CZ290477B6 - Monoklonální protilátka nebo její fragment, její aminokyselinové sekvence a polypeptid je obsahující, buněčná linie schopná ji produkovat, způsob její přípravy a farmaceutický prostředek ji obsahující - Google Patents

Abstract

Monoklon ln protil tka nebo jej fragment, kter m n sleduj c vlastnosti - reaguje pouze s .alfa.V-°et zcem lidsk ho .alfa.V-integrinu, - blokuje vazbu na integrinov² substr t .alfa.V-integrin nesouc bu ku, - spou t reverzaci zaveden interakce bun n matrice zp sobenou .alfa.V-integrinem, - blokuje v²voj n dor , - je prost cytotoxick²ch · ink a - obsahuje aminokyselinov sekvence ·sek z kladn struktury a komplementaritu ur uj c ch ·sek lehk ho °et zce od pozice 21 do pozice 127 podle obr. 17a a t k ho °et zce od pozice 20 do pozice 137 podle obr. 17b. Linie bun k hybridomu, schopn produkovat tuto monoklon ln protil tku a aminokyselinov sekvence, kter tato linie obsahuje. Polypeptid sest vaj c z t chto aminokyselinov²ch sekvenc . Zp sob p° pravy monoklon ln protil tky a farmaceutick² prost°edek, kter² ji obsahuje.\

Description

Vynález se týká monoklonální protilátky a linie buněk hybridomu produkujících tuto protilátku.

Kromě toho se vynález týká buněk hybridomu vytvářející monoklonální protilátku s označením 272-17E6 a uložené pod číslem uložení DSM ACC2160 i monoklonální protilátky mající shora uvedené vlastnosti a kterou lze získat uvedenou linií buněk hybridomu.

Kromě toho se vynález týká sekvencí DNA a sekvencí aminokyselin. Sekvence DNA kódují protilátku nebo její části. Sekvence jsou uvedeny na obr. 17a a 17b a v připojeném sekvenčním protokolu.

Konečně se vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího uvedenou protilátku jako účinnou složku.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou superrodinou receptorů s adhezí k povrchu buněk, které řídí vazbu buněk s pevným extracelulárním okolím-jak s extracelulámí matricí (ECM), tak s ostatními buňkami. Adheze má pro buňku základní význam; zajišťuje ukotvení, klíč pro migraci a signály pro růst a diferenciaci. Integriny se účastní přímo četných normálních a patologických stavů a jako takové jsou prvořadým cílem po terapeutické zásahy. Integriny jsou integrální transmembránové proteiny, heterodimery, jejichž vazebná specifičnost závisí na tom, který z asi 14 α-řetězců je zkombinován se kterým z několika 8 β-řetězců. Integriny se člení do čtyř navzájem se překrývajících podskupin obsahujících řetězce βΐ, β2, β3 nebo aV a určitá buňka může expresovat několik různých integrinů a každé podskupiny. V posledním desetiletí se ukázalo, že integriny jsou hlavními receptory podílejícími se na adhezi buněk. Zprávy týkající se integrinů, popsal například E. Ruoslahti (j. Clin. Invest., 1991, str. 87) a R. O. Hyneš (Cell, 1992, str. 69), přičemž integriny mohou být vhodnými cíly terapeutického zásahu.

S výjimkou erythrocytů expresují všechny lidské buňky jeden nebo několik integrinů. Jejich funkce jsou regulovány v mnoha hladinách, avšak primárně závisí jejich ligandová specifičnost na tom, který α-řetězec asociuje se kterým β-řetězcem v heterodimeru a na aktivačním stavu integrinů (Hyneš, 1992, Diamond a Springer, 1994). Buněčný základ, na němž integriny operují (Chán a Hemler, 1993) a varianta sestřihu, ze které je integrin použit (Delwel a kol., 1993) může specifičnost rovněž ovlivňovat. Za těchto daných komplexností, jedna z mála spolehlivých indikací specificity integrinů, je přímo rozrušovat integrinovou funkci a analyzovat, které buněčné odezvy jsou ovlivněny. Historie výzkumu integrinů ukazuje, že reakční činidla, která mohou specificky blokovat integrinovou funkci jsou rozhodujícími činiteli ve funkční analýze, od funkce blokovat CSAT-protilátky, která první definovala integrinový βΐ-řetězec (Neff a kol., 1982) až po četné významné pozdější příklady (například P1D6, PlB5[Wayner a Carter, 1987], P4C10 [Carter a kol., 1990], AIIB2 [Halí a kol., 1990], 3A3 [Turner a kol., 1989], GOH3 [Sonnenberg a kol., 1987] a LM609 [Cheresh a Spiro, 1987]): oblast je absolutně závislé na takových reakčních činidlech.

aV-Serie integrinů jsou nyní považovány na nadřízenou subrodinu jak s klasickými, tak s novými funkcemi. Stejně jako klasické zprostředkujíc vázání a prodlužování (Pytela a kol., 1985; Cheresh, 1991) se aV-integriny podílejí v lokomoci (Seftor a kol., 1992), receptorové

-1 CZ 290477 B6 intemalizaci (Panetti a McKeown Longo, 1993a; Panetti a McKeown Longo, 1993b), jako virové koreceptory (Wickhem a kol., 1993), při řízení extracelulárních proteázových kaskád a jako regulátory progrese nádorů (Feding-Habermann a kol., 1992). Specifičnosti pěti známých aV-sérií integrinů, ανβΐ (Zhang a kol., 1993) -β3 (Pytela a kol., 1985; Cheresh a kol., 1987), -β5 (Cheresh a kol. 1989), -β6 (Busk a kol., 1992) a -β8 (Moyle a kol., 1987) byla částečně definována a jeví se, že výlučně rozeznávají ligandy nesoucí RGD-fNHi-arginin-glycinasparagová kyselina-COOH) tripeptidové sekvence, včetně sekvencí ve vitronektinu (ανβΐ, ανβ3, ανβ5), ve fibronektinu (ανβΐ, ανβ3, ανβ5, ανβ6), a νοη Wilebrandova faktoru, fibrinogenu a osteopontinu (ανβ3) (například 1991; Busk a kol., 1992; Zhang akol., 1993; Denhardt a Guo, 1993; Smith a Cheresh, 1990). Dimery s podobnými specifičnostmi mohou být koepresovány na téže buňce (například ανβΐ a ανβ5 pro vitronektin na M21 buňkách) (Wayner akol., 1991) mohou však řídit nezávislé funkce. Avšak překrývající se ligandové specificity v rámci samotné αν rodiny a také mezi αν a βΐ řadami integrinů znamenají, že určení funkce na definovaný receptor v rámci určité buněčné oblasti je problematické. Funkce blokování protilátek je nezbytná pro objasnění funkce ανβ3 (Cheresh a Spiro 1987; Chuntharapai a kol., 1993) a ανβ5 (Wayner a kol., 1991). Avšak pro jiné αν integriny nejsou známy žádné protilátky, které specifikují komplex a rozrušují funkci. Zvláště je málo reakčních činidel, která specifikují aV řetězec komplexu a jsou schopna narušit funkci integrinů celé rodiny. Lehmann a kol. (1994) popisuje ανβχ protilátku, která nevykazuje reverzní buněčnou matricovou interakci a žádnou aktivitu blokující vývoj nádoru.

Proto je trvalý zájem o vývoj funkce aV-série integrigů v souvislosti s vývojem nádorů. Lidský maligní melanom se stává převážnou agresivní rakovinou kůže. Zvýšené hladiny integrinů α2β1 (Daanen a kol., 1993; Etoh a kol., 1992)a α3β1 (Natali a kol., 1993, Yoshinaga a kol., 1993) α4β1 (Hart a kol., 1991) a αόβΐ (Hart a kol., 1991) se vždy podílejí na progresi melanomu avšak z integrinů se nej konzistentněji podílejí integriny αν řady. Obzvláště jak invaze z primárního nádoru tak vzdálené metastázy jsou histologicky charakterizovány zvýšenou expresí ανβ3 integrinů „vitronektinového receptoru“. Primárně neinvazní nádory a nemaligní melanotický nevi expresují málo zjistitelný ανβ3, což je receptor vzácný ve zralé dospělé tkáni (Brooks a kol. 1994; Buck a kol. 1990; Pignatelli a kol., 1992; Lessey a kol., 1992; Korhonen a kol., 1991; Nesbitt a kol., 1993). Imunohistochemie nádorů metastáz dokládají postupný nárůst ανβ3 s invasním stadiem (Albelda a kol., 1990; Si a Hersey 1994), skríning řad melanomu rovnoměrně vykazuje vysokou expresi integrinů αν serie (Sanders a kol., 1992; Gehlsen a kol., 1992; Marshall a kol. 1991) a kromě toho krevní kapiláry expresují ανβ3 v průběhu angiogeneze nádoru (Brooks a kol., 1994).

Studie in vivo rovněž prokazují ανβ3 ve vývoji melanomu. V myším B16-F10 systému malanomu se mohou experimentální metastázy plic potlačit vysokými hladinami RGD-peptidů (Hardan a kol., 1993; Humphries a kol., 1986), což jsou mocné blokátory αν integrinové funkce. Nejnověji Felding-Habermann a kol. doložili, že αν série integrinů podporují růst subkutánního nádoru M21 lidského melanomu u myší s oslabenou imunity. Systém M21 je elegantní a sestává ze sledu buněk expresujících různé integriny α V série (Kieffer a kol., 1991; Felding-Habermann a kol., 1992; Cheresh a Spiro, 1987). Mateřský M21 expresuje ανβ3 a ανβ5 (Wayner a kol., 1991): váže se na vitronektin a roste jako subkutánní nádor. Somatický variant M21, M21-L nevykazuje žádný zjistitelný α V (Cheresh a Spiro, 1987): nemůže vázat vitronektin a vyvíjí pomalu rostoucí nádory. M21-L4 je transfektant M21-L, stabilně reexpresující aV-řetězec plné délky: váže vitronektin a rychle roste jako subkutánní nádor (Felding-Habermann a kol., 1992). Proto přítomnost buněčných povrchových αν-integrinů má přímý vztah kM21 subkutánnímu růstu.

Avšak M21 byly podrobeny extrémním selekčním tlakům v průběhu zavedení variantních linií M21-L a M21-L4. Podle vynálezu se zjistilo, že αν-integrinová funkce na nativní populaci M21 se může blokovat a že lze zjistit překvapivý účinek na chování buňky a na vývoj nádoru.

-2CZ 290477 B6

Peptidické antagonisty se mohou snadno syntetizovat, jejich použití je však omezeno pro jejich špatnou biologickou dostupnost, krátký poločas in vivo a rychlé vylučování živočichy (Humphries a kol., 1988). Syngenické protilátky nabízejí zajímavou alternativu za peptidy. Mají in vivo dlouhý poločas (Tao a Morrison, 1989, Haba a kol., 1985) a jejich vazebná specificita se může snadno doložit o sobě známými způsoby, naneštěstí jakkoliv jsou vynikají aV-specifické protilátky jako LM142 (Cheresh a Spiro, 1987),je málo protilátek, které účinně blokují aV-integrinové funkce.

O specificitě a biologické funkci členů rodiny αν bylo mnohokrát pojednáno, především z důvodu neexistujících reakčních činidel, která by rychle vyřadila z funkce celou třídu - neexistuje žádná mocná protilátka blokující αν. Objev, že klasické receptory adhese rodiny integrinů podporují jiné málo obvyklé biologické funkce zintenzivnil výzkum jejich molekulárních mechanismů působení. Výzkum objevil některé nepředpověditelné oblasti integrinů, které alostericky popisují jejich aktivační stav nebo při ligaci mohou aktivovat integrinovou funkci. Inhibitory integrinové funkce na rozdíl od toho obecně okludují aktivní místo, přičemž klasickým příkladem jsou RGD-peptidy, které replikují poznání integrinového místa četných ligandů sérií αν a α5β1.

Podstata vynálezu

Monoklonální protilátka podle vynálezu má následující vlastnosti:

- reaguje pouze s aV-řetězcem lidských aV-integrinů,

- blokuje vazbu na integrinový substrát nesoucích aV-integrin,

- spouští reverzaci zavedené interakce matrice buněk způsobenou aV-integrinem,

- blokuje vývoj nádorů,

- je prostá cytotoxických účinků a

- blokuje vývoj nádorů,

- je prostá cytotoxických účinků a

- obsahuje aminokyselinové sekvence úseků základní struktury a komplementaritu určujících úseků lehkého řetězce od pozice 21 do pozice 127 podle obr. 17a a těžkého řetězce od pozice 20 do pozice 137 podle obr. 17b.

Integrovaným substrátem monoklonální protilátky podle vynálezu je vitronektin, fibrinogen nebo fibronektin.

Nádorem, jehož růst buněk má monoklonální protilátky podle vynálezu blokovat, je melanom.

Monoklonální protilátka podle vynálezu je produkovaná linií buněk hybridomu označení 272-17E6 a uložené pod objednacím číslem DSM ACC2160. Tato linie buněk obsahuje aminokyselinové sekvence úseků základní struktury a komplementaritu určující úseky lehkého řetězce od poloh 21-127 aminokyselin 1-107 SEQ ID Č:1 podle obr. 17a a těžkého řetězce od poloh 20-137 aminokyselin 1-118 sekvence SEQ ID Č:9 podle obr. 17b.

Vynález se také týká polypeptidů sestávajících z uvedených aminokyselinových sekvencí.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahuje monoklonální protilátku podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Způsob přípravy monoklonální protilátky spočívá podle vynálezu v tom, že se imunizuje myš čištěným ανβ integrinem, selektují se klony vážící se na čištěný ανβ receptor prostřednictvím ELISA a produkuje se buněčná linie produkující protilátku.

Nebo se imunizuje myš čištěným vitronektinem, selektují se klony vážící se na čištěný vitronektinový receptor prostřednictvím ELISA a produkuje se buněčná linie produkující protilátku.

Vynález tedy popisuje takovou novou protilátku blokující funkci zaměřenou proti lidskému αν integrinovému řetězci, která se označuje jako 17E6. V čestných zprávách se pojednávalo o ireversibilní povaze interakce mezi ανβ3 a jeho ligandem, například vitronektinem. Zjistilo se, že 17E6 rychle spouští změnu své tak zvané ireversibilní interakce mezi integriny sérií αν a jejich substráty, což naznačuje terapeutické použití, vynález analyzuje mechanismus působení 17E6 a zjišťuje, že je mimořádně chabým kompetitorem pro ligandovou vazbu k ανβ3, zatímco vitronektin a vzorky aktivních míst na bázi RGD vykazují silnou vzájemnou kompetici na receptoru. A jiné protilátky se silně ucházejí o 17E6. Proto 17E6 působí jakožto allosterický inhibitor. Pokusy se sesítěním dokládají, že ανβ3 avšak nikoliv ανβΐ nebo ανβ5 potřebuje být dimerován než může blokovat 17E6. Tento objev ukazuje, že 17E6 funguje novým mechanismem zahrnujícím manipulaci integrinem navozených signálních transdukčních drah.

Protilátka podle vynálezu blokuje vývoj nádorů, přičemž však nemá cytotoxické působení.

Obecné poznatky, materiály, obrázky, tabulky a zkratky

Mikroorganismy, buněčné řady, plazmidy, fagenidy, promotory, signální znaky resistence, replikační počátky nebo jiné fragmenty vektorů, které jsou zde zmiňovány, jsou normálně obchodně nebo jinak obecně dostupné. V některých případech nejsou shora uváděné materiály přímo koupitelné. Používá se jich však pouze jako příkladů za účelem doložení vlastností nebo působení na objekty vynálezu a nejsou tedy podstatné pro realizaci vynálezu. Mohou být nahrazeny zpravidla jinými obecně dostupnými látkami a biologickými materiály.

Monoklonální protilátkou 17E6 je protilátka, která se produkuje buněčnou řadou hybridoma mající označení 272-17E6. Buněčná řada je uložena pod objednacím číslem DSM ACC2160 ve sbírce mikroorganismů Deutsche Sammlung Fůr Mikroorganismen, Brauschweig, Německo.

Techniky a způsoby, které jsou pro vynález podstatné jsou v popisné části podrobně popsány. Jiné techniky, které podrobně popsány nejsou odpovídají obecným o sobě známým způsobům, které pracovníci v oboru dobře znají nebo které jsou podrobně popsány v odkazech na patentovou a obecnou technickou literaturu.

DNA a aminokyselinové sekvence, zahrnují také mírně obměněné nebo modifikované sekvence, jako mutanty a varianty, které se mohou získat záměrně nebo náhodně chemickými nebo fyzikálními procesy. Obecně jsou zahrnuty všechny takové mutanty a varianty, které vykazují popsané vlastnosti a funkce.

