CZ289308B6 - Homologní rekombinantní expresní vektor pro expresi rekombinantních genů a způsob exprese rekombinantních genů - Google Patents

Abstract

Homologn rekombinantn expresn vektor pro expresi rekombinantn ch gen v "Non-Secreting/Zero" NS/O bu k ch, p°i em tento vektor zahrnuje promotor pro expresi rekombinantn ho genu, transkrip n jednotku k duj c selek n sign ln znak, a specifickou DNA sekvenci lokusu 2A my ho imunoglobulinu gama pro m stn c lenou homologn rekombinaci. Podle °e en byl identifikov n specifick² lokus v genomu my hostitelsk bu ky, ve kter m se za podm nek homologn rekombinace rekombinantn ho genu do tohoto specifick ho lokusu chromozomu dos hne stabiln integrace a n sledn²ch vysok²ch hladin exprese rekombinantn ho genu. Do rozsahu °e en rovn n le zp sob exprese rekombinantn ch gen .\

Description

Homologní rekombinantní expresní vektor pro expresi rekombinantních genů v Non-Secreting/Zero NS/O buňkách, přičemž tento vektor zahrnuje promotor pro expresi rekombinantního genu, transkripční jednotku kódující selekční signální znak, a specifickou DNA sekvenci lokusu 2A myšího imunoglobulinu gama pro místné cílenou homologní rekombinaci. Podle řešení byl identifikován specifický lokus v genomu myší hostitelské buňky, ve kterém se za podmínek homologní rekombinace rekombinantního genu do tohoto specifického lokusu chromozomu dosáhne stabilní integrace a následných vysokých hladin exprese rekombinantního genu. Do rozsahu řešení rovněž náleží způsob exprese rekombinantních genů.

(13) Druh dokumentu: B6 (51)lnt.Cl.⁷:

C12N 15/90

C12N 15/85

C07K 16/00

Homologní rekombinantní expresní vektor pro expresi rekombinantních genů a způsob exprese rekombinantních genů

Oblast techniky

Vynález se týká homologního rekombinantního expresního vektoru pro expresi rekombinantních genů v „Non-Secreting/Zero“ NS/O buňkách a způsobu exprese rekombinantních genů v „NonSecreting/Zero“ NS/O buňkách. Konkrétně byla podle vynálezu zjištěna metoda definování specifické pozice v genomu savců, která je výhodná pro vysokou hladinu exprese rekombinantních genů, a účinná metoda zvýšení frekvence klonů s vysokou expresí pomocí místního cílení expresních konstruktů do výhodných pozic genomu.

Dosavadní stav techniky

Rekombinantní expresní konstrukty jsou běžně používány pro generování stabilních savčích buněčných linií, které exprimují žádaný rekombinantní protein. Tyto rekombinantní expresní konstrukty mohou být buď toho typu, že v transfekované hostitelské buňce zůstávají ve formě extrachromozomálního plazmidu, nebo mohou patřit k typu, který se integruje do hostitelského genomu. Savčí hostitelské buňky, které nesou stabilně integrované kopie rekombinantních genů, jsou obvykle spolehlivější z hlediska udržování a integrity rekombinantního genu. Jakmile je identifikována hostitelská savčí rekombinantní buňka, která produkuje rekombinantní protein, jsou tyto integrované kopie rekombinantního genu vhodnější než extrachromozomální kopie tohoto genu.

Avšak frekvence buněčných linií nesoucích stabilně integrované kopie rekombinantního genu aexprimujících žádaný protein ve vysokých hladinách je značně nízká. Ktomu, aby byly identifikovány klony exprimující rekombinantní protein ve vysokých hladinách, musí být obvykle testována velká množství stabilně transfekovaných savčích buněk. Obecně se předpokládá, že tato skutečnost je způsobena jevy odehrávajícími se v oblasti inzerce rekombinantního genu do savčího genomu. S ohledem na velikost savčího genomu je vysoce nepravděpodobné, že náhodná integrace by vedla k inzerci rekombinantního genu do loku výhodného vysokou hladinou genové exprese.

Zvýšení frekvence výskytu takových buněčných linií, které by exprimovaly rekombinantní gen ve vysokých hladinách, by poskytlo mnohem větší fond expresorů s vysokou hladinou exprese pro následnou selekci buněčné linie, která by produkovala rekombinantní protein. Toto zvýšení frekvence výskytu by navíc znamenalo snížení počtu stabilních buněčných linií, které je třeba generovat, aby byly identifikovány expresory s vysokou hladinou exprese rekombinantních proteinů.

Podstata vynálezu

Podstatou řešení podle vynálezu je homologní rekombinantní expresní vektor pro expresi rekombinantních genů v „Non-Secreting/Zero“ NS/O buňkách, přičemž tento vektor zahrnuje promotor pro expresi rekombinantního genu, transkripční jednotku kódující selekční signální znak, a specifickou DNA sekvenci lokusu 2A myšího imunoglobulinu gama pro místně cílenou homologní rekombinaci.

Uvedený selekční signální znak je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující guaninfosforibosyltransferázu (gpt), dihydrofolatreduktázu (dhfr), gen poskytující rezistenci k antibiotikům a glutaminsyntetázu. Nejvýhodněji je selekčním signálním znakem glutaminsyntetáza.

-1CZ 289308 B6

Uvedeným promotorem je ve výhodném provedení promotor typu „Cytomegalovirus-Immediate Early“, CMV-IE.

Výše uvedeným rekombinantním genem je výhodně imunoglobulinový gen.

Ve výhodném provedení tento vektor zahrnuje první promotor pro expresi prvního imunoglobulinového genu pro lehký řetězec imunoglobulinové molekuly a druhý promotor pro expresi druhého imunoglobulinového genu pro těžký řetězec imunoglobulinové molekuly.

Výše uvedeným prvním nebo druhým promotorem je ve výhodném provedení promotor typu CMV-IE.

Nejvýhodnější je podle předmětného vynálezu homologní rekombinantní expresní vektor, jehož struktura je znázorněna na přiloženém obr. 3 A (popis viz dále).

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob exprese rekombinantních genů v NonSecreting/Zero, NS/O, hostitelských buňkách, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

(a) přenos homologního rekombinantního vektoru podle některého z nároků 1 až 8 se specifitou 20 klokusu 2A imunoglobulinu gama do uvedené hostitelské buňky, přičemž uvedený vektor obsahuje DNA kódující rekombinantní gen a tento vektor se homologně rekombinuje s chromozomálním lokusem gama 2A hostitelské buňky; a (b) kultivaci hostitelských buněk za podmínek vhodných pro selekci a expresi rekombinantního 25 genu.

Ve výhodném provedení tento postup zahrnuje stupeň použití vektoru, který se homologně rekombinuje s chromozomálním lokusem gama 2A hostitelské buňky na jakémkoliv místě uvnitř zmíněného hostitelského lokusu gama 2A.

Pokud se týče použitých zkratek, NS/O znamená specifickou myší plazmacytomatickou buněčnou linii, což bude ještě vysvětleno v dalším popisu (zkratka je odvozena od termínu NonSecreting/Zero), gpt znamená guaninfosforibosyltransferázu, dhfr znamená dihydrofolátereduktázu, a CMV-Ě znamená Cytomegalovirus-Immediate Early.

Vynález se týká metodického provedení postupu určeného k založení stabilní buněčné linie exprimující vysoké hladiny rekombinantního proteinu. Dále tento vynález ukazuje, že buněčné linie generované podle tohoto vynálezu exprimují rekombinantní proteiny v extrémně vysokých hladinách, které často předčí nejlepší expresní buněčné linie produkované náhodnou integrací 40 expresního konstruktu do savčího genomu.

Vynález se tyká definování specifické pozice v genomu savců, která je výhodná pro vysokou hladinu exprese rekombinantních genů, a dále se vynález týká způsobu účinného zvýšení frekvence klonu s vysokou expresí pomocí místního cílení expresních konstruktů do výhodných 45 pozic genomu.

Podle vynálezu byl zjištěn metodický postup k založení stabilní buněčné linie exprimující vysoké hladiny rekombinantního proteinu. Dále tento vynález ukazuje, že buněčné linie generované podle tohoto vynálezu exprimují rekombinantní proteiny v extrémně vysokých hladinách, které 50 často předčí nejlepší expresní buněčné linie produkované náhodnou integrací expresního konstruktu do savčího genomu.

Tento vynález se týká způsobu dosažení vysoké hladiny exprese rekombinantních genů v savčích buňkách. Vysoké hladiny exprese rekombinantního genu dosažené za využití postupu podle 55 tohoto vynálezu jsou výsledkem integrace rekombinantního genu, řízené dó určitého místa

-2CZ 289308 B6 hostitelského genomu. Místo integrace je předem zvoleno a integrace se dosahuje za pomoci homologní rekombinace DNA vektoru obsahujícího specifické DNA sekvence, o kterých je známo, že jsou homologní se specifickým místem na hostitelském genomu. Specifické místo v hostitelském genomu určené pro inzerci rekombinantního genu je vybráno tak, že se stanoví místo, které je vysoce aktivní s ohledem na genovou transkripci a snadno integruje homologní segmenty DNA.

Savčí buňky, které je možno využít v postupu podle uvedeného vynálezu, jsou vybrány ze skupiny, zahrnující buňky typu NS/O, přičemž výčet použitelných buněčných linií není omezen pouze na ně, přičemž tyto typy buněk jsou zároveň nejvýhodnějším typem z hlediska předmětného vynálezu.

Buňky typu NS/O (viz. publikace: Methods in Enzymology, 73B: 3-46, 1981, autoři G. Gafre a C. Milstein) se kultivují v suspenzi při teplotě asi 37 °C, například v modifikovaném minimálním esenciálním médiu Dulbecco (Hazelton Research Products) s obsahem asi 10% fetálního telecího séra (HyClone; definovaná séra neobsahující žádný detekovatelný endotoxin) nebo Iscovovo modifikované médium Dulbecco (JRH Biosciences) s obsahem asi 9% koňského séra. Tyto buňky se kultivují v rotačních kultivačních lahvích, suspenzních nádobách Wheaton turbolift o obsahu 46 litrů (Wheaton), případně v 75 litrových, 200 litrových nebo 300 litrových fermentorech s týdenní sklizní přibližně 1-2x10⁶ buněk na mililitr (3-4 dělení za týden). Média používaná v suspenzních nádobách nebo ve fermentorech mohou obsahovat asi 0,1 %-0,3 % F68 pluronic pro snížení střihové síly na buňkách. Buňky nejsou obvykle kultivovány déle než 3-4 měsíce od počátečního výsevu kultury.

Bezbuněčné extrakty se připravují z buněk typu NS/O rozrušením těchto buněk pomocí kavitace v dusíku, hypotonickou lýzou, případně dalšími vhodnými metodami. Buňky se oddělují odstřeďováním, přičemž mohou být omyty izotonickým roztokem pufru, jakým může být například fosfátový solný pufr o pH asi 7,4. Hypotonická lýze se provádí vystavením buněk působení asi 10 objemů hypotonického pufru (asi 10 mM KC1, asi 20 mM HEPES, pH asi 7,4, asi

1,5 mM MgCl₂, asi 0,1 mM EDTA; nebo asi 25 mM HEPES, pH asi 7,5, asi 5 mM MgCl₂ a 1 mM EDTA) a izolace se provádí odstředěním. Pufr používaný pro iýzy může rovněž obsahovat redukční činidlo, jakým je například dithiothreitol (DTT). Hypotonický pufr obecně obsahuje inhibitory proteáz, jako například PMSF, obecně obsahuje inhibitory proteáz, jako například PMSF, leupeptin nebo pepstatin. Buňky se resuspendují v asi 3 objemech hypotonického pufru, umístí se na dobu asi 20 minut na led a následně se lyžují asi 20 rázy v homogenizéru Dounce. V homogenizéru Dounce je možno za použití těsných náplní o objemu 100 mililitrů a působením asi 25 rázů nebo o objemu 300 mililitrů a působením asi 15 rázů dosáhnout rozrušení asi 90 % až asi 95 % buněk. Rozrušování buněk pomocí tlaku dusíku je možno rovněž provést v hypotonickém pufru. Resuspendované buňky se umístí do dusíkové tlakové nádoby za tlaku dusíku 2,758 MPa na dobu asi 30 minut, což probíhá při teplotě 4 °C a za současného třepání. Rozrušení buněk je poté dosaženo uvolněním tlaku a následnou evakuací buněk z tlakové nádoby. Buněčný lyzát je dále zpracováván následujícími centrifugačními kroky; od asi 400 do asi 1000 x g (supematant Sl), při asi 30 000 x g (supematant S2) a při asi 300 000 x g (supematant S3). Buněčný lyzát může být též zpracováván podle následujícího postupu. Nerozrušené buňky a buněčná jádra se oddělí odstřeďováním při asi 3000 otáčkách za minutu prováděném po dobu asi 10 minut při teplotě 5 °C na odstředivce Beckman GRP. Postnukleámí supematantový roztok je odstřeďován po dobu asi 20 minut při asi 16 000 otáčkách za minutu v odstředivce Sorval s rotorem SS34. Supematantový roztok je dále zpracováván odstřeďováním prováděným po dobu asi 60 minut při asi 50 000 otáčkách za minutu v odstředivce Beckman (s rotorem 50,2Ti) nebo při 45 000 otáčkách za minutu (s rotorem 45Ti). Po přídavku asi 2 mM DTT a 0,1 % CHAPS se výsledný supematantový roztok uchovává při teplotě asi -80 °C.

K molekulárnímu klonování cDNA může být použita kterákoliv z různých vhodných metod. Tyto metody jsou vybrány ze skupiny zahrnující přímou funkční expresi rekombinantního genu, následující konstrukci knihovny cDNA konstruované v bakteriofágovém nebo plazmidovém

-3CZ 289308 B6 transportním vektoru se značenou oligonukleotidovou sondou vytvořenou podle aminokyselinové sekvence žádaného proteinu.

Přípravu knihoven cDNA je možno provést standardními metodami a technickými prostředky všeobecně známými podle dosavadního stavu techniky. Příklady takovýchto běžně známých metod konstrukce knihoven cDNA je možno nalézt napfíklad v publikaci: Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982. Pro odborníky pracující v daném oboru je zřejmé, že DNA, kódující žádaný protein, může být také izolována z knihovny genomové DNA.

Sestavování genomových DNA knihoven může být provedeno standardními metodami a technickými prostředky všeobecně známými z dosavadního stavu techniky. Jako příklad takovýchto dobře známých metod konstrukce knihoven DNA je možno uvést postupy uvedené například v publikaci: Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J., Molekular Cloning: A Laboratory 15 Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982.

