RU2175657C2 - Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа - Google Patents
Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2175657C2 RU2175657C2 RU97115378A RU97115378A RU2175657C2 RU 2175657 C2 RU2175657 C2 RU 2175657C2 RU 97115378 A RU97115378 A RU 97115378A RU 97115378 A RU97115378 A RU 97115378A RU 2175657 C2 RU2175657 C2 RU 2175657C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hcv
- region
- virus
- hepatitis
- proteins
- Prior art date
Links
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 31
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 title claims description 23
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 17
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 title abstract 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 title 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 55
- 239000002523 lectin Substances 0.000 abstract description 21
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 abstract description 20
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 abstract description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 abstract description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 abstract description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 abstract description 5
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 abstract description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 9
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 8
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 5
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 4
- 101710132593 Protein E2 Proteins 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700008783 Hepatitis C virus E1 Proteins 0.000 description 3
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 3
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 3
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 3
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 3
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 3
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 3
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N thapsigargin Chemical compound CCCC(=O)O[C@H]1C[C@](C)(OC(C)=O)[C@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C(\C)=C/C)C(C)=C2[C@@H]2OC(=O)[C@@](C)(O)[C@]21O IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000234271 Galanthus Species 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010068997 Mannose-Binding Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000001698 Mannose-Binding Lectins Human genes 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108700010756 Viral Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000005664 protein glycosylation in endoplasmic reticulum Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanamine Chemical compound NCCOCCN GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000011312 Vector Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- -1 asialoglycoproteins) Chemical compound 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108020003928 mannose binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000036209 mannose binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid tungsten Chemical compound [W].OP(O)(O)=O DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940070376 protein Drugs 0.000 description 1
- 230000027380 protein glycosylation in Golgi Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к диагностике, лечению и профилактике гепатита C. Два белка оболочки гепатита C (E1 и E2) экспрессируются без сиалилирования. Рекомбинантная экспрессия этих протеинов в низших эукариотах или в клетках млекопитающих, у которых блокировано терминальное гликозилирование, дает рекомбинантные белки, которые имеют большее сходство с естественными гликопротеинами вируса гепатита C. Когда их выделяют при помощи сродства к лектину GNA, протеины E1 и E2 соединяются в вирусоподобные частицы. Клетки, несущие рецептор маннозы или рецептор асиалогликопротеина, можно инфицировать ВГС и использовать для культивирования вируса. 4 с. и 2 з.п. ф-лы.
Description
Это изобретение относится к общим областям экспрессии рекомбинантного белка и вирусологии. Более конкретно, изобретение относится к гликопротеинам, пригодным для диагностики, лечения и профилактики инфекции вирусом гепатита С и к способам получения таких гликопротеинов.
Прототипы изобретения
Гепатит НИА-НИВ (ГНАНВ) является трансмиссивным заболеванием (или группой заболеваний), по- видимому, вирусной этиологии, отличающимся от других форм поражения печени, связанного с вирусом, таких как вызванные вирусом гепатита А (ВГА), вирусом гепатита В (ВГВ), вирусом гепатита дельта (ВГД), цитомегаловирусом (ЦМВ) или вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ). Эпидемиологические данные наводят на мысль, что ГНАНВ может быть трех типов: эпидемического типа, передающегося с водой, типа, передающегося через кровь или с инъекциями, и типа, спорадически появляющегося у населения. Количество вызывающих его возбудителей неизвестно. Однако недавно были выделены новые виды вирусов, вирус гепатита С (ВГС) как основная (если не единственная) причина передающегося через кровь ГНАНВ (ВВ-ГНАНВ). См., например, PCT WO 89/046699. Гепатит C является главной формой гепатита, связанного с переливанием крови, во многих странах и регионах, включая Соединенные Штаты, Европу и Японию. Имеются также сведения об участии ВГС в возникновении печеночно-клеточного рака. Поэтому существует необходимость в эффективном способе предупреждения и лечения ВГС-инфекции.
Гепатит НИА-НИВ (ГНАНВ) является трансмиссивным заболеванием (или группой заболеваний), по- видимому, вирусной этиологии, отличающимся от других форм поражения печени, связанного с вирусом, таких как вызванные вирусом гепатита А (ВГА), вирусом гепатита В (ВГВ), вирусом гепатита дельта (ВГД), цитомегаловирусом (ЦМВ) или вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ). Эпидемиологические данные наводят на мысль, что ГНАНВ может быть трех типов: эпидемического типа, передающегося с водой, типа, передающегося через кровь или с инъекциями, и типа, спорадически появляющегося у населения. Количество вызывающих его возбудителей неизвестно. Однако недавно были выделены новые виды вирусов, вирус гепатита С (ВГС) как основная (если не единственная) причина передающегося через кровь ГНАНВ (ВВ-ГНАНВ). См., например, PCT WO 89/046699. Гепатит C является главной формой гепатита, связанного с переливанием крови, во многих странах и регионах, включая Соединенные Штаты, Европу и Японию. Имеются также сведения об участии ВГС в возникновении печеночно-клеточного рака. Поэтому существует необходимость в эффективном способе предупреждения и лечения ВГС-инфекции.
Потребность в чувствительных специфичных методиках для скрининга и выявления носителей ВГС и зараженных ВГС крови и препаратов крови значительна. Посттрансфузионный гепатит (ПТТ) встречается приблизительно у 10% больных, получавших переливание крови, и ВГС вызывает до 90% этих случаев. Основная проблема этого заболевания в том, что оно часто вызывает хроническое прогрессирующее поражение печени (25-55%).
Лечение больного, также как предупреждение передачи ВГС с кровью и препаратами крови или при тесном контакте с персоналом, требует доступных диагностических и прогностических средств для обнаружения нуклеиновых кислот, антигенов и антител, связанных с ВГС. К тому же существует также нужда в эффективных вакцинах ииммунотерапевтических лечебных препаратах для предупреждения и/или лечения этого заболевания.
ВГС появляется в крови инфицированных лиц в очень небольших количествах по сравнению с другими инфекционными вирусами, из-за чего этот вирус очень трудно обнаружить. Низкая концентрация вируса, возможно, является основной причиной того, что возбудитель ГНАНВ так долго оставался необнаруженным. Даже при том, что в настоящее время его клонировали, ВГС все еще трудно культивировать и размножать. Соответственно, очень нужны рекомбинантные способы получения диагностических (терапевтических) профилактических белков ВГС.
Вдобавок, очень нужна вакцина ВГС. Однако вырастить ВГС в культуре клеток очень трудно. Поэтому не было возможности вывести ослабленные штаммы вируса при помощи серийных пассажей на культурах ткани/клеток.
Сущность изобретения
При экспрессировании в рекомбинантных системах было обнаружено, что два белка ВГС, E1 и E2 проявляются как связанные с оболочкой асиалогликопротеины. Это было неожиданным, потому что гликопротеины обычно не остаются у млекопитающих в форме с маннозой на конце, а подвергаются дальнейшим модификациям другими углеводами: форма, оканчивающаяся на маннозу, в типичных случаях, является только переходной. У E1 и E2 (как они экспрессировались в наших системах) этот асиалогликопротеин, казалось, являлся конечной формой. E1 (белок оболочки 1) является гликопротеином с молекулярной массой около 35 кД, который транслируется с предсказанной области E1 генома ВГС. E2 (белок оболочки 2) является гликопротеином с молекулярной массой около 72 кД, который транслируется с предсказанной областью NSI (неструктурный белок 1) генома ВГС, основываясь на флавовирусной модели ВГС. Так как вирусные гликопротеины часто высоко иммуногенны, E1 и E2 являются первыми кандидатами для использования в иммуноанализах и терапевтических/профилактических вакцинах.
При экспрессировании в рекомбинантных системах было обнаружено, что два белка ВГС, E1 и E2 проявляются как связанные с оболочкой асиалогликопротеины. Это было неожиданным, потому что гликопротеины обычно не остаются у млекопитающих в форме с маннозой на конце, а подвергаются дальнейшим модификациям другими углеводами: форма, оканчивающаяся на маннозу, в типичных случаях, является только переходной. У E1 и E2 (как они экспрессировались в наших системах) этот асиалогликопротеин, казалось, являлся конечной формой. E1 (белок оболочки 1) является гликопротеином с молекулярной массой около 35 кД, который транслируется с предсказанной области E1 генома ВГС. E2 (белок оболочки 2) является гликопротеином с молекулярной массой около 72 кД, который транслируется с предсказанной областью NSI (неструктурный белок 1) генома ВГС, основываясь на флавовирусной модели ВГС. Так как вирусные гликопротеины часто высоко иммуногенны, E1 и E2 являются первыми кандидатами для использования в иммуноанализах и терапевтических/профилактических вакцинах.