Výraz protilátka zahrnuje také fragmenty protilátky, například Fab', (ab')₂ nebo jednořetězcové Fv. Tyto fragmenty se mohou produkovat o sobě známými způsoby.

-4CZ 290477 B6

Používané zkratky mají následující význam:

allbp3 ανβΐ ανβ3 ανβ5 ανβ6 ανβ8 10G2 14.18 G2a 14D9.F8 14Ε2 17Ε6 20Α9 23G5 3Α3 integrin integrin integrin integrin integrin integrin Mab Mab Mab Mab Mab Mab Mab Mab

9.2.27 Mab

ADCC protilátkově zaměněná buněčná cytotoxicita

AECM protilátka a efektor buněčně závislé cytostatis

A1IB2 Mab

AP3 ATCC B16F10 CP8 CSAT cRGDfV cRGDfK EMM31

Mab Americká sbírka typů kultur buněčná linie Mab Mab cyklický peptid: Arg-Gly-Asp-DPhe-Val cyklický peptid: Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys buněčná linie

GOH3 Mab

GRGDSPK

LM142

LM609

M21

M21-L M21-L-IIb M21-L4

MAb

MTT NBT-BCIP

NP18

OG

P1D6

P1H6

P4C10

P5H9

PMSF

RGD SDS-PAGE UCLAP-3 peptid: Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-pro-Lys

Mab

Mab buněčná linie buněčná linie buněčná linie buněčná linie monoklonální protilátka 3-(4,5-dimethyltziazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbiomid nitro modř tetrazoliumbromchlorindolylfosfát buněčná linie oktylglukosid-(detergent)

Mab

Mab

Mab

Mab fenylmethylsulfbnylfluorid peptid: NH₂-Arginin-glycin-asparagová kyseliny-COOH sodiumdodecylsulfátpolyakrylamidová gelová elektroforesa buněčná linie

WM164

WM793

V+B2 buněčná linie buněčná linie buněčná linie

Vysvětlení tabulek

Tabulka I

Protilátky jsou porovnávány v ELISA a buněčné ELISA. O rekreačních činidlech a specificitách je plně pojednáno v popise. Symbol „+ znamená positivní reakci žádnou reakci.

Klíč: Protilátka. Protilátky charakterizované v této studii (podtržené), standardní reagencie (vytisknuté kurzivou).Imunogen: ανβ3 = imobilizovaný lidský placentální integrin ανβ3.

M21 = inaktní M21 buňky. Čištěný ανβ3 a aIIbvB3 byly imobilizovány na 96 důlkových destičkách pro ELISA - buněčné řady M21, M21-L a M21-L-IIb a UCLAP3 se nechávají růst a fixují se na destičkách a zkoušejí se na protilátkovou reaktivitu způsobem ELISA.

Specificita: (viz popisnou část) αν = αν řetězec savčích integrinů. 200 KDa = neznámý 200 000 MW povrchový protein buněk melanomu.

ανβ5 = integrin ανβ5. βΐ = integrinový βΐ řetězec. β3 = integrinový β3 řetězec.

Tabulka II

Hladiny reaktivity se zřetelem na kontrolu (pouze sekundární protilátka) byly takto odstupňovány: 1-2(-), 2^1(+), 4-9(++), větší než 9 (+++). Například na M21 je relativní fluorescenční intenzita kontroly typicky 30-50 jednotek a LM142 vazby 300 až 500 jednotek, což dává střední relativní reaktivitu přibližně 10 (400/40).

(*) M21-L byl permeabi litován 70% ethanolem při teplotě -20 °C.

(@) M21-L zahrnuje intracelulámí souhrn β3 řetězce VNR integrinů.

Tabulka III

M21 a M21-L buňky se shromáždí se systémem trypsin/EDTA, inkubují se protilátkou 17E6, promyjí se vstřikují se do ocasní cévy holé myši („nudě mice“). Po sedmi týdnech se myši zabijí a plíce se zkoušejí se zřetelem na tumor foci. Předběžné ošetření 17E6 snižuje počet vyvinutých foci. Podobná čísla vývoje foci se zjistí, jestliže se vstřiknou buňky M21-L (které nemají αν na buněčném povrchu).

* = porovnáno s kontrolou: žádná závislost na protilátce.

Vysvětlení obrázků

Obr. 1

Fluorescencí aktivované buněčné třídicí (FACS) analýzy skupiny protilátek aV a kontrol se zřetelem na buňky M21 a M21L lidského melanomu. Buňky se inkubují s 10 pg mf¹ primárních protilátek, obarveny fluorescenčně značenými sekundárními protilátkami, opačně obarveny propidiumjodidem k umožnění vytřídění nekrotických buněk a analyzováno bylo 10 000 buněk na analyzovaný vzorek.

Uzavřený pík znamená intenzitu společně primární a sekundární vrstvy. Na svislé ose je počet buněk na kanál, na vodorovné log fluorescenční intenzity v tomto kanálu. M21 nese povrchový

-6CZ 290477 B6 αν integrin, M21-L ho nemá. Obrazec zabarvení pro αν skupinu protilátek těsně souhlasí sLM142 (αν-specifická) a LM609 (avP3-specifická) zabarveními. Obzvláště reagují sM21 avšak minimálně sM21-L. protilátka 9.2.27 reaguje s povrchovým proteoglykanem. 14E2 a21H6 rozpoznává jinak nedefinovaný 200KDa melanomu povrchový protein. Jejich obraze v zabarvení jsou oddělené od obrazců zabarvení skupiny aV. Zvláště reagují podobně jak s M21 taksM21-L.

Obr. 2

Skupina α V protilátek imunoprecipituje podobné proteiny

Živé M21 melanomy (A) se na povrchu buněk značí biotinem, extrahují se detergentem a podporují se imunoprecipitaci a štěpení na neredukční 7,5% DSD-PAGE. Zároveň se zpracovávají standardy a hmotnosti v KDa jsou ukázány vlevo. Precipitace je s kontrolními protilátkami LM142 (anti-αν: pruh b) a LM609 (anti-avP3: pruh c) a 21H6 (pruh e), 20A9 (pruh f), 23G5 (pruh g) 17E6 Pruh h), 14D9 (pruh i) a 14E2 (pruh j). LM142 a LM609 precipituje podobný obrazec proteinů k 10G, 20A9, 23G5 a 17E6 zatímco 21H6 a 14E2 precipituje pás přibližně při 200 KDa. 14D9 precipituje oba obrazce. M21 melanomy (B), M21-L αν deficientní melanomu (C) a UCLAP-3 buňky (D) jsou buňky s povrchem značeným biotinem a imunoprecipitují jako v (A). Precipitace se s protilátkou LM142 (anti-αν: pruh b), LM609 (anti-av33: pruh c) 17E6 (pruh d), AP3 (anti-β3: pruh e) a 20A9 (pruh f). Molekulová hmotnost je vyznačena v pruhu (a) a hmotnosti v KDa jsou vlevo.

Obr. 3

17E6 interferuje s počáteční vazbou buněk na vnitronektin

Série buněčných linií melanomu (Mels.) a buněčných linií karcinomu (Cars.) se skrínují FACS pro reaktivnitu s 17E6 Mab. FACS intenzity jsou popsány v tabulce II. Buňky se nechají vázat na vitronektinem povlečené substráty (0,5 pg mF¹ povlak) v přítomnosti supernatantů hybridomu z 17E6 (otevřený) nebo 14E2 (pevný). Po promytí se čítají vázané buňky způsobem popsaným ve stati materiály a způsoby a hodnoty se normalizují se zřetelem na vázání v nepřítomnosti protilátek. S výjimkou B16F10 (myší melanomu) jsou všechny buňky lidského původu. Malme 3 je fibroblastová linie. Absolutní procento vázaných buněk v nepřítomnosti protilátek je pro M21 (70%), WM 164 (68%), A375 (75 %), EMM31(67%), WM793 (65 %), MalMe3 (67%), B16F10(70%), UCLA-P3 (76 %), NP-18(65%), SW1116(68%), HT29 (65 %). Na vodorovné oseje procento buněčné vazby kontroly.

Obr. 4

17E6 narušuje adhesi zprostředkovávanou jak ανβ3 tak ανβ5 integriny

Čištěné monoklonální protilátky (Mab) nebo myší ascity se koinkubují v průběhu vázání buněk na vitronektinem povlečené substráty (5 mg ml“¹). Buněčné linie (A, B) M21; (C, D) UCLAP-3; (E, F) WM-793. Symboly znamenají následující protilátky (specificity): (plné kolečko) = 17E6 (av); (plný trojúhelníček) = LM609 (ανβ3); (plný kosočtvereček) = 14D9.F8 (av); (prázdné kolečko) - P4C10 (βΐ); (prázdný čtvereček) = P5H9 (ανβ5); (prázdný trojúhelníček) = P5H9 + LM609 [zředění vychází od 10 pg ml'¹] (μνβ3, μνβ5). Svislá osa: vázané buňky (%), vodorovná osa: levá strana Mab (pg/ml), pravá strana: zředění ascitu (1/x).

-7CZ 290477 B6

Obr. 5

17E6 narušuje adhesi na vitronektin nikoliv však na jiné matricové složky

Studuje se vliv 17E6 (αν, plné kolečko) a P4C10 (βΐ, prázdné kolečko) na vázání buněk na vitronektin (A), na laminin (B) nebo na kolagenový typ I (C). Pouze VN povlečené povrchy neblokují 17E6 vázání buněk. Pouze kolagenový typ I a laminin P4C10 blokuje vázání buněk. Svislá osa: vázané buňky (%), vodorovná osa: P4C10 zředění (1/x) (horní osa) a Mab (pg/ml) (spodní osa), svislá osa: procento vázaných buněk.

Obr. 6

17E6 reversuje kontakty ustaveného systému buňka-vitronektin

M21 melanom se nechá vázat po dobu 24 hodin na povrchy povlečené vitronektinem (VN horní řada) nebo fibronektinem (FN spodní řada). Buňky se vážou v průběhu 30 minut, a jsou dobře protažené a proliferují ve 24 hodinách (a, e) jestliže se 17E6 přidá do kultivačního prostředí (b, f). Po 30 minutách na vitronektinu (b) buňky se zaokrouhlí, zatímco na fibronektinu (f) zůstávají protažené. LM509 (c, g) a 14E2 (d, h) mají malý vliv na oba substráty. Koncentrace protilátek: (b): 0,1 pg mF¹. (c, d, f, h) 100 pg ml'¹.

Obr. 7

Vývoj M21 lidského melanomu v BALB/c holé myši se moduluje αν-integriny. A.B. Vliv na subkutánní M21 vývoj. 0,5 xlO⁶ M21 (A) nebo M21-L(B) se inkubuje s pufrem (prázdný kroužek), s protilátkami 17E6 (plný kroužek) nebo s 14E2 (prázdný trojúhelníček) a vstřikuje se subkutánně holé myši. V průběhu doby se měří rozměry nádoru a zaznamenává se jeho objem. Je znázorněn typický pokus. Vadné tyčinky ukazují s.e.m. 8 zvířat na skupinu. Na svislé ose je objem nádoru v mm³, na vodorovné ose počet dní po vstřiknutí.

C. Vliv αν na M21 experimentální metastázy

0,32 x 10⁶ (plný čtvereček, plný kosočtvereček) nebo 1 x 10⁶ (prázdný čtvereček, prázdný kosočtvereček) buněk M21 (plný kosočtvereček, prázdný kosočtvereček) nebo M21L (plný čtvereček, prázdný čtvereček) se vstřikne do ocasní cévy holé myši. V daném čase se myši usmrtí a plíce se zkoušejí na nádorové moduly, všechny M21 myši se usmrtí 42. den. V případě M21-L myší se 3 až 6 myší usmrtí v každém bodě. Nádorů po 6 týdnech je v případě M21 myši příliš vysoký počet (»2150 na plíce), takže T-statistiky jsou doloženy pro hypotézu, že M21-L skupina je od téže populace jako kontrolní M21 skupiny v 42 den na úrovni < 0,001 (**) nebo < 0,02 (*). Kde jak Hi tak Io injektovaných skupin mají stejný význam, uvádí se pouze jedna hodnota, tyčinky ukazují střední počet nádorů na skupinu. Na svislé oseje počet nádorů na plíci, na vodorovné ose dny po vstřiknutí.

Obr. 8

17E6 není cytotoxický. A vliv 17E6 na M21 buněčnou proliferaci

Očkuje se 5 x ΙΟ⁴ M21 v DMEM/FCS s nosičem (prázdné kolečko), nebo v přítomnosti 50 pg ml'¹ protilátky 17E6 (plné kolečko) nebo 14E2 (prázdný trojúhelníček) a denně se počítá počet buněk. Kinetika a saturační hustota proliferace jsou protilátkami neovlivněny. Na svislé ose je počet buněk na vodorovné počet dní.

-8CZ 290477 B6

B. Na 17E6 závislá lyse M21 buněk mikrogliálními buňkami

Thymidinem značené buňky M21 se smísí s BALB/c-odvozenými mikrogliálními mozkovými makrofágy, přidají se sériově řáděné protilátky a po inkubaci se měří uvolňování thymidinu. Kontroly: (prázdný trojúhelníček) M21 buňky samotné; (plný kosočtvereček) M21 + 17E6 (100 nM); (prázdný čtvereček) M21 + 14,18 G2a; (plný trojúhelníček) M21 +mikroglia. Střed ± s.d. (n=6). Experimentální podmínky: (plné kolečko) M21 + mikroglia + 17E6; (prázdný čtvereček) M21 + mikroglia + 14,18 G2a. 17E6 nenavozuje na protilátce závislou lysi buněk. Střed ± s.d. (n=3). Na svislé oseje cytotoxicita (%) na vodorovné koncentrace protilátky (M).

C. Na 17E6 závislá cytostase M21buněk mikrogliálními buňkami M21 buňky se inkubují s mikrogliálními buňkami a se sériově zředěnou protilátkou a pak se pulsují s [H³]— thimidinem k měření DNA syntézy. Měří se včlenění thymidinu ([H³]-thy). Symboly mají stejný význam jako v odstavci B. Zaznamenává se cytostatická aktivita samotných efektorových buněk (plný trojúhelníček). Mikroskopická pozorování při zkoušce dokládají, že oblasti homogenních mikrogliálních buněk při 1418 G2a> 10‘¹⁰M, žádné M21 buňky nepřežívají. Na svislé oseje vnesený [H³]- thimidin (cpm x 10“³), na vodorovné ose koncentrace protilátky (M).

Obr. 9

17E6 neovlivňuje DNA syntézu M21 buňkami

Buněčné linie (A) M21, (B) M21-L, (C) M21-L4 a (D) M21-LGpIIb se kultivují a pufrují (prázdné kolečko) nebo se přidávají protilátky 17E6 (plné kolečko), LM609 (plný trojúhelníček) nebo 14E2 (prázdný trojúhelníček) v uvedených koncentracích. (B) a (D) jsou rutinní pozitivní kontroly, taxol (prázdný kosočtvereček). Po 48 hodinách se buňky pulsují s [H³]- thimidinem a měří se zavedená radioaktivita, protilátky nemají žádný vliv na syntézu DNA. Taxol ji dokonale potlačuje. Srovnej s obr. 8: 90 pg ml“¹ Mab = 600 nM. Na svislé ose je vnesený [H³]- thimidin (cpm x 10“³), na vodorovné koncentrace Mab (pg/ml).

Obr. 10

EL1SA 17E6 a fragmentů na čištěném ανβ3.

Intaktní 17E6 (prázdný trojúhelníček) a jeho fragmenty F(ab')₂ (prázdné kolečko) nebo F(ab') (prázdný čtvereček) v uvedených koncentracích se nechají vázat ba slepých destičkách povlečených 1 mg ml“¹ s ανβ3 a zjišťuje se vázaná protilátka. Na svislé oseje optická hustota (OD) při 450 nm, na vodorovné protilátka (loglOpg/ml).

Obr. 11

Vázání buněk, zprostředkovávané ανβΐ a ανβ5 nikoliv však ανβ3 je blokováno 17E6 F(ab'). Buňky, jak uvedeno, se nechají vázat na 5 mg ml“¹ povlak vitronektinu v přítomnosti uvedených koncentrací 17E6 a jeho fragmentů F(ab')₂ nebo F(ab'). 100% vázání se mění od přibližně 85%(WM164) do přibližně 50% (V + B2) všech přidaných buněk, na svislé ose procento maximálně vázaných buněk, na vodorovné koncentrace protilátky (ug/ml).

