JPH04505104A - 相同組換え法を用いてのタンパク質の生成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １７、前記細胞が悪性細胞である請求の範囲第１５項記載のヒト細胞。

１８、前記増幅可能な遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子である請求の範囲第１５項記載の ヒト細胞。

１９、培養における哺乳類タンパク質の発現のためのヒト細胞以外の哺乳類細胞 であって、タンパク質を発現する１０ｋｂのヒト野生型遺伝子以内に増幅可能な 遺伝子を含んで成る増幅可能領域を含んで成り、ここで前記２種の遺伝子が前記 標的遺伝子に関係する実質的に単独でのヒト野生型配列及び前記増幅可能な遺伝 子に関係するフランキング配列により分離されることを特徴とする哺乳類細胞。

２０、培養における異種タンパク質の発現のための細胞を生成するための方法で あって： 増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子の１０ｋｂのコード領域内のＤＮＡ配列と 相同の少なくとも約１５０ｂｐの少なくとも１つのフランキング領域を含んで成 る構造体により、前記標的遺伝子を含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、こ こで前記増幅可能な遺伝子が前記標的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、 それによって前記構造体がゲノムにおける前記増幅可能な遺伝子及び前記標的遺 伝子を含んで成る増幅可能な領域を定義するために前記−次細胞の前記ゲノム中 に相同的に組込まれるようになり： 前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造 体を含んで成る一次細胞について選択し： 前記−次細胞から前記ゲノムのＤＮＡ部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅 可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり； 前記−次細胞ＤＮＡＲ分により哺乳類二次発現宿主細胞を形質転換し、ここで前 記二次発現宿主細胞が前記−次宿主細胞の種とは異なる種のものであり、そして 前記二次発現宿主細胞に存在する前記ＤＮＡ部分とは異なる前記二次発現宿主細 胞のクローンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し ； 前記増幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択 し；そして 増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は 前記選択の後に存在することを含んで成る方法。

２１、前記増幅が前記二次発現宿主細胞によるものである請求の範囲第２０項記 載の方法。

２２、前記−次細胞がヒト細胞である請求の範囲第２０項記載の方法。

２３、前記ヒト細胞が二倍体繊維芽細胞である請求の範囲第２２項記載の方法。

２４、前記増幅可能な遺伝子が野生型遺伝子よりも高いＫｍを有する突然変異化 されたＤＨＰＲ遺伝子である請求の範囲第２０項記載の方法。

２５、前記二次宿主発現細胞がＤＨＦＲＨＦ性である請求の範囲第２４項記載の 方法。

明　細　書 相同組換え法を用いてのタンパク質の生成本発明の分野は、哺乳類タンパク質の 発現である。

背景 制限酵素、クローニング、配列決定、逆転写酵素及びモノクローナル抗体の発見 は、核酸配列の単離、同定及び操作にふける高い能力をもたらした。これらの能 力の結果として、多くの遺伝子及びそれらの転写制御要素が同定され、そして操 作されて来た。遺伝子は、異種宿主（細菌及び真核生物宿主細胞系）において所 望する多量のタンパク質を生成するために使用されて来た。

多くの場合、コード配列を得、そしてそれらの発現を誘発する方法は長く且つ困 難な方法であった。コード配列、すなわちｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの同定は、 時々、ライブラリーの構成、読み取り枠のフラグメントの同定、末端配列の試験 及び同様のものを包含する。イントロンが時々存在する哺乳類遺伝子において、 多くの場合、コード領域は、遺伝子に関係する全体の核酸のたった小さな画分で ある。他の場合、偽遺伝子又は複数メンバーの遺伝子種類が、対象の特定遺伝子 を単離する能力を不明瞭にして来た。それにもかかわらず、技法が改良されるに つれて、対象の遺伝子の好都合な同定及び単離の連続したバレートが存在して来 た。

多くの情況において、主にタンパク質生成の源に興味の対象が存在する。タンパ ク質を生成する本体における細胞タイプは時々、不適切な源である。なぜならば 、タンパク質は低い量で生成され、タンパク質は培養において増殖されにくい分 化された宿主細胞においてのみ生成され得、又は宿主細胞、特にヒト細胞は生成 物の産生のための培養方法において経済的でなく又は効果的でないからである。

従って、所望するタンパク質の経済的且つ効果的な産生及び可能な場合、タンパ ク質生成物の適切なプロセッシングを提供する細胞による培養にふいて対象のタ ンパク質を産生ずるための代用の技法を開発することに有意な興味が存在する。

択可能な遺伝子に突然変異を誘発する一般的な方法を記載する。Ｗｅｉｄｌｅ久 ｆｆ、、　Ｇｅｎｅ、　６６：　１９３〜２０３（１９８ｇ）は、ＤＨＦＲ遺伝 子による組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子の増幅及び選択高圧力の不在 下での増幅の損失を記載する。Ｍｕｒｎａｎｅ及びＹｅｚｚｉ、　Ｓｏｍａｔｉ ｃ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

旦：２７３〜２８６　（１９８８）は、転写プロモーターを欠く組込まれた選択 可能な遺伝子マーカーによるヒト細胞系の形質転換及び遺伝子マーカーのタンデ ム重複及び増幅を記載する。Ｔｈｏｍ由来の幹細胞における標的遺伝子による特 定部位の突然変異誘発を記載する。Ｓｏｎｇなど、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、　８４：６８２０〜６８２４　（１９８７）は、２ 段階組込みによるヒト細胞における相同組換えを記載する。Ｌｉ５ｋａｙなど、 、　’Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉ口ａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　 Ｒｅｐｅａｔｅｄ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｊｎ　Ｍｏ ｕｓｅ　Ｃｅ１ｌｓ、”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、　４９　：　１３〜１８９　（１９８４）は、同じ遺伝 子の２種の異なった突然変異の組込み及び突然変異遺伝子間の相同組換えを記載 する。Ｒｕｂｎｉｔ２及びＳｕｂｒａｍａｎｉ、　Ｍｏｌ、ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、４　：　２２５：３−２２５８（１９８４）は、哺乳類細胞における 相同組換えのために必要とされる最少量の相同性を記載する。Ｋｉｍ　ａｎｄ　 Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ。