Открытие, что E1 и E2 не сиалилированы, является значительным. Особая форма белка часто подсказывает, какие клетки могут служить подходящим хозяином для рекомбинантной экспрессии. Прокариоты, такие как E.coli, не гликозилируют белки и, в общем, не подходят для получения гликопротеинов, используемых как антигены, из-за того, что гликозилирование часто является важным для полной антигенности, растворимости и стабильности белка. Низшие эукариоты, такие как дрожжи и грибки, гликозилируют белки, но в целом не способны добавлять к углеводным комплексам терминальные остатки сиаловой кислоты.
Поэтому белки, полученные в дрожжах, могут быть антигенно отличными от своих естественных (нерекомбинантных) аналогов.
Экспрессия в клетках млекопитающих предпочтительна в случаях, когда важна антигенность продукта, так как гликозилирование рекомбинантного протеина должно очень походить на таковое у протеинов природных вирусов.
Новые данные указывают, что при инфицировании вирус ВГС может проникнуть в клетки хозяина либо через асиалогликопротеиновый рецептор, найденный на гепатоцитах, либо через рецептор маннозы, найденный на эндотелиальных клетках печени и макрофагах (особенно, на купферовских клетках). Неожиданно было обнаружено, что масса естественных E1 и E2 не содержит терминальных остатков сиаловой кислоты, а только гликозилированную сердцевину. Небольшие фракции дополнительно содержат терминальный N-ацетилглюкозамин. Соответственно, объектом настоящего изобретения является получение гликопротеинов оболочки ВГС, лишенных всех или почти всех терминальных остатков сиаловой кислоты.
Другим аспектом изобретения является способ получения асиало-E1 или E2 в условиях подавления присоединения терминальной сиаловой кислоты, например, путем экспрессии в дрожжах или экспрессии в клетках млекопитающих, используя антибиотики для облегчения секреции или выделения.
Другим аспектом изобретения является способ очистки E1 и E2 путем сродства к лектинам, которые связывают терминальные остатки маннозы или терминальные N - ацетилглюкозаминовые остатки.
Другим аспектом изобретения является иммуногенная композиция, включающая рекомбинантный асиалогликопротеин, выбранный из группы, состоящей из E1 и E2 ВГС в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. По желанию (необязательно) можно включить иммунологический адъювант.
Другим аспектом изобретения является реагент для иммуноанализа, включающий рекомбинантный асиалогликопротеин, выбранный из группы, состоящей из E1 и E2 ВГС в сочетании с подходящим носителем. Другой реагент для иммуноанализа по этому изобретению состоит из рекомбинантного асиалогликопротеина, выбранного из группы, состоящей из E1 и E2 ВГС, в сочетании с подходящей выявляемой меткой.
Еще один аспект изобретения касается димеров и агрегатов более высокого порядка E1 и/или E2. Одним из видов изобретения является комплекс E2. Другой разновидностью изобретения является гетеродимер E1:E2.
Еще одним аспектом изобретения является композиция ВГС-вакцины, состоящая из агрегатов E1:E2 и фармацевтически приемлемого носителя.
Еще одним аспектом изобретения является способ очистки комплексов E1:E2.
Еще одним аспектом изобретения является способ размножения ВГС в культуре клеток, включающий: (а) предоставление клетки, экспрессирующей рецептор, выбранный из группы, состоящей из рецептора маннозы и рецептора асиалогликопротеина; (б) инфицирование клетки ВГС; (в) выращивание инфицированной клетки. Предпочтительно, чтобы клетка экспрессировала рекомбинантный рецептор.
Способы проведения изобретения
А. Определения
Термин "асиалогликопротеин" относится к гликозилированному протеину, который в значительной степени освобожден от остатков сиаловой кислоты. Асиалогликопротеины можно получить рекомбинантным способом, либо путем очистки из культуры клеток, либо из естественных источников.
А. Определения
Термин "асиалогликопротеин" относится к гликозилированному протеину, который в значительной степени освобожден от остатков сиаловой кислоты. Асиалогликопротеины можно получить рекомбинантным способом, либо путем очистки из культуры клеток, либо из естественных источников.
В настоящее время предпочтительны асиалогликопротеины, получающиеся из ВГС, предпочтительно, гликопротеины E1 и E2, наиболее предпочтительно, рекомбинантные E1 и E2 (pE1 и pE2). Белок, "в значительной степени освобожденный" от сиаловой кислоты, подпадает под это определение, если количество остатков сиаловой кислоты незначительно влияет на связывание гликопротеина с протеинами, связывающими маннозу, такими как GNA. Такая степень сиалилирования, в общем, достигается, если сиаловая кислота составляет менее 40% общего количества N-связанных углеводов, более предпочтительно - менее 30%, более предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10, более предпочтительно менее 5% и самое предпочтительное менее 2%.
Термин "E1" используется здесь для обозначения белка или полипептида, экспрессированного в пределах первых 400 аминокислот полипротеина ВГС, участка, иногда упоминаемого как протеин E или S. В естественном виде он является гликопротеином в 35 кД, строго связанным с оболочкой. У большинства природных штаммов ВГС протеин E1 закодирован в вирусном полипротеине после протеина С (сердцевины).
Протеин E1 располагается приблизительно между 192 и 383 аминокислотами полноразмерного полипротеина. В термин "E1" здесь также включаются аналоги и усеченные мутанты, дающие перекрестные иммунологические реакции с естественным E1.
Термин "E2" используется здесь для обозначения белка или полипептида, экспрессируемого в пределах первых 900 аминокислот полипротеина ВГС, участка, иногда упоминаемого как белок NSI. В естественном виде он является гликопротеином в 72 кД, строго связанным с оболочкой. У большинства естественных штаммов ВГС протеин E2 следует за протеином E1.
Протеин E2 располагается приблизительно между 384 и 820 аминокислотами. В понятие "E2" здесь также включаются аналоги и усеченные мутанты, дающие перекрестные иммунологические реакции с естественным E2.
Термин "агрегат" используется здесь для обозначения комплекса E1 и/или E2, содержащего более одного мономера E1 или E2. В рамках этого определения димеры E1:E1 и E2:E2 и гетеродимеры E1:E2 являются "агрегатами". Композиции изобретения могут также включать более крупные агрегаты с молекулярной массой, превышающей 800 кД.
Термин "частица" используется здесь для обозначения агрегата E1, E2 или E1/E2, видимого при электронной микроскопии и имеющего размеры не менее 20 нм. Предпочтительными частицами являются те, которые имеют приблизительно сферическую форму и диаметр около 40 нм при электронной микроскопии.
Термин "очищенные" здесь применяют по отношению к протеинам в композиции, где заданный протеин составляет не менее 35% всего белкового компонента композиции. Предпочтительно, заданный протеин составляет не менее 40%, более предпочтительно не менее 50%, более предпочтительно не менее 60%, еще более предпочтительно не менее 70%, даже предпочтительнее не менее 80%, даже предпочтительнее не менее 90% и предпочтительнее всего не менее 95% всего белкового компонента. Композиция может содержать другие соединения, такие как углеводы, соли, липиды, растворители и т.п., не нарушая определения процента очистки, здесь применяющегося. "Изолированный" асиалогликопротеин ВГС означает композицию асиалогликопротеина ВГС, очищенную не менее чем на 35%.
"Протеин, связывающий маннозу", здесь означает лектин или другой протеин, специфически связывающийся с протеинами с гликозилированием, оканчивающимся на маннозу (например, асиалогликопротеины), например лектины, связывающие маннозу, антитела, специфичные для гликозилирования, оканчивающегося на маннозу, протеин рецептора маннозы (R.A.B. Ezekowitz et al., J.Exp. Med. (1990) 176-1785-94), протеины рецептора асиалогликопротеина (H.Kurata et al. , J. Biol Chem. (1990) 265: 11295-98), сывороточный протеин, связывающий маннозу, (1. Schuffenecker et al., Cytoqenet. Coll Genet. (1991) 56: 99-102; K. Sastry et al. , J. Immunol. (1991) 147: 692-97), сывороточный протеин, связывающий асиалогликопротеин и т.п. Лектины, связывающие маннозу, включают, например, GNA, конканавалин А (КонА) и другие лектины со сходными связывающими свойствами.
Термин "лектин GNA" относится к агглютинину растения Galanthus nivalus, продажному лектину, который связывает гликопротеины, оканчивающиеся маннозой.