Obr. 12

Vázání M21 na vitronektin je blokováno sesítěním 17E6 F(ab'). V průběhu vázání buněk M21 na vitronektin (obr. 4, 11), 17E6 F(ab') fragmenty nebo nedostatečná AP3 protilátka za 0 (prázdné kolečko), 0,1 (prázdný trojúhelníček stojící na vrcholu), 1,0 (prázdný čtvereček) nebo 10 pg pl“¹ (prázdný trojúhelníček stojící na podstavě) se koinkubují s uvedenými koncentracemi sesíťující protimyší sekundární vrstvy protilátky. Sesítění vykazuje identické ELISA afinity pro 17E6

-9CZ 290477 B6

F(ab') a AP3, (neznázoměno). na svislé oseje optická hustota (OD) při 405 nm, na vodorovné koncentrace kozí protimyší protilátky (pg/ml).

Obr. 13

Ligandové aktivní místo mimetik a vitronektinu konkurují s jiným místem pro vázání na ϋώβ3 v přímé konkurenční zkoušce. Vzrůstající koncentrace vitronektinu (prázdný trojúhelníček stojící na vrcholu) nebo peptidů GRGDSPK. (prázdné kolečko, plné kolečko) nebo cRGDfV (plný kosočtvereček, prázdný kosočtvereček) se koinkubují s biotinylovaným vitronektinem (1 pg ml’¹ = 1,5 nM) nebo s biotinylovaným cRGDfV derivátem (cRGDfK-bio: 50 nM) na abp3 povlečených destičkách. Vázaný biotin se zjišťuje s antibiotinovou protilátkou. Obr. předpokládá střední Mr projednomocný multimemí vitronektin 0,65 Mda. Na svislé oseje procento ligandové vazby, na vodorovné peptid/VN (log [(pMj).

Obr. 14

17E6 nekonkuruje s vitronektinem pro vazbu k ccbp3 v přímé konkurenční zkoušce. Vzrůstající koncentrace 17E6 (plné kolečko) jiných anti οώβ3 protilátek (prázdný čtvereček, prázdný kosočtvereček, prázdný trojúhelníček stojící na vrcholu, prázdný trojúhelníček stojící na podstavě) nebo ligandových mimetických cRGDfV (plný kosočtvereček) se koinkubují s biotinylovaným vitronektinem (1 pg ml’¹) na οώβ3 povlečených destičkách. Vázaný biotin se detekuje s anti-biotinovou protilátkou (srovnej profil nasycení za stejných οώβ3 podmínek povlékání pro 17E6: obr. 10). Na svislé oseje procento vázaného VN, na vodorovné ose [Mab] ug/ml -[cRGD] pm.

Obr. 15

Ligandy a aktivní místa mimetik nekonkurují s protilátkami pro vázání na οώβ3 b předblokované konkurenční zkoušce. Vzrůstající koncentrace vitronektinu (Vn prázdné kolečko), fibrinogenu (FC, prázdný trojúhelníček stojící na vrcholu), fibronektinu (FN prázdný čtvereček), cRGDfV (66203, plný trojúhelníček stojící na podstavě) nebo indikované protilátky (plný kosočtvereček) se preinkubují po dobu jedné hodiny na οώβ3 povlečených destičkách a pak se zkoumá přidáním (žádné promytí) biotinylované protilátky. (1 pgml“¹), jak ukázáno. Zjišťuje se vázaný biotin. Hodnota vázané protilátky 100% naznačuje, že vázání protilátky v přítomnosti koncentrací kompetitivní látky je stejné jako v kontrolní zkoušce bez kompetitoru. Ligandy neovlivňují vázání protilátky, na svislé oseje procento zkoušené vázané protilátky, na vodorovné ose (na levé i na pravé straně) koncentrace ligandů (pg/ml).

Obr. 16

Protilátky si konkurují navzájem pro vazbu na οώβ3 v předblokové konkurenční zkoušce. Vzrůstající koncentrace protilátek 17E6 (plné kolečko), LM609 (prázdný trojúhelníček stojící na vrcholu), AP3 (prázdný čtvereček) nebo 14D9.F8 (prázdný trojúhelníček stojící na podstavě) v uvedené výši se preinkubují po dobu jedné hodiny na οώβ3 povlečených destičkách a pak se zkoušejí přidáním (žádné promytí) biotinylované protilátky (1 μg ml’¹) jakje ukázáno na každém panelu. Zjišťuje se vázaný biotin. Hodnota vázané protilátky 100% naznačuje, že vázání protilátky v přítomnosti koncentrací konkurenční látky si konkurují navzájem v konkurenčních skupinách. Na svislé oseje procento zkoušené vázané protilátky, na vodorovné ose (na levé i na pravé straně) koncentrace protilátky (pg/ml).

- 10CZ 290477 B6

Obr. 17 a, b

Sekvence cDNA variabilních (Fv) oblastí Mab 17E6

Lehký řetězec: VL17E6 těžký řetězec (a) a těžký řetězec VH17E6 (b). Jsou ukázány kompletní nukleotid a dedukovaná aminokyselinová sekvence variabilních oblastí (včetně vedoucí sekvence), vedoucí sekvence jsou vyznačeny výrazně; CDR sekvence jsou v kursivě. Těžký řetězec má charakteristickou strukturu skupiny II B a lehký řetězec kappa skupiny V, podle Kabatovy klasifikace.

Obr. 18

Schematická representace klonovacího procesu mRNA kódující Fv domény protilátky 17E6 těžkého a lehkého řetězce se extrahují z 17E6 buněk hybridomu, transkribovaných do cDNA a PCR se používá k zesílení variabilních oblastí, tyto oblasti se klonují a sekvencují.

A = antigen vázající místo

L = lehký řetězec

H = těžký řetězec = hlava v = variabilní oblast c = konstantní oblast h a 1 = těžký a lehký řetězec p = primerová mix pr = primer

PCR A = PCR zesílení

C = klonování a sekvencování

Odkazy na literaturu (a k. = a kol.)

Albelda, S.M., a k. (1990), Cancer Res 50, 6 757-6 764. Bhattacharya, s. a k. (1995) J. Biol. Chem. 270: 16 781-16 787. Brooks, P. C. a k. (1994), Science 264, 569-571.

Buck, C„ a k. (1990), Cell Differ. Dev. 32, 189-202. Buck, Mak. (1992), J. Biol. Chem. 267, 5 790-5 796.

Carter, W. G. a k. (1990), J. Cell Biol. 110, 1 387-1 404. Chán, B. M. a Hemler, Μ. E. (1993), J. Cell Biol. 120, 537-543. Charo, I. F. a k. (1990), J. Cell Biol. 111,2 795-2 800.

Cheng, Y. F. a k. (1991), Exp. Cell Res. 194, 69-77.

Cheresh, D. A. a k. (1987), J. Cell Biol. 105, 1 163-1 173.

Cheresh, D. A a k. (1989), Cell 57, 59-69.

Cheresh, D. A (1991), Cancer Metastasis Rev. 10, 3-10.

Cheresh, D. A. a Harper, J. R. (1987), J. Biol, Chem. 262, 1 434. Cheresh, D. A. a Spiro, R. C. (1987), J. Biol, Chem. 262, 17 703. Chemy, R. C. a k. 1993, J. Biol. Chem. 268, 9 725-9 729. Chirgwin, J. M. a k. (1979), Biochemistry 18, 5 294-5 299. Chuntharapai, A. a k. (1993), Exp. Cell Res. 205, 245-352.

Danen, E. H. a k. (1993), Int. J. Cancer 54, 315-321. de Boer, H. C. a k. (1993), J. Biol. Chem. 268, 1 279-1 283. Delwel, G. O. a k. (1993), J. Biol. Chem. 268, 25 865-25 875. Denhardt, D. T. a Guo, X (1993), FASEB J. 7, 1 475-1 482. Diamond, M. S a Springer, T. A. (1994), Current Biology 4, 506. Dougall, WC., 1994, Oncogene., 9: 2 109-23

-11 CZ 290477 B6

Etoh, Tak. (1992), J. Dermatol. 19, 841-846.

Felding-Habermann, B a k. (1992), J. Clin. Invest. 89, 2 018-2 022.

Fidler, I. J. (1986), Cancer Metastasis Rev. 5, 29-49.

Fidler, I. J. (1988), Isr. J. Med. Sci. 24,456—463.

Furihata, K a k. (1987), J. Clin. Invest. 80, 1 624-1 630.

Gehlsen, K. R. a k. (1992), Clin.Exp. Metastasis 10, 111-120.

Goodman, S. L. a k. (1991), J. Cell Biol. 113, 931-941.

Gussow, D a Clackson, T. (1989), Nucleic. Acids. Res. 17,4000 Haba, Sak. (1985), J. Immunol. 134,3 291-3 297.

Halí, D. Eak. (1990), J. Cell Biol. 110,2 175-2 184.

HardanJ a k. (1993), Int. J. Cancer 55, 1 023-1 028.

Harel, W. a k. (1990), Cancer Res. 50, 6 311-6 315.

Harlow, E a Lané, D. (1988). Antibodies-a laboratory Manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory).

Hart, I. R a k. Birch (1991), Cancer Metastasis Rev. 10, 115-128.

Herlyn, D a k. (1985), Cell Immunol. 92, 105-114.

Herlyn, D a k. (1990), Cancer Res. 50, 2 296-2 302.

Humphries, M. J a k. (1986), Science 233, 467-470.

Humphries, M. J. a k. (1988), J. Clin. Invest. 81, 782-790.

Hyneš, R. O. (1992), Cell 69, 11-25.

Jones, S. T. a Bendig, Μ. Μ. (1991), Biotechnology 9, 88-89.

Kabat, E. A. a k. (1987), US dept. health and human services, US gouvemmant Printing offices).

Kazal, L. A. a k. (1963), Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989-994.

Kieffer, N. a k. (1991), J. Cell Biol. 113, 451-461.

Korhonen, M. a k. (1991), Lab. Invest. 65, 347-356.

Landegren, U. (1984), J. Immunol. Methods 67, 379-388.

Lehmann, M. a k. (1994). Cancer Research 54, 2 102-2 107.

Lessey, B. A. a k. (1992), J. Clin. Invest. 90, 188-195.

Liotta, L. A. a k. (1991), Cell 64, 327-336.

Mershall, J. F. ak. (1991), Int. J. Cancer 49, 924-931.

Melvaer, K. L. a Fystro, D. (1982), Appl. Environ. Microbiol. 43, 493-494.

Mosmann, T. (1983), Methods 65, 55-63.

Moyle, M. a k. (1991), J. Biol. Chem. 266, 19 650-19 658.

Mujoo, K. a k. (1989), Cancer Res. 49, 2 857-2 861.

Natali, P. G. a k (1993), Int. J. Cancer54, 68-72.

Neff, N. T. a k. (1982), J. Cell Biol. 95, 654-666.

Nesbitt, S. a k. (1993), J. Biol. Chem. 268, 16 737-16 745.

Orlando, R. A. a Cheresh, D. A. (1991), J. Biol. Chem. 266, 19 543

Panetti, T. S. a McKeown Longo, P. J. (1993a), J. Biol. Chem. 268,11 988-11 993.

Panetti, T. S. a McKeown Longo, P. J. (1993b), J. Biol. Chem. 268,11 492-11 495.

Paulsson, M. a k. (1987). Eur. J. Biochem. 166, 11-19.

Pignatelli, M. a k. (1992), Hum. Pathol. 23, 1 159-1 166.

Poste, G. a k. (1980), Cancer Res. 40, 1 636-1 644.

Preissner, K. T. (1991), Annu. Rev. Cell Biol. 7, 275-310.

Pytela, R. a k. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82,5 766-5 770.

Pytela, R. a k. (1986), Science 231, 1 559-1 562.

Rodeck, U. a k. (1985), J. Immunology 134, 1 300-1 304.

Ruoslahti, E. a k. (1982), Methods Enzymol. 82 Pt A, 803-831.

Ruoslahti, E., (1991), J. Clin. Invest. 87.)

Sambrook, J. a k. (1989). Molecular Cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Sanders, L. C. a k. (1992), Cold Spring Harb. Symp. Qaunt. Biol. 57,233-240.

Sanger, F. a k. (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5 463Seftor, R. E. a k. (1992), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1 557

Si, Z. a Hersey, P. (1994), Pathology. 26, 6-15.

- 12CZ 290477 B6

Smith, J. W. a k. (1990)., J. Biol. Chem. 265, 11 008-11 013. Smith, J. W. a Cheresh, D. A. (1988), J. Biol. Chem. 263, 18 726 Smith, J. W. a Cheresh, D. A. (1990), J. Biol. Chem. 265, 2 168 Sonnenberg, A. a k. (1987), J. Biol. Chem. 262, 10 376-10 383.

Sonnenberg, A. a k. (1988), Nátuře (London) 336, 487-489. Sonnenberg, A. (1993), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 184, 7-35. Stetler Stevenson, W. G. a k. (1993), Annu. Rev. Cell Biol. 9, 541 Stockmann, A. a k. 1993, J-Biol-Chem., 268: 22 874-82 Sutter, A. a k. (1991), Pathobiology 59, 254-258.

Takada, Y. a k. (1987), J. cell. Biochem. 37, 385-393.

Tao, Μ. H. and Morrison, S. L. (1989), J. Immunol. 143, 2 595-2 601. Towbin, H. a k. (1979), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, 4 350-4 354.

Turner, D. C. a k. (1989), J. Neurosci. 9, 3 287-3 296. Wayner, E. A. a k. (1991), J. Cell Biol. 113, 919-929.

Wayner, E. A. a Carter, W. G. (1987), J. Cell Biol. 105, 1 873-1 884. Wickham, T. J. a k. (1993), Cell 73, 309-319.

Yatohgo, T. a k. (1988), Cell Struct. Funct. 13, 281-292. Yoshinaga, I. G. a k. (1993), Melanoma Res. 3, 435—441. Zambruno, G. a k. (1993), J. Cell Sci. 105, 179-190.

Zhang, Z. a k. (1993), J. Cell Biol. 122, 235-242.

Podrobný popis vynálezu

Skupina αν monoklonálních protilátek reaguje s integrinovým αν řetězcem

Protilátkové skrínování ELISA čištěných ανβ3 a allbp3 ukazuje pět klonů, 17E6, 20A9, 23G5, 14D9.F8, 10G2, které reagují specificky s ανβ3 (tabulka I). Tyto Mab jsou ukončeny ,,α-V skupinou“. Všechny jsou IgGl izotypy. Při téže zkoušce ELISA anti-integrinové protilátky známé specificity proti ανβ3 komplexu (LM609), aV řetězce (LM142), ανβ5 komplex (P5H9), allbp3 komplex (CP8), β3 řetězce (AP3) a βΐ řetězce (P4C10) reagují jak předpověděno v literatuře (tabulka I). Při ELISA na fixovaných buňkách („CELISA“) s buňkami expresujícími ανβ3 a ανβ5 (M21) ανβ5 avšak nikoliv ανβ3 (UCLAP3) ani ανβ3 ani ανβ5 (M21-L) a allbp3 (M21-L-IIb), α-V skupina vykazuje reakční obrazec konzistentní sjejich rozpoznáním αν-integrinového řetězce a jasně odlišuje od reakce s β3, β5, βΐ nebo s jinými α-řetězci (tabulka I). Výsledky potvrzují hodnoty ELISA s čištěnými receptory. Mab se specificitami pro β3 a Gpllb se rovněž získají na skrínu (hodnoty neukázány) a reagují jasně odděleným způsobem od αν skupiny. 17E6, 14D9.F8, 20A9 a 23G5 váží ανβ3 s podobnou zdánlivou afinitou. 50 % vazby se dosahuje při přibližně 10 až 20 ng mf¹ (přibližně 50 až 100 pM - podobně k LM609). 10G2 se váže podobně na LM142 s přibližně 10 krát nižší afinitou). CP8, proti αΙ^β3 a I4E2 (viz níže), vykazují minimální vazbu na ανβ3 při koncentracích až do 100 nM.

