s, 5 až 12 % hmotnostních glukózy a 0,1 až 1,2% hmotnostních extraktu z kvasnic, vztaženo na celkovou hmotnost prostředí. Koncentrace mikrokonidií se upraví na 40 až 120 milionů v 1 ml a po 1 až 2 dnech se směs

-2CZ 287995 B6 inaktivuje, například přidáním thiomersalu v poměru 1:10 000 až 1 : 25 000 nebo jinou vhodnou látkou, užívanou k tomuto účelu. Výsledná suspenze se balí a je připravena pro použití u zvířat.

Příprava vakcíny, podávané dávky a způsob podání pro prevenci a léčení budou dále vysvětleny v příkladech 1 až 3.

Způsobem podle vynálezu je možno připravit inaktivovanou vakcínu, která snižuje pravděpodobnost opakované infekce a poskytuje vysoký stupeň imunity. Na rozdíl od známých vakcín poskytuje vakcína podle vynálezu imunitu proti všem důležitým typům dermatomykóz u zvířat.

Vakcína podle vynálezu tedy poskytuje ve srovnání se známými vakcínami zejména následující výhody:

- u řady živočišných druhů, u nichž se infekce vyskytuje je možno dosáhnout imunity po nitrosvalové injekci,

- u zvířat je možno vyvolat imunitu proti téměř všem typům dermatomykóz,

- vakcína má stálé imunogenní vlastnosti,

- příprava vakcíny je snadná,

- vakcína obsahuje úplnou sestavu exo- a endo-antigenů kultur dermatofytů a po podání zvířatům nevyvolává žádné vedlejší reakce.

Vakcína byla úspěšně zkoušena na více než 500 zvířatech různých druhů, převážně v oblastech, v nichž se onemocnění vyskytuje.

Kmeny, užité pro výrobu vakcíny byly uloženy ve veřejné sbírce kultur „All-Union Collection of Pathogenic Fungi within the USSR, Ministry of Health Centre for Deep Mycoses“ v Leningradu a ve veřejné sbírce kultur „DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen“, Mascheroder Weg IB, W-3300 Braunschweig, SRN.

Dále budou uvedeny podrobněji vlastnosti jednotlivých kmenů těchto mikroorganismů.

Trichophyton verrucosum VKPGF-931/410

Kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg IB, W-3300 Braunschweig, SRN, dne 1. října 1992 pod číslem DSM 7277.

Kmen byl získán přímou selekcí, založenou na produkci spor a na snížení infektivity epizootického kmene č. 410, který byl izolován u jelena 1978. Kmen byl identifikován při použití Rebell-taplinova klíče podle publikace Rebeli G., Taplin D.: Dermatophytes, Their recognition and identification, 1978 a Kashkin P. N. a další, Opredelitel patogennykh, toksigenykh vrednykh dlya cheloveka gribov, 1979.

Biologické vlastnosti tohoto kmene budou dále popsány v tabulce 1.

Kmen VKPGF-931/410 se liší od epizootického kmene rychlejším růstem v živném prostředí, nesmírně velkou produkcí mikrokonidií, nižší virulencí a absencí jakékoliv reakce s příslušnými antigeny.

Trichophyton mentagrophytes, VKPGF-930/1032

Kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen, Mascheroder Weg IB, W-3300 Braunschweig, SRN, 1. října 1992 pod číslem DSM 7279.

-3CZ 287995 B6

Kmen byl získán přímou selekcí, založenou na produkci spor a na snížení virulence epizootického kmene č. 1032, který byl izolován u koně 1985. Kmen byl identifikován a popsán stejným způsobem, jak bylo popsáno svrchu a podrobnosti jsou uvedeny ve svrchu zmíněných publikacích Rebella a Taplina a také Kashkina. Biologické vlastnosti kmene jsou shrnuty v tabulce 2.

Kmen VKPGF-930/1032 se od epizootického kmene liší rychlejším růstem v živném prostředí, nesmírně velkou produkcí mikrokonidií, nižší virulencí a nepřítomností jakékoliv reakce s příslušným antigenem.

Trichophyton equinum, VKPGF-929/381

Kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur DSM-Deusche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mescheroder Weg 1B, W-3300 Braunschweig, SRN, 1. října 1992 pod číslem DSM 7276.

Kmen byl získán přímou selekcí, založenou na produkci spor a snížení virulence epizootického kmene č. 381, který byl izolován u koně 1986. Kmen byl identifikován a popsán stejným způsobem jako svrchu a podrobnosti jsou uvedeny ve svrchu zmíněných publikací Rebella a Taplina a také Kishkina. Biologické vlastnosti tohoto kmene jsou podrobně uvedeny v tabulce 3.

Kmen VKPGF-929/381 se od epizootického kmene liší rychlejším růstem v živném prostředí, nižší virulencí a nepřítomností jakékoliv reakce s příslušným antigenem.

Microsporum canis, VKPGF-928/1393

Kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur DSM - Deustche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, mascheroder Weg 1B, 3-3300 Braunschwieg, SRN, 1. října 1992 pod číslem DSM 7281.