"Рекомбинантным" гликопротеином здесь называется гликопротеин, экспрессированный с рекомбинантного полинуклеотида, в котором структурный ген, кодирующий гликопротеин, экспрессируется под контролем регуляторной последовательности, не примыкающей в естественных условиях к структурному гену, или в котором структурный ген модифицирован.
Например, можно создать вектор, в котором структурный ген E1 помещен под контроль функционального фрагмента промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы дрожжей (ГАФДГ). В настоящее время предпочтительным промотором для использования в дрожжах является гибридный промотор АДГ2/ГАФ, описанный в патенте США N 4.880.73, для которого используется фрагмент промотора ГАФДГ в сочетании с предшествующей активационной последовательностью, полученной из алкогольдегидрогеназы 2. Модификации структурного гена могут включать замещение различных кодонов вырожденными кодонами (например, использовать предпочтительные для хозяина кодоны, элиминировать или создать сайты рестрикции, контролировать образование шпилек и т.д.) и замещение, вставку или удаление ограниченного числа кодонов, кодирующих различные аминокислоты (предпочтительно не более 10%, более предпочтительно менее 5% от размера естественной аминокислотной последовательности подлежат изменению) и т.п. Таким же образом "рекомбинантным" рецептором назван протеин рецептора, экспрессированный с рекомбинантного полинуклеотида, в котором структурный ген, кодирующий рецептор, экспрессируется под контролем регуляторных последовательностей, не примыкающих в естественных условиях к структурному гену, или в котором структурный ген модифицирован.
Термин "изолированный полипептид" относится к полипептиду, в значительной степени свободному от других компонентов вируса ВГС, в особенности от полинуклеотидов. Полипептидная композиция является "существенно свободной" от других компонентов, если вес полипептида в композиции составляет не менее 70% веса полипептида и другого компонента, с ним соединенного, более предпочтительно - не менее 80%, еще более предпочтительно - около 90% и самое предпочтительное - 95% или более.
Например, композиция, содержащая 100 мкг/мл E1 и только 3 мкг/мл других компонентов ВГС (например, ДНК, липиды и т. д.), является существенно свободной от "других компонентов ВГС" и таким образом является композицией изолированного полипептида в рамках этого определения.
Термин "лидер секреции" относится к полипептиду, который при кодировании на аминоконце белка вызывает после трансляции секрецию белка в культуральную среду хозяйских клеток. Лидер секреции, как правило, получается из используемой клетки хозяина.
Например, в число лидеров секреции, подходящих для использования в дрожжах, входит лидер альфа-фактора Saccharomyces cerevisial (см. патент США N 4.870.008).
Термин "низший эукариот" относится к клеткам-хозяевам, таким как дрожжи, грибы и т. п. Низшие эукариоты являются, как правило, (не обязательно) одноклеточными. Предпочтительными эукариотами являются дрожжи, особенно виды, относящиеся к Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenuba и т.п. Saccharomyces cerevisiae, S.Carisbergensis и К.lactis являются наиболее часто используемыми дрожжевыми хозяевами и общепринятыми грибковыми хозяевами.
Термин "высший эукариот" относится к клеткам-хозяевам, полученным от высших животных, таких как млекопитающие, рептилии, насекомые и т.п.
В настоящее время предпочтительны высшие эукариотные клетки-хозяева, полученные от китайского хомячка (например, CHO-клетки яичника китайского хомячка), обезьян (например, клетки COS), человека и насекомого (например, spodoptera frugiperda). Клетки-хозяева могут быть представлены в виде суспензии или культуры в матрасе, культур ткани, культур органов и т.п.
Термин "модулятор кальция" относится к соединению, способному секвестировать или связывать ионы кальция в эндоплазматическом ретикулуме или изменять концентрацию ионов кальция в ЭПР путем действия на белки, регулирующие обмен кальция (например, белки кальциевых канальцев, кальциевые насосы и т. д. ). В число подходящих модуляторов кальция входит, например, тапсигаргин, EGTA (этиленгликоль-бис/бета-аминоэтиловый эфир/- N, N, N', N' - тетрауксусная кислота). В настоящее время предпочтительным модулятором является тапсигаргин (см. , например, O.Thastrup et al., Ргос. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87:2466-70).
Термин "иммуногенный" относится к способности вещества вызывать гуморальный и/или клеточный имунный ответ либо в одиночку, либо в связанном с носителем состояния в присутствии адъюванта или без него. "Нейтрализация" относится к иммунному ответу, блокирующему инфекционность, либо частично, либо полностью, инфекционного возбудителя. "Вакцина" является иммуногенной композицией, способной осуществить защиту от ВГС, частичную или полную, применимой для лечения индивидуума.
Термин "биологическая жидкость" относится к жидкости, полученной из организма, такой как сыворотка, плазма, слюна, желудочный сок, слизь и т.п. В общем, биологические жидкости подлежат скринингу на присутствие частиц ВГС. Некоторые биологические жидкости используются как источник других продуктов, таких как свертывающие факторы (например, фактор VIII:C), сывороточный альбумин, гормон роста и т.п. В таких случаях важно, чтобы источник биологической жидкости был свободен от загрязнения вирусом, таким как ВГС.
Б. Общий способ
Область E1 генома ВГС описывается в ЕР 388.232 как область "E", тогда как E2 описывается как "NS1". Область E1 включает приблизительно аминокислоты 192-383 полноразмерного вирусного полипротеина. Область E2 включает приблизительно аминокислоты 384-820. Полные последовательности прототипов этих протеинов (штамм ВГС-1) доступны специалисту (см. ЕР 388.232), так как являются общими способами клонирования и экспрессии протеинов. Как E1, так и E2, могут экспрессироваться с полинуклеотида, кодирующего первые 850-900 аминокислот полипротеина ВГС: посттрансляционное процессирование в большинстве эукариотных клетках-хозяевах расщепляет первоначальный полипротеин на С, E1 и H2. Можно усекать 5' конец кодирующей области для того, чтобы уменьшить величину продуцируемого протеина С.
Область E1 генома ВГС описывается в ЕР 388.232 как область "E", тогда как E2 описывается как "NS1". Область E1 включает приблизительно аминокислоты 192-383 полноразмерного вирусного полипротеина. Область E2 включает приблизительно аминокислоты 384-820. Полные последовательности прототипов этих протеинов (штамм ВГС-1) доступны специалисту (см. ЕР 388.232), так как являются общими способами клонирования и экспрессии протеинов. Как E1, так и E2, могут экспрессироваться с полинуклеотида, кодирующего первые 850-900 аминокислот полипротеина ВГС: посттрансляционное процессирование в большинстве эукариотных клетках-хозяевах расщепляет первоначальный полипротеин на С, E1 и H2. Можно усекать 5' конец кодирующей области для того, чтобы уменьшить величину продуцируемого протеина С.
Экспрессию асиалогликопротеинов можно получить множеством способов. Например, можно получить экспрессию в низших эукариотах (таких, как дрожжи), которые в норме не добавляют остатки сиаловой кислоты к гликозилированным протеинам. В дрожжевых экспрессионных системах в настоящее время предпочтительно пользоваться лидером секреции, таким как лидер альфа- фактора S.cerevisial, так чтобы протеин экспрессировался после трансляции в питательную среду. Также в настоящее время предпочтительно пользоваться мутантами с дефицитом гликозилирования, таким как pmr1, так как эти мутанты обеспечивают только гликозилирование сердцевины и часто секретируют гетерологичные белки с высокой эффективностью (Н.К. Pudolph et al., Cell (1989) 58:133-45). Альтернативно можно использовать другие виды дрожжей, такие как Pichia pastaris, которые экспрессируют гликопротеины, содержащие 8-9 остатков маннозы в виде, напоминающем, как считают, тип гликозилирования сердцевины, наблюдающийся у млекопитающих в S.cerevisia.
Альтернативно можно вызвать экспрессию в клетках млекопитающих и блокировать терминальное гликозилирование (добавление сиаловой кислоты). Рекомбинантные конструкции будут предпочтительно включать сигнал секреции, чтобы гарантировать, что протеин направлен в эндоплазматический ретикулум. Транспорт в аппарат Гольджи, по-видимому, блокируют сами E1 и E2: высокий уровень экспрессии E1 или E2 в клетках млекопитающих, кажется, прекращает секрецию всех белков клетки в эндоплазматическом ретикулуме или в аппарате Гольджи. Можно дополнительно использовать мутант с дефектом гликозилирования. См., например, P. Stanlcy, Ann. Rev. Genet. (1984) 18: 525-52. В случае гликозилирования или транспорта мутант экспрессирует E1 или E2 с сиалилированием, тогда терминальный остаток сиаловой кислоты можно удалить обработкой нейраминидазой.