Schopnost α-V skupiny rozpoznávat nativní αν-integriny se testuje FACS (obr. 1, tabulka II) a imunoprecipitací z povrchově značených buněk (obr. 2). V FACS analýze (obr. 1) av-expresní linie (M21) reaguje silně s 17E6, 14D9.F8, 20A9, 23G5 a s αν-definujícími protilátkami LM142 a LM609, mírně s 10G2 a také s kontrolními Mab 14E2 a 21H6 a Mab 9.2.27. Na rozdíl, av-defícientní varianta (M21-L) reaguje slabě s α-V skupinou a s LM142 a LM609, vykazuje však podobnou reaktivitu jako M21 se 14E6 a s 9.2.27. M21-L má intracelulámí oblast β3 subjednotek, které se zjišťují ve FACS pouze, když jsou buňky permealizovány (tabulka II). V analýze FACS M21-L4 (αν-retransfektovaných M21-L buňkách [Felding-Habermann a kol., 1992]) α-V skupina poskytuje reakční obrazce jako MS21. Kontrolní vektorové transfektanty, M21-L12 a Gpllb transfektanty, M21-L-IIb (Kieffer a kol., 1991), nevykazují žádné reakce s α-V skupinou (tabulka I). UCLAP-3 adenokarcinom reaguje s α-V skupinou, sLM142

- 13CZ 290477 B6 a P5H9, nikoliv však s LM609. UCLAP-3 neexpresuje β3 (viz úvod). Melanom WM793 má stejný reakční obrazec jako M21. V imunoprecipitačním skríningu M21 buněk, α-V skupina dává stejné imunoprecipitační obrazce jako LM142 (anti-αν) a LM609 (anti ανβ3) (obr. 2a). Silný široký pás je pozorován při přibližně 92kDa a slabší pás při přibližně 145kDa se slabými doprovodnými pásy při přibližně lOOkDa, což je charakteristický obrazec povrchu značených integrinů ανβ3 a ανβ5 (Wayner a kol.. 1991). Při rovnání s precipitačními obrazci na M21-L žádná skupina α-V neprecituje (hodnoty z 17E6 a 20A9 jsou ukázány) a žádná neudává LM142 nebo LM609 (obr. 2c). Podobné precipitační obrazce dávají βΐ-specifické protilátky zobou buněčných linií. V M21-L precipitace s anti-β3 protilátkami poskytuje pás při přibližně 92kDa, v důsledku intracelulámě β3-ζη30εηέ v premeabilních (možná nekrotických) buňkách. UCLAP3 (obr. 2d) neposkytuje žádný precipitát s LM609, avšak komplex přibližně 95kDa/145kDa se vysráží α-V skupinou a LM142 (obr. 2d). Souhrnně analýzy ELISA, CELISA, FACS a imunoprecipitace poskytují konzistentní reakční obrazce a silně dokládají, že Maby α-V skupiny reagují s extracelulárními oblastmi lidských αν-integrinových řetězců.

Mab 17E6 je mocnou protilátkou blokující funkce

17E6 může modifikovat počáteční vazbu buněk k ligandům av:

αν-Integriny mohou fungovat jako receptory vitronektinu, takže α-V skupina se skrínuje se zřetelem na možné vlivy na vázání buněk na vitronektinové substráty. Po integrinové analýze FACS, se zkouší buňky ve vazebních testech (tab. II, obr. 3). Ve FACS reagují buňky linií lidského melanomu a karcinomu podobně s α-V skupinou. Reakce s 17E6 je sumarizována (obr. 3). Počáteční vázání k vitronektinu buněk reagujících ve FACS s 17E6 je silně blokováno touto protilátkou, avšak pouze slabě ovlivněno kontrolní protilátkou 14E2 (obr. 3). Jiné členy α-V skupiny jsou méně silné (hodnoty' neuvedeny). Bouřlivé vázání myších buněk B16F10 na vitronektin není ovlivňováno 17E6 a B16F10 nereaguje s 17E6 ve FACS. Jak předpověděno (Cheresh a Harper, 1987), B16F10 vázání na vitronektin je citlivé na mikromolámí koncentrace RGD-peptidů, což poukazuje na přítomnost funkčního povrchu ανβ3 (SLG a B. Diefenbach). proto 17E6 a α-V skupina reagují s lidským, nikoliv s myším αν.

Zkoumal se vliv 17E6 na buněčné vázání. 17E6 blokuje M21 vázání (přibližně 85%%) na vitronektin s IC50 přibližně 0,1 pg ml“¹ (obr. 4a). vynález potvrzuje dřívější studie (Wayner a kol., 1991) poukazem, že M21 vázání je špatně blokováno protilátkami na ανβ3 (LM609) nebo ανβ5 (P5H9) samotnými, avšak silně blokováno, jestliže se přidají společně (obr. 4a, b). Anti-βΐ integrinové protilátky (P4C10) nemají žádný vliv na M21 vázání na vitronektin (obr. 4b). Linie UCLAP3 a WM793 vážou na vitronektin a toto vázání se blokuje 17E6 a také komplementárními αvβ5-speciflckými (P5H9/UCLAP3) nebo ax^3-specifickými protilátkami (LM609/WM793) (Obr. 4c-f). Na ανβ5 (UCLAP3) 17E6 má IC50 přibližně 30 ng ml’¹. Na WM793 má přibližně 60 ng ml“¹ a pro LM609 IC50 přibližně 600 ng ml¹. UCLAP3 expresuje ανβ5 avšak žádný ανβ3 (Wayner a kol., 1991) zatímco WM 793 expresuje vysoké hladiny ανβ3 (tabulka I). Blokovací specificita 17E6 se potvrzuje jeho nedostatkem vlivu na vázání buňky na jiné matricové substráty (obr. 5) P4C10 (anti-βΐ) ruší vázání M21 na laminin a kolagen. Buněčná adhese k těmto dvěma substrátům může být zprostředkována βΐ sérií integrinů (Sonnenberg a kol., 1988; Takada a kol., 1987).

Souhrnně s biochemickými údaji jsou tyto výsledky konzistentní s teorií, že 17E6 váže αν řetězec různých integrinových komplexů a rozrušuje jejich interakci s jejich ligandy.

- 14CZ 290477 B6

17E6 spouští změnu zavedených buněčných matricových interakcí zprostředkovaných av-integriny:

Dále se zkoumalo, zda 17E6 může ovlivňovat zavedené interakce buňka-matrice. Jestliže 17E6 při nízkých koncentracích (přibližně 0,1 pg ml^-1) se přidá do M21 buněk, navozuje extrenzivní zaoblování buněk po půl hodině až po jedné hodině při teplotě 37 °C vM21 kulturách i po 24 hodinách vázání (obr. 6). Vliv je plně reversibilní a po promytí se buňky vracejí do protáhlého stavu v průběhu 48 hodin. Na rozdíl od toho protilátky LM609 a 14E6 ovlivňují morfologii pouze mírně i ve vysokých koncentracích (100 pg ml'¹), protilátky nijak morfologicky neovlivňují ani v koncentraci 100 pg ml¹ fibronektinem povlečené substráty (obr. 6). M21-L4 (a jiné buňky vázané přes αν) jsou podobně ovlivňovány 17E6 na vitronektinových povrchách, nikoliv však na fibronektinu, kolagenu nebo lamininu.

17E6 blokuje M21 nádorový vývoj u holé myši

Zkoumá se vliv αν-blokující protilátky 17E6 na subkutánní vývoj M21 nádorů v případě BALB/c nu/nu myši (obr. 7). Na zvířecích modelech vývoj M21 nádorů v případě holé myši se uvádí do vztahu s expresí buněčného povrchu αν sérií integrinů (viz úvod). M21 buňky se subkutánně koinjektují s protilátkami prostými endotoxinu. 17E6 konzistentně (4/4 pokusy) blokuje subkutánní vývoj M21 nádorů (obr. 7a). V přítomnosti 17E6 nejsou žádné nádory (0/32) a zvířata zůstávají prosta nádorů déle než 6 měsíců. Kontrolní nádor se vyskytuje v 75 až 90 %. Neblokující protilátky proti αν řetězci samotnému a kontrolní protilátky proti melanomu buněčného povrchu, vykazují proměnlivé a nekonzistentní účinky na vývoj nádoru. U kontrol, ošetřených 14E2 se nádory zmenšují v závislosti na pokusu o 30 až 60%, růst nádoru však setrvává jako u neošetřených kontrol a podobně jako v případě kontrol tato zvířata mají pulmonámí mikro-metastázy, jestliže se plíce vnesou do tkáňové kultury (neznázoměno). Na rozdíl od toho zvířata ošetřená 17E6 nemají ani subkutánní nádory ani metastázy v plicích, v játrech, v ledvinách, ve slezině, ve střevech, v žaludku ani v hrudních ani v břišních dutinách, jestliže se po óměsících usmrtí. Linie M21-L s deficientem ανβ3 rostou subkutánně mnohem pomaleji než M21 a nejsou ovlivněny 17E6. M21-L kontroly, ošetřené 14E2 vykazují zmenšení ve srovnání s neošetřenými zvířaty, podobně jako je pozorováno u M21 buněk (obr. 7b).

Růst M21 a M21-L a vliv protilátky 17E6 se porovnává na případu „experimentální metastazy“ za použití vstřiknutí do ocasní cévy jako modelu. M21 vytváří četné kolonie v závislosti na dávce, zatímco M21-L vytváří významně méně kolonií, avšak vytváří plicní moduly při vstřiknutí ve vyšší dávce (obr. 7c). Jinak řečeno, růst nádoru v plicích se rovněž podporuje přítomností buněčného povrchu αν-integrinů a předinkubace M21 a 17E6 snižuje (o 90 %) počty vytvořených nádorových kolonií. Je zajímavé, že úroveň vytváření nádoru je podobná jako se dosahuje M21- buňkami v témže pokusu. Protilátka nemění počty zvířat, ve kterých nádor rostl (tabulka III).

Souhrn lze konstatovat, že přítomnost αν na povrchu buněk podporuje vytváření nádoru M21 jak na subkutánních tak na experimentálních metastázových modelech a αν blokování a reversování protilátky 17E6 bouřlivě potlačuje růst M21. V modelech experimentálních metastáz s buňkami M21 a chabý růst M21-L těsně sleduje subkutánní obrazec růstu nádoru a M21 růst také se potlačuje předběžným ošetřením 17E6. tyto údaje zesilují souvislost mezi av-integriny a vývojem lidského melanomu.

Působení 17E6 nezpůsobuje cytotoxicitu

Po zjištění silných vlivů na vázání, morfologii a vývoj nádoru se zkoušelo zjištění mechanismu působení 17E6. Zkoušela se cytotoxicita 17E6 (obr. 8). Kinetika buněčného růstu a hustota konečného dosaženého nasycení není značně ovlivněna přítomností 17E6 nebo kontrolní protilátky (obr. 8a).

-15CZ 290477 B6

Holá myš je imunologicky deficientní. Z několika buněk směrodatných pro imunitu, které zůstaly, jsou makrofágy nejochotnější řídit cytotoxicitu, odezvu zprostředkovanou protilátkou. Ke zkoušení možnosti, že protilátky řídí buněčnou cytotoxicitu (ADCC) se zkouší myší makrofágy syngenní k protilátce v ADCC proti M21 buňkám. Jakožto efektorové buňky jsou myší roztokové makrofágy (mikroglia) zvláště silnými mediátory ADCC (Sutter a kol., 1991). Pozitivní kontrola Mab 14.18 G2a způsobuje téměř dokonalou lysi M21 při <10⁹M, zatímco 17E6 až při 10“⁷ M nezprostředkovává ADCC (obr. 8b).

Za účelem hodnocení, zdali 17E6 může vyvíjet cytostatickou účinnost v přítomnosti efektorových buněk, se měří DNA syntéza M21 mikrogliálních kokultur v přítomnosti protilátek (obr. 8c). 14.18 G2a způsobuje při 10“¹⁰N >90 % inhibici v začleňování do [³H]-thimidinu.

Po zkouškách vlivu na proliferaci buněk ADCC a AECM se zkouší se zřetelem na to, jak se ovlivní hladiny syntézy DNA vM21 buňkách působením Mab. Na včleňování thimidinu nemá žádný vliv 17E6, 14E2 a LM609 v koncentraci 0,5 μΜ (obr. 9). Protilátkami není rovněž ovlivněna syntéza DNA vM21-L, M21-L4 a M21-L-IIb buňkách. M21-L a M21-L-IIb nereaguje ani s 17E6 ani s LM609 avšak reaguje s 14E2 (obr. 1). Četné jiné buněčné linie melanomu se rovněž zkoušejí a jejich DNA syntéza nevykazuje zřejmé ovlivnění α-V skupinou (neznázorněno).

17E6 a 14E2 jsou IgGl izotypy a neovlivňují komplementem zprostředkovávanou lysi na M21 buňkách, je možno usoudit, že 17E6 jsou specifické vůči αν-integrinům a nemají drastické toxické působení na jiné buněčné systémy.

Působení 17E6 na buněčný ανβ3 vyžaduje sesítění receptoru nikoliv však u ανβΐ nebo ανβ5

V četných biologických systémech transmembránový signál je iniciován dimerozací receptorů. Ovšem multimerizace ανβ3 mění fosfotyrosinylační obrazec HUVEC (Bhattacharya a kol., 1995). Poroto se zkoumalo, zdali je receptorová agregace zahrnuta v průběhu 17E6 působení, 17E6 inhibuje buněčné integriny ανβ3, ανβ5 a ανβΐ (obr. 4). Intaktní 17E6 a jeho F(ab')₂ a F(ab') fragmenty mají podobné vazebné charakteristiky v ELISA na izolovaný ανβ3 (obr. 10) s 50% sycením dosahovaným při přibližně 1 ng mF^l (přibližně 7pM intaktní Mab). Podobné titrační křivky ELISA naznačují monovalentní interakci mezi 17E6 a ELISA destičkami. Avšak při zkouškách vázání se fragmenty chovají odlišně. F(ab')2 fragmenty a intaktní 17E6 blokují vázání buněk zprostředkovávané ανβΐ (V + B2 buňky) a ανβ5 (UCLAP-P3 buňky) (IC50 přibližně 0,1 pg ml^-1: přibližně 700 pM) a ανβ3 vázání (WM164 a M21 buňky) (IC50 přibližně 0,5pgmr': přibližně 3 nM) a F(ab') fragment je jak aktivní, tak dimemí protilátkou na ανβΐ a ανβ5 (obr. 11). Avšak fragment F(ab') má alespoň 1 x 10⁴ větší účinnost jak na ανβΐ tak na ανβ5 než na ανβ3, kde pouze blokuje 25 + 10 % při nejvyšších zkoušených koncentracích (50 pg ml¹: IC50»50pg ml¹: »400nM)-při těchto hladinách irelevantní protilátky rovněž produkují podobný stupeň blokování (neznázorněno), což naznačuje, že tento okrajový efekt není specifický.

Chybějící biologická aktivita fragmentu F(ab') protilátky, který je schopen vázat (jako 17E6F(ab'): (obr. 10)) je klasickým indikátorem, že k protilátkou zprostředkované funkci je nutná dimerizace. K potvrzení, že zesítění bylo skutečně nutné k působení 17E6 a ανβ3, byl 17E6F(ab') zesítěn v průběhu zkoušky buněčné vazby přísadou polyklonální protilátky F(ab'). Klasický efekt podobný prozonu se pozoruje, když při kritické koncentraci jak primárních, tak sekundárních protilátek, a pouze tehdy, je patrná silná inhibice buněčné vazby. Adhezi buněk neovlivňují vysoká množství druhé vrstvy protilátky samotné nebo samotného F(ab'). Spíše nebyl efekt specifickým výsledkem zesítěn integrinů ανβ3: zesítění ανβ3 vazbou však neinhibiční protilátky AP3 nemělo vliv na připojení buněk (obr. 12). Koncentrace aktivního

- 16CZ 290477 B6

F(ab') po přidání sekundární protilátky v zesíťovacích experimentech koinciduje s IC50 intaktního 17E6 na ανβ3 zprostředkované připojení (viz obr. 11).

Tyto údaje společně ukazují, že zesítěné integrinů ανβ3 je nutné k prevenci připojení WM164 a M21 ke kognatovým ligandům, zatímco ανβ5 a ανβΐ nevyžadují k aktivaci zesítění.

17E6 je špatným blokátorem receptorových funkcí v testu izolovaného receptoru:

Neobvyklá povaha funkce 17E6 na ανβ3 se studuje podrobně testy izolovaného receptoru. Rozdíl mezi klasickými blokátory aktivních míst a 17E6 je výrazný. Vazba vitronektinu na ανβ3 se nasycuje při přibližně 5pgmr‘ (přibližně lOnM: za předpokladu průměrné velikosti vitronektinového multimeru 10 monomerů) (obr. 13) a tato vazba je specificky ukončena jak s klasickými lineárními ligandovými mimetickými peptidy (GRGDSPK:IC₅₀ přibližně 2μΜ), tak s cyklizovanými peptidy (cRGDřV:IC₅o přibližně 5 nM). Při použití biotinem značené varianty cRGDfV, biotinu cRGDfK, je možno přímo dokázat, že vitronektinová vazba konkuruje nejenom inhibitorům, ale že vitronektin konkuruje vazbě inhibitoru (obr. 13), což znamená, že systém je symetrický. Ve skutečnosti jak vitronektin, tak GRGDSPK a cRGDfV si konkurují navzájem a činí tak „racionálně“ a „symetricky“ tím, že IC₅₀ pro konkurenci zrcadlí IC50 pro inhibici vitronektinové vazby ke komplexu ανβ3 (obr. 13).