Kmen byl získán přímou selekcí, založenou na produkci spor a na snížení virulence epizootického kmene č. 1393, který byl izolován u kočky 1988. Kmen byl identifikován svrchu uvedeným způsobem, podrobnosti je možno nalézt ve svrchu zmíněných publikacích Rebellova a Taplina a také Kashkina. Biologické vlastnosti kmene jsou podrobněji popsány v tabulce 4.

Kmen VKPGF-928/1393 se liší od epizootického kmene rychlejším růstem v živném prostředí, velikou schopností vytvářet spory, nižší virulencí a nepřítomností jakékoliv reakce s odpovídajícím antigenen.

Microsporum canis var. obesum, VKPGF-727/1311

Kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur DSN - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, mascheroder Weg lb, W-3300 Braunschweig, SRN, 1. října 1992 pod číslem DSM 7280.

Kmen byl získán přímou selekcí, založenou na produkci spor a na snížení virulence epizootického kmene č. 1311, kmen byl izolován u tygra 1986. Kmen byl identifikován svrchu uvedeným způsobem, podrobnosti je možno nalézt ve svrchu zmíněných publikacích Rebella a Taplina a také Kashkina. Biologické vlastnosti kmene jsou uvedeny v tabulce 5.

Kmen VKPGF-727/1311 se liší od epizootického kmene rychlejším růstem v živném prostředí, velkou kapacitou vytvářet spory, nižší virulencí a nepřítomností jakékoliv reakce s odpovídajícím antigenem.

Microsporum canis var. distortum, VKPGF-728/120

-4CZ 287995 B6

Kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mescheroder Weg 1B, W-3300 Braunschweig, SRN, 1. října 1992, pod číslem DSM 7275.

Kmen byl získán přímou selekcí, založenou na tvorbě spor a na snížené virulence epizootického kmene č. 120, který byl izolován u černého pantera 1987. Kmen byl izolován svrchu uvedeným způsobem, podrobnosti je možno nalézt ve svrchu zmíněných publikacích Rebella a Taplina a také Kashkina. Biologické vlastnosti kmene budou uvedeny v tabulce 6.

Kmen VKPGF-728/120 se liší od epizootického kmene rychlejším růstem v živném prostředí, nesmírně velkou produkcí mikrokonidií, nižší virulencí a nepřítomností jakékoliv reakce s příslušným antigenem.

Microsporum gypseum, VKPGF-729/59

Kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, W-3300 Braunschweig, SRN, 1. října 1992 pod číslem DSM 7274.

Kmen byl získán přímou selekcí, založenou na produkci spor a na snížení virulence epizootického kmene č. 59, který byl izolován u koně 1985. Kmen byl identifikován svrchu uvedeným způsobem, podrobnosti je možno nalézt ve svrchu zmíněných publikacích Rebella a Taplina a také Kishkina. Biologické vlastnosti kmene jsou uvedeny v tabulce 7.

Kmen VKPGF-729/59 se od epizootického kmene lisí rychlejším růstem v živném prostředí, velikou produkcí mikrokonidií, nižší virulencí a nepřítomností jakékoliv reakce s příslušným antigenem.

Tabulka 1

Vlastnosti kmenů	Kmen č.VKPGF-931/410	Epizootický kmen č. 410
popis kultury	po 10 až 15 dnech zralé kolonie s jednotlivými sporami, bílé, sametovité, konvexní, na okraji v úzkém pruhu rostou do hloubky, bezbarvé, průměr kolonie 10 až 15 mm živné prostředí: agar se sladem	Po 25 až 30 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, povrch krémový, kožovitě sametovitý, spodní strana bezbarvá, průměr kolonií 9 až 13 mm
morfologické vlastnosti	po 10 až 15 dnech zralé kultury s rozvětvenými hyfy se septy, šířka 1 až 3 pm, četné oválné, pyroformní mikrokonidie s rozměrem 1,5 až 3 x 3 až 5 pm, žádné makrokonidie	po 25 až 30 dnech kultura s rozvětveným meciliem se septy, malé množství oválných, pyroformních, cylindrických mikrokonidií s rozměrem 1 až 3 x 3 až 7 pm, jednotlivé protáhlé nepravidelné makrokonidie s 2 až 5 septy, rozměr 3 až 5 x 25 až 30 pm, četné arthrospory v řetězcích, průměr 6 až 8 pm, chlamydospory s průměrem 10 až 12 pm.

-5CZ 287995 B6

Tabulka 1 - pokračování

Vlastnosti kmenů	Kmen č. VKPGF-931/410 Epizootický kmen č. 410
Patogenní vlastnosti	výsledkem po 12 až 15 dnech p buněk na cm² na skarifikovanou tenké nekrotické strupy	o podání dávky 500 až 600 tisíc kůži králíka: pevné azbestovité strupy, mokvání
	spontánní úprava po 19 až 20 dnech \| 25 až 30 dnech
Reaktivní odpověď	Výsledek po podkožní a nitrosvalové injekci inaktivovaných antigenů: žádná klinická změna \| zánět v otok v místě injekce
Antigenní odpověď	20 až 25 dnů po injekci antigei v krevním séru při pasivní herna 1 : 320 až 1 : 340 při enzymaticky vázané imunoa 1 :400ažl : 1600	íů králíkům jsou titry protilátek glutinační reakci (PHR): 1 : 320 až 1 : 640 jsorpční zkoušce (ELISA): 1 :400ažl : 1600
Imunologická odpověď	Výsledky imunizace králíků inaktivovaným antigenem (alespoň 5 x) vyvolává imunitu \| vyvolává imunitu

Tabulka 2

Vlastnosti kmenů	Kmen č. VKPGF-930/1032	epizootický kmen č. 1032
popis kultury	po 10 až 15 dnech na agaru se sladem krémové, sametovitopoprášené, ploché kultury, slabě zvýšený střed, úzký rostoucí okraj, spodní strana světlehnědá, průměr kolonie 25 až 30 mm	po 25 až 30 dnech kolonie na agaru se sladem, bílé, ploché, úzký rostoucí okraj, spodní strana červenohnědá, průměr kolonie 15 až 20 mm
morfologické vlastnosti	rozvětvené hyfy na septy, šířka 1 až 3 pm, četné pyriformní oválné mikrokonidie s rozměrem 1 až 3 x 2 až 6 pm, žádné makrokonidie	rozvětvené přímé i spirální hyfy se septy, šířka 1 až 3 pm, okrouhlé, ploché pyriformní mikrokonidie s rozměrem 1 až 3 x 2 až 6 pm malé množství prodloužených oválných makrokonidií se 2 až 5 septy, rozměr 3 až 6 x 15 až 25 pm
patogenní vlastnosti	výsledky 9 až 10 dnů po podání dávky 500 až 600 tisíc buněk na cm² skarifikované kůže králíka nekrotické strupy \| tuhé, azbestovité strupy
spontánní 22 až 25 dnech	úprava po 30 až 35 dnech
reaktivní odpověď	výsledky po podkožní a nitrosvalové injekci inaktivovaného antigenů z kultury bez klinických změn \| zánět a otok v místě injekce
antigenní odpověď	29 až 25 dnů po injekčním protilátek v krevním séru PHR: 1 : 320 až 1 : 640 ELISA: 1 : 400 až 1 : 1600	jodání antigenů králíkům, titr 1 : 320 až 1 : 640 1 :400ažl : 1600

-6CZ 287995 B6

Tabulka 2 - pokračování

Vlastnosti kmenů	Kmen č. VKPGF-930/1032 \| epizootický kmen č. 1032
imunogenní odpověď	výsledky imunizace skupiny králíků inaktivovaných antigenem z kultury (alespoň 5 opakování): vyvolává imunitu \| vyvolává imunitu

Tabulka 3

Vlastnosti kmenů	Kmen č. VKPGF-929/381	epizootický kmen č. 381
popis kultury	po 10 až 15 dnech kolonie na agaru se sladem, bílé, sametovité, poprášené, ploché s mírně zvýšeným středem, úzký rostoucí okraj, spodní strana světlehnědá, průměr kolonií 15 až 20 mm	po 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, bílé, sametovité, mírně zvrásněný střed, úzký rostoucí okraj, spodní strana červenohnědá, průměr kolonií 13 až 15 mm
morfologické vlastnosti	rozvětvené hyfy se septy, široké 1 až 3 pm, početné oválné pyriformní mikrokonidie s rozměrem 2 až 3 x 3 až 6 pm, žádné makrokonidie	rozvětvené hyfy se septy a stočeným zakončením, šířka 1 až 4 pm, malé množství oválných, pyriformních mikrokonidií 2 až 3 x 3 až 7 pm, laločnaté makrokonidie 4 až 7 x 15 až 25 pm
patogenní vlastnosti	výsledek 10 až 12 dnů po podání 500 až 600 tisíc buněk na cm²skarifíkované kůže králíka: nekrotické strupy \| azbestovité strupy spontánní úprava po: 20 až 22 dnech \| 25 až 30 dnech
reaktivní odpověď	výsledky po podkožní a nitrosvalové injekci inaktivovaného antigenu z kultury: bez klinických změn \| zánět a otok v místě injekce
antigenní odpověď	20 až 25 dnů po injekčním p králíkům, titr protilátek v krevní 1 : 320 až 1 : 640 ELISA: 1 :800ažl : 1600	odání inaktivovaného antigenu m séru PHR: 1 : 320 až 1 : 640 1 : 800 až 1 : 1600
imunologická odpověď	výsledky imunizace u skupiny králíků inaktivovaných antigenem z kultury (alespoň pět opakování): vyvolává imunitu \| vyvolává imunitu

Tabulka 4

Vlastnosti kmenů	Kmen č. VKPGF-928/1393	epizootický kmen č. 1393
popis kultury	po 10 až 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, bílé, vločkovité, konvexní, úzký rostoucí okraj, arachnoidní, spodní strana hnědá, průměr kolonie 30 až 35 mm	po 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, šedobéžové, arachnoidní, poprášený střed, zvlněný rostoucí okraj, spodní strana žlutavá, průměr kolonií 20 až 25 mm

Tabulka 4 - pokračování

Vlastnosti kmenů	Kmen č. VKPGF-928/1393	epizootický kmen č. 1393
morfologické vlastnosti	rozvětvené hyfy se septy, šířka 1 až 4 pm, četné pyriformní, cylindrické mikrokonidie, malý počet fusiformních makrokonidií se 3 až 11 septy, rozměr 10 až 20 x 40 až 75 pm	rozvětvené hyfy se septy, široké 2 až 6 pm, malý počet pyriformních, cylindrických mikrokonidií s rozměrem 1 až 3 x 3 až 7 pm, četné fusiformní makrokonidie se 3 až 11 septy, rozměr 10 až 20 x 45 až 85 pm
patogenní vlastnosti	výsledky 9 až 11 dnů po podání dávky 500 až 600 tisíc buněk na cm² na skarifikovanou kůži králíka: nekrotické strupy \| tuhé azbestovité strupy
spontánní 20 až 24 dnech	úprava po 25 až 45 dnech
reaktivní odpověď	výsledek po podkožním a nitrosvalovém podání inaktivovaného antigenů z kultury: bez klinických změn \| zánět a otok v místě injekce
antigenní odpověď	20 až 25 dnů po injekčním protilátek v krevním séru PHR: 1 : 320 až 1 : 640 ELISA: 1 : 400 až 1 : 1600	podání antigenů králíkům, titr 1 : 320 až 1 : 640 1 : 400 až 1 : 1600
imunologická odpověď	výsledky imunizace na skupině králíků s inaktivovanými antigeny z kultur (alespoň pět opakování): vyvolává imunitu \| vyvolává imunitu

Tabulka 5

Vlastnosti kmenů	kmenč. VKPGF-727/1311	epizootický kmen č. 1311
popis kultury	po 10 až 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, bílé, vločkovité, ploché s hustším zvýšeným středem, úzký rostoucí okraj, spodní strana bezbarvá s hnědým středem, průměr kolonie 30 až 35 mm	po 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, šedavé, provazcovité až arachnoidní s částmi bílého mycelia vzhledu chomáčků bavlny, zvlněný rostoucí okraj, spodní strana hnědavá, průměr kolonie 23 až 28 mm
morfologické vlastnosti	rozvětvené hyfy se septy, šířka 1 až 3 pm, četné pyriformní, oválné a cylindrické mikrokonidie 1 až 3 x 3 až 7 pm, malé množství krátkých, fusiformních, eliptických, prodlouženě oválných makrokonidií, některé nepravidelného tvaru, se 2 až 5 septy, 11 až 20 x 25 až 50 pm	rozvětvené hyfy se septy, šířka 1 až 5 pm, malé množství oválných cylindrických mikrokonidií 1 až 3 x 3 až 8 pm, mnohé eliptické, fusiformní, prodloužené oválné nebo nepravidelné makrokonidie se 2 až 5 septy, rozměry 11 až 20 x 25 až 55 pm
patogenní vlastnosti	výsledek 12 až 15 dnů po podání 500 až 600 tisíc buněk na cm²skarifikované kůže králíka tenké nekrotické strupy \| tuhé azbestovité strupy
	spontánní úprava po 10 až 25 dnech \| 25 až 30 dnech

-8CZ 287995 B6

Tabulka 5 - pokračování

Vlastnosti kmenů	kmen č. VKPGF-727/1311 \| epizootický kmen č. 1311
reaktivní odpověď	výsledky po podkožní a nitrosvalové injekci inaktivovaného antigenu z kultury: bez klinických změn \| zánět a otok v místě injekce
antigenní odpověď	20 až 25 dnů po injekčním podání antigenu králíkům, titr protilátek v krevním séru PHR: 1 : 320 až 1 : 340 1 : 320 až 1 : 340 ELISA: 1 : 800 až 1 : 1600 1 : 800 až 1 : 1600
Imunologická odpověď	výsledky imunizace skupiny králíků inaktivovaných antigenem z kultury (alespoň pět opakování): vyvolává imunitu \| vyvolává imunitu

Tabulka 6

Vlastnosti kmenů	kmen č. VKPGF-728/120	epizootický kmen č. 120
popis kultury	po 10 až 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, krémovité, sametovité, poprášené, knoflíkovité zvýšení ve středu, úzký rostoucí okraj, jemně zvlněné, spodní strana světlehnědá s tmavěhnědým středem, průměr kolonií 25 až 30 mm	po 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, světle béžové, jakoby poprášené, úzký rostoucí okraj, spodní strana hnědá, průměr kolonie 18 až 20 mm
morfologické vlastnosti	rozvětvené hyfy se septy na agaru se sladem, 1 až 3 pm široké, četné pyriformní, oválné, cylindrické mikrokonidie 1 až 3 x 3 až 8 pm malý počet nepravidelně deformovaných makrokonidií se 2 až 9 septy, o velikosti 8 až 20 x 25 až 70 pm	rozvětvené hyfy se septy, 1 až 3 pm široké, malý počet pyriformních oválných, cylindrických mikrokonidií 1 až 3x3 až 8 pm, četné nepravidelně deformované nebo fusiformní makrokonidie se 2 až 9 septy, rozměr 8 až 20 x 25 až 80 pm
patogenní vlastnosti	výsledek 12 až 15 dnů po podání dávky 500 až 600 tisíc buněk na cm² na skarifikovanou kůži králíka: tenké nekrotické strupy \| azbestovité strupy spontánní úprava po: 20 až 25 dnech \| 27 až 45 dnech
reaktivní odpověď	výsledky podkožní a nitrosvalové injekce inaktivovaného antigenu z kultury: bez klinických změn \| zánět a otok v místě injekce
antigenní odpověď	20 až 25 dnů po injekčním protilátek v krevním séru, PHR: 1 : 320 až 1 : 640 ELISA: 1 : 800 až 1 : 1600	podání antigenu králíkům, titr 1 : 320 až 1 : 640 1 :800ažl : 1600
imunogenní odpověď	výsledky imunizace skupiny králíků inaktivovaným antigenem z kultury (alespoň pět opakování): vyvolává imunitu \| vyvolává imunitu

-9CZ 287995 B6

Tabulka 7

Vlastnosti kmenu	kmen č. VKPGF-729/59	epizootický kmen č. 59
popis kultury	po 10 až 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, bílé, sametovité až vločkovité, ploché se slabě zvýšeným středem, úzký rostoucí okraj, spodní strana hnědavá, průměr kolonie 25 až 30 mm	po 15 dnech zralé kolonie na agaru se sladem, sametovité až poprášené, ploché s vločkovitým bílým myceliem ve středu, úzký rostoucí okraj, spodní strana hnědavá, průměr kolonie 20 až 22 mm
morfologické vlastnosti	rozvětvené hyfy se septy, široké 2 až 3 pm, četné oválné, pyriformní cylindrické mikrokonidie 2 až 4 x 3 až 6 pm, žádné nebo malý počet makrokonidií, eliptických, prodlouženě oválných se 2 až 5 septy, rozměr 7 až 15 x 25 až 40 pm	rozvětvené hyfy se septy, široké 2 až 5 pm, malý počet oválných, pyriformních, válcových mikrokonidií s rozměry 2 až 4 x 3 až 7 pm, četné eliptické, prodloužené oválné makrokonidie se 2 až 5 septy, rozměry 7 až 15 x 25 až 50 pm
patogenní vlastnosti	výsledek 12 až 15 dnů po podání dávky 500 až 600 tisíc buněk na cm² na skarifíkovanou kůži králíka: tenké nekrotické strupy \| tuhé azbestické strupy spontánní úprava po: 20 až 22 dnech \| 25 až 28 dnech
reaktivní odpověď	výsledky po podkožní a nitrosvalové injekci inaktivovaného antigenu z kultury: bez klinických změn \| zánět v místě injekce
antigenní odpověď	20 až 25 dnů po injekčním pod< látek v krevním seru, PHR: 1 : 320 až 1 : 640 ELISA: 1 : 400 až 1 : 1600	mí antigenu králíkům, titr proti- 1 : 320 až 1 : 640 1 : 400 až 1 : 1600
imunogenní odpověď	výsledky imunizace skupiny králíků inaktivovaným antigenem z kultury (alespoň pět opakování): vyvolává imunitu \| vyvolává imunitu

Vakcínu je možno připravit při použití kmene Trichophyton sarkisovii, č. 551/68, který byl popsán například v SU patentovém spisu č. 1 177 972 z 8. 5. 1985.

Tento kmen byl rovněž uložen ve veřejné sbírce kultur DSM - Deutsche sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg IB, W-3300 Braunschweig, SRN 1. října 1992 podč. DSM 7278.

Vynález se tedy týká zvláště:

- vakcíny proti dermatomykózám, která obsahuje antigenní materiál z alespoň jednoho z následujících kmenů Dermatophytes:

- Trichophyton verrucosum, zvláště Trichophyton verrucosum, kmen č. VKPGF-931/410, a/nebo

- Trichophyton methagrophytes, zvláště Trichophyton mentagrophytes, kmen č. VKPGF930/1032 a/nebo

- Trichophyton sarkisovii, zvláště Trichophyton sarkisovii, kmen č. VKPGF-551/68,

- Microsporum canis, zvláště Microsporum canis, kmen č. VKPGF-928/1393,

-10CZ 287995 B6

- Microsporum canis var. obesum, zvláště Microsporum canís var. obesum, kmen č. VKPGF727/1311 a/nebo

- Microsporum canis var. distortum, zvláště Microsporum canis var. distortum, kmen č. VKPGF-728/120 a/nebo

- Microsporum gypseum, zvláště Microsporum gypseum kmen č. VKPGF-729/59, a fyziologicky přijatelný nosič.

- vakcíny proti dermatomykózám, vhodné zvláště pro použití u psů, koček a koní, obsahující antigenní materiál z kmenů Trichophyton verrucosum č. VKPGF-931/410, Trichophyton mentagrophytes č. VKPGF-930/1032, Trichiphyton equinum č. VKPGF-929/381, Trichophyton sarkisovii č. VKPGF-551/68, Microsporum canis č. VKPGF-928/1393, Microsporum canis var. obesum č. VKPGF-727/1311, Microsporum canis var. distortum č. VKPGF-728/120 a Microsporum gypseum č. VKPGF-729/59, spolu s fyziologicky přijatelným nosičem,

- dále tvoří podstatu vynálezu vakcína proti dermatomykózám, zejména pro použití u skotu, která obsahuje antigenní materiál z kmenů Trichophyton verrucosum č. VKPGF-931/410, Trichophyton mentagrophytes č. VKPGF-930/1032 a Trichophyton sarkisovii č. VKPGF551/68, spolu s fyziologicky přijatelným nosičem,

- svrchu uvedené vakcíny, které obsahují 40 až 120 milionů, s výhodou 90 milionů mikrokonidií,

- vakcíny proti dermatomykózám, tak jak byly svrchu popsány, obsahující mimoto ještě thiomersal nebo formaldehyd nebo 2-proipolakton jako inaktivátor,

- vakcíny, tak jak byly svrchu popsány, v nichž je jako nosič, přijatelný z fyziologického hlediska užit vodný roztok, který obsahuje 0,2 až 2,0 % hmotnostních fermentované, hydrolyzované svalové bílkoviny, 5 až 12% hmotnostních glukózy, a 0,1 až 1,2% hmotnostních extraktu z kvasnic, vztaženo na celkovou hmotnost roztoku,

- následující kmeny dermatofytů:

Trichophyton verrucosum, kmen č. VKPGF-931/410,

Trichophyton mentagrophytes kmen č. VKPGF-930/1032,

Trichophyton equinum, kmen č. VKPGF-929/381,

Microsporum canis, kmen č. VKPGF-928/1393,

Microsporum canis var. obesum, kmen č. VKPGF-727/1311,

Microsporum canis var. distortum kmen č. VKPGF-728/120 a

Microsporum gypseum, kmen č. VKPGF-729/59.

- Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby této vakcíny, který spočívá v tom, že se

a. připraví antigenní materiál z alespoň jednoho z následujících kmenů:

-Trichophyton verrucosum č. VKPGF-931/410,

-Trichophyton mentagrophytes č. VKPGF-930/1032, -Trichophyton sarkisovii č. VKPGF-551/68, -Microsporum canis č. VKPGF-928/1393,

-Microsporum canis var. obesum, č. VKPGF-727/1311, -Microsporum canis var. distortum, č. VKPGF-728/120 a -Microsporum gypseum, č. VKPGF-729/59 a

b. antigenní materiál se smísí s nosičem, přijatelným z fyziologického hlediska.

- Podstatu vynálezu tvoří rovněž svrchu uvedený způsob, při němž se k inaktivaci použitých patogenních mikroorganismů navíc užije zvláště inaktivátor, zejména thermersal, formaldehyd nebo 2-propiolakton.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení jeho rozsahu.

-11CZ 287995 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Aby bylo možno vyrobit 1 litr vakcíny, pěstují se kultury kmenů VKPGF-931/410, 930/1032, 929/381, 551/68, 929/1393, 727/1311, 728/120 a 729/59 na agaru se sladem 15 dnů při teplotě 26 °C. Každá kultura se pěstuje v osmi lahvích. Pak se hmota oddělí, homogenizuje, smísí se s 10 200 ml roztoku a vloží do mísícího zařízení. Použitým roztokem je vodný roztok, obsahující 1 % hmotnostní hydrolyzované svalové bílkoviny, 10% hmotnostních glukózy a 1% hmotnostní extraktu z kvasnic. Koncentrace mikrokonidií se upraví na 90 milionů na 1 ml homogenátu. Po dvou dnech se z každé kultury odebere 125 ml suspenze a tyto podíly se smísí v jediné nádobě. Vakcínu je možno připravit smísením různých kombinací uvedených kmenů.

K inaktivaci homogenátu se přímo do suspenze buněk přidá Thiomersal v poměru 1 : 20 000. To znamená, že se na 1 litr homogenátu přidá 50 mg tohoto prostředku a směs se pak nechá stát 2 dny při teplotě místnosti.

Výsledná vakcína se plní do lahví, kontroluje se sterilita, bezpečnost a imunogenní vlastnosti podle známých požadavků a pak se vakcína uloží při teplotě 4 °C.

Vakcína, vyrobená uvedeným způsobem byla užita k imunizaci různých živočichů.

K profylaxi i léčení byla vakcína užita v dávkách, uvedených v následující tabulce 8.

Tabulka 8

živočich	věk měsíce	místo injekce	dávka ml
profylaxe	léčení
Felidae^x	1 až 6	gluteální sval	2 až 5	3 až 6
	více než 6	gluteální sval	3 až 7	4 až 10
malé kočky	1 až 5	gluteální sval	1 až 1,5	1 až 1,5
	více než 5	gluteální sval	1 až 2	1 až 2
Ursidae	1 až 12	gluteální sval	1 až 3	3 až 5
	více než 12	gluteální sval	3 až 6	5 až 6
Procyonidae	1 až 10	gluteální sval	0,3 až 0,5	0,5
	více než 10	gluteální sval	0,3 až 0,5	0,5 až 1,0
Vivarridae	1 až 12	gluteální sval	0,3 až 0,5	0,5
	více než 12	gluteální sval	0,5 až 1,0	0,5 až 1,0
Hyaenidae	1 až 12	gluteální sval	1 až 3	1 až 3
	více než 12	gluteální sval	3 až 5	5 až 6
Canidae	1 až 10	gluteální sval a	0,3 až 0,5	0,5 až 1,0
	více než 10	ramenní sval	0,3 až 1,0	0,5 až 1,0
Equidae	3 až 12	šíje	0,3 až 0,5	0,5 až 1,0
	více než 12	šíje	0,5	0,5 až 1,0
Tyrodae	1 až 6	ramenní svaly	3 až 5	5 až 10
	více než 6	a šíje	5 až 8	7 až 10
Bovidae	1 až 12	šíje	3 až 5	5 až 10
	více než 12	šíje	5 až 8	7 až 10

^x Felidae = střední a velké kočky.

-12CZ 287995 B6

Příklad 2

Vakcína, vyrobená způsobem popsaným v příkladu 1, byla zkoušena na laboratorních zvířatech a na řadě dalších zvířat na účinnost, a to jak při preventivním, tak při léčebném použití. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 9.

Příklad 3

Vakcína, získaná způsobme popsaným v příkladu 1, byla užita k léčení různých zvířat, trpících dermatofytózami. Získané výsledné výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 10.

Tabulka 9

zvíře	počet	dávka ml	účinnost
králíci	10	1,0	nebylo možno pozorovat žádné příznaky onemocnění po
psi	5	0,3	infekci virulentními kulturami T. Mentagrophytes, T.
kočka domácí	3	1,0	verrucosum, T. equinum, M. canis, M. gypseum
kůň	5	0,5	nevznikla žádná dermatofytóza na bázi M. canis a T.
poník	3	0,3	mentagrophytes po přímém styku se zvířaty, trpícími tímto
velbloud	2	5,0	onemocněním
medvěd	2	3,0
leopard	2	4,0
hyena	2	2,0	nevznikla žádná dermatofytóza na bázi M. canis a T.
serval	2	3,0	mentagrophytes po přímém styku se zdroji infekce
ocelot	2	2,0
lev	2	3,0
tygr	3	7,0
nasu	3	0,5
cibetka	2	1,0
králík	7	1,5	nevznikly žádné příznaky onemocnění po přímé infekci
pes	3	0,5	virulentními kulturami T. sarkisovii a M. gypseum
kočka domácí	3	1,5
černý panter	2	5,0	nevznikla žádná dermatofytóza na bázi kmenů M. canis, T.
tygr	5	7,0	mentagrophytes a T. verrucosum po přímém kontaktu se
husa	6	3,0	zdrojem infekce
pes	8	0,5
lama	2	3,0

Tabulka 10

zvíře	počet	množství ml	účinek
černý panter	5	7,0	zvířata byla napadena M. canis. K úpravě klinického
černý panter	3	4,0	stavu došlo 12 až 25 dnů po imunizaci
kůň	3	1,0
poník	2	0,5
lev	3	10
tygr	3	10
pes	4	0,5
medvěd	1	5,0
hyena	1	5,0

-13CZ 287995 B6

Tabulka 10 - pokračování

zvíře	počet	množství ml	účinek
kočka domácí	15	1,5	zvířata byla napadena M. canis. K úpravě klinického
pes	5	0,5	stavu došlo 10 až 20 dnů po imunizaci
kůň	5	0,7
černý panter	1	6,0	zvířata byla napadena trichofytózou kmenem T.
červená liška	4	1,0	mentagrophytes. Úprava klinického stavu 12 až 15
medvěd	2	5,0	dnů po imunizaci
horská ovce	1	7,0
kůň	15	1,0	napadení M. equinum, úprava 12 až 20 dnů po imunisaci

Literatura (1) Aisenberg A. A., Noskow A. I., Kolovatsky P. P.: „Primenenie Yulona v Veterinarii“ v Scientific and Technical Information Bulletin of the Statě Scientific Control Committee under the Moldavian Council of Ministers (1958), str. 88.

(2) SU patentový spis č. 548 947 (1976).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vakcína proti dermatomykózám, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní materiál z alespoň jednoho z následujících inaktivovaných kmenů dermatofytů: Trichophytou verrucosum, kmen č. VKPGF-931/410, DSM 7277, a/nebo Trichophyton mentagrophytes, kmen č. VKPGF-930/1032, DSM 7279, a/nebo Trichophyton sarkisovii, kmen č. VKPGF-551/68, DSM 7278, Trichophyton equinum, kmen č. VKPGF-929/381, DSM 7276, Microsporum canis, kmen VKPGF-928/1393, DSM 7281, Microsporum canis var. obesum, kmen č. VKPGF727/1311, DSM 7280, a/nebo Microsporum canis var. distortum, kmen č. VKPGF-728/120, DSM 7275, a/nebo Microsporum gypseum, kmen č. VKPGF-729/59, DSM 7274.
2. Vakcínaproti dermatomykózám podle nároku 1,vyznačující se t í m, že obsahuje antigenní materiál z inaktivovaných dermatofytů:

Trichophyton verrucosum, DSM 7277, Trichophyton mentagrophytes, DSM 7279 a Trichophyton sarkisovii, DSM 7278.
3. Vakcína proti dermatomykózám podle nároku 1, vyznačující se tím, ze obsahuje antigenní materiál z inaktivovaných dermatofytů:

Trichophyton equinum, DSM 7276,

Microsporum canis, DSM 7275, 7280 nebo 7281 a

Microsporum gypseum, DSM 7274.
4. Vakcína proti dermatomykózám podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní materiál ze tří různých inaktivovaných kmenů Microsporum canis, var. distortum, DSM 7275, var. obesum, DSM 7280 a DSM 7281.
5. Vakcína proti dermatomykózám podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní materiál z inaktivovaných dermatofytů:

Trichophyton equinum, DSM 7276, Microsporum canis, DSM 7281,

-14CZ 287995 B6

Microsporum canis var. obesum, DSM 7280,

Microsporum gypseum, DSM 7274.
6. Vakcína proti dermatomykózám podle nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní materiál ze všech následujících inaktivovaných kmenů dermatofytů Trichophyton verrucosum č. VKPGF-931/410, DSM 7277 a Trichophyton mentagrophytes, kmen č. VKPGF-930/1032, DSM 7279 a Trichophyton sarkisovii kmen č. VKPGF-551/68, DSM 7278 a Trichophyton equinum č. VKPGF-929/381, DSM 7276, a Microsporum canis č. VKPGF-928/1393, DSM 7281, a Microsporum canis var. obesum, č. VKPGF-727/1311, DSM 7280, Microsporum canis var. distortum, č. VKPGF-728/120, DSM 7275 a Microsporum gypseum č. VKPGF-729/59, DSM 7274.
7. Vakcína proti dermatomykózám podle některého z nároků laž6, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní materiál z inaktivovaných čistých kultur dermatofytů.
8. Vakcína proti dermatomykózám podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní materiál z kultur dermatofytů, inaktivovaných thiomersalem, 2propiolaktonem nebo formaldehydem.
9. Vakcína proti dermatomykózám podle některého z nároků laž8, vyznačující se tím, že jako antigenní materiál z dermatofytů obsahuje homogenizovanou kulturu dermatofytů.
10. Vakcína proti dermatomykózám podle některého z nároků laž9, vyznačující se tím, že jako antigenní materiál z dermatofytů obsahuje 40 až 120 milionů mikrokonidií v 1 ml.
11. Vakcína proti dermatomykózám podle některého z nároků lažlO, vyznačující se tím, že kromě antigenního materiálu obsahuje ještě pomocný prostředek.
12. Vakcína proti dermatomykózám podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že kromě antigenního materiálu obsahuje ještě z fyziologického hlediska přijatelný nosič.
13. Vakcína proti dermatomykózám podle některého z nároků lažl2, vyznačující se tím, že jako fyziologicky přijatelný nosič obsahuje vodný roztok s obsahem 0,2 až 2 % hmotnostních fermentované hydrolyzované svalové bílkoviny, 5 až 12 % hmotnostních glukózy a 0,1 až 1,2 % hmotnostních extraktu z kvasnic.
14. Trichophyton verrucosum č. VKPGF-931/410, DSM 7277, použitelný pro výrobu vakcíny proti dermatomykózám.
15. Trichophyton mentagrophytes č. VKPGF-930/1032, DSM 7279, použitelný pro výrobu vakcíny proti dermatomykózám.
16. Trichophyton equinum č. VKPGF-929/381, DSM 7276, použitelný pro výrobu vakcíny proti dermatomykózám.
17. Microsporum canis č. VKPGF-928/1393, DSM 7281, použitelný pro výrobu vakcíny proti dermatomykózám.
18. Microsporum canis var. obesum, č. VKPGF-727/1311, DSM 7280, použitelný pro výrobu vakcíny proti dermatomykózám.
19. Microsporum canis var. distortum, č. VKPGF-728/120, DSM 7275, použitelný pro výrobu vakcíny proti dermatomykózám.

-15CZ 287995 B6
20. Microsporum gypseum č. VKPGF-729/59, DSM 7274, použitelný pro výrobu vakcíny proti dermatomykózám.
21. Použití vakcíny proti dermatomykózám podle nároků 1 až 13 pro výrobu farmaceutického 5 prostředku k profylaxi a/nebo léčení dermatomykóz.
22. Použití vakcíny proti dermatomykózám podle některého z nároků 1 až 13 pro výrobu farmaceutického prostředku pro tvorbu imunity a/nebo odolnosti proti infekci, vyvolané dermatofyty.
23. Způsob výroby vakcíny podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že kultura dermatofytů se homogenizuje ve vodném roztoku, inkubuje dva dny a pak se inaktivuje.
24. Způsob podle nároků 23, vy zn ač uj í c í se t í m , že se směs po homogenizaci upraví 15 na obsah 40 až 120 milionů mikrokonidií na 1 ml.
25. Způsob podle nároku 23 nebo 24, vyznačující se tím, že se směs po homogenizaci upraví na 90 milionů mikrokonidií na 1 ml.

20
26. Způsob podle některého z nároků 23 až 25, vyznačující se tím, že se kultura inaktivuje thiomersalem 2-propiolaktonem nebo formaldehydem.
27. Způsob podle některého z nároků 23 až 26, vyznačující se tím, že se homogenizuje kultura, vypěstovaná na pevné živné půdě.