PL182961B1 - Przeciwciało monoklonalne, fragmenty F(ab') i F(ab') oraz pojedyńczołańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego, hybrydomowa linia komórkowa, sekwencja DNA, sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego i zastosowanie przeciwciała monoklonalnego - Google Patents

Abstract

1. Przeciwcialo monoklonalne zawierajace sekwencje aminokwasowa regionów zrebu (FR) i regionów determinujacych dopasowanie (CDR) lekkiego lancucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciezkiego lancucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadajace nastepujace wlasciwosci: - reaguje tylko z lancuchem av ludzkiej integryny av, - blokuje wiazanie sie podloza integrynowego z komórka niosaca integryne av , - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integryne av, - blokuje rozwój nowotworu, oraz - nie wykazuje aktywnosci cytotoksycznej. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne, fragmenty F(ab') i F(ab')₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego, hybrydomowa linia komórkowa, sekwencja DNA, sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego i zastosowanie przeciwciała monoklonalnego.

Przeciwciało monoklonalne będące przedmiotem wynalazku wytwarzane jest przez hybrydomową linię komórkową. Monoklonalne przeciwciało, którego korzystna odmiana ma nazwę 17E6, posiada następujące właściwości: reaguje tylko z aV-łańcuchem ludzkich aV-integryn, blokuje przyłączanie do integrynowego podłoża komórki niosącej aV-integrynę, dokonuje odwrócenia ustalonej interakcji matrycy komórki powodowanej przez aV-integryny blokuje rozwój nowotworu i nie wykazuje cytotoksycznej aktywności. Będąca przedmiotem wynalazku hybrydomowa linia komórkowa o oznaczeniu 272-17E6 jest złożona pod numerem dostępu DSM ATCC 2160 hybrydomowej Sekwencje DNA kodują przeciwciało lub jego części. Sekwencje są podane na fig. 17a i 17b i w załączonym protokole sekwencji.

Integryny są super-rodziną komórkowych receptorów adhezji powierzchniowej, kontrolujących przyłączanie komórek do stałego otoczenia zewnętrznego - zarówno do pozakomórkowej matrycy (ECM), jak i do innych komórek.

Adhezja ma fundamentalne znaczenie dla komórki; pozwala na zakotwiczenie, sygnalizuje początek migracji i sygnalizuje wzrost i różnicowanie.

Integryny są bezpośrednio związane z wieloma normalnymi i patologicznymi stanami i jako takie są podstawowymi celami terapeutycznej interwencji.

Integryny są integralnymi transmembranowymi białkami, heterodimerami, których specyficzność wiązania zależy od tego, który z pewnych 14 α-łańcuchów jest połączony z pewnym z 8 p4ańcuchów.

Integryny klasyfikuje się w cztery zachodzące na siebie podrodziny, zawierające łańcuchy BI, B2, B3 lub αν, i dana komórka może wytwarzać kilka różnych integryn z każdej podrodziny.

W ostatniej dekadzie wykazano, że integryny są głównymi receptorami związanymi z komórkową adhezją. Raporty dotyczące integryn podał np. E. Ruoslahti (J. Clin. Invest., 1991, 87) i R. O. Hynes (Celi, 1992, 69), i mogą one być odpowiednimi celami terapeutycznej interwencji.

Poza erytrocytami, wszystkie ludzkie komórki wytwarzają jedną lub więcej integryn. Ich funkcje są regulowane na wielu poziomach, ale przede wszystkim, ich specyficzność wobec ligandów zależy od tego, który α-łańcuch wiąże się z którym β-łańcuchem w heterodimerze, oraz od stanu aktywacji integryn (Hynes, 1992; Diamond i Springer, 1994).

Tło komórkowe, na którym operują integryny (Chan i Hemler, 1993), i wariant rozszczepienia stosowanej postaci integryny (Delwel i in., 1993) może także wpływać na specyficzność.

Zważywszy na tę złożoność, jednym z kilku pewnych wskaźników specyficzności integryn jest bezpośrednie zaburzenie funkcji integryn i analizowanie, które odpowiedzi komórki zmieniły się.

Historia badań integryn wykazała, że reagenty specyficznie blokujące funkcje integryny są decydującymi czynnikami w analizie funkcjonalnej, od blokującego funkcje CSAT-przeciwciała, które pierwsze zdefiniowało integrynowy βΐ-łańcuch (Neff i in., 1982), do licznych istotnych późniejszych przykładów (eg. P1D6, P1B5 (Wayner i Carter, 1987), P4C10 (Carter i in., 1990), ΑΙΙΒ2 (Hall i in., 1990), 3A3 (Turner i in., 1989) G0H3 (Sonnenberg i in., 1987), LM609 (Cheresh i Spiro, 1987)): dziedzina całkowicie zależy od istnienia takich reagentów.

Integryny serii αν są obecnie główną podrodziną, zarówno z klasycznymi, jak i nowymi funkcjami. Poza klasyczną mediacją przyłączania i rozprzestrzeniania się komórek (Pytela i in., 1985; Cheresh, 1991), αν-integryny są także związane z lokomocją komórki (Seftor i in., 1992), internalizacją receptorów (Panetti i McKeown Longo, 1993a; Panetti i McKeown Longo, 1993b), jako ko-receptory wirusowe (Wickham i in., 1993), w zarządzaniu pozakomórkowymi kaskadami proteazy (de Boer i in., 1993), i jako regulatory rozwoju nowotworów (Felfing

182 961

Habermann i in., 1992). Specyficzności 5 znanych serii αν integryn, ανβΐ (Zhang i in., 1993), -β3 (Pytela i in., 1985; Cheresh i in., 1987), -β5 (Cheresh i in., 1989), -β6 (Busk i in., 1992) i β8 (Moyle i in., 1991), zdefiniowano częściowo, i wydają się one wyłącznie rozpoznawać ligandy niosące trójpeptydowe sekwencje RGD-(NH2-arginina-glicyna-kwas aspartowy-COOH), w tym sekwencje w witronektynie (ανβΐ, ανβ3, ανβ5), fibronektynie (ανβΐ, ανβ3, ανβ5 ανβό), i czynniku νοη Willebranda, fibryno-genie i osteopontynie (ανβ3) (e.g. 1991; Busk i in., 1992; Zhang i in., 1993; Denhardt i Guo, 1993; Smith i Cheresh, 1990). Dimery z podobnymi specyficznościami można współwytwarzać w tych samych komórkach (eg. ανβ3 i αν β5 - dla witronektyny na komórkach M21) (Wayner i in., 1991), ale mogą one kontrolować niezależne funkcje. Jednak nakładające się specyficzności ligandowe w rodzinie αν i także pomiędzy seriami αν- i βΐ- integryn oznaczają, że przypisanie funkcji zdefiniowanym receptorom w danym otoczeniu komórkowym jest problematyczne. Blokujące funkcje przeciwciała pełniły ważną funkcję w wyjaśnianiu działania ανβ3 (Cheresh i Spiro, 1987; Chuntharapai i in., 1993) i ανβ5 (Wayner i n., 1991). Jednak, dla innych αν-integryn, nie są znane przeciwciała specyfikujące kompleksującą i zakłócającą funkcję. W szczególności dostępnych jest kilka reagentów specifikujacych αν-łańcuch kompleksu i zakłócające integrynowe funkcje całej rodziny. Lehmann i in. (1994) opisał przeciwciało ανβχ, które nie wykazuje odwrócenia interakcji matrycy komórki i aktywności blokowania rozwoju nowotworu.

Wobec tego istnieje ciągłe zainteresowanie działaniem serii αν integryny na rozwój nowotworu. Ludzka złośliwa melanoma jest coraz szerzej rozpowszechnionym agresywnym rakiem skóry. Związane są z tym postępem melanomy zwiększone poziomy integryn η2β1 (Danen i in., 1993; Etoh i in., 1992), α3β1 (Natali i in., 1993; Yoshinaga i in., 1993), α4β1 (Hart i in., 1991), i αόβΐ (Hart i in., 1991), ale najspójniej integryny z serii αν. W szczególności, zarówno inwazja pierwotnego nowotworu, kal i odległe metastazy charakteryzują się histologicznie zwiększonym wytwarzaniem integryny ανβ3, „receptora witronektyny”. Pierwotne nieinwazyjne nowotwory i niezłośliwe melanotyczne znamiona wytwarzają niewiele wykrywalnego ανβ3, receptora rzadkiego w zdrowej dorosłej tkance (Brooks i in., 1994; Buck i in., 1990; Pignatelli i in., 1992; Lessey i in., 1992; Korhonen i in., 1991; Nesbitt i in., 1993). Immunohistochemia fazowych nowotworów i metastaz wykazała stały wzrost ilości ανβ3 w fazie inwazyjnej (Albelda i in., 1990; Si i Hersey, 1994), masowe badania linii melanomowych ujawnia wysokie wytwarzanie integryn serii av (Sanders i in., 1992; Gehlsen i in., 1992; Marshall i in., 1991), i ponadto rosnące naczynia włosowate wytwarzają ανβ3 w czasie angiogenezy nowotworu (Brooks i in., 1994).

Studia in vivo także wskazują na rolę ανβ3 w rozwój melanomy. W mysim układzie melanomowym B16-F10, eksperymentalną metastazę płucną można stłumić wysokim poziomem peptydów RGD (Hardan i in., 1993); Humphries i in., 1986), silnych blokerów funkcji av-integrynowych. Ostatnio Felding-Habermann i współpracownicy wykazali że integryny serii αν promują podskórny wzrost nowotworu M21 ludzkiej melanomy u myszy o osłabionej odporności. Układ M21 jest elegancki i składa się z zestawu komórek wytwarzających integryny αν różnych serii (Kieffer i in., 1991; Felding-Habermann i in., 1992; Cheresh i Spiro, 1987). Macierzysty M21, wytwarza ανβ3 i ανβ5 (Wayner i in., 1991): wiąże się z witronektyną i rośnie jako podskórny nowotwór. M21-L, somatyczny wariant M21, nie wykazuje αν (Cheresh i Spiro, 1987): nie może wiązać witronektyny i powoduje rozwój powolnie rosnących nowotworów. M21-L4 jest transfektantem M21-L, trwale wytwarzającym pełnej długości αν-łańcuch: wiąże on witronektynę i rośnie gwałtownie jako podskórny nowotwór (Felding-Habermann i in., 1992). Tak więc obecność integryn αν powierzchni komórki jest bezpośrednio skorelowany z podskórnym wzrostem M21.

Jednak, M21 poddawano ekstremalnym ciśnieniom selekcyjnym w czasie ustalania wariantowych linii M21-L i M21-L4. W tym wynalazku odkryto, że αν-integrynową funkcję rodzimej populacji M21 można blokować, co daje zaskakujący efekt zachowania komórki i rozwój nowotworu. Peptydowych antagonistów można syntetyzować z łatwością, jednak ich zastosowanie jest ograniczone ze względu na słabą biodostępność, krótkie półtrwanie in vivo

182 961 i szybkie zanikanie u zwierząt (Humphries i in., 1988). Jednorodne przeciwciała oferują interesującą alternatywę dla peptydów. Mają one długi czas półżycia in vivo (Tao i Morrison, 1989; Haba i in., 1985) i ich specyficzności wiązania można wykazać standardowymi technikami. Niestety, chociaż istnieją doskonałe αν-specyficzne przeciwciała, takie jak LM142 (Cheresh i Spiro, 1987), istnieje niewiele efektywnie blokujących αν-integrynowe funkcje.

Specyficzność i biologiczna funkcja członków rodziny αν jest dyskusyjna, przede wszystkim ze względu na nieistnienie reagentów wyłączających funkcję całej klasy - nie istnieje silnego blokującego αν przeciwciała. Odkrycie, że klasyczna adhezja receptorów rodziny integryn wspiera inne mniej konwencjonalne biologiczne funkcje zintensyfikowała poszukiwania ich molekularnych mechanizmów działania. Poszukiwania ujawniły kilka nieprzewidzianych regionów na integrynach, które allosterycznie informują o ich stanie aktywacji, lub po ligacji, mogą same aktywować funkcje integrynowe. Inhibitory integrynowej funkcji, w przeciwieństwie do tego, zwykle okludują aktywne miejsce, przy czym klasycznym przykładem są peptydy RGD replikujące miejsce rozpoznawania integryny wielu łigandów integryny serii αν ία5β1.

Wynalazek opisuje takie nowe, blokujące funkcje, przeciwciało skierowane wobec ludzkiego łańcucha αν-integryny, oznaczony 17E6. Wiele raportów przedyskutowało nieodwracalną naturę interakcji pomiędzy ανβ3 i jego ligandem, np. witronektyną. Opisano tu, że 17E6 będzie gwałtownie włączał tak zwaną nieodwracalną interakcję pomiędzy integrynami serii αν i ich podłożami, sugerując terapeutyczne zastosowanie. Wynalazek analizuje mechanizm działania 17E6 i stwierdza, że jest on bardzo słabym współzawodnikiem dla ligandowego wiązania z ανβ3, podczas gdy witronektyną i oparte na RGD sondy miejsc aktywnych silnie współzawodniczą ze sobą na receptorze. Inne przeciwciała silnie współzawodniczą za 17E6. Tak więc, 17E6 działa jako allosteryczny inhibitor. Krzyżowy eksperyment ujawnia, że ανβ3, ale nie ανβΐ lub ανβ5, musi być dimeryzowany przed zablokowaniem 17E6. Wynalazek ujawnia, że 17E6 działa dzięki nowym mechanizmom obejmującym manipulację indukowanymi integryną ścieżkom transdukcji sygnałów. Przeciwciało według wynalazku blokuje rozwój nowotworu, i ponadto nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

- reaguje tylko z łańcuchem ety ludzkiej integryny Oy,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę Oy,

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę ety,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.

Korzystnie jako podłoże integrynowe stosuje się witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę.

Przeciwciało charakteryzuje się tym, że powoduje zahamowanie wzrostu nowotworu, poprzez blokowanie rozrostu komórek nowotworu melanoma.

Przedmiotem wynalazku jest także fragment F (ab') i F (ab^ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak przeciwciało monoklonalne, przy czym przeciwciało to zawiera sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

- reaguje tylko z łańcuchem ciy ludzkiego integryny Oy,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę Oy,

182 961

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę ety,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest hybrydomowa linia komórkowa o oznaczeniu 272-17E6 i złożona pod numerem dostępu DSM ACC2160, charakteryzująca się tym, że może wytwarzać przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty fragmenty F (ab'), i F (ab')₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja aminokwasowa, stanowiąca sekwencję przedstawioną na fig. 17a.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja aminokwasowa, stanowiąca sekwencję przedstawioną na fig. 17b. Korzystnie sekwencja ta rozpoczyna się od pozycji 21, a bardziej korzystnie od pozycji 20.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja DNA, stanowiąca sekwencję przedstawioną na fig. 17a albo jej mutanty lub warianty kodujące FR(y) i CDR(y) lekkiego łańcucha przeciwciała monoklonalnego o następujących właściwościach:

- reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny ος,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę Oy,

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę ety,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja DNA, stanowiąca sekwencję z fig. 17b albo jej mutanty lub warianty kodujące FR(y) i CDR(y) lekkiego łańcucha przeciwciała monoklonalnego o następujących właściwościach:

- regeneruje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny Oy,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę Oy,

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę «y,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku zawiera sekwencję początkową przedstawioną na fig. 17a., a bardziej korzystnie sekwencja według wynalazku zawiera sekwencję początkową przedstawioną na fig. 17b.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

- reaguje tylko z łańcuchem (\ ludzkiej integryny oiy,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę ciy,

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę ety,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej, lub fragmenty F (ab*) i F (ab')₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne, polegający na tym, że immunizuje się mysz oczyszczoną integryną aVb3, wybiera się klony wiążące się z oczyszczonym receptorem aVb3 w teście ELISA i wytwarza się standardowymi

182 961 technikami specyficzną linię komórek produkującą to przeciwciało. Korzystnie jako podłoże integrynowe stosuje się witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę, a najkorzystniej jako integrynę stosuje się witronektynę.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

- reaguje tylko z łańcuchach ludzkiej integryny cą,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę ος,

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę ot^

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej, do wytwarzania leku do leczenia nowotworu, korzystnie melanoma.

Korzystnie że jako podłoże integrowane stosuje się witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę.

Również korzystnie jako przeciwciało monoklonalne można stosować fragmenty F(ab') i F(ab')₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne, przy czym przeciwciało to zawiera sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

- reaguje tylko z łańcuchem ludzkiej integryny c^,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę Oy,

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę c^,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

- reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryńy cę,

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę ος,,

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę c^,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz

- nie wykazuje aktywności cytotoksycznej, do wytwarzania środka diagnostycznego do lokalizacji i oceny wzrostu nowotworu.

‘ Korzystnie do realizacji tego sposobu jako podłoże integrynowe można stosować witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę. Również korzystnie można stosować jako przeciwciało monoklonalne - fragmenty F(ab9 i F, (ab^ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne, przy czym przeciwciało to zawiera sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty łub warianty posiadające następujące właściwości:

- reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny

- blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę ety,

182 961

- uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynęcty,

- blokuje rozwój nowotworu, oraz nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.