Дрожжи в дальнейшем нужно стимулировать кальциевым модулятором, для того чтобы получить секрецию протеина в эндоплазматический ретикулум. В число подходящих модуляторов входят тапсигаргин и А23817 (см,: например, O.Thastup et al., Proc. Nat. Accd. Sci. USA (1990) 87:2466-70). Например, можно экспрессировать большое количество E1 или E2 внутриклеточно в клетках млекопитающих (например, клетки CHO, COS, HeLa и т.п.) путем трансфекции вектором рекомбинантного вируса осповакцины. Выждав, пока протеин экспрессируется и накопится в эндоплазматическом ретикулуме, клетки обрабатывают кальциевым модулятором в концентрации, достаточно большой, чтобы вызвать освобождение содержимого ЭР. Затем белок извлекается из культуральной среды, которая замещается для следующего цикла.
Дополнительно может оказаться выгодным экспрессировать усеченную форму протеина оболочки. Как E1, так и E2, по-видимому, обладают высокогидрофобным доменом, который, очевидно, удерживает протеин внутри эндоплазматического ретикулума и препятствует эффективному выделению. Поэтому можно по желанию убрать части последовательности, обнаруженные в одной или нескольких областях аминокислот 170-190, 260-290 или 330-380 у El (нумерация от начала полипротеина) и 660-830 у E2 (см., например, рисунок 20-1 в ЕР 388.232). Похоже, что по крайней мере один из этих гидрофобных доменов образует трансмембранную область, которая не является существенной для антигенности протеина и поэтому может быть удалена без ущерба. Какую область лучше удалить, можно определить немногими экспериментами по удалению, проведенными обычным образом. Удаление гидрофобного 3'-конца у E2 приводит к секреции части экспрессированного E2 с сиалилированием секретированного протеина.
Для получения экспрессии можно использовать любой из ряда векторов. Низшие эукариоты, такие как дрожжи, обычно трансформируются плазмидами методом преципитации фосфатом кальция или подвергаются трансфекции рекомбинантным вирусом. Векторы могут независимо размножаться в клетке-хозяине или могут интегрироваться в геном клетки-хозяина. Высшие эукариоты могут трансформироваться плазмидами, но обычно они инфицируются рекомбинантным вирусом, например рекомбинантным вирусом осповакцины. Вирус осповакцины особенно предпочтителен, так как инфицирование вирусом осповакцины останавливает экспрессию белков клетки-хозяина. В настоящее время в число предпочтительных клеток-хозяев входят линии клеток HeLa и плазмоцитомы. В представленной системе это означает, что E1 и E2 накапливаются как главные гликозилированные разновидности в ЭР хозяина.
Так как pE1 и pE2 будут преобладающими гликопротеинами с маннозным окончанием, их легко выделить в чистом виде из клетки при помощи лектинов, таких как агглютинин Galanthus nivalus (GNA), который связывает терминальные остатки маннозы
Протеины, которые в естественном виде экспрессируются как гликопротеины с маннозным окончанием, в физиологии млекопитающих встречаются относительно редко. В большинстве случаев гликопротеин млекопитающих имеет маннозное окончание только в транзиторной промежуточной форме, образующейся в процессе гликозилирования. То что белки оболочки ВГС, рекомбинантно экспрессированные, содержат оканчивающийся на маннозу гликозильный остаток или (в меньшей степени) N-ацетилглюкозамин, означает, что белки ВГС и цельные вироны можно отделять и частично очищать от эндогенных протеинов при помощи лектинов, специфичных для терминальной маннозы или N-ацетилглюкозамина. Рекомбинантные протеины кажутся аутентичными и считаются в сущности идентичными белкам оболочки, обнаруживаемым в зрелом свободном вирионе или форме протеина, связанной с оболочкой клетки. Поэтому можно использовать лектины, такие как GNA для протеинов с маннозным окончанием и WCA (агглютинин семян пшеницы) и их эквиваленты для протеинов с N-ацетилглюкозаминовым окончанием. Можно пользоваться лектинами, фиксированными на твердой фазе (например, колонкой лектин-сефароза), чтобы отделить E1 и E2 от надосадочной жидкости культуры клеток или от других жидкостей, например, для очистки во время получения антигенов для вакцины или для использования в иммуноанализе.
Протеины, которые в естественном виде экспрессируются как гликопротеины с маннозным окончанием, в физиологии млекопитающих встречаются относительно редко. В большинстве случаев гликопротеин млекопитающих имеет маннозное окончание только в транзиторной промежуточной форме, образующейся в процессе гликозилирования. То что белки оболочки ВГС, рекомбинантно экспрессированные, содержат оканчивающийся на маннозу гликозильный остаток или (в меньшей степени) N-ацетилглюкозамин, означает, что белки ВГС и цельные вироны можно отделять и частично очищать от эндогенных протеинов при помощи лектинов, специфичных для терминальной маннозы или N-ацетилглюкозамина. Рекомбинантные протеины кажутся аутентичными и считаются в сущности идентичными белкам оболочки, обнаруживаемым в зрелом свободном вирионе или форме протеина, связанной с оболочкой клетки. Поэтому можно использовать лектины, такие как GNA для протеинов с маннозным окончанием и WCA (агглютинин семян пшеницы) и их эквиваленты для протеинов с N-ацетилглюкозаминовым окончанием. Можно пользоваться лектинами, фиксированными на твердой фазе (например, колонкой лектин-сефароза), чтобы отделить E1 и E2 от надосадочной жидкости культуры клеток или от других жидкостей, например, для очистки во время получения антигенов для вакцины или для использования в иммуноанализе.
Альтернативно можно предоставить подходящий лектин для выделения E1, E2 или вирионов ВГС из жидкости или тканей лиц с подозрением на ВГС инфекцию. Так как гликопротеины с маннозным окончанием относительно редки, такая процедура должна служить очистке белков, присутствующих в пробе, существенно ослабляя интенсивность фона. После связывания лектинами протеин ВГС может быть обнаружен при помощи антиВГС-антител.
Если присутствуют цельные вироны, можно альтернативно обнаружить нуклеиновые кислоты ВГС при помощи методик полимеразной цепной реакции (PCR) или другими способами накопления нуклеиновых кислот, направленными на сохранение областей генома ВГС (например, некодирующей области 5'). Этот способ позволяет изолировать и дать характеристику различных штаммов ВГС независимо от отклонений или вариантов антигенности, например, в случаях, когда новый штамм не дает перекрестной иммунной реакции со штаммом, применявшимся для получения антител. Есть много других способов использовать преимущества уникального распознавания гликопротеинов с маннозным окончанием при помощи отдельных лектинов.
Например, можно инкубировать пробы, предположительно содержащие вироны или протеины ВГС с биотин- или авидинмеченными лектинами, и осаждать протеин-лектиновый комплекс при помощи авидина или биотина. Можно также использовать сродство лектина к протеинам ВГС, чтобы нацелить соединения на вироны с терапевтической целью, например, конъюгировав антивирусное соединение с GNA. Альтернативно можно использовать подходящие лектины для того, чтобы удалить гликопротеины с маннозным окончанием из сыворотки или плазмы, снизив или исключив таким образом риск загрязнения ВГС.
В настоящее время предпочтительно изолировать асиалогликопротеины E1 и/или E2 из неочищенных лизатов клеток путем инкубирования с иммобилизированным протеином, связывающим маннозу, особенно с лектином, таким как КонА или GNA. Клетки лизируются, например, механическим разрушением в гипотоническом буфере, потом лизат центрифугируют, чтобы приготовить постнуклеарный лизат, и еще раз центрифугируют, чтобы получить неочищенную фракцию микросомальных мембран. Неочищенная фракция мембран последовательно солюбилизируется в буфере, содержащем детергент, такой как тритон Х-100, Np40 или им подобный. Этот экстракт с детергентом в дальнейшем очищают от нерастворимых частиц центрифугированием и образовавшийся осветвленный лизат инкубируют в хроматографической колонке, содержащей иммобилизированный протеин, связывающий маннозу, предпочтительно GNA, фиксированный на твердой подложке, такой как агароза или сефароза, в течение времени, достаточного для связывания, обычно на 16-20 часов. Затем суспензию пропускают через колонку до тех пор, пока E1/E2 начинают появляться в элюенте, затем - инкубируют в колонне в течение времени, достаточного для связывания, обычно около 12-24 часов. Связанный материал затем промывается дополнительным количеством буфера с детергентом (например, тритоном Х-100, NP40 или им подобным) и элюируется маннозой для того, чтобы получить очищенный асиалогликопротеин.