Pokud není v případě klonování rekombinantního genu výhodnou metodou dostupná příslušná sekvence DNA, je nezbytné určit aminokyselinovou sekvenci kódovaného proteinu. Pro tento účel je možno izolovat žádaný protein a určit částečnou aminokyselinovou sekvenci 20 automatickými sekvenátory. Není nutné určovat celou aminokyselinovou sekvenci, ale lineární sekvence jedné nebo více oblastí, které mají od asi 6 až 8 aminokyselinových zbytků a jsou určené pro PCR amplifikaci částečných fragmentů DNA.

Po identifikaci vhodných aminokyselinových sekvencí jsou syntetizovány sekvence DNA, které je mohou kódovat. Vzhledem ktomu, že genetický kód je degenerovaný je možno použít více než jednoho kodonu ke kódování určité aminokyseliny a z tohoto důvodu může být příslušná aminokyselinová sekvence kódována jakýmkoliv DNA oligonukleotidem ze skupiny zahrnující podobné oligonukleotidy kódujících stejnou aminokyselinovou sekvenci. Pouze jeden člen z této skupiny však bude identický s původní sekvencí DNA, ten však bude schopen hybridizace s DNA dokonce i v přítomnosti DNA oligonukleotidů s chybným párováním nukleotidů. Také DNA oligonukleotidy s chybným párováním se však mohou i přesto hybridizovat s původní DNA v míře, která umožňuje identifikaci a izolaci DNA kódující žádaný protein.

Všechna trojpísmenová a jednopísmenová označení aminokyselin používaná v tomto popisu 35 odpovídají označení aminokyselin, které je standardně používáno podle dosavadního stavu techniky, přičemž tato označení jsou uvedena v následujícím seznamu:

Alanin	Ala	A	Leucin	Leu	L
Arginin	Arg	R	Lysin	Lys	K
Asparagin	Asn	N	Methionin	Met	M
Asparagová kyselina	Asp	D	Fenylalanin	Phe	F
Cystein	Cys	C	Prolin	Pro	P
Glutamová kyselina	Glu	E	Serin	Ser	S
Glutamin	Gin	Q .	Threonin	Thr	T
Glycin	Gly	G	Tryptofan	Trp	w
Histidin	His	H	Tyrosin	Tyr	Y
Isoleucin	Ile	I	Valin	Val	v

Klonovaná DNA, získaná výše popsanými metodami, může být molekulárním klonováním 40 rekombinantně exprimována do expresního vektoru, který obsahuje vhodný promotor a další příslušné transkripční regulační elementy, a přenesena do hostitelských prokaryontních nebo eukaryontních buněk, kde produkuje rekombinantní protein. Metody a technické prostředky k provedení těchto postupů jsou v úplnosti popsány laboratorním manuálu T. Maniatise a kol. (citace této publikace viz výše) a jsou běžně známy z dosavadního stavu techniky.

-4CZ 289308 B6

Expresní vektory jsou v tomto dokumentu definovány jako sekvence DNA, které jsou nutné pro transkripci klonovaných kopií genů a translaci jejich mRNA kyselin ve vhodné hostitelské buňce. Tyto vektory mohou být použity pro expresi eukaryontních genů v různých hostitelských buňkách, kterými mohou například být bakteriální buňky, modrozelené řasy, rostlinné buňky, hmyzí buňky a živočišné buňky.

Specificky navržené vektory dovolují přenos DNA mezi hostitelskými buňkami, jako jsou například bakteriální-kvasinkové nebo bakteriální-živočišné buňky. Vhodně konstruované expresní vektoiy by měly obsahovat: počáteční replikační sekvenci pro autonomní replikaci v hostitelské buňce, volitelné signální znaky, omezený počet užitečných restrikčních míst pro restrikční enzymy, potenciál pro vysoký počet kopií a aktivní promotory. Promotor je definován jako sekvence DNA, které řídí vazbu RNA polymerázy na DNA a iniciuje syntézu RNA. Silný promotor je takový promotor, který způsobuje vysokou frekvenci iniciací syntézy mRNA kyselin. Expresní vektory mohou být vybrány ze skupiny zahrnující klonovací vektory, modifikované klonovací vektory, specificky navržené plazmidy nebo viry, přičemž tímto není výčet použitelných vektorů nijak omezen.

Pro expresi rekombinantních proteinů v savčích buňkách mohou být použity různé savčí expresní vektory. Komerčně dostupné savčí expresní vektory, které jsou vhodné pro expresi rekombinovaných proteinů, je možno zvolit ze skupiny zahrnující pMClneo (Strategene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-Psv2-neo (ATCC 37593), pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) a IZD35 (ATCC 37565), přičemž tímto není výčet použitelných savčích expresních vektorů nijak omezen.

DNA kódující žádaný protein může být klonována do expresního vektoru pro expresi v rekombinantní hostitelské buňce. Rekombinantní hostitelské buňky mohou být prokaryontní nebo eukaryontní, například zvolené ze skupiny zahrnující bakterie, kvasinkové buňky, savčí buňky ze skupiny zahrnující buněčné linie hovězího, prasečího, opičího a hlodavčího původu, a hmyzí buňky ze skupiny zahrnující buněčné linie odvozené od drosofily, přičemž ovšem tímto není výčet použitelných rekombinantních hostitelských buněk nijak omezen. Buněčné linie odvozené od savčích druhů, které mohou být vhodné pro účely uvedeného vynálezu a které jsou běžně komerčně dostupné, mohou být vybrány ze skupiny zahrnující CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BSC-l (ATCC CCL 26) a MRC-5 (ATCC CCL 171), přičemž ovšem tímto není výčet použitelných buněčných linií odvozených od savčích druhů nijak omezen.

Expresní vektor, který je předmětem tohoto vynálezu, může být zaveden do hostitelské buňky kteroukoliv z mnoha různých běžně známých metod, které jsou vybrány ze skupiny zahrnující transformaci, transfekci, fůzi protoplastů a elektroporaci, přičemž ovšem tímto není výčet použitelných technik nijak omezen. Buňky obsahující expresní vektor jsou klonovány a individuálně analyzovány, zda produkují rekombinantní protein. Identifikace buněčných klonů hostitelských buněk produkujících rekombinantní protein může být provedena několika způsoby, mezi které patří například imunologická reakce s protilátkami, a přítomností takové aktivity v hostitelských buňkách, která je podmíněna přítomností rekombinantního proteinu, přičemž ovšem tímto výčtem není výčet způsobů identifikace buněčných klonů nijak omezen.

Po expresi rekombinantních proteinů v rekombinantních hostitelských buňkách může být žádaný protein zpracován tak, aby byl izolován v přečištěné formě. K čištění rekombinantního proteinu lze použít několik dostupných vhodných metod. Rekombinantní protein může být izolován z buněčných lyzátů a extraktů nebo z upraveného kultivačního média různými kombinacemi nebo jednotlivou aplikací metod vybraných ze skupiny zahrnující vysolovací fřakcionaci, iontově výměnnou chomatografii, gelovou separační chromatografií, hydroxyapatitovou adsorpční chromatografií a hydrofobní interakční chromatografií.

-5CZ 289308 B6

Rekombinantní proteiny mohou být navíc separovány od ostatních buněčných proteinů použitím imunoafinitní chromatografie na kolonách modifikovaných monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami, které jsou specifické pro rekombinantní protein. Protilátky je možno připravit metodami běžně známými z dosavadního stavu techniky.

Monospecifické protilátky je možno izolovat ze savčího antiséra obsahujícího protilátky reaktivní proti rekombinantnímu proteinu nebo se připraví jako monoklonální protilátky reaktivní s žádaným rekombinantními proteinem za použití metody podle Kohlera a Milsteina, Nátuře 256: 495-497 (1975). Monospecifické protilátky jsou v tomto dokumentu definovány jako jednoduché protilátkové částice nebo jako násobné protilátkové částice, které mají homogenní vazebné charakteristiky na příslušný rekombinantní protein. Homogenní vazbou se v tomto dokumentu míní schopnost protilátkové částice, které mají homogenní vazebné charakteristiky na příslušný rekombinantní protein. Homogenní vazbou se v tomto dokumentu míní schopnost protilátkové částice vázat se na specifický antigen nebo epitop, například takové, které jsou asociovány s rekombinantním proteinem, jakje popsáno výše. Specifické protilátky mohou být pěstovány na zvířatech, vybraných ze skupiny zahrnující například myši, krysy, morčata, králíci, kozy, koně a další, přičemž králíci jsou výhodně používáni pro daný účel, jejich imunizací a vhodnou koncentrací rekombinantního proteinu s přídavkem nebo bez přídavku imunitního adjuvans.

Pro přípravu rekombinantních DNA sekvencí kódujících různé oblasti protilátek, lehké řetězce a těžké řetězce získané z lidských buněčných linií B, kombinované s lidskými konstantními oblastmi, je možno výhodně použít následujících postupů. Tyto rekombinantní DNA mohou být použity pro transfekování savčích buněk na expresi rekombinantních lidských protilátek, které si zachovají antigenní specifitu protilátek odvozených od B buněk lidského donoru. Pokud budou tyto rekombinantní imunoglobuliny aplikovány s terapeutickým účelem, potom budou výhodně rozeznávány jako proteiny tělu vlastní. Celková RNA se extrahuje z lidských heterohybridomů, například z popsaných lidských heterohybridních buněk, například pomocí buněčné solubilizace za použití guanidiniumizokyanátu, viz. Chirwíng a kol. Biochem. 18: 5294-5299, (1979).

Pro odborníky pracující v tomto oboru je zřejmé, že buňky produkující protilátky jsou vhodné pro přípravu rekombinantních molekul DNA kódujících celé molekuly protilátek nebo jejich části. Tyto buňky, které produkují protilátky, mohou být vybrány ze skupiny popsané v publikaci: ATCC Catalogue of Cell Lineš And Hybridomas, 7. vydání, 1992, přičemž ovšem tímto není jejich výčet nijak omezen. Informace týkající se DNA kódující imunoglobulinové těžké a lehké řetězce, a rovněž tak i data týkající se sekvence pro proměnné oblasti lidských protilátek, jsou uvedeny v publikaci Kabat a kol. „Sequences of Proteins of Immunological Interst“, 4. vydání, Bethesda, Matyland: National Institute of Health, 1987, a rovněž tak v aktualizacích této databáze a v dalších databázích dostupných ve Spojených státech amerických i v jiných dalších zahraničních databázích (sekvence jak nukleových kyselin, tak i proteinů).

Popis vyobrazení na přiložených obrázcích

Homologní rekombinantní expresní vektor pro expresi rekombinantních genů v savčích buňkách, vektor a postup exprese rekombinantních genů v savčích hostitelských buňkách budou v dalším blíže vysvětleny s pomocí přiložených obrázků, na kterých je:

- na obr. 1 znázorněn schematický diagram plazmidů p9014,

- na obr. 2 je znázorněno místo inzerce p9014 do myšího chromozomu,

- a na obr. 3, který je rozdělen na části A, B a C, je v části A znázorněn homologní rekombinantní protilátkový expresní plazmid pIgG2A; část B znázorňuje akt homologní rekombinace pro inzerci protilátkového expresního plazmidů do chromozomu; a část C

-6CZ 289308 B6 znázorňuje část chromozomu obsahující homologně rekombinovaný protilátkový expresní plazmid.

Expresní plazmid p9014 (viz. Biotechnigues, 14, str. 754-755, 1993, autoři Palladino a kol.), který byl konstruován pomocí standardních metod pro klonování DNA, obsahuje transkripční jednotku kódující těžký a lehký řetězec imunoglobulinu řízenou bezprostředně časným promotorem lidského cytomegaloviru a jako signálního znaku pro selekci používá transkripční jednotky pro glutaminsyntetázu (viz. obr. 1). Buněčná linie byla generována elektroporací Sal I linearizovaného plazmidu p9014 do myší plazmacytomatické buněčné linie NS/O a selekcí stabilních linií, které integrovaly plazmid, růstem v médiu neobsahujícím glutamin (viz. Antibody, Immunocanjugates and Radiopharmaceuticals 4, str. 829-835,1991, autoři DeMartino a kol.; a Joumal of Immunology 150, str. 2844-2857,1993, autoři Singer a kol.). Z generovaných klonů byl vybrán pro následné studie klon Dl2, u něhož byla prokázána výjimečně vysoká hladina exprese rekombinantní protilátky (> 15 pg/den na jednu buňku). Vysoká specifická produktivita tohoto klonu naznačuje, že vektor p9014 byl inkorporován do myšího genomu na místě zvýhodňujícím expresi. V prvním kroku charakterizace integračního místa vektoru p9014 v této buněčné linii byla izolována genomická DNA z klonu Dl2, štěpena Xba I a testována s fragmentem pro konstantní oblast lidského imunoglobulinu kapa. Za přísně řízených podmínek se tento fiagment hybridizuje pouze s transfekovaným genem a protože tento gen je v blízkosti místa Sal I použitého klinearizaci plazmidu, identifikuje tímto restrikční fragment, který obsahuje spojení DNA plazmidu a genomické myší DNA. Tato nukleotidová sonda identifikovala zónu o velikosti 3,3 kilobází v genomické DNA klonu D12 reprezentující jedinou kopii integrovaného p9014. Tyto výsledky naznačují, že vysoké hladiny exprese pozorované u klonu D12 jsou odvozeny od jediné kopie plazmidu p9014, která je vložená do spojeného fragmentu o velikosti 3,3 kilobází obsahujícího Xba I.

Aby bylo možno charakterizovat místo inzerce, byly vytvořeny genomické knihovny klonu Dl2 a rekombinované bakteriofágové plaky byly testovány nukletidovou sondou obsahující konstantní oblast lidského imunoglobulinu kapa a plazmidovou nukleotidovou sondou z druhého konce místa Sal I, použitého pro linearizaci původního plazmidu před transfekcí. Rekombinantní bakteriofágové klony obsahující fragmenty nesoucí spojení p9014 smyší genomickou DNA zobou stran místa inzerce byly izolovány a subklonovány do plazmidu. Sekvenční analýza myšího genomu v místě integrace prokázala, že vektor p9014 byl vložen do 2A loku myšího imunoglobulinu gama. Tato inzerce vedla k 1,8 kilobázové (kb) duplikaci genu 2A myšího imunoglobulinu gama, která začala ve vzdálenosti 48 párů bázi (b.p.) ve směru proti přepisu genu polyadenylového adičního signálu. Na 3' konci spojení plazmidu s myší genomovou DNA byla přítomná sekvence 36 párů bázi (b.p.), která nebyla odvozena ani z transfekovaného vektrou, ani z loku 2A myšího imunoglobulinu gama. V tomto spojení bylo deletováno 32 párů bázi (b.p.) ze sekvence vektoru. Podrobnější zkoumání 5' konce odhalilo deleci 791 párů bází (b.p.) ze sekvence plazmidu během inzerčního procesu a naopak byla zjištěna přítomnost 16 párů bází (b.p.) neidentifikované DNA (viz. obr. 2).

Původní buněčná linie použitá pro transfekci, NS/O, je linie plně diferencovaných B buněk, tedy buněčného typu, který za normálních podmínek exprimuje výjimečně vysoké hladiny imunoglobulinové RNA zlokusu pro těžký řetězec Ig. Zjištění, že p9014 se vložil právě do tohoto lokusu, ukazuje, že promotor CMV-IEp může být z této chromozomální pozice exprimován ve vysokých hladinách. Z uvedených výsledků je patrné, že použití homologní rekombinace k inzerci rekombinantního expresního DNA vektoru do tohoto imunoglobulinového loku může promotovat vysoké hladiny exprese pro další rekombinantní proteiny v této buněčné linii.

Aby bylo možno prověřit toto chování, byly jako homologní rekombinantní cílené sekvence generovány expresní konstrukty obsahujíc 2A gen pro zárodečnou linii myšího imunoglobulinu gama. Dále byla připravena NS/O genomová bakteriofágové knihovna, tato byla testována pomocí nukleotidové sondy z nepřepsané oblasti M2 z 3' konce z myšího genu IgG2A

-7CZ 289308 B6 a u několika izolovaných klonů byla prokázána přítomnost genu celé zárodečné linie myšího genu IgG2A. U jednoho z těchto bakteriofágových klonů byl vyštěpen BamHI a subklonován 5,1 kilobází velký genomický fragment, který obsahoval celou kódující oblast pro myší Ig gama 2A, s výjimkou větší části CH1 exonu z jeho 5' konce. Sal I restrikční místo bylo vloženo do přirozeně se vyskytujícího restrikčního místa Stu I, které je přítomno ve vzdálenosti 39 párů bází (b.p.) v protisměru exprese genu od membránového exonu 2, což poskytlo jedinečné místo pro linearizaci uvnitř sekvence 2A kódující myší imunoglobulin gama. Tento klonovaný fragment byl použit pro generování komplexního expresního vektoru, který obsahoval:

1) geny pro těžký a lehký globulinový řetězec, transkribované z bezprostředního časného promotoru lidského CMV;

2) gen pro glutaminsyntetázu používaný jako signální znak pro selekci;

3) plazmidovou vektorovou sekvenci; a

4) 5,1 kilobází dlouhý BamHI fragment loku 2A pro myší imunoglobulin gama (viz. obr. 3B). (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 79, str. 2623-2627, 1982, autoři Yamawaki-Kataoka Y. a kol.; Molecular Immunology 26, str. 819-826, 1989, autoři Hallb., a kol.; Nucleic Acid Research 9, str. 1365-1381, 1981, autoři Yamawaki-Kataoka Y., a kol.; Biotechnology 10, str. 169-175, 1992, autoři Bebbington C. R., a kol.). Tento homologní rekombinantní inzerční typ vektoru byl navržen pro optimalizaci procesu integrace, ve kterém se lokus 2A myšího imunoglobulinu gama, kteiý je obsažen ve vektoru, může rekombinovat s endogenním lokem 2A myšího imunoglobulinu gama, což způsobuje přímou a definovanou inzerci expresního vektoru (viz. obr. 3B). Předpokládá se, že inzerce tohoto vektoru, zprostředkovaná homologní rekombinací ve kterémkoliv místě uvnitř loku 2A pro imunoglobulin gama, povede k vysoké hladině exprese rekombinantní DNA kódující protilátky.

Buňky NS/O byly transfekovány Sal I linearizovaným imunoglobulinovým vektorovým konstruktem za použití elektroporace a poté byly naneseny na 96-jamkové mikrotitrační destičky. Ve 147 jamkách byl pozitivně detekován růst buněk za podmínek selekce v GS selekčním médiu. Stabilní buněčné linie, které homologní rekombinací integrovaly imunoglobulinový konstrukt do svého endogenního loku 2A pro myší imunoglobulin gama, exprimovaly rekombinantní protilátku ve vysokých hladinách. K rychlému testování klonů, které potenciálně nesly homologní rekombinanty, byl použit test ELISA, jako rychlý test pro první zjištění jamek exprimujících vysoké hladiny rekombinantních protilátek. Testem ELISA, provedeným na supematantu ze všech 147 jamek, bylo identifikováno 20 jamek s vysokou hladinou exprese protilátek. Buňky z těchto 20 jamek byly znovu pasážovány a opětovně testovány na expresi protilátek. Buňky odebrané z 12 z celkem 20 výše uvedených jamek pokračovaly v expresi vysokých hladin protilátek. Těchto 12 buněčných linií tvořilo soubor klonů, které měly do chromozomu zabudovaný pIgG2A/imunoglobulinový plazmid.

Pro identifikaci stabilních klonů, ve kterých byl transfekovaný vektor integrován do loku 2A myšího imunoglobulinu gama, byl vyvinut Southemův hybridizační test. K identifikování vhodného enzymu pro detekci homologních rekombinantů bylo prověřeno velké množství restrikčních enzymů. Při štěpení NS/O genomické DNA enzymem Hpal, následném přenosu a testování pomocí nukleotidové sondy pro myší zárodečnou linii imunoglobulinu gama 2A pro 3' konec loku byl získán štěp o velikosti 15 kilobází. Naproti tomu, pokud byl do IgG2A loku homologní rekombinací vložen imunoglobulinový vektor, na přenosu byl přítomen Hpa I fragment o velikosti 10 kilobází (viz. obr. 3C).

Southemova přenosová analýza 12 buněčných linií s vysokou hladinou exprese prokázala, že 9 z těchto buněčných linií obsahovalo fragment o 10 kilobázích v souhlasu shomologně rekombinantní inzercí konstruktu do myšího loku IgG2A (Tabulka 1). U těchto 9 klonů bylo potvrzeno, že se jedná o homologní rekombinanty dalším Southemovým hybridizačním testem za

-8CZ 289308 B6 použití hybridizační nukleotidové sondy rozeznávající pouze imunoglobulinový expresní vektor. Tyto výsledky svědčí o tom, že k homologní rekombinaci do loku 2A myšího imunoglobulinu gama 2A dochází o extrémně vysoké frekvenci. Homologní rekombinanty tvořily 75 % klonů s vysokou hladinou exprese a 6 % z celkového počtu stabilních buněčných linií.

Tabulka 1

Číslo klonu	Homologní rekombinant	Specifická produkce pg/buňka/den
13	Ano	24,40
16	Ano	16,50
10	Ano	21,80
28	Ne	18,30
42		21,50
6	Ano	28,10
22	Ne	43,10
41		33,60
58	Ano	14,00
60	Ano	36,40
69	Ano	40,70
88	Ne	32,50

Všech 12 klonů s vysokou hladinou exprese bylo testováno z hlediska úrovně jejich produktivity rekombinantního proteinu. Buněčná kultivační média byla oddělena od buněk vysetých ve známé hustotě po 24, 48 a 72 hodinách kultivace a za použití Poros testu bylo zjištěno množství rekombinantních protilátek produkované jednou buňkou za den. Tyto buňky produkovaly extrémně vysoké hladiny rekombinantních protilátek pohybující se v rozmezí od 14 do 43 pg/buňka/den. Tyto hladiny produktivity byly stejné nebo vyšší, než množství rekombinantního proteinu produkované původní buněčnou linií D12.

Vybrané buněčné linie byly znovu vysety, přičemž u nich byla změřena specifická produktivita a ze stejného originálního buněčného poolu byla izolována RNA, aby bylo možno rozhodnout, zda trojnásobný rozdíl ve specifických produktivitách u některých buněčných linií je důsledkem rozdílů v hladinách RNA byla provedena Northemova analýza za použití konstantních oblastí genů pro těžký a lehký řetězec imunoglobulinu jako hybridizačních nukleotidových sond. Množství RNA nanášené do každé linie bylo normalizováno k expresi myšího beta aktinu a síla hybridizačního signálu byla kvantifikována. Výsledky tohoto experimentu naznačují, že množství RNA je relativně konstantní při srovnávání jednotlivých buněčných linií. To dále naznačuje, že rozdíly v úrovni exprese protilátek pozorované u těchto buněk jsou výsledkem působení buněčných faktorů a nejsou primárně způsobeny rozdílnými hladinami RNA.

Příklady provedení vynálezu

Homologní rekombinantní expresní vektor pro expresi rekombinantních genů v savčích buňkách, způsob exprese rekombinantních genů v savčích hostitelských buňkách a vektor používaný pro tyto účely budou v dalším ilustrovány pomocí konkrétních příkladů provedení, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

-9CZ 289308 B6

Příklad 1

Konstrukce knihovny

Buněčná linie byla generována elektroporací plazmidu p9014, linearizovaného Sal I (viz. Biotechniques 14, str. 754-755, 1993, autoři Palladino a kol.) do myší plazmocytomatické buněčné linie NS/O a selekcí buněk se stabilní integrací zmíněného plazmidu kultivací v médiu neobsahujícím glutamin (viz. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4, str. 829-835, 1991, autoři DeMartino a kol.; a Journal of Immunology 150, str. 2844-2857, autoři Singer a kol.). Z generovaných klonů byla v buněčné linii D12 prokázána extrémně vysoká hladina exprese (>15 pg/buňka/den) rekombinantní protilátky. Tato vysoká specifická produktivita tohoto klonu naznačuje, že vektor p9014 se inzeroval do myšího genomu na zvýhodňujícím místě pro expresi. Za účelem klonování spojení 5' konce genomické DNA a plazmidu byla zkonstruována genomická knihovna za použití klonovacího systému LambdaGem 11 Xho I Half-Site Arms Cloning Systems (Promega) postupem podle návodu výrobce. Genomická DNA buněčné linie D12 byla částečně štěpena enzymem Mbo I (BoehringerMannheim). Pozitivní plaky byly identifikovány pomocí dvou různých nukleotidových sond:

1) pomocí fragmentu Xmn I/Pst I genu rezistentního proti ampicilinu (354 párů bází); a

2) použitím fragmentu o 300 párech bází (b.p.) exonu 7 z genu křeččí glutaminsyntetázy.

Pro klonování 3' konce spojení plazmidu sgenomickou DNA byla genomická knihovna konstruována za použití klonovacího kitu Lambda/Zap II/Gigapack II Gold (Stratagene). Jak vektor tak i D12 genomická DNA byly kompletně štěpeny enzymem Xba I (BoehringerMannheim), produkty byly ligovány (Ligation Kit, Stratagen) a baleny podle návodu výrobce. Pozitivní plaky byly identifikovány pomocí nukleotidové sondy konstantní oblasti lidského genu kapa. Všechny nukleotidové sondy byly značeny posunem jednořetězcového zlomu. Fágová DNA byla izolována pomocí LambdaSorb (Promega) postupem podle návodu výrobce.

Sekvence DNA inzerované do fágové DNA byly subklonovány do vektoru pSP72 (Promega). Plazmidová DNA z bakterie byla izolována za použití standardní metody alkalické lyže. Inzerty byly sekvenovány Sagnerovou dideoxy metodou terminace řetězce.

Příklad 2

Izolace štěpu z myšího genu IgG2A z buněk NS/O

Podle tohoto příkladu byla DNA, částečně naštěpená Mbol a izolovaná z myší plazmocytomatické buněčné linie NS/O, inzerována do vektoru Lambda Gem-11 (Promega) a l,8xl0⁶ nezávislých plaků bylo testováno nukleotidovou sondou (BglII-BstXl) odvozenou od IgG2A M2 nepřepsané oblasti z 3’ konce. Plakovou metodou bylo izolováno 14 pozitivních bakteriofágů, přičemž jejich lyzáty byly připraveny ve větších množstvích. Rekombinantní bakteriofágy byly charakterizovány restrikčním mapováním a Southem hybridizací, přičemž byl identifikován jeden klon obsahující celou kódovací oblast genu myšího Ig gama 2A. Fragment, vyštěpený BamHI, o délce 5,1 kilobází a obsahující celou kódující oblast IgG2A (s výjimkou většiny CH1 exonu na 5' konci), membránové exony a nepřepsaná oblast z 3' konce byly vystřiženy a klonovány do BamHI místa v modifikované formě Blueskript (Stratagene), ve kterém bylo destruováno místo Sáli v multiklonovací oblasti.

-10CZ 289308 B6

Příklad 3

Konstrukce plazmidu místně cíleného na IgG2A

Podle tohoto provedení byl plazmid obsahující myší IgG2A gen o velikosti 5,1 kilobází částečně štěpen za použití Stul a linearizovaný plazmid byl izolován na gelu. Ligačním spojením bylo do IgG2A fragmentu zavedeno specifické Sall místo, přičemž byl selektován subklon, kteiý obsahoval přidané Sall místo lokalizované 39 párů bází (b.p.) proti směru přepisu řetězce od exonu M2 na IgG2A. Modifikovaný inzert IgG2A o velikosti 5,1 kilobází (b.p.) byl vyštěpen štěpením BamHI, zarovnán T₄DNA polymerázou a klonován do podobně zarovnaného místa Sall na imunoglobulinovém expresním vektoru. Finální místně cílený plazmid pIgG2A byl linearizován pro elektroporaci štěpením Sall. Mapa finálního místně cíleného plazmidu je znázorněna na obr. 3.

Příklad 4

Elektroporace

Podle tohoto příkladu byly NS/O buňky kultivovány vlscovově modifikovaném Dulbeccovu médiu (Sigma) s přídavkem 10% fetálního telecího séra a 4mM glutaminu. Potom bylo 10 miliónu buněk smíseno s 25 mikrogramy linearizovaného plazmidu pIgG2A v objemu 800 mikrolitrů solného fosfátového pufru a elektroporováno za použití Bio-Rad Gene Pulser (1,5 kV; 3 mikrofarady; vzdálenost elektrod 0,4 cm). Transfekované buňky byly vysety vlscovově modifikovaném Dulbeccovu médiu spřídavkem 10% FCS (fetální telecí sérum) a 1 mM glutaminu pro GS selekci klonů. Selekční médium (GS selekční Iscovovo médium neobsahující glutamin, 10 % dialyzovaného FCS, nukleosidy IX, asparagin IX) bylo přidáno do jamek o 24 hodin později. U 147 jamek byl identifikován pozitivní růst buněk a tyto byly testovány testem ELISA.

Příklad 5

Test ELISA

Testování klonů na produkce rekombinantních protilátek bylo provedeno testem ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Kultivační supematanty z klonů byly zředěny v poměru 1:10 a 1:100 v % BSA v PBS. Vzorky byly naneseny do 96 jamkových mikrotitračních destiček (Immulon 2, Dynatech Laboratories, lne.), pokryty myšími monoklonálními protilátkami lidského lehkého řetězce lambda (Zymed) a jednu hodinu inkubovány při teplotě 37 °C. Poté byly přidány myší monoklonální protilátky lidského lehkého řetězce IgGl konjugované s křenovou peroxidázou (Zymed) a jednu hodinu inkubovány při teplotě 37 °C. Destička byla po každé inkubaci třikrát omyta PBS. Vázané protilátky byly detekovány vizualizací přídavkem substrátu ABTS [2,2-azino-di(3-ethylbezthiazolin)sulfonová kyselina] (Zymed). Barva byla ponechána se vyvíjet po dobu dvaceti minut při teplotě místnosti. Absorbance byla měřena při 415 nm (BioRad Microplate Reader 2550) a koncentrace protilátek byla vypočtena použitím softwaru pro analýzu dat Microplate Manager (BioRad). Standardní křivka byla vytvořena pomocí série dvojnásobných ředění rekombinantních protilátek.

-11 CZ 289308 B6

Příklad 6

Identifikace homologních rekombinantů pomocí Southemova blotování

Genomická DNA z jednotlivých klonů byla izolována buď proteinkinázovou metodou K/SDS nebo rychlou guanidinhydrochloridovou metodou (viz. Molekular Cloning: A Laboratory Manual“, autoři Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982).

Aby bylo možno identifikovat homologní rekombinanty bylo 10 mikrogramů genomické DNA z klonů s vysokou hladinou exprese a stejné množství DNA z neproduktivních kontrolních klonů kompletně štěpeno Hpa I, přečištěno na 0,8 % agarosovém gelu a přeneseno na nitrocelulózu Southemovou metodou (viz. Mol. Biol. 98, str. 503, 1975, autor Southem E. J.). Tyto bloty byly hybridizovány se dvěma různými nukleotidovými sondami:

1) s fragmentem Xba I o velikosti asi 3,5 kilobází směrem lokalizovaném ve směru po vlákně od myšího loku IgG2A, a

2) s fragmentem Sall/BamHI (276 kilobází b.p.) z páteře plazmidu pBR322.

Hybridizační nukleotidové sondy DNA byly značeny posunem jednořetězcového zlomu (viz. Molec. Biol. 113, str. 237-251, 1977). Při tomto postupu bylo identifikováno dvacet jamek exprimujících vysoké hladiny protilátek. Opětné testování po klonální expanzi odhalilo, že z těchto 20 jamek 12 pokračovalo v produkci vysokých hladin protilátek, z nichž všechny měly expresní vektor homologně rekombinován do své genomové DNA.

Příklad Ί

Specifická produktivita

Specifická produktivita buněčných klonů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, byla určována vysetím buněk o hustotě 3x10⁵ buněk na jamku ve trojím provedení na 6 jamkové destičce pro kultivaci tkáňových kultur. Médium bylo odebráno z jedné jamky po 24 hodinách, ze druhé jamky po 48 hodinách a ze třetí jamky po 72 hodinách. Po každém odběru byly buňky spočítány. Toto médium bylo následně analyzováno na koncentraci rekombinantních protilátek za použití afínitních kolon POROS protein A. Specifická produktivita vyjádřená vpikogramech na den a buňku byla vypočtena za použiti programu Kalaidagraph. Tyto hladiny produkce protilátek se pohybovaly v rozmezí od přibližně 14 do přibližně 43 pg/buňka/den.

Příklad 8

Analýza RNA

U každé buněčné linie bylo 10⁸ buněk omyto třikrát roztokem IX PBS, lyžováno v roztoku 4M guanidinizothiokyanátu a rozrušeno za použití tkáňového homogenizátoru. Tento lyzát byl převrstven na 5,7 M podklad chloridu cezného a odstřeďován přes noc na rotoru SW28 při 20 000 otáčkách za minutu při teplotě 20 °C. RNA byla získána rozpuštěním pelety v dH2O a následným srážením etanolem. Koncentrace RNA byla určována odečítáním optické hustoty při vlnové délce 260 nm.

Potom bylo 10 mikrogramů z celkové RNA pro každou buněčnou linii děleno na formaldehyd/agarózovém gelu v pufru IX MOPS po dobu tří hodin za napětí 180 V a poté

-12CZ 289308 B6 přeneseno na nitrocelulózový papír v podstatě tak, jak je uváděno v literatuře (viz. Biochem. 18, str. 5294-5299, 1979).

RNA bloty byly hybridizovány do následujících fosforem-32 (³²P) značených nukleotidových sond myší DNA:

a) fragment EcoRl-Xhol o velikosti 2 kilobází, který obsahoval konstantní oblast lidského imunoglobulinu IgGl;

b) fragment EcoRl-Xbal o velikosti 600 párů bází (b.p.), který obsahoval konstantní oblast C2 lidského imunoglobulinu lambda;

c) fragment EcoRl-BamHI o velikosti 1200 párů bází (b.p.) z myšího genu pro beta-aktin, který byl generován pomocí RT-PCR amplifikace s použitím oligonukleotidů 5' - CUA CUA CUA CUA ATG GAT GAC GAT ATC GCT GC-3' (SEQ.ID.NO.:1) a

5' - CAU CAU CAU CAU ACG CAG CTC AGT AAC AGT CC-3’ (SEQ.ID.NO.:2).

Jeden RNA blot byl hybridizován s oběma výše uvedenými nukleotidovými sondami pro imunoglobuliny po dobu přes noc při teplotě 42 °C v 10 % dextransulfátu, 4X SSC, 40 % formamidu, 0,8 % Denhardtově Tris pufrovacím roztoku. Po hybridizaci byly filtry omyty 2X SSC, třikrát roztokem 0,1 % SDS při teplotě místnosti a dvakrát roztokem 0,lX SSC, dále 0,1 % SDS dvakrát po dvaceti minutách při teplotě 50 °C před autoradiografií. Intenzita signálu byla stanovena na přístroji Phosphorimager. Po kvantifikaci se dvěma nukleotidovými sondami pro imunoglobuliny byly filtry zbaveny signálu omýváním při teplotě 70 °C po dobu 15 minut v dH₂O a rehybridizovány s beta-aktinovou nukleotidovou sondou, která dovoluje normalizovat množství RNA obsažené v každé linii. Všechny z testovaných buněčných linií produkovaly přibližně ekvivalentní množství RNA specifické na protilátky.

Příklad 9

Transfekce buněk NS/O

Buňky NS/O byly udržovány v exponenciálním růstu v následujícím médiu: Iscovovo minimální esenciální médium s přídavkem 10 % tepelně inaktivovaného fetálního hovězího séra a 4 mM glutaminu; přičemž tyto buňky byly udržovány při teplotě 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru nastaveném na obsah 5 % až 6,5 CO₂.

Plazmid určený pro transfekci byl linearizován štěpením restrikčním enzymem ve specifickém místě; výhodně se toto specifické místo nacházelo v oblasti bakteriální sekvence vektoru a nikoliv v sekvenci vloženého genu, který se má exprimovat. Po restrikci byla DNA zbavena proteinů extrakcí fenolem, extrakcí směsí fenol/chloroform (v poměru 1:1) a jednou finální extrakcí chloroformem; načež byla DNA vysrážena za sterilních podmínek v biologicky bezpečném boxu za použití roztoku 0,2-0,4 M chloridu sodného a 70 % etanolu. DNA byla resuspendována v takovém množství sterilní destilované vody, aby byla dosažena vypočtená koncentrace 1 mg/1 ml. Získaný roztok DNA byl poté bezprostředně použit nebo zmražen (na teplotu -20 °C) a uchováván v tomto stavu až do případného použití.

V den uskutečnění transfekce byly u zásobních kultur buněk NS/O spočítány životaschopné buňky. Celkově bylo použito lxl O⁷ životaschopných buněk v každé transfekční kyvetě. Buňky byly nejprve odděleny odstřeďováním prováděným při 3000 x g po dobu 5 minut za teploty místnosti; buněčné pelety byly poté dvakrát omyty sterilním fosfátovým solným pufrem (PBS) a resuspendovány v koncentraci 10⁷ buněk v 800 mililitrech. Od této chvíle byla tato buněčná suspenze udržována na ledu. Potom byl podíl 10⁷ buněk za sterilních podmínek v biologickém

-13CZ 289308 B6 bezpečnostním boxu opatrně přenesen do 0,4 centimetrové kyvety (vzdálenost mezi elektrodami) BioRad. K tomuto roztoku byl opatrně přimíšen roztok 40 miligramů linearizované plazmidové DNA a kyveta byla udržována na ledu po dobu 5 minut. Před elektroporací byla vnější strana kyvety otřena do sucha a poté byla kyveta umístěna do kyvetového držáku přístroje BioRad Gene Pulser. Tento genový pulzer byl nastaven na dodávání 3 mF při 1500 V v každém pulzu. Pro tento postup byly použity dva následné pulzy. Kyveta byla potom umístěna po dobu 2-5 minut na led a poté byly buňky přeneseny do 30 mililitrů modifikovaného růstového média s obsahem 1 mM glutaminu, místo původně použitého obsahu 4 mM glutaminu, v 50 mililitrové sterilní zkumavce na jedno použití. Potom bylo 10 mililitrů buněčné suspenze zvýše zmíněných 30 mililitrů distribuováno na jednu mikrotitrační destičku s 96 jamkami v množství přibližně 100 μΐ na jamku; 10 mililitrů buněčné suspenze (ze zbývajících dvaceti mililitrů) bylo zředěno 10 mililitry modifikovaného růstového média a rozděleno do dvou mikrotitračních destiček s 96 jamkami v množství přibližně 100 pl na jamku; a zbývajících 10 mililitrů výše uvedené buněčné suspenze bylo naředěno 30 mililitry modifikovaného růstového média a rozděleno do čtyř mikrotitračních destiček s 96 jamkami v množství přibližně 100 pl na jamku. Tyto destičky byly inkubovány přes noc ve zvlhčovaném inkubátoru nastaveném na teplotu 37 °C, přičemž obsah CO2 byl udižován na 5 % - 6,5 %.

Selektivní médium:

Selektivní médium pro GS selekci mělo následující složení:

Iscovovo minimální esenciální médium (neobsahující glutamin; Sigma) % dialyzovaného fetálního hovězího séra (od firmy Hyclone);

IX nukleosidy*; IX asparagin**;

*50X zásobní roztok ribonukleosidů:

mg adenosinu mg guanosinu mg cytidinu mgthymidinu (všechny ribonukleosidy od firmy Sigma v kvalitě pro buněčné kultury) doplněno na 100 mililitrů sterilní destilovanou vodou. Filtračně sterilován na 0,1 m filtrační jednotce a skladován v zamraženém stavu (při teplotě -20 °C) v 10 mililitrových alikvótních podílech.

**100X asparagin:

600 mg na 100 ml sterilní destilované vody. Filtračně sterilován na 0,1 m filtrační jednotce a skladován při teplotě 4 ^eC.

Selekce:

hodin po transfekci bylo do každé z 96 jamek mikrotitrační destičky přidáno 100 pl selektivního média a destičky byly inkubovány ve zvlhčovaném inkubátoru nastaveném na teplotu 37 °C a obsah CO₂ v rozmezí od 5 % - 6,5 % tak dlouho, dokud se neobjevily buněčné kolonie, což trvalo přibližně 3 až 3,5 týdne. Při provádění tohoto postupu nebylo třeba přídavku žádných živin, pokud jamky nezačaly vysychat, přičemž byly destičky monitorovány v intervalech 3-4 dní. Jamky obsahující rostoucí kolonie se v tomto případě zabarvily žlutě a v tomto okamžiku byly tyto jamky testovány tak, že bylo odebráno 50 až 100 pl kultivačního

- 14CZ 289308 B6 roztoku a jamka byla doplněna selektivním médiem (za účelem zachování životaschopných kmenů).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Homologní rekombinantní expresní vektor pro expresi rekombinantních genů vNonSecreting/Zero, NS/O, buňkách, přičemž tento vektor zahrnuje promotor pro expresi rekombinantního genu, transkripční jednotku kódující selekční signální znak, a specifickou DNA sekvenci lokusu 2A myšího imunoglobulinu gama pro místně cílenou homologní rekombinaci.

2. Homologní rekombinantní expresní vektor podle nároku 1, kde selekční signální znak je vybrán ze skupiny zahrnující guaninfosforibosyltransferázu, dihydrofolatereduktázu, gen poskytující rezistenci k antibiotikům a glutaminsyntetázu.

3. Homologní rekombinantní expresní vektor podle nároku 2, kde selekčním signálním znakem je glutaminsyntetáza.

4. Homologní rekombinantní expresní vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde uvedeným promotorem je promotor typu Cytomegalovirus-Immediate Early, CMV-IE.

5. Homologní rekombinantní expresní vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde uvedeným rekombinantním genem je imunoglobulinový gen.

6. Homologní rekombinantní expresní vektor podle nároku 4, kde uvedený vektor zahrnuje první promotor pro expresi prvního imunoglobulinového genu pro lehký řetězec imunoglobulinové molekuly a druhý promotor pro expresi druhého imunoglobulinového genu pro těžký řetězec imunoglobulinové molekuly.

7. Homologní rekombinantní expresní vektor podle nároku 6, kde uvedený první nebo druhý promotor je každý promotorem typu CMV-IE.

8. Homologní rekombinantní expresní vektor podle nároku 6, který má strukturu znázorněnou na obr. 3A.

9. Způsob exprese rekombinantních genů v Non-Secreting/Zero, NS/O, hostitelských buňkách, vyznačující se tím, žezahmuje:

(a) přenos homologního rekombinantního vektoru podle některého z nároků 1 až 8 se specifitou k lokusu 2A imunoglobulinu gama do uvedené hostitelské buňky, přičemž uvedený vektor obsahuje DNA. kódující rekombinantní gen a tento vektor se homologně rekombinuje s chromozomálním lokusem gama 2A hostitelské buňky; a (b) kultivaci hostitelských buněk, za podmínek vhodných pro selekci a expresi rekombinantního genu.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň použití vektoru, který se homologně rekombinuje s chromozomálním lokusem gama 2A hostitelské buňky na jakémkoliv místě uvnitř zmíněného hostitelského lokusu gama 2A.

4 výkresy

-15CZ 289308 B6