Vazba 17E6 saturuje ανβ3 při 0,01 - 0,1 pgmf¹ (700 až 70 pM) (viz obr. 10). protilátka je však jen slabým inhibitorem ligandové vazby. I při 70 nM protilátky je méně než 30 (+10) % inhibice vitronektinové vazby. LM609 se chová podobně, zatímco ανβ3 vazba neinhibitujících protilátek (14D9.F8, 20A9 a WAM2-4) je neúčinná. Ligandový mimetický cyklický peptid cRGDfV blokuje účinně interakci receptoru a ligandu (IC50 přibližně 10 nM) (obr. 14), neovlivňuje však vazbu 17E6. Neinhibituje ani intaktní, ani monovalentní 17E6 (neznázoměno).

17E6 váže ανβ3 v přítomnosti saturačních množstvích podněcujícího ligandu

Slabá konkurence 17E6 pro ligand v testu izolovaného receptoru a dostupnost silných konkurenčních inhibitorů, jako cRGDfV vyvolává otázku, jak ovlivňuje 17E6 funkci αν. Blokující působení 17E6 a jeho fragmentů při testech buněčných vazeb pro integrin ανβ3 vyžaduje zesítění, což je chování, jež se plně neslučuje s inhibici konkurencí. Napřed se zkoumá, zda ligandy ανβ3 interferují přímo s vazbou 17E6.

Ligandy se předem vážou na receptor a přidá se nízká koncentrace přímo značeného 17E6 (obr. 15). Vazba 17E6 není ovlivněna (<10% bloku) vysokou koncentrací vitronektinu, fibronektinu nebo fibrinogenu (což jsou negativní ligandy ανβ3 {Cheresh a Spiro, 1987}) ve 100-násobku potřebného množství k nasycení specifických vazebních míst na ανβ3. Na rozdíl předem vázaný 17E6 konkuruje silně s vazbou následně přidaného značeného 17E6 (obr. 15, 16) a nativní ligandy ανβ3 také se navzájem dobře konkurují (neznázoměno). To činí falešným náš předpoklad, že 17E6 si konkuruje s vitronektinem na aktivní straně ανβ3. Spíše silní aktivní místo konkurenti, jako cyklický peptid cRGDfV při 200 μΜ také nepůsobí na vazbu 17E6, avšak blokují vitronektinovou vazbu na ανβ3 s IC₅₀ 2nM (obr. 13).

Údaje ELISA (obr. 10) značí, že interakce 17E6 - ανβ3 jsou monovalentní, což snižuje možnost, že konkurenční artefakt je pozorován vlivem velmi vysoké afinity protilátky kombinované s nízkou afinitou ligandu. Označí se však jiné a β3- specifické protilátky a použije se jich k podnícení předem vázaného ligandu (obr. 15), včetně protilátek samotných (obr. 16). Protilátky si navzájem úspěšně konkurují a spadají jasně do konkurenčních skupin (16). β3 specifická protilátka AP3 konkuruje se svou vlastní vazbou, ale neovlivňuje vazbu a není ovlivněna protilátkami specifickými pro buď komplex ανβ3 (LM609), nebo αν-řetězec samotný (17E6, 14D9.F8); přičemž LM609, 17E6 a 14D9.F8 konkurují silně. Na rozdíl od toho předem vázaného

-17CZ 290477 B6 ligandy neovlivňují vazbu 17E6 na ανβ3. Musí se přijmout závěr, že 17E6 nepůsobí přímou konkurencí na ligandovém vazebném místě.

Klonování a sekvencování proměnných oblastí 17E6

Ke klonování knihoven cDNA obohacených immunoglobulinem pero oblasti těžkých a lehkých řetězců hybridomu 17E6 se použije primární knihovny určené k posílení PCR proměnlivých oblastí immunoglobulinu. Primery redundantní proměnlivé oblasti končí na počátku lídru. Revesní primery konstantní oblasti končí 30 bp v konstantní oblasti. Primery jsou označeny terminálem Sal I nebo Xmal restrikčních míst pro klonování. Získají se produkty PCR očekávané velikosti (420 až 450 bp) (Jones a Bendig, 1991), klonují se a sekvencují se (obr. 17). Délka lehkého řetězce variabilní oblasti immunoglobulinu 17E6, VL17E6 je 381 bp. Délka variabilní oblasti těžkého řetězce 17E6, VH17E6 je 411 bp. Variabilní sekvence těžkého řetězce jsou charakterizovány immunoglobuliny Kabatovy skupiny lib a sekvence lehkého řetězce jsou charakterizovány immunoglobuliny Kabatovy skupiny V. (Kabat a kol. 1987). Klonovací strategie je naznačena schematicky na obr. 18.

Progres nádoru a metastázy je klasickým onemocněním, kdy se buňky vymknou normálním růstovým a adhezním kontrolám a opustí, migrují, připojují se a rostou na nesprávném místě. Nyní se ví o tom, že integriny ovládají mnohé adhezní okolnosti a adheze může mechanicky regulovat vzájemně provázené okolnosti včetně růstu, diferenciace, pohybu buněk a aktivity proteázových sítí vývojových okolnosti, jež jsou repetovány do metastatické kaskády (Liota a kol. 1991; Stetler Stevenson a kol. 1993; Fidler, 1988). V této studii se popisují protilátky zaměřené proti integrinům aV série, z nichž jedna, 17E6 narušuje původní připojení buněk, zpřetrhává stabilní aV-ligandové interakce a interferuje s vývojem lidského melanomu ve zvířecím modelu in vivo (Fidler, 1986). V biochemických analýzách ukázaly protilátky skupiny α-V reakční obrazce velmi blízké k LM142, což je dobře definovaná protilátka lidské αν, liší se však od reakčních obrazců av33-specifické (LM609) a a\^5-specifické (P5H9) a od jiných definovaných antiintegrinových protilátek. Protilátky skupiny α-V tudíž pravděpodobně rozeznají lidský řetězec aV. Klonování cDNA immunoglobulinu 17E6 transkribuje projevené jedinečné nepochybné sekvence. Sekvence těžkého řetězce jsou charakteristické immunoglobuliny Kabatovy skupiny lib a sekvence lehkého řetězce jsou charakteristické Kabatovy skupiny V (Kabat a kol., 1987). protilátka je tudíž jednoznačně definována.

17E6 silně narušuje buněčné interakce zprostředkovávané aV. Pro pochopení funkce integrinů byly rozhodující protilátky, které narušují funkci, avšak aV-oblast postrádala mocnou pro třídu specifickou protilátku. 17E6 blokuje aV-zprostředkované spojení buněk s IC₅o přibližně 0,3 až 1 nM (protilátka MW 150 000); pro porovnání peptický blokátor GRGDSPK má IC₅₀ přibližně 5 μΜ. Linie buněk experesující hlavně ανβ3 (WM793) nebo ανβ5 (UCLAP3) jsou blokovány 17E6, jako je tomu u buněk experesujících hlavně a\^l. 17E6 je tudíž generálním inhibitorem av-integrinů.

17E6 nejenom brání počáteční interakci αν-integrinů s jejich ligandy, ale způsobuje také retrakci dobře ustálených interakcí buněk připojených k vitronektinu. Interakce a\^3 s vitronektinem byly popsány jako „nedisociovatelné“, probíhající ve dvou krocích, s počáteční blokovatelnou interakcí, za níž následuje rychle stabilizační reakce (Orlando a Cheresh, 1991). Na rozdíl od toho způsobuje 17E6 rychle retrakci a částečně oddělování M21 a mnoha jiných buněk (nepublikované poznatky) z vitronektinových substrátů. Zakrouhlování se reverzuje, když se protilátka odstraní. Počáteční připojení M21 na vitronektin je nedokonale blokováno (přibližně z 90 %) působením 17E6, avšak jeho zaoblovací účinek postihuje v podstatě všechny připojené buňky. Mohly být potvrzeny dřívější studie, kde počáteční připojení M21 k vitronektinu bylo plně blokováno směsemi protilátek anti-o^3 a 3ηίϊ-ανβ5 a peptidy RGDS, což znamenalo, že se to týkalo jak ανβ3, tak ανβ5 (Eayner a kol., 1991). Jak je ukázáno v této studii, blokuje 17E6 několik αν-receptorů a může reverzovat stabilní interakce jimi zprostředkované. Rozdíl

- 18CZ 290477 B6 v působení 17E6 na připojené a připojované M2i buňky může spočívat v rozdílné funkci a umístění ανβ3 a ανβ5 v každé situaci. Při připojování buněk jsou oba difuzně rozděleny, zatímco u připojených buněk se zjišťují ve fekálních kontaktech ανβ3 a ανβ5 je difuzně rozdělen (Wayner a kol., 1991; Zambruno a kol. 1993). Zkoumalo se dále, zda 17E6 selektivně rozrušuje jeden z těchto kontaktů.

Růst nádorů M21 v holé myši závisí silně na aV-integrinech (Felding-Habermann a kol. 1992; Sanders a kol., 1992). Jelikož 17E6 mohl modulovat stabilní interakce aV-ligandů a měl dlouhotrvající účinek, zkoumalo se jeho působení na vývoji nádorů. Zjistilo se, že 17E6 blokuje vývoj subkutánních nádorů M21 v holé myši, což silně podpořilo studie Feldinga a Habermanna a kol. Kromě toho se dalo dokázat, že αν také podporuje a 17E6 inhibuje vývoj na experimentálních metastázách plic. Tento vynález tudíž nezávisle potvrdil dřívější významnou studii a rozšířil ji pomocí syngenické protilátkou zprostředkované ..terapie“ působením 17E6. Tyto výsledky zdůrazňují význam aV-integrinů ve vývoji nádoru M21 a eliminují možnost, že dřívější výsledky vznikly jako artefakt selekce klonování.

Působení 17E6 in vitro pokračuje po dobu delší než 24 hodin s následným proplachem. při objemu myši 20 ml je koncentrace počáteční protilátky in vivo přibližně 10 nM, což je řádově nadbytečné oproti IC₅₀ pro reverzování interakce buňka-ligand v kultuře. 17E6 je syngeneický pro ošetřované zvíře, BALB/C nu/nu a poločas života IgGl myši je 20 až 200 hodin (Tao Morrison, 1989; Haba a kol., 1985). Tudíž IC₅₀ pro reverzaci interakce M21-ligand se mohlo v tomto modelu zvýšit o nejméně 100 hodin (5 poločasů života). Je zajímavé porovnat 17E6 s peptidy RGD. V modelu myšího melanomu B16F10-C57blk6 inhibují společně injektované peptidy vývoj plicních nádorů B16-F10 (Humphries a kol.. 1986; Hardan a kol. 1993). Za stejného předpokladu jako pro 17E6, je přítomno přibližně 100 μΜ peptidů RGD (Hardan a kol., 1993) přibližně o dva řády nad dávkou potřebnou k blokování připojení buněk na vitronektin. Avšak RGDS má sérový poločas života 8 minut (Humphries a kol. 1988). Jako všeobecný terapeutický cíl by mohlo být výhodné vytvořit dlouhodobé blokátory k potlačení vývoje nádorů.

Jak může 17E6 ovlivnit vývoj nádoru? Jelikož nereaguje s myšími buňkami, působení na nádorové buňky a zřejmé účinky protilátky na nádorovou angiogenezi mohou být vyloučeny (Brooks a kol. 1994). Jedinými účinky 17E6, které lze identifikovat jsou: a) jeho vazba na extracelulámí oblast aV-integrinů, b) jeho schopnost narušovat aV-zprostředkované buněčné interakce. Dá se předpokládat, že byla eliminována většina zdrojů protilátkou zprostředkovaného zabíjení holé myši. 17E6 neovlivňuje chronicky ani akutně růst a životnost buněk M21, nezprostředkovává komplementární fixaci, neovlivňuje synthesi DNA a nezprostředkovává syngenickou makrofágem vyvolávanou cytotoxicitu. Buňky M21 jsou citlivé na ADCC, neboť byly účinně zabíjeny mikrogliálními buňkami v přítomnosti Mab 14.18 G2a. MAb IgGl (podobně jako 17E6) efektivně zprostředkují myší makrofág ADCC (Herlyn a kol. 1985). Počet míst ανβ3, expresovaných na buňku, může být pod kritickou hranicí pro výskyt ADCC. Dřívější studie ukázaly, že účinnost ADCC koreluje s hustotou cílového antigenu (Rodeck a kol. 1985). Makrofágy na rozdíl od jiných meyloidů nebo lymfocytických ejektorových buněk expresují všechny tři třídy Fcgama receptorů. Údaje argumentují proti ADCC jako mechanismu vysvětlujícímu inhibici nádorového růstu pozorovaného in vivo s 17E6. Protilátka je prostá endotoxinu. Nemůže být vyloučeno, že zabíjení zprostředkované NK-buňkami je aktivováno 17E6, avšak je-li tomu tak, je daleko méně aktivován syngeneickými řídicími protilátkami s izotypem, kterých bylo použito.

17E6 tudíž působí pravděpodobně zhoršováním funkce αν-integrinů. Funkce, které může 17E6 blokovat a kde se může podílet αν zahrnují adhezi buněk, interakci s rozpustnými matričními složkami (Seftor a kol. 1992), modulaci inhibitorové sítě proteáz/proteáza (Gehlsen a kol. 1992; de Boer a kol. 1993; Preissner, 1991), podporování pohybu buněk (Seftor a kol. 1992; Gehlsen a kol. 1992) nebo ovlivňování intemalizace receptorů (Wickham a kol. 1993; Panetti a McKeown

- 19CZ 290477 B6

Longo, 1993a; Panetti a McKeown Longo, 1993b), avšak který z těchto vlivů je zúčastněn, pokud některý; to bude předmětem dalšího bádání.

Blokující účinek 17E6 na ανβ3, nikoli však na ανβΐ a ανβ5 vyžaduje dimerizaci cíle. Ačkoliv monovalentní a divalentní fragmenty protilátky 17E6 jsou rovněž aktivní ve vázání ανβ3 integrinu v ELISA a v blokování buněčné adheze zprostředkované ανβΐ a ανβ5, jsou proti ανβ3 monovalentní fragmenty téměř neúčinné. Nadto, přidají—li se k monovalentním fragmentům zasíťující protilátky, získají znovu schopnost blokovat ανβ3 zprostředkovatelnou adhezi a při tom vykazují klasický prozonový efekt. Samotné zesítění ανβ3 však nestačí k blokování aktivity, jelikož zesítění AP3 neúčinkuje na adhezi zprostředkovanou ανβ3: AP3 váže řetězec β3 (viz obr. 2B:e).

Přechod od monovalentní k bivalentní interakci způsobuje ostrý nárůst afinity protilátky k jejímu cíli (Lané a Harlow, 1988). Titrace ELISA 17E6 na izolovaném ανβ3 tento přechod neukáže a naznačuje proto, že v této konfiguraci se vyskytuje monovalentní interakce jak s monovalentními, tak divalentními elementy 17E6. V testech ligand-vázajících receptorů, které používají stejného uspořádání ELISA, je 17E6 překvapivě chabým blokujícím činidlem, ve srovnání s peptidickými ligandovými mimetikyEMD66203:cRGDFv. K. uvedení do kontextu: zatímco cRGDfV získává 2 až 3 řády v aktivitě (IC₅₀ od přibližně 1 μΜ do přibližně 1 nM) při přechodu od buněčného testu k izolovanému receptorovému testu, 17E6 ztrácí nejméně 3 řády zdánlivé aktivity (IC₅o od přibližně lOOngmf¹ do >100pgmr’) a stává se v podstatě neaktivním.