При элюции предпочтительно элюировать только до тех пор, пока в элюате не начнет появляться протеин, в этот момент элюирование останавливается и колонка уравновешивается в течение 2-3 часов, прежде чем приступить к элюированию протеина. Полагают, что это дает достаточно времени для того, чтобы прореагировали оставшиеся крупные белковые агрегаты. В случаях, когда E1 и E2 экспрессируются вместе в естественном виде (т.е. без процессирования домена связи с оболочкой), существенная часть асиалогликопротеинов появляется в виде агрегатов E1:E2. При исследовании под электронным микроскопом значительная часть этих агрегатов выглядит как частицы почти сферической формы диаметром около 40 нм, что соответствует предполагаемым размерам интактного вируса. Эти частицы кажутся самоорганизующимися вирусными субъединицами.
Ожидается, что эти агрегаты должны образовывать четвертичную структуру, очень схожую со структурой аутентичных частиц вириона ВГС, и поэтому ожидается, что они будут служить как высокоиммуногенная вакцина.
Комплексы E1/E2 могут быть далее очищены гель-хроматографией на основной среде, например фрактогель-ДЭАЭ или ДЭАЭ-сефароза. При помощи фрактогель-ДЭАЭ гель-хроматографии можно получить комплексы E1/E2, очищенные, приблизительно, до 60-80%. E1 можно далее очистить обработкой лизинпротеазой, потому что у E1 есть 0-1 Лиз остаток. Обработка комплекса лизинпротеазой разрушает E2 и позволяет легко отделить E1.
Тканевая специфичность ВГС вместе с наблюдением, что гликопротеины оболочки ВГС имеют маннозные окончания, наводят на мысль, что вирус использует рецептор маннозы или асиалогликопротеиновый рецептор (АСГР) для того, чтобы проникнуть в клетку-хозяина. Маннозные рецепторы обнаружены на макрофагах и клетках синусоидов печени, тогда как АСГР обнаружен на паренхиматозных гепатоцитах. Поэтому должно быть возможно выращивать ВГС в клетках-хозяевах, экспрессирующих один или оба эти рецептора. Можно либо использовать первичные культуры клеток, которые естественно экспрессируют этот рецептор, в условиях, сохраняющих рецептор, или можно ввести в другую линию клеток, такую как HeLa, СНО, COS и т.п., вектор, способствующий экспрессии этого рецептора.
Клонирование рецептора маннозы и его трансфекция и экспрессия в фибробластах были продемонстрированы М. Е. Maylor et al. J.Biol. Chem (1990) 265:12156-62.
Клонирование и секвенирование АСГР описаны К. Drickamer et al., J. Biol. Chem (1984) 259; 770-78 и М. Spiess et.al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA (1985) 82:6465-69; трансфекция и экспрессия функционального АСГР в НТС гомозитных типирующих клетках крыс описана М. McPhaul и Р.Beгg, Pros. Nat Acad. Sci. USA (1986) 83:8863-67 и М.McPhaul и Р.Berg, Mc1. Cell Biol. (1987) 7: 1841-47.
Таким образом, возможна трансфекция одного или обоих рецепторов в подходящие линии клеток и использование получившихся клеток в качестве хозяина для размножения ВГС в культуре. Серийные пассажи ВГС в такой культуре должны привести к возникновению ослабленных штаммов, подходящих для использования в качестве живой вакцины. Можно либо использовать первичные культуры клеток, которые естественным образом экспрессируют этот рецептор, создавая условия, при которых рецептор сохраняется, или можно произвести трансфекцию другой линии клеток, такой как HeLa, CHO, COS и т.п., вектором, обеспечивающим экспрессию рецептора.
Клонирование рецептора маннозы и его трансфекция и экспрессирование в фибробластах были показаны Taylor et al. (см. выше), тогда как трансфекция и экспрессия функционального АСГР в гомозиготных типирующих клетках крыс описана McPhaul et al. (см. выше).
В настоящее время предпочтительно пользоваться бессмертной линией клеток, трансфицированных одним или обоими рекомбинантными рецепторами.
Иммуногенные композиции можно приготовить известными способами. Настоящие композиции включают иммуногенное количество полипептида, например композиции частиц E1, E2 или E1/E2, обычно соединенного с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно далее включающие адъювант.
Если желателен "коктейль" - комбинация полипептидов ВГС, для повышения эффективности можно, например, смешать вместе антигены E1 и E2. Агрегаты вирусоподобных частиц E1/E2 представят, как ожидается, особенно полезный вакцинный антиген. Иммуногенные композиции можно вводить животным, чтобы вызвать образование антител, или получить источник антител, или создать защитный иммунитет у животного.
Фармацевтически приемлемые носители включают любой носитель, который сам не вызывает образования антител, опасных для индивидуума, получающего композицию. Подходящими носителями обычно являются крупные, медленно разрушающиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полилактокислоты, полигликолевые кислоты, полимеры аминокислот, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам.
В число предпочтительных адъювантов, усиливающих эффективность композиции, входят, но ими не ограничиваются: гидроксид алюминия (алум), N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr - MDP), найденный в патенте США N 4.606.918, N-ацетил- нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (hor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланил-2-(1'-2'-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и R1B1, который содержит три компонента, извлеченные из бактерий, монофосфориллипид А, димиколат трехалозы и скелет клеточной стенки (MPL + TDM + CWS) в 2% эмульсии сквален/твин 80.
Дополнительно можно использовать такие адьюванты, как стимулон (Cambridge Bioscience, Morcester, МА). Далее, в препаратах, не предназначенных для людей, и в исследовательских целях можно пользоваться полным адъювантом Фрейнда(ПАФ) и неполным адъювантом Фрейнда (НАФ).
Иммуногенные композиции обычно будут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, этанол и т.д. Дополнительно в число таких наполнителей могут быть включены вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие средства, буферные вещества для поддержания pH и т.п.
Типичные иммуногенные композиции готовятся в форме, пригодной для инъекций, либо как жидкий раствор, либо как эмульсия, также можно приготовить сухие формы, пригодные для растворения в жидком наполнителе с образованием раствора или суспензии перед инъекцией. Препараты также могут быть эмульгированы или инкапсулированы в липосомы для усиления адъювантного эффекта.
Иммуногенные композиции, используемые как вакцины, включают иммунологически эффективное количество полипептида ВГС, а также другие вышеупомянутые компоненты по потребности.
"Иммунологически эффективное количество" означает, что введение такого количества индивидууму либо однократно, либо как одна из нескольких последующих доз, эффективно для лечения, как определено выше. Это количество варьирует, в зависимости от здоровья и физического состояния индивидуума, которому оно вводится, таксономической группы индивидуумов, подвергающихся воздействию (например, человекообразные приматы, приматы и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени желаемой защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом, штамма ВГС, вызвавшего инфекцию и других, имеющих значение факторов.
Ожидается, что это количество будет колебаться в довольно широких пределах, которые можно определить при обычных испытаниях.
Эти самособирающиеся агрегаты E1/E2 могут также служить носителями вакцины для гетерологичных (не ВГС) гаптенов таким же образом, как поверхностный антиген гепатита В (см. европейскую патентную заявку 174.444). При таком применении агрегаты E1/E2 представляют иммуногенный носитель, способный стимулировать иммунный ответ на гаптены или антигены, конъюгированные с агрегатом.
Антиген можно конъюгировать либо обычными химическими способами, либо можно клонировать его в ген, кодирующий E1 и/или E2, с локализацией, соответствующей гидрофильной области белка.
Иммуногенные композиции принято вводить парентерально, обычно, путем подкожных или внутримышечных инъекций. Дополнительные прописи, подходящие для других способов введения, включают прописи для перорального введения и суппозиториев. Лечебная дозировка может быть введена однократно или в несколько приемов по схеме. Вакцину можно вводить в соединении с другими иммунорегулирующими средствами.
В. Примеры
Данные ниже примеры представлены в качестве дальнейшего руководства для практического специалиста и не должны рассматриваться как какие-либо ограничения изобретения.
Данные ниже примеры представлены в качестве дальнейшего руководства для практического специалиста и не должны рассматриваться как какие-либо ограничения изобретения.
ПРИМЕР 1 (Клонирование и экспрессия)
(А).
(А).
