CZ289923B6 - Hepatitis C virový, zkrácený asialoglykoprotein, farmaceutická kompozice s jeho obsahem a jeho pouľití - Google Patents

Abstract

Je pops n hepatitis C virov², neboli HCV, zkr cen² asialoglykoprotein vybran² ze skupiny zahrnuj c asialoglykoprotein exprimovan² z E1 oblasti HCV, kter zahrnuje deleci sti sekvence, nach zej c se v oblasti aminokyselin 330 a 380 E1 oblasti, slovan od za tku HCV polyprotein a asialoglykoprotein exprimovan² z E2 oblasti HCV, kter zahrnuje deleci sti sekvence, nach zej c se v oblasti aminokyselin 660 a 830 E2 oblasti, slovan od za tku HCV polyproteinu, d le farmaceutick kompozice, kter obsahuje tento asialoglykoprotein a jeho pou it pro imunodiagnostickou metodu pro detekci protil tek proti HCV.\

Description

Tento vynález je zaměřen na hepatitis C virový, neboli HCV, zkrácený asialoglykoprotein, farmaceutickou kompozici, která obsahuje tento asialoglykoprotein a jeho použití pro imunodiagnostickou metodu pro detekci protilátek proti HCV.

Dosavadní stav techniky

Non-A non-B hepatitida (NANBH) je nakažlivá choroba (nebo skupina chorob), o které se soudí, že je způsobena virem a je odlišitelná od jiných forem s virem asociovaných jatemích chorob, jako jsou choroby způsobené hepatitis A virem (HAV), hepatitis B virem (HBV), delta hepatitis virem (HDV), cytomegalovirem (CMV) nebo virem Epstein-Barrové. Epidemiologické studie napovídají, že mohou být tři typy NANBH: vodou přenosný typ nebo jehlami přenosný typ a sporadicky se vyskytující společně získaný typ. Počet příčinných agens je neznámý. Nicméně nový virový druh, hepatitis C virus (HCV) byl nedávno identifikován jako primární (ne-li jediný) původce krví přenosné NANBH (BB-NANBH). Hepatitis C se jeví být hlavní formou hepatitid spojených s transfuzí v mnoha zemích nebo oblastech, včetně Spojených států, Evropy a Japonska. Je zde také evidentní přispění HCV v indukci hepatocelulámího karcinomu. Existuje tak potřeba účinné metody pro prevenci a léčbu HCV infekce. Potřeba citlivých, specifických metod pro screening a identifikaci nosičů HCV a HCV-kontaminované krve nebo krevních produktů je zřejmá. Post-transfúzní hepatitida (PTH) se vyskytuje přibližně u 10 % transfundovaných pacientů a HCV je přičítáno 90 % těchto případů. Hlavním problémem u této choroby je častá progrese do chronického jatemího onemocnění, nastávající z 25 až 55 %.

Péče o pacienta, jakož i prevence přenosu hepatitis C viru krví a krevními produkty nebo těsným osobním kontaktem, potřebuje spolehlivý diagnostický a prognostický nástroj k detekci nukleových kyselin, antigenů a protilátek, týkajících se HCV. Navíc je zde také potřeba účinná vakcinace a imunoterapických léčebných agens pro prevenci a/nebo léčbu choroby.

HCV se objevuje v krvi infikovaných jedinců ve velmi nízkém stupni ve srovnání s jinými infekčními viry, což činí virus velmi obtížně detekovatelným. Nízké virové zatížení je pravděpodobně prvotním důvodem, že kauzální agens NANB hepatitid nebylo tak dlouho detekováno. I když byl nyní klonován, je stále obtížné HCV kultivovat a pomnožovat. V souladu stím je zde silná potřeba rekombinantních prostředků pro produkci diagnostických, terapeutických a profylaktických HCV proteinů.

Navíc je velká potřeba HCV vakcíny. Je nicméně obtížné kultivovat HCV v buněčných liniích. Není tak možné produkovat atenuované virové kmeny sériovou pasáží ve tkáňové/buněčné kultuře.

Podstata vynálezu

Podstatou tohoto vynálezu je hepatitis C virový, neboli HCV, zkrácený asialoglykoprotein vybraný ze skupiny zahrnující asialoglykoprotein exprimovaný z El oblasti HCV, která zahrnuje deleci části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 330 až 380 El oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů a asialoglykoprotein exprimovaný z E2 oblasti HCV, která zahrnuje deleci části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 660 až 830 E2 oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů.

-1 CZ 289923 B6

Výhodným provedením tohoto vynálezu je asialoglykoprotein, kde uvedený zkrácený asialoglykoprotein je exprimován z El oblasti HCV a obsahuje deleci v části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 330 až 380 El oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinu.

Podle jiného ztělesnění je výhodným provedením tohoto vynálezu asialoglykoprotein, kde uvedený zkrácený asialoglykoprotein je exprimován z E2 oblasti HCV a obsahuje deleci v části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 660 až 830 E2 oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinu.

Podstatou tohoto vynálezu je také farmaceutická kompozice, která obsahuje hepatitis C virový, neboli HCV, asialoglykoprotein popsaný výše a farmaceuticky přijatelný excipient.

Podstatou tohoto vynálezu je konečné použití hepatitis C virového asialoglykoproteinu vymezeného výše pro imunodiagnostickou metodu pro detekci protilátek proti HCV.

Dále se popisuje předmětný vynález detailně a v širších souvislostech.

Bylo zjištěno, že dva HCV proteiny, El a E2, se jeví být s membránou asociovanými asialoglykoproteiny, jsou-li exprimovány v rekombinantních systémech. Toto je překvapující, protože asialoglykoproteiny obvykle nezůstávají v manózou zakončené formě u savců, ale jsou modifikovány cukry. Manózou zakončená forma je obvykle pouze přechodná. V případě El a E2 (jak byly exprimovány v předmětném systému) se jeví být asialoglykoprotein konečnou formou. El (obalový protein 1) je asialoglykoprotein, mající molekulovou hmotnost 35 000, který je přepisován z dané oblasti HCV genomu. E2 (obalový protein 2) je asialoglykoprotein, mající molekulovou hmotnost okolo 72 000, který je přepisován zdané NS1 (nestruktumí protein 1) oblasti HCV genomu, na základě flavivirového modelu HCV. Protože virové asialoglykoproteiny jsou často vysoce imunogenické, jsou El a E2 prvními kandidáty při použití v imunodiagnostických a terapeutických/profylaktických vakcínách.