Tato anomálie a relevance údajů sesíťování buněčné protilátky byla vyřešena konkurenčními experimenty. Ty naznačují, že 17E6 na rozdíl od peptických blokátorů neinterferuje přímo s místy vázajícími ligand. Pokud není přímý výskyt, předpokládá se obvykle, že blokující činidlo funguje stérickou oklusí ligand-receptorových onterakčních míst, což je názor zhodnocený v integrinové oblasti ligand-aktivními místními mimetiky jako jsou RGD-obsahující peptidy (Hyneš, 1992) a ligandovou inaktivací způsobenou mutagenezí tohoto místa ve vitronektinu (Chemey a kol., 1993). Nyní zjištěné údaje silně naznačují, že u mocné blokující protilátky 17E6 tomu tak není. V souhrnu: u ανβ3 integrinů a) se ligandové mimetické peptidy navzájem konkurují a konkurují ligandům samotným, b) ligandy konkurují peptidům, c) ani peptidy, ani ligandy nekonkurují vazbě 17E6, d) 17E6 nekonkuruje ligandové nebo ligand-mimetické vazbě, e) 17E6 je plně konkurující sám sobě ajiným αν-vazebným protilátkám.

17E6 je extrémně chabým konkurentem pro ligandovou vazbu k ανβ3, zatímco vitronektin a vzorky aktivních míst založených na RGD si silně konkurují navzájem a s receptorem. A ostatní protilátky konkurují silně 17E6. 17E6 proto působí jako alosterický inhibitor. Zesíťovací pokusy ukazují, že ανβ3 musí být dimerizován než může 17E6 blokovat, ne tak ανβΐ a ανβ5. Tento objev ukazuje, že 17E6 funguje novým mechanismem zahrnujícím manipulaci s integrinem signálními transdukčními drahami spíše než pouhým antagonizováním interakcí integrin-ligand.

Jelikož ligandy ανβ3 jsou homopolymery ve svém aktivním tvaru a jsou inaktivní jako monomery, (Preissner, KT, 1991; Stockmann, A. a kol., 1993), může být multimerizace integrinů substrátem nezbytná pro jejich funkci a skutečně dimerizace kináz receptorového ryrosinu rodiny receptorů růstového faktoru ligandy je klíčovou okolností v iniciaci signální transdukce (Dougall, WC a kol. 1994). Intuitivně je zřejmé, že stereochemie polymerového substrátu se stane rozhodující v orientování integrinů v membráně a určují tvoření signálního komplexu. Z této zábrany může povstat biologická „logika“ multimerického vitronektinu pro adhezi buněk. Vitronektinové multimery mají velikost 3 až lójednotek (Stockmann A. a kol., 1993) a lze předpovědět vytvoření uspořádaných řad integrinů na povrchu buněk a nutnou zlepšenou afinitu multimerickými interakcemi. Individuální životnost interakce monomemího vitronektinu-avÚ3 je krátká a afinita nízká, zatímco rotace neligovaného integrinu v rovině membrány je rychlá

-20CZ 290477 B6 a protilátková afinita je vysoká. Dá se tudíž předpovědět, že divalentní protilátky, spojené s jedním integrinem na povrchu buňky, mohou zachycovat disociované integriny při rotaci a pohlcovat je v konformaci, která nemůže vázat ligand. To způsobuje progresivní oslabování molekulové řady ανβ3 a vitronektinových vazeb a destabilizuje inteakci buňka-vitronektin -jako by se odlupovala molekulární přilnavá část („velcro“). To může vysvětlovat nedostatek funkce 17E6 v receptorových testech, kde receptor nemůže rotovat v potřebné orientaci k získání divalentní vazby (patrno z údajů ELISA) a jeho účinnost v buněčném testu, vysvětlovat pozorovatelnou chybějící potřebnost konkurence pro aktivní místo v buněčném testu a vysvětlit neúčinnost fragmentů F(ab') v blokování adheze k buňkám zprostředkované ανβ3.

Implicitně je také zřejmé, že jelikož ανβ5 a ανβΐ (ανβ6, ανβδβ ανβΐ) vytvářejí překrývající se lígandové spektrum s ανβ3 je myslitelné, že navzájem řídí své funkce, způsobem přímo analogickým vzájemné regulaci heterodimerizace receptorů v rodině růstových faktorů RTK (Dougall, WC a kol., 1994). Například ανβ5 tím, že má k vitronectinu větší afinitu než βανβ3, může konkurovat s vazebnými místy ανβ3 na individuálních multimerech tohoto substrátu - přičemž zamezuje homodimery ανβ3 potřebné k vytvoření signálu, nebo uchování adheze k buňkám tím, že je nahradí heterodimery ανβ5-ανβ3. Ostatní αν-integriny mohou fungovat podobným vzájemně regulujícím způsobem, ověřená data k potvrzení této domněnky však chybějí.

Byl tedy vytvořen sled monoklonálních protilátek proti řetězci lidského aV-integrinu. Jedna z nich, 17E6, jednak blokuje, jednak reversuje aV-zprostředkované procesy in vivo. Je zajímavé, že také blokuje vývoj melanomu závisejícího na aV v holých myších. To naznačuje, že aV-integriny mohou být účinnými kandidáty v léčení nádorů. Když byl tento rukopis připravován,, popsal Lehmann a kol. (Lehmann a kol. 1994) αν-specifické protilátky s některými vlastnostmi příbuznými 17E6. Bude zajímavé sledovat, zda bude také moci reversovat αν- zprostředkované interakce a narušovat vývoj melanomu.

Terapeutické a diagnostické využití

Protilátka podle vynálezu se může podávat lidem za účelem léčení. Proto se vynález rovněž týká farmaceutického prostředku, obsahujícího jako účinnou látku alespoň jednu protilátku nebo protilátkový fragment shora definovaný spolu s jedním nebo s několika farmaceuticky vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly. Zpravidla se protilátka podle vynálezu podává intravenózně vstřikováním nebo parenterálně. Obecně se podává dostatečně velká dávka protilátky (nebo jejího fragmentu) k dosažení žádaného potlačení nebo rozrušení nádoru. Taková dávka závisí na věku, na podmínkách, na pohlaví a na rozsáhlosti onemocnění a může být 0,1 mg/kg až 200 mg/kg, s výhodou je 0,1 mg/kg až 100 mg/kg. Účinná látka se podává jednou nebo několikrát denně a buď ve formě jedné dávky, nebo po několik dní.

Prostředky pro parenterální podání zahrnují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze, Jakožto příklady nevodných rozpouštědel se uvádějí propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje například olivový olej, a vstřikovatelné organické estery například ethyloleát, přičemž jsou vhodná i jiná rozpouštědla, známá v oboru pro tento účel, protilátky podle vynálezu se mohou používat ve formě farmaceutického prostředku obsahujícím fyziologicky vhodný nosič. Jakožto příklady takových fyziologicky vhodných nosičů se uvádějí solanka, PBS, Ringerův roztok, nebo laktátovaný Ringerův roztok. Farmaceutický prostředek může obsahovat také konzervační přísadu a jiné další přísady, jako jsou antibiotiky, antioxidanty a chelatační činidla.

Protilátkám (nebo její fragment) se také mohou konjugovat o sobě známými způsoby na cytokiny například IL-2 k podpoře své cytotoxicity.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou vhodné pro ošetřování nádorů všech druhů, včetně melanomu, gliomu a karcinomu a také nádorů oběhového systému a pevných nádorů.

-21 CZ 290477 B6

Pro diagnostické účely se protilátka podle vynálezu může konjugovat například na radio-opakní barvivo nebo se může radioaktivně značit. Výhodným značícím způsobem je způsob „lodogen“. S výhodou se protilátka podává pro diagnostické účely jako scFv fragment. Tak se dosahuje 5 lepších výsledků takže substrakce pozadí není nutná.

Následující tabulky jsou podrobně vysvětleny na str. 9.

ío Tabulka I

Reakční obrazec MAbs v ELISA a CELISA

ANTIBODY	ÍMMUNO GEN	ISOTYF	ανβ3	a Ilb23	M21	M21-L	M21-L- llb	UCLA -P3	SPECIFIC ITY
17E6	avB3	lgd/κ		-	+	-	-	4-	aV
20A9	M21	lgGI/κ	+	-	+	-	-	4-	aV
23 G5	M21	lgG1/<	4-	-	+	-	-	4-	aV
14D9.F8	M21	lgG1/<	4-	-	+	-	-	+	aV
10G2	M21	lgGI/κ	+	-	+	-	-	4-	aV
14E2	M21	lgG1/>í		-	+	+	4-	-	200 KDa
21H6	M21	lgG2a/<	-	-		+		-	200 KDa
LM609		lgGt/κ	+		+				aV&3
LM142		lgG1/«	4-	-	+	-	-	4-	ctV
P5H9		lgG1/K	-	-	+	-	-	4-	avB5
CP8		lgGI/κ	I	4·	-	-	+	-	allbB3
P4C10		lgGI/κ		-		♦	4-	4-	C1
AP3		lgG1/«	i +	+	4-	-	4-	-	I β3

antibody = protilátka specific = specificita

- 22 CZ 290477 B6

Tabulka II

Shrnutí monoklonální protilátkové reaktivity v průtokové cytometrii

	Μ21	M2Í-L	M21-L (Ρ>	Μ21- L-ltb	Μ21- 14	Μ21- L12	UCLA- P3	WM793
Antibody	pecificřty	ανΒ3;	(Μ)©’		allbB3	ανβ3;		ανΒ5	avB3;
		ανΒ5				ανΒ5			avG5
17E6	αν	++	-	-	-	++	-	+++	+++
20A9	αν	++	-	-	-	++	-	+++	+++
23G5	αν	+ +	-	-	-	++	-	+++	+++
14D9.F8	αν	++	-	-	-	++	-	+++	+++
14E2	200KDa	++	++	++	++	++	++	-	+++
LM609	ανβ3	++	-	-	-	+	-	-	++
LM142	αν	+++	-	-	-	++	-	+ +	+++
P5H9	ανβ5	+	-	-	-	+	-	++ +	+
P4C10	β!	+ +	++	++	++	++	++	++	++
AP3	β3	++	-	++	++	+	+	-	+
CP8	allb£3	-	-	-	++	-	-	-	-

antibody = protilátka specific = specificita

Tabulka III

Inhibice vývoje M21 nádoru (tumor foci) prostřednictvím 17E6 Mab v případě plicní kolonizační experimentální metastázové zkoušky myši BALB/C nu/nu

Buňky a ošetření	Úbytek nádoru	Počet tumoru foci	% kontrola
	Střed ± SEM	Medián	Rozsah
M21 (kontrola	99	87 ± 110	30	(3-378)	100
M21 + 17E6	78	8 ±7.7	5	(0-21)	9
M21-L	56	19 ± 22	8.5	(0-60)	22*

x = porovnáno s kontrolou: žádná závislost na protilátce xx = hodnota proměnné v bodě 50% kumulativního rozdělení frekvence

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

-23CZ 290477 B6

Příklady provedení

Příklad 1

Materiály

Zvířata

Jako myši pro produkci protilátky (samička BALB/c, 8 týdnů stará) a pro nádorové modely („holá myš“, samička homozygotická athymická BALB/c nu/nu, 4 až 5 týdnů stará) se používá myší od Criffa (Barcelona Španělsko). Holá myš se udržuje ve sterilní místnosti v mikrosolátorové klícce a má k dispozici sterilizovanou potrava a vodu podle libosti. Všechny manipulace se provádějí v zařízení s laminámím průtokem.

Proteiny

Fibronektin (Ruoslahti a kol., 1982), vitronektin (Yatohgo a kol., 1968) se získá z čerstvě zmrazené lidské plazmy a fibrinogen (Kazal a kol., 1963) z krve jako celku. Laminin se získá z Engelbreth-Holm-Swarmových myších nádorů (Paulsson a kol., 1987). Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny manipulace při teplotě 20 °C a všechna promývání PBS prostým vápníku a hořčíku („PBS“: 137 mM chloridu sodného, 2,8 mM chloridu draselného, 8,1 mM dinaturiummonohydrogenfosfátu, 1,5 mM monokaliumdihydrogenfosfátu, hodnota pH 7,4). PBS++ je PBS s přidaným 1 mM chloridem hořečnatým a 1 mM chloridem vápenatým. Pokud není jinak chloridem hořečnatým a 1 mM chloridem vápenatým. Pokud není jinak uvedeno používá se chemikálií nejvyšší dostupné čistoty (Měrek KGaA, Darmastadt). Cyklické peptidy například cRGDfV a cRGDfK. se syntetizují o sobě známými způsoby (například FEBS Let. 291, str. 50 až 54, 1991). Lineární peptid GRGDSPK, kterého se používá jakožto srovnávací sloučeniny, je obchodně dostupný (například jako produkt společnosti Bachem, Švýcarsko).

Nádorové buňky a kultury

Americká organizace Američan Type Culture Collection (ATCC) dodává SW1116, HT29 lidský karcinom a A375 lidský melanom a následující buněčné řady jsou dary kolegů: M21 melanom, jeho varianty M21-L a M21-L4 (Cheresh a Spiro, 1987), M21-L-IIb (připraveno podle Kieffera a kol., 1991) a UCLA-P3 lidský plicní adenokarcinom (Ceresh a kol., 1989) (Dr. D. A. Cheresh, Scripps), WM793 a WM164 melanom (Dr. M. Herlyn, Wistar) (Herlyn a kol., 1990). NP18, karcinom pankreasu (Dr. G. Cappella, nemocnice Hospital Sant Pau, Barcelona). B16F10 myší melanom od Dr. I. Fidlera (Poste a kol., 1980) (Dr. S. Aliňo, universita Universty of Valencia). EMM31 je prokazatelný v naší skupině z nádorového vzorku podle standardních histologických kriterií jakožto primární melanom (Joggle a kol., nepublikovaná pozorování). Všechny buňky se kultivují při teplotě 37 °C v prostředí obsahujícím 7,5% oxidu uhličitého a 92,5% vzduchu v 90% RPMI 1640, 10 % zárodečného telecího séra (FCS) plus 2 mM L-glutaminu a jsou prosty mykoplazmy podle patentového testu (Mycotect Kit, Gibco).

Protilátky

Monoklonální protilátkové (MAb) fůze, ELISA skríning, subklonování a udržování kultur se vždy provádí o sobě známými způsoby (Harlow a Lané, 1988), pokud není jinak uvedeno.

-24CZ 290477 B6

Příklad 2

Imunizace

MAb proti ανβ3 se produkuje intraperitoneální (ip) injekcí čištěné placentální ανβ3 imobilizované na Sepharose (80 pg ανβ3 na 80 μΐ Sepharose ve 200 μΐ PBS) nebo živých buněk (1 x 10⁶ buněk v 0,5 ml PBS) každé dva týdny po dobu dvanácti týdnů. Čtyři dny po posledním vstřiknutí se provede PEG navozená fúze za použití Friendly Myeloma (Ventrex) jako partneru, protilátky k 200 kDa melanomu asociovanému povrchovému proteinu se produkují imunizací nedotčených M21 buněk (1 x 10^s buněk v 0,5 ml PBS).

Skríning

Používá se ELISA na receptorech a na fixovaných M21 buňkách. Pro receptor ELISA se povléknou 96 důlkové ELISA destičky (Dynatech) čištěným ανβ3 (1 pg/ml v PBS, 16 hodin při teplotě 4 °C), blokují se (1,5% odstředěné mléko v PBS, 1 hodina při teplotě 4 °C) a inkubují se supematanty hybridomu. Zjistí se vázané imunoglobuliny alkalickým fosfátovým konjugátem protimyšího Ig (Dako) za použití p-nitrofenylfosfátu jako substrátu. Pro celulární ELISA, M21 nebo M21-L, M21LIIb nebo UČLAP-3 buňky se fixují na 96 důlkové tkáňové kultivační destičce (4 % paraformaldehydu v PBS, 15 minut, teplota 20 °C) a blokují se (3 % BSA, PBS, 1 hodina, teplota 4 °C) před inkubací se supematanty hybridomu a detekují se jako v receptoru ELISA. Positivní hybridy se subklonují třikrát limitujícím ředěním a přizpůsobí se prostředí RPMI. Stanoví se imunoglobulinový izotyp za použití protilátek s těžkým řetězcem specifických pro podtřídu (Zymet) nebo protilátek s lehkým řetězcem (Promega).

Jiné myší MAb, použité při studii, jsou kolegiálním darem LM609 a ανβ3 a LM142 k αν (Cheresh a Spiro, 1987) (Dr. D. A. Cheresh, Scripps), P4C10 k β 1 integrinů (Carter a kol., 1990) (Telios) a P5H9 k ανβ5 integrinovému komplexu (Wayner a kol., 1991) (Dr. E. Wayner Universty of Minesota). CP8 k αΙΙόνβ3 komplexu (Dr. Ruggieri, Scripps), AP3k β3 řetězci (Furihata a kol., 1987) (ATCC), 9.2.27 proti melanovému buněčnému povrchovému proteoglykanu (Harel a kol., 1990) (Dr. R. Reisfeld, Scripps) a 14.18 G2a proti gangliosidu GD2 (Mujoo a kol., 1989).

Příklad 3

Čištění a odlupováníprotilátky

Pro čištění ve velkém měřítku se supematanty protilátky shromáždí z exponenciálního fázového kultivačního růstu v baňkách („roller bottle“). Protilátky se čistí na proteinové A-Sepharose CL-48 (Pharmacia) dialyzují se proti PBS před sterilní filtrací (0,45 μπι) a skladováním při teplotě -70 °C (Harlow a Lané, 1988). Čištěné protilátky se zbaví endotoxinů vedením přes Kurimnover-II sloupce (Kurita-Vater, Tokyo). Tak se sníží koncentrace endotoxinů z více než 250 IJ endotoxinů v mg¹ protilátky na méně než 0,2 IJ mg¹ při Limulusově zkoušce (Melvaer aFystro, 1982). Fragmenty 17E6 F(ab')₂ a F(ab') (myší IgGi) se připraví o sobě známým způsobem štěpení pepsinu a dělení na sloupcích proteinu A (Pharmacia) s následným papainovým štěpením a separací gelovou filtrací (Harlow a Lané 1988).

Čištění ανβ3 a αΙΙόβ3 integrinů

Získá se ανβ3 z lidské placenty (Smith Cheresh, 1988). Placenta se rozkrájí a promyje v přibližně dvou objemech ledového roztoku A (0,05 % [hmotnost/objem] digitoninu, 2mM chloridu vápenatého, 2mM PMSF, hodnota pH 7,4) a zfiltruje se. Zadržený materiál se extrahuje do přibližně čtyř objemů studeného pufru B (100 mM oktyh^D-glukopyranosidu [OG], 1 mM

-25CZ 290477 B6 chloridu vápenatého, 2 mM PMSF, v PBS) a odstřeďuje se (12 000gmax, 45 minut, 4 °C). Supematant se recirkuluje přes LM609 sloupec protilátky (16 hodin, 4 °C). Po promytí pufrem C (0,1 % NP-40 v PBS, přibližně 10 cv) a pufrem D (0,1 % NP-40, 2 mM chloridu vápenatého, 10 mM octanu sodného, hodnota pH 4,5, přibližně 10 cv), vázaný materiál se eluuje pufrem E (pufr D nastavený na hodnotu pH 3,1). Eluant se neutralizuje 3M Tris (Hodnota pH 8,8), dialysuje se proti pufru C a koncentruje se přibližně 10 x za použití Aquacidu II (Calbiochem). Čištěný receptor se skladuje při teplotě -70 °C.

Z lidských destiček se připraví allbp3 (Pytela a kol., 1986). Prošlé koncentráty destiček se smísí s jedním objemem pufru Tyrodes, peletují se (1200 gmax) a peleta se extrahuje (po dobu jedné hodiny, 20 °C) s lysovým pufrem (50 mM OG, 1 mM chloridu hořečnatého, 1 mM chloridu vápenatého, 1 μΜ chloridu manganatého, 2 mM chloridu manganatého, 2 mM PMSF, 150 mM chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,4). Po odstředění (32 000 gmax, 30 minut, 4 °C) se supematant recirkuluje (16 hodin, teplota 4 °C) přes GRGDSPK konjugovanou CL—4B Sepharosovou kolonu. Kolona se promyje lysovým pufrem (přibližně lOcv) a eluuje se GRGDSPK (3 mg mF^l v 90% lysového pufru, 10% dimethylsulfoxidu). Pík se koncentruje pětkrát, dialyzuje se proti modifikovanému lysovému pufru (0,1 % NP-40 místo OG) a uloží se při teplotě -70 °C. Integrinové preparáty mají čistotu přibližně 98% podle antiintegrinové ELISA za použití a a β řetězců specifických monoklonálních protilátek a SDS-PAGE.

Příklad 4

Povrchové značení a imunocharakterizace

Buněčná povrchová biotinylace a extrakce

Buňky v exponenciálním růstu se shromáždí za použití EDTA, promyjí se a 5 x 10⁶ buněk v PBS (1 ml), povrchově se značí biotin-N-hydroxysukcinimidoesterem (10μg/ml, Signa) na nekonečném rotátoru (2 hodiny, 20 °C), promyjí se a 5 x 10⁶ buněk na mililitr se lysuje po dobu jedné hodiny při teplotě 20 °C v extrakčním pufru (100 mM OG 2 mM chloridu vápenatého, 1 mM chloridu hořečnatého a 1 mM PMSF v PBS). Po odstředění (12 000 g, 20 minut) se použije supematantu pro imunoprecipitaci.

Imunoprecipitace

Biotinylové buněčné extrakty se imunoprecipitují čištěným antiintegrinem Mab kopulovaným s kuličkami Affigelu-10 (Biorad) nebo vázanými na protein-G Sepharosu (Pharmacia). Inkubuje se 10 mg kopulovaného MAb s 5E6 buněčnými ekvivalenty biotinylovaných buněčných extraktů přes noc při teplotě 4 °C. Promyté kuličky se vaří v neredukčním SDS vzorkovém pufru, odstředí se štěpí se na 7,5% SDS-PAGE. Po elektroforetickém přenosu na nitrocelulózu (Towbin a kol., 1979) se pruhy zviditelní kozím anti-biotin alkalickým fosfatázovým konjugátem (Dako) za použití NBT-BCIP (Biorad) jakožto substrátu.

Průtoková cytomatrie

Buňka se shromáždí za použití EDTA, promyjí se a 10⁶ buněk v PBS-1 % BSA se inkubují na MAb (10 pg ml'¹, 20minut, 4 °C). Po promytí a značení (20 minut, 4 °C) s kozím anti-myším Ig-FITC (Becton Dickinson) se buňky inkubují s propidiumjodidem před analýzou průtokovou cytometrií (EPICS Profile II, Coulter). Živé buňky se oddělí vhodným způsobem na stranu a předem se rozmělní. Excituje se fluorescein při 480 nm s argonovým laserem a zaznamená se emitovaná fluorescence (525 nm). V některých zkouškách se M21-L buňky zabarví po krátké fixaci a po permeabilizačním stupni (70% ethanol, 5 minut x -20 °C.

-26CZ 290477 B6

Na komplementu závisící cytotoxicita (CDC):

Buňky M21 (10 000) se nanesou na 96 důlkovou destičku s 50 μΐ kompletního prostředí a s 20 μΐ protilátek. Jakožto zdroj komplementu se přidá králičí sérum (50 μΐ, 1 : 5, Behring) a destičky se inkubují (teplota 37 °C, 60 minut). Lyse se kvantifikuje technikou MTT (Mosmann, 1983). Procento lyse se vypočte za použití důlků s 1 % Tween-20 jakožto 100% kontrola lyse a bez protilátky jako % kontrola lyse.

Příklad 5

Růst buněk, životnost a aktivace

Zkoušky proliferace: Pro testování chronického působení protilátek se inkubuje 10⁶ buněk v přítomnosti MAb (70 pg ml“¹ PBS, 1 hodina, teplota 20 °C na nekonečném rotátoru, promyje se a resuspenduje se a dále se kultivuje v prostředí RPM1. Růst a životnost se stanovuje vylučováním Trypanové modře. Aktivace se měří MTT zkouškou shora popsanou, a počet buněk se vypočítává denně za použití čítače buněk (Coulter electronics).

Detašují se přilnuté buňky melanomu (systém 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA). Promyté buňky se očkují do 96 důlkové mikrotestovací destičky s plochým dnem (1 x 10⁴ buněk na důlek) a kultivují se bez přítomnosti (kontrola) nebo v přítomnosti sériově ředěných protilátek v RPMI prostředí s 10% FCS. Po 48 hodinách se buňky pulzačně značí po 18 hodin (18,5 kBeq [³H]tymi- dinu na důlek) a shromáždí se. Vnesená radioaktivita se měří a vyjadřuje se jako počet signálů za minutu.

Příklad 6

Zkouška protilátkou řízené buněčné cytotoxicity (ADCC)

Příprava BALB/C v mikrogliálních buněk a podmínky pro ADCCC a pro cytostasi zprostředkovávanou protilátkou efektorovou buňkou (AECM) se provádí v podstatě jako je popsáno (Sutter a kol., 1991). Buňky M21 se pulsují po dobu 18 hodin [³H]tymidinem (18,5 kBq na 4xl0³ buněk na důlek) a inkubují se na 96 důlkových destičkách s BALB/C mikroglia (5 x 10⁴ na důlek) v 200 μΐ DMEM/FCS (10%) v přítomnosti protilátky. Po 48 hodinách [³H] se měří značení setrvávající v nukleární oblasti štítových buněk. MAb závislá cytotoxicita se vypočte za použití vzorce;

[(experimentální ccpm - spontánní ccpm) / (maximální ccpm - spontánní ccpm)] x 100

Příklad 7

Na protilátce a na efektorové buňce závislá cytostasis (AECM):

Postupuje se stejně jako v případě ADCC, používá se však místo pulzovaných buněk čerstvě pasážovaných neznačených M21 buněk. Po 24 hodinách se efektorové štítové buněčné kokultury pulsují se [³H]tymidinem (18,5 kBq na důlek) po dalších 24 hodin a měří se vnesené [³H] nukleární značení.

Zkouška vázání buněk se provádí jak dříve popsáno (Goodman a kol., 1991) za použití hexosaminidazové aktivity (Landegren, 1984) ke zjištění vázaných buněk. Zředění a buněčné suspenze jsou ve připojovacím pufru (RPMI, 1 % BSA, 25 mM HEPES, hodnota pH 7,4).

-27CZ 290477 B6

Matricové ptoteiny se povléknou na 96 a 48 důlkové destičky, důlky se blokují BSA a sériově se zředěný MAb přidá do důlků s následným přidáním buněk (2,5 x 10⁴ až 5 x 10⁴). Po jedné hodině při 37 °C se nepřilnuté buňky vymyjí a vázané buňky se čítají proti standardní paralelní křivce. Inhibice vázání se vypočte za použití důlků s žádnými MAb jako srovnávacími vzorky. Zpravidla se 70 % přidaných buněk váže na vitronektin za hodinu. Vázání buněk k povlečeným důlkům samotným BSA je rutinně menší než 5 % specificky vázaných buněk.

Zkoušky sesítění. Jako při zkoušce vázání buněk se buňky nechávají vázat na destičky povlečené matricí v přítomnosti sériově řáděného 17E6 nebo jeho fragmentů F(ab')₂ nebo F(ab') a vzrůstajícího množství kozího proti myšího F(ab') jako sesíťujícího činidla. Promytí a detekce vázaných buněk jsou stejné jako pro zkoušku normálního vázání buněk.

Reverzálni zkouška vázání. Buňky se nanesou v připojovacím pufrem na důlky povlečené a blokované jako při zkoušce vázání buněk a inkubují se při teplotě 37 °C. Po protažení (60 až 75 minut) se přidají sériově ředěné MAb a buňky se vrátí do inkubátoru, nebo se buňky nechají po dobu 24 hodin před přidáním protilátky. Po dvou až třech hodinách v přítomnosti protilátky se supematanty pečlivě odstraní a nahradí se 5 krát čerstvým, předehřátým vázacím pufrem za získání konečného faktoru zředění >1 x 10⁵.

Vývoj nádoru in vivo: Nádorové buňky v exponenciálním růstu se shromáždí pomocí EDTA, promyjí se zkoušejí se se zřetelem na životnost vylučováním barviva tryptanová modř. Životnost je 96 až 99 %. Pro primární růst nádoru se buňky (0,5 x 10⁶ buněk v 0,2 ml PBS++) vstřikují subkutánně do boku holé myši. Růst nádoru se sleduje měřením průměru nádoru a objem nádoru se vypočte aproximačním vzorcem pro protáhlý elipsoid objem = [(a.b²)/2j, kde znamená a nejdelší osu nádoru a b nejkratší osu nádoru. Vždy se zkouší alespoň 8 zvířat ze skupiny.

Pro experimentální plicní metastázy se shromáždí buňky (0,05 % trypsinu/0,02 % EDTA) a vstřikují se do ocasní cévy holé myši (0,5 x 10⁶ buněk v 0,2 ml PBS++). Po sedmi týdnech se myši usmrtí, plíce se vyjmou a fixují se v Bouinsově roztoku a počítají se tumor foci na povrchu plic. Pro ošetření protilátkou se shromážděné a promyté buňky inkubují s čištěným endotoxinem prostým MAb (70 pg na 10⁶ buněk 0,5 ml PBS++) po dobu 30 minut při teplotě 20 °C v nekonečném rotátoru před zředěním na 0,5 x 10⁶ buněk v 0,2 ml PBS a před vstřikováním. Životnost buněk se posuzuje vylučováním trypanové modře před ukončením projektu vstřikování, přičemž se nezjistí žádné podstatnější rozdíly (životnost před vstřiknutím = životnost po vstřiknutí ± 5 %). Posuzují se hodnoty inhibice nádoru za použití 2-ocasních T testů podle Studenta.

Příklad 8

Molekulární biologické techniky

Pokud není uvedeno jinak, všechny molekulární biologické techniky jsou jak dříve podrobně popsáno (Sambrook a kol., 1989).

Příprava RNA a cDNA: RNA se jako celek izoluje z buněk 17E6 guanidiniumthiokanátovou extrakcí a RNA se izoluje ultraodstředěním gradientu hustoty cesiumchloridu (Chirgwin a kol., 1979). cDNA v prvním řetězci se syntetizuje za použití obchodní soupravy (Pharmacia). Syntéza se provádí v objemu 15 μΙ s 5 pg RNA po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Prvního řetězce DNA se používá přímo pro zesílení PCR.

PCR zesílení·. Oblasti obměny myšího lehkého řetězce a obměny těžkého řetězce se zesilují za použití nadbytkových a semidegenerovaných souborů PCR primerů určených ke hybridizaci myších lg vůdčích sekvencí (Jones a Bendig, 1991). Směs 61 oligonukleotidů slouží jako 5' primery nebo variabilní oblasti těžkého řetězce a směs 405 oligonukleotidů slouží jako 5'

-28CZ 290477 B6 primery pro kappa variabilní oblast řetězce. Primery 3' jsou určeny k teplotní hybridizaci v konstantní oblasti: používá se specifického lgGl a kappa myších primerů.

Pro zesílení s termostabilní DNA polymerázou se 25 μΐ reakční směsi obsahující: 1 μΐ 5 cDNA-RNA hybridu, 250 nM vhodné směsi 5' a 3' primerů, 200 μΜ každého dNTP, 1 mM chloridu hořečnatého (pro lehký řetězec), 2 mM chloridu hořečnatého (pro těžký řetězec) a 1 J Taq polymerázy (Cetus) převrství minerálním olejem a podrobí se působení hybridizační teplotě 60 až 55 °C. Po 30 cyklech (Γ X 55 °C: 1,5'x 72 °C: 45 s x 92 °C), jedna desetina reakce PCR se provádí elektroforesou na l%agarózovém TAE gelu a výsledné PDR produkty se zviditelňují 10 ethidiumbromidovým zabarvením.

Molekulární klonování a sekvencování·. Ligatuje se 1 μΐ každého PCR produktu do TA vektoru (Invitrogen, San Diego). Dvě DNA ligační reakce pro variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce se transformuje tepelným šokem do příslušného kmene E. coli ZG1 buněk k vytvoření dvou i? DNA knihoven: jedné pro lehkou variabilní oblast 17E6 Mav a druhé pro těžkou variabilní oblast 17E6 Mab. Kolonie se selektují na LB destičkách se 100 pg/ml karbenicilinu a používají se pro další analýzu. Pozitivní kolonie se detekují PCR skríningen nebo digescí s plazmidem (Gussow a Clackson, 1989). Dvouřetězcový plazmid DNA se připraví (Wizard preps, Promega Corp.) pro sekvencování z transformantů. Provádí se tepelné cyklické sekvencování za použití způsobu 20 dideoxynukleotidového řetězcového zakončení (Sanger a kol., 1977) za použití Taq polymerázy.

používá se souproudých a protiproudých sekvencujících primerů komplementárních pro TA vektor.

Zkoušky vázání integrinového ligandu a kompetice: Biotinylace ligandů Ligand v PBS se zředí 25 pětinásobnou koncentrací ligačního pufru (konečná koncentrace: 1 mg ml^-1 proteinu, 100 mM chloridu sodného, 100 mM hydrogenuhličitanu sodného, hodnota pH 8,2) v konečném objemu 1 ml. Čerstvě připravený N-hydroxysukcinimidobiotinový roztok (100 μΐ, 1 mg ml“¹ v dimethylsulfoxidu) se přidá za míchání a reakce se nechá probíhat po dobu dvou hodin při teplotě 20 °C s rotací, po vyčerpávající dialýze při teplotě 4 °C, PBS, 0,05 % nitridu sodného) se posuzuje 30 koncentrace proteinu a biotinylovaný ligand se uchovává při teplotě 4 °C a použije se v průběhu hodin. Syntéza biotinylovaného peptidu cRGDfK (cyklický-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys = Nbiotinaminohexanoová kyselina) je popsána ve známém stavu techniky a lze ji získat o sobě známými standardními způsoby.

Přímá kompetiční zkouška'. Tato zkouška je založena na některých modifikacích dřívějších způsobů (Smith a kol., 1990). Zředí se ανβ3 na 1 pg ml“¹ v pufru A (150 mM chloridu sodného, 1 mM chloridu hořečnatého, 1 mM chloridu vápenatého, 10 μΜ chloridu manganatého, 20 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,4) a 100 ml se nanese přes noc při teplotě 4 °C na 96 důlkové mikrotitrační destičky. Destička se promyje jednou pufrem B (3 % BSA [hmotnost/objem], 40 100 mM chloridu sodného, 1 mM chloridu hořečnatého, 1 mM chloridu vápenatého, 10 μΜ chloridu manganatého, 50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,4) a inkubuje se po dobu dvou hodin při teplotě 20 °C v témže pufru.

Pro propláchnutí pufrem C (pufr B s BSA o koncentraci 0,1 %[hmotnost/objem]) se přidá 45 biotinylovaný ligand (1 pg ml“¹ konečná koncentrace) a sériově ředěné testované peptidy nebo proteiny. Po inkubaci (3 hodiny, teplota 30 °C) se nevázaný ligand vymyje z destičky trojnásobným propláchnutím pufrem C a v inkubování se pokračuje po dobu další jedné hodiny s antibiotinalkalickou fosfatázovou konjugovanou protilátkou (1 : 10 000 v pufru C) (Sigma) s následným promytím PBS a detekcí vázané protilátky NBT-BCIP (Biorad) jako substrátem. 50 Molekuly ECM a protilátky se rutinně biotinylují a používají se jako takové při zkoušce konfigurace.

Zkoušky se rutinně provádějí trojnásobně až čtyřnásobně a opakují se nejméně třikrát k odvození IC50 zneváženého souhlasu sigmoidní křivky. Výsledky se normalizují proti extremním

-29CZ 290477 B6 kontrolním peptidům k umožnění intrazkouškového porovnání. Lineární RGD peptid GRD a GRGDSPK a cyklický peptid cRGDfV se rutinně zavádí do titrací jakožto externí standardy, jak tomu bylo u kontrolních důlků, kde vazba biotinylovaných ligandů k blokovaným avšak integrinů prostých důlků, a měří se antibiotinová protilátka k ligandu prostému integrinu: signál z kontrolních důlků je < 7,5 % specifického ligandového vázání. Předblokované kompetiční zkušební destičky, povlečené receptorem a blokované jako pro přímou kompetiční zkoušku se předinkubují dvojnásobně koncentrovanými protilátkami, matricovými molekulami nebo kompetitivními peptidy (50 μΐ v pufru C, jedna hodina, teplota 30 °C) před přidáním biotinylovaného zkoušecího ligandu nebo protilátky (50 μΐ v pufru C) a v inkubaci se pokračuje (3 hodiny, teplota 30 °C) s následným promytím a detekcí vázaného biotinu, jak popsáno pro přímou kompetiční zkoušku.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace

i) Přihlašovatel

A. jméno: Měrek Patent GmbH

B. město: Darmstadt

E. Země: Německo

F. poštovní údaje: (ZIP): 64271

G. telefon: 49-6151-727022

H. telefax: 49-6151-727191 ii) Název vynálezu monoklonální protilátka, její fragment, způsob její přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje iii) Počet sekvencí: 17 i v) Forma pro počítač

A. Typ média: Floppy disk

B. Počítač: IMB PC kompatibilní

C. Operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D. Software: Patentln Release # 1.0„ verse # 1,30 (EPO)

2. Informace o sekv ID. Č.l:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 381 páru bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězce: jeden

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žádná iv) Anti-smysl: žádný

v) Typ fragmentu: N-zakončení vi) Zdroj původu

A. Organismus: myš

B. Kmen: Balb/c

-30CZ 290477 B6 vii) Bezprostřední zdroj

B. Klon: 72-17E6 ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 1..129

D. Další informace:/funkce=“vedoucí - a FR-1 sekvence (vedoucí: 1 až 60, FR-1: 61-129)“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 130..162

D. Další informace:/funkce=“CDR-l sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 163..207

D. Další informace:/funkce=“FR-2 sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 208...228

D. Další informace:/funkce-‘CDR-2 sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 229...324

D. Další informace:/funkce=“FR-3 sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 325...351

D. Další informace:/funkce=“CDR-3 sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 352...381

D. Další informace:/funkce=“FR-4 sequence“

-31 CZ 290477 B6 xi) Popis sekvence ID. č. 1

ATG GTG Met Val 1

TCC TCA GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA

48 96

Ser Ser AGA TGT

Ala 5 GAT Asp

Gin Phe Leu Gly Leu Leu 10 ATC CAG ATG ACA CAG ACT

Leu ACA Thr

Leu Cys Phe Gin 15 TCC TCC CTG TCT

GTT Val

ACC Thr

Arg

Cys 20

Ile

Gin Met

Thr 25

Gin Thr

Ser

Ser 30

Leu

Ser

GCC

TCT

CTG

GGA

GAC

AGA

GTC

ATC

ATC

AGT

TGC

AGG

GCA

AGT

CAG

GAC

144

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Val

Ile

Ile

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asp

35

40

1

5

ATT

AGC

AAT

TAT

TTA

AGC

TGG

TAT

CAA

CAG

AAG

CCA

GAT

GGA

ACT

GTT

192

Ile

Ser

Asn

Tyr

Leu

Ser

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp

Gly

Thr

Val

10

1

5

10

AAA

CTC

CTG

ATC

TTC

TAC

ACA

TCA

AAA

TTA

CAC

TCA

GGA

GTC

CCA

TCA

240

Lys

Leu

Leu

Ile

Phe

Tyr

Thr

Ser

Lys

Leu

His

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

15

1

5

1

AGA

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGA

ACA

GAT

TAT

TCT

CTC

ACC

ATT

AGT

288

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

5

10

15

20

AAC

CTG

GAC

CAA

GAA

GAT

ATT

GCC

ACT

TAC

TTT

TGC

CAA

CAG

GGT

AAT

336

Asn

Leu

Asp

Gin

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Gly

Asn

25

30

1

ACG

TTT

CCG

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

GGG

ACA

AAG

GTG

GAA

ATG

AGA

381

Thr

Phe

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Met

Arg

5

1

5

10

2. Informace o sekv ID. Č. 2:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 43 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 2

-32CZ 290477 B6

Met 1

Val

Ser Ser

Ala Gin Phe Leu Gly Leu Leu

Leu

Leu

Cys

Phe 15

Gin

5

10

Val

Thr

Arg

Cys

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Thr

Thr

Ser

Ser

Leu

Ser

20

25

30

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Val

Ile

Ile

Ser

Cys

40

2. Informace o sekv ID. Č. 3:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 11 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 3

Arg Ala Ser Gin Asp

Ile Ser Asn Tyr Leu Ser

2. Informace o sekv ID. Č. 4:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 15 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 4

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys

Leu Leu Ile Phe

1S

2. Informace o sekv ID. Č. 5:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 7 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein

-33CZ 290477 B6 xi) Popis sekvence ID. č. 5

Tyr Thr Ser Lya Leu Hle Ser

2. Informace o sekv ID. Č. 6:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 32 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 6

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 15 10 15

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gin Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys 20 25 30

2. Informace o sekv ID. Č. 7:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 9 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 7

Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Tyr Thr

5

2. Informace o sekv ID. Č. 8:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 10 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 8

Phe Gly Gly Gly

Thr Lys Val

Glu Met Arg

-34CZ 290477 B6

2. Informace o sekv ID. Č.9:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 411 páru bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězec: jeden

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žádná iv) Anti-smysl: žádný

v) Typ fragmentu: N-zakončení vi) Zdroj původu

A. Organismus: myš

B. Kmen: Balb/c vii) Bezprostřední zdroj

B. Klon: 272-17E6 ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: DCS

B. Lokace: 1 „57

D. Další informace:/funkce=“vedoucí sekvence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 58..147

D. Další informace:/funkce=“FR-l sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 148..162

D. Další informace:/funkce=“CDR-l sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 163...204

D. Další informace:/funkce=“FR-2 sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 205...255

D. Další informace:/funkce=“CDR-2 sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 256...351

D. Další informace:/funkce=“FR-3 sequence“ ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 352...378

D. Další informace:/funkce=“CDR-3 sequence“

-35CZ 290477 B6 ix) Charakteristika

A. Jméno/klíč: CDS

B. Lokace: 379...411

D. Další informace:/funkce=“FR-4 sequence“ xi) Popis sekvence ID. č. 9

ATG

GGA TGG AGC TGG GTC TTT ATC TTC

CTG TTT TCA GTA ACT GCA GGT 48

Met

Gly Trp

Ser

Trp Val

Phe

Ile

Phe

Leu

Phe

Ser

Val

Thr

Ala

Gly

15

20

25

GTC CAC TCC

CAG GTC Gin Val 1

CAG CTT

CAG Gin 5

CAG Gin

TCT GGG

GCT GAA CTG GCA GAG

96

Val

His

Ser

Gin

Leu

Ser

Gly

Ala

Glu Leu 10

Ala

Glu

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

ATG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTT

144

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Met

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

AGT

AGT

TTC

TGG

ATG

CAC

TGG

GTA

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTG

192

Ser

Ser

Phe

Trp

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

1

5

1

5

10

GAA Glu

TGG Trp

ATT GGA

TAC ATT AAT CCT AGA TCT GGT TAT ACT GAG

TGT AAT

240

Ile

Gly

Tyr 1

Ile Asn Pro Arg 5

Ser

Gly

Tyr

Thr

Glu 10

Cys

Asn

GAG

ATA

TTC

AGG

GAC

AAG

GCC

ACA

ATG

ACT

GCA

GAC

ACC

TCC

TCC

AGC

288

Glu

Ile

Phe

Arg

Asp

Lys

Ala

Thr

Met

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

15

1

5

10

ACA

GCC

TAC

ATG

CAA

CTG

AGT

GGT

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

GTC

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Gly

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

15

20

25

TAT

TAC

TGT

GCA

AGT

TTT

CTG

GGA

CGA

GGG

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGT

384

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ser

Phe

Leu

Gly

Arg

Gly

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

30

1

5

1

CAA

GGA

ACC

TCA

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

411

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

ser

5

10

-36CZ 290477 B6

2. Informace o sekv ID. Č. 10:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 19 aminokyselin

B. Typ. aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 10

Met Gly Trp Ser Trp Val 1 5	Phe Ile Phe Leu 10	Phe	Ser	Val	Thr Ala Gly 15
Val	. His Ser
2. Informace o sekv ID. Č.l 1:
i)	Charakteristiky sekvence A. Délka: 30 aminokyselin B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární
ii)	Typ molekuly: protein
xi)	Popis sekvence ID. č. 11
Gin	Val Gin Leu Gin Gin	Ser	Gly	Ala	Glu	Leu	Ala	Glu	Pro	Gly Ala
1	5				10					15
Ser	Val Lys Met Ser Cys	Lys	Ala	Ser	Gly	Tyr	Thr	Phe	Ser
	20			25					30

2. Informace o sekv ID. Č. 12:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 5 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 12

Ser Phe Trp Met His

5

2. Informace o sekv ID. Č. 13:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 14 aminokyselin

-37CZ 290477 B6

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 13

Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly

10

2. Informace o sekv ID. Č.14:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 17 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) popis sekvence ID. č. 14

Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Cys Asn Glu Ile Phe Arg

10 15

ASp

2. Informace o sekv ID. Č. 15:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 32 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence ID. č. 15

Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin

10 15

Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser

25 30

2. Informace o sekv ID. Č. 16:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 9 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein

-38CZ 290477 B6 xi) Popis sekvence ID. č. 16

Phe Leu Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr

2. Informace o sekv ID. Č. 17:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 11 aminoky selin

B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi Popis sekvence ID. č. 17

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

Průmyslová využitelnost

Monoklonální protilátka, buněčná linie hybridoma produkující tuto protilátku, DNA sekvence kódující pro tuto protilátku a aminokyselinové sekvence. Monoklonální protilátka, jejíž výhodné provedení se označuje jako 17E6, mající následující vlastnosti

- reaguje pouze s aV-řetězcem lidských aV-integrinů,

- blokuje vazbu na integrinový substrát buněk nesoucích aV-integrin,

- spouští reverzaci zavedené interakce matrice buněk způsobenou aV-integriny,

- blokuje vývoj nádorů a

- je prostá cytotoxických účinků je vhodná pro přípravu farmaceutického prostředku proti nádorům, zvláště proti melanomu nebo pro diagnostickou lokaci a pro posouzení růstu nádoru.

Claims (23)

1. Monoklonální protilátka nebo její fragment, která má následující vlastnosti

- reaguje pouze aV-řetězcem lidského aV-integrinu,

- blokuje vazbu buňky nesoucí aV-integrin na integrinový substrát,

- spouští reverzaci zavedené interakce buněčné matrice způsobenou aV-integrinem,

- blokuje vývoj nádorů,

- je prostá cytotoxických účinků a

- obsahuje aminokyselinové sekvence úseků základní struktury a komplementaritu určujících úseků lehkého řetězce od pozice 21 do pozice 127 podle obr. 17a a těžkého řetězce od pozice 20 do pozice 137 podle obr. 17b.

2. Monoklonální protilátka, podle nároku 1, přičemž integrinovým substrátem je vitronektin, fibrinogen nebo fibronektin.

3. Monoklonální protilátka, podle nároku 1 nebo 2, přičemž, jehož růst buněk se má blokovat, je melanom.

4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku nebo její fragment podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

5. Linie buněk hybridomu A(B) mající označení 272-17E6 a uložená pod číslem DSM ACC2160, schopná produkovat monoklonální protilátku s vlastnostmi podle nároku 1.

6. Monoklonální protilátka, produkovaná linií buněk hybridomu podle nároku 5.

7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku podle nároku 6 a farmaceuticky přijatelný nosič.

8. Linie buněk schopná produkovat monoklonální protilátku podle nároku 1 obsahující aminokyselinové sekvence úseků základní struktury a komplementaritu určující úseky lehkého řetězce pozice 21 do pozice 127 podle obr. 17a a těžkého řetězce od pozice 20 do pozice 137 podle obr. 17b.

9. Polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence podle obr. 17a.

10. Polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence podle obr. 17b.

11. Polypeptid sestávající z aminokyselin od pozice 1 do pozice 107 podle obr. 17a.

12. Polypeptid sestávající z aminokyselin od pozice 1 do pozice 118 podle obr. 17b.

13. Polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence lehkého řetězce od pozice 21 do pozice 127 podle obr. 17a.

14. Polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence těžkého řetězce od pozice 20 do pozice 137 podle obr. 17b.

15. Molekula DNA kódující polypeptid podle nároku 13.

16. Molekula DNA kódující polypeptid podle nároku 14.

-40CZ 290477 B6

17. Vektor DNA obsahující nukleotidový řetězec od pozice 61 do pozice 381 SEQ ID. Č:l.

18. Vektor DNA obsahující nukleotidový řetězec od pozice 58 do pozice 411 SEQ ID Č:9.

19. Vektor DNA obsahující nukleotidový řetězec od pozice 1 do pozice 381 SEQ ID C: 1.

20. Vektor DNA obsahující nukleotidový řetězec od pozice 1 do pozice 411 SEQ ID Č:9.

21. Způsob přípravy monoklonální protilátky podle nároku 1, vyznačující se tím, že se imunizuje myš čištěným ανβ integrinem, selekují se klony vážící se na čištěný ανβ receptor prostřednictvím ELISA, produkuje se buněčná linie produkující protilátku a protilátka se izoluje.

22. Způsob podle nároku 21, v y z n a č u j í c í se t í m , že integrinemje vitronektin.

23. Způsob přípravy monoklonální protilátky podle nároku 1, vyznačující se tím, že se imunizuje myš čištěným vitronektinem, selekují se klony vážící se na čištěný vitronektinový receptor prostřednictvím ELISA, produkuje se buněčná linie produkující protilátku a protilátka se izoluje.