Векторы строили из плазмид, содержащих 5'-часть генома ВГС, как описано в ЕР 318.216 и ЕР 388.232. Кассета ВГС (S/B) содержит фрагмент ДНК StuI - Bgt II, кодирующий 5'-конец полипротеина от Мет1 до Лей906, начиная с нуклеотида-63, относящегося к Мет1. Сюда входят белок сердцевины (С), протеин E1 (также иногда упоминаемый как S), протеин E2 (также упоминаемый как NSI) и 5'-часть области NS2a. После экспрессии этого конструкта его разделяют протеолизом на отдельные белки С, E1 и E2.
Кассета ВГС (А/В) содержит фрагмент ДНК ApaLI-BgIII, кодирующий 5'-конец полипротеина от Мет1 до Лей906, начиная с нуклеотида-6, относящегося к Мет1. Сюда входят белок сердцевины (С), протеин E1 (также иногда упоминаемый как S), протеин E2 (также упоминаемый как NSI) и 5'-часть области NS2a.
После экспрессии этого конструкта отдельные протеины С, E1 и E2 получают протеолитической обработкой.
Кассета C-E1 (S/B) (часть StuI - BamHI) содержит 5'-конец от Мет1 до Иле340 (сайт BamHI в гене). Экспрессия этой кассеты приводит к экспрессии С и в какой-то степени усеченного E1 (E1'). Часть, срезанная с 3'-конца, является гидрофобной областью, которая считается служащей как сигнал трансляции.
Кассета NSI (В/В) (часть BamHI - BgIII содержит маленькую часть 3' от E1 (от Мет364), весь E2 и часть НС2а (до Лей906). В этом конструкторе фрагмент E1 служит транслокационным сигналом.
Кассета ТРА-NSI использует лидер активатора тканевого плазминогена человека (tPA) как транслокационный сигнал вместо 3'-части E1. Эта кассета содержит усеченную форму E2 от Гли406 до Глу661, у которой утрачен гидрофобный конец 3'.
Каждая кассета встраивается в вектор pGEM3Z (Promega) с или без синтетической бета-глобиновой некодирующей последовательности для транскрипции и трансляции in vitro, пользуясь экспрессией T7 и ретикулоцита кролика.
Векторы рекомбинантного вируса осповакцины (rVV) готовили встраиванием кассет в плазмиду pSC11 (полученную от Dr. В. Moss, NIH), после чего следует рекомбинация с вирусом осповакцины, как описано Charkrabarty et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5:3403-09.
(В).
Альтернативный экспрессирующий вектор получен путем встраивания ВГС (А/Б) в pS59 (полученную от Dr. В. Moss NIH) между сайтами StaI и SpeI с последующей рекомбинацией с вирусом осповакцины, как описано Charkrabarty et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5:3403-09.
(С).
Клетки HeLa собирали центрифугированием в течение 7 минут при 2000 об/мин при комнатной температуре в стерильных центрифужных флаконах емкостью 500 мл (ротор JA-10).
Осадки ресуспендировали в дополнительной культуральной среде (Joklik - модифицированная MEM Spenner среда + 5% лошадиной сыворотки и гентамицин) ("центрифужная среда") до окончательной концентрации 2•107 клеток/мл. Разрушенная ультразвуком неочищенная масса вируса vv/SC59 - ВГС добавлялась к множеству инфекции в 8 бляшкообразующих единиц/клетку и смесь перемешивали 30 минут при 37oC. Затем инфицированные клетки переносили в центрифужный флакон, содержащий 8 л центрифужной среды, и инкубировали в течение 3 дней при 37oC.
Затем культивированные клетки собирали центрифугированием и осадки ресуспендировали в буфере (10 мМ трис-HCL, pH 9,0, 152 мл). Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором 40 мл Dounce (50 ударов) и ядра осаждали центрифугированием (5 минут, 1600 об/мин, 4oC, ротор JA-20). Ядерные осадки ресуспендировали в трис-буфере (24 мл), регомогенизировали и снова осаждали, собирая все супернатанты.
Собранный лизат разделяли на порции в 10 мл и разрушали ультразвуком 3 х 30 минут в соникаторе в виде винного рога при средней мощности. Обработанный лизат (15 мл) наслаивали на 17 мл подушки из сахарозы (36%) в центрифужных пробирках SW 28 и центрифугировали в течение 80 минут при 13500 об/мин при 4oC для того, чтобы осадить вирус. Осадок вируса ресуспендировали в 1 мл трис-буфера (1 мМ трис-HCL, pH 9,0) и замораживали при -80oC.
ПРИМЕР 2 (Сопоставление продуктов in vitro и in vivo)
(A)
E1 и E2 экспрессировали оба in vitro и in vivo и метилы 35S-Мет применявшиеся векторы, описанные выше, в примере 1. Клетки BSC-40 и HeLa инфицировали векторами rVV для экспрессии in vivo. Питательную среду и лизаты клеток исследовали на рекомбинантные белки. Проводили иммунопреципитацию продуктов человеческой ВГС иммунной сывороткой, тогда как протеины in vitro анализировали прямым методом. Образовавшиеся белки анализировали хроматографией SDS-PAGE.
(A)
E1 и E2 экспрессировали оба in vitro и in vivo и метилы 35S-Мет применявшиеся векторы, описанные выше, в примере 1. Клетки BSC-40 и HeLa инфицировали векторами rVV для экспрессии in vivo. Питательную среду и лизаты клеток исследовали на рекомбинантные белки. Проводили иммунопреципитацию продуктов человеческой ВГС иммунной сывороткой, тогда как протеины in vitro анализировали прямым методом. Образовавшиеся белки анализировали хроматографией SDS-PAGE.
Ретикулоцитарная экспрессионная система (pGFM3Z с ВГС (S/B) или ВГС (А/В) продуцировала протеины С, E1 и E2 с молекулярной массой приблизительно 18 кД, 35 кД и 72 кД соответственно. Лизаты клеток BSC-40 и HeLa, после трансфекции rVV, содержащим ВГС (S/B), ВГС (А/В) или C-E1 (S/B) давали те же самые протеины. Из-за того, что ретикулоцитарная система не обеспечивает эффективного процессирования в аппарате Гольджи и поэтому не предоставляет сиаловую кислоту, то продукты, как полученные in vitro, так и полученные in vivo, проявляют одинаковую подвижность, наводит на мысль, что протеины не сиализируют in vitro. Только вектор rVV, содержащий TPA-NSI, вызывает какую-то внеклеточную секрецию E2 с измененной подвижностью, соответствующей сиалилированию.
(В)
ВГС (S/B) экспрессировали in vitro и инкубировали с набором биотинилированных лектинов: GNA, SNA, PNA, WGA и КонА.
ВГС (S/B) экспрессировали in vitro и инкубировали с набором биотинилированных лектинов: GNA, SNA, PNA, WGA и КонА.
После инкубации комплексы собирали на авидин-акриловых шариках, промывали, элюировали буфером Лэмли для образца и анализировали хроматографией SDS-PAGE. Результаты показали, что E1 и E2 фиксированы на GNA и КонА, что указывает на наличие маннозы. GNA связывается с терминальными маннозными группами, тогда как КонА связывается с любой альфа-связанной маннозой. Отсутствие связывания с SNA, PNA и WGA указывается, что ни один из белков не содержит сиаловую кислоту, галактоза-N-ацетилгалактозамин или N-ацетилглюкозамин.
(С)
E1 и E2 с радиоактивной меткой получали в клетках BSC - 40 путем инфицирования rVV, содержащим ВГС (S/B) (vv/SC11-ВГС) и производили иммунопреципитацию человеческой ВГС+ иммунной сывороткой. Половину осажденного материала обрабатывали нейраминидазой в течение ночи, чтобы удалить любую сиаловую кислоту.
E1 и E2 с радиоактивной меткой получали в клетках BSC - 40 путем инфицирования rVV, содержащим ВГС (S/B) (vv/SC11-ВГС) и производили иммунопреципитацию человеческой ВГС+ иммунной сывороткой. Половину осажденного материала обрабатывали нейраминидазой в течение ночи, чтобы удалить любую сиаловую кислоту.
После обработки обработанные и необработанные протеины анализировали хроматографией SDS-PAGE. Не наблюдалось значительного различия в подвижности, что указывает на отсутствие сиализирования in vivo.
(D)
E1 и E2 с радиоактивной меткой получали в клетках BSC-40 путем инфицирования rVV, содержащим ВГС (А/В) (vv/S С 59-ВГС), и производили либо иммунопреципитацию ВГС+ сывороткой человека, либо осаждали биотинилированным лектином GNA, связанным с акриловыми шариками, используя vv/S 11, свободный от ВГС последовательностей, в качестве контроля. Преципитаты исследовали хроматографией SDS-PAGE. Данные показали, что E1 и E2 были главными разновидностями протеинов с маннозным окончанием в vv/SC 59-ВГС инфицированных клетках. GNA также эффективно, как антисыворотка человека, осаждал E1 и E2 из среды культуры клеток. Наблюдался компонент в 25 кД, но он казался специфическим для клеток, инфицированных вирусом осповакцины.