Zjištění, že El a E2 nejsou sialyzovány, je významné. Jednotlivá forma proteinu často určuje, které buňky mohou sloužit jako vhodný hostitel pro rekombinantní expresi. Prokaryota jako E. coli neglykosylují proteiny a jsou obecně nevhodné pro produkci asialoglykoproteinů použitých jako antigen, protože glykosylace je často důležitá pro plnou antigenicitu, solubilitu a stabilitu proteinu. Nižší eukaryota jako kvasinky a houby glykosylují proteiny, ale obecně jsou neschopné přidávat koncový zbytek sialové kyseliny ke komplexu cukru. Tak z kvasinek odvozené proteiny mohou být antigenově odlišné od jejich přirozených (nerekombinantních) protějšků. Exprese v savčích buňkách je preferována pro aplikaci, ve které je důležitá antigenicita produktu, přičemž glykosylace rekombinantních proteinů by se měla velice podobat té, která je u přirozených virových proteinů.

Nové informace ukazují, že HCV virus může proniknout do hostitelských buněk během infekce díky buď asialoglykoproteinovému receptoru nacházenému na hepatocytech, nebo manózovému receptoru nacházenému na hepatických endoteliálních buňkách a makrofázích (zejména Kupfferových buňkách). Překvapivě bylo shledáno, že většina přirozených El a E2 neobsahuje terminální zbytek kyseliny sialové, ale je pouze glykosylována na jádru. Malá frakce navíc obsahuje koncový N-acetylglukosamin.

Jak je uvedeno svrchu, předmětem předkládaného vynálezu je hepatitis C virový, zkrácený asialoglykoprotein, který postrádá všechny nebo podstatné koncové zbytky kyseliny sialové.

Vynález nachází použití při vyvolání imunitní odpovědi u živočicha, zahrnující stupně poskytnutí kompozice, obsahující účinné množství uvedeného HCV asialoglykoproteinu ve farmaceuticky přijatelném vehikulu a podání uvedené kompozice tomuto živočichovi.

-2CZ 289923 B6

Aspektem vynálezu je metoda detekce protilátky proti hepatitis C viru (HCV) (anti-HCV protilátka), zahrnující stupně poskytnutí výše definované kompozice, inkubace biologického vzorku s touto kompozicí za podmínek, které umožňují tvorbu komplexu protilátka-antigen a stanovení, zda se vytvořil komplex protilátka-antigen, obsahující uvedený asialoglykoprotein.

Provedení vynálezu

A. Definice

Výraz „asialoglygoprotein“ označuje glykosylovaný protein, který je prost sloučeniny kyseliny sialové. Asialoglykoprotein může být připraven rekombinantně nebo purifikací z buněčné kultury nebo z přirozeného zdroje. V současnosti preferované asialoglykoproteiny jsou odvozené od HCV, výhodně jde o asialoglykoproteiny El a E2, nejvýhodněji rekombinantní El a E2 (rEl a rE2). Protein „v podstatě prostý“ sialové kyseliny se dosáhne v mezích možností této definice, jestliže množství zbytku sialové kyseliny významně neinterferuje s vazbou asialoglykoproteinu na manózu vážící proteiny jako je GNA. Tento stupeň sialilace bude obvykle dosažen tam, kde je méně než 40 % celkově N-vázaných cukrů na sialové kyselině, výhodněji méně než 30 %, ještě výhodněji méně než 20 %, zvláště výhodně méně než 10 %, obzvláště výhodně méně než 5 % a nejvýhodněji méně než 2 %.

Výraz „El“, jak je zde používán, označuje protein nebo polypeptid exprimovaný v rozmezí prvních 400 aminokyselin HCV polyproteinu, označovaného jako E nebo S protein. Ve své přirozené formě jde o asialoglykoprotein s molekulovou hmotností 35 000, který je silně asociován s membránou. Ve většině HCV kmenů je El protein kódován ve virovém proteinu, následujíc C (jádrový) protein. El protein se rozkládá od asi aminokyseliny 192 k asi aminokyselině 383 celkové délky polyproteinu. Výraz „El“, jak je zde použit, také zahrnuje analoga a upravené mutanty, které jsou imunologicky křížově reaktivní s přirozeným El.

Výraz „E2“, jak je zde použit, označuje protein nebo polypeptid exprimovaný v rozmezí prvních 900 aminokyselin HCV polyproteinu, někdy označovaného jako NS1 protein. Ve své přirozené formě je to glykoprotein o molekulové hmotnosti 72 000, který je silně asociován s membránou. Ve většině přirozených kmenů E2 protein následuje El protein. E2 protein se rozkládá přibližně od aminokyseliny 384 k aminokyselině 820. Výraz „E2“, jak je zde použit, označuje také analogy a opracované mutanty, které jsou imunologicky zkříženě reaktivní s přirozeným E2.

Výraz „purifikovaný“, jak je zde použit, označuje kompozici, kde požadovaný protein tvoří alespoň 35 % celkové proteinové komponenty v kompozici. Požadovaný protein účelně tvoří alespoň 40 %, lépe alespoň 50 %, ještě lépe alespoň 60 % a výhodně 70 %, výhodněji 80 %, ještě výhodněji 90 % a nejvýhodněji alespoň 95 % celkové proteinové komponenty.

Kompozice může obsahovat jiné sloučeniny jako cukry, soli, lipidy, rozpouštědla a tak podobně, bez ohrožení výše uvedené čistoty. „Izolovaným“ HCV glykoproteinem je míněna HCV asialoglykoproteinová kompozice, která má čistotu alespoň 35 %.

„Manózu vázající protein“ znamená lektin nebo jiný protein, který specificky váže proteiny, mající manózou zakončenou glykosylaci (to je asialoglykoprotein), například manózu vázající lektiny, protilátky specifické pro manózou zakončené glykosylace, receptorový protein pro manózu (R. A. B. Ezekowitz a spol, J. Exp. Med. 176,1785 až 1794 (1990)), receptorový protein pro asialoglykoprotein (H. Kuráte a spol., J. Biol. Chem. 265, 11295 až 11298 (1990)), sérový manózu vázající protein (I. Schuffencecker a spol., Cytogenet. Gell Genet 56. 99 až 102 (1991)), K. Sastry a spol., J. Immunol. 147. 692 až 697 (1991)), sériový asialoglykoprotein vázající protein a podobně. Manózu vázající lektiny zahrnují například GNA, conkavalin (ConA) a další lektiny s podobnými vazebnými vlastnostmi.

-3CZ 289923 B6

Výraz „GNA lektin“ označuje aglutinin Galanthus nivalus, komerčně dostupný lektin, který váže manózou zakončené glykoproteiny.

„Rekombinantní“ glykoprotein, jak je zde označen, je glykoprotein exprimovaný zrekombinantního polynukleotidu, ve kterém strukturální gen kódující glykoprotein je exprimován pod kontrolou regulačních sekvencí, nikoli přirozeně připojených ke strukturálnímu genu, nebo kde strukturální gen je modifikován. Například se může získat vektor, ve kterém je strukturální gen El umístěn pod kontrolou funkčních fragmentů promotoru kvasinkové glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH). Současně preferovaným promotorem pro použití ve kvasinkách je hybridní ADH2 (GAP promotor popsaný US patentem 4 880 734, který využívá fragmentu GAPDH promotoru v kombinaci s protisměrnou aktivační sekvencí odvozenou od alkohol dehydrogenázy 2). Modifikace strukturálního genu může zahrnout substituci různých kodonů a degenerací kodonů (to je utilizovat hostitelem preferované kodony, eliminovat nebo generovat místo štěpení restrikčními enzymy, kontrolovat vlásenkové formace atd.) a substituci, inzerci nebo deleci limitovaného množství kodonů, kódujících odlišné aminokyseliny (výhodně ne více než 10%, výhodněji méně než 5% z přirozených aminokyselinových sekvencí by mělo být změněno) a tak podobně. Podobně „rekombinantním“ receptorem označujeme receptorový protein exprimovaný z rekombinantního polynukleotidu, ve kterém strukturální gen, kódující receptorový protein, je exprimován pod kontrolou regulační sekvence nepřirozeně připojené ke strukturálnímu genu, nebo ve kterém je strukturální gen modifikován.

Termín „izolovaný polypeptid“ označuje polypeptid, který je v podstatě prostý jiných HCV virových komponent, zejména polynukleotidů. Polypeptidová kompozice je „v podstatě prostá“ jiných komponent, jestliže hmotnost polypeptidu v kompozici je alespoň 70 % hmotnosti polypeptidu a dalších komponent, výhodněji alespoň asi 80 %, ještě výhodněji asi 90 % a nejvýhodněji 95 % nebo více. Například kompozice, obsahující 100 pg/ml El a pouze 3 pg/ml jiných HCV komponent (to je DNA, lipidů atd.) je v podstatě prostá .jiných virových komponent“ a tak je kompozice izolovaného peptidu v mezích rozsahu této definice.

Termín „sekreční leader“ označuje polypeptid, který kóduje N-konec proteinu a způsobuje, že protein je po translaci secemován do kultivačního média hostitelských buněk. Sekreční leader bude obecně odvozen od použité hostitelské buňky. Například vhodný sekreční leader pro užití ve kvasinkách je Saccharomyces cerevisiae α-faktor leader (viz US patent 4 870 008).

Výraz „nižší eukaryota“ označuje hostitelské buňky jako jsou kvasinky, houby a podobně. Nižší eukaryota jsou obyčejně (ale ne nezbytně) jednobuněčná. Preferovanými nižšími eukaryoty jsou kvasinky, zejména druhy Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Mansenula a podobně. Nejběžněji používanými kvasinkovými hostiteli jsou Saccharomyces cerevisiae, S.carlsbergensis a K.lactis a jsou to běžně užívané hostitelské buňky.

Termín „vyšší eukaryota“ označuje hostitelské buňky odvozené z vyšších živočichů jako jsou savci, plazi, hmyz a podobně. Současně preferovanými vyššími eukaryotickými hostitelskými buňkami jsou ty, které jsou odvozeny od čínského křečka (to jsou CHO), opice (to jsou COS buňky), lidské a hmyzí (to jsou Spodoptera frugiperda). Hostitelské buňky mohou být poskytnuty v suspenzi nebo ve zkumavkové kultuře, tkáňových kulturách, orgánových kulturách a podobně.

Výraz „kalciový modulátor“ označuje sloučeninu schopnou sekvestrace nebo vazby kalciových iontů uvnitř endoplazmatického retikula, nebo ovlivňovat koncentraci kalciových iontů uvnitř ER svým působením na kalciové regulační proteiny (to jsou proteiny kalciového kanálu, kalciové pumpy atd.). Vhodné kalciové modulátory obsahují například thapsigargin, EGTA (ethylenglykol-bis/p-aminoethylether/,N,N,N'-tetraoctová kyselina). Preferovaným modulátorem je thapsigargin (viz např. O. Thastrup a spol., Proc.Nat.Acad.Sci. USA (1990) 87:2466-70).

-4CZ 289923 B6

Termín „imunogenický“ označuje schopnost substance způsobovat humorální a/nebo buněčnou imunitní odpověď, je-li sama navázána na nosič, za přítomnosti nebo nepřítomnosti přísad. „Neutralizace“ označuje imunitní odpověď, která blokuje infekčnost buď částečně, nebo úplně, infekčního agens. „Vakcína“ je imunogenická kompozice, vhodná pro léčbu individua.

Výraz „biologická tekutina“ označuje tekutinu získanou z organismu jako je sérum, plazma, sliny, žaludeční sekret, hlen apod. Obecně je biologická tekutina screenována na přítomnost HCV částic. Některé biologické tekutiny jsou užity jako zdroj jiných produktů, jako jsou srážecí faktory (to je faktor VIII:C), sérový albumin, růstový hormon apod. V takových případech je důležité, že zdroj biologické tekutiny je prost kontaminace virem jako je HCV.)

B. Obecná metoda

El oblast HCV genomu je popsána v EP 388 323 jako oblast „E“, zatímco E2 je popsána jako „NS1“. El oblast zahrnuje přibližně aminokyseliny 192 až 383 ve virovém polyproteinu plné délky. E2 oblast zahrnuje přibližně oblast aminokyselin 383 až 820. Kompletní sekvence prototypů těchto proteinů (HCV-1 kmen) jsou v oboru dosažitelné (viz EP 388 232) a jsou obecnými metodami pro klonování a expresi proteinů. Jak El, tak E2 mohou být exprimovány z polynukleotidu, kódujícího prvních 850 až 900 aminokyselin HCV polyproteinu: posttranslační zpracování ve většině eukaryotických buněk štěpí počáteční polyprotein na C, El a E2. Je možno upravit 5'^vkonec kódující oblasti pro snížení množství produkovaného proteinu.

Exprese asialoglykoproteinů může být dosaženo mnoha metodami. Například je možno dosáhnout exprese v nižších eukaryotách (jako jsou kvasinky), které přirozeně nepřidávají zbytky kyseliny sialové ke glykosylovaným proteinům. V kvasinkovém expresním systému se nyní preferuje využití sekrečního leadera jako je S. cerevisiae α-faktor leader, takže protein je exprimován po translaci do kultivačního média. Je také v současnosti preferováno využívání glykosylace postrádajících mutant jako je pmrl, protože tyto mutanty poskytují pouze jádrovou glykosylaci a často secemují heterologní proteiny s vysokou výtěžností (Η. K. Rudolph a spol., Cell 58, 133 až 145 (1989)). Alternativně je možno využít jiné druhy kvasinek jako je Pichia pastoris, která exprimuje glykoproteiny, obsahující 8 až 9 manózových zbytků ve formě, o které se soudí, že se podobá jádrové glykosylaci formy pozorované u savců a S. cerevisiae. Alternativně je možné uskutečnit expresi v savčích bufikách a blokovat terminální glykosilaci (předání sialové kyseliny). „Rekombinantní“ konstrukty budou výhodně zahrnovat expresní signál k zajištění toho, že protein je směrován do endoplazmatického retikula. Transport do Golgiho aparátu se jeví být blokován El a E2 samotnými: vysoká hladina exprese El nebo E2 v savčích buňkách se zdá být ukončující sekrecí všech celulámích proteinů v endoplazmatickém retikulu nebo cis Golgiho aparátu. Je navíc možno využít glykosylace defektních mutantů. Viz například P. Stanley, Ann.Rev.Genet (1984) 18:525-52. V případě glykosylace nebo transportního mutanta exprimujícího El nebo E2 se sialyzací, mohou být terminální zbytky kyseliny sialové odděleny působením neuraminidázy.

Výtěžek může být dále zvyšován působením kalciového modulátoru k získání uvolnění proteinu zvnitřku endoplazmatického retikula. Ke vhodným modulátorům patří thapsigargin, EGTA a A23817 (viz např. O. Thastrup a spol., Proc.Nat.Acad.Sci.USA (1990) 87:2466-70). Je například možno exprimovat velké množství El a E2 intracelulámě v savčích buňkách (to jsou CHO, COS, HeLa buňkách a podobně) transfekcí rekombinantním vektorem viru vakcinie. Po poskytnutí času pro expresi proteinů a akumulaci v endoplazmatickém retikulu jsou buňky vystaveny působení kalciového modulátoru v koncentraci vysoce dostačující k tomu, aby způsobil uvolnění obsahu ER. Protein je získán zpět z kultivačního média, odkud je vzat do dalšího cyklu.

Navíc může být výhodné exprimovat upravenou formu obalového proteinu. Jak El tak E2 receptor se jeví mít silně hydrofobní doménu, která výrazně kotví protein v endoplazmatickém retikulu a zabraňuje účinnému uvolnění. Tak si je možno přát deleci oblasti sekvence nalezené vjedné nebo více oblastech aminokyselin 170-190, 260-290 nebo 330-380. El (počítáno od

-5CZ 289923 B6 začátku polyproteinu) a aminokyselin 660-830 E2 (viz například obr. 20-1 EP 388 233). Je pravděpodobné, že alespoň jedna z těchto hydrofobních domén formuje transmembránovou oblast, která není nezbytná pro antigenicitu proteinu a která tak může být deletována bez nežádoucího účinku. Nejlepší oblast pro deleci může být určena provedením malého množství delečních experimentů zkušeným odborníkem. Delece hydrofobního 3' konce v E2 vede k sekreci exprimované části E2 se sializací secemovaného proteinu.

Je možno použít jakoukoliv variantu vektorů k získání sekrece. Nižší eukaryota, jako jsou kvasinky, jsou typicky transformovány za použití metody srážení fosforečnanem vápenatým nebo transfekcí rekombinantním virem. Vektory se mohou replikovat v hostitelské buňce nezávisle, nebo se mohou integrovat do genomu hostitelské buňky. Vyšší eukaryota mohou být transformována plazmidy, ale jsou obvykle infikována rekombinantním virem, například rekombinantním virem vakcinie. Vakcinia je zejména preferována, protože infekce vakcinií zastavuje expresi proteinů hostitelské buňky. Nyní jsou preferovanými hostitelskými buňkami HeLa a plazmacytomová buněčná linie. V přítomném systému to znamená, že El a E2 se akumulují jako většinový glykosylovaný typ v ER hostitele. Protože rEl a rE2 budou převažující glykoproteiny, které jsou terminované manózou, mohou být snadno purifikovány z buněk užitím lektinů, jako je aglutinin Galanthus nivalus (GNA), který váže terminační manózové zbytky.

Proteiny, které jsou přirozeně exprimovány jako manózou terminované glykoproteiny, jsou relativně vzácné v savčí fyziologii. Ve většině případů je savčí glykoprotein manózou terminovaný pouze jako přechodný intermediát v metabolické cestě glykosylace. Skutečnost, že HCV proteiny, exprimované rekombinantně, obsahují manózou terminovanou glykosylaci nebo (v menším stupni) N-acetyl-glukosamin znamená, že HCV proteiny a všechny viriony mohou být separovány a částečně purifikovány z endogenních proteinů použitím lektinů specifických pro terminální manózu nebo N-acetyl-glukosamin. Rekombinantní proteiny se jeví být autentickými a zdají se být v podstatě identické s obalovými proteiny nalezenými ve zralém, volném virionu nebo k vytvořeným s buňkou asociovaným obalovým proteinům. Je tak možno použít lektinů jako je GNA pro manózou zakončené proteiny a WGA (zárodečný aglutinin pšenice) a jeho ekvivalenty pro N-acetyl-glukosamin zakončené proteiny. Mohou se využít lektiny, využívající pevnou fázi (to je lektin-Sepharose® kolonu) k separaci El a E2 ze supematantu buněčné kultury a jiných tekutin, to je pro purifikaci během produkce antigenů pro vakcínu nebo pro použití v imunozkoušce.

Alternativně je možno poskytnout vhodný lektin k izolaci El, E2 nebo HCV virionů z roztoku nebo tkáňových vzorků ze subjektu, o němž se předpokládá, že je infikován HCV. Protože manózou zakončené glykoproteiny jsou relativně vzácné, může takový postup sloužit k čištění proteinů přítomných ve vzorku, významně redukujícím pozadí. Po vazbě na lektin může být HCV protein detegován použitím anti-HCV protilátek. Jestliže je přítomný celý virion, je možno alternativně detekovat HCV nukleové kyseliny použitím PCR technik nebo jiné metody amplifikace nukleové kyseliny, směřující k zachování oblasti HCV genomu (například 5' nekódující oblast). Tato metoda dovoluje izolaci a charakterizaci odlišných kmenů HCV s ohledem na antigenní drift nebo variaci, tj. v případech, kde nové kmeny nejsou zkříženě imunologicky reaktivní s kmeny použitými pro přípravu protilátek. Je zde mnoho dalších cest využití výhodnosti unikátního rozpoznání manózou zakončených glykoproteinů jednotlivými lektiny. Například je možno inkubovat vzorky, o kterých se předpokládá, že jsou kontaminované HCV viriony nebo proteiny s biotinem nebo avidinem značenými lektiny a srážet protein-lektinový komplex použitím avidinu nebo biotinu. Je možno také použít afinitu lektinů k HCV proteinům k zaměření sloučenin na virion za terapeutickým účelem, například konjugací antivirové sloučeniny s GNA. Alternativně je možno použít vhodné lektiny k vyloučení manózou zakončených glykoproteinů ze séra nebo frakce plazmy a tak redukovat nebo eliminovat riziko HCV kontaminace.

-6CZ 289923 B6

Nyní je preferováno izolovat El a/nebo E2 asialoglykoproteiny ze surového buněčného lyzátu inkubací s imobilizovaným manózu vázajícím proteinem, zejména lektinem jako je ConA nebo GNA. Buňky jsou lyžovány, to je například mechanickou disrupcí v hypotonickém pufru následovanou odstředěním pro přípravu post-nukleámího lyzátu a dalším odstředěním pro získání surové frakce mikrosomální membrány. Surová membránová frakce je následně solubilizována v pufru, obsahujícím povrchově aktivní látky jako je Triton X-100, NP-40 a podobně. Detergentový extrakt je dále vyčištěn od nerozpustných částic odstředěním a výsledný vyčištěný lyzát je inkubován ve chromatografické koloně, obsahující imobilizovanou manózu vázající protein, výhodně GNA vázaný na pevný nosič jako je agaróza nebo Sepharosa® po dobu dostatečnou pro vazbu, typicky 16 až 20 hodin. Suspenze je pak aplikována do kolony až do té doby, dokud se nezačne objevovat v eluentu, pak inkubována v koloně po dobu dostačující pro navázání, obvykle asi 12 až 24 hodin. Vazebný materiál je pak vymýván dalším pufir obsahujícím detergentem (to je například Tritonem® X-100, NP-40 a podobně) a eluován manózou k poskytnutí čištěného asialoglykoproteinu. Při eluci je preferováno eluovat pouze do té doby, než se proteiny objeví v eluátu, v tomto bodě je eluce zastavena a kolona se ekvilibruje 3 až 2 hodiny před elucí proteinů. O tom se předpokládá, že je dostačující čas pro zpomalení stupně očekávaných velkých proteinových agregátů. V případech, kdy El a E2 jsou exprimovány společně v nativní formě (to je bez úpravy membránu vázající domény) se podstatná frakce asialoglykoproteinů jeví jako E1:E2 agregáty. Jsou-li zkoumány elektronovým mikroskopem, jeví se podstatný podíl těchto agregátů jako téměř sférické částice, mající průměr asi 40 nm, což je velikost očekávaná pro intaktní virus. Tyto částice se jeví být samoshromažďujícími se částicemi subvirovými. U těchto agregátů se očekává, že budou vykazovat kvartémí strukturu velmi podobnou struktuře autentických HCV virionových částic a tak se předpokládá jejich využití jako vysoce imunogenické vakcíny.

E1/E2 komplexy mohou být dále purifikovány gelovou chromatografíí v základním médiu, například Fractogel-DEAE nebo DEAE-Sepharose®. Použitím fractogelové-DEAE gelové chromatografie je možno získat E1/E2 komplexy přibližně 60 až 80 % čistoty. Je možno dále purifikovat El působením lysin proteázy, protože El má O až 1 lysinový zbytek. Působení lysin proteásy na komplex se ničí E2 a umožňuje se tak snadná separace El.

Tkáňová specifíta HCV v kombinaci s pozorováním, že HCV obalové glykoproteiny jsou manózou zakončené, napovídá, že virus využívá manéžový receptor nebo asialoglykoproteinový receptor (ASGR), aby vstoupil do hostitelské buňky. Manózový receptor se nachází na makrofágách a buňkách hepatálních sinusů, zatímco ASGR se nachází na parenchymálních hepatocytech. Je tak možné kultivovat HCV využitím hostitelských buněk, které exprimují jeden nebo oba tyto receptory. Je možno využití buď primární buněčné kultury, které přirozeně exprimují receptor, za použití podmínek, při kterých je receptor udržován, nebo může být transfektována jiná buněčná linie jako je HeLa, CHO, COS a podobně, vektorem, poskytujícím expresi receptoru. Klonování manéžového receptoru a jeho transfekce a exprese ve fibroblastech byla demonstrována Μ. E. Taylorem a spol., J.Biol.Chem (1990) 265:12156-62. Klonování a sekvenování ASGR bylo popsáno K. Drichamerem a spol., J.Biol.Chem (1984) 259:770-78 a M. Spiessem a spol, Proc.Nat.Acad.Sci.USA (1985) 82:6465-69, transfekce a exprese funkčního ASGR v krysích HTC buňkách byla popsána M. McPhaulem a P. Bergem, Proc.Nat.Acad.Sci.USA (1986) 83:8863-67 a M. McPhaulem a P. Bergem, Mol.Cell.Biol. (1987) 7:1841-47. Je tak možno transfektovat jeden nebo oba receptory do vhodných buněčných linií a použít výsledných buněk jako hostitelů pro propagaci HCV v kultuře. Sériová pasáž HCV v takové kultuře by měla přinést vývoj atenuovaných kmenů vhodných pro užití jako živé vakcíny. Je možno využít buď primární buněčné kultuiy, které přirozeně exprimují receptor za použití podmínek, ve kterých je receptor zachován, neboje možno transfektovat jinou buněčnou linii jako HeLa, CHO, COS a podobně, vektorem, poskytujícím expresi receptoru. Klonování manéžového receptoru a jeho transfekce a exprese ve fibroblastech byla demonstrována Taylorem a spol., supra, zatímco transfekce a exprese funkčního ASGR v krysích HTC buňkách byla popsána McPhaulem a spol., supra. Nyní je preferováno použití imortalizovaných buněčných linií transfektovaných jedním nebo oběma rekombinantními receptory.

Imunogenické kompozice mohou být připraveny podle metod známých v oboru. Předkládané kompozice obsahují imunogenické množství polypeptidu, např. El, E2 a/nebo E1/E2 částicových kompozic a/nebo zkráceného glykoproteinu vybraného ze skupiny, zahrnující glykoprotein exprimovaný z El oblasti HCV, která zahrnuje deleci části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 330-380 El oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů a glykoprotein exprimovaný zE2 oblasti, která zahrnuje deleci části sekvence nacházející se v oblasti aminokyselin 660-830 E2 oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů, obvykle kombinované s farmaceuticky přijatelným nosičem, výhodně obsahujícím přísadu. Je-li žádoucí „kokteil“, může být kombinace HCV polypeptidů, jako například El plus E2 antigenů, smísena spolu pro zvýšení účinnosti. Viru podobné částice E1/E2 agregátů jsou uvažovány jako poskytující zvláště vhodný vakcinový antigen. Imunogenické kompozice mohou být podávány živočichům pro indukci produkce protilátek, buď poskytnutím zdroje protilátek, nebo indukcí protektivní imunity u živočicha.

Farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují jakýkoliv nosič, který sám neindukuje produkci protilátek, škodících individuálnímu podání kompozice. Vhodné nosiče jsou typicky velké, pomalu metabolizující molekuly jako proteiny, polysacharidy, polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymemí aminokyseliny, aminokyselinové kopolymery a inaktivní virové částice. Takové nosiče jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Výhodné přísady pro zvýšení účinnosti kompozice zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, hydroxid hlinitý (alum), N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP) jak je uvedeno v US patentu 4 606 918, N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-L-alanin-2-(l',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosf oryloxy)-ethanamin) (MTP-PE) a RB1, který obsahuje tři složky extrahované z bakterie, monofosforyl lipid A, trehalose dimycolát a skelet buněčné stěny (MPL+TDM+CWS) ve 2% emulzi squalen/Tween® 80. Dále mohou být použity přísady jako Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA). Pro nehumánní aplikace a výzkumné účely může být použito kompletní Freudovo adjuvans (CFA) a nekompletní Freudovo adjuvans (IFA).

Imunogenické kompozice budou typicky obsahovat farmaceuticky přijatelná vehikula jako je voda, fyziologický roztok, glycerol, ethanol atd. Dále mohou být v takových vehikulech zahrnuty pomocné substance jako jsou smáčecí nebo emulgační činidla, pH pufrující substance a podobně.

Typicky se imunogenické kompozice připraví jako injekce, buď jako kapalné roztoky, nebo suspenze; mohou být také připraveny pevné formy vhodné pro rozpuštění nebo suspenzi v kapalném vehikulu před injekcí. Přípravek může být také emulgován nebo enkapsulován v liposomech pro zvýšení přídavného účinku.

Imunogenické kompozice používané jako vakcíny zahrnují imunologicky účinné množství HCV polypeptidu podle vynálezu, jakož jakékoliv další výše uvedené komponenty podle potřeby. „Imunologicky účinné množství“ znamená, že podání takového množství jednotlivci, buď v jednotné dávce, nebo jako část série, je účinné pro léčení, jak bylo definováno dříve. Toto množství se mění v závislosti na zdravotním a fyzickém stavu jednotlivce, který je léčen, taxonomické skupině jednotlivce, který je léčen (například nehumánní primáti, primáti atd.), kapacitě individuálního imunitního systému syntetizovat protilátky, stupni požadované ochrany, formulaci vakcíny, zhodnocení medicinální situace lékařem, kmenu infektujícím HCV a dalších relevantních faktorech. Předpokládá se, že množství bude ležet v širokém rozmezí, které může být stanoveno rutinními pokusy.

-8CZ 289923 B6

E1/E2 samoshromažďující se agregáty mohou také sloužit jako vakcínové nosiče pro přítomné geterologní (non-HCV) hapteny, stejně jako hepatitis B povrchový antigen (viz evropská patentová přihláška 174 444). V tomto použití E1/E2 agregáty poskytují imunogenický nosič schopný stimulace imunitní odpovědi k haptenům nebo antigenům konjugovaným do agregátů. Antigen může být konjugován buď obvyklými chemickými metodami, nebo může být klonován do genu, kódujícího El a/nebo E2 v umístění, odpovídajícím hydrofílní oblasti proteinu.

Imunogenické kompozice jsou obvykle podávány parenterálně, typicky injekcí, například subkutánně nebo intramuskulámě. Další přípravky vhodné pro jiný způsob podání zahrnují orální přípravky a čípky. Dávkové ošetření může být jednotlivá dávka nebo násobné dávky. Vakcína může být podávána ve spojení s dalšími imunoregulačními činidly.

Příklady provedení vynálezu

Dále uváděné příklady představují praktické provedení pro odborníky v oboru a nejsou v žádném případě pro předložený vynález omezující.

Příklad 1 (Klonování a exprese) (A) Vektory byly konstruovány zplazmidů, obsahujících 5' část HCV genomu, jak je popsáno v EP 318 216 a EP 388 232. Kazeta HCV (S/B) obsahuje StuI-BglIII DNA fragment, kódující 5' zakončení polyproteinu od Meti do Leugoe, začínající u nukleotidu -63 vzhledem kMetj. Zahrnuje jádrový protein (C), El protein (někdy také označovaný jako S), E2 protein (označovaný také jako NS1) a 5' část NS2a oblasti. Po expresi konstruktu se jednotlivé C, El a E2 proteiny produkují proteolytickým zpracováním.

Kazeta HCV (A/B) obsahuje ApsLI-BglII DNA fragment, kódující 5' konec polyproteinu od Meti až do Leu₉o6, začínající u nukleotidu -6 vzhledem k Meti. Zahrnuje jádrový protein (C), El protein (někdy také označovaný jako NS1) a 5' část NS2a oblasti. Po expresi konstruktu se jednotlivé C, El a E2 proteiny produkují proteolytickým zpracováním.

Kazeta C-El (S/B) (StuI-BamHI část) obsahuje 5' konec od Met] až do Ile₃4o (BamHI místo v genu). Exprese této kazety vede k expresi C a určitého zkráceného El (El'). Část zkrácená od 3' konce je hydrofobní oblast, o které se předpokládá, že slouží jako translokační signál.

Kazeta NSI (B/ (BamHI-BglII část) obsahuje malou 3' část od El (od Met₃₆₄), celý E2 a část NS2a (do Leugoó)- V tomto konstruktu slouží El fragment jako translokační signál.

Kazeta TPA-NS1 využívá leader aktivátoru lidského tkáňového plazminogenu (tPA) jako translokační signál místo 3' části El. Kazeta obsahuje zkrácenou formu E2 od Gly4oe do G1U661, ve které je hydrofobní 3' konec vypuštěn.

Každá kazeta byla inzertována do vektoru pGME3Z /Promega) s a bez syntetický β-globin, 5' nekódující sekvence pro transkripci a translaci za použití T7 a expresi in vitro v králičím retikulocytu. Rekombinantní vektory viru vaccinia (rW) byly připraveny vsunutím kazet do plazmidu pSCl 1 (získaný od Dr. B. Mosse, NIH) a následující rekombinací s vaccinia virem, jak popsal Charkrabarty a spol., Mol. Cell. Biol. 5, 3404 až 3409 (1985).

-9CZ 289923 B6 (B) Pozměněný expresní vektor byl zkonstruován inzertem HCV (A/B) mezi Stul a Spěl místa pSCS9 (získaný od Dr. B. Mosse, NIH) a následující rekombinací s vaccinia virem, jak popsal Charkrabarty a spol., Mol. Cell. Biol. 5, 3403 až 3409 (1985).

(C) HeLa S3 buňky byly shromážděny odstřeďováním po dobu 7 minut při frekvenci otáček

2000 min'¹ při teplotě místnosti ve sterilních 500 ml odstřeďovacích nádobách (JA-10 rotor). Pelety byly resuspendovány na konečnou koncentraci 2x10⁷ buněk/ml v dalším kultivačním médiu (Joklik modifikované MEM Spinner médium + 5 % koňského séra a gentamycin) („spinner-medium“). Ultrazvukem zpracovaný surový w/scs9-HCV zásobní virus byl přidán to v násobku infekce 8 pfu/buňka a směs byla míchána při teplotě 37 °C 30 minut. Infektované buňky byly pak přeneseny do nádoby obsahující 8 litrů spiner-média a inkubovány 3 dny při 37 °C.

Kultivované buňky pak byly shromážděny odstředěním a pelety byly resuspendovány v pufru 15 (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 152 ml). Buňky byly pak homogenizovány za použití 40 ml Dounce homogenizátoru (50 rázů) a jádra peletována odstředěním (5 min., frekvence otáček 1 600 min¹, 4 °C, JA-20 rotor). Jádrové pelety byly resuspendovány ve Tris pufru (24 ml), rehomogenizovány a opět peletovány při poolování všech supematantů.

Poolovaný lyzát byl rozdělen na ÍOml podíly a zpracován ultrazvukem 3x30 minut v sonifikátoru při střední síle. Sonifikovaný lyzát (15 ml) byl navrstven na 17ml sacharózové polštářky (36 %) v SW28 odstřeďovacích zkumavkách a odstřeďován při frekvenci otáček 13 500 min’¹ po 80 min při 4 °C pro peletování viru. Peleta viru byla resuspendována v 1 ml Tris pufru (1 mM Tris HC1, pH 9,0) a zmražena při -80 °C.

Příklad 2 (Porovnání produktů in vitro a in vivo) (A) E2 a E2 byly exprimovány oba in vitro a in vivo a ³⁵S-Met značeny za použití vektorů popsaných v příkladu 1 výše. BSC-40 a HeLa buňky byly infektovány rW vektory pro in vivo expresi. Médium a buněčné lyzáty byly zkoušeny na rekombinantní proteiny. Produkty byly imunoprecipitovány za použití lidského HCV imunitního séra, zatímco in vitro proteiny byly analyzovány přímo. Výsledné proteiny byly analyzovány SDS-PAGE.

Retikulocytový expresní systém (pGEM3Z s HCV(S/B) nebo HCV(A/B)) produkuje C, El a E2 proteiny, mající molekulové hmotnosti přibližně 18 000, 35 000 a 72 000. Lyzáty z BSC-40 a HeLa buněk transfektovaných rW, obsahujícím HCV(S/B), HCV(A/B) nebo C-E1(S/B) 40 vykazují stejné proteiny. Protože retikulocytový systém neposkytuje účinné golgi zpracování, a proto neposkytuje sialovou kyselinu, skutečnost, že oba in vitro a in vivo produkty vykazují identické pohyblivosti, potvrzuje, že proteiny nejsou in vivo sialylovány. Pouze rW vektor, obsahující TPA-NS1 vede vjakékoliv extracelulámí sekreci E2, která vykazuje změněnou pohyblivost spojenou se sialylací.

(B) HCV(S/B) byl exprimován in vitro a inkubován s panelem biotinylovaných lektinů: GNA, SNA, PNA, WGA a ConA. Po inkubaci byly komplexy shromážděny na avidin-akiylových kuličkách, promyty, eluovány Laemli-vzorkovým pufrem a analyzovány SDS-PAGE. Výsledky ukazují, že El a E2 se váže ke GNA a ConA, což indikuje přítomnost manózy. GNA se váže kterminálním manózovým skupinám, zatímco ConA se váže k jakékoliv α-napojené manóze.

Nepřítomnost vazby ke SNA, PNA a WGA indikuje, že žádný z proteinů neobsahuje sialovou kyselinu, galaktosa-N-acetylgalaktosamin nebo N-acetylglukosamin.

-10CZ 289923 B6 (C) Radioaktivně značený El a E2 byly produkovány v BSC-40 buňkách infekcí rVV, obsahujícím HCV(S/B) (w/SCl 1-HCV) a imunoprecipitovány s lidským HCV⁺ imunním sérem. Polovina imunoprecipitovaného materiálu byla ošetřena přes noc neuraminidázou pro odstranění jakékoliv sialové kyseliny. Po tomto zpracování se ošetřené a neošetřené proteiny analyzují pomocí SDS-PAGE. Nebyl pozorován žádný významný rozdíl v mobilitě, indikující nepřítomnost sialylace in vivo.

(D) Radioaktivně značený El a E2 byly produkovány v BSC-40 buňkách infekcí rW, obsahujícím HCV(A/B) (w/SCS9-HCV) a buď imunoprecipitovány lidským HCV⁺ sérem, nebo precipitovány za použití biotinylovaného GNA lektinu připojeného k akrylovým kuličkám za použití w/SCl 1 prostého HCV sekvence jako kontroly. Precipitáty byly analyzovány SDS-PAGE. Údaje demonstrují, že El a E2 byly hlavními druhy manózou zakončených proteinů ve w/SCS9-HCV infikovaných buňkách. CNA byl účinný jako lidské antisérum ve srážení El a E2 z buněčného kultivačního média. Byla pozorována komponenta o molekulové hmotnosti 25 000, ale jeví se být specifickou k vakcinia-infektovaným buňkám.

Příklad 3 (Purifikace za použití lektinu) (A) HeLa S3 buňky byly inokulovány purifikovaným základním virem o vysokém titru w/SCS9-HCV při násobné infekci 5 pfu/buňku a směs byla míchána při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Infektované buňky byly pak přeneseny do nádoby, obsahující 8 litrů spinner-média a inkubovány 3 dny při 37 °C. Buňky byly opět shromážděny odstředěním a resuspendovány v hypotonickém pufru (20 mM HEPES, 10 mM NaCl, 1 mM MgC12, 120 ml) na ledu. Buňky pak byly homogenizovány Dounce homogenizérem (50 rázů) a jádra peletována odstředěním (5 minut, frekvence otáček 1 600 min’¹, 4 °C, JA-20 rotor). Pelety byly spojeny, resuspendovány ve 48 ml hypotonického pufru, rehomogenizovány, znovu odstředěny, opět spojeny a zmraženy na-80 °C.

Zmražené supematanty pak byly roztaveny a mikrosomální membránové frakce post-jademého lyzátu izolovány odstředěním po dobu 20 minut v JA-20 rotoru při frekvenci otáček 13 500 min’¹ při 4 °C. Supematant byl odstraněn aspirací.

Pelety byly vyňaty do 96 ml detergentového pufru (20 mM Tris-Hcl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DDT, 0,5 % Triton X-100, pH 7,5) a homogenizovány (50 rázů). Produkt byl vyčeřen odstředěním při frekvenci otáček 13 500 min*¹ po dobu 20 minut při teplotě 4°C a supematant byl shromážděn.