ての相同組換えのためのアッセイを記載する。

発明の要約 対象の哺乳類タンパク質の発現は、適切な転写物の産生の妨害を伴わないで、対 象の遺伝子付近への増幅可能な遺伝子及び他の調節配列の組込みのために相同組 換えを用いることによって達成される。増幅可能な遺伝子及び対象の遺伝子を含 んで成る領域は増幅され得、そのゲノムはフラグメント化され、そして標的のタ ンパク質の発現のために発現宿主に直接的又は間接的にトランスファーされ得る 。前もって増幅されていない場合、標的領域は増幅され、そして細胞集団が標的 タンパク質を生成する細胞についてスクリーンされる。標的タンパク質を高く且 つ安定したレベルで産生ずる細胞が拡張され、そして標的タンパク質の発現のた めに使用される。

図面の簡単な説明 第１図は、変性されたポリリンカーの配列を示すプラスミドｐＣＧ、１の図であ り； ＣＧ、ＨＲＩからのＤＮＡによる相同組換えによりＥＰＯ遺伝子座の標的決定の 結果の図であり； 第４図は、相同組換え出来事が生じた細胞から産生されたＰＣＲ増幅フラグメン トの図である。

特定の態様の記載 培養において対象の哺乳類タンパク質を産生ずるための方法及び組成物が提供さ れる。その方法は、対象のタンパク質をコードする標的遺伝子の付近に増幅可能 な遺伝子を組込むために宿主細胞における相同組換えを利用する。増幅可能な遺 伝子及び標的遺伝子の両者を含む領域は、増幅可能領域として言及されるであろ う。得られた形質転換された一次細胞は、増幅のために選択する条件にゆだねら れ、又はその増幅が続いて行なわれ得る。“形質転換”とは、形質転換、トラン スフェクト、形質導入、接合、融合、エレクトロポレーション又は活性細胞中に ＤＮＡを導入するためのいづれか他の技法を包含する。次に、形質転換された細 胞の染色体又はＤＮＡが、増幅可能な領域を二次発現宿主細胞のゲノム中にトラ ンスファーするために使用され、ここで前もって十分に又はまったく増幅されて いない場合、標的領域はさらに増幅される。得られた細胞系は標的タンパク質の 産生のためにスクリーンされ、そして二次細胞系が所望する産生レベルのために 選択され、そしてこの細胞は拡張され、そして培養にふいて所望するタンパク質 の産生のために使用され得る。

−次細胞は、いづれかの対象の哺乳類細胞、特に培養において容易に増殖しない 哺乳類細胞、より特別には霊長類細胞、特定にはヒト細胞（ここでヒト細胞は正 常な細胞、たとえば胚又は悪性細胞、特に正常な細胞である）であり得る。種々 の細胞タイプ、たとえば繊維芽細胞、特に二倍体皮膚繊維芽細胞、リンパ球、上 皮細胞、ニューロン、内皮細胞又は他の体細胞又は生殖細胞が一次細胞として使 用され得る。皮膚繊維芽細胞が特に興味の対象であり、これは多数の正常細胞、 胎児の腎細胞及び同様のものを提供するために容易に増殖され得る。これらの細 胞は対象の遺伝子を発現することができ又は発現することができなくても良い。

標的遺伝子が誘発可能であり、又は一定の分化された細胞に単に発現される場合 、標的遺伝子が発現される細胞を選択することができ、これは培養において増殖 できる固定化された細胞を要する。

選択料の適切な使用により、ゲノムに組込まれた遺伝子が隣接するフランキング ＤＮＡにより増幅されるであろう多くの増幅可能遺伝子が存在する。増幅可能遺 伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メタロチオネイン−■及び■、好ましくは 霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボ キシラーゼ、等を包含する。増幅可能遺伝子は、特に増幅が一次宿主で使用され 又は増幅可能遺伝子がマーカーとして使用される場合、二次又は発現宿主におい て機能し、そして所望には一次宿主において機能する転写シグナルを有するであ ろう。

標的遺伝子は、前記列挙遺伝子への連続した添加により同定され、そして単離さ れた多くの対象のタンパク質をすでに有する対象のいづれかの遺伝子であり得る 。対象のタンパク質は、シトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）　、たとえばインター ロイキン１−１０；成長因子、たとえばＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、　及びＴＧ Ｆ　；ソマトトロピン；成長ホルモン；コロニー刺激因子：たとえばＧ−、Ｍ− 、及びＧＭ−Ｃ３Ｆ；エリトロポエチン：プラスミノーゲン活性化因子；たとえ ば組織及び尿；酵素、たとえばスーパーオキシドジスムターゼ；インターフェロ ン；Ｔ−細胞受容体；表面膜タンパク質：インシュリン；リポタンパク質；α１ −抗トリブシン；ＣＤタンパク質、たとえばＣＤ３，４．８．１９；血餅因子、 たとえば第■Ｃ因子及びｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ因子：抗血餅因子、た とえばプロティンＣ：心房ナチュレチック（ｎａｔｕｒｅｔｉｃ）因子：腫瘍壊 死因子；輸送タンパク質；回帰受容体（ｈｏｍｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）； アトレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｓ）；調節タンパク質：等を包含する。

相同組換えのためには、増幅可能遺伝子が標的領域のＤＮＡと相同のＤＮＡを１ 端又は両端上に有するであろう構造体が調製されるであろう。相同ＤＮＡは標的 遺伝子の転写された領域の１００　ｋｂ、通常５０ｋｂ、好ましくは約２５ｋｂ 以内であり、より好ましくは標的遺伝子の２ｋｂ以内であろう。遺伝子とは、成 熟ｍＲＮＡの転写のために必要とされるコード領域及びそれらの配列を意味する 。相同ＤＮＡは、エンハンサ−配列、転写開始配列、これらの配列の５′領域又 は同様のものを含んで成る５′−上流領域を含むことができる。相同領域は、コ ード領域の一部を含むことができ、ここで前記コード領域は読み取り枠又はエキ ソン及びイントロンの組合せのみから成る。相同領域はイントロンのすべて又は 一部を含んで成り、ここで１又は複数のエキソンのすべて又は一部がまた存在す ることができる。他方、相同領域は、転写終結領域のすべて又は一部、又はこの 領域の３′領域を包含するために３′−領域を含むことができる。相同領域は標 的遺伝子のすべて又は一部にわたって拡張し、又は転写調節領域及び／又は構造 遺伝子のすべて又は一部を含んで成る標的遺伝子の外側に存在することができる 。大部分、相同配列は増幅可能遺伝子に近い方で又は末端の方で連結されるであ ろう。通常、標的遺伝子に通常関係する野生型配列以外の配列が、増幅可能遺伝 子の少なくとも片側上増幅可能遺伝子から相同配列を分離するために使用される であろう。その配列のある部分は、増幅可能遺伝子に関係する操作の結果として 、その増幅可能遺伝子に関係する５′又は３′配列であり得る。

増幅可能遺伝子を両端に有する相同領域は、標的領域と同される。たとえば、標 的遺伝子のための転写開始領域を変えることが所望され、その結果、相同領域の 一部は、標的遺伝子の野生型５′領域とは異なるヌクレオチドを含む。他方、野 生型開始領域と構造遺伝子との間に野生型開始領域とは異なる転写開始領域の挿 入を提供することができる。同様に、構造遺伝子中に種々の突然変異体を導入す ることが所望され、その結果、相同領域は、コードされたタンパク質における変 化をもたらすミスマツチを含んで成る。たとえば、シグナルリーダー配列は、標 的タンパク質発現生成物の分泌を提供するために標的遺伝子と読み枠を整合して 導入されるであろう。

他方、標的遺伝子の３′領域、たとえば未翻訳領域、ポリアデニル化部位、等を 変えることができる。従って、相同組換えにより、野生型プロモーターの転写調 節下で野生型タンパク質を発現するために、標的遺伝子の組込み性の維持を提供 することができ、又は標的遺伝子の転写調節、プロセッシング又は配列の変化を 提供することができる。多くの場合、転写開始領域に対してシンハンサーを導入 することが所望され、これは、たとえば転写開始調節領域から上流の領域に又は イントロン又は標的遺伝子からさらに下流に前記エンハンサ−に関係する増幅可 能遺伝子を組込むことによって提供され得る。

本発明の構造体を調製するためには、相同組換えのために標的とされる配列を知 ることが必要であろう。ゲノムにおける配列に相補的な１４個の塩基の配列が相 同組換えのために提供することができることが報告されているが、通常、個々の 両端配列は少なくとも約１５０ｂｐであり、そして１２ｋｂ又はそれ以上、通常 約８ｋｂ以下である。その両端領域の大きさは、既知配列の大きさ、突然変異誘 発が関与したとしても、組込みのための部位に対して相同性を有するゲノム中の 配列の数及び突然変異誘発のための領域の分離の程度、組込みのための特定の部 位又は同様のものにより決定されるであろう。

組込み構造体は従来の手段に従って調製され得、ここで配列が合成され、天然源 から単離され、操作され、クローン化され、連結され、インビトロ突然誘発にゆ だねられ、プライマー修復し、又は同様に処理され得る。種々の段階で、その連 結された配列はクローン化され得、そして制限分析、配列決定又は同様のものに より分析され得る。通常、その構造体は、原核生物宿主、たとえばＥ、　コリに おいて機能する複製システム及び選択のためのマーカー、たとえば耐殺生物剤、 栄養要求宿主への相補性、等を含んで成るクローニングベクター上に担持される であろう。他の機能的な配列、たとえば前記構造体又はその一部の導入及び切り 出しを容易にするためのボ＋Ｊ　ＩＪンカー又は同様のものがまた存在する。多 くのクローニングベクター、たとえばｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、等が利用 できる。

構造体が調製された後、次にそれは、−次細胞標的における相同組換えのために 使用され得る。種々の技法が、−次宿主において機能的な複製システムに連結さ れないで、−次細胞のゲノム中にその構造体を組込むために使用され得る。たと えば、アメリカ特許第４．３１９．２１６号並びに関連文献セクションにおいて 引用された文献を参照のこと。他方、構造体は、通常ウィルス複製システムを有 する適切なベクター、たとえばＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウィルス、アデノウィルス 又は同様のウィルス中に挿入され得る。線状ＤＮＡ配列のベクターはまた、トラ ンスフェクトされた細胞を同定するために選択可能なマーカーを有する。選択可 能なマーカーは、Ｇ４１８による選択を可能にするネオ遺伝子、ＨＡＴ媒体によ る選択のる。

ベクターは宿主において安定して維持され得ても、又はされ得なくても良い。ベ クターが安定して維持される場合、細胞は、宿主のゲノム中へのベクターの相同 組込みのためにスクリーンされ、ここで細胞を治癒するための種々の技法が使用 され得る。ベクターが安定して維持され得ない場合、たとえば温度感受性複製シ ステムが用いられる場合、細胞がベクターにより治癒され得るように許容温度か ら非許容温度に温度を変えることができる。この場合、増幅可能遺伝子及び存在 する場合、選択可能マーカーを含んで成る構造体の組込みを有するそれらの細胞 のみが選択を生存することができる。

選択可能なマーカーが存在する場合、その選択可能なマーカーにより構造体の存 在について選択することができる。選択可能なマーカーが存在しない場合、増幅 可能な遺伝子により構造体の存在について選択することができる。ネオ遺伝子／ 　ｍ　ＬのＧ４１８又はＨＡＴ培地の形質転換体の増殖のだめの培地を使用する ことができる。ＤＨＦＲが増殖可能遺伝子である場合、選択培地は約０．０１〜 ０．２５−のメ２−レキセードを含むことができる。

相同組換えを実施する場合、ＤＮＡが一次細胞中に導入されるであろう。使用さ れ得る技法は、リン酸カルシウム／ＤＮＡ同時沈殿物、核中へのＤＮＡのマイク ロインジェクション、エレクトロポレーション、損なわれていない細胞との細菌 性プロトプラストの融合、トランスフェクション、ポリカチオン、たとえばポリ ブレン、ポリオルニチン、等、又は同様のものを包含する。ＤＮＡは一本鎖又は 二本鎖、線状又は環状のものであり得る。哺乳類細胞を形質転換するための種々 の技法のためには、Ｋｅｏｗｎなど、、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎｏｌ ｏｇｙ（１９８９）、　Ｋｅｏｗｎなど、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｆ！ｎ ｚｙｎｏ１ｏｇｙ（１９９０）第１８５巻、５２７〜５３７ページ及びＭａｎｓ ｏｕｒなど、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３６　：３４８〜３５２　（１９８８）を 参照のこと。

標的領域から上流及び又は下流で、構造体は二重交差が生じたかの同定を提供す る遺伝子であり得る。このためには、ヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ 遺伝子が、使用され得る。なせならば、チミジンキナーゼ遺伝子の存在は、機能 的なＨ５Ｖ−ｔｋ遺伝子を含む細胞上への細胞毒性効果のためにヌクレオシド類 似体、たとえばアシクロバー（ａ　ｃ　ｙｃｌｏｖｉｒ）又はガンシクロバー（ ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）の使用により検出され得るからである。これらのヌク レオシド類似体への感受性の不在は、チミジンキナーゼの不在を示し、そして従 って、相同組換えが生じた場合、二重交差がまた生じたことを示す。

殺生物剤への耐性又はマーカー遺伝子の存在のために選択する培地においての増 殖により明らかなようにマーカー遺伝子の存在は、標的構造体の存在及び宿主ゲ ノム中へのその組込みを確立する。この時点でさらに選択は行なわれる必要がな い。なぜならばその選択は、増幅された標的遺伝子の発現が検出され得る場合、 二次発現宿主において行なわれるであろうからである。所望により、相同組換え がＰＣＲを用い、そしてその得られた増幅されたＤＮＡ配列を配列決定すること によって生じたかどうかを決定することができる。所望により、増幅は、適切な 増幅用試薬により一次細胞をストレスすることによって、この時点で行なわれ得 、その結果、複数コピーの標的遺伝子が得られる。他方、増幅は二次細胞発現宿 主へのトランスファーを待つことができる。

約２０ｋｂ以上、好ましくは約５０ｋｂ以上の高分子量ＤＮＡ又は好ましくは中 期染色体は、増幅ベクターの適切な組込みを有する一次受容細胞株から調製され る。調製及び単離技法は、Ｎｅ１ｓｏｎ及びＨｏｕｓｍａｎ、　Ｇｅｎｅ　Ｔｒ ａｎｓｆｅｒ（Ｒ，Ｋｕｃｔ＋ｅｒｌａｐａｔｉ）ＰＩｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、 　１９８６により記載される。次に、ＤＮＡは、−次細胞のために使用されるの と同じ又は異なった技法を用いて、二次宿主発現細胞中に上記と同じ態様で導入 され得る・種々の哺乳類発現宿主が利用でき、そして使用され得る。これらの宿 主は、ＣＨＯ細胞、サル腎細胞、Ｃ１２７マウス繊維芽細胞、３Ｔ３マウス細胞 、Ｖｅｒｏ細胞、等を包含する。所望には、宿主は、増幅可能な遺伝子、又は増 幅剤に実質的にほとんど応答しない遺伝子のために負のバックグラウンドを有す るであろう。

形質転換された細胞は約０．０１〜０．５−のメトトレキセートを含む選択培地 で増殖され、そして他のマーカー、たとえばネオ遺伝子が存在する場合、その培 地は約０．１〜ｌｌｌ１ｇ／ｍｌのＧ４１８を含むことができる。耐性コロニー が単離され、そして次に、標的遺伝子に対して並置しての構造体の存在について 分析され得る。これは、標的遺伝子生成物の発現の検出の結果として存在し、こ こで通常、標的遺伝子生成物、ＰＣＨの使用、サザンハイプリダイゼーション又 は同様のものに対して負のバックグラウンドが存在するであろう。

次に、その構造体を含む細胞が拡張され、そして漸進的に高濃度の増幅試薬、た とえばＤＨＰＲ遺伝子のために０．５〜２００−のメトトレキセートを含む培地 による選択及び増幅にゆだねられ、そして個々の選択段階で、標的生成物の産生 について分析され得る。拡張は、少なくとも重複を包含し、そして少なくとも５ 個のコピー、好ましくは１０個のコピー又はそれ以上のコピーをタンデム関係で もたらすことができる。従って、タンパク質生成は、単一のコピーからの発現か ら少なくとも１８５倍、通常少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍に高め られるであろう。

次に種々のクローンが標的生成物の最適な安定した産生のためにスクリーンされ 得、そして次にこれらのクローンが拡張され、そして培養での産生のために商業 的に使用され得る。

この態様においては、高い収率の生成物を、そのメツセージを単離する必要性を 伴わないで及び遺伝子工学に関する種々の操作を行なわないで又はゲノム遺伝子 を単離しないで得ることができ、ここでひじょうに大きな遺伝子が主要研究及び 開発努力であり得る。

次の例は例示的であって、本発明を限定するものではない。

正常なヒト二倍体皮膚繊維芽細胞（“−次受容体”）を、２０％ウシ胎児血清に より補充されたＥＥＭＥＭ培地中で増殖する。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨ ＦＲ）欠失性チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＰＵＫＫ−Ｂ１１細胞（Ｕ ｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、５ｃｉ− ＵＳＡ　７７　：　４２１６〜４２２０　（１９８０）　）　（“二次受容体” ）を、１０％の透析されたウシ胎児血清により補充されたα−培地中で増殖する 。

ＤＮＡベクター 増幅ベクターを、ＰＯＣｌ２　（Ｙａｎ　１ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど、、　Ｇ ｅｎｅ　３３　：１０３〜１１９　（１９８５）　）から構成する。ヘルペス単 純ウィルスのチミジンキナーゼ（Ｈ３Ｖ　ｔｋ）プロモーターにより誘導された ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）を含む１．８　ｋ ｂのＨａｅＩＩフラグメントを、ｐＨｙｇ　（Ｓｕｇｄｅｎなど、、　Ｍｏｌ、 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５　：　４１０〜４１３（１９８５））からＨａｅ■によ る消化及びゲル電気泳動により単離する。合成アダプターとこのフラグメント上 に付加し、）（ａｅＩＩ末端をＨｉｎｄＩＩＩ末端に転換し、そして得られたフ ラグメントをＨｉｎｄ■により消化されたＰＯＣｌ２に連結する。その得られた プラスミドｐＵＣＨは、ｈｐｈ及びβ−ラクタマーゼの転写が反対方向で存在す るようなヒグロマイシンカセットを含む。

ＳＶ４０転写シグナルにより誘導されたＤＨＦＲ遺伝子を含ル電気泳動により単 離する。得られたプラスミドｐＵＣＤは、ＤＨＰＲが同じ方向に転写されるよう にＤＨＦＲカセットを含む。第１エキソン及びその第４イントロンの一部の他に 、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の転写開始を両端に有する Ｌ４５ｋｂのＤＮＡを含むファージＦ１５（Ｆｒｉｅｚｎｅｒ　Ｄｅｇｅｎなど ＋Ｉ　Ｊ、Ｒｉａｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１　：　６９７２〜６９８５（１９８６ ）からの１．７６ｋｂのＨａｍＨＩｙラグメントを、ＨａｍＨＩ消化の後、ゲル 電気泳動により単離する。このフラグメントを、ＢａｒｎＨｒによりｐＵＣＤを 消化した後、それに連結する。

得られたプラスミドｐＵＣＧは、ＤＨＦＲカセットの反対の方向に配向されたｔ −ＰＡフラグメントのプロモーターを有する。そのｔ−ＰＡフラグメントは、ｐ ＵＣＧに対して独得でない単一のＮｃｏ１部位を含む。ＮｃｏＩによる部分消化 を行ない、そしてＮｏｔＩリンカ−を挿入する。その得られたプラスミドｐＣＧ は、相同組換えの頻度を高めるために一次ヒト二倍体繊維芽細胞の形質転換の前 、そのプラスミドの線状化を可能にするｔ−ＰＡフラグメントにおけるユニーク ＮｏｔＩ部位を含む（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉなど、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ。

でＤＮＡを用いてのエレクトロポレーションにより一次受容体中に導入する。次 にその得られた細胞を選択培地（２００ＩＩＩｌ／ＩＩＩＩのヒグロマイシンＢ を有するＥＥＭＥＭ）中で増殖する。耐性コロニーを単離し、そしてランダム組 込み体と相同組込み体とを区別するために、プライマーとして配列ＧＣＧＧＣＣ ＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＡ及びＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴ（１’ＴＧＧＡＧＴＧ ＧＡを用いてＰＣＲ（Ｋｊａｙ及びＳａ＋１ｔｈｉｅｓ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　：　８８８７〜８９０３（１９８８））により分析 する。これらの２種のプライマーを用いてのＰＣＲによる細胞ＤＮＡの増幅は、 正しく標的決定された細胞からのＤＮＡが存在する場合のみ、１．９ｋｂのフラ グメントを生成する。ｔ−ＦＡ領域中に組込まれたＤＨＦＲ遺伝子を含む細胞を 拡張し、そして二次受容体の調製のための遺伝子材料の源として使用する。

二次受容体の調製 中期染色体を、ＤＨＦＲを有する、相同組換えを示す受容体から調製しくＮｅ１ ｓｏｎなど、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、２　：　５６３〜５７７ 　（１９８４）　）、そして次に、リン酸カルシウム介在遺伝子トランスファー によりＤＨＦＲ−欠失ＣＨＯ細胞中で形質転換する（Ｎｅｌｓｏｎなど、、　Ｊ 、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、２　：　５６３〜５７７（１９８４）　）。

次にその細胞を、選択培地（２００層／ｍｌのヒグロマイシンＢを含むα−培地 ）中で増殖する。耐性コロニーを単離し、そしてヒ）ｔ−ＰＡの発現について分 析する（ＫａｕｆｍａｎｆＬζ、、　Ｍｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５　：　１ ７５０〜１７５９（１９８５））　、次にその細胞クローンを、漸進的に高い濃 度のメトトレキセート（０，０２〜８０ＪＩ？１１段階により４倍に濃度が上昇 する）を含む選択培地中で増殖する。この増殖工程の後、細胞を収穫し、そして ヒトｔ−ＰＡを、ｔ−ＰＡに対して特異的なモノクローナル抗体によるＥＬ　Ｉ 　ＳＡアッセイを用いて分析する（Ｗｅｉｄｉｅ及びＢｕｃｋｅｔ、　Ｇｅｎｅ 　５１　：　３１〜４０１９８７））　、高レベルのｔ−ＰＡの発現を提供する クローンを、続く使用のために貯蔵する。

クローンを、ヒトエリトロポエチンの推定されるプロモーター領域に対する２種 の３６ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブ ５　’　−ＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＡＧＴＴＣＣＧＣＡＡＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧ ＴＣＴＧＧ　−３’及び５　’　−ＣＧＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＴＣ ＴＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＣＧ−３’を用いて、ＥＭＢＬにおけるヒト胎盤 ＤＮＡゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得る。このクロー ンから２つのサブクローンをｐＳＰ７２　（Ｋｒ　ｉｅｇ及びＭｅｌｔｏｎ（１ ９８７）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５５３９７〜４１５）に創造し、こ こで１つのサブクローンは、ＥＰＯ（ｐＴＤ、１）のコード領域の上流の領域が らの５ｋｂのＢａｒｎＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含み、そして他の１ つのサブクローンはＥＰＯ（ｐＴＤ、２）をコードする５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ −ＢａｍＨＩフラグメントを含む。

エリトロポエチンを標的化するためのＤＮＡフラグメントの構成 プラスミドｐＣＧ、１を、５ａｃＩとＫｐｎ　１部位との間のｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ　ＳＫ　（−）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリリンカーと合成二本鎖 の７２塩基対ＤＮＡフラグメント（第１図）とを置換することによって構成した 。第２図に関しては、得られたフラグメントの末端上にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ 及び、ＸｂａＩ部位を構成するためにオリゴヌクレオチドプライマー５　’　− ＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧＴＴ−３’及び５　’　− ＧＡＧＧＴ［：ＴＡＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ−３’を用 いて、プラスミドｐＵｃＨ０ＣＭＶ（Ｍ、（１：ａｌｏｓ、　５ｔａｎｆｏｒｄ 口、のギフト）のＰＣＲ増幅により得られたヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ 、　Ｂｏｓｈａｒｔなど、、（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１．５２１〜５３０） の初期遺伝子のエンハンサ−及びプロモーターを含む６７８ｂｐのフラグメント が、ｐＣＧ、１中のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａ１部位との間にクローン化された。

得られたプラスミドｐＣＧ、ＣＭＶを、追加の構成のために使用した。

ｐＴＤ、２からの６２０ｂｐのＢｓ　ｔＥＩＩ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを、 Ｂｓ　ｔＥＩＩ−Ｘｂａ　Ｉアダプターの使用によりＸｂａＩにより制限された ｐＣＧ−ＣＭＶに連結し、プラスミドｐＣＧ、ＣＭＶ／ＥＰＯを創造し、ここで ＥＰＯフラグメントのＢｓｔＥＩＩ部位はＣＭＶＶフラグメントのプロモータ一 端の次に存在する。ｐｃｃ、ＣＭＶ／ＥＰＯ中に、プラスミドｐｓＶ２ｄｈｆｒ （Ｓａｂｒａｍａ旧など（１９８１）Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、１．８５４ 〜８６４）からの耐メトトレキセート性をコードする１、　９４　ｋｂのフラグ メント及びプラスミドｐＭｃ１ｎｅｏポリＡ　（Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃ ｈｉ（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１．５０３〜５１２）からの耐Ｇ４１８性をコー ドするＬ１５ｋｂのフラグメントを連続的にクローン化した。

ネオ遺伝子をＸｈｏＴ−３ａｌ■フラグメントとして得、そしてｄｈｆｒ遺伝子 を、得られるフラグメントの末端でＭｌｕＩ部位を付加するように企画されたプ ライマー５　’　−ＧＧＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡ ＴＡ　−３’及びＭＶ／ＥＰＯのそれぞれのＸｈｏＩ及びＭ　Ｉ　ｕ　Ｉ部位中 にクローンし、それらの転写がＣＭＶの方向と同じ方向で存在するようにブ５　 スミ）’ｐＣＧ、ＣＭＶ　／ＥＰＯ／　ＤＨＰＲ及びｐ［：Ｇ、ＣＭＶ　／　Ｅ ＰＯ／　Ｎｅｏ　／ＤＨＰＲを得た。最後に、ｐＴＤ、１からの５ｋｂのＢａｍ ＨＩ　−Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩ［７ラグメントを、ｐＣＧ、ＣＭＶ　／ＥＰＯ／Ｎｅ ｏ／ＤＨＰＲのＣｌａＩ部位でＣ１ａＩアダプターを通して付加し、ｐＣＧ、Ｈ ＲＩを得た。ｐＣＧ、ＨＲＩにおいては、５′の５ｋｂのＥＰＯフラグメントは 、起源のλクローンに関して、６２０ｂｐのＢｓｔＥＩＩ−ＸｂａＩフラグメン トの配向と同じ配向で存在する。

５′の５ｋｂのＢａｒｎＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＥＰＯフラグメント、ｄｈｆｒ及 びＧ４１　ｇ？−カー、ＣＭＶｘンハンサー／プロモーター及び６２０ｂｐのＢ ｓ　ｔＥＩＩ−Ｘｂａ　ＩＥＰＯ７ラグメントを含む９．５４　ｋｂのフラグメ ントを、ＮｏｔＩ又は５ａｃＩＩフラグメントとしてｐｃｃ、ＨＲＩから放した 。このＮｏｔＩフラグメントは、それが出来事（第３図）を促進するために５ｋ ｂ及び６２０ｂｐの相同性を有するオメガ構造体として組換えで作用するように 企画される場合、相同組換えのために使用され得る。

エレクトロポレーションに関しては、まずＤＮＡをＮｏｔＩにより切断し、次に フェノール／クロロホルムによす抽出し、そして遠心分離の前、エタノールの添 加により沈殿せしめた。得られたＤＮＡペレットを、１００Ｍのトリス−ＨＣｌ 。

１ｍＭのＥＤＴＡ　（ＴＥ）の体積（１０ｉｔ１）中に２ｍｇ／ａ＋１の濃度で 再懸濁した。

細胞中にＤＮＡの導入 形質転換された一次ヒト２９３胎児腎細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３）を、１ ０％ウシ血清、グルタミン（２ｍＭ＞及びペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）　／ス トレプトマイシン（０，１ｍｇ／ｍｌ）により補充されたＣｅｌｌｇｒｏ　ＤＭ ＥＭ　ＨＩ３（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中に培養し、そして５％ＣＯ２中で３７℃ で増殖した。９０％の集密度で、細胞を、トリプシン処理、短い遠心分離による 濃縮及び１０７細胞１０．８ｍｌでＰＢＳ中への再懸濁よりエレクトロポレーシ ョンのために調製した。その細胞を４℃で平衡化し、そしてＮｏｔＩにより制限 されたＤＮＡ　（５０ｇ）（上記のようにして）を添加した。その混合物を、Ｂ ｉｏ　Ｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒによリ９６０μＦ及び２６０Ｖでエレク トロボレート処理し、そして次に１０ｃｍの皿上にプレートする前、１０分間再 び氷で冷却した。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、１０ｃｍの皿か らの細胞を、０．６　ｍｇ／＋ｎｌ　（有効濃度）で０４１８を含む培地中の５ 種の２４−ウェルプレートにそって平等に分けた。これらのエレクトロポレーシ ョン条件下で、４〜ｌＯ個のコロニーが２週間の薬物選択後、ウェル当り生存す る。

ＰＣＲ分析による相同組換えの検出 ｐＣＧ、ＨＲＩからのＮｏｔｌ制限ＤＮＡを用いて、好結果をもたらす相同組換 えを、１．２ｋｂのゲノム配列（第３図）を同時に欠失しながら、標的ＥＰＯ遺 伝子座での３．８ｋｂの構造体の挿入により得る。ＰＣＲを用いて、第４図に示 されるように、独得の標的出来事対ＤＮＡのランダム組込みを検出する。２種の プライマーを合成し、ここで１つのプライマーはＣＭＶの３′末端に合成され、 そして他のプライマーは標的ＤＮＡにおける６２０ｂｐのＢｓ　ｔＥＩＩ−Ｘｂ ａ　Ｉフラグメントのために使用されるＸｂａ　Ｉ部位の方での領域３′に合成 される。相同組換え出来事は、ゲノムにＤＮＡ標的を生成し、これからこれらの プライマーが８６０ｂｐの増幅生成物を生成する。

標的出来事を検出するために、４個のウェルのそれぞれ（約１６個のコロニーを 示す）からのクローン（エレクトロボレートされた２９３個の細胞からの）のプ ールを、ウェルをトリプシン処理し、そしてプールのために個々の９０％のウェ ルを用いることによって生成した。残る１０％の個々のウェルを、前記ウェル中 に再接種した。次にゲノムＤＮＡを次の通りに個々のプールから調製した。個々 のプール中の細胞を、１．５ｍｌのマイクロ遠心分離管で２分間の遠心分離によ りペレット化し、ＰＢＳ　（２０ＩＸＩ）中に再懸濁し、そして１０ＩｏＭのト リス−ＩＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１００ｍＭのＮａＣ１，５ｍＭのＥＤＴＡ、 １％のＳＤＳ及びＲ，Ｎ、、＠Ａ　（４０ａｇ／ｍｌ＞を含む溶液（４００ｄ） により３７℃で１時間処理した。次に、プロティナーゼＫ　（１０４，１０ｍｇ ／ｍｌ）を添加し、そしてサンプルを５０℃で４時間インキュベートし、その後 、フェノール／クロロホルム（それぞれ２００Ｉ！ｌ）、次にクロロホルム（４ ００，ｄ）と共に激しく撹拌することにより抽出し、エタノール（８００ｄ）を 添加し、そして２５℃で１゜分間撹拌した。ＤＮＡベレットを７０％エタノール により洗浄し、乾燥せしめ、そしてＴＥ（２０ｉｔｌ）中に再懸濁した。

平均４０ｇのゲノムＤＮＡを個々のサンプルから一部た。

ゲノムＤＮＡの個々のサンプル約ＩＲをＰＣＲ分析のために使用した。ＴＥの１ ０Ｉ！１体積中、ＤＮＡを１０分間煮沸し、その後ＰＣＲ混合物（４０ｄ）を添 加した。その反応物（５０１！１）は、１０ｍＭ（７）　トＩＪ　ス−ＨＣ１（ ２５℃でｐＨ９，０）、５０ｍＭのＫＣＩ、１．５ｍＭのＭｇＣＬ　、０．０１ ％のゼラチン、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２００ＭのｄＮＴＰ、それぞ れ１声のプライマー： ５　’　−ＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧ−３’及び５　 ’　−ＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧ−３’　、及び１． ５Ｕの４℃で３分間の初期インキュベーションの後、サンプルを、９４℃で１分 間の変性、６６℃で１．５分間のアニーリング及び７２℃で２分間の拡張の４５ 回のサイクルにゆだねた。４５回のサイクルの最後で、サンプルを７２℃でさら に５分間インキュベートした。個々のサンプルの一部（２０ｍ）を、ＴＢＥ中で 作動される１％アガロースゲル上で分析し、そしてエチジウムプロミドにより染 色した。３回のエレクトロポレーションから分析された９０個のプールのうち、 正しいサイズのフラグメントを示した２種のサンプルをエチジウムプロミド染色 により同定した。ＰＣＲ反応からのＤＮＡを回収し、そしてＸｂａ　Ｉによる制 限マツピングにゆだねた。正しい増幅生成物は、）（ｂａ　Ｉによる処理に基づ いて、２種のフラグメント、６６９ｂｐ及び１９１ｂｐを生成する。２種のプー ルからのサンプルは両者とも、正しいサイズのフラグメントを生成した。さらに 、プール１かのサンプルは末カット材料で他のバンドを示す。

前記方法に従って、中期染色体を、ＤＨＦＨによる相同組換えを示す受容体から 調製し、そしてＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞中で形質転換する。耐性コロニーを単離 し、そしてＥＰＯの発現について分析した後、細胞クローンを、濃度で４倍の上 昇の段階を伴って、漸進的に高い濃度のメトトレキセート（０，０２〜８０−） を含む選択培地中で増殖する。次に細胞を収穫し、クローン化し、そしてＥＰＯ の産生のためにスクリーンする。少なくとも２倍のＥＰＯ産生の増強を提供する クローンを単離する。

本発明の方法は対象の広範囲の種類の哺乳類遺伝子の発現への新規アプローチを 提供することは、上記結果から明らかである。その方法は、単純であり、標的遺 伝子の領域における約３００ｂｐ又はそれ以上の配列の知識を要するのみであり 、そして次に発現宿主に増幅可能な領域をトランスファーするために実質的に従 来の技法を使用することができ、そして高い収率で所望する生成物の産生ずるこ とができる。

本明細書に引用されるすべての出版物及び特許は、それぞれ個々の出版物又は特 許出願が引用により導入されていることを特別に及び個々に示しているかのよう に、引用により本明細書に組込まれる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的い゛くらか詳細に記載され ているけれども、特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

ＦＩＧ、　４ 国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類タンパク質を生成するための方法であって：二次発現宿主に相同の標 的遺伝子を含んで成り、そして対象のタンパク質及び増幅可能な遺伝子を発現す る増幅可能な領域の複数コピーを含んで成る哺乳類の二次発現宿主細胞を増殖す ることを含んで成り、それによって前記標的遺伝子が発現され、そして前記タン パク質が生成され；ここで前記二次宿主発現細胞が： 前記標的遺伝子の増幅を提供するために、増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子 のコード領域の遺伝子座でのＤＮＡ配列と相同の合計少なくとも約１５０ｂｐの 少なくとも１つのフランキング領域を含んで成る構造体により前記標的遺伝子を 含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、ここで前記増幅可能な遺伝子が前記標 的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、それによって前記構造体が増幅可能 な領域を定義するために前記一次細胞のゲノム中に相同的に組込まれるようにな り； 前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造 体を含んで成る一次細胞について選択し； 前記一次細胞から前記ゲノムのＤＮＡ部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅 可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり； 前記一次細胞ＤＮＡ部分により二次発現宿主細胞を形質転換し、そして前記二次 発現宿主細胞に存在する前記ＤＮＡ部分とは異なる前記二次発現宿主細胞のクロ ーンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し；前記増 幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択し；そ して 増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は 前記選択の後及び前記増殖の前に存在することを含んで成る方法により生成され ることを特徴とする方法。
2. ２．前記増幅可能な遺伝子が哺乳類ＤＨＦＲ遺伝子である請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．前記部分が中期染色体である請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記部分が制限フラグメントである請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．前記一次細胞がヒト細胞である請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．前記ヒト細胞が繊維芽細胞である請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記構造体が前記一次宿主細胞のために殺生物剤に対する耐性を提供する殺 生物性マーカーを含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．哺乳類タンパク質を生成するための方法であって：増幅可能な遺伝子及び前 記標的遺伝子の５０ｋｂのコード領域内のＤＮＡ配列と相同の少なくとも約１５ ０ｂｐの少なくとも１つのフランキング領域を含んで成る構造体により、前記標 的遺伝子を含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、ここで前記増幅可能な遺伝 子が前記標的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、それによって前記構造体 がゲノムにおける前記増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子を含んで成る増幅可 能な領域を定義するために前記一次細胞の前記ゲノム中に相同的に組込まれるよ うになり； 前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造 体を含んで成る一次細胞について選択し； 前記一次細胞から前記ゲノムのＤＮＡ部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅 可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり； 前記一次細胞ＤＮＡ部分により哺乳類二次発現宿主細胞を形質転換し、ここで前 記二次発現宿主細胞が前記一次宿主細胞の種とは異なる種のものであり、そして 前記二次発現宿主細胞に存在する前記ＤＮＡ部分とは異なる前記二次発現宿主細 胞のクローンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し ； 前記増幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択 し； 増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は 前記選択の後に存在し；そして前記増幅可能な領域の複数のコピーを含んで成る 前記二次発現宿主細胞を増殖し、これによって前記標的遺伝子が発現され、そし て前記タンパク質が生成されることを含んで成る方法。
9. ９．前記増幅が前記二次発現宿主細胞によるものである請求の範囲第８項記載の 方法。
10. １０．前記一次細胞がヒト細胞である請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．前記ヒト細胞が二倍体繊維芽細胞である請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記増幅可能な遺伝子が野生型遺伝子よりも高いＫｍを有する突然変異化 されたＤＨＦＲ遺伝子である請求の範囲第８項記載の方法。
13. １３．前記二次宿主発現細胞がＤＨＦＲ欠失性である請求の範囲第１２項記載の 方法。
14. １４．前記構造体が相同フランキング領域により前記増幅可能な領域から分離さ れたマーカー遺伝子をさらに含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。
15. １５．ヒト細胞であって、標的遺伝子の増幅を提供するためにヒトゲノムにおけ るその野生型部位以外の部位で及びタンパク質を発現する標的遺伝子の遺伝子座 内に増幅可能な遺伝子を含んで成るヒト細胞。
16. １６．前記細胞が正常な細胞である請求の範囲第１５項記載のヒト細胞。
17. １７．前記細胞が悪性細胞である請求の範囲第１５項記載のヒト細胞。
18. １８．前記増幅可能な遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子である請求の範囲第１５項記載の ヒト細胞。
19. １９．培養における哺乳類タンパク質の発現のためのヒト細胞以外の哺乳類細胞 であって、タンパク質を発現する１０ｋｂのヒト野生型遺伝子以内に増幅可能な 遺伝子を含んで成る増幅可能領域を含んで成り、ここで前記２種の遺伝子が前記 標的遺伝子に関係する実質的に単独でのヒト野生型配列及び前記増幅可能な遺伝 子に関係するフランキング配列により分離されることを特徴とする哺乳類細胞。
20. ２０．培養における異種タンパク質の発現のための細胞を生成するための方法で あって： 増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子の１０ｋｂのコード領域内のＤＮＡ配列と 相同の少なくとも約１５０ｂｐの少なくとも１つのブランキング領域を含んで成 る構造体により、前記標的遺伝子を含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、こ こで前記増幅可能な遺伝子が前記標的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、 それによって前記構造体がゲノムにおける前記増幅可能な遺伝子及び前記標的遺 伝子を含んで成る増幅可能な領域を定義するために前記一次細胞の前記ゲノム中 に相同的に組込まれるようになり； 前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造 体を含んで成る一次細胞について選択し； 前記一次細胞から前記ゲノムのＤＮＡ部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅 可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり； 前記一次細胞ＤＮＡ部分により哺乳類二次発現宿主細胞を形質転換し、ここで前 記二次発現宿主細胞が前記一次宿主細胞の種とは異なる種のものであり、そして 前記二次発現宿主細胞に存在する前記ＤＮＡ部分とは異なる前記二次発現宿主細 胞のクローンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し ； 前記増幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択 し；そして 増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は 前記選択の後に存在することを含んで成る方法。
21. ２１．前記増幅が前記二次発現宿主細胞によるものである請求の範囲第２０項記 載の方法。
22. ２２．前記一次細胞がヒト細胞である請求の範囲第２０項記載の方法。
23. ２３．前記ヒト細胞が二倍体繊維芽細胞である請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．前記増幅可能な遺伝子が野生型遺伝子よりも高いＫｍを有する突然変異化 されたＤＨＦＲ遺伝子である請求の範囲第２０項記載の方法。
25. ２５．前記二次宿主発現細胞がＤＨＦＲ欠失性である請求の範囲第２４項記載の 方法。