E1 и E2 с радиоактивной меткой получали в клетках BSC-40 путем инфицирования rVV, содержащим ВГС (А/В) (vv/S С 59-ВГС), и производили либо иммунопреципитацию ВГС+ сывороткой человека, либо осаждали биотинилированным лектином GNA, связанным с акриловыми шариками, используя vv/S 11, свободный от ВГС последовательностей, в качестве контроля. Преципитаты исследовали хроматографией SDS-PAGE. Данные показали, что E1 и E2 были главными разновидностями протеинов с маннозным окончанием в vv/SC 59-ВГС инфицированных клетках. GNA также эффективно, как антисыворотка человека, осаждал E1 и E2 из среды культуры клеток. Наблюдался компонент в 25 кД, но он казался специфическим для клеток, инфицированных вирусом осповакцины.
ПРИМЕР 3 (Очистка при помощи лектина)
(А)
В клетки HeLa инокулировали массу очищенного vv/SC 59-ВГС вируса с высоким титром при множестве инфекции в 5 бляшкообразующих единиц/клетку и смесь перемешивали 30 минут при 37oC. Затем инфицированные клетки переносили в центрифужный флакон, содержащий 8 л центрифужной среды и инкубировали 3 дня при 37oC. Клетки снова собирали центрифугированием и ресуспендировали в гипотоническом буфере (20 мМ HEPES, 10 мМ NaCI, 1 мМ MgCl2, 120 мл) на льду. Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором Dounce (50 ударов) и ядра осаждали центрифугированием (5 минут, 1600 об/мин, 4oC, ротор JA-20). Осадки собирали, ресуспендировали в 48 мл гипотонического буфера, повторно регомогенизировали, центрифугировали, снова собирали и замораживали при -80oC.
(А)
В клетки HeLa инокулировали массу очищенного vv/SC 59-ВГС вируса с высоким титром при множестве инфекции в 5 бляшкообразующих единиц/клетку и смесь перемешивали 30 минут при 37oC. Затем инфицированные клетки переносили в центрифужный флакон, содержащий 8 л центрифужной среды и инкубировали 3 дня при 37oC. Клетки снова собирали центрифугированием и ресуспендировали в гипотоническом буфере (20 мМ HEPES, 10 мМ NaCI, 1 мМ MgCl2, 120 мл) на льду. Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором Dounce (50 ударов) и ядра осаждали центрифугированием (5 минут, 1600 об/мин, 4oC, ротор JA-20). Осадки собирали, ресуспендировали в 48 мл гипотонического буфера, повторно регомогенизировали, центрифугировали, снова собирали и замораживали при -80oC.
Затем замороженные супернатанты размораживали и фракцию микросомальных мембран из пост-нуклеарного лизата изолировали центрифугированием в течение 20 минут в роторе JA-20 при 13500 об/мин при 4oC. Супернатант удаляли отсасыванием.
Осадки взбалтывали в 96 мл детергентного буфера (20 мМ трис-HCI, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ DDT, 0,5% тритон-X-100, pH 7,5) и гомогенизировали (50 ударов). Продукт осветляли центрифугированием в течение 20 минут при 13500 об/мин 4oC и собирали супернатанты.
Колонка с GNA-агарозой (1 см х 3 см, 3 мг GNA/ мл шариков, 6 мл объем сорбента, Vector Lals, Burlingame, CA) предварительно уравновешивалась детергентным буфером. Образец супернатанта вносили в колонку с рециркуляцией при скорости тока 1 мл/мин в течение 16-20 часов при 4oC. Затем колонку промывали детергентным буфером.
Очищенные протеины E1/E2 элюировали альфа-D-маннозидом (0,9 М в детергентном буфере) при скорости тока 0,5 мл/мин. Элюцию останавливали при появлении E1/E2 в элюенте и давали колонке вновь уравновеситься в течение 2-3 часов. Фракции анализировали вестерн-блоттированием и окраской серебром. Пиковые фракции собирали вместе и облучали УФ для инактивации любых остатков вируса осповакцины.
(В)
Асиалогликопротеины E1 и E2, очищенные GNA-агарозой, подвергали седиментации в 20-60% глицерине. Градиенты разделяли и анализировали протеины методами SDS-PAGE и вестерн-блоттированием. Пятна зондировали GNA для идентификации E1 и E2.
Асиалогликопротеины E1 и E2, очищенные GNA-агарозой, подвергали седиментации в 20-60% глицерине. Градиенты разделяли и анализировали протеины методами SDS-PAGE и вестерн-блоттированием. Пятна зондировали GNA для идентификации E1 и E2.
Результаты указывают на присутствие гетеродимера E1:E2, осаждающегося с ожидаемой скоростью (т.е. позиция, характерная для протеина в 110 кД). Также появляются более крупные агрегаты протеинов оболочки ВГС. Также появлялись E2: E2 гомодимеры. Казалось, что E2 преобладал над E1 в более крупных разновидностях, хотя отдельные разновидности E1:E2 также выявлялись.
Более крупные агрегаты осаждались значительно скорее, чем тиреоглобулиновый маркер.
(С)
E1 и E2, очищенные GNA-агарозой, осаждали в градиенте 20-60% глицерина с 1 мМ EDTA. Фракции анализировали SDS-PAGE с и без бета-меркаптоэтанола (ME). Количество E1 и E2 почти не зависело от присутствия ME, что указывало на отсутствие дисульфидных связей между гетеродимерами.
E1 и E2, очищенные GNA-агарозой, осаждали в градиенте 20-60% глицерина с 1 мМ EDTA. Фракции анализировали SDS-PAGE с и без бета-меркаптоэтанола (ME). Количество E1 и E2 почти не зависело от присутствия ME, что указывало на отсутствие дисульфидных связей между гетеродимерами.
(D)
Комплексы E1/E2 (приблизительно 40% чистоты) анализировали на Coulter DM-4 анализаторе субмикронных частиц. Обнаружен материал в диапазоне 20-60 нм.
Комплексы E1/E2 (приблизительно 40% чистоты) анализировали на Coulter DM-4 анализаторе субмикронных частиц. Обнаружен материал в диапазоне 20-60 нм.
(Е)
Комплексы E1/E2 (очищенные приблизительно на 40%) исследовали под электронным микроскопом с негативным контрастированием фосфорно-вольфрамовой кислотой.
Комплексы E1/E2 (очищенные приблизительно на 40%) исследовали под электронным микроскопом с негативным контрастированием фосфорно-вольфрамовой кислотой.
На электронных микрограммах выявлено присутствие частиц сферической формы диаметром около 40 нм. Комплексы E1/E2 инкубировали с ВГС + иммунной сывороткой человека, потом исследовали под ЭМ с негативным контрастированием. Наблюдались комплексы антител, содержащие крупные агрегаты и более мелкие частицы.
ПРИМЕР 4 (Хроматографическая очистка)
(А)
Очищенный лектином GNA материал, приготовленный, как описано в примере 3 (0,5-0,8 мл), разводили в 10 раз буфером А (20 мМ трис-Cl буфер, pH 8,0; 1 мМ EDTA) и наносили на колонку Fractogel EMD DEAE-650 1,8 х 1,5 см (ЕМ Separations, Gibbstown, New Jersey, каталожный N 16883), уравновешенную в буфере А.
(А)
Очищенный лектином GNA материал, приготовленный, как описано в примере 3 (0,5-0,8 мл), разводили в 10 раз буфером А (20 мМ трис-Cl буфер, pH 8,0; 1 мМ EDTA) и наносили на колонку Fractogel EMD DEAE-650 1,8 х 1,5 см (ЕМ Separations, Gibbstown, New Jersey, каталожный N 16883), уравновешенную в буфере А.
Фракцию протеина, содержащую E1/E2, элюировали тем же буфером со скоростью 0,2 мл/мин и собирали 1 мл фракций. Фракции, содержащие E1 и E2 (определенные по SDS-PAGE), соединяли и хранили при -80oC.