Kwestie ogólne, materiały, liczby, tabele, skróty:

Mikroorganizmy, linie komórek, plazmidy, fagemidy, promotory, znaczniki oporności, początki replikacji lub inne fragmenty wektorów wspomniane w opisie są zwykle handlowo lub inaczej ogólnie dostępne. W pewnych przypadkach wyżej wspomniane materiały nie są bezpośrednio dostępne, jednak stosuje się je tutaj tylkoprzykładowo w celu wykazania właściwości lub efektów przedmiotów wynalazku.

Monoklonalne przeciwciało 17E6 jest przeciwciałem, które jest wytwarzane przez hybrydomową linię komórek mającą oznaczenie 272-17E6. Linię komórek złożono pod numerem dostępu DSM ACC2160 w Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Braunschweig, RFN. Techniki i metody, które są istotne według wynalazku opisano szczegółowo w opisie. Inne technologie, których nie opisano szczegółowo, odpowiadają standardowym metodom, dobrze znanym fachowcom, lub są opisane bardziej szczegółowo w cytowanych odnośnikach i opisach patentowych i w standardowej literaturze.

Sekwencje DNA i aminokwasowe obejmują także nieco zmienione sekwencje, takie jak mutanty i warianty, który można otrzymać intencjonalnie lub przypadkowo w chemicznych lub fizycznych procesach. Zwykle dołączono wszystkie takie mutanty i warianty, które wykazują opisane właściwości i funkcje.

Termin „przeciwciało” obejmuje także, z zasady, fragmenty przeciwciał, takie jak F(ab'), F (ab')₂ lub pojedynczo łańcuchowe Fvs. Fragmenty te można wytwarzać zwykłymi standardowymi technikami.

Skróty:

αΙ1ήβ3	integryna
ανβϊ	integryna
ανβ3	integryna
ανβ5	integryna
ανβό	integryna
ανβ8	integryna
1OG1	Mab
14.18 G2a	Mab
14D9.F8	Mab
14Ε2	Mab
17Ε6	Mab
20Α9	Mab
23G5	Mab
3Α3	Mab
9.2.27	Mab
ADCC	skierowana na przeciwciało cytotoksyczność komórkowa
AECM	cytostaza zależna od przeciwciała i komórki efektorowej
AIIB2	Mab
AP3	Mab
ATCC	zbiór American Type Culture
B16F10	linia komórek
CP8	Mab
CSAT	Mab
cRGDfV	cykliczny peptyd: Arg-Gli-Asp-DFen-Wal
cRGDfK	cykliczny peptyd: Arg-Gli-Asp-DFeb-Liz
EMM31	linia komórek
GOH3	Mab

182 961

GRGDSPK	peptyd: Gli-Arg-Gli-Asp-Ser-Pro-Liz
LM142	Mab
LM609	Mab
M21	linia komórek
M21-L	linia komórek
M21-L-IIb	linia komórek
M21-L4	linia komórek
Mab	monoklonalne przeciwciało
MTT	bromek 3-(4-5-dimetylotiazol-2-ilo)-2-5-diphenylotetrazoliowy
NBT-BCIP	nitrowy błękit tetrazolowy - fosforan bromochloroindolilu
NP 18	linia komórek
OG	glukozyd oktylu-(detergent)
P1D6	Mab
P1H6	Mab
P4C10	Mab
P5H9	Mab
PMSF	fluorek fenylometylosulfonylu
RGD	peptyd: NH2-arginina-glicyna-kwas-aspartowy-COOH
SDS-PAGE	electroforeza na żelu dodecylosiarczan sodu/poliakryloamid
UCLAP-3	linia komórek
WM164	linia komórek
WM793	linia komórek
V+B2	linia komórek

Tabela 1

Przeciwciała porównywano testem ELISA i komórkowym testem ELISA. Reagenty i specyficzności przedyskutowano w pełni w tekście: + = pozytywna reakcja, - = bez reakcji.

Klucz: - Przeciwciało. Przeciwciała badane w tym studium (wytłuszczone), standardowe reagenty {kursywa). - Immunogen: ανβ3 = unieruchomiona ludzka łożyskowa integryna ανβ3. M21 - nietknięte komórki M21. - Oczyszczone ανβ3 i αΙΙβ3 unieruchomiono na 96-komórkowych płytkach testem ELISA.

- linie komórek M21, M21-L i M21-L-IIb, i UCLAP3 hodowano i unieruchomiono na płytkach i testowano na reaktywność przeciwciał w CELISA.

- Specyficzność: (patrz tekst) αν - łańcuch αν integryn ssaka. 200 KDa = nieznane białko powierzchniowe o masie cząsteczkowej 200,000 komórek melanomy. ανβ5 - integryna ανβ5. βΐ = łańcuch integryny βΐ. β3 = łańcuch integryny β3.

Tabela 2

Poziomy reaktywności względem kontroli (tylko wtórne przeciwciało) oceniono jak następuje: 1-2 (-), 2-4 (+), 4-9 (++), >9 (+++). Np. na M21 względem intensywność fluorescencji kontroli wynosiła typowo 30-50 jednostek, a dla wiązania LM142 wynosiła 300-500 jednostek, dając średnią względną reaktywność około 10 (400/40).

(*) M21-L permeabilizowano 70% etanolem w temperaturze -20°C.

(@) M21-L ma wewnątrzkomórkową pulę łańcucha β3 integryny VNR.

Tabela 3

Komórki M21 i M21-L zebrano trypsyną/EDTA, inkubowano z przeciwciałem 17E6 lub kontrolnym, przemyto i wstrzyknięto do żyły ogonowej nagiej myszy. 7 tygodni później zwierzęta zabito i zbadano płuca na miejsca rozwoju ognisk nowotworów. Wstępne przetwarzania 17E6 obniżyło liczbę ognisk. Podobna liczba ognisk powstała, gdy wstrzyknięto komórki M21-L (którym brak αν na powierzchni komórki).

* = Porównanie z kontrolą: nie zależy od przeciwciała

182 961

Figura 1. Analiza fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) grupy alfa-V przeciwciał i kontroli wobec ludzkich komórek melanomy M21 i M21L. Komórki inkubowano z 10 pg/ml pierwotnego przeciwciała, zabarwiono fluorescencyjnie znaczonymi wtórnymi przeciwciałami, przeciwbarwiono jodkiem propidiowym w celu bramkowania nekrotycznych komórek i zanalizowano 10000 komórek na próbkę. Otwarty pik reprezentuje intensywność samego przeciwciała drugiej warstwy. Zamknięty pik intensywność specyfikacji pierwotnego i wtórnego łącznie. Pionowa oś pokazuje liczbę komórek na kanał, pozioma oś pokazuje logarytm fluorescencyjnej intensywności w tym kanale. M21 niesie powierzchniowy αν integryny, M21-L nie. Wzór zabarwiania dla przeciwciał grupy alfa-V ściśle odpowiada zabarwieniu LM142 (αν-specyficzne) i LM609 (ανβ3-specyficzne). W szczególności reagują z M21, a minimalnie z M21-L. Przeciwciało 9.2.27 reaguje z powierzchniowym proteoglikanem. 14E2 i 21H6 rozpoznają przeciwnie niezdefiniowane powierzchniowe białko melanomy 200 KDa. Ich wzory zabarwienia są oddzielone od zabarwień grupy alfa-V. Szczególnie reagują podobnie z M21 i M21-L.

Figura 2. Immunowytrącanie podobnych białek przez przeciwciała grupy Alfa-V. Żywotne komórki M21 melanomy (A) były oznakowane powierzchniowo biotyną, ekstrahowane detergentem, immunostrącone i rozdzielone na nieredukującym SDS-PAGE 7,5%. Standards przepuszczono drogą a, a masy w KDa pokazano z lewej strony. Wtrącano kontrolnymi przeciwciałami LM142 (anty-αν: droga b) i LM609 (anty-av^3: droga c), i 21H6 (droga d), 10G2 (droga e), 20A9 (droga f), 23 G5 (droga g), 17E6 (droga h), 14D9 (droga i), i 14E2 (droga j). LM142 i LM609 wytrąca podobny wzór białkowy co 10G2, 20A9, 23G5, i 17E6, a 21H6 i 14E2 wytrąca pasmo ~200 KDa. 14D9 wytrąca oba wzorce. M21 melanomę (B), M21-L αν-deficytową melanomę (C), i komórki UCLAP-3 (D) oznakowano powierzchniowo biotyną, i immunostrącano jak w (A). Strącano przeciwciałami LM142 (anty-αν: droga b), LM609 (anty-αvβ3: droga c), 17E6 (droga d), AP3 (anty-β3: droga e) i 20A9 (droga f). Znaczniki masy cząstkowej przepuszczono drogą a, a masy w KDa pokazano z lewej strony. Wskazano pozycję pasm αν, βΐ, β3, β5.

Figura 3. 17Ε6 przeszkadza w początkowym przyłączaniu komórek do witronektyny. Serię melanomowych linii (Mels.) i linię komórek raka (Cars.) przesiano metodą FACS na reaktywność z 17E6 Mab. Intensywności FACS opisano w tabeli 2. Komórkom pozwolono się przyłączyć do podłoży powlekanych witronektyną (0,5 g/ml powłoki) w obecności hybrydomowych supematantów z 17E6 (otwarte) lub 14E2 (zamknięte). Po przemyciu przyłączone komórki policzono tak, jak opisano w Materials and Methods, i dane normalizowano do przyłączania w nieobecności przeciwciała. Należy zauważyć, że poza B16F10 (mysia melanoma), wszystkie komórki były ludzkie. Malme 3 jest linią fibroblastów. Absolutny procent komórek związanych w nieobecności przeciwciała wynosił dla M21 (70%), WM164 (68%), A375 (75%), EMM31 (67%), WM793 (65%), MaIMe3 (67%), B16F10 (70%), UCLA-P3 (76%), NP-18 (65%), SW1116 (68%), HT29 (65%). .Oś pozioma: przyłączenie komórki w % kontroli.

Figura 4. 17E6 zakłóca adhezję mediowana przez integryny ανβ3 i ανβ5. Oczyszczone monoklonahie przeciwciała (Mab) lub mysie komórki puchliny współinkubowano w czasie przyłączania komórek do powleczonych witronektyną podłoży (5 mg/ml). Linie komórek (A, B) M21, (C, D) UCLAP-3; (E, F) WM-793. Symbole reprezentują następujące przeciwciała (specyficzności): ( · ) = 17E6 (av); ( ▲) = LM609 (ανβ3); ( ♦) = 14D9F8 (αν): (O ) = P4C10 (βΐ); (□) P5H9 (ανβ5); ( V ) = PSH9 + LM609 (rozcieńczenia od 10 pg/ml) (ανβ3+ανβ5). Oś pionowa: komórki przyłączone (%). Oś pozioma: z lewej: Mab (pg/ml), z prawej strony: rozcieńczeniekomórek puchlin (l/x).

Figura 5. 17E6 zakłóca adhezję do witronektyny ale nie innych elementów matrycy. Zbadano działanie 17E6 (αν,) i P4C10 (βΐ,) na przyłączanie komórek do witronektyny (A), lamininy (B) lub kolagenu typ I (C). Blokowanie przyłączania komórek 17E6 zachodziło tylko na powierzchniach powlekanych VN. Blokowanie przyłączania komórek P4C10 zachodziło tylko na powierzchniach powlekanych kolagenem typ I i lamininą.

182 961

Oś pozioma: rozcieńczenie P4C10 (llx) (górna oś) i Mab (pg/ml) (dolna oś); oś pionowa: % komórek związanych.

Figura 6. 17E6 odwraca ustalone połączenia komórka-witronektyna.

M21 melanomę łączono przez 24 godziny z powierzchniami powlekanymi witronektyną (VN - górny wiersz) lub fibronektyną (FN - dolny wiersz). Komórki przyłączone przez 30 minut, dobrze spłaszczone, namnażały się przez 24 godziny (a, e), gdy do hodowli dodano 17E6 (b, f). Po 30 minutach na witronektynie (b) komórki zaokrągliły się, podczas gdy na fibronektynie (f) pozostały płaskie. LM609 (c, g) i 14E2 (d, h) słabo wpływały na oba podłoża. Stężenia przeciwciał: - (b): 0,1 pg/ml.(c, d, f-h): 100 pg/ml.

Figura 7. Rozwój ludzkiej melanomy M21 u nagich myszy BALB/c jest modulowany av-integrynami.

A, B. Wpływ 17E6 na podskórny rozwój M21. 0,5 χ ΙΟ⁶ M21 (A.) lub M21-L (B) inkubowano z buforem ( O ), przeciwciałami 17E6 ( · ) lub 14E2 (Δ) i wstrzyknięto podskórnie nagim myszom. Po pewnym czasie rozmiary nowotworu zmierzono i objętość wykreślono. Pokazano typowy eksperyment. Słupki błędów pokazują s.e.m. z 8 zwierząt na grupę. Oś pionowa: objętość nowotworu (mm³), oś pozioma: dni po wstrzyknięciu.

C. Wpływ αν na eksperymentalną metastazę M21.

0,32 χ 10⁶ ( ♦ , ) lub 1 χ 10⁶ ( < , □ ) komórek M21 ( ♦ , < ) lub M21L ( , □ ) wstrzyknięto do żyły ogonowej nagich myszy. Po podanym czasie grupy zwierząt zabito i płuca zbadano na guzy nowotworów. Wszystkie myszy M21 zabito 42 dnia. Dla myszy M21-L, w każdym punkcie zabito 3-6 myszy. Ilość nowotworu po 6 tygodniach u myszy M21 była zbyt wielka, aby ją liczyć (>250 na płuco), tak więc podano statystykę T dla hipotezy, że grupa M21-L pochodzi z tej samej populacji, co i kontrolna grupa M21 przy 42 dniach na poziomie <0,001 (**) lub <0,02 (*). Tam, gdzie grupy o dużej i małej wielkości zastrzyku mają tę samą istotność, pokazano tylko jedną. Słupki pokazują średnią liczbę nowotworów dla grup. Oś pionowa: metastazy/płuco; oś pozioma: dni po wstrzyknięciu.

Figura 8. 17E6 nie jest cytotoksyczny.

A. Wpływ 17E6 na rozmnażanie komórki M21. 5 χ ΙΟ⁴ M21 posiano w DMEM/FCS z nośnikiem ( O ), lub w obecności 50 pg/ml przeciwciał 17E6 ( © ) lub 14E2 (Δ) i liczbę komórek obliczano codziennie. Przeciwciała nie wpływają na kinetykę i gęstość nasycenia rozmnażania. Oś pionowa: liczba komórek; oś pozioma: dni.

B. Zależna od 17E6 liza komórek M21 komórkami mikroglejowymi. Znaczone tymidyną komórki M21 zmieszano z pochodzącymi od BALB/c mikroglej owymi mózgowymi makrofagami, dodano seryjnie rozcieńczone przeciwciała i po inkubacji zmierzono uwalnianie tymidyny. Kontrolne: (Δ) tylko komórki M21; ( ❖ ) M21 + 17E6 (100 nM); ( <> ) M21 + 14,18 G2a; (Δ) M21 + mikroglej. Średnia ± s. d. (n=6). Eksperymentalne: ( · ) M21 + mikroglej + 17E6; (□) M 21 + microglia + 14,18 G2a. 17E6 nie indukuje zależnej od przeciwciała łizy komórki. Średnia ± s. d (n=3). Oś pionowa: cytotoksyczność (%); oś pozioma: stężenie przeciwciała (M).

C. Zależna od 17E6 cytostaza komórek M21 komórkami mikroglejowymi. Komórki M21 inkubowano z komórkami mikroglejowymi i seryjnie rozcieńczonym przeciwciałem, a następnie znaczono [H³]-tymidyną w celu zmierzenia syntezy DNA. Zmierzono włączanie tymidyny ((H³]-thy). Symbole jak w B. Zauważalna cytostatyczna aktywność samych komórek efektorowych (Δ). Mikroskopowa obserwacja testu wykazała, że w regionach jednorodnego mikrogleju komórek przy 14,18 G2a> 10'¹⁰ M nie przeżyły żadne komórki M21. Oś pionowa: włączanie [H³]-tymidyny (cpm χ 10^-3); oś pozioma: stężenie przeciwciałą (M).

Figura 9. 17E6 nie wypływa na syntezę DNA przez komórki M21.

Linie komórek (A) M21; (B) M21-L; (C) M21-L4; (D) M21-LGpIIb poddano hodowli i dodano bufor ( O ), lub przeciwciała 17E6 ( · ), LM609 (Δ) lub 14E2 (Δ) w podanych stężeniach. W (B) i (D), pokazano zwykłą pozytywną kontrolę, taksol ( 0 ). Po 48 godzinach komórki znakowano [H³]-tymidyną i zmierzono włączoną radioaktywność. Przeciwciała nie miały

182 961 wpływu na syntezę DNA. Taksol całkowicie je tłumi. Por. fig. 8: 90 pg/ml Mab = 600 nM. Oś pionowa: włączanie [H³]-tymidyny (cpm χ 10'³); oś pozioma: stężenie Mab (pg/ml).

Figura 10. Test ELISA 17E6 i fragmentów na oczyszczonym ανβ3. Nietknięte 17E6 (Δ), jego fragmenty F(ab')₂ ( O ) lub F(ab') ( □ ) w podanych stężeniach pozostawiono do związania z płytkami powlekanymi w stężeniu 1 mg/ml ανβ3 i wykrywano związane przeciwciało. Oś pionowa: gęstość optyczna (OD) dla 450 nm; oś pozioma: przeciwciało (logio Mg/ml). '

Figura 11. Przyłączanie komórki mediowane ανβΐ i ανβ5, ale nie ανβ3 jest blokowane przez 17E6 F(ab'). Wskazanym komórkom pozwolono się przyłączyć do 5 mg/ml powłoki witronektynowej w obecności wskazanych stężeń 17E6, jego fragmentów F(ab')₂ lub F(ab'). Pełne przyłączanie wahało się od ~85% (WM164) do ~50% (V+B2) całej ilości dodanych komórek. Oś pionowa: % maksymalnego przyłączenia komórek; oś pozioma: stężenie przeciwciała (pg/ml).

Figura 12. Przyłączanie M21 do witronektyny jest blokowane sieciujący 17E6 F(ab'). W czasie przyłączania komórek M21 do witronektyny (jak na fig. 4,11), koinkubowano fragmenty 17E6 F(ab') lub nietknięte przeciwciało AP3 w ilości 0 ( O ), 0.1 ( V ), 1.0 (□), lub 10 pg/μΐ (Δ) ze wskazanymi stężeniami sieciującego antymysiego przeciwciała drugiej warstwy. Środek sieciujący wykazywał identyczne powinowactwa ELISA dla 17E6 F(ab') i AP3, (nie pokazane). Oś pionowa: optyczna gęstość (OD) przy 405 nm; oś pozioma; stężenie przeciwciało antymysiego kozy (pg/ml).

Figura 13. Mimetyki ligandu aktywnego miejsca i witronektyna współzawodniczą ze sobą o wiązanie z ανβ3 w testach bezpośredniego współzawodniczenia. Rosnące stężenia witronektyny ( V ) lub peptydów GRGDSPK ( O , · ) lub cRGDfV ( Φ , 0 ) koinkubowano z biotynylowaną witronektyną (1 pg/ml = 1.5 nM) lub biotynylowaną pochodną cRGDfV (cRGDfK-bio: 50 nM) na powlekanych ανβ3 płytkach. Związaną biotynę wykrywano przeciwciało antybiotynowe. Figura zakłada średnie M_r dla jedno wartościowej multimerycznej witronektyny 0,65 MDa. Oś pionowa: % związanego ligandu; oś pozioma: peptyd/VN (log[(pM)].

Figura 14. 17E6 nie współzawodniczy z witronektyną w wiązaniu z ανβ3 w testach bezpośredniego współzawodniczenia. Rosnące stężenia 17E6 (·), innych przeciwciał antyανβ3 ( □ , 0 , V , Δ ), lub mimetyku ligandu cRGDfV ( ♦ ) koinkubowano z biotynylowaną witronektyną (1 pg ml’¹) na powlekanych ανβ3 płytkach. Związaną biotynę wykrywano przeciwciało antybiotynowe (por. profile nasycenia w takich samych warunkach powlekania ανβ3 dla 17E6: fig. 10). Oś pionowa: % związanego VN; oś pozioma: [Mab] pg/ml [cRGD] μΜ.

Figura 15. Ligandy i mimetyki aktywnego miejsca nie współzawodniczą z przeciwciałami o wiązanie z ανβ3 w przedblokowych testach współzawodniczenia. Rosnące stężenia witronektyny (VN, O ), fibrynogenu (FG, V ), fibronektyny (FN, □), cRGDfV (66203, Δ), lub wskazanego przeciwciała ( ♦ ) pre-inkubowanó przez 1 godzinę na powlekanych ανβ3 płytkach i następnie sondowano dodając (bez przemywania) biotynylowane przeciwciało (1 pg/ml). Związaną biotynę wykrywano. Liczba 100% związania przeciwciała wskazuje, że wiązanie przeciwciała w obecności pokazanego związku prowokującego było takie, jak w kontrolnej bez współzawodnika. Ligandy nie wpływają na wiązanie przeciwciała. Oś pionowa: % związanej sondy przeciwciała; oś pozioma (prawa i lewa strona): stężenie ligandu (pg/ml).

Figura 16. Przeciwciała współzawodniczą ze sobą w wiązaniu z ανβ3 w przedblokowych testach współzawodniczenia. Rosnące stężenia przeciwciał 17E6 (·), LM609 ( V), AP3 ( □ ) lub 14D9. F8 (Δ), we wskazanych stężeniach, pre-inkubowano przez 1 godzinę na powlekanych ανβ3 płytkach i następnie sondowano dodając (bez przemywania) biotynylowane przeciwciało (1 pg/ml), jak pokazano na każdym wykresie. Związaną biotynę wykrywano. Liczba 100% związania przeciwciała wskazuje, że wiązanie przeciwciała

182 961 w obecności pokazanego związku prowokującego było takie, jak w kontrolnej bez współzawodnika. Przeciwciała współzawodniczą ze sobą w krzyżowych grupach współzawodnictwa. Oś pionowa: % związanej sondy przeciwciała; oś pozioma (prawa i lewa strona): stężenie przeciwciała (pg/ml).

Figura 17 a, b. Sekwencja cDNA zmiennych regionów (Fv) Mab 17E6.

Lekki łańcuch: Ciężki łańcuch VL17E6 (a) i ciężki łańcuch VH17E6 (b). Pokazano kompletny nukleotyd i wydedukowaną sekwencję aminokwasową zmiennych regionów (w tym początkowych sekwencji). Początkowe sekwencje wytłuszczono; Sekwencje CDR podano kursywą. Ciężki łańcuch miał charakterystyczną strukturę grupy II B i lekki łańcuch kappa grupy V, według klasyfikacji Kabata.

Figura 18. Schematyczna reprezentacja procesu klonowania.

mRNA kodujący domeny Fv ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała 17E6 ekstrahowano z hybrydomowych komórek 17E6, transcrybowano w cDNA, i zastosowano PCR do wzmocnienia zmiennych regionów. Te następnie klonowano i sekwencjonowano.

Literatura

Albelda, S.M., i in. (1990), Cancer Res. 50,6757-6764.

Bhattacharya, S. i in. (1995) J. Biol. Chem. 270:16781-16787.

Brooks, P.C. i in. (1994), Science 264, 569-571.

Buck, C., i in., (1990), Celi Differ. Dev. 32,189-202.

Busk, M. i in. (1992), J. Biol. Chem. 267, 5790-5796.

Carter, W.G. i in. (1990), J. Celi Biol. 110,1387-1404.

Chan, B.M. i Hemler, M.E. (1993), J. Celi Biol. 120, 537-543.

Charo, I.F. i in. (1990), J. Celi Biol. 111, 2795-2800.

Cheng, Y.F. i in. (1991), Exp. Celi Res. 194, 69-77.

Cheresh, D.A. i in. (1987), J. Celi Biol. 105, 1163-1173.

Cheresh, D.A. i in. (1989), Celi 57,59-69.

Cheresh, D.A. (1991), Cancer Metastasis Rev. 10, 3-10.

Cheresh, D.A. i Harper, J.R. (1987), J. Biol. Chem. 262, 1434.

Cheresh, D.A. i Spiro, R.C. (1987), J. Biol. Chem. 262,17703.

Chemy, R.C. i in., 1993, J. Biol. Chem. 268, 9725-9729.

Chirgwin, J. M. i in. (1979), Biochemistry 18, 5294-5299.

Chuntharapai, A. i in. (1993), Exp. Celi Res. 205, 345-352.

Danen, E.H. i in. (1993), Int. J. Cancer 54, 315-321.

de Boer, H.C. i in. (1993), J. Biol. Chem. 268,1279-1283.

Delwel, G.O. i in. (1993), J. Biol. Chem. 268,25865-25875.

Denhardt, D.T. i Guo, X. (1993), FASEB J. 7,1475-1482.

Diamond, M.S. i Springer, T.A. (1994), Current Biology 4, 506.

Dougall, WC., 1994, Oncogene, 9: 2109-23.

Etoh, T. i in. (1992), J. Dermatol. 19, 841-846.

Felding-Habermann, B. i in. (1992), J. Clin. Invest. 89, 2018-2022.

Fidler, I.J. (1986), Cancer Metastasis Rev. 5, 29-49.

Fidler, I.J. (1988), Isr. J. Med. Sci. 24, 456-463.

Furihata, K. i in. (1987), J. Clin. Invest. 80,1624-1630.

Gehlsen, K.R. i in. (1992), Clin. Exp. Metastasis 10, 111-120.

Goodman, S.L. et al (1991), J. Celi Biol. 113, 931-941.

Gussow, D. i Clackson, T. (1989), Nucleic, Acids, Res. 17,4000.

Haba, S. i in. (1985), J. Immunol. 134, 3291-3297.

Hall, D.E. et al (1990), J. Celi Biol. 110,2175-2184.

Hardan, I. i in. (1993), Int. J. Cancer 55, 1023-1028.

182 961

Hareul, W. et al (1990), Cancer Res. 50, 6311-6315.

Harlow, E. i Lane, D. (1988). Antibodies - a laboratory Manuał (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory).

Hart, LR. i in. Birch (1991), Cancer Metastasis Rev. 10,115-128.

Herlyn, D. i in. (1985), Celi Immunol. 92, 105-114.

Herlyn, D. i in. (1990), Cancer Res. 50, 2296-2302.

Humphries, M.J. i in. (1986), Science 233,467-470.

Humphries, M.J. i in. (1988), J. Clin. Invest. 81, 782-790.

Hynes, R.O. (1992), Celi 69, 11-25.

Jones, S.T. i Bendig, M.M. (1991), Biotechnology 9, 88-89.

Kabat, E.A. i in. (1987), US dept. health i human services, US gouvernment Printing offices).

Kazał, L.A. i in. (1963), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989-994.

Kieffer, N. et al (1991), J. Celi Biol. 113,451-461.

Korhonen, M. i in., (1991), Lab. Invest. 65, 347-356.

Landegren, U. (1984), J. Immunol. Methods 67, 379-388.

Lehmann, M. i in. (1994). Cancer Research 54,2102-2107.

Lessey, B.A. i in. (1992), J. Clin. Invest. 90,188-195.

Liotta, L.A. i in. (1991), Celi 64, 327-336.

Marshall, J.F. et al (1991), Int. J. Cancer 49, 924-931.

Melvaer, K.L. i Fystro, D. (1982), Appl. Environ.

Mikrobiol. 43,493-494.

Mosmann, T. (1983), Methods 65, 55-63.

Moyle, M. i in. (1991), J. Biol. Chem. 266, 19650-19658.

Mujoo, K. i in. (1989), Cancer Res. 49,2857-2861.

Natali, P.G. i in. (1993), Int. J. Cancer 54, 68-72.

Neff, N.T. et al (1982), J. Celi Biol. 95,654-666.

Nesbitt, S. i in. (1993), J. Biol. Chem. 268,16737-16745.

Orlando, R.A. i Cheresh, D.A. (1991), J. Biol. Chem. 266,19543.

Panetti, T.S. i McKeown Longo, P.J. (1993a), J. Biol. Chem. 268,11988-11993.

Panetti, T.S. i McKeown Longo, P.J. (1993b), J. Biol. Chem. 268, 11492-11495.

Paulsson, M. et al (1987), Eur. J. Biochem. 166,11-19.

Pignatelli, M. i in. (1992), Hum. Pathol. 23,1159-1166.

Poste, G. i in. (1980), Cancer es. 40,1636-1644.

Preissner, K.T. (1991), Annu. Rev. Celi Biol. 7,275-310.

Pytela, R. i in. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5766-5770.

Pytela, R. i in. (1986), Science 231,1559-1562.

Rodeck, U. i in. (1985), J. Immunology 134,1300-1304.

Ruoslahti, E. i in., (1982), Methods Enzymol. 82 Pt A, 803-831.

Ruoslahti, E., (1991), J. Clin. Invest. 87.

Sambrook, J. i in. (1989). Molecular Cloning, a laboratoiy manuał (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Sanders, L.C. et al. (1992), Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 57, 233-240.

Sanger, F. in. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463.

Seftor, R.E. i in. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89,1557.

Si, Z. i Hersey, P. (1994), Pathology. 26, 6-15.

Smith, J.W. et al (1990), J.Biol. Chem. 265,11008-11013.

Smith, J.W. i Cheresh, D.A. (1988), J. Biol. Chem. 263,18726.

Smith, J.W. i Cheresh, D.A. (1990), J. Biol. Chem. 265,2168.

Sonnenberg, A i in. (1987), J. Biol. Chem. 262, 10376-10383.

Sonnenberg, A. i in. (1988), Naturę (London) 336,487-489.

Sonnenberg, A. (1993), Curr. Top. Mikrobiol. Immunol. 184, 7-35.

182 961

Stetler Stevenson, W.G., i in. (1993), Annu. Rev. Celi Biol. 9, 541.

Stockmann, A. i in., 1993, J-Biol-Chem., 268: 22874-82.

Sutter, A. i in. (1991), Pathobiology 59, 254-258.

Takada, Y. i in. (1987), J. Celi. Biochem. 37, 385-393.

Tao, M.H. i Morrison, S.L. (1989), J. Immunol. 143, 2595-2601.

Towbin, H. i in. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

Turner, D.C. i in. (1989), J. Neurosci. 9, 3287-3296.

Wayner. E. A. i in. (1991), J. Celi Biol. 113, 919-929.

Wayner. E.A. i Carter, W.G. (1987), J. Celi Biol. 105, 1873-1884.

Wickham, T.J. i in. (1993), Celi 73, 309-319.

Yatohgo, T. i in. (1988), Celi Struct. Funct. 13,281-292.

Yoshinaga, I.G. i in. (1993), Melanoma. Res. 3,435-441.

Zambruno, G. i in. (1993), J. Celi Sci. 105,179-190.

Zhang, Z. i in. (1993), J. Celi Biol. 122,235-242.

Szczegółowy opis

Monoklonalne przeciwciała grupy aV reagują z integrynowym łańcuchem αν. Odsiewanie przeciwciał metodą ELISA na oczyszczonych ανβ3 i αΙ^β3 odkryło pięć klonów, 17E6, 20A9, 23G5, 14D9. F8, 10G2, które reagowały specyficznie ζανβ3 (tab. 1). Te Mab nazywa się „grupą alfa-V”. Wszystkie były izotypem IgGl. W tym samym teście ELISA, anty-integrynowe przeciwciała o znanej specyficzności wobec kompleksu ανβ3 (LM609), łańcuchów ocv (LM142), kompleksu (χνβ5 (PSH9), kompleks αΙΙόβ3 (CP8), łańcuchów β3 (AP3), i łańcuchów βΐ (P4C10), reagowały tak, jak przewidywano w literaturze (tab. 1). W teście ELISA na unieruchomionych komórkach („CELISA”), z komórkami wytwarzającymi ανβ3 i ανβ5 (M21), ανβ5, ale nie ανβ3 (UCLAP3), ani ανβ3 i <χνβ5 (M21-L), i αΙΙόβ3 (M21-L-Ilb), grupa alfa-V pokazała wzór reakcji spójny z faktem rozpoznawanie αν-integrynowego łańcucha, i wyraźnie różny od reakcji z β3, β5, βΐ, lub innych α-łańcuchów (tab. 1). Wyniki są zgodne z danymi ELISA z oczyszczonymi receptorami. Mabs ze specyficznością dla β3 oraz Gpllb także otrzymano w przesiewaniu (dane nie pokazane); reagowały one w sposób wyraźnie różny od grupy alfa-v. 17E6, 14D9.F8, 20A9 i 23G5 wiązały ανβ3 z podobnym pozornym powinowactwem. 50% wiązanie osiągnięto przy -10-20 ng/ml (-50-100 pM - podobnie jak LM609). 10G2 wiąże się podobnie jak LM142 z około 10-krotnie niższym powinowactwem). CP8 wobec (xIIbβ3 i 14E2 (patrz niżej), wykazało minimalne wiązanie z ανβ3 w stężeniach do 100 nM.

Zdolność grupy alfa-v do rozpoznawania rodzimych integryn αν przetestowano metodą FACS (fig. 1; tab. 2) i metodą immunostrącaniaj^ow powierzchniowo znaczonych komórek (fig. 2). W analizie FACS (fig. 1), wytwarzająca αν linia (M21) reagowała silnie z 17E6, 14D9.F8, 20A9, 23G5 i z definiującymi αν przeciwciałami LM142 i LM609, umiarkowanie z 10G2, i także z kontrolnymi Mabs 14E2 i 21H6 i Mab 9.2.27. W przeciwieństwie do tego, deficytowy w αν wariant (M21-L) reagował słabo z grupą alfa-v i z LM142 i LM609, ale wykazał podobną reaktywność jak M21 z 14E2, 21H6 i 9.2.27. M21-L zawiera wewnątrzkomórkowy zasób subjednostek β3, który odkryto w FACS tylko, gdy komórki permeabilizowano (tab. 2). W analizie FACS M21-L4 (αν-retransfekowane komórki M21-L (Felding-Habermann i in., 1992)), grupa alfa-v dała wzory reakcji jak z M21. Transfektanty kontrolnego wektora, M21-L12 i transfektanty Gpllb, M21-L-Ilb (Kiefifer i in., 1991), wykazała brak reakcji z grupą alfa-v (tab. 1). Adenokarcynoma UCLAP-3 reagowała z grupą alfa-v, z LM142 i PSH9, ale nie z LM609. UCLAP-3 nie wytwarza β3 (patrz wstęp). Melanoma WM793 miała taki sam wzór reakcji jak M21. W immunostrąceniowym przesiewaniu do Komórek M21, grupy alfa-v dały taki sam immunostrąceniowy wzór jak LM142 (anty-αν), i LM609

182 961 (anty-avP3) (fig. 2a). A silne szerokie pasmo pojawiło się przy ~92 kDa.i słabsze pasmo przy ~145 kDa, ze słabymi towarzyszącymi pasmami przy ~100 kDa, wzór charakterystyczny dla powierzchniowo znaczonych integrynανβ3 ΐανβ5 (Wayner i in., 1991). W porównaniu ze wzorami strącania na M21-L, nic z grupy alfa-v nie wytrącało (pokazano dane z 17E6 i 20 A9), podobnie jak LM142 lub LM609. (Fig. 2c) βΐ-specyficzne przeciwciała dały podobny wzór strącania z obu linii komórek. Dla M21-L strącanie przeciwciałami anty-β3 dało pasmo przy ~92 kDa, dzięki wewnątrzkomórkowym β3-znaczonym w przepuszczalnych (zapewne nekrotycznych) komórkach. UCLAP3 (fig. 2d) nie wytrącało się z LM609, ale kompleks -95 kDa/145 kDa wytrącał się grupą alfa-v i LM142 (fig. 2d). Podsumowując, analizy ELISA, CELISA, FACS i immunostrącanie dały spójne wzory reakcji i silnie sugerują, że Mabs grupy alfa-v reaguje z pozakomórkowymi domenami na łańcuchach ludzkiej αν-integryny. Mab 17E6 jest silnym blokującym funkcje przeciwciałem.

17E6 może modyfikować początkowe przyłączenie komórki do ligandówav. Integryny αν mogą funkcjonować jako receptory dla witronektyn, tak więc grupę alfa-v przesiano na możliwy wpływ na przyłączenie komórek do witronektynowych podłoży. Po analizie FACS integryn komórki przetestowano w teście przyłączania (tabela 2, fig. 3). W teście FACS linie komórek ludzkiej melanomy i raka reagowały podobnie z grupą alfa-v. Reakcję z 17E6 podsumowano (fig. 3). Początkowe przyłączanie do witronektyn komórek reagujących w teście FACS z 17E6 był silnie blokowany przez to przeciwciało, ale tylko słabo przez kontrolne przeciwciało 14E2 (fig. 3). Inni członkowie grupy alfa-v wykazali słabe działanie (dane nie pokazane). Żywe przyłączanie mysich komórek B16F10 na witronektynie nie było zakłócane 17E6 i B16F10 nie reagował z 17E6 w teście FACS. jak przewidywane (Cheresh i Harper, 1987), przyłączanie B16F10 do witronektyny było wrażliwe na mikromolowe stężenia peptydów RGD, sugerując obecność funkcjonalnego powierzchniowego ανβ3 (SLG i B. Diefenbach). Tak więc, 17E6 i grupa alfa-v reagowała z ludzkim ale nie mysim ocv.

Zbadano wpływ 17E6 na przyłączanie komórek. 17E6 blokował przyłączanie M21 (-85%) do witronektyny z IC₅₀ równym -0,1 pg/ml (fig. 4a). Wynalazek potwierdza dawniejsze studia (Wayner i in., 1991) pokazując, że przyłączanie M21 było słabo blokowane przez same przeciwciała dla ανβ3 (LM609) lub ανβ5 (PSH9), ale było silnie blokowane, gdy dodano je razem (fig. 4a,b). Integrynowe przeciwciała anty-βΐ (P4C10) nie miały wpływu na przyłączanie M21 do witronektyny (fig. 4b). Lines UCLAP3 i WM793 przyłączały się do witronektyny, a przyłączanie to blokował 17E6, a także komplementarne οο/β5-specyficzne (PSH9/UCLAP3) lub ανβ3-specyficzne przeciwciała (LM609/WM793) (fig. 4c-f). Na ανβ5 (UCLAP3) 17E6 miał IC₅₀ -30 ng/ml. Na WM793, it was -60 ng/ml, a dla LM609 IC₅₀ wynosiło -600 ng/ml. UCLAP3 wytwarza ανβ5, ale nie ανβ3 (Wayner i in., 1991), podczas gdy WM793 wytwarza duże ilości ανβ3 (tab. 1). Specyficzność blokującą 17E6 potwierdzono brakiem wpływu na przyłączanie komórek do innych matrycowych podłoży (fig. 5). P4C10 (anty-βΐ) uniemożliwiał przyłączanie M21 do laminin i kolagenu. Adhezję komórek do tych dwu podłoży można mediować integrynami serii βΐ (Sonnenberg i in., 1988; Takada i in., 1987).

Wraz z danymi biochemicznymi, wyniki te są spójne z teorią, że 17E6 wiążą łańcuch αν różnych kompleksów integrynowych i zakłóca ich odziaływanie z ich ligandami.

17E6 uruchamia odwracanie ustalonych oddziaływań matrycy komórkowej mediowanych przez integrynę αν. Następnie zbadano, czy 17E6 może wpływać na ustalone oddziaływania komórka-matryca. Gdy do komórek M21 dodano 17E6 w niskich stężeniach (-0,1 pg/ml), indukowało ona silne zaokrąglanie komórek po 0,5-1 godzinie w temperaturze 37°C w kulturach M21 nawet po 24 godzinach od przyłączenia (fig. 6). Wpływ był w pełni odwracalny i po przemyciu komórki powróciły do ich spłaszczonego stanu w ciągu 48 godzin. W przeciwieństwie do tego, przeciwciała LM609 i 14E2 wpływy na morfologię tylko nieznacznie nawet przy wysokich stężeniach (100 pg/ml). Przeciwciała nie miały morfologicznego wpływu nawet przy stężeniu 100 pg/ml na powlekanych fibronektyną podłożach

182 961 (fig. 6). M21-L4 (i inne komórki przyłączone przez αν) podobnie reagowały na 17E6 na powierzchni witronektyny, ale nie fibronektyny, kolagenu lub lamininy.

17E6 blokuje rozwój nowotworu M21 u nagich myszy.

W wynalazku zbadano wpływ blokującego αν przeciwciała 17E6 na podskórny rozwój nowotworu M21 u myszy BALB/c nu/nu (fig. 7). W modelach zwierzęcych, rozwój nowotworów M21 u nagich myszy skorelowano z wytwarzaniem na powierzchni komórek integryn serii αν (patrz wstęp). Komórki M21 współwstrzyknięto podskórnie z wolnymi od endotoksyn przeciwciałami. 17E6 spójnie (4.4 eksperymenty) blokował podskórny rozwój nowotworów M21 (fig. 7a). Nie powstały żadne nowotwory (0/32) w obecności 17E6, i zwierzęta nadal pozostają wolne od nowotworów już ponad 6 miesięcy. Kontrolny atak nowotworu wystąpił w 75-90%. Nieblokujące przeciwciała wobec samego łańcucha αν i kontrolny przeciwciała wobec powierzchni komórek melanomy pokazało zmienny i niespójny wpływ na rozwój nowotworu. W próbach kontrolnych traktowanych 14E2, rozwój nowotworu zredukowano zgodnie z doświadczeniem o 30-60%, ale pozostałe nowotwory wzrastały jak nieleczone próby kontrolne i tak jak kontrolne miały w płucach mikro-metastazy po umieszczeniu ich w kulturze (nie pokazane). W przeciwieństwie do tego, zwierzęta traktowane 17E6 nie miały ani podskórnych nowotworów, ani metastaz w płucach, wątrobie nerce, śledzionie, okrężnicy, żołądku ani w jamach tułowia i odbytu, po sekcji po 6 miesiącach. Linę M21-L uboga wavp3 rosła wolniej podskórnie niż M21, i nie reagowała na 17R6. Poddane działaniu M21-L kontrole po potraktowaniu 14E2 wykazały zmniejszoną skalę ataku w porównaniu z nieleczonymi zwierzętami, podobnie jak w przypadku komórek M21 (fig. 7b).

Wzrost M21 i M21-L i wpływ przeciwciała 17E6 porównywano w „eksperymentalnej metastazie” w modelu wstrzykiwania do żyły ogonowej. M21 tworzyły wiele kolonii w zależności od dawki, podczas gdy M21-L tworzyły znacznie mniej kolonii, ale formowały guzki płucne po wstrzyknięciu w wysokich dawkach (fig. 7c). Innymi słowy, wzrost nowotworu w płucach ułatwiała także obecność integryn αν z powierzchni komórki, a pre-inkubacja M21 z 17E6 redukowała (o 90%) liczbę kolonii powstającego nowotworu. Ciekawe, że poziom powstawania nowotworu był podobny do poziomu osiąganego przez komórki M21 -L w takim samym eksperymencie. Przeciwciało nie zmieniało liczby zwierząt, u których rósł nowotwór (tab. 3).

Podsumowując, obecność αν na powierzchni komórka promuje powstawanie nowotworu M21 w podskórnym i eksperymentalnym metastatycznym modelu, a blokujące i od wracające αν przeciwciało 17E6 energicznie stłumiło wzrost M21. W eksperymentalnym modelu metastazy z komórką M21, żywiołowy wzrost M21 i słaby wzrost M21-L ściśle powtarza podskórny wzór wzrostu nowotworu, a wzrost M21 był także stłumiony wstępną obróbką 17E6. Dane te wzmacniają więź pomiędzy integrynąav i rozwojem ludzkiej melanomy.

Wpływ 17E6 nie związany z cytotoksycznością

Po zaobserwowaniu silnego wpływu na przyłączanie, morfologię i rozwój nowotworu, starano się znaleźć mechanizm działania 17E6. Przetestowano 17E6 na cytotoksyczność (fig. 8). Kinetyka wzrostu komórka i końcowe gęstości nasycenia nie reagowały zbyt silnie na obecność 17E6 lub kontrolnego przeciwciała (fig, 8a).

Nagie myszy mają osłabioną odporność. Z kilku pozostałych rodzajów immunokompetentnych, makrofagi mogą prawdopodobnie kierować cytotoksyczną, mediowaną przeciwciałem odpowiedzią. Aby zbadać prawdopodobieństwo, że przeciwciała kierują komórkową cytotoksycznością (ADCC), mysie makrofagi jednorodne z przeciwciałami przetestowano w ADCC wobec komórek M21. Jako efektory, makrofagi komórek mysiego mózgu (mikroglej) są szczególnie silnymi mediatorami ADCC (Sutter i in., 1991). Pozytywna kontrola, Mab 14.18 G2a spowodowała prawie całkowitą lizę M21 w stężeniu < ΙΟ’⁹ M, podczas gdy 17E6 w stężeniu do 10’⁷M nie mediuje ADCC (fig. 8b).

182 961

W celu oceny, czy 17E6 może wykazywać cytostatyczną aktywność w obecności efektorowych komórek, zmierzono syntezę DNA mikroglejowych współkultur M21 w obecności przeciwciał (fig. 8c). W stężeniu 10’¹⁰ M 14.18 G2a powodowało > 90% inhibicję włączania [³H]-tymidyny.

Zbadawszy wpływ na rozmnażanie komórek, ADCC i AECM, zbadano, czy poziomy syntezy DNA w komórkach M21 reagowały na Mabs. 17E6, 14E2, i LM609 w stężeniu 0,5 μΜ nie miały wpływu na włączanie tymidyny (fig. 9). Synteza DNA w komórkach M21-L, M21-L4 i M21-L-IIb nie wykazywała wpływu przeciwciał. M21-L i M21-L-IIB nie reagują z 17E6 i LM609, ale reagują z 14E2 (fig. 1). Wiele innych melanomowych linii komórek przetestowano także i stwierdzono, że na ich syntezę DNA nie wpływa w sposób oczywisty grupa alfa-v (nie pokazano).

17E6 i 14E2 były izotypami IgGl, i nie wpływały na komplementarnie mediowaną lizę komórek M21 (nie pokazano). Można wywnioskować, że wpływy 17E6 są specyficzne wobec integrynav, i nie mają drastycznego toksycznego wpływu na inne układy komórkowe.

Działanie 17E6 na komórkowe ανβ3, ale nie ανβΐ lub ανβ5 wymaga krzyżowania receptorowego: W wielu układach biologicznych przezbłonowa sygnalizacja jest inicjowana metoda dimerizacji receptorów. W istocie, multimeryzacja ανβ3 zmienia fosfotyrozynalicyjne wzory w HUVEC (Bhattacharya i in. 1995). Zbadano wobec tego, czy agregacja receptorów zachodziła w czasie działania 17E6. 17R6 inhibituje komórkowe integryny ανβ3, ανβ5 i ανβΐ (fig. 4). Nietknięte 17E6 i jego fragmenty F(ab')₂ i F(ab') mają podobne charakterystyki wiązanie w teście ELISA na izolowanym ανβ3 (fig. 10), z 50% nasyceniem osiąganym przy stężeniu ~1 ng/ml (~7 pM nietkniętego Mab). Podobne krzywe miareczkowania ELISA sugerował jedno wartościowe oddziaływanie pomiędzy 17E6 i płytkami ELISA. Ale w testach przyłączania komórek fragmenty zachowywały się różnie. F(ab')₂ i nietknięty 17E6 blokował przyłączanie komórek mediowane ανβΐ (komórki V+B2) i ανβ5 (komórki UCLA-P3) (IC₅₀ ~ 0,1 pg/ml, -700 pM), oraz przyłączanie ανβ3 (WM164 i komórki M21) (IC_5O~O,5 pg/ml: ~3 nM), a fragment F(ab') był tak aktywny, jak dimeryczne przeciwciała na ανβΐ i ανβ5 (fig. 11). Jednak fragment F(ab') był co najmniej lxl0⁴-krotnie aktywniejszy na ανβΐ i ανβ5, niż na αν β3, gdzie tylko blokował 25+10% przy najwyższych stężeniach zbadanych (50 pg/ml:- IC₅₀» 50 pg/ml: 400 nM) - w tych stężeniach inne przeciwciała także dały podobne stopnie blokowania (nie pokazane) sugerując, że ten marginalny wpływ jest niespecyficzny.

Brak biologicznej aktywności fragmentu F(ab9 przeciwciała, które jest zdolne do wiązania (jak F(ab') 17E6: (fig. 10)) jest klasycznym indykatorem tego, że dimeryzacja jest konieczna dla mediowanego przeciwciałem działania. W celu potwierdzenia, że wiązanie krzyżowe było w istocie potrzebne dla oddziaływania 17E6 na ανβ3, F(ab9 i 17E6 związano krzyżowo w czasie testu przyłączania komórek dodając poliklonalne przeciwciało anty-F(ab'). Zaobserwowano klasyczny wpływ typu prozonu, w którym przy krytycznych stężeniach pierwotnego i wtórnego przeciwciała, i tylko wtedy, zaobserwowano silną inhibicję przyłączania komórek. Duże ilości samego przeciwciała drugiej warstwy alone lub samego F(ały) nie wpływają na adhezję komórek. Ponadto efekt nie był niespecyficznym rezultatem wiązania krzyżowego integryny ανβ3: wiązanie krzyżowe ανβ3 przez wiązanie nieinhibitującego przeciwciała AP3 nie miało wpływu na przyłączanie komórek (fig. 12). Stężenia of FiabO aktywnego po dodaniu wtórnego przeciwciała w eksperymentach wiązania krzyżowego, koincyduje z IC₅₀ nietkniętego 17E6 dla ανβ3-mediowanego przyłączania (por. fig. 11).

Łącznie, dane te wskazują, że wiązanie krzyżowe integryny ανβ3 jest potrzebne w celu zapobiegania przyłączaniu WM164 i M21 na rozpoznanych ligandach, podczas gdy ανβ5 i ανβΐ nie wymaga wiązania krzyżowego do inaktywacji.

17E6 jest słabym blokerem receptorowej funkcji w teście izolowanego receptora.

Niezwykłą naturę funkcji 17E6 na ανβ3 zbadano szczegółowo w teście izolowanego receptora. Zwrócono uwagę na kontrast pomiędzy klasycznymi blokerami miejsc aktywnych i 17E6. Wiązanie witronektyny z ανβ3 nasyca się przy -5 pg/ml (~10 nM: zakładając przeciętny rozmiar multimeru witronektyny na 10 monomerów) (fig. 13), i specyficznie

182 961 współzawodniczy z klasycznymi peptydami mimetycznymi Urnowego ligandu (GRGDSPK: IC₅₀ ~2 μΜ) i cyklizowanymi peptydami (cRGDfV: IC₅₀ ~5 nM). Stosując znaczony biotyną wariant cRGDfV, cRGDfK-biotyna, można było wykazać bezpośrednio, że nie tylko inhibitory współzawodniczyły o wiązanie z witronektyną ale że witronektyna współzawodniczyła o wiązanie z inhibitorem (fig. 13), to jest układ był symetryczny. W istocie, witronektyna, GRGDSPK i cRGDfY współzawodniczą ze sobą i czynią to zarówno „racjonalnie”, jak i „symetrycznie”, w tym sensie, że IC₅₀ dla współzawodnictwo odzwierciedlało IC₅₀ dla inhibicji wiązania witronektyny do kompleksu ανβ3 (fig. 13).

Wiązanie 17E6 nasyca ανβ3 przy stężeniu 0,01-0,1 pg/ml (700-70 pM) (por. fig. 10). Jednak przeciwciało jest tylko słabym inhibitorem wiązania ligandu. Nawet przy stężeniu 70 nM przeciwciała występowało mniej niż 30(+10)% inhibicji wiązania witronektyny. LM609 zachowywał się w podobny sposób, podczas gdy non-inhibitujące przeciwciała wiążące ανβ3 (14D9.F8, 20A9 i WAM2-4) były nieskuteczne. Mimetyk ligandowy, cykliczny peptyd cRGDfV skutecznie blokował oddziaływanie receptor-ligand (IC₅₀ ~10 nM) (fig. 14), ale nie wpływał na wiązanie 17E6. Nie inhibitował ani nietknięty, ani jedno wartościowy 17E6 (nie pokazane).

17E6 wiąże ανβ3 w obecności nasycających ilości wyzywającego ligandu.

Słabe współzawodnictwo 17E6 o ligand w teście izolowanego receptora i dostępność silnie współzawodniczących inhibitorów jak cRGDfV podniosło pytanie, jak 17E6 wpływa na funkcję αν. Aktywność blokowania 17E6 i jego fragmentów w testach komórkowego przyłączania dla integryny ανβ3 wymaga wiązania krzyżowego, co nie jest w całości zgodne z inhibicją przez współzawodnictwo. Zbadano następnie, czy ligandy ανβ3 interferują bezpośrednio z wiązaniem 17E6. Ligands wstępnie związano z receptorem i dodano w niskich stężeniach bezpośrednio znaczony 17E6 (fig. 15). Na wiązanie 17E6 nie wpłynęły (< 10% blokowania) wysokie stężenia witronektyn, fibronektyn lub fibrynogenu (rodzime ligandy ανβ3 {Cheresh i Spiro, 1987}) 100-krotnie wyższe od potrzebnych do nasycenia miejsc specyficznego wiązania na ανβ3. W przeciwieństwie do tego wstępnie związany 17E6 współzawodniczy silnie o wiązanie z następnie dodanym znaczonym 17E6 (fig. 15, 16), a rodzime ligandy ανβ3 także współzawodniczą dobrze ze sobą (nie pokazane). Zaprzeczyło to naszemu założeniu, że 17E6 współzawodniczył z witronektyną o aktywne miejsce ανβ3. Ponadto, silni współzawodnicy o aktywne miejsce, jak cykliczny peptyd cRGDfV przy stężeniu 200 μΜ także nie mają wpływu na wiązanie 17E6, jednak blokują wiązanie witronektyny do ανβ3 z IC₅₀ 2nM(fig. 13).

Dane ELISA (fig. 10) wskazują że oddziaływania 17E6 ζανβ3 były jedno wartościowe, co zmniejsza prawdopodobieństwo, że artefakt współzawodniczący zaobserwowano dzięki bardzo wysokiemu powinowactwu przeciwciała połączony z niskim powinowactwem ligandu. Jednak inne specyficzne przeciwciała dla αν i β3 oznaczono i użyto do wyzwania wcześniej związanego ligandu (fig. 15), z tych samych przeciwciał (fig. 16). Przeciwciała w pełni współzawodniczą ze sobą i wyraźnie układają się w krzyżowe współzawodniczące grupy (fig. 16). β3-specyficzne przeciwciało AP3 współzawodniczyło z tym wiązaniem, ale nie wpływało na wiązanie i nie podlegało wpływowi przeciwciał specyficznych albo dla kompleksu ανβ3 (ML609), albo samego łańcucha αν (17E6, 14D9.F8); LM609, 17E6 i 14D9.F8 wszystkie silnie współzawodniczyły krzyżowo. W przeciwieństwie do tego, wstępnie związane ligandy nie wpływały na wiązanie 17E6 z ανβ3. Należy stwierdzić, że 17E6 nie działa poprzez bezpośrednie współzawodnictwo o miejsce wiązania ligandu.

Klonowanie i sekwencjonowanie zmiennych regionów 17E6.

Zastosowano bibliotekę primerów zaprojektowaną do wzmacniania PCR zmiennych regionów immunoglobulin do klonowania wzbogaconych w immunoglobuliny bibliotek cDNA dla reagionów ciężkiego i lekkiego łańcucha hybrydomy 17E6. Nadmiarowe primery zmiennego regionu kończyły się w miejscu początku sekwencji początkowej. Primery odwrotne stałego regionu kończyły się 30 par zasad w głębi into stałego regionu. Primery zaprojektowano z terminalnymi miejscami restrykcji Sal I lub Xma I dla klonowania. Produkty PCR

182 961 o spodziewanych rozmiarach (420-450 par zasad (Jones i Bendig, 1991)) otrzymano, klonowano i sekwencjonowano (fig. 17). Zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny 17E6, VL17E6, miał 381 par zasad. Zmienny region ciężkiego łańcucha, VH17E6, miał 41 par zasad. Zmienne sekwencje ciężkiego łańcucha były charakterystyczne dla grupy immunoglobulin Kabata Ilb, a sekwencje lekkiego łańcucha charakterystyczne dla grupy Kabata V (Kabat i in., 1987). Strategię klonowania pokazano schematycznie (fig. 18).

Postęp i metastaza nowotworu jest klasyczną chorobą, w której komórki wychodzą spod kontroli normalnego wzrostu i adhezji i inwadują, migrują, wiążą się i rosną w nieodpowiednich miejscach. Wiadomo obecnie, że integryny kontrolują wiele stanów adhezji komórki, a adhesion może z kolei regulować mechanistycznie przeplecione zdarzenia, w tym wzrost, różnicowanie, ruch komórki i aktywność sieci proteaz, rozwojowe zdarzenia, które powtarzają się w metastatycznej kaskadzie (Liotta i in., 1991; Stetler Stevenson i in., 1993; Fidler, 1988). W tym opisano przeciwciała skierowane wobec ludzkich integryn serii aV, z których jedna, 17E6, zakłóca początkowe przyłączanie komórek, zrywa trwałe oddziaływania αν-ligand i zakłóca rozwój ludzkiej melanomy w modelu zwierzęcym in vivo (Fidler, 1986). W biochemicznej analizie przeciwciała grupy alfa-v wykazały wzory reakcji zbliżone do LM1142 - dobrze zdefiniowanego przeciwciała ludzkiej αν - ale różne od wzorów reakcji anty-integrynowych przeciwciał ανβ3-specyficznych (LM609), αvβ5-specyficznych (PSH9) i innych zdefiniowanych. Tak więc, grupy alfa-v przeciwciała mogą rozpoznawać łańcuch ludzkiej αν-integryny. Klonowanie cDNA transkryptów immunoglobuliny 17E6 ujawniło unikalne, niedwuznaczne sekwencje. Zmienne sekwencje ciężkiego łańcucha były charakterystyczne dla grupy Kabata Ilb immunoglobulin, a sekwencje lekkiego łańcucha charakterystyczne dla grup V Kabata (Kabat i in., 1987). Tak więc, przeciwciało jest zdefiniowane jednoznacznie.

17E6, silnie zakłócone odziaływanie komórkowe mediowane przez αν. Przeciwciała zakłócające funkcję były ważne dla zrozumienia funkcji integryny, ale pole αν nie miało silnego specyficznego dla klasy blokującego przeciwciała. 17E6 blokuje mediowane przez αν przyłączanie komórek z IC₅₀ ~0,3-l nM (przeciwciało o masie cząsteczkowej 150.000); dla porównania bloker peptidowy, GRGDSPK, ma IC₅₀ of ~5 μΜ. Linie komórek wytwarzające głównie ανβ3 (WM793) lub ανβ5 (UCLAP3) są blokowane przez 17E6, jak i komórki wytwarzające głównie ανβΐ. Tak więc, 17E6 jest ogólnym inhibitorem integryn αν.

17E6 nie tylko zapobiega początkowemu oddziaływaniu integryn αν z ich ligandami, ale także powoduje odwrócenie dobrze ustalonych oddziaływań, powodując nagła retrakcję komórek przyłączonych na witronektynie. Oddziaływanie ανβ3 z witronektyną opisano jako „niedysocjujące”, zachodzące w dwu etapach, z początkowym blokującym oddziaływaniem i szybką reakcją stabilizacji (Orlando i Cheresh, 1991). W przeciwieństwie do tego, 17E6 wywołuje gwałtownie retrakcję i częściowe odłączenie M21 i wielu innych komórek (niepublikowane obserwacje) od witronektynowego podłoża. Po usunięciu przeciwciała zaokrąglanie cofało się. Początkowe przyłączanie M21 do witronektyny is niecałkowicie blokowane (~90%) przez 17E6, ale jego wpływ zaokrąglający wpływa istotnie na wszystkie przyłączone komórki. Można potwierdzić poprzednie badania, w których początkowe przyłączanie M21 do witronektyny było w pełni blokowane przez mieszaniny przeciwciał anty-αvβ3 i antyανβ5 oraz przez peptydy RGDS, implikując, że brały w tym udział ανβ3 i ανβ5 (Wayner i in., 1991). Jak pokazuje to studium, 17E6 blokuje kilka receptorów αν i może odwracać trwałe oddziaływania mediowane przez nie. Różnica w aktywności 17E6 wobec przyłączonych i przyłączanych komórek M21 może leżeć w różnych fimkcjach i lokalizacjach ανβ3 i ανβ5 w każdej sytuacji. Na przyłączanych komórkach oba są rozproszone, podczas gdy w przyłączonych komórkach ανβ3 znajduje się w ogniskach, a ανβ5 jest rozproszone (Wayner i in., 1991; Zambruno i in., 1993). Zbadano później, czy 17E6 selektywnie zrywa jedno z tych połączeń.

Wzrost of nowotworów M21 u nagich myszy zależy silnie od integryn aV (FeldingHabermann i in., 1992; Sanders i in., 1992). Ponieważ 17E6 mógłby modulować trwałe oddziaływania αν-ligand i wywiera długotrwały wpływ, zbadano jego wpływ na rozwój

182 961 nowotworu. Odkryto, że 17E6 blokował rozwój podskórnych nowotworów M21 u nagich myszy. Silnie potwierdzając studia of Feldinga-Habermąnna i in. Ponadto można wykazać, że αν także promował, a 17E6 inhibitował, rozwój M21 jako doświadczalnej metrastazy płucnej. Wynalazek niezależnie potwierdził ważne wcześniejsze badania i rozszerzył je stosując jednorodną mediowaną przeciwciałem „terapię” 17E6. Wyniki podkreślają znaczenie integrynav w rozwoju nowotworu M21, i eliminują możliwość, że wcześniejsze wyniki wynikały z wyboru selekcyjnych artefaktów.

In vitro wpływy 17E6 trwają> 24 godziny po przemyciu. Jeśli objętość myszy wynosiła 20 ml, początkowe stężenie przeciwciała in vivo było —10 nM, o rząd wielkości przekraczając IC₅₀ odwracania oddziaływań komórka-ligand w kulturze. 17E6 jest jednorodne dla leczonych zwierząt, BALB/C nu/nu, a czas półtrwania mysiego IgGl wynosi 20-200 godzin (Tao i Morrison, 1989; Haba i in., 1985). Tak więc, IC₅₀ dla odwracającego oddziaływania M21-ligand może być przekroczone o co najmniej 100 godzin w tym modelu (5 okresów półtrwania). Ciekawe jest porównanie 17E6 z peptydami RGD. W mysim modelu melanomy B16F10-C57blk6 współwstrzyknięte peptydy inhibitowały rozwój płucnych nowotworów B16-F10 (Humphries i in., 1986; Hardan i in., 1993). Z takimi samymi założeniami, jak dla 17E6, było obecne -100 μΜ peptydu RGD (Hardan i in., 1993), o dwa rzędy wielkości ponad dawkę wymaganą do blokowania przyłączania komórek do witronektyny. Jednak, RGDS ma czas półtrwania w osoczu 8 minut (Humphries i iń., 1988). Jako ogólny cel terapeutyczny może być korzystne odtworzenie długo żyjących blokerów do supresji rozwoju nowotworu.

Jak 17E6 może wpływać na rozwój nowotworu? Ponieważ nie reaguje z mysimi komórkami, wpływa na komórki nowotworów, a oczywisty wpływ przeciwciała na angiogenezę nowotworu można wykluczyć (Brooks i in., 1994). Jedynymi wpływami 17E6, które można zidentyfikować, są: a) jego wiązanie z pozakomórkową domeną integryn αν, b) jego zdolność do zakłócenia mediowanych αν komórkowych oddziaływań. Można założyć, że większość źródeł mediowanego przeciwciałami zabijania dostępnego u nagiej myszy wyeliminowano. 17E6 nie wpływa chronicznie ani ostro na wzrost i żywotność komórki M21a, nie mediuje komplementarnego utrwalania, nie wpływa na syntezę DNA i nie mediuje jednorodnej, mediowanej makrofagiem cytotoksyczności. Komórki M21 były wrażliwe na ADCC, ponieważ były skutecznie zabijane przez komórki mikroglejowe w obecności Mab 14.18 G2a. Mab IgGl (jak 17E6) skutecznie mediuje mysi makrofag ADCC (Herlyn i in., 1985). Liczba miejsc avPg wytwarzanych na jedną komórkę może być niższa od krytycznego progu zachodzenia ADCC. Wcześniejsze studia wykazały, że skuteczność ADCC koreluje z gęstością docelowego antygenu (Rodeck i in., 1985) Makrofagi w odróżnieniu od innych efektorowych komórek mieloidowych lub limfocytycznych wytwarzają wszystkie trzy klasy receptorów Fcy. Dane te przemawiają przeciwko ADCC jako mechanizmowi wyjaśniającemu inhibicję wzrostu nowotworu obserwowaną in vivo dla 17E6. Przeciwciało było wolne od endotoksyny. Nie można wykluczyć, że zabijanie mediowane komórką NF jest aktywowane 17E6, ale w tej sytuacji jest dużo słabiej aktywowane przez zastosowane kontrolne jednorodnego izotypu przeciwciała.

Tak więc, 17E6 działa prawdopodobnie uszkadzając funkcję integryny αν. Funkcje, które 17E6 można blokować, a αν współwykonywać, obejmują adhezję komórek, oddziaływanie z rozpuszczalnymi składnikami matrycy (Seftor i in., 1992), modulacja sieci proteaza/inhibitor proteazy (Gehlsen i in., 1992; de Boer i in., 1993; Preissner, 1991), stymulacja ruchu komórek (Seftor i in., 1992; Gehlsen i in., 1992), lub wpływanie na internalizację receptora (Wickham i in., 1993; Panetti i McKeown Longo, 1993a; Panett i McKeown Longo, 1993b), jednak która, jeśli którakolwiek, bierze w tym udział, pozostaje kwestią dalszych eksperymentów.

Wpływ blokujący 17E6 naavP3, ale nie ηηανβΐ i ανβ5, wymaga dimerizacji celu. Chociaż jedno wartościowe i dwuwartościowe fragmenty przeciwciała 17E6 są jednakowo aktywne w wiązaniu integryny ανβ3 w teście ELISA, i w blokowaniu adhezji komórek mediowanej ανβΐΐ ανβ5, jednowartościowe fragmenty są zasadniczo nieaktywne wobec ανβ3. Ponadto,

182 961 gdy wiążące się krzyżowo przeciwciała dodaje się do jedno wartościowych fragmentów, zachowują one zdolność do blokowania mediowanej ανβ3 adhezji i wykazują tym klasyczny prozonowy wpływ. Simple wiązanie krzyżowe ανβ3 nie jest dostateczne do zablokowania aktywności, jednak, ponieważ wiązanie krzyżowe AP3 nie ma wpływu na mediowaną ανβ3 adhezję, AP3 wiąże łańcuch β3 (por. fig. 2B:e).

Przejście od jednowartościowego do dwuwartościowego oddziaływania powoduje ostry wzrost powinowactwa przeciwciała do jego celu (Lane i Harlow 1988). Miareczkowanie ELISA 17E6 na izolowanym ανβ3 nie pokazuje tego przejścia, i wobec tego wskazuje, że w tej konfiguracji zachodzi jedno wartościowe oddziaływanie z jednoczesnymi jedno wartościowymi i dwuwartościowymi elementami 17E6. W testach wiążących ligand receptorów w takiej samej konfiguracji ELISA 17E6 jest zaskakująco słabym blokującym reagentem w porównaniu z mimetykami peptydowych ligandów jak EMD66203:cRGDfV. Umieszczając to w kontekście: podczas gdy cRGDfV uzyskuje jakieś 2-3 rzędy wielkości aktywności (IC₅₀ od ~1 μΜ do ~1 nM) przy przeniesieniu z testu komórkowego do testu izolowanego receptora, 17E6 traci co najmniej 3 rzędy wielkości pozornej aktywności (IC_sood —100 ng/ml do 100 pg/ml) i w istocie staje się nieaktywny.

Tę anomalię i ważność danych wiązania krzyżowego komórkowego przeciwciała rozstrzygnięto w eksperymentach współzawodnictwa. Wskazały one, że 17E6, w odróżnieniu od peptydowych blokerów, nie interferuje bezpośrednio z miejscem wiązania ligandu. W nieobecności bezpośrednich dowodów zakłada się zwykle, że blokujący reagent działa poprzez stery czną okluzję miejsca oddziaływania ligand-receptor, co jest potwierdzane w dziedzinie integryn przez mimetyki aktywnego miejsca ligandu, takie jak peptydy zawierające RGD (Hynes, 1992), i inaktywację ligandu powodowaną przez bezpośrednią mutagenezę tego miejsca w witronektynie (Chamey i in., 1993). Nasze dane wskazują że nie jest tak dla silnie blokującego przeciwciała 17E6. Podsumowując: na integrynie ανβ3 a) mimetyczne peptydy ligandów współzawodniczą ze sobą i z samymi ligandami b) ligandy współzawodniczą z peptydami c) peptydy ani ligandy nie współzawodniczą z wiązaniem 17E6 d) 17E6 nie współzawodniczy z wiązaniem ligandu lub mimetyka ligandu e) 17E6 w pełni współzawodniczy za sobą i innymi wiążącymi αν przeciwciałami.

17E6 jest niezwykle słabym rywalem dla wiązania ligandu z ανβ3, podczas gdy sondy aktywnego miejsca witronektyny i oparte na RGD współzawodniczą silnie ze sobą na receptorze. Inne przeciwciała współzawodniczą silnie z 17E6. Tak więc, 17E6 działa jako allosteryczny inhibitor. Doświadczenia krzyżowego wiązania wykazują że ανβ3, ale nie ανβ3 lub ανβ5, musi być dimeryzowane przed blokowaniem przez 17E6. Odkrycie to ujawnia, że 17E6 działa według nowego mechanizmu obejmującego manipulację ścieżkami transdukcji sygnału indukowanymi integryną a nie po prostu antagonizując oddziaływania integryna-ligand.

Ponieważ ligandy ανβ3 sąhomopolimerami w ich formie aktywnej i są nieaktywne jako monomery (Preissner, KT. 1991; Stockmann, A. i in. 1993) multimeryzacja integryn przez podłoże może być istotna dla ich działania; w istocie dimeryzacja kinaz receptora tyrozyny z rodziny receptorów czynników wzrostu przez ligandy jest kluczowym zderzeniem w inicjowaniu sygnału transdukcji (Dougall, WC. i in., 1994). Jest intuizyjnie oczywiste, że stereochemia polimeru podłoża jest niezwykle istotna dla orientacji integryny w błonie i kieruje powstawaniem sygnałowego kompleksu. W istocie biologiczna „logika” multimerycznej witronektyny dla adhezji komórki może wynikać z tego ograniczenia. Witronektynowe multimery zawierają od 3 do 16 jednostek (Stockmann, A. i in., 1993) i można przewidywać powstawanie uporządkowanych wzorów integryny na powierzchni komórka i potrzebne ulepszone powinowactwo dzięki oddziaływaniu multimerycznemu. Indywidualny czas trwania oddziaływania monomeryczna witronektyna-αvβ3 jest krótki, a powinowactwo słabe, podczas gdy rotacja nieligowanej integryny w płaszczyźnie błony jest szybka, a powinowactwo przeciwciała i szybkość są wysokie. Tak więc można przewidywać, że dwuwartościowe przeciwciała związane z jedną integryną na powierzchni komórki mogą chwytać zdysocjowane integryny podczas rotacji i zatrzymywać w konformacji nie mogącej wiązać ligandu.

182 961

Powoduje to postępujące osłabienie molekularnego wzoru wiązań ανβ3 i witronektyny i destabilizację oddziaływania komórka-witronektyna - tak jakby zhiszczanie moleculamej siatki. Może to tłumaczyć brak działania 17E6 w teście receptora, ponieważ receptor nie może rotować do potrzebnej orientacji, aby umożliwić dwuwartościowe wiązanie (udowodnione danymi ELI SA), oraz jego skuteczność w teście komórkowym, wyjaśnić obserwowany brak potrzeby współzawodnictwa o aktywne miejsce w teście komórkowym, a także wyjaśnić brak skuteczności fragmentu F(ab') w blokowaniu mediowanej ανβ3 adhezji komórek.

Jest także oczywiste, że ponieważ ανβ5 i ανβΐ (i ανβ6, ανβ8 i ανβΐ) dzielą nakładające się spektrum ligandów z ανβ3 można pomyśleć, że wzajemnie regulują swoje działanie, w sposób bezpośrednio analogiczny do wzajemnej regulacji przez heterodimeryzację receptorów w rodzinie receptorów czynnika wzrostu RTK (Dougall, WC. i in., 1994). Np. ανβ5, mając wyższe powinowactwo niż ανβ3 dla witronektyn, może współzawodniczyć z miejscem wiązania ανβ3 na indywidualnych multimerach tego podłoża - zamykając homodimery ανβ3 potrzebne do wytwarzania sygnału, lub zawieszać adhezję komórek, zastępując je heterodimerami οτνβ5-ανβ3. Inne integryny ccv mogą działać w podobny sposób wzajemnej regulacji, ale nie ma pewnych potwierdzających takie hipotezy.

Podsumowując, opracowano zestaw monoklonalnych przeciwciał wobec ludzkich łańcuchów integryn αν. Jedno z nich, 17E6, blokuje i odwraca mediowane αν procesy in vivo. Ciekawe, że blokuje także zależny od αν rozwój melanomy u nagich myszy. Sugeruje to, że integryny αν mogą być skutecznymi kandydatami do leczenia nowotworów. Przy przygotowywaniu tej publikacji Lehmann i in. (Lehmann i in., 1994) opisał ocv-specyficzne przeciwciała z pewnymi właściwościami podobnymi do 17E6. Interesujące będzie sprawdzenie, czy może także odwracają mediowane αν oddziaływania i zakłócają rozwój melanomy.

Zastosowanie lecznicze i diagnostyczne

Przeciwciało według wynalazku można podawać ludzkim pacjentom w celach terapii. Wobec tego, przedmiotem wynalazku jest farmaceutyczna kompozycja zawierająca jako aktywny składnik co najmniej jedno przeciwciało lub fragment przeciwciała, zdefiniowane powyżej i w zastrzeżeniach, w połączeniu z jednym lub wieloma farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, zarobkami lub rozcieńczalnikami. Typowo przeciwciało według wynalazku będzie wstrzykiwane dożylne lub pozajelitowo. Zwykle dawki przeciwciała (lub jego fragmentów) są wystarczająco duże, aby spowodować pożądane stłumienie nowotworu i lizę nowotworu. Dawka będzie zależała od wieku, stanu, płci i zasięgu choroby pacjenta i może się wahać od 0,1 mg/kg do 200 mg/kg, korzystnie od 0,1 mg/kg do 100 mg/kg na dawkę w jednej lub więcej porcjach podawanych dziennie, przez jeden lub kilka dni.

Preparaty do pozajelitowego podawania obejmują sterylne wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny i emulsje. Przykłady niewodnych rozpuszczalników obejmują glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne takie jak oliwa, i nadawające się do wstrzykiwania organiczne estry takie jak oleinian etylu i inne rozpuszczalniki znane fachowcom, które nadają się do tych celów. Przeciwciała według wynalazku można stosować w kompozycjach zawierających fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Przykłady takich nośników obejmują solankę, PBS, roztwór Ringera, lub mlekowy roztwór Ringera. Środki konserwujące lub inne dodatki takie jak antybiotyki, antyutleniacze i środki chelatujące mogą także występować w farmaceutycznych kompozycjach.

Przeciwciało (lub jego fragment) może także być sprzężone znanymi sposobami z cytokinami takimi jak IL-2 w celu podtrzymania ich cytotoksyczności.

Farmaceutyczne kompozycje według wynalazku nadają się do leczenia wszystkich rodzajów nowotworów, w tym melanom, glejaków i raków, a także nowotworów układu krążenia i nowotworów stałych.

Dla celów diagnostycznych przeciwciało można sprzęgać, np., z ekranującym barwnikiem lub znaczyć radioaktywnie. Korzystną metodą znaczenia jest metoda lodogenowa.

Korzystnie przeciwciało będzie się podawać jako takie lub fragmenty scFv dla celów diagnostycznych. Daje to doskonałe wyniki, tak że nie jest potrzebne odejmowanie tła.

182 961

Tabela 1

Wzór reakcji MAb w teście ELISA i komórkach

Przeciwciało	Immunogen	Izotyp	ανβ3	αΙΠ?β3	M21	M21-L	M21- -L-IIb	UCLAP3	Specyficzność
20A9	M21	IgGl/κ	+	-	+	-	-	+	alphm
23G5	M21	IgGl/k	+	-	+	-	-	+	αν
14D9.F8	M21	IgGl/κ	+	-	+	-	-	+	αν
10E2	M21	IgGl/k	+	-	+	-	-	+	αν
14E2	M21	IgG2/k	-	-	+	+	+	-	200
									KDa
21H6	M21	IgG2/k	-	-	+	+	+	-	200 KDa
LM609		IgGl/k	+	-	+	-	-	-	ανβ3
LM142		IgGl/k	+	-	+	-	-	+	αν
P5H9		IgGl/κ	-	-	+	-	-	+	ανβ5
CP8		IgGl/κ	-	+	-	-	+	-	αΐ^β
									3
P4C10		IgGl/k	-	-	+	+	+	+	βΐ
AP3		IgGl/κ	+	+	+	-	+	-	β3

Tabela 2

Podsumowanie reaktywności przeciwciała monoklonalnego w cytometrii przepływowej

Przeciwciało	Specyficzność	Μ21	M21-L	M21-L(p)	M21-L-IIb	M21-L4	M21-L12	UCLA-P3	WM793
ανβ3, ανβ5	(β3)@	(β3)@	α!Π?β3	ανβ3, ανβ5	(β3)@	ανβ5	ανβ3, αν β5
17Ε6	αν	++	-	-	-	++	-	4-Η-	+++
20Α9	αν	4-4-	-	-	- .	4-4-	-	4-4-4-	+++
23G5	αν	4-4-	-	-	-	4-4-	-	4-Η-	4-Η-
14D9.F8	αν	4-4-	-	-	-	++	-	4-4-4-	4-Η-
14Ε2	200 KDa	-Η-	+4-	-Η-	-Η-	++	4-4-	-	+++
LM609	ανβ3	4-4-	-	-	-	+	-	-	4-4-
LM142	αν	4-4-4-	-	-	-	4-4-	-	4-4-	4-4-4-
Ρ5Η9	ανβ5	+	-	-	-	+	-	+++	+
P4C10	βΐ	-Η-	++	-Η-	4-4-	4-4-	4-4-	4-4-	4-4-
ΑΡ3	β3	4-4-	-	++	Ή-	+	+	-	+
CP8	αΙΙΕβ	-	-	-	-Η-	-	-	-	-
	3			-

182 961

Tabela 3

Inhibicja rozwoju nowotworu M21 przez 17E6 Mab w płucach myszy BALB/C nu/nu test „eksperymentalnej metastazy”

Komórki i leczenie	Pojawienie nowotworu	Liczba ognisk nowotworu	% kontrolnej
średnie ± 110	mediana	(zakres)
M21 (kontrolna)	99	87 ± 110	30	(3-378)	100
M21+17E6	78	8 ±7,7	5	(0-21)	9
M21-L	56	19 ±22	8,5	(0-60)	22*

Przykłady

Przykład 1: Materiały.

Zwierzęta: Myszy do wytwarzania przeciwciał (samice BALB/c; 8 tygodniowe) i do modeli nowotworów („nagie myszy”: samice homozygotyczne atymiczne BALB/c nu/nu; 4-5 tygodniowe) z Criffa (Barcelona, Hiszpani). Nagie myszy trzymano w sterylnym pokoju w mikro-izolacyjnych klatkach i dawano im sterylizowany pokarm i wodę ad libitum. Wszystkie manipulacje prowadzono w pudle z przepływem laminamym.

Białka: Fibronektynę (Ruoslahti i in., 1982), witronektynę (Yatohgo i in., 1988) otrzymano z zamrożonego ludzkiego osocza i fibrynogenu (Kazał i in., 1963) z pełnej krwi. Lamininę otrzymano z mysich nowotworów Engelbretha-Holma-Swarma (Paulsson i in., 1987).

Gdzie nie podano inaczej, wszystkie manipulacje prowadzono w temperaturze 20°C, a wszystkie przemywania prowadzono PBS bez wapnia i magnezu („PBS”: 137 mM NaCl, 2,8 mM KC1, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO4; pH 7,4). PBS++jest PBS z dodanym 1 mM MgCl₂ i 1 mM CaCl₂. Gdzie nie podano specjalnie, chemikalia (Merck KGaA, Darmstadt) były najwyższej dostępnej czystości. Cykliczne peptydy takie jak cRGDfV i cRGDfK zsyntetyzowano znanymi standardowymi technologiami (np. FEBS Let. 291, str. 50-54, 1991). Liniowy peptyd GRGDSPK, który stosuje się jako porównawczy, jest handlowo dostępnym związkiem (np. z Bachem, Szwajcaria).

Linie komórek i kultury nowotworowe - American Type Culture Collection (ATCC) dostarczyła SW1116, ludzkiego raka HT29 i ludzką melanomę β375, a następujące ludzkie linie komórek były uprzejmym darem kolegów: melanoma M21, jej warianty M21-L i M21-L4 (Cheresh i Spiro, 1987), M21-L-IIb (według (Kieffer i in., 1991)), ludzka płucna adenokarcynoma UCLA-P3 (Cheresh i in., 1989) (Dr D.A., Cheresh, Scripps), melanoma WM793 i WM164 (Dr M. Herlyn; Wistar) (Herlyn i in., 1990). Rak trzustki NP1B (Dr G. Cappella; Hospital Sant Pau; Barcelona). Mysia melanoma B16F10 originalnie pochodziła od dr I. Fidlera (Poste i in., 1980) (Dr S. Alino; University of Valencia). EMM31 ustalono w naszej grupie z próbki nowotworu zdefiniowanej standardowymi histologicznymi kryteriami jako pierwotna melanoma (Jaggle i in. niepublikowane obserwacje). Wszystkie komórki hodowano w temperaturze 37°C w 7,5% CO₂, 92,5% powietrza w 90% RPMI 1640, 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) plus 2 mM L-glutaminy, i były one jednakowo wolne od mykoplazmy, co oceniono odpowiednim testem (Mycotect Kit; Gibco).

Przeciwciała - fuzje monoklonalnych przeciwciał (MAb), przesiewanie ELISA, subklonowanie i utrzymywanie kultur prowadzono standardowymi technologiami (Harlow i Lane, 1988) jeśli nie podano inaczej.

Przykład 2

Immunizacja: MAbs wobec ανβ3 wytworzono przez dootrzewnową (ip) iniekcję oczyszczonego łożyskowego ανβ3 unieruchomionego na Sepharose (80 pg ανβ3 na 80 μΐ Sepharose w 200 μΐ PBS) lub żywych komórek M21 (lxl0⁶ komórek w 0,5 ml PBS) co 2 tygodnie przez 12 tygodni. Cztery dni po ostatniej iniekcji wykonano indukowaną PEG fuzję stosując

182 961

Friendly Myeloma (Ventrex) jako partnera. Przeciwciała dla związanego z melanomą powierzchniowego białka 200 kDa wytworzono immunizując nietknięte komórki M21 (1x10⁶ komórek w 0,5 ml PBS).

Odsiewanie: Stosowano test ELISA na receptorach i na unieruchomionych komórkach M21. Dla receptorowego testu ELISA, 96-studzienkową płytkę ELISA (Dynatech) powlekano oczyszczonym ανβ3 (1 pg/ml w PBS, 16 godzin; 4°C), blokowano (1,5% chude mleko w PBS; 1 godzina; 4°C) i inkubowano z hybrydomowymi supematantami. Związany immunoglobuliny wykrywano alkaliczno-fosfatazowym koniugatem anty-mysiej Ig (Dako) stosując fosforan p-nitrofenylu jako podłoże. Dla komórkowego testu ELISA, komórki M21 lub M21-L, M21-LIIb lub UCLAP-3 unieruchamiano na 96-studzienkowej płytce do hodowli tkanki (4% paraformaldehydu w PBS, 15 minut, 20°C) i blokowano (3% BSA, PBS; 1 godzina; 4°C) przed inkubację z hybrydomowymi supematantami i detekcją jak w receptorowym teście ELISA. Pozytywne hybrydy subklonowano trzy razy ograniczającym rozcieńczaniem i adaptowano do medium RPMI. Izotyp immunoglobuliny określono stosując specyficzne dla podklasy ciężkołańcuchowe przeciwciała (Zymed) i lekkołańcuchowe przeciwciała (Promega).

Inne mysie MAb użyte w badaniach otrzymano od kolegów: LM609 do ανβ3 i LM142 do αν (Cheresh i Spiro, 1987) (Dr D.A. Cheresh; Scripps), P4C10 do integryny βΐ (Carter i in., 1990) (Telios), PSH9 do kompleksu integryny ανβ5 (Wayner i in., 1991) (Dr E. Wayner, University od Minnesota), CP8 do kompleksu αΙΙήβ3 (Dr Ruggieri; Scripps), AP3 do łańcucha β3 (Furihata i in., 1987) (ATCC), 9.2.27 wobec powierzchniowego proteoglikanu komórki melanomy (Harel i in., 1990) (Dr R. Reisfeld; Scripps) i 14.18 G2a wobec gangliozydu GD2 (Mujoo i in., 1989).

Przykład 3

Oczyszczanie przeciwciał i zwiększanie skali: Do oczyszczania w dużej skali zebrano supematanty przeciwciał z wykładniczej fazy kultur hodowanych w butlach. Przeciwciała oczyszczone na białkowej A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) dializowano wobec PBS przed sterylną filtracją (0,45 pm) i magazynowaniem w temperaturze -70°C (Harlow i Lane, 1988). Oczyszczone przeciwciała uwolniono od endotoksyn przepuszczając przez columny Kurimover-II (Kurita-Vater; Tokio). Zmniejszyło to poziom endotoksyn z 250 lU/mg przeciwciała do <0,2 lU/mg w teście Limulus (Melvaer i Fystro, 1982). Fragmenty Fiab^ i F(ab/ 17E6 (mysia IgGl) wytworzono standardowymi technikami rozszczepiania pepsyn i separacji na kolumnach protein-A (Pharmacia), a następnie rozszczepiania papainowego i separacji metodą filtracji żelowej (Harlow i Lane, 1988).

Oczyszczanie integryn ανβ3 i αΙ^β3 ανβ3 otrzymano z ludzkiego łożyska (Smith i Cheresh, 1988). Porodowe łożyska macerowano i przemyto w ~2 objętościach roztworu z lodem A (0,05% digitoniny, 2 mM CaCl₂ 2 mM PMSF, pH 7,4), następnie przesączono. Pozostały materiał ekstrahowano w ~4 objętościach bufora z lodem B (100 mM oktylo-a-D-glukopiranozydu [OG], 1 mM CaCl₂, 2 mM PMSF w PBS) i odwirowano (12000 g maks., 45 minut; 4°Ć). Supematant recyrkulowano nad kolumną z przeciwciałem LM609 (16 godzin; 4°C). Po przemyciu buforem C (0,1% NP-40 w PBS; ~10 cv) i buforem D (0,1% NP-40, 2 mM CaCl₂,10 mM octanu sodu; pH 4,5: ~10 cv), związany materiał eluowano buforem E (bufor D adiustowany do pH 3,1). Eluant zobojętniono 3 M Tris (pH 8,8), dializowano wobec bufora C i zatężono ~10x stosując Aquacide II (Calbiochem). Oczyszczony receptor przechowywano w temperaturze -70°C.

αΙΠ)β3 wytworzono z ludzkich płytek (Pytela i in., 1986). Przeterminowane koncentraty płytek zmieszano z 1 objętością bufora Tyrodes, granulowano (1200 g maks.) i granulki ekstrahowano (1 godzina; 20°C) z buforem lizy (50 mM OG, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 1 μΜ MnCl₂, 2 mM PMSF, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl; pH 7,4). Po odwirowaniu (32000 g maks., 30 minut; 4°C) supematant recyrkulowano (16 godzin; 4°C) nad sprzężoną z GRGDSPK kolumną CL-4B Sepharose. Kolumnę przemyto buforem lizy (~10 cv) i eluowano GRGDSPK (3 mg/ml w 90% buforze lizy, 10% DMSO). Pik zatężono ~5-krotnie, dializowano

182 961 wobec zmodyfikowanego bufora lizy (0,1% NP-40 podstawione dla OG) i przechowywano w temperaturze 70°C. Preparaty integryny miały -95% czystości w teście antyintegrynowym ELISA stosując specyficzne dla a- i β-łańcuchów monoklonalne przeciwciała oraz metodą SDS-PAGE.

Przykład 4. Powierzchniowe znakowanie i immunocharakteryzacja

Biotynylacja i ekstrakcja powierzchni komórki: - Komórki w wykładniczym stadium wzrostu zebrano przy pomocy EDTA, przemyto i 5x10₆ komórek w PBS (1 ml) powierzchniowo znaczono biotyno-N-hydroksysukcinimidowym estrem (10 pg/ml; Sigma) w wyparce obrotowej (2 godziny; 20°C), przemyto i 5xl0⁶ komórek na miłilitr poddano lizie przez 1 godzinę w temperaturze 20°C w buforze ekstrakcji (100 mM OG, 2 mM CaC12, i 1 mM MgCl₂ i 1 mM PMSF w PBS). Po odwirowaniu (12000 g, 20 minut) supematant zastosowano do immunostrącania.

Immunostrącanie: Ekstrakty biotynylowanych komórek immunostrącono oczyszczonymi anty-integrynowymi MAb sprzężonymi z kulkami Affigiel-10 (Biorad), lub związanymi z protein-G Sepharose (Pharmacia), 10 mg sprzężonego MAb inkubowano z równoważnikami komórek 5E6 biotynylowanych ekstraktów komórek przez noc w temperaturze 4°C. Przemyte kulki gotowano w nieredukującym buforze do próbek SDS, odwirowano i rozdzielono na 7,5% SDS-PAGE. Po electroforetycznym przeniesieniu na nitrocelulozę (Towbin i in., 1979), pasma wywołano kozim anty-biotynowym koniugatem alkalicznej fosfatazy (Dako) stosując NBT-BCIP (Biorad) jako podłoże.

Cytometria przepływu: Komórki zebrano EDTA, przemyto, i 10⁶ komórek w PBS-1% BSA inkubowano z MAb (10 pg/ml; 20 minut, 4°C). Po przemyciu i znakowaniu (20 minut, 4°C) kozim anty-mysim Ig-FITC (Becton Dickinson), komórki inkubowano z jodkiem propidiowym przed analiza cytometrii przepływu (EPICS Profile II, Coulter). Żyjące komórki wybrano przy pomocy odpowiednich bramek w rozrzucie na boki i do przodu. Fluoresceinę wzbudzono przy długości 488 nm aronowo/jonowym laserem i emitowaną fluorescencję (525 nm) zarejestrowano. W pewnych eksperymentach, komórki M21-L zabarwiono po krótkiej fiksacji i penneabilizacji (70% etanolu; 5 minut x -20°C).

Komplementarna zależna cytotoksyczność (CDC). Komórki M21 (10.000) umieszczono w 96-studzienkowej płytce z 50 pl kompletnego medium i 20 pl przeciwciał. Surowicę królika (50 pl, 1:5); Behring) dodano jako źródło środka uzupełniającego i płytkę inkubowano (37°C; 60 minut). Lizę przeliczono techniką MTT (Mosmann, 1983). Procent lizy obliczono stosując studzienki z 1% Tween-20 jako 100% lizowaną kontrolą, i bez przeciwciała jako 0% lizowaną kontrolą.

Przykład 5. Wzrost komórki, żywotność i aktywacja

Testy rozmnażania: W celu przetestowania wpływu chronicznego przeciwciała, 10⁶ komórek inkubowano w obecności MAb (70 pg/ml PBS; 1 godzina; 20°C) wyparce obrotowej, przemyto, następnie umieszczono w zawiesinie i dalej hodowano w medium RPMI. Wzrost i żywotność oceniono metodą wykluczania błękitu trypanowego. Aktywację zmierzono w teście MTT jak opisano powyżej, i liczbę komórek ustalano dziennie stosując licznik komórek (Coulter electronics).

Przywarte komórki melanomu odłączono (0,05% trypsyny/0,02% EDTA). Przemyto komórki posiano na 96-studzienkowej płaskodennej mikrotestowej płytce (1x10⁴ komórek na studzienkę) i hodowano bez (kontrola) lub w obecności seryjnie rozcieńczonego przeciwciała w medium RPMI z 10% FCS. Po 48 godzinach komórki zaznaczano pulsacyjnie przez 18 godzin (18,5 kBeq [³H]tymidyny na studzienkę) i zebrano. Włączoną radioaktywność zmierzono i wyrażono w impulsach na minutę.

Przykład 6

Testy cytotoksyczności komórkowej skierowanej na przeciwciało (ADCC): Preparowanie mikroglejowych komórek i przygotowanie warunków dla ADCC i cytostazy mediowanej przeciwciałem z komórką efektorową (AECM) były takie, jak opisano (Sutter i in., 1991). Komórki M21 znaczono pulsacyjnie przez 18 godzin z [³H]-tymidyną (18 kBq na 4xl0³ ko

182 961 morek na studzienkę) i inkubowano na 96-studzienkowej płytce z mikroglejem BALB/C (5xl0⁴ komórek na studzienkę) w 200 μΐ DMEM/FCS (10%) w obecności przeciwciał. Po 48 godzinach zmierzono znacznik [³H] pozostały w jądrowym przedziale docelowych komórek. Cytotoksyczność zależną od MAb obliczono stosując wzór: [(eksperymentalne ccpm - spontaniczne ccpm) / (maks, ccpm - spontaniczne ccpm)) x 100.

Przykład 7

Cytostaza zależna przeciwciała i komórki efektorowej (AECM). Jak w przypadku ADCC, ale zamiast pulsacyjnego znaczenia użyto świeżo pasażowanych nieznaczonych komórek M21. Po 24 godzinach współkultury efektor-komórka docelowa znakowano pulsacyjnie [³H]-tymidyną (18 kBq na studzienkę) przez dodatkowe 24 godzin i zmierzono ilość włączonego znacznika [³H].

Testy przyłączania komórek: były takie, jak opisano powyżej (Goodman i in., 1991), z zastosowaniem działania heksozoaminidazy (Landegren, 1984) do wykrywania przyłączonych komórek. Rozcieńczania i zawiesiny sporządzono w buforze przyłączania (RPMI, 1% BSA, 25 mM HEPES; pH 7,4). Matrycowe białka powlekano na 96- lub 48-studzienkowe płytki, studzienki blokowano BSA i dodawano seryjnie rozcieńczany MAb i komórki (2,5x10⁴ - 5x10⁴). Po 1 godzinie w temperaturze 37°C nieprzywarte komórki wymyto, a przyłączone komórki policzono wobec równoległej krzywej standardowego przebiegu. Inhibicję przyłączania obliczono stosują studzienki baz MAb jako odnośniki. Typowo ponad 70% dodanych komórek przyłączało się do witronektyny po 1 godzinie. Przyłączanie komórek do studzienek powlekanych tylko BSA dawało zwykle mniej niż 5% specyficznie przyłączonych komórek.

Test powierzchniowego wiązania krzyżowego. Jak w teście przyłączania komórek, komórkom pozwolono się wiązać z płytkami powlekanymi matrycą w obecności seryjnie rozcieńczonego 17E6 lub jego fragmentów Fiab^ lub F(ab'), i rosnących ilości koziego-anty-mysiego-F(ab') jako reagentu wiązanie krzyżowego. Przemywanie i detekcja przyłączonych komórek była taka, jak dla normalnego przyłączania komórek.

Test odwracania przyłączania: Komórki umieszczono na płytkach w buforze przyłączania na studzienkach powlekanych i blokowanych jak w testach przyłączania komórek, i inkubowano w temperaturze 37°C. Po rozłożeniu (60-75 minut), dodano seryjnie rozcieńczone MAb i komórki zawrócono do inkubatora. Alternatywnie, komórkom pozwolono się przyłączać przez 24 godzin przed dodaniem przeciwciała. Po 2-3 godzinach w obecności przeciwciała, supematanty ostrożnie usunięto i zastąpiono 5 razy świeżym, podgrzanym buforem przyłączania - co dawało końcowy czynnik rozcieńczenia > 1x10⁵.

In vivo rozwój nowotworu: Komórki nowotworu w fazie wykładniczego wzrostu zebrano EDTA, przemyto i żywotność oceniono metodą wykluczania błękitu trypanowego. Wynosiła ona 96-99%. Dla pierwotnego wzrostu nowotworu komórki (0,5 χ 10⁶ komórek w 0,2 ml PBS++) wstrzyknięto podskórnie w boki nagich myszy. Wzrost nowotworu śledzono mierząc średnice nowotworu cyrklem i objętość nowotworu obliczano stosując przybliżony wzór dla wydłużonej elipsoidy objętość = ((a -b²)/2) gdzie:

a jest najdłuższą osią nowotworu, a b najkrótszą. Użyto minimum 8 zwierząt w grupie.

Dla eksperymentalnej metastazy płucnej komórki zebrano (0,5% trypsyny/0,02% EDTA) i wstrzyknięto do żyły ogonowej nagich myszy (0,5x10⁶ komórek w 0,2 ml PBS++). 7 tygodni później zwierzęta zabito, płuca usunięto i utrwalono w roztworze Bouinsa, i policzono ogniska nowotworu na powierzchni płuc. Dla leczenia przeciwciałami zebrane i przemyte komórki inkubowano z oczyszczonymi wolnymi od-endotoksyny MAb (70 pg na 10⁶ komórek w 0,5 ml PBS++) przez 30 minut w temperaturze 20°C w wyparce obrotowej przed rozcieńczeniem do stężenia 0,5x10⁶ komórek w 0,2 ml PBS i iniekcją. Żywotność komórek

182 961 oceniono metodą wykluczania błękitu trypanowego przed i po zakończeniu cyklu iniekcji, przy czym nie znaleziono istotnej różnicy (żywotność przed iniekcją = żywotność po iniekcji ± 5%). Dane inhibicji nowotworu przetestowano stosując 2-wymiarowy T-test Studenta.

Przykład 8. Techniki biologii molekularnej

Jeśli nie podano inaczej, wszystkie techniki biologii molekularnej były zgodne z poprzednim szczegółowym opisem (Sambrook i in., 1989).

Wytwarzania RNA i cDNA. Całość RNA izolowano z komórek 17E6 ekstrakcją tiocyjanianez guanidyny i RNA wydzielono ultrawirowaniem z gęstościowym gradientem chlorku cezu (Chirgwin i in., 1979). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano stosując handlowy zestaw (Pharmacia). Syntezę prowadzono w objętości 15 μΐ z 5 pg RNA przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Pierwszą niż cDNA zastosowano bezpośrednio do wzmacniania PCR.

Wzmacnianie PCR: zmienne regiony mysiego lekkiego i ciężkiego łańcucha wzmocniono stosując nadmiarowy i półdegenerowany zestaw primerów PCR opracowany do hybrydyzacji do mysich początkowych sekwencji Ig (Jones i Bendig, 1991). Mieszanina 61 oligonukleotydów służyła jako 5'-primery lub zmienna domena ciężkiego łańcucha, a mieszanina 405 oligonukleotydów służyła jako 5'-primery dla zmiennej domeny łańcucha kappa. 3'-primery zaprojektowano do włączania się w stały region: zastosowano specyficzne primery mysie IgGl i kappa.

Dla wzmacniania termostabilnąpolimerazą DNA 25 μ/ mieszaniny reakcyjnej zawierającej: 1 μΐ hybrydy cDNA-RNA, 250 nM odpowiedniej mieszaniny primerów 5' i 3', 200 μΜ każdego dNTP, 1 mM MgCl₂ (dla lekkiego łańcucha), 2mM MgCl₂ (dla ciężkiego łańcucha) i 1 U polimerazy Taq (Cetus), dopełniono olejem mineralnym i uruchomiono na gorąco w temperaturze 60°C do 55°C wygrzewania. Po 30 cyklach (l'x55°C: 1,5 x 72°C: 45s x 92°C), jedną dziesiątą reakcji PCR umieszczono na 1% agarozie na TAE do electroforezy i zabarwiano bromkiem etydiowym dla pokazania powstałych produktów PCR.

Molekularne klonowanie i sekwencjonowanie: 1 μΐ każdego produktu PCR ligowano w wektor TA (Invitrogen, San Diego). Dwie mieszaniny reakcyjne ligacji DNA, dla zmiennych regionów ciężkiego i lekkiego łańcucha, transformowano metodą szoku cieplnego do właściwych komórek E. coli szczepu TG1 dla wytworzenia dwu bibliotek DNA, Mab lekkiego zmiennego regionu 17E6 i Mab ciężkiego zmiennego regionu 17E6 Mab. Kolonie zebrano na płytkach LB ze 100 pg/ml karbenicyliny i pobrano do dalszej analizy. Pozytywne kolonie odkryto metodą przesiewania PCR lub stosując trawienie plazmidu (Gussow i Clackson, 1989). Dwuniciowy plazmid DNA wytworzono (Wizard pres, Promega Corp.) do sekwencjonowania z transformantów. Prowadzono termiczne cykliczne sekwencjonowanie stosując dideoksynukleotydowy sposób terminacji łańcucha (Sanger i in., 1977) i polimerazę Taq. Stosowano obukierunkowe sekwencjonujące primery komplementarne dla wektora TA.

Testy wiązania i współzawodniczenia ligandu integryny. Biotynylacja ligandów: Ligandy w PBS rozcieńczono 5-krotnie stężonym buforem ligacji (końcowe stężenie: 1 mg/ml białka, 100 mM NaCl · 100 mM NaHCO₃, pH 8,2) w końcowej objętości 1 ml. Świeżo wytworzony roztwór N-hydroksysukcynimidobiotyny (100 μΐ; 1 mg/ml w DMSO) dodano z mieszaniem i reakcję kontynuowano prze 2 godziny w temperaturze 20°C z pełną rotacją. Po dokładnej dializie w (4°C: PBS, 0,05% NaN₃), oceniono stężenie białka i biotynylowany ligand przechowywano w temperaturze 4°C i użyto w ciągu 21 dni. Syntezę biotynylowego peptydu cRGDfK (cykliczny-Arg-Głi-Asp-DFen-Liz = kwas N-biotyno-aminoheksanowy) opisano w literaturze lub można jej dokonać standardowymi technikami.

Test bezpośredniego współzawodniczenia. Testy były oparte na pewnych modyfikacjach wcześniejszych metod (Smith i in., 1990). ανβ3 rozcieńczono do stężenia 1 pg/ml w buforze A (150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 10 μΜ MnCl₂,20 mM Tris-HCl; pH 7,4) i 100 ml umieszczono na noc w temperaturze 4°C w 96-studzienkowej mikromiareczkowej płytce. Płytkę przemyto raz buforem B (3% BSA, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂,1 mM CaCl₂, 10 μΜ MnCl₂, 50 mM Tris-HCl; pH 7,4) i inkubowano 2 godziny w temperaturze 20°C w takim samym buforze.

182 961

Po przemyciu buforem C (bufor B z BSA w stężeniu 0,1%) dodano biotynylowany ligand (1 pg/ml końcowego stężenia) i seryjnie rozcieńczonymi testowymi peptydarni lub białkami. Po inkubacji (3 godziny, 30°C), niezwiązany ligand spłukano z płytki przemywając 3 razy buforem C, i kontynuowano inkubację przez Ih ze sprzężonym z anty-biotyno-alkaliczną fosfatazą przeciwciałem (1:10000 w buforze C) (Sigma), a następnie przemyto PBS i wykryto związane przeciwciało NBT-BCIP (Biorad) jako podłożem. Cząsteczki i przeciwciała ECM rutynowo biotynylowano i stosowano w takiej testowej konfiguracji.

Testy prowadzono rutynowo potrójnie lub poczwórnie, i powtarzano co najmniej 3 razy w celu otrzymania IC₅₀ z nieważonej dopasowanej krzywej esicowej. Wyniki znormalizowano wobec zewnętrznej próby kontrolnej peptydów w celu umożliwienia porównań między testami. Jako zewnętrzne wzorce wykorzystywano zwykle liniowy.

RGD peptyd GRGDSPK i cykliczny peptyd cRGDfV do miareczkowań, jak podobnie stosowano kontrolne studzienki w teście wiązania biotynyłowanego łigandu z zablokowanymi studzienkami bez integryny i w teście wiązania antybiotynowego przeciwciała z wolną od ligandu integryną. Sygnał z kontrolnych studzienek był < 7,5% specyficznego wiązania ligandu.

Test współzawodniczenia przed blokowaniem. Płytki powlekane receptorem i zablokowane jak w teście bezpośredniego współzawodniczenia preinkubowano z podwójnie stężonymi przeciwciałami, cząsteczkami matrycy lub współzawodniczącymi peptydami (50 μΐ w buforze C: 1 godzina; 30°C) przed dodaniem biotynyłowanego sondującego ligandu lub przeciwciała (50 μΐ w buforze C) i kontynuowano inkubację (3 godziny; 30°C), po czym przemyto i wykryto związanąbiotynę, jak to opisano dla testu bezpośredniego współzawodniczenia.

182 961

182 961

FIG. 2

182 961

FIG. 3

Melanoma.

M21

WM164

A375

EMM31

WM793

MALME3

B16F10

=□ ]

ZZZ) zzi

Z3

I

I Rak

UCLAP-3

NP18

SW1116

HT-29

---------------1---------------1_______________1________________1_______________L

100 80 60 40 20 0

FACS

182 961

10'² ΙΟ'¹ 10° ΙΟ¹ ΙΟ'⁵ ΙΟ'⁴ ΙΟ'³

FIG. 4

182 961

100

i. « * * * -«· * t «ιιΐ , i i_« «11<i

10^-2 10^-1 10° 10¹

FIG. 5

182 961

I7E6 LM609 I4E2

FIG. 6

182 961

FIG. 7

182 961

FIG. 8

182 961

FIG. 9

182 961

Fig. 10

182 961

Fiq. 11

ΙΟ’³ ΙΟ’² 10 ¹

182 961

2.5 g 2.0 c o 1.5

O ¹⁰

0.5

0.0

10^ 10-³ 10-² 10*¹ 10° 10¹ 10²

O 0 pg/ińl V °-l Pg/ml □ 1-0 pg/ml △ 10.0 pg/ml

Fig, 12

182 961

+ 50nM cRGDfK-bio

Ο GRGDSPK -ίΟ cRGDfV + φ GRGDSPK + φ cRGDfV + nM cRGDfK-bio 50 nM cRGDfK-bio l^g/ml VN-biotin l/xg/ml VN—biotin

182 961

ΙΟ⁴ ΙΟ³ 10~² ΙΟ¹ 10° ΙΟ¹ © 17Ε6 □ ŁM609 Ο 14D9.F8 V 20Α9

Λ WAM 2-4 φ cRGDfV

182 961

0.01 0.1 1 10 100 0.01 0.1 1 10 100

O VN

V FG □ FN A 66203 ^przeciwciało

Fig. 15

182 961

0.01 0.1 1 10 100 0.01 0.1 1 10 100 • 17E6

V LM 609 □ AP3 △ 14D9.F8

Fig, 16

182 961

Fig. 17a

początek	CAG Gin ACC Thr	TTC Phe AGA Arg	CTT Leu TGT Cys	GGT Gly FR1 GAT Asp	CTC Leu ATC Ile	CTG Leu CAG Gin	TTG Leu ATG Met
ATG Met CTC Leu	GTG Val TGT Cys	TCC Ser TTT Phe	TCA Ser CAA Gin	GCT Ala GTT Val
ACA	CAG	ACT	ACA	TCC	TCC	CTG	TCT	GCC	TCT	CTG	GGA
Thr	Gin	Thr	Thr	Ser	Ser	Leu	Ser CDR1	Ala	Ser	Leu	Gly
GAC	AGA	GTC	ATC	ATC	AGT	TGC	AGG	GCA	AGT	CAG	GAC
Asp	Arg	Val	Ile	Ile	Ser	Cys FR2	Arg	Ala	Ser	Gin	Asp
ATT	AGC	AAT	TAT	TTA	AGC	TGG	TAT	CAA	CAG	AAG	CCA
Ile	Ser	Asn	Tyr	Leu	Ser	Trp	Tyr	Gin	Gin CDR2	Lys	Pro
GAT	GGA	ACT	GTT	AAA	CTC	CTG	ATC	TTC	TAC	ACA	TCA
Asp	Gly	Thr	Val	Lys FR3	Leu	Leu	Ile	Phe	Tyr	Thr	Ser
AAA	TTA	CAC	TCA	GGA	GTC	CCA	TCA	AGA	TTC	AGT	GGC
Lys	Leu	His	Ser	Gly	Val	Pro	Ser	Arg	Phe	Ser	Gly
AGT	GGG	TCT	GGA	ACA	GAT	TAT	TCT	CTC	ACC	ATT	AGT
Ser	Gly	Ser	Gly	Thr	Asp	Tyr	Ser	Leu	Thr	Ile	Ser
AAC	CTG	GAC	CAA	GAA	GAT	ATT	GCC	ACT	TAC	| | f	TGC
Asn CDR3	Leu	Asp	Gin	Glu	Asp	Ile	Ala	Thr	Tyr FR4	Phe	Cys
CAA	CAG	GGT	AAT	ACG	TTT	CCG	TAC	ACG	TTC	GGA	GGG
Gin GGG Gly	Gin ACA Thr	Gly AAG Lys	Asn GTG Val	Thr GAA Glu	Phe ATG Met	Pro AGA Arg	Tyr	Thr	Phe	Gly	Gly

182 961

Fig. 17b

początek	TTC Phe GTC Val	CTG Leu CAG Gin	TTT Phe CTT Leu	TCA Ser CAG Gin
ATG Met GTA Val	GGA Gly ACT Thr	TGG Trp GCA Ala	AGC Ser GGT Gly	TGG Trp GTC Val	GTC Val CAC His	TTT Phe TCC Ser	ATC tle FR1 CAG Gin
CAG	TCT	GGG	GCT	GAA	CTG	GCA	GAG	CCT	GGG	GCC	TCA
Gin	Ser	Gly	Ala	Glu	Leu	Ala	Glu	Pro	Gly	Ala	Ser
GTG	AAG	ATG	TCC	TGC	AAG	GCT	TCT	GGC	TAC	ACC	TTT
Val	Lys	Met	Ser	Cys	Lys	Ala	Ser	Gly	Tyr	Thr	Phe
	CDR1					FR2
ATG	AGT	TTC	TGG	ATG	CAC	TGG	GTA	AAA	CAG	AGG	CCT
Ser	Ser	Phe	Trp	Met	His	Trp	Val	Lys	Gin	Arg	Pro
								CDR2
GGA	CAG	GGT	CTG	GAA	TGG	ATT	GGA	TAC	ATT	AAT	CCT
Gly	Gin	Gly	Leu	Glu	Trp	Ile	Gly	Tyr	Ile	Asn	Pro
AGA	TCT	GGT	TAT	ACT	GAG	TGT	AAT	GAG	AT A	TTC	AGG
Arg	Ser	Gly	Tyr	Thr	Glu	Cys	Asn	Glu	Ile	Phe	Arg
	FR3
GAC	AAG	GCC	ACA	ATG	ACT	GCA	GAC	ACC	TCC	TCC	AGC
Asp	Lys	Ala	Thr	Met	Thr	Ala	Asp	Thr	Ser	Ser	Ser
ACA	GCC	TAC	ATG	CAA	CTG	AGT	GGT	CTG	ACA	TCT	GAG
Thr	Ala	Tyr	Met	Gin	Leu	Ser	Gly	Leu	Thr	Ser	Glu
									CDR3
GAC	TCT	GCA	GTC	TAT	TAC	TGT	GCA	AGT	TTT	CTG	GGA
Asp	Ser	Ala	Val	Tyr	Tyr	Cys	Ala	Ser	Phe	Leu	Gly
						FR4
CGA	GGG	GCT	ATG	GAC	TAC	TGG	GGT	CAA	GGA	ACC	TCA
Arg	Gly	Ala	Met	Asp	Tyr	Trp	Gly	Gin	Gly	Thr	Ser
GTC	ACC	GTC	TCC	TCA
Val	Thr	Val	Ser	Ser

182 961

początek region zmienny

region stały

Fm -mRNA

Ciężki i lekki łańcuch

Klonowanie i sekwencjonowanie

Fig. 18

182 961

-iLft 609 |ft21| ?	]LM 142 Al
1·ι· ii* i* Λ·	ii· ii‘ ti» ti· ii-
?117E6 A i	!114D9 Al
i*· ii* ii» i·· ir*	ił· tv ii* ti* fr
?120A9 Al	h23G5 , Al
	tf· 1·« 1« i·» iv
ί 10G2^	119.2.27 : Κλ
if i·* ti» tv i«	:«· te· ii* te» tr
?121H6 ' Al	1114E2 Aa
	te· :♦» iv ii-

	tu 609 |M21L|	3	LM 142
	r ti· ii> ti· tł-		• ιί™ιέ» ιέ· ιέ-
J			1409
	• i·· ii* ii· ii-	1	Κ ΙΗ ii> li· li-
Si	£*Λ	Sn	23G^
><	r i»· ii* ii· ir·		• iH 14· i*· ii
	10G2.
	i· t·· ii» ii· tr	1
	21H6		Έ
1	IV 14* ii» ir	l	s· ii* ii» tv ti^

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (22)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

   - reaguje tylko z łańcuchem oą, ludzkiej integryny

   - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę cą,

   - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę

   - blokuje rozwój nowotworu, oraz

   - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.
2. 2. Przeciwko monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jako podłoże integrynowe stosuje się witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę.
3. 3. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że nowotworem, którego wzrost komórek jest blokowany, jest melanoma.
4. 4. Fragmenty F(ab^r) i F(ab')₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak przeciwciało monoklonalne, przy czym przeciwciało to zawiera sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

   - reaguje tylko z łańcuchem oą, ludzkiej integryny ot^

   - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę (Ą,

   - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynęfA,

   - blokuje rozwój nowotworu, oraz

   - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.
5. 5. Hybrydomowa linia komórek o oznaczeniu 272-17E6 i złożona pod numerem dostępu DSM ACC2160, charakteryzująca się tym, że może wytwarzać przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty fragmenty F(ab9 i F, (ab^ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne.
6. 6. Sekwencja aminokwasowa, znamienna tym, że stanowi sekwencję przedstawioną na fig. 17a.
7. 7. Sekwencja aminokwasowa, znamienna tym·, że stanowi sekwencję przedstawioną na fig. 17b.
8. 8. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 7, znamienna tym, że rozpoczyna się od pozycji 21.

   182 961
9. 9. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 8, znamienna tym, że rozpoczyna się od pozycji 20.
10. 10. Sekwencja DNA, znamienna tym, że stanowi sekwencję przedstawioną na fig. 17a albo jej mutanty lub warianty kodujące (FR(y) lekkiego łańcucha przeciwciała monoklonalnego o następujących właściwościach:

    - reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny

    - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę

    - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę Oy,

    - blokuje rozwój nowotworu, oraz

    - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.
11. 11. Sekwencja DNA, znamienna tym, że stanowi sekwencję z fig. 17b albo jej mutanty lub warianty kodujące FR(y) i CDR(y) lekkiego łańcucha przeciwciała monoklonalnego o następujących właściwościach:

    - reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny ciy,

    - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę ety,

    - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę cę,

    - blokuje rozwój nowotworu, oraz

    - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.
12. 12. Sekwencja DNA według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera sekwencję początkową przedstawioną na fig. 17a.
13. 13. Sekwencja DNA według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera sekwencję początkową z fig. 17b.
14. 14. Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, zawierającego sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

    - reaguje tylko z łańcucha Oy ludzkiej integryny Oy, blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę ety,

    - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę ety,

    - blokuje rozwój nowotworu, oraz

    - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej, lub fragmenty F(ab') i F(ał/)₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne, znamienny tym, że immunizuje się mysz oczyszczoną integryną aVb3, wybiera się klony wiążące się z oczyszczonym receptorem aVb3 w teście ELISA i wytwarza się standardowymi technikami specyficzną linię komórek produkującą to przeciwciało.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako podłoże integrynowe stosuje się witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako integrynę stosuje się witronektynę.
17. 17. Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

    - reaguje tylko z łańcuchem cą, ludzkiej integryny

    - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę cą,

    182 961

    - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę

    - blokuje rozwój nowotworu, oraz

    - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej, do wytwarzania leku do leczenia nowotworu, korzystnie melanoma.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że jako podłoże integrynowe stosuje się witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę.
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że jako przeciwciało monoklonalne stosuje się fragmenty Ρ(ηΚ) i f, (ab')₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne, przy czym przeciwciało to zawiera sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

    - reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny

    - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę c^,

    - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę c^,

    - blokuje rozwój nowotworu, oraz

    - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.
20. 20. Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

    - reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny ος,

    - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę c^,

    - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynę a,,

    - blokuje rozwój nowotworu, oraz

    - nie wykazuje aktywności cytotoksycznej, do wytwarzania środka diagnostycznego do lokalizacji i oceny wzrostu nowotworu.
21. 21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że jako podłoże integrynowe stosuje się witronektynę, fibrynogen lub fibronektynę.
22. 22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że jako przeciwciało monoklonalne stosuje się fragmenty Ρ(ηό() i Ρ(ηό()₂ oraz pojedynczo łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała monoklonalnego posiadające takie same właściwości jak to przeciwciało monoklonalne, przy czym przeciwciało to zawiera sekwencję aminokwasową regionów zrębu (FR) i regionów determinujących dopasowanie (CDR) lekkiego łańcucha od pozycji 21 do 127 przedstawionych na fig. 17a i od pozycji 20 do 137 ciężkiego łańcucha przedstawionych na fig. 17b, albo ich mutanty lub warianty posiadające następujące właściwości:

    - reaguje tylko z łańcuchem ος, ludzkiej integryny (\,

    - blokuje wiązanie się podłoża integrynowego z komórką niosącą integrynę

    - uruchamia odwrócenie ustalonej interakcji matrycy komórek powodowanej przez integrynęciy,

    - blokuje rozwój nowotworu, oraz nie wykazuje aktywności cytotoksycznej.

    * * *

    182 961