GNA-agarózová kolona (1 cm x 3 cm, 3 mg GNA/ml kuliček, 6 ml objem lože, Vector Lebs, Burlingame, CA) byla předem ekvilibrována s detergentovým pufrem. Vzorek supematantu byl aplikován na kolonu s recirkulací při průtokové rychlosti 1 ml/min po 16 až 20 hodin při teplotě 4 °C. Kolona pak byla promyta detergentovým pufrem.

Purifíkované E1/E2 asialoglykoproteiny byly eluovány a-D-mannosidem (0,9 M vdetergentovaném pufru) při průtokové rychlosti 0,5 ml/min. Eluce byla zastavena při výskytu E1/E3 v eluentu a kolona byla ponechána ekvilibrovat po dobu 2 až 3 hodin. Frakce byly analyzovány pomocí Western blot a vybarvené stříbrem. Píkové frakce byly spojeny a ozářeny UV pro inaktivaci jakéhokoliv zbytkového vaccinia viru.

(B) GNA-agarózou purifíkované El a E2 asialoglykoproteiny byly sedimentovány 20 až 60% glycerinovými gradienty. Gradienty byly frakcionovány a proteiny byly analyzovány SDS-PAGE a Westem-blottingem. Bloty byly zkoušeny s GNA na identifikaci El a E2.

-11CZ 289923 B6

Výsledky ukazují přítomnost E1:E2 heterodimeru, který sedimentuje očekávanou rychlostí (tj. poloha charakteristická pro protein o molekulové hmotnosti 110 000). Jsou také přítomny větší agregáty HCV obalových proteinů. E2:E2 homodimery jsou také patrné. E2 se jeví být převládajícím ve větších druzích vzhledem k El, i když také byly detegovány diskrétní E1:E2 druhy. Větší druhy sedimentují výrazně rychleji než thyroglobulinový markér.

(C) GNA-agarózou purifíkovaný El a E2 byly sedimentovány ve 20 až 60% glycerinových gradientech obsahujících 1 mM EDTA. Frakce byly analyzovány SDS-PAGE s a bez β-merkaptoethanolu (βΜΕ). Nebyl pozorován žádný nebo jen malý rozdíl ve zjevném zastoupení El a E2 za přítomnosti nebo βΜΕ, indikující nepřítomnost disulfídových vazeb mezi heterodimery.

(D) E1/E2 komplexy (přibližně 40% čistoty) byly analyzovány na Coulter DM-4-sub-mikronovém částicovém analyzátoru. Materiál v rozmezí 20 až 60 nm byl detekován.

(E) E1/E2 komplexy (přibližně 40 % čistoty) byly analyzovány elektronovou mikroskopií za použití negativního vybarvení fosforwolframovou kyselinou. Elektronový mikrograf odhaluje přítomnost částic, majících sférický zjev a průměr asi 40 nm. E1/E2 komplexy byly inkubovány sHCV⁺ lidským imunním sérem, potom analyzovány EM s negativním vybarvením. Byly pozorovány komplexy protilátky, obsahující velké agregáty a malé částice.

Příklad 4 (Chromatografické čištění) (A) GNA lektinem purifíkovaný materiál připravený v příkladu 3 (0,5 až 0,8 ml) byl zředěn lOx pufřem A (20 mM Tris-Cl pufr, pH 8,0, 1 mM EDTA) a aplikován na 1,8 x 1,5 cm kolonu Fractogelu EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, kat. č. 16883) ekvilibrovanou v pufru A. Proteinová frakce, obsahující E1/E2 byla eluována stejným pufrem při průtoku 0,2ml/min a byly odebírány lml frakce. Frakce, obsahující El a E2 (stanoveno SDS-PAGE) byly spojeny a uloženy při -80 °C.

(B) Materiál purifíkovaný v části (A) výše má čistotu 60 až 80 % hodnoceno pomocí SDS-PAGE. Identifikace domnělých El a E2 pruhů byla potvrzena analýzou N-terminální sekvence za použití transferové techniky. Pro tento účel byl fractogel-DEAE purifíkovaný E1/E2 materiál redukován přídavkem Laemli pufru (pH 6,8, 0,06 M Tris-Cl, 2,3 % SDS, 10% glycerin, 0,72 M β-merkaptoethanol) a vařen 3 minuty. Vzorek pak byl vložen na 10% polyakrylamidový gel. Po SDS-PAGE byl protein přenesen na polyvinylidendifluorid-(PVDF)-ovou 0,2 μηι membránu (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Z blotu byly vyříznuty pruhy domnělých El a E2 proteinů a podrobeny analýze N-terminálních aminokyselin, i když nebyla věnována žádná zvláštní péče ochraně amino-terminální blokace během přípravy materiálu. Prvních 15 cyklů odhaluje, že El vzorek má sekvenci

Tyr-Gln-V al-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-V al-X-Asn-Asp, zatímco sekvence E2 je

Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-Gly-Phe. Tyto údaje o aminokyselinových sekvencích jsou v souladu s údaji předpokládanými z odpovídajících DNA sekvencí.

E1/E2 produkt purifíkovaný výše fractogel-DEAE chromatografíí je považován za agregovaný, jak je zřejmé ze skutečnosti, že velké množství El a E2 koeluuje v oblasti prázdného objemu kolony pro gelovou chromatografíi Bio-Sil TSK-400 SW. Toto ukazuje, že za nativních podmínek má významné množství E1/E2 komplexu molekulovou hmotnost nejméně 800 000. E1/E2 materiál, mající molekulovou hmotnost asi 650 000, byl rovněž pozorován.

Claims (5)

1. Hepatitis C virový, neboli HCV, zkrácený asialoglykoprotein vybraný ze skupiny zahrnující asialoglykoprotein exprimovaný z El oblasti HCV, která zahrnuje deleci části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 330 až 380 El oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů a asialoglykoprotein exprimovaný z E2 oblasti HCV, která zahrnuje deleci části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 660 až 830 E2 oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů.

2. Asialoglykoprotein podle nároku 1, kde uvedený zkrácený asialoglykoprotein je exprimován z El oblasti HCV a obsahuje deleci v části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 330 až 380 El oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů.

3. Asialoglykoprotein podle nároku 1, kde uvedený zkrácený asialoglykoprotein je exprimován z E2 oblasti HCV a obsahuje deleci v části sekvence, nacházející se v oblasti aminokyselin 660 až 830 E2 oblasti, číslované od začátku HCV polyproteinů.

4. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje hepatitis C virový, neboli HCV, asialoglykoprotein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a farmaceuticky přijatelný excipient.

5. Použití hepatitis C virového asialoglykoproteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro imunodiagnostickou metodu pro detekci protilátek proti HCV.