(В)
Материал, очищенный вышеуказанным способом (А) по результатам SDS-PAGE, был очищен на 60-80%. Идентификация полос предполагаемых E1 и E2 подтверждалась анализом N-терминальной последовательности после осуществления методики переноса. Для этого материал E1/E2, очищенный Fractogel-DEAE, восстанавливали добавлением буфера Ламмли (pH 6,8, 0,06 М трис-Cl, 2,3% SDS, 10% глицерина, 0,72 М бета-меркаптоэтанола) и кипятили 3 минуты. Затем пробу загружали в 10% полиакриламидный гель.
Материал, очищенный вышеуказанным способом (А) по результатам SDS-PAGE, был очищен на 60-80%. Идентификация полос предполагаемых E1 и E2 подтверждалась анализом N-терминальной последовательности после осуществления методики переноса. Для этого материал E1/E2, очищенный Fractogel-DEAE, восстанавливали добавлением буфера Ламмли (pH 6,8, 0,06 М трис-Cl, 2,3% SDS, 10% глицерина, 0,72 М бета-меркаптоэтанола) и кипятили 3 минуты. Затем пробу загружали в 10% полиакриламидный гель.
После хроматографии SDS-PAGE протеин переносили на 0,2 мкм мембрану из поливинилиден-дифторида (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Полоски, соответствующие предполагаемым протеинам E1 и E2, вырезали из пятна и подвергали N-терминальному аминокислотному анализу, хотя при приготовлении материала не предпринимали особых мер для предотвращения аминотерминального блокирования. Первые 15 циклов показали, что образец E1 имеет последовательность: Тир-Глн-Вал- Арг-Х-Сер-Тре-Гли-Х-Тир-Гис-Вал-Х-Асн-Асп, тогда как последовательность E2 была: Тре-Гис-Вал-Тре-Гли-Х-Х-Ала-Гли-Гис-Х- Вал-Х-Гли-Фен. Эти данные определения аминокислотной последовательности согласуются с тем, что ожидалось по соответствующим последовательностям ДНК.
Продукт E1/E2, очищенный, как описано выше, хроматографией Fractogel-DEDE, считается агрегированным на том основании, что большое количество E1 и E2 совместно элюируют в область свободного объема хроматографической колонки гель-фильтрации Bio-Sil TSK-4000 SW. Это указывает, что в естественных условиях значительное количество комплекса E1/E2 имеет молекулярную массу не менее 800 кД. Также наблюдалось присутствие материала E1/E2 с молекулярной массой около 650 кД.
Claims (6)
1. Асиалогликопротеин вируса гепатита С (HCV), выбираемый из группы, включающей усеченный гликопротеин, экспрессируемый из El-района HCV, который содержит делецию в части последовательности, обнаруженной в области, покрывающей аминокислоты 330-380 El-района, пронумерованного от начала полипротеина HCV, и усеченного гликопротеина, экспрессируемого из Е2-района HCV, содержащего делецию в части последовательности, обнаруженной в области, покрывающей аминокислоты 660-830 Е2-района, пронумерованного от начала полипротеина HCV.
2. Асиалогликопротеин по п.1, отличающийся тем, что упомянутый усеченный гликопротеин экспрессируется из E1-района HCV и содержит делецию в части последовательности, обнаруженной в области, покрывающей аминокислоты 330-380 E1-района, пронумерованного от начала полипротеина HCV.
3. Асиалогликопротеин по п.1, отличающийся тем, что упомянутый усеченный гликопротеин экспрессируется из Е2-района HCV и содержит делецию в части последовательности, обнаруженной в области, покрывающей аминокислоты 660-830 Е2-района, пронумерованного от начала полипротеина HCV.
4. Иммуногенная композиция для диагностики, лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С, содержащая асиалогликопротеин вируса гепатита С (HCV) по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.
5. Способ индукции иммунного ответа антигеном у животного, включающий стадии: получения композиции, содержащей эффективное количество иммуногенной субстанции в фармацевтически приемлемом носителе; и введения упомянутой композиции упомянутому животному, отличающийся тем, что иммуногенная субстанция содержит асиалогликопротеин HCV по любому из пп.1-3.
6. Способ иммуноанализа для выявления в биологическом образце антител к HCV, включающий получение биологического образца, получение полипептидного реагента, реакцию биологического образца с полипептидным реагентом при условиях, обеспечивающих образование комплексов антиген-антитело и определение образования комплекса антиген-антитело, содержащего упомянутый полипептидный реагент, отличающийся тем, что в качестве полипептидного реагента используют композицию по п.4.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61141990A | 1990-11-08 | 1990-11-08 | |
| US611,419 | 1990-11-08 | ||
| US611.419 | 1990-11-08 | ||
| US611,965 | 1990-11-08 | ||
| US758,880 | 1991-09-13 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU93043621A Division RU2123528C1 (ru) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Способ получения белков hcv, пригодных для использования в вакцине или иммуноанализе, асиалогликопротеин (варианты), композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе (варианты), способ очистки асиалогликопротеина и способ понижения содержания или элиминации hcv |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97115378A RU97115378A (ru) | 1999-10-27 |
| RU2175657C2 true RU2175657C2 (ru) | 2001-11-10 |
Family
ID=24448944
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97115378A RU2175657C2 (ru) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа |
| RU93043621A RU2123528C1 (ru) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Способ получения белков hcv, пригодных для использования в вакцине или иммуноанализе, асиалогликопротеин (варианты), композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе (варианты), способ очистки асиалогликопротеина и способ понижения содержания или элиминации hcv |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU93043621A RU2123528C1 (ru) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Способ получения белков hcv, пригодных для использования в вакцине или иммуноанализе, асиалогликопротеин (варианты), композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе (варианты), способ очистки асиалогликопротеина и способ понижения содержания или элиминации hcv |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| IE (1) | IE20060502A1 (ru) |
| RU (2) | RU2175657C2 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2424794C1 (ru) * | 2009-12-30 | 2011-07-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО УГМА Росздрава) | Способ лечения врожденного гепатита с у детей первого года жизни |
| RU2429877C1 (ru) * | 2010-06-30 | 2011-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ИНГИЛС" | Способ лечения хронического вирусного гепатита с |
| RU2440128C1 (ru) * | 2010-05-17 | 2012-01-20 | Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава) | Способ комплексной патогенетической терапии острых форм вирусного гепатита в и микст-гепатитов (в+с, в+d, в+с+d) |
| CN103063840A (zh) * | 2011-10-18 | 2013-04-24 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种细胞靶点肝x受体在制备治疗丙型肝炎病毒药物中的应用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU765940B2 (en) * | 1998-06-24 | 2003-10-02 | Innogenetics N.V. | Particles of HCV envelope proteins: use for vaccination |
| RU2178806C2 (ru) * | 2000-01-21 | 2002-01-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHSVD1, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ФРАГМЕНТА ГЕНА US6 ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 1-ГО ТИПА, КОДИРУЮЩЕГО ИММУНОДОМИНАНТНУЮ ЧАСТЬ ГЛИКОПРОТЕИНА D (gD) HSV-1, В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHЕRICHIA COLI |
| RU2747822C2 (ru) * | 2016-03-14 | 2021-05-14 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Олигонуклеотиды для понижения экспрессии pd-l1 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4401647A (en) * | 1980-03-03 | 1983-08-30 | The Regents Of The University Of Ca | Radiolabeled neoglycopeptides |
-
1991
- 1991-11-07 RU RU97115378A patent/RU2175657C2/ru active
- 1991-11-07 RU RU93043621A patent/RU2123528C1/ru active
- 1991-11-08 IE IE20060502A patent/IE20060502A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2424794C1 (ru) * | 2009-12-30 | 2011-07-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО УГМА Росздрава) | Способ лечения врожденного гепатита с у детей первого года жизни |
| RU2440128C1 (ru) * | 2010-05-17 | 2012-01-20 | Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава) | Способ комплексной патогенетической терапии острых форм вирусного гепатита в и микст-гепатитов (в+с, в+d, в+с+d) |
| RU2429877C1 (ru) * | 2010-06-30 | 2011-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ИНГИЛС" | Способ лечения хронического вирусного гепатита с |
| CN103063840A (zh) * | 2011-10-18 | 2013-04-24 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种细胞靶点肝x受体在制备治疗丙型肝炎病毒药物中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2123528C1 (ru) | 1998-12-20 |
| IE20060502A1 (en) | 2006-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6274148B1 (en) | Hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| EP0842947B1 (en) | Hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| RU2175657C2 (ru) | Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа | |
| EP1471073B1 (en) | Hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| JP2945759B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 | |
| IE84479B1 (en) | Hepatitis C Virus Asialoglycoproteins | |
| CZ289923B6 (cs) | Hepatitis C virový, zkrácený asialoglykoprotein, farmaceutická kompozice s jeho obsahem a jeho pouľití |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |