CZ288074B6 - Kapsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450 - Google Patents
Kapsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ288074B6 CZ288074B6 CZ19983050A CZ305098A CZ288074B6 CZ 288074 B6 CZ288074 B6 CZ 288074B6 CZ 19983050 A CZ19983050 A CZ 19983050A CZ 305098 A CZ305098 A CZ 305098A CZ 288074 B6 CZ288074 B6 CZ 288074B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cytochrome
- prodrug
- capsule
- cells
- cell
- Prior art date
Links
- 239000002775 capsule Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims abstract description 40
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims abstract description 40
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 108010020076 Cytochrome P-450 CYP2B1 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims abstract description 14
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 152
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 238000002679 ablation Methods 0.000 claims description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- -1 diallyl ammonia Chemical compound 0.000 abstract description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 abstract 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 80
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 31
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 30
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 6
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 5
- 108010087945 whey acidic proteins Proteins 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 101710167917 Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100024633 Carbonic anhydrase 2 Human genes 0.000 description 3
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 241000713821 Mason-Pfizer monkey virus Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000010914 gene-directed enzyme pro-drug therapy Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 2
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- CJRJTCMSQLEPFQ-UHFFFAOYSA-N 6-cat Chemical compound ClC1=CC=C2CC(N)CCC2=C1 CJRJTCMSQLEPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPSOKQFFOYYPKC-UHFFFAOYSA-N 7-pentoxyphenoxazin-3-one Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(OCCCCC)=CC=C3N=C21 ZPSOKQFFOYYPKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241001492360 Retroviral provirus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001342 constant potential amperometry Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000020335 dealkylation Effects 0.000 description 1
- 238000006900 dealkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002359 drug metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005496 eutectics Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940040511 liver extract Drugs 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical group 0.000 description 1
- PZNOBXVHZYGUEX-UHFFFAOYSA-N n-prop-2-enylprop-2-en-1-amine;hydrochloride Chemical compound Cl.C=CCNCC=C PZNOBXVHZYGUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
- C12N9/0079—Steroid 11 beta monooxygenase (P-450 protein)(1.14.15.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/126—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers
- A61K2035/128—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers capsules, e.g. microcapsules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Kapsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450, která sestává z porézní membrány, jež je propustná pro průchod molekul prodrogy do kapsule, přičemž molekuly prodrogy jsou přeměňovány na aktivní metabolity cytochromem P450. Materiál kapsule sestává z komplexu tvořeného sulfátem celulózy a polydimethyldiallylammonia. Buňka produkující cytochrom P450 obsahuje savčí expresní vektor pcDNA3 nesoucí gen cytochromu P450 z krysích jater, jenž kóduje cytochrom P450 2B1. Prodroga je cyklofosfamid a/nebo ifosfamid. Kapsule spolu s prodrogou je určena k léčbě rakovinového onemocnění nebo jiného obdobného onemocnění nebo poruchy, zejména rakoviny prsu nebo rakoviny slinivky. Řešení dále poskytuje farmaceutickou soupravu obsahující kapsuli a prodrogu, která je aktivovatelná cytochromem P450.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká kapsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450 a replikačně-defektních retrovirových vektorů kódujícími gen cytochromu P450, které jsou schopny změnit neškodné rakovinové prology na cytotoxické metabolity. Dále se vynález týká používání takových retrovirových vektorů na přípravu léčiv na léčbu různých druhů rakoviny nebo ablaci nádorů.
Dosavadní stav techniky
Protirakovinová léčiva, která se používají pro léčbu nádorů, se ve většině aplikují systémově a šíří se celým tělem pacienta. Vysoká systematická dávka takového léčiva, která je nutná pro léčbu rakoviny, je spojena s vedlejšími účinky nepříjemnými pro pacienta.
Ve snaze obejít tento problém, používaly se rakovinové prodrogy, které musejí být metabolizovány nebo aktivovány v těle předtím než se stanou cytotoxickými. Žel, lidské nádory, které obsahují příslušné vysoké hladiny aktivujících enzymů, jsou vzácné. Hlavním místem pro aktivací prodrog jsou játra. Aby se zajistilo, který je na vzdáleném místě, dostane dostatečnou dávku aktivovaného léku, množství aktivované prodrogy, která je produkována v játrech, musí být toto množství dosti velké, což zase vede k toxickým vedlejším účinkům pro pacienta.
Jednou ze strategií, kterou by bylo možno tyto problémy vysoké systemické koncentrace aktivovaných léků obejít, by bylo poskytnout prostředky pro aktivaci prodrogy přímo v místě nádoru nebo blízko místa nádoru. Tato strategie by vyžadovala, aby buňky nádoru, nebo buňky v místě nádoru byly geneticky změněné tak, aby produkovaly velká množství enzymů, které jsou třeba pro metabolizaci rakovinových prodrog. Retrovirální vektory se ideálně hodí pro stabilní dodávku genů do buněk, protože retrovirus integrovat DNA formu svého genomu do genomu hostitelské buňky, a tak všechny dceřinné buňky infikované buňky ponesou retrovirový vektor nesoucí terapeutický gen. Další výhodou je, že většina retrovirů infikuje pouze dělicí se buňky, a proto jsou ideálním nosičem dodávky genu pro buňky nádoru.
Bylo již testováno mnoho cytotoxických genů nesených retrovirovými vektory. Tyto geny kódují enzymy, které mohou měnit substance, které jsou farmakodynamicky a toxikologicky inertní i na úrovni vysokých dávek, ale které je možno změnit in vivo na vysoce aktivní metabolity (Connors, T.A.(1995), Gene Therapy 2: 702-709).
V chemoterapii rakoviny se zjistilo, že vhodně navržené prodrogy jsou účinné při léčbě zvířecích nádorů s vysokými hladinami aktivujícího enzymu (Connors, T. a Whisson, M. (1966) Nátuře 210: 866 867 a Cobb, L, a kol. (1969), Biochemical Pharmacology 18: 1519-1527). Klinické výsledky však zklamaly, protože bylo zjištěno, že lidská rakovina, která obsahuje příslušně vysoké hladiny aktivujícího enzymu, je vzácná (Connors, T. (1986), Xenobiotica 16: 975-988). Virově řízená enzymatická terapie prodrogou (VDEPT) a obecnější genově řízená enzymatická terapie prodrogou (GDEPT) spolu souvisejí v tom, že jejich cílem je také zničit buňky nádoru pomocí pro nádor specifickou aktivací prodrogy. V tomto případě je však genetické zakódování enzymu buď specificky zaměřeno na maligní buňky, neboje řízeno specifickým promotorem.
Až dosud se většina úsilí zaměřeného na terapii prodrogou soustředila na používání thymidinkinázy lidského herpes simplex viru (HSV-tk) jako suicidálního genu. I když enzym HSV-tk v kombinaci s prodrogou ganciclovir (GCV) byl doporučován jako dobrý systém pro GDEPT (Culver, k. a kol., (1992), Science 256: 1550-1552, Ram, Z. a kol., (1993), Cancer Research 53: 83-88 a Chen, S., Shine, H. a kol., (1 994), Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 3054-3057), existuje mnoho teoretických úvah, které by naznačovaly, že to v žádném případě není ta nej lepší kombi
-1 CZ 288074 B6 nace. Zaprvé, je to specifická látka S-fáze bez účinku na klidové buňky. Je tomu tak proto, že GCV monofosfát je krátkodobý a musí být přítomen, když buňky vstupují do S-fáze, aby měl toxický efekt. HSV-tk fosforuje GCV na monofosfátovou formu (reakce, kterou nemohou uskutečnit savčí enzymy), která je poté fosforylovaná buněčnými enzymy na trifosfátovou formu a začleněna do DNA. Zadruhé, aktivní léčivo je trifosfát a neočekávalo by se, že bude volně difundovat tak, aby způsobil pomocný efekt. Pomocný efekt však byl pozorován jak in vivo, i když se zdá, že je zapojena metabolická spolupráce a ve druhém případě může být některý efekt nepřímý a zahrnovat imunitní komponent (Bi, W., Parysek, L. a kol., (1993), Human Gene Therapy 4: 725-731, Vile, R. a Hart, I. (1993), Cancer Research 53: 3860-3864 a Freeman, S., Abboud, C. a kol., (1993), Cancer Research 53: 5274-5283). Jednou nevýhodou je, že pomocný efekt závisí na kontaktu buňka-buňka. Může to být způsobeno přítomností mezerového spojení tvořeného intimním kontaktem mezi transdukovanou buňkou a okolními buňkami, což umožňuje fosforylovaného gancicloviru.
Nedávno byly uvedeny zajímavé výsledky s buňkami, které byly transfikovány genem se zakódovaným krysím cytochromem P450 formy 2B1, a pak léčeny cyklofosfamidem (Chen,S., Shine, H. a kol., (1994), Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 3054- 3057).
Cílem tohoto vynálezu je poskytnout nové replikační-defektivní retrovirové vektory přenášející gen se zakódovaným cytochromem P450 pod transkripční kontrolou specifického regulačního elementu nebo promotoru cílové buňky nebo promotorů indukovatelných rentgenovým zářením, které mohou být transfikovány do obalových buněčných linií s cílem produkovat rekombinantní retrovirové částice užitečné pro genovou terapii různých druhů rakoviny.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je kapsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450, jejíž podstata spočívá vtom, že sestává z porézní membrány jež je propustná pro průchod molekul prodrogy do kapsule, přičemž molekuly prodrogy jsou přeměňovány na aktivní metabolity cytochromem P450. Materiál kapsule podle vynálezu sestává z komplexu tvořeného sulfátem celulózy a polydimethyldiallylammonia.
Význakem kapsule podle předloženého vynálezu je, že buňka produkující cytochrom P450 obsahuje savčí expresní vektor pcDNA3 nesoucí gen cytochromu P450 z krysích jater jenž kóduje cytochrom P450 2B1.
Kapsule podle vynálezu je vhodná pro použití k léčbě rakovinového onemocnění nebo jiného odborného onemocnění nebo poruchy.
Kapsule podle vynálezu je určená pro současné nebo následné podávání subjektu s prodrogou, která je aktivovaná cytochromem P-450, v terapeuticky účinném množství.
Význakem vynálezu je dále kapsule pro podávání injekčně a/nebo implantací do cílových buněk a/nebo v jejich místě, přičemž prodroga se podává systematicky a/nebo lokálně.
Cílové buňky jsou v souladu s vynálezem zejména buňky nádorů prsu a/nebo nádorů slinivky a prodroga je cyklofosfamid a/nebo ifosfamid.
Předložený vynález dále zahrnuje farmaceutickou kompozici, která obsahuje předmětnou kapsuli.
Součástí předloženého vynálezu je dále farmaceutická souprava, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje předmětnou kapsuli a prodrogu, která je aktivovatelná cytochromem P450.
-2CZ 288074 B6
Farmaceutická souprava podle vynálezu je dále vyznačená tím, že kapsule a prodroga jsou v různých lékových formách.
Farmaceutická souprava podle vynálezu může obsahovat kapsuli ve formě vhodné pro podávání injekcí a/nebo implantací do cílových orgánů a/nebo poblíž těchto cílových orgánů a prodrogu ve formě pro systematické a/nebo lokální podávání.
Význakem farmaceutické soupravy podle vynálezu je dále to, že obsahuje kapsule ve formě vhodné pro implantaci do a/nebo poblíž tkáně rakoviny prsu nebo tkáně rakoviny slinivky.
Farmaceutická souprava podle vynálezu obsahuje cyklofosfamid a/nebo ifosfamid jako prodrogu.
Význakem předloženého vynálezu je dále použití kapsuli podle vynálezu pro přípravu farmaceutické soupravy a použití pro přípravu farmaceutické kompozice pro ablaci nádorových buněk.
Vynález je založený na tom, že se využívá replikačně-defektní retrovirový vektor nesoucí gen cytochromu P450 pod transkripční kontrolou specifického regulačního elementu nebo promotoru cílové buňky nebo promotoru indukovatelného rentgenovým zářením.
Je to replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je uveden výše, kde vektor obsahuje oblast 5‘LTR struktury U3-R-U5; jednu nebo více sekvencí zvolených z kódujících nebo nekódujících sekvencí; a oblast 3‘LTR zahrnující zcela nebo částečně deletovanou oblast U3, kde zmíněná deletovaná oblast U3 je nahrazena polyvazební sekvencí obsahující specifický regulační element nebo promotor cílové buňky nebo promotor indukovatelný rentgenovým zářením, následovaný oblastí R a U5, která je charakterizována tím, že alespoň v jedné z kódujících sekvencí kóduje cytochrom P450.
Replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je uveden výše, ve kterém je specifický regulační element nebo promotor cílové buňky zvolen z jednoho nebo více elementů skupiny, kterou tvoří WAP, MMTV, specifické regulační elementy a promotory blaktoglobulinu a kaseinu, specifické regulační elementy a promotory pankreatu včetně regulačních elementů a promotorů karbonátdehydratázy II a b-glukokinázy, specifické regulační elementy a promotory lymfocytů včetně imunoglobulinu a MMTV lymfocytické specifické regulační elementy a promotory a MMTV specifické regulační elementy a promotory propůjčující responsivitu glukokortikoidním hormonům nebo směřující expresi do prsní žlázy.
Replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je uveden výše, ve kterém jsou uvedené oblasti LTR zvoleny z alespoň jednoho elementu skupiny, kterou tvoří LTR z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV a MPMV.
Replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je uveden výše, ve kterém je uvedený retrovirový vektor založen na vektoru BAG nebo vektoru pLXSN.
Replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je uveden výše, ve kterém je uvedený retrovirový vektor pLX2Bl připraven, jak je popsáno v příkladu 1.
Replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je veden výše, ve kterém je uvedený retrovirový vektor pc3/2Bl připraven, jak je popsáno v příkladu 2.
Replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je uveden výše, ve kterém jsou retrovirové sekvence zapojené do integrace retroviru pozměněny nebo alespoň částečně deletovány.
Replikačně-defektní retrovirový vektor, jak je uveden výše, ve kterém jsou uvedené regulační elementy nebo promotory regulovatelné jednáním molekul.
-3CZ 288074 B6
Linie obalových buněk transfikovaná replikačně-defektním retrovirovým vektorem, jak je uveden výše; uvedená linie obalové buňky obsahuje alespoň jedno retrovirově nebo rekombinantně retrovirově vytvořené kódování proteinů, které je třeba pro obalení uvedeného retrovirového vektoru.
Linie obalové buňky, jak je uvedena výše, kdy tato linie obalové buňky je původem z hlodavce, psa, kočky neboje lidská a je histokompatibilní s lidskou tkání.
Linie obalové buňky, jak je uvedena výše, kdy tato linie obalové buňky je zvolena ze skupiny, kterou tvoří psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 a GP+envAM-12.
Rekombinantní retrovirová částice vyprodukovaná kultivací linie obalové buňky, jak je uvedena výše, ve vhodných podmínkách s nepovinně následující izolací produkované rekombinantní retrovirové částice.
Farmaceutická kompozice obsahující rekombinantní retrovirovou částici, jak je uvedena výše, nebo linii obalové buňky, jak je uvedena výše.
Linie obalové buňky, jak je uvedena výše, zapouzdřená v porézní membráně, která je propustná pro rekombinantní retrovirové částice produkované uvedenou linií obalové buňky.
Linie obalové buňky, jak je uvedena výše, zapouzdřená v komplexu, který tvoří sulfát celulózy a polydimethyldiallylamonium.
Způsob ablace buněk nádoru, který spočívá v podávání subjektu, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství rekombinantní retrovirové částice, jak je uvedeno výše, linie obalové buňky, jak je uvedena výše, nebo zapouzdřenou linii obalové buňky, jak je uvedeno výše a buď současně, nebo s časovým odstupem, rakovinovou prodrogu, kterou je možno aktivovat cytochromem P450.
Způsob, jak je uveden výše, kdy buňky nádoru jsou buňkami nádoru prsu nebo pankreatického nádoru.
Způsob, jak je uveden výše, kde rekombinantní retrovirová částice, linie obalové buňky nebo zapouzdřená linie obalové buňky je podávána injekcí nebo implantací do nádoru nebo místa nádoru.
Použití rekombinantní retrovirové částice, jak je uvedeno výše, linie obalové buňky, jak je uvedeno výše, nebo zapouzdřené linie obalové buňky, jak je uvedeno výše, pro přípravu farmaceutické kompozice užitečné pro ablaci buněk nádoru.
Retrovirový provirus integrovaný v lidském genomu, nesoucím gen s cytochromem P450 pod transkripční kontrolu specifického regulačního elementu nebo promotoru cílové buňky nebo promotoru indukovatelného rentgenovým zářením;
a lidská buňka obsahující gen cytochromu P450 pod transkripční kontrolou specifického regulačního elementu nebo promotoru cílové buňky nebo promotoru indukovatelného rentgenovým zářením.
Cytochromy P450 tvoří širokou skupinu monooxygenáz, které katalyzují oxidaci širokého množství substrátů. Produkují je některé bakterie, kvasinky a vyšší organismy tam, kde hrají úlohu při detoxikaci xenobiotok, v bioaktivačních reakcích a metabolismu různých endogenních sloučenin.
-4CZ 288074 B6
Cytochrom P450 katalyzuje hydroxylaci běžně užívaných rakovinových prodrog cyklofosfamidu (CPA) a ifosfamidu na jejich aktivní toxické formy. Normálně je exprese endogenního genu pacienta s cytochromem P450 omezena na játra,a protitumorové účinky systematicky aplikovaných CPA závisejí na následné systemické distribuci toxických metabolitů drog z jater. To vedlo k problémům s toxicitou, protože aktivovaná droga ovlivňuje nejen tumor, ale rovněž ovlivňuje jiné normální tkáně pacienta, jako kostní dřeň a ledviny.
Terapeutický přístup, kde se gen cytochromu P450 selektivně zavádí do buněk nádoru a je v těchto buňkách příliš exprimovaný, by tento problém obešel. Toxické metabolity produkované z transdukovaných buněk nádoru ovlivňují okolní netransdukované buňky nádoru způsobem závisejícím na gradientu koncentrace. Další výhodou systému cytochrom P-450/CPA je nezávislost na replikaci buňky pro cytotoxické účinky na okolní buňky. Je tomu tak proto, že jeden z generovaných aktivních metabolitů působí mezi-řetězcové křížové vazby bez ohledu na fázi buněčného cyklu. Později, během syntézy DNA, je důsledkem těchto mezi-řetězcových křížových vazeb odumření buňky.
Retroviralní vektory jsou nejčastěji používané nosiče transferu genů pro klinické pokusy, které byly dosud provedeny. Většina z těchto pokusů však použila přístup ex vivo, kde byly buňky pacienta izolovány, modifikovány v kultuře, a pak pacientovi znovu zavedeny.
Pro léčbu rakoviny by bylo proveditelné izolovat buňky pacienta (buď tumorové buňky, nebo normální buňky), infikovat je in vitro rekombinantní retrovirovou částicí nesoucí gen kódující cytochrom P450, a pak je vrátit do pacienta v blízkosti tumoru. Tento přístup je však neobyčejně náročný na intenzivní práci, protože každá z pacientových buněk se musí izolovat, kultivovat, transdukovat genovou konstrukcí a úspěšně vrátit bez infekce náhodnými činidly. Náklady a čas, které jsou třeba při takovém přístupu, omezují jeho praktickou užitečnost.
Alternativně by bylo možno použít alogenický přístup, kde jeden druh buněk je infikován rekombinantní retrovirovou částicí nesoucí gen kódující P450 a pak jej použít pro léčbu mnoha různých pacientů. Takový přístup je mnohem proveditelnější, za předpokladu, že bude možno překonat problémy imunitního odmítnutí. Většina nádorů však není vhodná pro genovou terapii ex vivo.
Ideálně by gen kódující cytochrom P450 měl být zaveden in vivo do buněk nádoru nebo do buněk v blízkosti nádoru.
Dodání genů iv vivo přináší množství nových problémů. Zaprvé a především je třeba se zabývat úvahami o bezpečnosti.
Hlavní otázkou při eventuální genové terapii in vivo z hlediska bezpečnosti i z čistě praktického hlediska je zacílení exprese. Je jasné, že terapeutické geny nesené vektory by neměly být exprimovány bez rozlišení do všech tkání a buněk, ale spíše jen do potřebné cílové buňky. Toto je zvláště důležité, když geny, které mají být přeneseny, jsou takové geny aktivující prodrogu, které jsou určeny pro ablaci specifických buněk nádoru. Ať při ablaci či jinak, necílové buňky by byly zřejmě velice nežádoucí.
Základní náhodná integrace provirové formy retrovirového genomu do genomu infikovaných buněk představuje závažný etický problém, protože taková náhodná integrace může vést k aktivaci protoonkogenů, a tak vést k vývoji nové rakoviny. Většina výzkumných pracovníků by souhlasila, že replikačně-defektní retrovirus, jako jsou všechny, které se běžně používají, bude s mizivě malou pravděpodobností integrován do nebo blízko buněčného genu zapojeného v kontrole buněčné proliferace. Obecně se však také předpokládá, že explozivní expanze populace replikace schopných retrovirů zjediného infekčního případu nakonec zajistí dost integračních případů, aby se taková fenotypická integrace stala velice reálnou možností.
-5CZ 288074 B6
Systémy retrovirových vektorů jsou optimalizovány tak, aby minimalizovaly možnost přítomnosti replikace schopného viru. Je však dobře zdokumentováno, že rekombinační případy mezi komponenty systému retrovirových vektorů může vést k tvorbě potenciálně patogenní replikace schopného viru a bylo vytvořeno mnoho generací vektorových systémů, aby se minimalizovalo toto riziko rekombinace (Salmons, B. a Gíinzburg, W.H. (1993), Human Gene Therapy 4(2): 129-41.
Systémy retrovirových vektorů tvoří dva komponenty:
1) Retrovirový vektor samotný je modifikovaný retrovirus (vektor plazmid), ve kterém je gen kódující virové proteiny nahrazen terapeutickými geny. Protože náhrada genů kódujících virové proteiny účinně mrzačí virus, musí být zachráněn druhým komponentem v systému, který zajišťuje chybějící virové proteiny pro modifikovaný retrovirus.
Druhým komponentem je:
2) Linie buňky, která produkuje velká množství virových proteinů, avšak chybí jí schopnost produkovat replikace schopný virus. Tato linie buňky je známá jako linie obalové buňky a tvoří ji linie buňky transfikovaná jedním nebo více plazmidy nesoucími geny, které umožňují zapouzdření modifikovaného retrovirového vektoru.
Pro generování rekombinantní retrovirové částice je retrovirový vektor transfikován do linie obalové buňky. Za těchto podmínek je modifikovaný retrovirový genom včetně vsunutého terapeutického genu transkribován z retrovirového vektoru a zapouzdřen do modifikovaných retrovirových částic. Tyto rekombinantní retrovirové částice se pak použijí na infikování nádorových buněk, během čehož vektorový genom a jakýkoliv cytotoxický gen jsou integrovány do DNA cílové buňky. Buňka infikovaná takovou rekombinantní virovou částicí nemůže vyprodukovat nový vektorový virus, protože v těchto buňkách nejsou přítomny žádné virové proteiny ale DNA vektoru nesoucího terapeutikum je integrována do DNA buňky a nyní může být exprimována v infikované buňce.
Již dříve bylo popsáno mnoho systémů retrovirového vektoru, které by měly umožnit cílení přenášených cytotoxických genů (Salmons, B. a Gíinzburg, W.H. (1993), Human Gene Therapy 4(2): 129-41). Většina z těchto přístupů zahrnuje buď omezení infekčního případu na předem definované typy buněk, nebo použití heterologních promotorů pro nasměrování exprese spojených heterologních terapeutických genů do specifických typů nádorových buněk. Používají se takové heterologní promotory, které by měly řídit expresi spojených genů pouze do těch typů buněk, ve kterých je tento promotor normálně aktivní anebo dodatečně kontrolovatelný. Tyto promotory byly dříve vsunuty spolu s terapeutickým genem do těla retrovirových vektorů, na místo genů gag, pol nebo env.
Retrovirová dlouhá koncová perioda (LTR), která lemuje tyto geny, nese retrovirový promotor, který je obecně nespecifický v tom smyslu, že může pohánět expresi v mnoha různých typech buněk (Majors, J. (1990). v „Retroviruses - Strategies of replication (Swanstrom, R. a Vogt, P.K., Eds): Springer-Verlag, Berlin: 49-92). Byla popsána interference promotorů mezi LTR promotorem a heterologními interními promotory, jako jsou specifické promotory tkáně popsané výše. Kromě toho je známo, že retrovirové LTR obsahují silné posilovače, které mohou nezávisle nebo ve spojení s retrovirovým promotorem ovlivnit expresi buněčných genů blízko místa integrace retroviru. Ukázalo se, že tento mechanismus přispívá k tumorigenicitě u zvířat (van Lohuizen, M. a Bems, A. (1990), Biochim.Biophys.Acta 1 032. 213-235). Tato dvě pozorování podpořila vývoj autoinaktivujících vektorů (SIN), ve kterých jsou retrovirové promotory funkčně inaktivovány v cílové buňce (WO 94/29437). Mezi další modifikace těchto vektorů patří vsunutí kazet s promotorovým genem do oblasti LTR pro vytvoření dvojitých kopií vektorů (WO 89/11539). V obou těchto vektorech však jsou heterologní promotory vsunuté do těla vektoru nebo do oblasti LTR přímo spojeny s terapeutickým genem.
-6CZ 288074 B6
Výše popsaný SIN vektor, který nese deietovaný 3‘LTR (WO 94/29437), využívá kromě toho heterologní promotor jako promotoru Cytomegalovirus (CMV), místo retrovirového promotoru 5‘LTR (U3-volný 5‘LTR) pro pohon exprese konstrukce vektoru v linii obalové buňky. Ve 3‘LTR je také zahrnut heterologní polyadenylační signál (WO 94/29437).
Cílem tohoto vynálezu je stavba bezpečného retrovirového vektoru, který obsahuje gen cytochromu P450 jako terapeutický princip. Tento nový vektor nese heterologní konstitutivní, indukovatelný nebo pro tkáň specifický promotor anebo regulační element ve 3‘LTR, který se po infekci zdvojí a je translokován do 5‘LTR v cílové buňce. V infikované buňce tak zavedený promotor kontroluje expresi genu cytochromu P450, který je vsunut do těla vektoru. Tento vektor neprochází autoinaktivací - ale místo toho je změna promotoru, kdy vzniká název ProCon vektor pro konverzní vektory promotoru. Principy a výhody systému ProCon jsou podrobněji popsány ve WO 9607748.
Protože výsledkem konverze promotoru není autoinaktivace, retrovirový vektor bude transkripčně aktivní v cílové buňce, kromě toho oba LTR se budou z větší části skládat ze sekvencí heterologní promotor/posilovač v cílové buňce. To sníží pravděpodobnost toho, aby integrovaný vektor v cílové buňce byl vystaven stejné inaktivaci po dlouhá období, jak bylo popsáno u konvenčních vektorů (Xu, L., Yee, J.K. a kol., (1989), Virology 171:331-341) a rovněž sníží možnost rekombinace s endogenními retrovirovými sekvencemi a vznik potenciálně patopgenního replikace schopného viru, a tak zvýší bezpečnost systému.
Podle vynálezu není 5‘LTR konstrukce retrovirového vektoru modifikována a exprese virového vektoru v obalových buňkách je poháněna normálním retrovirovým promotorem U3. Normální retrovirová polyadenylace je povolena a ve 3‘LTR nejsou obsaženy žádné heterologní polyadenylační signály. To je důležité pro rozvoj strategií genové terapie in vivo, protože normální fyziologická regulace viru prostřednictvím normálního virového promotoru, a zahrnující eventuálně také normální virovou kontrolu polyadenylace, bude po dlouhá období převažovat in vivo, zatímco obalové buňky budou produkovat rekombinantní virus.
Po dosažení předcházejícího a dalších cílů vynález poskytuje retrovirový vektor, který prochází konverzí promotoru zahrnující region 5‘LTR struktury U3-R-U5; jednu nebo více kódovacích sekvencí zvolených ze skupiny genů známých jako geny cytochromu P450; a oblast 3‘LTR obsahující zcela nebo částečně deletovanou oblast U3, kde uvedená deletovaná oblast U3 je nahrazena heterologním promotorem, následovaným R a U5 oblastí.
Uvedený promotor může být konstitutivní jako Cytomegalovirus (CMV), přímý prvotní promotor/posilovač, indukovatelný jako glukokortikoidní hormony (např. promotor MMTV) nebo specifické pro cílovou buňku.
Specifické regulační elementy a promotory pro cílovou buňku jsou voleny z jednoho nebo více elementů jakéhokoliv genu, ale v této konkrétní formě mohou být z promotorů, které zahrnují regulační elementy a promotory karbonátdehydratázy II a beta-glukokinázy, regulační elementy a promotory specifické pro lymfocyty včetně regulačních elementů a promotorů karbonátdehydratázy II a β-glukokinázy, regulační elementy a promotory specifické pro lymfocyty z acidických proteinů syrovátky (WAP), myší virus nádoru prsu (MMTV), regulační elementy a promotory specifické pro β-laktoglobulin a kaasein, regulační elementy a promotory specifické pro pankreas včetně lymfocytických regulačních elementů a promotorů specifických pro imunoglobulin a MMTV a promotory a regulační elementy specifické pro MMTV a promotory přenášející responsivitu na glukokortikoidní hormony či směřující expresi do prsní žlázy. Mezi jiné promotory patří například CD4, CD34 a promotory IL2. Uvedené regulační elementy a promotory regulují nejlépe expresi uvedeného retrovirového vektoru.
-7CZ 288074 B6
Zdá se, že oblast promotoru WAP, který je nutný pro zprostředkování specifičnosti prsní žlázy, je restrikční fragment 320 bp Xhol/Xbal (-413 až -93) (Kolb, A.F., Gunzburg, W.H., Albang, R., Brém, G., Erfle, V., a Salmons, B. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 217,1045-1052). Určité experimenty kromě toho naznačují, že fragment promotoru 0.6 Kb Pstl MMTV (Salmons, B., Groner, B., Calberg Bača, C.M., a Ponta, H. (1985), Virology 144: 101-114) může hrát úlohu při regulaci specifičnosti exprese prsní žlázy vykazovanou MMTV (Kolb, A.F., Gunzburg, W.H., Albang, R., Brém, G., Erfle, V., a Salmons, B. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 1045-1052).
Oblasti LTR se volí alespoň z jednoho elementu skupiny, kterou tvoří LTR viru myší leukémie (MLV), myší virus nádoru prsu (MMTV), myší virus sarkomu (MSV), opičí virus imunodeficience (SIV), lidský virus imunodeficience (HIV), lidský virus leukémie T-buňky (HTLV), kočičí virus imunodeficience (FIV), kočičí virus leukémie (FELV), hovězí virus leukémie (BLV) a virus opice Mason-Pfizer (MPMV).
Retrovirový vektor je s výhodou založen na vektoru LXSN (Miller, A.D. a Rosman, G.J. (1989), Biotechniques 7:980-990), pBAG (Price, J., Turner, D. a kol., (1987), Proc.Natl. Acad.Sci. USA 84: 156-160) nebo hybridu obou.
Kódující sekvence terapeutického genu může být jakýkoliv gen cytochromu P450, ale s výhodou je to krysí cytochrom P450 forma 2B1, kterou definovali Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y., a kol., (1982) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: 2793-2797.
V další konkrétní formě vynálezu je zajištěn systém retrovirového vektoru, který tvoří retrovirový vektor, jak byl popsán výše, jako první komponent a linie obalové buňky obsahující alespoň jednu retrovirovou nebo rekombinantně retrovirovou kódující konstrukci pro proteiny, která je nutná pro zapouzdření uvedeného retrovirového vektoru.
Linie obalové buňky je výhodou zvolena z elementu skupiny, kterou tvoří Ψ-2, Ψ-Crypt, ΨAM, GP+E-86, PA317 a GP+envAM-12, nebo kterákoliv z těchto konstrukcí supertransfikovaná rekombinantem, což umožňuje expresi povrchových proteinů z jiných zapouzdřených virů.
Vynález rovněž zahrnuje mRNA vyplývající z retrovirového vektoru podle vynálezu.
V linii obalové buňky je exprese retrovirového vektoru regulována normálním neselektivním retrovirovým promotorem obsaženým v oblasti U3. Jakmile však vektor vstoupí do cílové buňky, dojde ke konverzi promotoru a gen P450 je exprimován z výběrového promotoru specifického pro tkáň nebo indukovatelného, vsunutého do vektoru ProCon. Nejen že jakýkoliv promotor specifický pro tkáň je možno do systému zahrnout, čímž umožňuje selektivní zacílení širokého množství různých typů buněk, ale kromě toho po konverzi již struktura a vlastnosti retrovirového vektoru nepřipomínají strukturu a vlastnosti viru. To má samozřejmě neobyčejně významné důsledky z hlediska bezpečnosti.
Tyto vektorové systémy budou použity pro generování rekombinantního viru, který je možno použít pro infikování nádorových nebo normálních buněk in vivo.
Rekombinantní retroviry, které byly purifikovány nebo koncentrovány, je možno uchovat přidáním nejdříve dostatečného množství formulačního pufru do média obsahujícího rekombinantní retrovirus, aby se vytvořila vodná suspenze. Formulační pufr je vodný roztok, který obsahuje sacharid, strukturální aditivum s vysokou molekulovou hmotností a pufrovací komponentu ve vodě. Vhodný roztok může také obsahovat jednu nebo více aminokyselin.
Rekombinantní retrovirus je také možno uchovat v purifikované formě. Konkrétněji, před přidáním formulačního pufru může být výše popsaný surový rekombinantní retrovirus vyčištěn přes filtr, a poté se zkoncentruje, jako systémem koncentrace s příčným tokem (Filtron Technolo
-8CZ 288074 B6 gy Corp., Nortborough, ΜΑ). V rámci jedné konkrétní formy se přidá DNáza do koncentrátu, aby byla digerována exogenní DNA. Výluh se pak diafiltruje, aby se odstranily nadbytečné komponenty média a vytvořil se rekombinantní retrovirus ve vhodnějším pufrovaném roztoku. Diafiltrát se pak vede přes gelovou kolonu Sephadex S-500 a vymývá se purifikovaný rekombinantní retrovirus. K tomuto eluátu se přidá dostatečné množství formulačního pufru, aby bylo dosaženo požadované finální koncentrace konstituentů a aby se rekombinantní retrovirus minimálně zředil a vodná suspenze se pak skladuje, nejméně při -70 °C nebo okamžitě vysušená. Jak bylo uvedeno výše, formulační pufr je vodný roztok, který obsahuje sacharid, strukturální aditivum s vysokou molekulární hmotností a pufrovací komponentu ve vodě, tento vodný roztok může také obsahovat jednu nebo více aminokyselin.
Surový rekombinantní retrovirus je také možno purifikovat chromatografií v ionexové koloně. Obecně se surový rekombinantní retrovirus čistí přes filtr a filtrát se založí do kolony, která obsahuje vysoce sulfonovanou celulózovou matrici. Rekombinantní retrovirus se vymývá z kolony v purifikované formě při použití vysoce solného pufru. Vysoce solný pufr se pak nahradí vhodnějším pufrem tak, že elauát se vede přes kolonu molekulárního vylučování. Poté se přidá dostatečné množství formulačního pufru, jak je uvedeno výše, do purifikovaného rekombinantního retroviru, a pak se vodná suspenze buď okamžitě vysuší, nebo skladuje, nejlépe při -70 °C.
Vodnou suspenzi v surové nebo purifikované formě je možno vysušit lyofilizací nebo odpařováním při teplotě místnosti. Konkrétně, lyofilizace zahrnuje kroky ochlazení vodné suspenze pod teplotu skelného přechodu nebo pod teplotu eutektického bodu vodné suspenze a odstranění vody z ochlazené suspenze sublimací, takže se vytvoří lyofílizovaný retrovirus. Když je rekombinantní retrovirus lyofilízován, je stabilní a může být skladován při teplotě 20 °C až 25 °C, jak je podrobněji uvedeno dále.
Při metodě odpařování se voda odstraní z vodné suspenze při teplotě místnosti odpařováním. Vodu je také možno odstranit rozprašovacím sušením.
Vodné roztoky, které se používají pro formulaci, jak bylo popsáno výše, se skládají ze sacharidu, strukturálního aditiva s vysokou molekulovou hmotností, pufrovacího komponentu a vody. Roztok může také obsahovat jednu nebo více aminokyselin. Kombinace těchto komponentů funguje tak, aby zachovala aktivitu rekombinantního retroviru při zmrazení a lyofilizací nebo sušení pomocí odpařování.
Strukturální aditivum s vysokou molekulovou hmotností pomáhá zabránit agregaci viru během zmrazování a zajišťuje strukturální podporu v lyofilizovaném nebo sušeném stavu. V kontextu tohoto vynálezu se podkládají strukturální aditiva za strukturální aditiva „s vysokou molekulovou hmotností“, jestliže jsou větší, než 5000 m.h. Nej lepším strukturálním aditivem s vysokou molekulární hmotností je lidský sérový albumin. Aminokyseliny, jestliže jsou přítomny, fungují tak, aby dále zachovaly infektivitu viru při ochlazení a rozmrazování vodné suspenze. Kromě toho fungují aminokyseliny tak, aby se dále zachovala infektivita viru během sublimace ochlazené vodné suspenze a když je v lyofilizovaném stavu.
Pufrovací komponent funguje tak, aby pufroval roztok tím, že zachová relativně konstantní pH. Je možno použít různé pufry v závislosti na požadovaném rozsahu pH, nejlépe mezi 7,0 a 7,8.
Vodné roztoky pro vytvoření rekombinantních retrovirů jsou podrobně popsány ve WO-A296121014.
Kromě toho, je lepší, aby vodný roztok obsahoval neutrální sůl, která se používá na úpravu finálně vytvořeného rekombinantního retroviru na příslušnou izoosmotickou koncentraci soli.
Lyofílizované nebo dehydrované retroviry je možno rekonstituovat za použití různých substancí, ale nejlépe se rekonstituují při použití vody. V určitých případech je možno také použít zředěné
-9CZ 288074 B6 slané roztoky, které dovedou finální formulaci k izotonicitě. kromě toho, může být výhodné použít vodné roztoky obsahující komponenty, o kterých je známo, že podporují aktivity rekonstituovaného retroviru. Mezi takové komponenty patří cytokinázy, jako IL-2, polykationty, jako protaminsulfát nebo jiné komponenty, které podporují transdukční účinnost rekonstituovaného retroviru. Lyofilizovaný nebo dehydrovaný rekombinantní retrovirus může být rekonstituován jakýmkoliv vhodným množstvím vody nebo rekonstitučních činidel, která umožňují podstatnou a raději úplnou solubilizaci lyofilizovaného nebi dehydrovaného vzorku.
Rekombinantní retrovirové částice mohou být podávány do širokého množství míst, včetně například takových míst, jako je orgán nebo místo nádoru. V jiných konkrétních formách může být rekombinantní retrovirus podáván orálně, intravenózně, bukálně/sublingválně, intraperitoneálně nebo podkožně. Denní dávkování závisí na přesném způsobu podávání, formě, v níž se podává, indikaci, proti které je podávání zaměřeno, daném subjektu a tělesné váze daného subjektu, a dále na preferenci a zkušenostech pověřeného lékaře.
Způsoby podávání zde popsané je možno uskutečnit prostě přímým podáním za použití jehly, katétru nebo souvisejícího zařízení. Konkrétně, u určitých konkrétních forem vynálezu, je možno přímo podat jednu nebo více dávek.
V jedné konkrétní formě vynálezu budou obalové buňky uzavřeny v kapsu lích. Pro účinnou léčbu musejí buňky produkující virus přežít dlouhá období v cílovém orgánu po implantaci a virus musí být během těchto období produkován a uvolňován z obalových buněk. Tím by svým účinkem obalové buňky, které produkují virus, představovaly malou továrnu na výrobu viru, umístěnou na místě aplikace. To umožní účinnou dodávku rekombinantního viru in vivo. Jinak infikované normální buňky, lidského původu nebo buňky původem zjiných druhů, budou zapouzdřeny a implantovány, a tak vytvoří malou továrnu na konverzi prodrogy, kterou je možno umístit blízko nebo do hmoty nádoru.
Dlouhodobá účinnost tohoto přístupu závisí na (1) ochraně buněk z hostitelského imunitního systému, který by normálně eliminoval buňky produkující virus nebo infikované buňky, zvláště jestliže tyto buňky jsou z různých druhů, jak tomu obvykle je v případě buněk produkujících retrovirový vektor a na (2) přežití in sítu po dlouhá období, což může vyžadovat vaskularizaci.
Bylo zjištěno, že neustálé produkce vektorového viru z implantovaných obalových buněk je možno dosáhnout příslušným zapouzdřením obalových buněk produkujících virus před implantací, v mikrokapslích s polopropustnými membránami. Kromě toho bylo zjištěno, že takové kapsule se v hostiteli dobře naroubují, dojde u nich k vaskularizaci a nevyvolávají imunitní nebo zánětlivou reakci hostitele. Tato zjištění, spolu s polopropustností membrány kapsulí, umožňuje dlouhodobou dodávku retrovirálního vektoru in vivo.
Byla vyvinuta technologie zapouzdření zajišťující enkapsulaci obalových buněk produkujících virus a buněk infikovaných virem nebo normálních buněk v materiálu na základě celulózy. Při použití této techniky se zapouzdří až 1010, ale spíše 105-107 buněk v komplexu elektrolytu (např. z alginátu a polylyzinu nebo raději sulfátu celulózy a polydimethyl-diallylamonium chloridu) nebo v jiných porézních strukturách (jako polyamidy, polysulfony). Výsledné kapsule mohou mít různý průměr mezi 0,01 a 5 mm, ale s výhodou 0,1 a 1 mm. Je tedy možno vyrobit kapsule, které budou obsahovat různé množství buněk. Kapsule je polopropustná s póry, které jsou dostatečně velké, aby umožňovaly virům nebo molekulám prodrog prostupovat, ale dostatečně malé, aby chránily buňky imunitního systému před přístupem buněk, čímž významně snižuje imunitní reakci na tyto buňky. Kapsule a zapouzdřené buňky se kultivují v normálním kultivačním médiu pro buňky (jeho povaha závisí na linii zapouzdřené buňky) při standardních podmínkách vlhkosti, teploty a koncentrace CO2.
-10CZ 288074 B6
Po vhodné době kultivace (normálně ne méně než 1 hodinu a ne více než 30 dní), mohou být kapsule obsahující buňky chirurgicky implantovány do různých oblastí buď přímo, nebo injekcí za použití injekční stříkačky.
V různé době po implantaci enkapsulovaných buněk může být hostitel léčen cyklofosfamidem nebo ifosfamidem lokálně nebo systemicky. Buňky infikované virem exprimujícím cytochrom P450 změní tyto prodrogy na aktivní metabolity, které působí alkylaci a příčnou vazbu DNA. Rovněž buňky nesoucí a exprimující gen cytochromu P450 (jako zapouzdřené infikované buňky nebo obalové buňky) budou také katalyzátorem této konverze. V jedné konkrétní formě tohoto vynálezu tyto zapouzdřené infikované nebo obalové buňky budou buď pomalu se dělící buňky, nebo buňky, které byly ošetřeny mitomycinem C, nízkými dávkami záření nebo jinými prostředky, které zabrání replikaci buněk, a tak zabrání tomu, aby buňky samy byly ovlivněny cytotoxickými účinky prodrog.
Následující příklady budou tento vynález dále ilustrovat. Tyto příklady však v žádném případě nejsou míněny tak, aby omezovaly rozsah tohoto vynálezu, protože zřejmé modifikace budou patrné pro kohokoliv, kdo je zběhlý v této technice.
Příklad 1
Tento případ popisuje stavbu retrovirového expresního vektoru pro intratumorální infekci, který obsahuje gen pro krysí cytochrom P450 2B1.
Vektor exprese pLX2Bl, znázorněný na obrázku 1, byl konstruován ligací fragmentů získaných z plazmidu pLX125 a pSWl (Kedzie, K.M., Escobar, G.Y., Grimm, S.W., He, Y.A., Pepperl, D.J., Regan, J.W., Stevens, J.C., a Halpert, J.R. (1991), J. Biol. Chem. 266(33).2 215-2). pLX125 byl připraven, jak je popsáno v přihlášce (PCT/EP96/04447 zveřejněné jako WO97/13867).
Plazmid pLX125 byl linearizován a Hpal a výsledné tupé konce defosforylovány při použití telecí střevní fosfatázy. DNA byla purifikována separací na 1 % gelové agarose, excize a příprava používala protokol Qiaquick (Qiagen). Po precipitaci ethanolem byla DNA znovu suspendována ve vodě.
Klonovací vektor pSWl byl štěpen pomocí Smál a HincII, aby vznikly dva fragmenty s tupými konci. Směs výluhu byla separována na 1 % gelové agarose. Nejkratší fragment (l,5kb), který obsahoval krysí cytochrom P450 2B1 cDNA (Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y. a kol. (1982), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: 2793-2797) byl vyříznut a eluován za použití protokolu Qiaquick extrakce DNA, ethalonem precipitován a znovu suspendován ve vodě.
7,6 fMol pLX125 a 24 fMol fragmentu Smal/HindlI z PSWl byly smíchány a ligovány 3 dny při 12 °C za použití T4-ligázy (Boehringer). Ligáza byla inaktivována při 65 °C po dobu 10 min a DNA precipitována 10 násobným objemem butanolu. Precipitovaná DNA byla znovu suspendována ve vodě a elektroporována do bakterie DH10B (Gibco). Byly vybrány kolonie resistentní na ampicilin, připravena DNA a zkušebně štěpena se SspBI/SalI, BamHI/SspBI, Pvul a BamHl. Konečný správný plazmid byl označen pLX2Bl (viz Obr. 1).
Lipofekce
Jeden den před lipofekcí bylo nasazeno 3xl06 retrovirových obalových buněk PA317 (Miller, A.D. a Buttimore, C. (1986), Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902) do 10 cm petriho nebo kultivačních misek. V den infekce byly 4 pg pLX2Bl smíchány se 300 μΐ média bez séra. Souběžně bylo 45 μΐ Lipofectaminu (Gibco BRL) smícháno se 300 μΐ média bez séra. Roztok obsahující plazmid byl přidán ke směsi Lipofectaminu a inkubován po dobu 45 min. Po 35 min byly buňky
-11CZ 288074 B6 jednou promyty 6 ml média bez séra. 2,4 média bez séra bylo přidáno ke směsi lipofekce a výsledný 1 ml byl vložen na připravené buňky. Po 5 hodinách byly přidány 3,5 ml Dulbeccova modifikovaného Eagles média s obsahem 20 % FCS. Příštího dne byly buňky vystaveny trypsinu a rozředěny v poměru 1:20 a nasazeny na 100 mm misku. Po 24 hodinách byla média nahrazena 5 médiem obsahujícím analog neomycinu G418. Populace buněk byly izolovány a analyzovány pro expresi cytochromu P450.
Supematant z těchto populací buněk byl použit pro infikování cílových buněk CK. 1 ml supematantu obsahujícího viros z 5xl06 buněk byl přefiltrován přes filtr 0,45 pm a přidán do lxlO6 10 cílových CK buněk za přítomnosti 8 pg/ml polybrenu. Po 4 hodinách byl přidán ml Dulbecco modifikovaného eagles média s 10 % fetálního telecího séra, příští den byly buňky vystaveny trypsinu, zředěny a o 24 hodin později vloženy do selekčního média obsahujícího dalších 400 pg/ml G418. Po 2 týdnech byly izolovány kolonie resistentní na G418 a testovány na aktivitu cytochromu P450 2B1. 2x104 buněk bylo rozprostřeno na 3 cm misku a vystaveno koncentraci 15 ifosfamidu měnící se mezi 0 a 5 mM. Byla pozorována vyšší senzitivita buněk infikovaných retrovirem s cytochromem P450 2B1 ve srovnání s kontrolními, neinfíkovanými buňkami.
Enkapsulace (Zapouzdření)
Získané obalové buňky produkující retrovirový vektor jsou zapouzdřeny, jak je popsáno v příkladu 2 ve WO 97/01357.
Implantace
Získané kapsule jsou zbaveny chirurgickým zákrokem „klíčovou dírkou“ blízko nebo do transplantovaných nebo spontánních nádorů BAL/c nebo GR myší. Asi šest kapsulí o průměru 1 mm je vloženo na každém místě operace. Místo po chirurgickém zákroku je uzavřeno 1 suturou. Myši jsou pak léčeny cyklofosfamidem nebo ifosfamidem lokálně, přímou intratumorální injekcí 100 μΐ 20 mg/ml nebo systematickými koncentracemi 130 mg CPA/kg tělesné váhy 30 i.p.a 40-60 mg IFO/kg tělesné váhy i.p. po dobu maximálně 10 týdnů. Během této doby se denně monitoruje velikost nádoru a makroskopický vzhled. Myši jsou pak usmrceny, tkáň obsahující vsunutá kapsule a tumor vyjmuta, a připraveny histologické řezy pro světelnou a elektronovou mikroskopii. Tyto řezy jasně ukazují dobré naroubování pouzder, vaskularizaci a žádné důkazy přítomnosti lymfocytů, které by indikovaly buněčnou imunitní reakci. Tyto řezy také nevykazují 35 žádné známky odumření buněk nebo nekrózy v rámci kapsule. Naopak tumor vykazoval nekrózu a makroskopicky bylo za testované období jasné zmenšení velikosti.
Příklad 2
Tento příklad popisuje stavbu stabilní buněčné linie, která exprimuje konstitutivně krysí cytochrom P450 2B1.
Expresní vektor pc3/2Bl byl vytvořen ligací fragmentů získaných z plazmidu pcDNA3 (Invitro45 gen) a pSWl (Kedzie, K.M., Escobar, G.Y., Grimm, S.W., He, Y.A., Pepperl, D.J., Regan, J.W.,
Stevens, J.C., a Halpert, J.R. (1991), J. Biol. Chem. 266(33): 2 215-21).
Plazmid pcDNA3 byl štěpen pomocí Xhol/Xbal a výsledné fragmenty s lepivými konci byly defosfoiylovány za použití telecí střevní fosfázy. DNA páteř vektoru byla purifikována separací 50 na 1 % gelové agarose, excize a příprava používala protokol Qiaquick (Qiagen). Po precipitaci ethanolem byla DNA znovu suspendována ve vodě.
Klonovací vektor pSWl byl štěpen pomocí Xhol a Xbal, aby vznikly dva fragmenty. Směs výluhu byla separována na 1 % gelové agarose. Nejkratší fragment (l,5kb) obsahující cDNA 55 krysího cytochromu P450 2B1 (Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y. a kol., (1982), Proč. Nati.
-12CZ 288074 B6
Acad. Sci. USA 79: 2793-2797) byl vyříznut a eluován za použití Qiaquick protokolu extrakce DNA, precipitován ethanolem a znovu suspendován ve vodě.
8,3 fMol páteře pcDNA3 a 24,8 fMol fragmentu Xhol/Xbal a pSWl byly smíchány dohromady a ligovány 1 den při 12 °C při použití T4-ligázy (Boehringer). Ligáza byla inaktivovaná při 65 °C po dobu 10 min a DNA precipitovaná butanolem s 10 násobným objemem butanolu. Precipitovaná DNA byla znovu suspendována ve vodě a elektroporována do bakterie DH10B (Gibco). Byly vybrány kolonie resistentní na ampicilin, připravena DNA a zkušebně štěpena pomocí EcoRI, BamRV a Xhol. Finální správný plazmid byl označen pc3/2Bl.
Lipofekce
Před dnem transfekce bylo 3xl06 buněk z kočičí ledviny nasazeno do 100 mm misek. V den transfekce byly 4 pg pc3/2Bl smíchány se 100 pl média bez séra. Zároveň bylo smícháno 15 pl Lipofectaminu se 100 pl média bez séra. Roztok obsahující plazmid byl přidán ke směsi Lipofectaminu a inkubován po dobu 45 min. Po 35 min byly buňky jednou promyty 2 ml média bez séra. 800 pl média bez séra bylo přidáno ke směsi lipofekce a výsledný 1 ml byl dán na připravené buňky. Po 6 hodinách byl přidán lml DNEM (Glutamax) s 10 % FCS. Příští den se na buňky působilo tiypsinem a byly zředěny faktorem deset a nasazeny na 100 mm misku. Po 24 hodinách bylo médium nahrazeno neomycinovým médiem. Po 14 dnech byly izolovány klony resistentní na neomycin a testovány na přítomnost a aktivitu vektoru.
Buňky kočičí ledviny exprimující cytochrom P450 vykazovaly desetinásobně vyšší citlivost na ifosfamid nebo cyklofosfamid ve srovnání s buňkami standardního typu.
Vedlejší účinek bylo možno demonstrovat na normálním typu buněk kočičí ledviny, ale také na buňkách Rin5 derivovaných na pankreatickém nádoru. To bylo ukázáno společnou kultivací klonů buněk kočičí ledviny P450 2B1 buď s neprodukujícími buňkami kočičí ledviny normálního typu, nebo buňkami Rin5 derivovanými z krysího pankreatického nádoru a přidáním ifosfamidu. Neprodukující CK a Rin buňky jsou zahubeny toxickými metabolity ifosfamidu, které jsou produkovány a uvolňovány buňkami kočičí ledviny s cytochromem P450 2B1. Titrační studie za použití klonů jedné buňky kočičí ledviny s cytochromem P450 2B1 vykazovaly, že pouhých 0,25 mM ifosfamidu má specifické toxické účinky na tyto buňky a výsledkem 1-2 mM je odumření všech buněk. Klony buňky kočičí ledviny s cytochromem P450 2B1 byly vykázány analýzou řetězové reakce polymerázy, která získala genovou konstrukci DNA P450 2B1. Další biochemická analýza klonů za použití enzymatické dealkylace 7-pentoxyresorufinu cytochromem P450 2B1 odhalila, že geneticky modifikované buňky produkují cytochrom P450 2B1.
Kapsule obsahující tyto buňky byly vyrobeny jak je uvedeno v příkladu 1 a implantovány do myší blízko místa nádoru. Po léčbě cyklofosfamidem nebo ifosfamidem byla hodnocena účinnost léčby, jak je popsáno výše.
Retrovirový expresní vektor, který obsahuje gen kódující krysí cytochrom P450-2B1, může být také připraven, jak je dále popsáno v příkladě 4.
Příklad 3
Plazmid pLX125 byl nejdříve částečně štěpen restrikčním enzymem Xhol, aby vznikl vektor, který je linearizovaný na pozici 3547. Tento lineární plazmid byl dále štěpen restrikčním enzymem SspBI, aby se odstranil krátký fragment ve vícevazebném pLX125. V reparativním gelu se ukázalo, že správně odříznutý fragment vektoru je největším pásem. Při použití protokolu Quiaex (Qiagen) byla DNA v tomto pásu eluovaná a purifíkovaná z gelu.
-13CZ 288074 B6
Pro získání genu krysího cytochromu P450 2B1, byly buňky z linie buněk krysího hapatomu HTC podrobeny lýzi s roztokem D (4 M guanidium thiokyanátu, 25 mM citrátu sodného pH 7, 0,5 % N-natrium-laurylsarkosinu, O,1M 2-merkaptoethanolu) a celková RNA byla extrahována přidáním 1/15 objemu 3M octanu sodného, přidány byly při stejném objemu vody saturovaný 5 fenol a 1/5 objemu chloroform/izoamylalkoholu (49:1) a celá směs silně míchána. Po 15 min na ledu byl extrakt odstřeďován 20 min při 4 °C při 10 000 g. RNA ve vodné fázi byla precipitována s jedním objemem izopropanolu po dobu 3 min při -20 °C a odstřeďována při 10 000 g při 4 °C. Peleta byla promyta v 70% ethanolu a ponechána při teplotě místnosti po dobu 15 min odstřeďování při 4°C a 10 000 g byla peleta sušena ve vakuové sušičce a znovu rozpuštěna 10 v 0,5% roztoku SDS.
Extrahovaná RNA byla reverzně transkribována při použití protokolu pro syntézu cDNA (Pharmacia). Výsledná cDNA byla použita jako matrice pro PCR. Primery byly navrženy tak, aby obsahovaly SspBI restrikční místo (podtržené) v levém primeru (5‘15 AAGCCTGTACACTGGAGAGCATGCAC-3 ‘1 a celé místo Xhol (podtržené) v pravém primeru (5‘-CGATTACTCGAGACCTGGCTGCCTCA-3‘). Oba primery mají dodatečné báze na 5‘konci pro vyšší účinnost štěpení odpovídajícím restrikčním enzymem. 1526 bp-produkt byl štěpen pomocí Xhol a SspBI, aby se získaly tři fragmenty.
Tento nejdelší fragment (1545 bp), obsahující gen pro cytochrom P450, byl podvázán do Xhol/SspBI štěpeného plazmidu pLX125.
Stabilní linie buněk, která exprimuje krysí cytochrom P450 formu 2B1 konstitutivně, může být také připravena jak je dále popsáno v příkladu 5.
Příklad 4
Pro získání mRNA z krysího cytochromu P450 forma 2B1 byla usmrcena čtyři týdny stará 30 samice krysy, játra byla vyjmuta a okamžitě zmražena v kapalném dusíku. Zmrazená játra byla vložena do sterilizovaného filtrovaného GTC-pufřu (6M guanidium izothiokyanát, 5 mM citrát sodný, 0,lM 2-merkaptoethanol, 0,5 % N-natrium-laurylsarkosin) a homogenizovaná při teplotě místnosti. Pro separaci RNA byl extrakt z jater dán na polštář chloridu česného (5,7 M chlorid česný, 0,lMEDTA) a odstředěn ve sklopném rotoru při 20 °C a 32 000ot/min přes noc. 35 Po úplném odstranění supematantu byla peletovaná RNA znovu rozpuštěna v ledově studeném lOmM Tris pH 7,5 a precipitována přes noc při -20 °C s 1/15 objemu 3M octanu sodného a 2,5 objemu ethanolu. RNA byla odstřeďována ke dnu 40 min při 8 000 ot/min a 4 °C a vysušená peleta znovu suspendována ve sterilní vodě.
Extrahovaná RNA byla reverzně transkribovaná za použití protokolu pro syntézu cDNA (Pharmacia). Výsledná cDNA byla použita jako matrice pro následující PCR. Primer byl navržen tak, aby obsahoval restrikční místo EcoRI v levém primeru (5‘CGTGCGGAATTCGGCGGATTCAGCAT-3‘) a restrikční místo AcoRVI v pravém primeru (5‘-ATAACGGATATCACCTGGCTGCCTCA-3‘). Oba primery měly dodatečné báze na 45 5‘konci pro vyšší účinnost štěpeného enzymu. 1588 bp-amplifikator byl štěpen s EcoRI a AcoRV, aby se získali tři fragmenty.
Tento nejdelší fragment (1572 bp), obsahující gen pro cytochrom P450 2B1, byl ligován do EcoRI/EcoRV štěpeného plazmidu pcDNA3 (Innvitrogen).
-14CZ 288074 B6
Příklad 5
Stavba ProCon vektoru obsahujícího gen krysího cytochromu P450 pod transkripční kontrolu WAP promotoru.
Extrahovaná RNA připravená podle příkladu 4 byla reverzně transkribovaná za použití protokolu pro syntézu cDNA (Pharmacia). Výsledná cDNA je použita jako matrice (templát) pro PCR. Primery byly navrženy tak, aby obsahovaly restrikční místo BamHI (podtrženo) v levém primem (např. 5‘-AAGCCGGATCCCTGGAGAGCATGCAC-3‘) a BamHI místo (podtrženo) v pravém primerů (např. 5‘-CGATTAGGATCCCTGCCTCA-3‘). Oba primery mají dodatečné báze na 5‘-konci pro vyšší účinnost štěpení odpovídajícím restrikčním enzymem. 1526 bp produkt je štěpen pomocí BamHI a získaný fragment obsahující gen pro cytochrom P450 je ligován do BamHI štěpeného plazmidu pWAP6 (viz přihláška PCT č. PCT/EP96/03922 zveřejněná jako W097/09440).
Claims (16)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. K.apsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450, vyznačující se tím, že sestává z porézní membrány jež je propustná pro průchod molekul prodrogy do kapsule, přičemž molekuly prodrogy jsou přeměňovány na aktivní metabolity cytochromem P450.
- 2. Kapsule podle nároku 1,vyznačující se tím, že materiál kapsule sestává z komplexu tvořeného sulfátem celulózy a polydimethyldiallylammonia.
- 3. Kapsule podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že buňka produkující cytochrom P450 obsahuje savčí expresní vektor pcDNA3 nesoucí gen cytochromu P450 z krysích jater, jenž kóduje cytochrom P450 2B1.
- 4. Kapsule podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití k léčbě rakovinového onemocnění nebo jiného obdobného onemocnění nebo poruchy.
- 5. Kapsule podle nároků 1 a 4 pro současné nebo následné podávání subjektu s prodrogou, která je aktivovaná cytochromem P—450, v terapeuticky účinném množství.
- 6. Kapsule podle nároku 5 pro podávání injekčně a/nebo implantací do cílových buněk a/nebo v jejich místě, přičemž prodroga se podává systemicky a/nebo lokálně.
- 7. Kapsule podle kteréhokoliv z předchozích nároků 4až6, vyznačující se tím, že cílové buňky jsou buňky nádorů prsu a/nebo nádorů slinivky.
- 8. Kapsule podle kteréhokoliv z předchozích nároků 5až7, vyznačující se tím, že prodroga je cyklofosfamid a/nebo ifosfamid.
- 9. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje kapsuli podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8.
- 10. Farmaceutická souprava, vyznačující se tím, že obsahuje kapsuli podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8 a prodrogu, která je aktivovatelná cytochromem P450.-15CZ 288074 B6
- 11. Farmaceutická souprava podle nároku 10, vyznačující se tím, že kapsule aprodroga jsou v různých lékových formách.
- 12. Farmaceutická souprava podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje kapsule ve formě vhodné pro podávání injekcí a/nebo implantací do cílových orgánů a/nebo poblíž těchto cílových orgánů a prodrogu ve formě pro systemické a/nebo lokální podávání.
- 13. Farmaceutická souprava podle nároků 10ažl2, vyznačující se tím, že obsahuje kapsule ve formě vhodné pro implantaci do a/nebo poblíž tkáně rakoviny prsu nebo tkáně rakoviny slinivky.
- 14. Farmaceutická souprava podle nároků 10ažl3, vyznačující se tím, že obsahuje cyklofosfamid a/nebo ifosfamid jako prodrogu.
- 15. Použití kapsuli podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8 pro přípravu farmaceutické soupravy podle nároku 10.
- 16. Použití kapsuli podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8 pro přípravu farmaceutické kompozice pro ablaci nádorových buněk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK35296 | 1996-03-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ305098A3 CZ305098A3 (cs) | 1999-01-13 |
| CZ288074B6 true CZ288074B6 (cs) | 2001-04-11 |
Family
ID=8092560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19983050A CZ288074B6 (cs) | 1996-03-27 | 1997-03-27 | Kapsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6893634B1 (cs) |
| EP (1) | EP0892852B1 (cs) |
| JP (1) | JP4229982B2 (cs) |
| AT (1) | ATE309383T1 (cs) |
| AU (1) | AU713382B2 (cs) |
| CA (1) | CA2250173A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ288074B6 (cs) |
| DE (1) | DE69730595D1 (cs) |
| DK (1) | DK0892852T3 (cs) |
| ES (1) | ES2253775T3 (cs) |
| HU (1) | HU221349B1 (cs) |
| IL (1) | IL125795A0 (cs) |
| NO (1) | NO325392B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ331765A (cs) |
| PL (1) | PL188323B1 (cs) |
| RU (2) | RU2185821C2 (cs) |
| SI (1) | SI0892852T1 (cs) |
| SK (1) | SK282744B6 (cs) |
| WO (1) | WO1997035994A2 (cs) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE309000T1 (de) | 1995-06-27 | 2005-11-15 | Bavarian Nordic As | Verkapselte zellen die virenpartikeln produzieren |
| US6540995B1 (en) | 1996-03-27 | 2003-04-01 | Bavarian Nordic Research Institute Gmbh | Encapsulated cells producing cytochrome P450 |
| SI0892852T1 (sl) | 1996-03-27 | 2006-04-30 | Bavarian Nordic As | Inkapsulirane celice, ki eksprimirajo citokrom P450 za aktiviranje predzdravila |
| AU6328099A (en) * | 1998-09-21 | 2000-04-10 | Transgene S.A. | Pharmaceutical composition for the pre-treatment of a patient in need of drug or pro-drug |
| GB0400443D0 (en) | 2004-01-09 | 2004-02-11 | Oxford Biomedica Ltd | Cascade |
| US7091040B1 (en) * | 1999-01-04 | 2006-08-15 | Innovata Plc | P450/acetaminophen genetically directed enzyme prodrug therapy (GDEPT) |
| GB9900009D0 (en) * | 1999-01-04 | 1999-02-24 | Ml Lab Plc | Gene therapy |
| GB0010105D0 (en) * | 2000-04-26 | 2000-06-14 | Ml Lab Plc | Cell ablation |
| WO2003025191A2 (en) * | 2001-09-21 | 2003-03-27 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Pseudotyped retroviral vector system |
| GB201408233D0 (en) | 2014-05-09 | 2014-06-25 | Austrianova Singapore Pte Ltd | Use of polyanionic composition |
| MX377487B (es) | 2015-05-29 | 2025-03-04 | Univ Mexico Nac Autonoma | Nanoparticulas biocataliticas cyp-p22 con actividad citocromo p450 para la activacion de profarmacos. |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1215922A (en) * | 1984-05-25 | 1986-12-30 | Connaught Laboratories Limited | Microencapsulation of living tissue and cells |
| JPH02504344A (ja) | 1988-05-17 | 1990-12-13 | スローン‐ケツテリング・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ | レトロウイルスベクター |
| WO1994029437A1 (en) | 1993-06-07 | 1994-12-22 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Highly-efficient, self-inactivating, recombination-free, u3-free retroviral vectors |
| RU2039593C1 (ru) * | 1993-06-22 | 1995-07-20 | Ф.А. Чернышкова | Катализатор для получения фенола и ацетона |
| US5688773A (en) * | 1994-08-17 | 1997-11-18 | The General Hospital Corporation | Method of selectively destroying neoplastic cells |
| JP4037446B2 (ja) | 1994-09-02 | 2008-01-23 | ゲーエスエフ − フォルシュンクスツェントルム・フューア・ウムベルト・ウント・ゲズントハイト・ゲーエムベーハー | 非自己不活化性の発現標的化レトロウイルスベクタ |
| ATE309000T1 (de) | 1995-06-27 | 2005-11-15 | Bavarian Nordic As | Verkapselte zellen die virenpartikeln produzieren |
| JPH11511979A (ja) * | 1995-09-06 | 1999-10-19 | ババリアン・ノルディック・リサーチ・インスティテュート・アクティーゼルスカブ | ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性遺伝子を発現させるためのｗａｐまたはｍｍｔｖ制御配列の使用 |
| SI0892852T1 (sl) | 1996-03-27 | 2006-04-30 | Bavarian Nordic As | Inkapsulirane celice, ki eksprimirajo citokrom P450 za aktiviranje predzdravila |
-
1997
- 1997-03-27 SI SI9730726T patent/SI0892852T1/sl unknown
- 1997-03-27 NZ NZ331765A patent/NZ331765A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 HU HU9904116A patent/HU221349B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 EP EP97919307A patent/EP0892852B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 DE DE69730595T patent/DE69730595D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 JP JP53405197A patent/JP4229982B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 IL IL12579597A patent/IL125795A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 RU RU98119459/14A patent/RU2185821C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 RU RU2002103465/15A patent/RU2223788C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 ES ES97919307T patent/ES2253775T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 SK SK1323-98A patent/SK282744B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 AT AT97919307T patent/ATE309383T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 CA CA002250173A patent/CA2250173A1/en not_active Abandoned
- 1997-03-27 AU AU23827/97A patent/AU713382B2/en not_active Expired
- 1997-03-27 DK DK97919307T patent/DK0892852T3/da active
- 1997-03-27 PL PL97329071A patent/PL188323B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 CZ CZ19983050A patent/CZ288074B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 WO PCT/EP1997/001585 patent/WO1997035994A2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-24 US US09/160,067 patent/US6893634B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 NO NO19984540A patent/NO325392B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997035994A3 (en) | 1997-11-20 |
| HU221349B1 (en) | 2002-09-28 |
| US6893634B1 (en) | 2005-05-17 |
| CA2250173A1 (en) | 1997-10-02 |
| NO984540D0 (no) | 1998-09-28 |
| EP0892852B1 (en) | 2005-11-09 |
| NO325392B1 (no) | 2008-04-21 |
| JP2000509249A (ja) | 2000-07-25 |
| JP4229982B2 (ja) | 2009-02-25 |
| SK132398A3 (en) | 1999-04-13 |
| DK0892852T3 (da) | 2006-03-06 |
| WO1997035994A2 (en) | 1997-10-02 |
| HUP9904116A3 (en) | 2001-01-29 |
| AU2382797A (en) | 1997-10-17 |
| RU2185821C2 (ru) | 2002-07-27 |
| PL329071A1 (en) | 1999-03-15 |
| NZ331765A (en) | 2000-02-28 |
| SI0892852T1 (sl) | 2006-04-30 |
| DE69730595D1 (de) | 2004-10-14 |
| NO984540L (no) | 1998-09-28 |
| RU2223788C2 (ru) | 2004-02-20 |
| AU713382B2 (en) | 1999-12-02 |
| HUP9904116A2 (hu) | 2000-04-28 |
| ES2253775T3 (es) | 2006-06-01 |
| SK282744B6 (sk) | 2002-12-03 |
| ATE309383T1 (de) | 2005-11-15 |
| PL188323B1 (pl) | 2005-01-31 |
| IL125795A0 (en) | 1999-04-11 |
| EP0892852A2 (en) | 1999-01-27 |
| CZ305098A3 (cs) | 1999-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0776161B1 (en) | Use of a viral vector encoding a cytochrome p450 gene in combination with a chemotherapeutic agent for selectively destroying neoplastic cells | |
| JP4848348B2 (ja) | ウイルス粒子産生カプセル化細胞 | |
| US20020051763A1 (en) | Host-vector system which can be used in gene therapy | |
| JP2001000195A (ja) | 複製性又は半複製性ウイルス構築物、その製造、及び遺伝子送達のためのその用途 | |
| CZ288074B6 (cs) | Kapsule zapouzdřující buňky produkující cytochrom P450 | |
| EP0848757B1 (en) | The use of the wap of mmtv regulatory sequences for targeted expression of linked heterologous genes in human mammary cells, including human mammary carcinoma cells | |
| JP3535521B2 (ja) | レトロウイルスベクターおよび遺伝子治療におけるその用途 | |
| US6540995B1 (en) | Encapsulated cells producing cytochrome P450 | |
| Searle et al. | Sensitisation of human ovarian cancer cells to killing by the prodrug CB1954 following retroviral or adenoviral transfer of the E. coli nitroreductase gene | |
| JPH11503916A (ja) | 高力価組換えレトロウイルス調製物による細胞の高効率エクスビボ形質導入 | |
| EP0859854B1 (en) | Retroviral vectors carrying senescent cell derived inhibitors 1 (sdi-1) or antisense sdi-1 nucleotide sequences | |
| EP1179083A1 (en) | Triple hybrid amplicon vector systems to generate retroviral packaging lines | |
| Unger | Enriching suicide gene bearing tumor cells in vivo for an increased bystander effect: a novel strategy for cancer gene therapy | |
| Takebe et al. | Protection of Hematopoietic Progenitor Cells from Chemotherapy Toxicity by Transfer of Drug Resistance Genes | |
| Miyao et al. | Investigations of Retroviral-Mediated Gene Therapy for Malignant Glioma: Transduction with HTK-Bearing Retroviruses Sensitizes Glioma Cells to Ganciclovir |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110327 |