CZ290801B6 - Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují - Google Patents

Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují Download PDF

Info

Publication number
CZ290801B6
CZ290801B6 CZ1997908A CZ90897A CZ290801B6 CZ 290801 B6 CZ290801 B6 CZ 290801B6 CZ 1997908 A CZ1997908 A CZ 1997908A CZ 90897 A CZ90897 A CZ 90897A CZ 290801 B6 CZ290801 B6 CZ 290801B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plant
protein
seq
dna molecule
proteins
Prior art date
Application number
CZ1997908A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ90897A3 (cs
Inventor
Gregory Wayne Warren
Michael Gene Koziel
Martha Alice Mullins
Gordon James Nye
Brian Carr
Nalini Manoj Desai
Kristy Kostichka
Nicholas Brendan Duck
Juan Jose Estruch
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26979445&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ290801(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ90897A3 publication Critical patent/CZ90897A3/cs
Publication of CZ290801B6 publication Critical patent/CZ290801B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Popisuj se kmeny rodu Bacillus, kter jsou schopn produkovat v pr b hu vegetativn ho r stu pesticidn proteiny a pomocn proteiny. D le se popisuj tyto purifikovan proteiny, molekuly DNA, kter je k duj a zp soby pou it t chto kmen , protein a gen pro kontrolu k dc .\

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobů a prostředků pro kontrolu škůdců rostlin na jiných materiálech než rostlinách. Konkrétně jsou popsány nové pesticidní proteiny, které lze izolovat z bakterií rodu Bacillus ve stádu vegetativního růstu. Popsány jsou kmeny rodu Bacillus, proteiny a geny, které tyto proteiny kódují. Způsoby a prostředky podle vynálezu lze použít v řadě systému pro kontrolu škůdců rostlin a škůdců na jiných materiálech než rostlinách.
Dosavadní stav techniky
Škůdci rostlin jsou hlavním faktorem způsobujícím ztráty světově komerčně významných zemědělských plodin. Používá se rozsáhlá řada chemických pesticidů pro kontrolu nebo hubení škůdců, kteří mají v zemědělství význam. Existuje však velký zájem na vyvinutí účinných alternativních pesticidů.
Jako alternativy k chemické kontrole škůdců hrají významnou roli mikrobiální pesticidy. Nejrozsáhleji používaný mikrobiální produkt je založen na bakterii Bacillus thuringiensis (Bt). Bacillus thuringiensis je gram-pozitivním druhem rodu Bacillus vytvářejícím spory, který produkuje během sporulace insekticidní krystalický protein (ICP).
Je známá řada variet Bacillus thuringiensis, které produkují více než 25 různých, avšak podobných insenticidních krystalických proteinů. Většina insekticidních krystalických proteinů produkovaných Bacillus thuringiesis je toxická pro larvy některých druhů hmyzu z řádu Lepidoptera (motýli), Diptera (dvoukřídlí) a Coleoptera (brouci). Obecně se v případě, že je insekcidní krystalický protein pozřen citlivým hmyzem, krystal solubilizuje a je přeměněn na toxický zbytek protézami ve střevě hmyzu. Žádný z insekticidních krystalických proteinů účinných proti larvám brouků, jako je mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata) nebo potemník moučný (Tenebrio molitor), nevykazoval podstatné účinky na členy rosu Diabrotica, zejména na Diabrotica virgifera virgifera nebo Diabrotica longicomis barberi.
Bacillus cereus (Bc) je blízce příbuzný Bacillus thuringiesis. Hlavním odlišným znakem mezi těmito druhy je nepřítomnost parasporálního krystalu u Bacillus cereus. Bacillus cereus je široce rozšířenou bakterií, která se běžně nachází v půdě a byla izolována z řady potravin a léčiv. Tento organismus se podílí na kažení potravin.
Ačkoliv je Bacillus thuringiesis velmi užitečný při kontrole hmyzích škůdců, existuje potřeba rozšířit počet potenciálních biologických kontrolních činidel.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje prostředky a způsoby pro kontrolu škůdců rostlin. Popisují se zejména nové pesticidní proteiny, které jsou produkovány během vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus. Tyto proteiny jsou vhodné jako pesticidní činidla.
Konkrétněji se vynález týká v podstatě purifikovaného kmene rodu Bacillus, který produkuje v průběhu vegetativního růstu pesticidu protein, přičemž uvedeným kmenem rodu Bacillus není Bacillus sphaericus SSII-1. Výhodné jsou kmeny Bacillus thuringiesis s přírůstkovými čísly NRRL B-21225 aNRRL B-21439.
- 1 CZ 290801 B6
Vynález se dále týká pro hmyz specifického proteinu, izolovaného z Bacillus spp., výhodně však z kmene Bacillus thuringsis nebo Bacillus cereus, během fáze vegetativního růstu, a jeho složek, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1. Pro hmyz specifický protein podle vynálezu je výhodně toxický pro hmyz z řádů Coleoptera (brouci) nebo Lepidoptera (motýli) a má molekulovou hmotnost přibližně 30 000 nebo větší, výhodně přibližně 60 000 až přibližně 100 000 a ještě výhodněji přibližně 80 000.
Pro hmyz specifický protein podle vynálezu vykazuje zejména spektrum insekticidní účinnosti které zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiparda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
Pro hmyz specifický protein podle vynálezu lze výhodně izolovat z kmene Bacillus spp vybraného ze skupiny zahrnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL B-21225 a NRRL B21439.
Výhodné jsou pro hmyz specifické proteiny, které mají sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 2 a SEQ ID č. 5, včetně všech proteinů, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Dalším výhodným provedením vynálezu je pro hmyz specifický protein podle vynálezu, ze kterého byly odstraněny nebo ve kterém byly inaktivovány sekvence představující sekreční signál.
Vynález se dále týká pesticidních proteinů z více jednotek (multimerních pesticidních proteinů), které obsahují více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický protein podle vynálezu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje _ pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
Multimemí pesticidní proteiny podle vynálezu mají výhodně molekulovou hmotnost přibližně 50 000 až přibližně 200 000.
Vynález se dále týká fúzních proteinů, které obsahují několik proteinových domén včetně alespoň jednoho pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, vytvořených genetickými fúzemi ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu a popřípadě dalších složek použitých při fúzi.
Jak je tento termín používán v této přihlášce, označuje podstatná sekvenční homologie blízkou strukturní podobnost mezi sekvencemi aminokyselin. Podstatně homologické proteiny mohou být například homologické ze 40 %, výhodně z 50 % a nej výhodněji homologické z 60 % nebo 80 % nebo více. Homologické jsou rovněž podobné sekvence, ve kterých chybí jedna nebo několik subsekvencí aminokyselin nebojsou do nich vloženy subsekvence dalších aminokyselin.
Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1. zejména se vynález týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, kde spektrum insekticidní účinnosti zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
- 2 CZ 290801 B6
Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 1 nebo SEQ ID č. 4, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Dalším provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, kterážto nukleotidová sekvence byla optimalizována pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.
Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 3, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující multimemí pesticidní protein, který obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický protein podle vynálezu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
Dalším provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující několik proteinových domén včetně alespoň jednoho pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, vytvořenou genetickou fůzemi ve stejném čtecím rámci, ze které se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu a popřípadě dalších složek použitých při fůzi.
Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu fúzovaný k signální sekvenci, výhodně sekreční signál sekvenci nebo sekvenci způsobující cílení (targeting sequence), která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky, kterážto signální sekvence je hetrologního původu vzhledem k DNA, ke které je fúzována.
Vynález dále zahrnuje molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein podle vynálezu, které byly optimalizované pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.
Vynález se dále týká optimalizovaných molekul DNA, z jejichž 5'-konce byly odstraněny sekvence kódující sekreční signál.
Jak je tento termín používán v této přihlášce, označuje podstatná sekvenční homologie blízkou strukturní podobnost mezi sekvencemi nukleotidů, podstatně homologické molekuly DNA mohou být například homologické ze 60 %, výhodně z 80 % a nejvýhodněji homologické z 90 % nebo 95 % nebo více. Homologické jsou rovněž podobné sekvence, ve kterých chybí jedna nebo několik subsekvencí nukleotidů nebo aminokyselin nebo jsou do nich vloženy subsekvence dalších nukleotidů nebo aminokyselin.
Vynález rovněž zahrnuje molekuly DNA, které hybridizují s molekulami DNA podle vynálezu, jak jsou definovány výše, výhodně však s oligonukleotidovou sondou, kterou lze získat z uvedených molekul DNA, která obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň lOnukleoidů, za mírně přísných podmínek, a kteréžto molekuly vykazují pro hmyz specifickou účinnost a rovněž jsou jimi kódovány pro hmyz specifické proteiny.
Výhodné jsou molekuly DNA, u kterých dochází k hybridizaci při teplotě 65 °C v pufru obsahujícím 7 % SDS (dodecylsulfátu sodného) a fosforečnan sodný v 0,5M koncentraci.
- 3 CZ 290801 B6
Zejména výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein podle vynálezu, které lze získat způsobem který zahrnuje:
(a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou popsanou níže, získanou z molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 3 nebo SEQ ID č. 4, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
Vynález se dále týká pro hmyz specifických proteinů, které jsou kódovány molekulami DNA podle vynálezu.
Vynález rovněž zahrnuje expresivní kazetu, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu operabilně spojenou expresivními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, výhodně mikroorganismus nebo rostlině, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.
Vynález se dále týká vektorové molekuly obsahující expresivní kazetu podle vynálezu.
Expresivní kazeta nebo/a vektorová molekula podle vynálezu výhodně tvoří součást genomu rostliny.
Dalším provedením vynálezu je hostitelský organismus, výhodně organismus vybraný ze skupiny zahrnující buňky rostlin a hmyzu, bakterie, kvasinky, baculoviry, prvoky, hlísty a řasy, který obsahuje molekulu DNA podle vynálezu, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.
Vynález se dále týká transgenické rostliny, výhodně však rostliny kukuřice, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu této rostliny.
Výhodná je transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která byla stabilně transformována molekulou DNA podle vynálezu, expresivní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresivní kazetu.
Výhodná je rovněž transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu.
Vynález se dále týká transgenické rostliny, výhodně rostliny kukuřice, podle vynálezu, jak je definována výše, která dále exprimuje druhou odlišnou látku kontrolující hmyz, výhodně však δendotoxin z Bacillus thuringsis. Uvedenou rostlinou je výhodně hybridní rostlina.
V rámci rozsahu vynálezu se rozumí, že mezi části transgenických rostlin patří například rostlinné buňky, protoplasty, tkáně, kalus, embrya jakož i květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí s transgenických rostlin nebo jejich potomstva, dříve transformovaných molekulou DNA podle vynálezu, a které jsou tudíž alespoň zčásti tvořeny transgenickými buňkami. Tyto části jsou rovněž předmětem vynálezu.
Vynález se dále týká rostlinného propagačního materiálu rostlin podle vynálezu, který je ošetřen obalem chránícím semena.
- 4 CZ 290801 B6
Vynález dále zahrnuje mikroorganismus transformovaný molekulou DNA podle vynálezu, expresivní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresivní kazetu, přičemž je tímto mikroorganismem výhodně mikroorganismus, který se množí ba rostlinách a výhodněji bakterie kolonizující kořeny.
Vynález se dále týká enkapsulovaného pro hmyz specifického proteinu. Toto provedení zahrnuje mikroorganismus obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu.
Vynález se rovněž týká insekticivního prostředku obsahujícího hostitelský organismus podle vynálezu, výhodně však purifikovaný kmen rodu Bacillus, v insekticidně účinném množství, spolu s vhodným nosičem.
Vynález dále zahrnuje insekticidní prostředek obsahující izolovanou molekulu proteinu podle vynálezu, samotnou nebo v kombinaci s hostitelským organismem podle vynálezu nebo/a enkapsulovaný pro hmyz specifický protein podle vynálezu, v insekticidně účinném množství, spolu vhodným nosičem.
Vynález se dále týká způsobu získání purifikovaného pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje nanesení roztoku obsahujícího uvedený pro hmyz specifický protein na NAD-kolonu a eluci navázaného proteinu.
Vynález zahrnuje rovněž způsob identifikace účinnosti pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu na hmyz, kterýžto způsob zahrnuje:
pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, získání supematantu z uvedené kultury, poskytnutí potravy s uvedeným supematantem larvám hmyzu, a vyhodnocení mortality.
Dalším provedením vynálezu je způsob izolace pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje:
pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, získání supematantu z uvedené kultury, a izolaci uvedeného pro hmyz specifického proteinu z uvedeného supematantu.
Vynález rovněž zahrnuje způsob izolace molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein vykazující insekticidní účinnost proteinů podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje:
získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, hybridizaci uvedené molekuly DNA s DNA získanou z druhu rodu Bacillus, a izolaci uvedené hybridizované DNA.
Vynález se dále týká způsobu zvýšení rozsahu cílového hmyzu použitím pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu v kombinaci s alespoň jedním dalším insekticidním proteinem, který se liší od tohoto pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, výhodně však s insekticidním proteinem vybraným ze skupiny zahrnující δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis, inhibitory proteáz, lektiny, α-amylázy a peroxidázy.
Vynález rovněž zahrnuje způsob ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, výhodně druhem rodu Spodoptera nebo/a Agrotis, a výhodněji hmyzím škůdcem vybraným ze skupiny zahrnující Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea, při kterém se aplikuje na rostlinu nebo na plochu, ne které tato rostlina roste, insekticidní prostředek nebo toxinový protein podle vynálezu.
- 5 CZ 290801 B6
Vynález se dále týká způsobu ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, výhodně však druhem rodu Spodoptera nebo/a Agrotis, a výhodněji hmyzím škůdcem frugiperda,
Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea, který spočívá v tom, že se v oblasti, kde se může vyskytnout uvedený hmyzí škůdce, pěstuje transgenická rostlina exprimující pro hmyz specifický protein podle vynálezu.
Vynález rovněž zahrnuje způsob vytvoření hostitelského organismu, který obsahuje molekulu DNA podle vynálezu stabilně integrovanou do svého genomu a výhodně exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá v tom, že se uvedený hostitelský organismus transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresivní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresivní kazetu.
Vynález se dále týká způsobu vytvoření transgenické rostliny nebo rostlinné buňky, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu stabilně integrovanou do rostlinného genomu a výhodně exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá vtom, že se uvedená rostlina respektive rostlinná spočívá v tom, že se uvedená rostlina respektive rostlinná buňka transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresivní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresivní kazetu.
Vynález se rovněž týká způsobu insekticidního prostředku, který spočívá v tom, že se smíchá izolovaný kmen rodu Bacillus nebo/a hostitelský organismus nebo/a izolovaná molekula proteinu nebo/a enkapsulovaný protein podle vynálezu v insekticidně účinném množství s vhodným nosičem.
Vynález rovněž zahrnuje způsob vytvoření transgenického potomstva transgenické rodičovské rostliny, které obsahuje, stabilně začleněnou do rostlinného genomu, molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá vtom, že se uvedená rodičovská rostlina transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresivní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresivní kazetu a pesticidní znak se přenese na potomstvo uvedené transgenické rodičovské rostliny za použití známých postupů množení rostlin.
Vynález rovněž zahrnuje oligonukleotidovou sondu schopnou specificky hybridizovat s nukleotidovou sekvencí kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, kterážto sonda obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň 10 nukleotidů, a použití uvedené oligonukleotidové sondy pro screening libovolného kmene rodu Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zdaje v nich přirozeně přítomen pro hmyz specifický protein nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje tento gen.
Jak je zde uváděno, v průběhu vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus jsou produkovány pesticidní proteiny, tzv. vegetativní insekticidní proteiny, dále označované VIP.
Vegetativní insekticidní proteiny podle vynálezu nejsou přítomné ve velkém množství po sporulaci ajsou zejména exprimovány během logaritmické fáze růstu před stacionární fází. Pro účely vynálezu je vegetativní růst definován jako období před nastoupením sporulace. Geny kódující takové vegetativní insekticidní proteiny lze izolovat, klonovat a transformovat do různých nosičů pro použití v programech pro kontrolu škůdců.
Pro účely vynálezu mezi škůdce patří hmyz, houby, bakterie, háďata, roztoči, klíšťata, patogenní prvoci, motolice parazitující za zvířatech a podobně, aniž by se však jednalo o vyčerpávající výčet. Mezi hmyzí škůdce patří hmyz vybraný o řádů Coleoptera (brouci), Diptera (dvoukřídlí), Hymenoptera (blanokřídlí), Lepioptera (motýli), Mallophaga (všenky), Homoptera (stejnokřídlí), Hemiptera, Orthroptera (rovnokřídlí), Thysanoptera (třásnokřídlí), Dermaptera (škvoři), Isoptera
- 6 CZ 290801 B6 (všekazi), Anoplura (vši), Siphonaptera, Trichoptera (chrostíci) atd., zejména Coleoptera (brouci) a Lepidoptera (motýli).
Tabulky 1 až 10 uvádějí seznam škůdců na hlavních plodinách a škůdců s lékařským a veterinárním významem. Tito škůdci patří do rozsahu vynálezu.
Tabulka 1
Lepidoptera (motýli a můry)
Kukuřice
Ostrinia nubilalis
Agrotis ipsilon
Helicoverpa zea
Spodoptera frugiperda
Diatraea grandiosella
Elasmopalpus lignosellus
Diatraea saccharalis
Čirok
Chilo partellus
Spodoptera frugiperda
Helicoverpa zea
Elasmopalpus lignosellus
Feltia subterranea
Pšenice
Pseudaltia unipunctata
Spodoptera frugiperda
Elasmopalpus lignosellus
Agrotis orthogonia
Elasmopalpus lignosellus
Slunečnice
Suleima helianthana
Homoeosoma elactellum
Bavlník
Heliothis virescens
Helicoverpa zea
Spodoptera exigua
Pectinophora gossypiella
Rýže
Diatraea saccharalis
Spodoptera frugiperda
Helicoverpa zea
Sója
Pseudoplusia includens
Anticarsia gemmatalis
Plathypena scabra
Ostrinia nubilalis
Agrotis ipsilon
- 7 CZ 290801 B6
Spodoptera exigua
Heliothis virescens
Helicoverpa zea
Ječmen
Ostrinia nubilalis
Agrotis ipsilon
Tabulka 2
Coleoptera (brouci)
Kukuřice
Diabrotica virgifera virgifera
Diabrotica longicomis barberi
Diabrotica undecimpunctata howardi
Melanotus spp.
Cyclocephala borealis
Cyclocephala immaculata
Popiliajaponica
Chaetocnema pulicaria
Sphenophorus maidis
Čirok
Phyllophaga crinita
Eleodes, Conoderus a Aeolus spp.
Oulema melanopus
Chaetocnema pulicaria
Sphenophorus maidis
Pšenice
Oulema melanopus
Hypera punctata
Diabrotica undecimpuctata howardi
Slunečnice
Zygograma exclamationis
Bothyrus gibbosus
Bavlník
Anthonomus grandis
Rýže
Calaspis brunnea
Lissorhoptrus oryzophilus
Sitophilus oryzae
Sója
Epilachna varivestis
- 8 CZ 290801 B6
Tabulka 3
Homoptera (molice, mšice apod.)
Kukuřice
Rhopalosiphum maidis
Anuraphis maidiradicis
Čirok
Rhopalosiphum maidis
Sipha flava
Pšenice
Diuraphis noxia
Schizaphis graminum
Macrosiphum avenae
Bavlník
Aphis sossypii
Pseudatomoscelis seriatus
Trialeurodes abutilonea
Rýže
Nephotettis nigropictus
Sója
Myzus persicae
Empoasca fabae
Ječmen
Schizaphis graminum
Řepka olejka
Brevicoryne brassicae
Tabulka 4
Hemiptera (ploštice)
Kukuřice
Blissus leucopterus leucopterus
Čirok
Blissus leucopterus leucopterus
Bavlník
Lygus lineolaris
Rýže
Blissus leucopterus leucopterus
Acrostemum hilare
Sója
Acrostemum hilare
- 9 CZ 290801 B6
Ječmen
Blissus leucopterus leucopterus
Acrostemum hilare
Euschistus servus
Tabulka 5
Orthoptera (kobylky, cvrčci a švábi)
Kukuřice
Melanoplus femurrunrum
Melanoplus sanguinipes
Pšenice
Melanoplus femurrubrum
Melanoplus differentialis
Melanoplus sanguinipes
Bavlník
Melanoplus femurrubrum
Melanoplus differentialis
Sója
Melanoplus femurrubrum
Melanoplus differentialis
Stavby a domácnosti
Periplaneta americana
Blattella germanica
Blatta orientalis
Tabulka 6
Diptera (mouchy a komáři)
Kukuřice
Hylemya platura
Agromyza parvicomis
Čirok
Contarinia sorghicola
Pšenice
Mayetiola destructor Sitodiplosis mosellana Meromyza americana Hylemya coarctata
Slunečnice
Neolasioptera murtfeldtiana
-10CZ 290801 B6
Sója
Hylemya platura
Ječmen
Hylemya platura
Mayetiola destructor
Hmyz napadající člověka a zvířata a přenašeči nemocí
Aedes aegypti
Aedes albopictus
Phlebotomus papatasii
Musea domestica
Tabanus atratus
Cochliomyia hominivorax
Tabulka 7
Thysanoptera (třásněnky)
Kukuřice
Anaphothrips obscurus
Pšenice
Frankliniella fusca
Bavlník
Thrips tabaci
Frankliniella fusca
Sója
Sericothrips variabilis
Thrips tabaci
Tabulka 8
Hymenoptera (pilatky, mravenci, vosy atd.)
Kukuřice
Solenopsis milesta
Pšenice
Cephus cinctus
Tabulka 9
Další řády a reprezentativní druhy
Dermatoptera (škvoři)
Forficula auricularia
Isoptera (termiti)
Reticulitermes flavipes
-11CZ 290801 B6
Mallophaga (všenky)
Cuclotogaster heterographa
Bavicola bovis
Anoplura (vši)
Pediculus humanus
Siphonaptera (blechy)
Ctenocephalides felis
Tabulka 10
Acari (roztoči a klíšťata)
Kukuřice
Tetranychus urticae
Čirok
Tetranychus cinnabarinus
Tetranychus urticae
Pšenice
Aceria tulipae
Bavlník
Tetranychus cinnabarinus
Tetranychus urticae
Sója
Tetranychus turkestani
Tetranychus urticae
Ječmen
Petrobia latens
Důležití roztoči škodící člověku a zvířatům
Demacentor variabilis
Argas persicus
Dermatophagoides farinae Dermatophagoides pteronyssinus
Nyní, když bylo zjištěno, že lze izolovat pesticidní proteiny z druhů rodu Bacillus ve fázi vegetativního růstu, lze použití standardních postupů izolovat jiné kmeny a testovat jejich účinnost proti konkrétním škůdcům rostlin a škůdcům na jiných materiálech než rostlinách. Obecně lze kmeny rosu Bacillus izolovat ze vzorku libovolného materiálu, ve kterém žijí, včetně půdy, rostlin, hmyzu, prachu ze zrnového dopravníku, a vzorků jiných materiálů, za použití způsobů známých v oboru, viz například Travers a kol. (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53: 1 263-1 266; Saleh a kol. (1969) Can J. Microbiol. 15: 1 101-1 104; DeLucca a kol. (1981) Can J. Microbiol. 27:865-870; a Norris a kol. (1981) „The genera Bacillus and Sporolactobacillus“ v Starr a kol. (editoři), The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, svazek II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Po izolaci je možné u kmenů testovat pesticidní účinnost v průběhu vegetativního růstu. Tímto způsobem lze identifikovat nové pesticidní proteiny a kmeny.
-12CZ 290801 B6
Mezi mikroorganismy rodu Bacillus, které nacházejí uplatnění ve vynálezu, patří Bacillus cereus a Bacillus thuringiensis, jakož i druhy rodu Bacillus uvedené v tabulce 11.
Tabulka 11
Seznam druhů rodu Bacillus
Morfologiská skupina 1
B. megaterium
B. cereus*
B. cereus var. mycoides
B. thuringiensis*
B. licheniformis
B. subtilis*
B. pumilus
B. firmus
B. coagulans
Morfologická skupina 2
B. polymyxa
B. macerans
B. circulans
B. stearothermophilus
B. alvei
B. laterosporus
B. brevis
B. pulvifaciens
B. popilliae
B. lentimorbus
B. larvae
Morfologická skupina 3
B. sphaericus
B. pasteurii
Nezařazené kmeny
Podskupina A
B. apiarus
B. filicolonicus
B. thiaminolyticus
B. alcalophilus
Podskupina B
B. cirroflagellosus
B. chitinosporus
B. lentus
Podskupina C
B. badius
B. aneurinolyticus
B. macroides
B.Freundenreichii
-13CZ 290801 B6
Podskupina D
B. pentothenticus
B. epiphytus
Podskupina El
B. aminovorans
B. globisporus
B. insolitus
B. psychrophilus
Podskupina E2
B. psychrosaccharolyticus
B. macquariensis
Legenda k tabulce 11:
o těchto kmenech rodu Bacillus bylo dříve zjištěno, že souvisí s hmyzem.
Rozdělení do skupin je provedeno podle práce Parry, J. M. a kol. (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, Londýn.
Podle vynálezu lze z druhů rodu Bacillus izolovat pesticidní proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu. Podle jednoho provedení lze izolovat insekticidní proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu. Způsoby izolace proteinů jsou v oboru známé. Obecně lze proteiny purifikovat pomocí běžných chromatografických postupů, včetně gelové filtrace, iontové výměny a imunoafinitní chromatografie, pomocí vysoceůčinné kapalinové chromatografie, jako je vysoceůčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi, vysoceúčinná kapalinová chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací vysoceůčinná kapalinová chromatografie, vysoceúčinná chromatofokusing a hydrofobní interakční chromatografie atd., pomocí elektroforetického rozdělení, jako je jednorozměrná gelová elektroforéza, dvourozměrná gelová elektroforéza atd. Tyto způsoby jsou známé v oboru, viz například Current Protocols in Molecular Biology, svazky 1 a 2, Ansubel a kol. (editoři), John Wiley and Sons, New York (1988). Dále lze připravit protilátky proti v podstatě čistým připraveným proteinům, viz například Radka a kol. (1983) J. Immunol. 128: 2 804, a Radka a kol. (1984) Immunogenetics 19: 63. Pro purifikací proteinu vykazujícího pesticidní vlastnosti lze použít libovolnou kombinaci způsobu. Při vytváření postupu se po každém purifikačním stupni stanovuje pesticidní účinnost.
Těmito purifikačními stupni se získá v podstatě purifikovaná proteinová frakce. Termín „v podstatě purifikovaný“ nebo „v podstatě čistý“ označuje protein, který v podstatě neobsahuje žádnou sloučeninu normálně doprovázející protein v jeho přírodním stavu, skutečnost, že je připravený protein „v podstatě čistý“ lze stanovit z nepřítomnosti jiných detekovatelných proteinových pásů po elektroforéze v SDS-polyakrylamidovím gelu, což se určí vizuálně nebo denzitometricky. Alternativně může být stupeň čistoty indikován nepřítomností jiných aminokoncových sekvencí nebo N-koncových zbytků v purifikované látce. Čistotu lze ověřit novou chromotagrafií „čistých“ proteinů, kterou se zjistí nepřítomnost jiných píků při iontoměničové elektroforéze, elektroforéze s obrácenými fázemi nebo kapilární elektroforéze. Termín „v podstatě čistý“ nebo „v podstatě purifikovaný“ nejsou míněny tak, že by vylučovaly umělé nebo syntetické směsi proteinů s jinými sloučeninami, tyto termíny rovněž nejsou míněny tak, že by vylučovaly přítomnost malého množství nečistot, které nejsou na překážku biologické účinnosti proteinu, a které mohou být přítomny například v důsledku neúplné purifikace.
Jakmile je izolován purifikovaný protein, je možné tento protein, nebo polypeptidy, které jej tvoří, charakterizovat a sekvenovat pomocí standardních způsobů známých v oboru. Purifikovaný protein, nebo polypeptidy, které jej tvoří, lze například fragmentovat pomocí bromkyanu, nebo
-14CZ 290801 B6 proteázami jako je papain, chymotrypsin, trypsin, lysyl-C-endopeptidáza atd. (Oike a kol. (1982) J. Biol. Chem. 257.9 751-9 758, Liu a kol. (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215). Výsledné peptidy se oddělí, výhodně pomocí vysoceúčinné kapalinové chromotografie (HPLC), nebo roztavením gelů a elektroblotováním na poly(vinylidenfluoridové) membrány (PVDFmembrány), a podrobí se sekvenování aminokyselin, při kterém se peptidy výhodně analyzují pomocí automatických sekvenátorů. Lze stanovit N-koncové, C-koncové nebo vnitřní aminokyselinové sekvence. Z aminokyselinové sekvence purifikovaného proteinu ze syntetizovat nukleotidovou sekvenci, kterou lze použít jako sondu při izolaci genu kódujícího pesticidní protein.
Pesticidní proteiny mohou být oligomerní a lišit se v molekulové hmotnosti, počtu protomerů, peptidech které je tvoří, účinnosti proti konkrétním škůdcům a dalších vlastnostech. Pomocí zde popsaných způsobů lze však izolovat a charakterizovat proteiny účinné proti řadě škůdců.
Jakmile je purifikovaný protein izolován a charakterizován, je možno jej měnit různými způsoby, včetně substitucí, delecí, zkracování a inzercí aminokyselin. Způsoby takových manipulací jsou obecně známé v oboru. Například lze připravit obměny pesticidních proteinů v aminokyselinové sekvenci pomocí mutací DNA. Takové obměny (varianty) vykazují požadovanou pesticidní účinnost. Mutace prováděné v DNA kódující variantu samozřejmě nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a výhodně nevytvářejí komplementární oblasti, které by mohly produkovat sekundární strukturu mRNA, viz evropská patentová přihláška zveřejněná pod číslem 75 444.
Vynález tedy zahrnuje pesticidní proteiny, jakož i jejich složky a fragmenty. Mohou být tedy vytvořeny složkové protomery, polypeptidy nebo fragmenty proteinů, které si zachovávají pesticidní účinnost, mezi tyto fragmenty patří zkrácené sekvence, jakož i N-koncové, Ckoncové, vnitřní a vnitřní deletované aminokyselinové sekvence proteinů.
Očekává se, že většina delecí, inzercí a substitucí sekvence proteinů nezpůsobuje zásadní změny v charakteristice pesticidního proteinu. Pokud je však složité předvídat přesný vliv substituce, delece nebo inzerce před jejím provedením, je odborníkovi známé, že se vliv vyhodnotí pomocí běžných vyhledávacích testů.
Proteiny nebo jiné složkové polypeptidy, jak jsou zde popsány, lze použít samotné nebo v kombinaci. To znamená, že je možné použít několik proteinů pro kontrolu různých hmyzích škůdců.
Některé proteiny jsou tvořeny jediným polypeptidovým řetězcem, zatímco mnohé proteiny jsou tvořeny více než jedním polypeptidovým řetězcem, jsou tedy oligomerní. Kromě toho jsou některé vegetativní insekticidní proteiny (VIP) pesticidně účinné jako oligomery. V těchto případech se používají další protomery pro zvýšení pesticidní účinnosti nebo aktivaci pesticidních proteinů. Ty protomery, které se používají pro zvýšení nebo aktivaci, jsou označovány jako pomocné proteiny. Pomocné proteiny aktivují nebo zvyšují účinnost pesticidního proteinu pomocí interakce s pesticidním proteinem za vzniku oligomemího proteinu se zvýšenou pesticidní účinností ve srovnání s účinností pozorovanou za nepřítomnosti pomocného proteinu.
V rámci rozsahu vynálezu lze mezi pesticidními proteiny podle vynálezu překvapivě identifikovat novou skupinu proteinů specifických pro hmyz, tyto proteiny, které jsou označovány v tomto textu jako VIP3, lze získat z kmenů Bacillus spp, avšak výhodně z kmenů Bacillus thuringiensis a nejvýhodněji z kmenů Bacillus thuringiensis AB88 a AB424. Tyto uvedené vegetativní insekticidní proteiny jsou přítomné hlavně v supematantech kultur rodu Bacillus, přičemž tvoří alespoň 75% z celkového množství v případě kmene AB88. Proteiny VIP3 se dále vyznačují svým ojedinělým spektrem insekticidní účinnosti, které zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, avšak zejména proti Agrotis ipsilon nebo/a
-15CZ 290801 B6
Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
Agrotis ipsilon je agronomicky významným druhem hmyzu, který je značně resistentní vůči δendotoxinům. Macintosh a kol. (1990), J. Inverterbr. Pahtol. 56, 258-266, uvádějí, že δendotoxiny CrylA(b) a CrylA(c) vykazují insekticidní vlastnosti vůči Agrotis ipsilon s hodnotami LC50 více než 80 pg respektive 18 pg/ml potravy. Pomocí insekticidních proteinů vip3A podle vynálezu se dosáhne více než 50% mortality při přidání proteinu v množství, které je alespoň desetkrát, výhodně padesátkrát až třistapadesátkrát a nej výhodněji dvěstěkrát až třistakrát nižší než množství proteinů CrylA nutné pro dosažení právě 50% mortality. Zejména výhodné v rámci vynálezu jsou insekticidní proteiny vip3A, kterými se dosáhne 100% mortality při přidání proteinu v množství alespoň dvěstěšedesátkrát nižším než je množství proteinů CrylA nutné pro dosažení právě 50% mortality.
Insekticidní proteiny vip3A podle vynálezu jsou přítomné hlavně v supematantech kultur a je tudíž potřeba klasifikovat je jako sekretové proteiny. Výhodně obsahují vN-koncové sekvenci řadu kladně nabitých zbytků následovaných hydrofobní základní oblastí a nejsou v průběhu exportu upravovány na N-konci.
Stejně jako jiné pesticidní proteiny spadající do rozsahu vynálezu lze proteiny VIP3 detekovat v růstových stadiích před sporulací, což představuje další jasnou odlišnost od jiných proteinů, které patří do skupiny δ-endotoxinů. Výhodně začíná exprese proteinu specifického pro hmyz v průběhu střední logaritmické fáze (mid-log fáze) a pokračuje během sporulace. V důsledku specifického typu exprese v kombinaci s vysokou stabilitou proteinů VIP3 lze v supematantech sporulujících kultur nalézt velká množství proteinů VIP3. Zejména výhodné jsou proteiny VIP3 uvedené v sekvencích SEQ ID č. 2 a SEQ ID č. 5 a odpovídající molekuly DNA, které obsahují nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny, avšak zejména ty molekuly DNA, které obsahují nukleotidové sekvence uvedené v sekvencích SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 3 a SEQ ID č. 4.
Pesticidní proteiny podle vynálezu lze použít v kombinaci s endotoxiny Bacillus thuringiensis nebo jinými insekticidními proteiny pro zvýšení rozsahu cílového hmyzu. Dále má použití vegetativních insekticidních proteinů podle vynálezu v kombinaci s δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis nebo jinými insekticidními látkami odlišné povahy výrazný význam pro prevenci nebo/a řízení rezistence hmyzu, mezi jiné insekticidní látky patří inhibitory proteáz (jak serinového tak cysteinového typu, lektiny, α-amylázy a peroxidázy. Podle jednoho výhodného provedení je exprese vegetativních insekticidních proteinů v transgenické rostlině doprovázena expresí jednoho nebo několika δ-endotoxinů z Bacillus thuringiensis. Této společné exprese (koeprese) více než jedné insekticidní látky v jediné transgenické rostlině lze dosáhnout modifikací rostliny pomocí genetického inženýrství tak, že obsahuje a exprimuje všechny nutné geny. Alternativně lze rodičovskou rostlinu 1 geneticky modifikovat tak, že exprimuje vegetativní insekticidní proteiny a druhou rostlinu, rodičovskou rostlinu 2 geneticky modifikovat tak, že exprimuje δ-endotoxin z Bacillus thuringiesis. Křížením rodičovské rostliny 1 s rodičovskou rostlinou 2 se získají dceřinné rostliny (potomstvo), které exprimují všechny geny introdukované do rodičovských rostlin 1 a 2. Zejména výhodnými δ-endotoxiny z Bacillus thuringiesis jsou látky popsané v EP-A 0 618 976.
Podstatná část cytotoxických proteinů, ačkoliv ne všechny, působí binárně. Binární toxiny jsou typicky tvořeny dvěma proteinovými doménami, z nichž se jedna označuje jako doména A a druhá doména B (viz Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, J. E. Alouf aj. H. Freer, editoři, (1991) Academie Press). Doména A vykazuje silnou cytotoxickou účinnost. Doména B se váže na receptor na vnějším povrchu buňky před přenesením dovnitř buňky (intemalizací). typicky musí být cytotoxická doména A převáděna do cytoplazmy pomocí translokační domény. Často jsou doména A a doména B oddělenými polypeptidy nebo protomery, které jsou spojeny interakcí protein-protein nebo disulfidickou vazbou. Toxinem však může být i jediný polypeptid,
-16CZ 290801 B6 který je v buňce proteolyticky upraven na dvě domény, jako je tomu v případě exotoxinu A z pseudomonas. Lze shrnout, že binární toxiny mají typicky tři významné domény, cytotoxickou doménu A, doménu B vázající se na receptor a translokační doménu. Doména A a doména B jsou
Často spojeny doménami tvořícími interakce protein-protein.
Domény vázající se na receptor podle vynálezu jsou vhodné pro transport libovolného proteinu, toxinu, enzymu, transkripčního faktoru, nukleové kyseliny, chemikálie nebo libovolného jiného faktoru do cílového hmyzu, který má receptor rozpoznávaný doménou vázající se na receptor z binárních toxinů zde popsaných. Jelikož mají binární toxiny translokační domény, které penetrují fosfolipidové dvouvrstvené membrány a převádějí cytotoxiny přes tyto membrány, mohou být tyto translokační domény podobně vhodné při převádění libovolného proteinu, toxinu, enzymu, transkripčního faktoru, nukleové kyseliny, chemikálie nebo libovolného jiného faktoru přes fosfolipidovou dvouvrstvu jako je plazmatická membrána nebo vesikulámí membrána. Samotná translokační doména může perforovat membrány a tím vykazovat toxické nebo insekticidní vlastnosti. Všechny binární toxiny mají dále cytotoxické domény. Taková cytotoxická doména může být použitelná jako letální protein, buďto samotná nebo opři dodání do libovolné cílové buňky nebo cílových buněk libovolným způsobem.
Konečně jelikož binární toxiny složené ze dvou polypeptidů často tvoří komplex, je pravděpodobné, že jsou ve složkách binárních toxinů podle vynálezu oblasti tvořící interakce protein-protein. Tyto domény tvořící interakce protein-protein mohou být vhodné pro vytváření spojení mezi libovolnými kombinacemi toxinů, enzymů, transkripčních faktorů, nukleových kyselin, protilátek, zbytků vázajících se na buňky nebo libovolných jiných chemikálií, faktorů, proteinů nebo proteinových domén.
Toxiny, enzymy, transkripční faktory, protilátky, zbytky vázající se na buňku nebo jiné proteinové domény lze fúzovat k pesticidním nebo pomocným proteinům za vzniku genetických fúzí ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein který kombinuje vlastnosti vegetativního insekticidního proteinu a dalších složek použitých při fúzi. Dále pokud vykazuje proteinová doména fúzovaná k vegetativnímu insekticidnímu proteinu afinitu k dalším proteinu, nukleové kyselině, glycidu, lipidu nebo jiné chemikálii nebo faktoru, lze vytvořit třísložkový komplex. Tento komplex bude mít vlastnosti všech jeho složek. Podobnou úvahu lze použít pro přípravu čtyř nebo vícesložkových komplexů. Tyto komplexy jsou vhodné insekticidní toxiny, léčiva, laboratorní činidla a diagnostická činidla atd. Takovéto komplexy se v současné době používají například jako fúzní toxiny pro potenciální terapie rakoviny, jako činidla v ELISA-testech a immunoblotačních analýzách.
Jednou ze strategií obměňování pesticidních nebo pomocných proteinů je fúzování „S-zbytku“ („S-tag“) o délce 15 aminokyselin k proteinu bez zničení domény nebo domén vázajících se na buňku hmyzu, translokačních domén nebo domén vytvářejících interakce protein-protein přítomných v tomto proteinu. S-zbytek vykazuje vysokou afinitu (Kd=10_9M) k ribonukleázovém S-proteinu, ze kterého se, je-li navázán na S-zbytek, vytváří aktivní ribonukleáza. (viz F. B. Richards a H. W. Wxckoff (1971) v „The Enzymes“, svazek IV (Boyer, P. D., editor), str. 647-806, Academie Press, New York). Fúzi lze provést takovým způsobem, že se zničí nebo odstraní cytotoxická účinnost pesticidního nebo pomocného proteinu, čímž se nahradí cytotoxická účinnost vegetativního insekticidního proteinu novou cytotoxickou ribonukleázovou účinností. Výsledný toxin bude tvořen S-proteinem, pesticidním proteinem a pomocným proteinem, kde je buď pesticidní protein nebo pomocný protein produkován jako translační fúze s S-zbytkem. Podobných strategií lze použít pro fúzování jiných potenciálních cytotoxinů k pesticidním nebo pomocným proteinům, včetně, aniž by se však jednalo o omezující výčet, proteinů inaktivujících ribozomy, hormonů hmyzu, receptorů hormonů, transkripčních faktorů, proteáz, fosfatáz, exotoxinu A z Pseudomonas, nebo libovolných jiných proteinů nebo chemických faktorů, které jsou letální při dodání do buněk. Podobně lze do buněk dodávat proteiny, které nejsou letální, mohou však měnit buněčnou biochemii nebo fyziologii.
-17CZ 290801 B6
Spektrum toxicity pro různé druhy lze měnit tak, že se k pesticidním nebo pomocným proteinům fúzují domény, které rozpoznávají receptory na povrchu buněk jiných druhů. Mezi takovéto domény mohou patřit, aniž by se však jednalo o vyčerpávající výčet, protilátky, transferrin, hormony nebo peptidové sekvence izolované z fágem vytvářených afinitně selektovatelných knihoven (phage displayed affinity selectable libraries). Pro změnu spektra toxicity lze použít rovněž peptidové sekvence, které jsou navázány na živiny, vitaminy, hormony nebo jiné chemikálie, které jsou transportovány do buněk.
Pesticidní proteiny podle vynálezu jsou proteiny, které poskytují specifickou pesticidní vlastnost. Takovéto polypeptidy se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž jejich složkové polypeptidy mají molekulovou hmotnost nejméně 30 000 nebo větší, výhodně přibližně 50 000 nebo větší.
Je možné, že pesticidní protein je složkou multimemího pesticidního proteinu. Takovéto pesticidní proteiny se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž mají molekulovou hmotnost nejméně 50 000 až do nejméně 200 000, výhodně přibližně 100 000 až 150 000.
Pro účely vynálezu termín „vegetativní insekticidní protein“ (VIP) zahrnuje proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu, které lze použít buďto samotné nebo v kombinaci k dosažení pesticidní účinnosti, zahrnuje tedy pesticidní proteiny, pomocné proteiny a proteiny, které vykazují účinnost pouze za přítomnosti pomocného proteinu nebo polypeptidové složky těchto proteinů.
Je třeba vzít v úvahu, že pro získání nukleotidových a aminokyselinových sekvencí proteinů podle vynálezu jsou k dispozici i alternativní způsoby. Pro získání nukleotidové sekvence kódující pesticidní protein lze například izolovat zgenomové knihovny kosmidové klony, které exprimují pesticidní protein. Z větších účinných kosmidových klonů lze připravit menší subklony a testovat jejich účinnost. Tímto způsobem lze sekvenovat pro stanovení nukleotidové sekvence genu klony, které exprimují účinný pesticidní protein. Poté lze odvodit aminokyselinovou sekvenci proteinu. Obecné metody molekulární biologie jsou uvedené například v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, svazky 1-3, Sambrook a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) a v publikacích citovaných v této práci.
Vynález rovněž zahrnuje nukleotidové sekvence z organismů jiných než jsou druhy rodu Bacillus, kteréžto nukleotidové sekvence jsou izolovatelné hybridizací s nukleotidovými sekvencemi z kmenů Bacillus podle vynálezu. U proteinů kódovaných takovými nukleotidovými sekvencemi lze testovat jejich pesticidní účinnost. Vynález rovněž zahrnuje proteiny kódované těmito nukleotidovými sekvencemi. Vynález dále zahrnuje proteiny získané z organismů jiných než jsou protilátkami vytvořenými proti proteinům podle vynálezu. U izolovaných proteinů lze opět testovat jejich pesticidní účinnost pomocí zde popsaných způsobů nebo jiných způsobů známých v oboru.
Jakmile se izolují nukleotidové sekvence kódující pesticidní proteiny podle vynálezu, lze s nimi manipulovat a použít je pro expresi proteinu v řadě hostitelů, včetně jiných organismů, včetně mikroorganismů a rostlin.
Pesticidní geny podle vynálezu lze optimalizovat pro zvýšenou expresi v rostlinách, viz například EP-A 0 618 976, EP-A 0 359 472, EP-A 0 385 962, WO 91/16 432, Perlak a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3 324-3 328, a Murray a kol. (1989) Nukleic Adids Research 17: 477498. Tímto způsobem lze syntetizovat geny používající kodónů preferovaných rostlinami. Preferovaným kodómem pro konkrétního hostitele je jediný kodón, který nejčastěji kóduje v tomto hostiteli danou aminokyselinu. Například kodón preferovaný kukuřicí pro konkrétní aminokyselinu lze odvodit ze známých genových sekvencí kukuřice. Použití kodónů kukuřicí pro 28 genů z rostlin kukuřice se nachází v práci Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research
-18CZ 290801 B6
17: 477-498. Lze rovněž vytvořit syntetické geny na základě distribuce kodónů, kterou konkrétní hostitel používá pro konkrétní aminokyselinu.
Tímto způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolné rostlině. Je třeba vzít v úvahu, že je možné, aby byla optimalizovaná nebo syntetická celá genoví sekvence nebo libovolná její část. To znamená, že je možné použít rovněž syntetické nebo částečně optimalizované sekvence.
Podobným způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolném io mikroorganismu. Preferované použití kodónů pro rod Bacillus je uvedeno například v patentu
Spojených Států Amerických č. 5 024 837 a v práci Johansen a kol. (1988) Gene 65: 293-304.
Metody konstrukce expresivních kazet pro rostliny, jakož i zavedení v cizí DNA do rostlin jsou popsány v oboru. Takovéto expresivní kazety mohou obsahovat promotory, terminátory, 15 zesilovače, vedoucí sekvence, introny a jiné regulační sekvence operabilně spojené škodující sekvencí pesticidního proteinu. Dále je třeba vzít v úvahu, že je možné použít v expresivních kazetách promotory nebo terminátory genů VIP.
Obecně se pro introdukci cizí DNA do rostlin používají vektory na bázi Ti-plazmidu, jakož i 20 přímý DNA, lipozómy, elektroporace, mikroinjekce a vstřelování mikročástic. Takové způsoby jsou popsány v oboru, viz například Guerche a kol., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause a kol., (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30-36; Klein a kol (1987) Nátuře 327: 70-73; Howell a kol.. (1980) Science 208: 1 265: Horsch a kol.. (1985) Science 227: 1 229-1 231; DeBlock a kol., (1989) Plant Physiologv 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach a 25 Weissbach, editoři) Academie Press, lne. (1988); a Methods in Plant Molecular Biology (Schuler a Zielinsku, editoři) Academie Press, lne. (1989), viz rovněž patentová přihláška Spojených Států Amerických č. 08/008 374, a rovněž EP-A 0 193 259 a EP-A0 451 878. Je samozřejmé, že způsob transformace závisí na rostlinné buňce, která má být transformována.
Dále je možné složky expresivní kazety modifikovat pro zvýšení exprese. Lze například použít zkrácené sekvence, provést substituce nukleotidů nebo jiné modifikace, viz například Perlak a kol. (1991) Proč, nati. Acad. Sci. USA 88: 3 324-3 328; Murray a kol. (1989) Nukleic Acids Research 17: 477-498; a WO 91/16 432.
Konstrukt může rovněž obsahovat libovolné jiné nutné regulátory, jako jsou terminátory (Guerineau akol., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671-674;
Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev., 5: 141-149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1 261— 1 272; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151-158; Ballas a kol., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7 891-7 903; Joshi a kol., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9 627-9 639); rostlinné konvenční 40 sekvence pro transllaci (Joshi, C.P., (1987), Nucleic Acids Research, 15: 6 643-6 653), introny (Luehrsen a Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet., 225: 81-93) a podobně, operabilně spojené s nukleotidovou sekvencí. Může být výhodné zařadit do konstruktu expresivní kazety 5'-vedoucí sekvenci. Takové vedoucí sekvence mohou působit tak, že zvyšují translaci. Translační vedoucí sekvence jsou v obru známé a patří mezi ně:
vedoucí sekvence picomavirů, například vedoucí sekvence EMCV (5'-nekódující oblast encefalomyocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., a Moss, B. (1989) PNAS USA 86: 6126— 6130);
vedoucí sekvence potyvirů, například vedoucí sekvence TEV (viru skvrnitosti tabáku Tabacco Etch Virus) (Allison a kol., (1986); vedoucí sekvence MDMV (viru zakrslé mozaiky kukuřice), 50 Virology, 154: 9-20); a protein vázající těžký řetězec lidského immunoglobinu (Bip) (Macejak, D. G., a Samow, P., (1991), Nátuře 353: 90-94:
nepřekládaná vedoucí sekvence z mRNA obalového proteinu viru mozaiky (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., a Gehrke, L., (1987), Nátuře, 325: 622-625;
-19CZ 290801 B6 vedoucí sekvence viru mozaiky tabáku (TMV), (Gallie, D. R. a kol., (1989), Molecular Biology ofRNA, str. 237-256;
vedoucí sekvence viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) (Lommel, S. A. a kol., (1991),
Virology, 81: 382-385, viz rovněž Della-Cioppa a kol., (1987), Plant Physiology, 84: 965-968.
V expresivní kazetě lze použít rostlinný terminátor, viz například Rosenberg a kol., (1987), Gene, 56: 125; Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671-674; Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev., 5: 141-149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1 261-1 272; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151-158; Ballas a kol., (1989), Nuckleic Acids Res„ 17: 7 891-7 903; Joshi a kol., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9 627-9 639.
Pro tkáňové specifickou expresi lze nukleotidové sekvence podle vynálezu operabilně spojit s tkáňově specifickými promotory, viz například EP-A 0 618 976.
Do rozsahu vynálezu dále spadají transgenické rostliny, zejména transgenické fertilní rostliny transformované pomocí výše popsaných postupů a jejich asexuální nebo/a sexuální potomstvo, které obsahují a výhodně rovněž exprimují pesticidní protein podle vynálezu. Zejména výhodné jsou hybridní rostliny.
Transgenickými rostlinami podle vynálezu mohou být dvouděložné nebo jednoděložné rostliny. Výhodné jsou jednoděložné rostliny z čeledi Graminaceae, včetně rostlin rodů Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.
Zejména výhodná je transgenická kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, žito, oves, drnové trávy a rýže.
Z dvouděložných rostlin je zejména výhodná sója, bavlník, tabák, cukrová řepa, řepka olejka a slunečnice.
Rozumí se, že termín „potomstvo“ zahrnuje jak „asexuálně“ vytvořené potomstvo transgenických rostlin. Rozumí se, že tato definice rovněž zahrnuje všechny mutanty a varianty získatelné pomocí známých způsobů, jako je například buněčná fúze nebo selekce mutantů, které stále vykazují charakteristické vlastnosti původně transformované rodičovské rostliny, spolu se všemi produkty křížení a fúzí transformovaného rostlinného materiálu.
Další předmět vynálezu se týká proliferačního materiálu transgenických rostlin.
Proliferační materiál transgenických rostlin je podle vynálezu jako jakýkoli rostlinný materiál, který lze množit sexuálně nebo asexuálně in vivo nebo in vitro. Zejména výhodné jsou v rámci rozsahu vynálezu protoplasty, buňky, kalus, tkáně, orgány, semena, embrya, pyl, vaječné buňky, zygoty, spolu s libovolným jiným propagačním materiálem získaným z transgenických rostlin.
Předmětem vynálezu jsou rovněž části rostlin, jako jsou například květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, dříve transformovaných pomocí způsobů podle vynálezu, a které jsou tudíž alespoň zčásti tvořeny transgenickými buňkami.
Předtím než se rostlinný propagační materiál (plody, hlízy, zrna, semena), ale zejména semena, prodává jako komerční produkt, opatřuje se obvykle ochranným obalem, který obsahuje herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika těchto přípravků, pokud je to žádoucí spolu s dalšími nosiči, povrchově aktivními látkami nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými v oboru, pro poskytnutí ochrany proti poškození způsobenému bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci.
-20CZ 290801 B6
Pro ochranu semen je možné ochranný obal aplikovat na semena buďto impregnací hlíz nebo zrn kapalnou formulací nebo jejich obalením smíchanou vlhkou nebo suchou formulací. Kromě toho jsou ve speciálních případech možné jiné způsoby aplikace na rostliny, například se může provádět ošetření směrované na květy nebo plody.
Semeno rostliny podle vynálezu, které obsahuje molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pesticidní protein podle vynálezu, lze ošetřit obalem chránícím semena obsahujícím sloučeninu na ošetření rostlin, jako je například captan, carboxin, thiram (TMTD), mathalaxyl (Apron) a pirimofis-methyl (Actellic) a jiné sloučeniny, které se běžně používají na ošetření semen. V rámci rozsahu vynálezu jsou vhodné obaly chránící semena obsahující insekticidní prostředek podle vynálezu, a to buď samotný nebo v kombinaci s jedním z obalů chránících semena běžně používaných k ošetření semen.
Dalším předmětem vynálezu je tedy rostlinný propagační materiál kultivovaných rostlin, avšak zejména semeno rostlin, ošetřené obalem chránícím semena, jak je definován vý še.
Geny kódující pesticidní proteiny lze použít pro transformaci organismů patogenních pro hmyz. Mezi takové organismy patří Baculoviry, houby, prvoci, bakterie a háďátka.
Kmeny Bacillus podle vynálezu lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Alternativně lze gen kódující pesticid introdukovat pomocí vhodného vektoru do mikrobiálního hostitele, a tohoto hostitele aplikovat na prostředí, rostliny nebo zvířata. Je možné vybrat jako hostitele mikroorganismy, o kterých je známo, že obsahují „fotosféru (fyloplán, fylosféru, rhizosféru nebo/a rhizoplán) jedné nebo několika plodin, které jsou předmětem zájmu. Tyto mikroorganismy se vybírají tak, aby byly schopné úspěšné soutěžit v konkrétním prostředí s mikroorganismy divokého typu, aby v nich byl stabilně udržován a exprimován gen exprimující polypeptidový pesticid, a s výhodou aby zajišťovaly zlepšenou ochranu pesticidu před degradací a inaktivací způsobenou prostředím.
Mezi takového mikroorganismy patří bakterie, řasy a houby. Zejména zajímavými mikroorganismy jsou bakterie, například Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacterm Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, houby, zejména kvasinky, například Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium. Zvláště zajímavé jsou takové fytosférní druhy bakterií, jako je Pseudomonas syringe, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli a Azotobacter vinlandii, a fytosférní druhy kvasinek, jako je Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentti, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces, a Aureobasidium polluslans. Obzvláště zajímavé jsou pigmentované mikroorganismy.
Je dostupná řada způsobů introdukce genu exprimujícího pesticidní protein do mikroorganismu jako hostitele za podmínek, které umožňují stabilní udržení a expresi genu. Je například možné zkonstruovat kazety, které obsahují DNA-konstrukty, které jsou předmětem zájmu, operabilně spojené s transkripčními a translačními regulačními signály pro expresi DNA-konstruktů, a DNA-sekvenci homologickou se sekvencí v hostitelském organismu, jejímž prostřednictvím dojde k integraci, nebo/a replikační systém, který je funkční v hostiteli, jehož prostřednictvím dojde k integraci nebo stabilnímu udržení.
Mezi transkripční a translační regulační signály patří, aniž by se tím však jejich rozsah jakkoli omezoval, promotor, místo iniciace transkropce, operátory, aktivátory, enhancery, další regulační elementy, místa vázající se na ribozomy, iniciační kodón, terminační signály a podobně, viz například patent Spojených Států Amerických č. 5 039 523, patent Spojených Států Amerických
-21CZ 290801 B6
č. 4 853 331, EP 0 480 762 A2, Sambrook a kol., viz výše; Molecular Cloning. a Laboratory
Manual, Maniatis a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York (1982); Advenced Bacterial Genetics, Davis a kol. (editoři), Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980), a v nich citované odkazy'.
Mezi vhodné hostitelské buňky, v případě že se buňky obsahující pesticid budou ošetřovat pro prodloužení účinnosti toxinu v buňce když se poté ošetřené buňky aplikují na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni, mohou patřit buďto prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňky, normálně s omezením na ty buňky, které neprodukují látky toxické pro vyšší organismy, jako jsou savci. Je však možné použít organismy produkující látky toxické pro vyšší organismy v případě, že toxin je nestabilní nebo aplikační množství dostatečně nízké, aby bylo možné vyhnout se možnosti toxicity pro savčího hostitele. Jako hostitelé jsou zejména zajímaví prokaryotní hostitelé a nižší eukaryotní hostitelé, jako jsou houby. Mezi ilustrativní příklady prokaryotních hostitelů patří jak gram-negativní tak gram-pozitivní hostitelé, a patří mezi ně Enterobacteriaceae, jako je Escherichia, Erwinina, Shigella, Salmonella, a Próteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, jako je Rhizobium; Spirillaceae, jako je fotobakterium. Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Sprillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, jako je Pseudomonas a Acetobacter; Azotobacteraceae a Nitrobacteraceae. Mezi eukaryotní hostitele patří houby, jako jsou Phycomycetes a Ascomycetes, Mezi které patří kvasinky, jako jsou Saccharomyces a Schizosaccharromyces, a kvasinky z třídy Basidiomycetes, jako je Rhotdotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces a podobně.
Mezi zejména zajímavé charakteristiky při výběru hostitelské buňky pro účely produkce patří snadnost introdukce genu pro protein do hostitele, dostupnost systémů exprese, účinnost exprese, stabilita proteinu v hostiteli, a přítomnost pomocných genetických schopností. Mezi charakteristiky zajímavé při použití jako pesticidních mikrokapslí patří ochranné vlastnosti pro pesticid, jako jsou silné buněčné stěny, pigmentace a intracelulámí packaging nebo vytváření inkluzních tělísek; afinita k listům; nepřítomnost toxicity pro savce; atraktivita pro požer škůdci; snadnost usmrcení a fixace bez poškození toxinu; a podobně. Dále je třeba brát v úvahu snadnost formulace a manipulace, ekonomická hlediska, stabilitu při skladování a podobně.
Mezi zejména zajímavé hostitelské organismy patří kvasinky, jako jsou Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. a Sporobolomyces sp., fytoplánové organismy jako jsou Pseudomonas sp., Erwinia sp. a Flavobacterium sp., nebo jiné organismy jako jsou Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp., a podobně. Mezi konkrétní organismy patří Pseudomonas aeruginosa, pseudomonas fluorescensm, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringsiesis, Escherichia coli, Bacillus subtilis a podobně.
Geny VIP lze introdukovat do mikroorganismů, které se množí na rostlinách (epifytů) pro dodání vegetativních insekticidních proteinů potenciálním škůdcům, kteří mají být kontrolováni. Epifyty mohou být například gram-pozitivní nebo gram-negativní bakterie.
Z rostliny, která je předmětem zájmu, lze například izolovat pomocí způsobů známých v oboru bakterie kolonizující kořeny. Konkrétně lze z kořenů rostliny izolovat kmen Bacillus cereus kolonizující kořeny (například viz J. Handelsman, S. Raffel, E. Mester, L. Wunderlich a C. Grau, Appl. Environ, Microbiol. 56:713-718, (1990)). VIP1 nebo/a VIP2 nebo/a VIP3 lze introdukovat do Bacillus cereus kolonizujícího kořeny pomocí standardních způsobů známých v oboru.
VIP3 nebo jiné VIP podle vynálezu lze rovněž introdukovat do mikroorganismu rodu Bacillus kolonizujícího kořeny pomocí elektrotransformace. Konkrétně lze VIP klonovat do kyvadlového vektoru (shuttle vector), například pHT3101 (D. Lereclus a kol., FEMS Microbiol. Letts., 60:211-218 (1989)), jak je popsáno v příkladu 10. Kyvadlový vektor pHT3101 obsahující kódující sekvenci konkrétního VIP lze poté transformovat do mikroorganismu rodu Bacillus
-22CZ 290801 B6 kolonizujícího kořeny pomocí elektroporace (D. Lereclus a kol. 1989. FEMS Microbiol. Letíš.,
60: 211-218)).
Expresivní systémy lze vytvořit tak, že jsou vegetativní insekticidní proteiny sekretovány vně cytoplazmy, například gram-negativní bakterie Escherichia coli. Výhody toho, že jsou vegetativní insekticidní proteiny sekretovány, jsou následující:
(1) zamezí se tím potenciálním toxickým účinkům exprimovaných vegetativních insekticidních proteinů v cytoplazmě, (2) může se zvýšit množství exprimovaného vegetativního insekticidního proteinu, a (3) může se usnadnit účinná purifikace vegetativního insekticidního proteinu.
Vegetativní insekticidní proteiny lze upravit tak, aby byly sekretovány Escherichia coli, například fúzí vhodného signálního peptidu Escherichia coli na N-konec signálního peptidu vegetativního insekticidního proteinu nebo nahrazením signálního peptidu vegetativního insekticidního proteinu signálním peptidem Escherichia coli. Signální peptidy rozpoznávané Escherichia coli lze nalézt v proteinech, o kterých je již známo, že jsou sekretovány Escherichia coli, jako je například protein OmpA (J. Ghrayeb, H. Kimura, M, Takahara. Y. Masui a M.Inouye, EMBO J., 3: 2 437-2 442 (1984)). OmpA je hlavním proteinem vnější membrány Escherichia coli a má se tedy za to, že je jeho signální peptid účinný v translokačním procesu. Signální peptid proteinu OmpA rovněž nemusí být modifikován před úpravou (processingem), jak tomu může být v případě jiných signálních peptidů, například lipoproteinového signálního peptidu (G. Duffaud, P. March a M. Inouye, Methods in Enzymology, 153: 492 (1987)).
Specificky lze na N-konce a C-konce kódujících sekvencí VIP za použití standardních způsobů známých v oboru zavést jedinečná restrikční místa BamHI. Tuo BamHI-fragmenty lze klonovat, ve čtecím rámci, do vektoru pIN-III-OmpAl, A2 nebo A3 (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, H. Hsiung, Y. Masui a M. Inouye, EMBO J„ 3: 2 437-2 442 (1984)), čímž se vytvoří fúzní gen ompA:VIP, který je sekretován do periplazmického prostoru. Další restrikční místa v polylinkeru pIN-IHompA lze eliminovat pomocí standardních způsobů známých v oboru, takže sekvence kódující N-koncovou aminokyselinu vegetativního insekticidního proteinu následuje přímo po místu štěpení signálního peptidu ompA. Sekretovaná sekvence vegetativního insekticidního proteinu v Escherichia coli je tedy poté identická s naticní sekvencí vegetativního insekticidního proteinu.
Pokud není nativní signální peptid vegetativního insekticidního proteinu nutný pro vytvoření správné struktury (folding) maturovaného proteinu, lze takové signální sekvence odstranit a nahradit signální sekvencí ompA. Jedinečná restrikční místa BamHI lze zavést na N-konci kódující sekvence proproteinu bezprostředně za sekvenci kódující signální peptid VIP a na Ckonci sekvence kódující VIP. Tyto BamHI-fragmenty lze poté klonovat do vektorů pIN-IIIompA jak je popsáno výše.
Obecné způsoby pro použití kmenů podle vynálezu k pesticidní kontrole nebo vytváření jiných organismů jako pesticidních činidel jsou známy v obru, viz například patent Spojených Států Amerických č. 5 039 523 a EP 0 480 762 A2.
Vegetativní insekticidní proteiny lze fermentovat v bakteriálním hostiteli a výslednou bakterii zpracovat a použít jako mikrobiální postřik stejným způsobem jakým se používají jako insekticidní postřiky kmeny Bacillus thuringiesis. V případě vegetativního insekticidního proteinu nebo vegetativních insekticidních proteinů, sekretovaných z mikroorganismů rodu Bacillus, se sekreční signál odstraní nebo mutuje za použití postupů známých v oboru, takovéto mutace nebo/a delece zabraňují sekreci vegetativního insekticidního proteinu nebo vegetativních insekticidních proteinů do růstového média během procesu fermentace. Vegetativní insekticidní proteiny jsou uschovány v buňce a buňky se poté zpracují za vzniku enkapsulovaných
-23CZ 290801 B6 vegetativních insekticidních proteinů. Pro tento účel lze použít libovolných vhodných mikroorganismů. Pro expresi endotoxinů Bacillus thuringiensis jako enkapsulovaných proteinů se v současné době používají mikroorganismy rodu Pseudomonas, přičemž se výsledné buňky zpracují a použijí k postřiku jako insekticidy (H. Gaethner a kol. 1993, vldvanced Engineered
Pesticides, editor L. Kim).
Tímto způsobem se používají různé kmeny Bacillus thuringiensis. Takovéto kmeny Bacillus thuringiensis vegetativní endotoxinový protein (nebo proteiny), jakož i vegetativní insekticidní proteiny. Alternativně mohou takové kmeny produkovat pouze vegetativní insekticidní proteiny. U nesporulujícího kmenu Bacillus subntilis bylo zjištěno, že produkuje vysoká množství endotoxinů CrylIIA z Bacillus thuringiensis (Agaisse, H. a Lereclus, D., „Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis CrylIIa toxin gene is not dependent on a sporulatin-specific sigma factor and is increased in a spoOA mutant“, J. Bacteriol., 176:4 734-4 741 (1994)). Podobný spoOA mutant lze připravit v případě Bacillus thuringiensis a použít jej pro produkci enkapsulovaných vegetativních insekticidních proteinů, které nejsou sekretovány do média ale jsou uchovány v buňce.
Pro uchování vegetativních insekticidních proteinů v buňce mikroorganismu Bacillus lze signální peptid změnit tak, že již nepůsobí jako sekreční signál.
Alternativně lze signální peptidy VIP podle vynálezu eliminovat ze sekvence, čímž se způsobí, že nejsou rozpoznatelné jako sekreční proteiny v mikroorganismech rodu Bacillus. Konkrétně lze za použití způsobů známých v oboru před proproteinovou sekvenci zařadit methioninové iniciační místo.
Geny pro vegetativní insekticidní proteiny lze introdukovat do mikroorganismů, které se rozmnožují na rostlinách (epifytů), pro dodání vegetativních insekticidních proteinů potenciálním škůdcům, kteří mají být kontrolováni. Epifyty mohou být například gram-pozitivní nebo gramnegativní bakterie.
Kmeny rodu Bacillus podle vynálezu, nebo mikroorganismy, které byly geneticky změněny tak, aby obsahovaly pesticidní gen a protein, lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Podle jednoho provedení vynálezu se celé, tj. nelyžované, buňky organismu produkujícího toxin (pesticid) ošetření činidly, které prodlužují účinnost toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni.
Alternativně se pesticidy produkují pomocí introdukce heterologního genu do buněčného hostitele. Exprese heterologního genu způsobuje přímo nebo nepřímo intracelulámí produkci a uchování pesticidu, tyto buňky se poté ošetří za podmínek, které prodlužují účinnost toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni. Výsledný produkt si uchovává toxicitu toxinu. Takové přirozeně enkapsulované pesticidy lze poté formulovat podle běžných technik pro aplikaci na prostředí obsahující škůdce, který má být kontrolován, například půdu, vodu, a listy rostlin, viz například EPA 0 192 319, a odkazy tam citované.
Účinné látky podle vynálezu se normálně aplikují ve formě prostředků, a lze je aplikovat na stanoviště plodiny nebo na rostlinu, která má být ošetřena, současně nebo postupně sjinými sloučeninami. Těmito sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fugicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími zemědělsky přijatelnými nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používáni při vytváření prostředků. Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně
-24CZ 290801 B6 používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá.
Výhodnými způsoby aplikace účinné látky podle vynálezu nebo agrochemického prostředku podle vynálezu, který obsahuje alespoň jeden z pro hmyz specifických proteinů produkovaných bakteriálními kmeny podle vynálezu, jsou aplikace na listy, obalování semen a půdní aplikace. Počet dávek a aplikační dávka závisí na intenzitě zamoření odpovídajícím škůdcem.
Vynález se tedy dále týká insekticidního prostředku, který obsahuje jako účinnou látku alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo/a rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, spolu se zemědělskou nosnou nebo pomocnou látkou, jako je nosič, ředidlo, povrchově aktivní látka nebo pomocná látka zlepšující aplikaci. Tento prostředek může rovněž obsahovat další biologicky účinnou sloučeninu. Uvedenými sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími zemědělsky přijatelnými nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků. Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčela, látky způsobující lepivost, pojivost nebo hnojivá.
Prostředek může obsahovat od 0,1 do 99 % hmot, účinné látky, od 1 do 99,9 % hmot, pevné nebo kapalné nosné nebo pomocné látky a od 0 do 25 % hmot, povrchově aktivní látky. Účinnou látku která obsahuje alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, nebo prostředek obsahující uvedenou účinnou látku, lze na rostliny nebo plodiny, které mají být chráněny, aplikovat spolu s určitými jinými insekticidy nebo chemikáliemi (1993 Crop Protection Vhemicals Refernce,Chemical and Pharmaceutical Press, Kanada) bez ztráty účinnosti, tyto látky a prostředky jsou kompatibilní s většinou jiných materiálů běžně používaných pro postřiky v zemědělství, neměly by však být používány v extrémně alkalických postřikových roztocích. Lze je aplikovat ve formě poprašků, suspenzí, smáčitelných prášků nebo v libovolné jiné formě vhodné pro použití v zemědělství.
Vynález dále popisuje způsoby kontroly nebo inhibice hmyzích škůdců, při kterých se aplikuje účinná látka, která obsahuje alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo prostředek obsahující uvedenou účinnou látku, na (a) prostředí, ve kterém se může hmyzí škůdce vyskytovat, (b) rostlinu nebo část rostliny za účelem ochrany uvedené rostliny nebo části rostliny před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem, nebo (c) semeno za účelem ochrany rostliny, které se z uvedeného semena vyvine, před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem.
-25CZ 290801 B6
Výhodným způsobem aplikace v oboru ochrany rostlin je aplikace na listy rostlin (listová aplikace), přičemž počet dávek a aplikační dávka závisí na rostlině, která má být chráněna, a riziku napadení daným škůdcem. Účinná látka se však může dostat do rostliny rovněž kořeny (systémové působení), pokud se na stanoviště rostliny aplikuje kapalná formulace nebo pokud se účinná látka zapracuje v pevné formě na stanovišti rostliny, například do půdy, například ve formě granulí /půdní aplikace). Při záplavovém pěstování rýže lze takovéto granule aplikovat v odměřených množstvích na zaplavené rýžové pole.
Prostředky podle vynálezu jsou rovněž vhodné na ochranu rostlinného rozmnožovacího materiálu, například semen, jako jsou plody, hlíza nebo zrna, nebo rostlinných řízků, proti živočišným škůdcům. Rozmnožovací materiál lze tímto prostředkem ošetřit před vysetím či vysázením, například semena lze obalovat před setím. Účinnou látku podle vynálezu lze rovněž aplikovat na zrní (obalování, moření), a to tak, že se na zrní buď aplikuje kapalný prostředek nebo se obalí pevným prostředkem. Prostředek lze rovněž aplikovat na místo setí nebo sázení ve chvíli setí nebo sázení rozmnožovacího materiálu, například do secí brázdy během setí. Vynález rovněž zahrnuje tyto způsoby ošetření rostlinného rozmnožovacího materiálu a rostlinný rozmnožovací materiál, který byl takto ošetřen.
Prostředky podle vynálezu, které obsahují jako účinnou látku rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jeden žňových toxinových genů v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, lze aplikovat libovolným známým způsobem pro ošetření semen nebo půdy bakteriálními kmeny, viz například patent Spojených Států Amerických č. 4 863 866. Tyto kmeny poskytují účinnou biologickou ochranu dokonce i v případě, že mikroorganismus není živý. Výhodná je však aplikace živých mikroorganismů.
Mezi cílové plodiny, které mají být chráněny, patří v rámci vynálezu například následující druhy rostlin:
obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepa (cukrová řepa a krmná řepa), trávy používané jako pícniny (srha říznačka, kostřavy a podobně), ovocné plodiny rodící jádrové, peckové a měkké ovoce (jabloně, hrušně, švestky, broskvoně, mandloně, třešně, jahodník, maliník a ostružiník), luskoviny (fazol, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka olejka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokosovník, skořec, kakaovník, podzemnice olejná), tykvovité rostliny (okurky, dýně, melouny), předné rostliny (bavlník, len, konopí, jutovník), rostliny produkující citrusové plody (pomeranče, citrony, grepy, mandarinky), zeleniny (špenát, hlávkový salát, chřest, zelí a jiné zeleniny z čeledi Brassicaceae, cibule, rajčata, brambory, paprika), vavřínovité rostliny (avokádo, mrkev, skořicovník, kafrovník), opadavé stromy a konifeiy (například lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), a rostliny jako je kukuřice, tabák, ořešák, kávovník, cukrová třtina, čajovník, vinná réva, chmel, banánovník a kaučukovník, jakož i okrasné rostliny, včetně hvězdicovitých (složnokvětých).
Rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, se obvykle aplikuje ve formě insekticidních prostředků, přičemž aplikaci lze provádět na pěstební plochu nebo rostlinu, která má být ošetřena, současně nebo postupně s dalšími biologicky účinnými sloučeninami. Těmito sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků.
-26CZ 290801 B6
Účinnou látku podle vynálezu lze použít v nemodifikované formě nebo spolu s libovolným vhodným zemědělsky přijatelným nosičem. Takovýmito nosiči jsou nosné a pomocné látky obvykle používané při vytváření zemědělských prostředků, a účinné látky podle vynálezu se tedy formulují známým způsobem do formy emulgovatelných koncentrátů, roztíratelných past, roztoků pro přímý postřik nebo ředitelných roztoků, zředěných emulzí, smáčitelných prášků, rozpustných prášků, poprašků a granulí, a rovněž se mohou enkapsulovat, například do polymerních látek. Způsoby aplikace, jako postřik, zmlžování, poprašování, rozmetání nebo zalévání se, stejně jako typ prostředku, volí podle požadovaných výsledků a převlékajících podmínek. Výhodné aplikační dávky se normálně pohybují od přibližně 50 g do přibližně 50 g do přibližně 5 kg účinné látky na hektar, výhodně od přibližně 100 g do přibližně 2 kg účinné látky na hektar. Významné jsou aplikační dávky v rozmezí od přibližně 200 g do přibližně 1 kg účinné látky na hektar a od 200 g do 500 g účinné látky na hektar.
V případě obalování (moření) semen činí výhodné aplikační dávky 0,5 g až 1 000 g účinné látky na 100 kg semen, výhodně 3 g až 100 g účinné látky na 100 kg semen nebo 10 g až 50 g účinné látky na 100 kg semen.
Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá. Formulace, tj. insekticidní prostředky, přípravky nebo směsi obsahující rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuriongiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, jako účinnou látku, nebo jako kombinaci s jinými účinnými látkami, a popřípadě pevnou nebo kapalnou nosnou nebo pomocnou látku, se připraví známým způsobem, například homogenním mícháním nebo/a mletím účinných látek s aditivy, například rozpouštědly, pevnými nosnými látkami a v některých případech povrchově aktivními sloučeninami (povrchově aktivními činidly, surfaktanty).
Jako rozpouštědla jsou vhodné následující látky: aromatické uhlovodíky, výhodně frakce obsahující 8 až 12 atomů uhlíku, například směsi xylenů nebo substituované naftaleny, ftaláty, jako je dibutylftalát nebo dioktylftalát, alifatické uhlovodíky, jako je cyklohexan nebo parafíny, alkoholy a glykoly a jejich ethery a estery, jako je ethanol, monomethyl- nebo monoethylether ethylenglykolu, ketony, jako je cyklohexanon, silně polární rozpouštědla, jako je N-methyl-2pyrrolidon, dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid, jakož i rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje, jako je epoxidovaný kokosový olej nebo sójový olej, nebo voda.
Pevnými nosiči požívanými například pro popraše a dispergovatelné prášky, jsou přírodní minerální plnidla, jako je kalcit, mastek, kaolin, montmorillonit nebo atapulgit. Pro zlepšení fyzikálních vlastností lze rovněž přivádět vysokodisperzní kyselinu křemičitou nebo vysokodisperzní absorbující polymery. Vhodnými granulovanými adsorpčními nosiči jsou porézní typy materiálů, například pemza, cihlová drť, sepiolit nebo bentonit, a vhodnými nesorpčními nosiči jsou materiály jako je kalcit nebo písek. Kromě toho lze použít rovněž rozsáhlou řadu předem granulovaných materiálů anorganické nebo organické povahy, například zejména dolomit nebo rozmělněné rostlinné zbytky.
V závislosti na povaze účinné látky, která je začleňována, jsou povrchově aktivními sloučeninami neionogenní, kationická nebo/a anionická povrchově aktivní činidla, která vykazují dobré emulgační, dispergační a smáčivé vlastnosti. Rozumí se, že termín „povrchově aktivní činidlo“ zahrnuje též směsi povrchově aktivních činidel.
Vhodnými anionickými povrchově aktivními činidly mohou být jak ve vodě rozpustná mýdla, tak ve vodě rozpustné syntetické povrchově aktivní sloučeniny. Vhodnými mýdly jsou soli alkalických kovů, soli kovů alkalických zemin nebo nesubstituované nebo substituované amoniové soli vyšších mastných kyselin (obsahujících 10 až 22 atomů uhlíku), například sodné
-27CZ 290801 B6 nebo draselné soli olejové nebo stearové kyseliny, nebo přírodních směsí mastných kyselin, které lze získat například z kokosového oleje nebo lojového oleje. Dalšími vhodnými povrchově aktivními činidly jsou rovněž soli mastných kyselin a methyltaurinu, jakož i modifikované a nemodifikované fosfolipidy.
Častěji se však používají tak zvané syntetické povrchově aktivní látky, zejména mastné sulfonáty, mastné sulfáty, sulfonované benzimidazolderiváty nebo alkylarylsulfonáty. Mastné sulfonáty nebo sulfáty jsou zpravidla ve formě solí s alkalickými kovy, solí s kovy alkalických zemin nebo nesubstituovaných nebo substituovaných amoniových solí, a obecně obsahují alkylový zbytek s 8 až 22 atomy uhlíku, který zahrnuje rovněž alkylovou část acylových zbytků, například sem patří sodná nebo vápenatá sůl kyseliny lignosulfonové, dodecylsulfátů nebo směsí mastných alkoholsulfátů získaných z přírodních mastných kyselin. Mezi tyto sloučeniny patří rovněž soli esterů kyseliny sírové a sulfonové kyseliny adičních produktů mastných alkoholů s ethylenoxidem. Sulfonované benzimidazolderováty výhodně obsahují dvě sulfonylové skupiny a jeden zbytek mastné kyseliny obsahující přibližně 8 až 22 atomů uhlíku. Mezi příklady alkylarylsulfonátů patří například sůl sodíku, vápníku nebo triethanolaminu a dodecylbenzensulfonové kyseliny, dibutylnaftalensulfonové kyseliny nebo kondenzačního produktu kyseliny naftalensulfonové a formyldehydu. Vhodné jsou rovněž odpovídající fosfáty, například soli esterů kyseliny fosforečné a aduktů p-nonylfenolu se 4 až 14 mol ethylenoxidu.
Neionogenními povrchově aktivními látkami jsou výhodně polyglykoletherderiváty alifatických nebo cykloalifatických alkoholů, nasycených nebo nenasycených mastných kyselin a alkylfenolů, kteréžto deriváty obsahují 3 až 30 glykoletherových skupin a 8 až 20 atomů uhlíku v (alifatickém) uhlovodíkovém zbytku a 6 až 18 atomů uhlíku v alkylovém zbytku alkylfenolů.
Dalšími vhodnými neionogenními povrchově aktivními látkami jsou ve vodě rozpustné adiční produkty polyethylenoxidu s polypropylenglykolem, ethylendiaminopolypropylenglykolem a alkylpolypropylenglykolem s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylovém řetězci, obsahující 20 až 250 ethylenglykoletherových skupin a 10 až 100 propylenglykoletherových skupin. Tyto sloučeniny obsahují obvykle na jednotku propylenglykolu 1 až 5 jednotek ethylenglykolu. Jako reprezentativní příklady neionogenních povrchově aktivních látek je možno uvést nonylfenolpolyethoxyethanoly, polyglykolethery ricinového oleje, adiční produkty polypropylenu a polyethylenoxidu, tributylfenoxypolyethoxyethanol, polyethylenglykol a oktylfenoxypolyethoxyethanol. Vhodnými neionogenními povrchově aktivními látkami jsou rovněž estery mastných kyselin a polyoxyethylensorbitanu, jako je polyoxyethylensorbitan-trioleát.
Kationickými povrchově aktivními látkami jsou výhodně kvartémí amoniové soli, které jako substituent dusíkového atomu obsahují alespoň jeden alkylový zbytek s 8 až 22 atomy uhlíku, a jako další substituenty nižší, nesubstituované nebo halogenované, alkylové skupiny, benzylové skupiny, nebo nižší hydroxyalkylové skupiny. Tyto soli jsou výhodně ve formě halogenidů, methylsulfátů nebo ethylsulfátů, jako je například stearyltrimethylamoniumchlorid nebo benzy ldi (2-chl orethy 1 )ethy lamon i umbrom id.
Povrchově aktivní látky běžně používané při vytváření prostředků, jsou popsány například v publikacích „mcCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual“ MC Publishing „Tensid Taschenbuch“, Carl Hanser Verlag, Mnichov/Vídeň.
Další zejména výhodnou vlastností insekticidního prostředku podle vynálezu je stálost účinné látky pokud je aplikován na rostliny a půdu. Mezi možné příčiny ztráty účinnosti patří inaktivace ultrafialovým světlem, teplem, listovým exsudáty a pH. Například při vysokém pH, zejména za přítomnosti redukčního činidla, krystaly δ-endotoxinů solubilizují a tím se stávají přístupnější proteolytické inaktivaci. Významné může být i vysoké pH listů, zejména pokud může mít povrch listů pH v rozmezí 8-10. U formulací insekticidního prostředku podle vynálezu je možné se s těmito problémy vypořádat buďto přidáním aditiv napomáhajících zabránění ztráty účinné látky nebo enkapsulací materiálu takovým způsobem, že je účinná látka chráněna proti inaktivaci.
-28CZ 290801 B6
Enkapsulaci lze provést chemicky (McGuire a Shasha, J Econ Entomol 85: 1 425-1 433, 1992) nebo biologicky (Barnes a Cummings, 1986; EP-A 0 192 319). Mezi způsoby chemické enkapsulace patří postupy, při kterých je účinná látka obalena polymerem, zatímco biologická enkapsulace zahrnuje expresi genů δ-endotoxinů v mikrobech. V případě biologické enkapsulace se jako účinná složka formulace použije nepoškozený mikrob, který obsahuje alespoň jednu molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě. Přidáním činidel chránících proti účinkům UV-záření se může účinně snížit poškození zářením. Inaktivaci teplem lze rovněž kontrolovat přidáním vhodného aditiva.
Výhodné jsou v rámci vynálezu formulace, které obsahují jako účinnou složku živé mikroorganismy, buď ve formě vegetativní buňky nebo výhodněji ve formě spor, pokud jsou v daném případě dostupné. Vhodné formulace mohou být tvořeny například polymemími gely, které jsou zesítěné polyvalentními kationty a obsahují uvedené mikroorganismy, jak popsali například D. R. Fravel a kol. v Phytopathology, svazek 75, č. 7, 774-777, 1985 za použití alginátu jaké polymerního materiálu. Z této publikace je rovněž známo, že lze používat společně více nosných materiálů. Uvedené formulace se zpravidla připravují mícháním roztoků v přírodě se vyskytujících nebo syntetických polymerů tvořících gely, například alginátů, a vodných roztoků solí polyvalentních iontů kovů tak, že se vytvoří jednotlivé kapičky, přičemž mikroorganismy mohou být suspendovány v jednom ze dvou uvedených reakčních roztoků nebo v obou těchto roztocích. Tvorba gelu začíná při míchání ve formě kapiček. Tyto částice gelu lze následně vysušit. Tento proces se nazývá ionotropní gelovatění. V závislosti na stupni vysušení se vytvoří kompaktní a tvrdé částice polymerů, které jsou strukturně zesítěny polyvalentními kationty a které obsahují mikroorganismy a nosič v převážně rovnoměrném rozmístění. Velikost částic může být až do 5 mm.
EP-A1-0 097 571 popisuje prostředky na bázi částečně zesítěných polysacharidů které, kromě toho že obsahují mikroorganismy, mohou obsahovat rovněž například jemně zrnitou kyselinu křemičitou jako nosný materiál a zesítění lze provést například ionty Ca++. Tyto prostředky vykazují vodní aktivitu nepřesahující hodnotu 0,3. Comick a kol. popisují v shrnujícím článku (New Directions in Biological Control: Alternatives for Supressing Agricultural Pests and Diseases, str. 345-372, Alan R. Liss, lne. (1990)) různé formulační systémy, přičemž jsou zmíněny granule s vermikulitem jako nosičem a kompaktní alginátové kuličky připravené způsobem ioniotropního gelovatění. takové prostředky popsal rovněž D. R. Fravel v Pesticide Formulations and Application Systems: 11. svazek, ASTM STP1112 Američan Society for Testing and Materials, Philadelphia, 1992, str. 173-179 a lze je použít pro formulaci rekombinantních mikroorganismů podle vynálezu.
Insekticidní prostředky podle vynálezu obsahují obvykle od přibližně 0,1 do přibližně 99%, výhodně přibližně 0,1 až přibližně 95 % a nejvýhodněji přibližně 3 až přibližně 90% účinné látky, přibližně 1 až přibližně 99,9 %, výhodně přibližně 1 až přibližně 99 % a nejvýhodněji přibližně 5 až přibližně 95 % pevného nebo kapalného aditiva, a přibližně 0 až přibližně 25 %, výhodně přibližně 0,1 až přibližně 25% a nejvýhodněji přibližně 0,1 až přibližně 20% povrchově aktivního činidla.
Podle výhodného provedení vynálezu obsahují insekticidní prostředky obvykle 0,1 až 99 %, výhodně 0,1 až 95 % rekombinantního kmene Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, který obsahuje alespoň jednu molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní forma, nebo jeho kombinace s jinými účinnými látkami, 1 až 99,9 % pevného nebo kapalného aditiva, a 0 až 25 %, výhodně 0,1 až 20 % povrchově aktivního činidla.
Zatímco komerční produkty se obvykle vyrábějí jako koncentráty, konečný spotřebitel obvykle používá zředěné formulace s podstatě nižší koncentrací. Insekticidní prostředky mohou obsahovat také další složky, jako stabilizátory, činidla proti pěnění, látky regulující viskozitu,
-29CZ 290801 B6 pojidla, činidla způsobující lepivost, jakož i hnojivá nebo jiné účinné látky pro dosažení speciálních efektů.
Pro lepší pochopení vynálezu obecně popsaného výše slouží následující podrobné příklady, které jsou uvedeny pouze pro ilustraci a vynález se jimi v žádném směru neomezuje, pokud není uvedeno jinak.
Byla vytvořena standardní nomenklatura založená na sekvenční identitě proteinů spadajících do rozsahu vynálezu. Níže jsou uvedena označení genů a proteinů používaná v následujících příkladech a jejich vztah k označením používaným v související základní přihlášce US 314 594/08.
označení genu nebo proteinu podle standardní nomenklatury označení genu nebo proteinu v základní přihlášce US 314 594/08 popis proteinu
VIP3A(a) VIP z kmene AB88 uvedený v sekvenci SEQ ID č. 1 této přihlášky
VIP3A(b) VIP z kmene AB424 uvedený v sekvenci SEQ ID č. 4 této přihlášky
Příklady provedení vynálezu
Příklady formulací
Účinnými látkami používanými v následujících příkladech formulací jsou kmen Bacillus cereus s přírůstkovým číslem NRRL B-21058, kmeny Bacillus thuringiesis s přírůstkovými čísly NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227 a NRRL B21439, a kmeny Bacillus spp a přírůstkovými čísly NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B21230. Všechny uvedené kmeny jsou kmeny izolovanými z přírody, které obsahují pro hmyz specifické proteiny podle vynálezu.
Alternativně se používají jako účinné látky izolované pro hmyz specifické proteiny samotné nebo v kombinaci s výše uvedenými kmeny rodu Bacillus.
AL Smáčitelné prášky
a) b) c)
spory Bacillus thuringiensis 25% 50% 75%
lignosulfonát sodný 5% 5% -
laurylsulfát sodný 3 % - 5%
diizobutylnaftalensulfonát sodný — 6% 10%
oktylfenolpolyethylenglykolether (7-8 mol ethylenoxidu) - 2% -
vysokodispezní kyselina křemičitá 5% 10% 10%
kaolin 62% 27% -
Spory se důkladně promíchají saditivy a směs se dobře rozemele ve vhodném mlýnu, čímž se získají smáčitelné prášky, které lze ředit vodou na suspenze libovolných požadovaných koncentrací.
-30CZ 290801 B6
A2. Emulgovatelný koncentrát
spory Bacillus thuringiensis 10%
oktylfenolpolyethylenglykolether (4-5 mol ethylenoxidu) 3%
dodecylbenzensulfonát vápenatý 3%
polyglykolether ricinového oleje (35 mol ethylenoxidu) 4%
cyklohexanon 30%
směs xylenů 50%
Z tohoto koncentrátu lze naředěním vodou získat emulze libovolné požadované koncentrace.
A3. Popraše
a) b)
spory Bacillus thuringiensis 5% 8%
mastek 95% -
kaolin - 92%
Popraše vhodné k okamžitému použití se získají smícháním účinné látky s nosiči a rozemletím směsi ve vhodném mlýnu.
A4. Vytlačované granule
spory Bacillus thuringiensis 10%
lignosulfonát sodný 2%
karboxymethylcelulóza 1 %
kaolin 87%
Účinná látka nebo kombinace se smíchá a rozemele s aditivy, a směs se poté navlhčí vodou. Tato směs se vytlačuje, granuluje a poté se vysuší v proudu vzduchu.
A5. Obalované granule
spory Bacillus thuringiensis 3%
polyethylenglykol o molekulové hmotnosti 200 3%
kaolin 94%
Účinná látka nebo kombinace se v míchačce rovnoměrně nanese na kaolin navlhčený polyethylenglykolem. Tímto způsobem se získá neprášící obalovaný granulát.
A6. Suspenzní koncentrát
spory Bacillus thuringiensis 40%
ethylenglykol 10%
nonylfenolpolyethylenglykolether (15 mol ethylenoxidu) 6%
lignosulfonát sodný 10%
karboxymethylcelulóza 1 %
37% vodný roztok formaldehydu 0,2 %
silikonový olej ve formě 75% vodného roztoku 0,8 %
voda 32%
Účinná látka nebo kombinace se důkladně promíchá s aditivy, čímž se získá suspenzní koncentrát, ze kterého lze naředěním vodou připravit suspenze libovolné požadované koncentrace.
-31CZ 290801 B6
Příklad 1
Kultivace bakterií
Subkultura kmene Bacillus cereus AB78 byla použita k inokulaci následujícího média, známého jako TB-vývar (TB broth):
trypon 12 g/1
kvasničný extrakt 24 g/1
glycerol 4ml/l
KH2PO4 2,1 g/1
k2hpo4 14,7 g/1
pH 7,4
K autoklávovanému vývaru se po ochlazení přidá fosforečnan draselný. Buňky se inkubují při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin až 36 hodin, tedy do počáteční až střední logaritmické fáze růstu.
Výše uvedený postup lze za použití procedur známých v oboru snadno upravit do rozsahu potřebného pro velké fermentory.
V průběhu vegetativního růstu, obvykle 24-39 hodin po započetí kultivace, tedy do počáteční až střední logaritmické fáze růstu, byly bakterie AB78 centrifugovány ze supernatantu kultury. Supematant kultury obsahující aktivní protein byl použit v biologických testech.
Příklad 2
Biologické testy na hmyzu
Kmen Bacillus cereus AB78 byl testován proti různým druhům hmyzu jak je popsáno níže.
Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicomis barberi respektive Diabrotica undecempunctata howardi:
připraví se řádění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci, zředěný supematant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Marrone a kol. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293) a nechá se ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do misek. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6 dnů.
Biologické testy s klony Escherichia coli: buňky Escherichia coli se nechají růst přes noc ve vývaru obsahujícím 100 pg/m ampicilinu při teplotě 37 °C. 10 ml kultury se sonikuje třikrát po dobu vždy 20 sekund. 500 μΐ sonikované kultury se přidá k roztavené potravě pro Diabrotica virgifera virgifera.
Leptinotarsa decemlineata: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 pěstované po dobu 24 36 hodin v přípravku Triton X-100tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. Kousky listů bramboru o ploše 5 cm2 se ponoří do těchto roztoků, usuší se proudem vzduchu a umístí se na navlhčený filtrační papír v umělohmotových miskách. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na kousky listů a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 3-5 dnů.
Tenebrio molitor: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci, zředěný supematant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Bioserv č. F9240) a nechá se
-32CZ 290801 B6 ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do umělohmotových misek. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6-8 dnů.
Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Meduca sexta respektive Spodoptera exigua: připraví se řádění supernatantu kultury AB78 pěstované po dobu 24 - 36 hodin v přípravku Triton X-100 tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. 100 μΐ se pipetuje na povrchu 18 cm2 ztuhlé umělé potravy (Bioserv. č. F9240) a nechá se uschnout na vzduchu. Čerstvě vylíhlé larvy se poté umístí na povrchu potravy a udržuje se teplota 30 °C.Mortalita se stanoví po uplynutí 3-6 dnů.
Culex pipiens: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci. 100 μ\ se pipetuje do 10 ml vody v umělohmotové nádobě o objemu 30 ml. Do vody se přidají larvy ve stádiu třetího instaru a teplota se udržuje na teplotě místnosti. Mortalita se stanoví po uplynutí 24 - 48 dnů.
Spektrum insekticidní aktivity AB78 je uvedeno v tabulce 14
Tabulka 14
Účinnost supernatantu kultury AB78 proti různým hmyzím škůdcům
testovaný druh hmyzu řád účinnost
Diabrotica virgifera virgifera Coleoptera +++
Diabrotica longicomis barberi Coleoptera +++
Diabrotica undecimpuctata howardi Coleoptera -
Leptinotarsa decemlineata Coleoptera -
Tenebrio molitor Coleoptera -
Ostrinia nubilalis Lepidoptera -
Heliothis virescens Lepidoptera -
Manduca sexta Lepidoptera -
Spodoptera exigua Lepidoptera -
Agrotis ipsilon Lepidoptera -
Culex pipiens Diptera -
Nově nalezený kmen Bacillus cereus AB78 vykazuje podstatně odlišné spektrum insekticidní účinnosti ve srovnání se známými δ-endotoxiny z bacillus thuringiensis účinnými proti broukům. AB78 zejména vykazuje selektivnější účinnost proti broukům než známé kmeny Bacillus thuringiensis účinné proti broukům, jelikož je specificky účinný proti Diabrotica spp. Přesněji, je nejúčinnější proti Diabrotica virgifera virgifera a Diabrotica longicomis barbeti, ale nikoli proti Diabrotica undecimpunctata howardi.
U řady kmenů Bacillus byla biologicky testována jejich účinnost v průběhu vegetativního růstu proti Diabrotica virgifera virgifera - viz tabulka 15. Výsledky svědčí o tom, že AB78 je jedinečný svou účinností proti Diabrotica virgifera virgifera, která není obecným jevem.
Tabulka 15
Účinnost supematantů kultur různých kmenů Bacillus spp. proti Diabrotica virgifera virgifera
-33CZ 290801 B6
kmen Bacillus procento mortality Diabrotica virgifera virgifera
Bacillus cereus AB78 (Bat. 1) 100
Bacillus cereus AB78 (Bat. 2) 100
Bacillus cereus (Carolina Bio.) 12
Bacillus cereus ATCC 11950 12
Bacillus cereus ATCC 14579 8
Bacillus mycoides (Carolina Bio.) 30
Bacillus popilliae 28
Bacillus thuringiensis HD135 41
Bacillus thuringiensis HD191 9
Bacillus thuringiensis GC91 4
Bacillus thuringiensis isrealensis 24
voda (kontrola) 4
Specifická účinnost AB78 proti Diabrotica virgifera virgifera je uvedena v tabulce 16.
Tabulka 16
Účinnost supematantu kultury AB78 proti čerstvě narozeným larvám Diabrotica virgifera virgifera
koncentrace supematantu kultury (μΐ/ml) procento mortality Diabrotica virgifera virgifera
100 100
25 87
10 80
5 40
2,5 20
1 6
0 0
Bylo vypočítáno, že hodnota LC50 činí 6,2 μΐ supematantu kultury na ml Diabrotica virgifera virgifera.
Byly prováděny rovněž biologické testy buněčné pelety a nebyla zjištěna žádná účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Přítomnost účinnosti pouze v supematantu tedy svědčí o tom, že tento vegetativní insekticidní protein je exotoxinem.
Příklad 3
Klonování celkové DNA z kmene Bacillus cereus AB78 pomocí kosmidů
Gen VIP1 A(a) byl klonován z celkové DNA připravené z kmene AB78 následujícím způsobem: Izolace DNA z AB78 se provede následovně:
1. Bakterie se nechají růst přes noc v 10 ml média L-broth (za použití sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml)
2. Přidá se 25 ml čerstvého média L-broth a 30 χ/g/ml ampicillinu.
3. Buňky se nechají růst po dobu 2-6 hodin na třepačce při teplotě 30 °C.
-34CZ 290801 B6
4. Buňky se odstředí v polypropylenové kyvetě s oranžovým uzávěrem o objemu 50 ml ve stolní klinické centrifuze IEC při 3/4 rychlosti.
5. Peleta buněk se resuspenduje v 10 ml TES (TES = 50mM TRIS o pH 8,0, lOOmM kyselina ethylendiamintetraoctová, 15mM chlorid sodný).
6. Přidá se 30 mg lyzozymu a provede se inkubace po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C.
7. Přidá se 200 μ\ 20% SDS (dodecylsulfonátu sodného) a 400 μ\ zásobního roztoku Proteinasy K (20 mg/ml) a provádí se inkubace při teplotě 37 °C.
8. Přidá se 200 μ\ čerstvé Proteinasy K a provádí se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 55 °C. Přidá se 5 ml TES pro dosažení konečného objemu 15 ml.
9. Provede se dvakrát fenolová extrakce (10 ml fenolu, centrifugace se provádí při teplotě místnosti při 3/4 rychlosti ve stolní klinické centrifuze IEC). Supematant (vrchní část) se přenese do čisté zkumavky pomocí pipety s velkým průměrem.
10. Provede se jednou extrakce směsí, kterou tvoří b objemovém poměru 1 : 1 fenol a chloroform s izoamylalkoholem (v poměru 24 : 1).
11. DNA se vysráží stejným objemem studeného izopropanolu. Provede se centrifugace, kterou se vytvoří peleta DNA.
12. Peleta se resuspenduje v 5 ml TE.
13. DNA se vysráží 0,5 ml 3M octanu sodného o pH 5,2 a 11 ml 95% ethanolu. Směs se umístí na 2 hodiny do -20 °C.
14. DNA se vyjme ze zkumavky umělohmotovým očkem, přenese se do kyvety pro mikrocentrifugaci, odstředí se, odpipetuje se nadbytek ethanolu, a vysuší se ve vakuu.
15. DNA se resuspenduje v 0,5 ml TE. Provede se inkubace po dobu 90 minut při teplotě 65 °C, pro usnadnění převedení DNA zpět do roztoku.
16. Za použití standardních postupů se stanoví koncentrace.
Klonování AB78 pomocí kosmidů:
Všechny postupy, pokud není uvedeno jinak, se provádějí podle instrukčního manuálu firmy Stratagene (Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, kat. č. 251301).
Obecně se provedou následující kroky:
A. DNA AB78 se částečně rozštěpí Sau 3A.
B. Připraví se vektorová DNA.
C. Provede se ligace a packaging (sbalení) DNA.
D. Vytvoří se kosmidová knihovna:
1. Vytvoří se kultura buněk HB101 tak, že se umístí 50 ml kultury pěstované přes noc do 5 ml TB s 0,2 % maltózy. Kultura se inkubuje po dobu 3,5 hodiny při teplotě 37 °C.
2. Buňky se odstředí a resuspendují v 0,5 ml lOmM síranu hořečnatého.
3. Smíchá se:
100 ml buněk,
100 ml naředěné směsi se sbalenou DNA,
100 ml 1 OmM síranu hořečnatého, ml TB.
4. Provede se adsorpce při teplotě místnosti po dobu 30 minut, přičemž se směs nemíchá.
5. Přidá se 1 ml TB a směs se mírně míchá. Provádí se inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C.
6. 200 ml se nanese na destičky L-amp. provádí se inkubace při teplotě 37 °C přes noc.
-35CZ 290801 B6
Alespoň 400 kosmidových klonů bylo normálně vybráno a byla u nich zkoumána účinnost proti
Diabrotica virgifera virgifera, jak je popsán v příkladu 2. DNA z 5 účinných klonů a neúčinných klonů byla použita pro Southemovy hybridizace. Výsledky svědčí o tom, že hybridizace za použití výše popsané oligonukleotidové sondy je v korelaci s účinností proti
Diabrotica virgifera virgifera (viz tabulka 18).
Kosmidové klony P3-12 a P5-4 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agrilcultural Research Service Patent Culture Collectin (NRRL) a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21061 respektive NRRL B-21059.
Tabulka 18
Účinnost kosmidových klonů AB78 proti Diabrotica virgifera virgifera
klon průměrné procento mortality (N=4)
klony které hybridizují se sondou
Pl—73 47
Pl—83 64
P2-2 69
P3-12 85
P5-4 97
klony které nehybridizují se sondou
Pl-2 5
P3-8 4
P3-9 12
P3-18 0
P4-6 9
Příklad 4
Purifikace vegetativních insekticidních proteinů z kmene AB88
Kapalná kultura bakterií byla nechána růst přes noc při teplotě 30 °C v TB-médiu. Buňky byly odcentrifugovány při 5000 g za 20 minut a byl odebrán supematant. Proteiny přítomné v supematantu byly vysráženy síranem amonným (70% nasycení), centrifugovány při 5000 g po dobu 15 minut a byla odebrána peleta. Tato peleta byla resuspendována v původním objemu 20mM Tris o pH 7,5 a dialyzována přes noc proti stejnému pufru při teplotě 4 °C. Dialyzát AB88 byl zakalenější než srovnatelný materiál z AB78. Dialyzát byl titrován na pH 4,5 za použití 20mM natrium-citrátu o pH 2,5 a po 30-minutové inkubaci při teplotě místnosti byl roztok centrifugován při 3000 g po dobu 10 minut. Proteinová peleta byla znovu rozpuštěna ve 20mM Bis-Tris-propanu o pH 9,0.
Po vyčeření byly separovány proteiny AB88 pomocí několika různých metod, včetně izoelektrické fokusace (Rotofor, BioRad, Hercules, Kalifornie, UDSA), precipitace při pH 4,5, chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací chromatografie a ultrafiltrace.
Proteiny byly separovány na anexové koloně Poros HQ/N (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, USA) za použití lineárního gradientu od 0 do 500mM chloridu sodného ve 200mM BisTris-propanu o pH 9,0 s rychlostí průtoku 4 ml za minutu. Insekticidní protein se vymýval při 250mM koncentraci chloridu sodného.
-36CZ 290801 B6
Protein účinný proti Ostrinia nubilalis zůstal v peletě získané pomocí prcipitace dialyzátu při pH 4,5. Po provedení preparativní izoelektické fokusace dialyzátu za použití amfolytů pH 3-10 byla nalezena insekticidní účinnost proti Ostrinia nubilalis ve všech frakcích s pH 7 nebo vyšším, pomocí elektroforézy těchto frakce v SDS-polyakrylamidovém gelu byly nalezeny pásy proteinů o molekulové hmotnosti přibližně 60 kDa a přibližně 80 kDa. Pásy 60 kDa a 80 kDa byly odděleny pomocí anexové \ysoceúčinné kapalinové chromatografie na koloně Poros-Q (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, USA). N-koncová sekvence byla získána ze dvou frakcí obsahujících proteiny které se mírně lišily molekulovou hmotností, oba však měly velikost přibližně 60 000. Získané sekvence si byly navzájem podobné a rovněž byly podobné některým δ-endotoxinům.
Pokud byla peleta účinná proti Ostrinia nubilalis získaná precipitací dialyzátu při pH 4,5 dále dělena pomocí anexové kolon} Poros-Q, byla účinnost nalezena pouze ve frakcích s hlavním pásem o molekulové hmotnosti přibližně 60 000.
Protein účinný proti Agrotis ipsilon rovněž růstával v peletě při okyselení dialyzátu AB88 na pH 4,5. Při preparativní izoelektrické fokusaci za použití amfolytů pH 3-10 nebyla účinnost zjištěna ve frakcích účinných proti Ostrinia nubilalis, místo toho byla nejvyšší ve frakci o pH 4,5-5,0. Její hlavní složky měly molekulovou hmotnost přibližně 35 000 a přibližně 80 000.
Peleta s pH 4,5 byla rozdělena pomocí anexové vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), čímž byly získány frakce obsahující pouze materiál o molekulové hmotnosti 35 000 a frakce obsahující jak pásy o molekulové hmotnosti 35 000 tak 80 000.
Příklad 5
Charakterizace vegetativních insekticidních proteinů AB88
Frakce obsahující vegetativní proteiny účinné proti různým druhům byly vytvořeny jak je popsáno v příkladu 4. Frakce \ykazující insekticidní účinnost byly rozděleny v 8 až 16% SDSpolyakrylamidových gelech a přeneseny na poly(vinyldenfluoridové) membrány (LeGendre a kol. (1989) v A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, ed. Matsudaria PT (Academie Press lne., New York, USA). Biologická analýza frakcí svědčí o tom, že za účinnost proti různým druhům z řádu motýlů jsou zodpovědné různé vegetativní insekticidní proteiny (VIP).
Účinnost proti Agrotis ipsilon je způsobena proteinem o molekulové hmotnosti 80 000 nebo/a proteinem o molekulové hmotnosti 35 000, podanými buď jednotlivě nebo v kombinaci. Tyto proteiny nejsou příbuzné žádným δ-endotoxineům z Bacillus thuringiensis, což dokazuje neexistence sekvenční homologie se známými sekvencemi δ-endotoxinů z Bacillus thuringiensis. Insekticidní protein vip3A(a) z kmene AB88 je přítomen hlavně (alespoň 75% z celkového množství) v supematantech kultur AB88.
Tyto proteiny se rovněž nenacházejí v δ-endotoxinovém krystalu AB8. N-koncové sekvence hlavních δ-endotoxinových proteinů byly srovnány sN-koncovými sekvencemi vegetativních insekticidních proteinů o molekulové hmotnosti 80 000 a 35 000 a nevykazují žádnou sekvenční homologii. N-koncová sekvence insekticidního proteinu vip3A(a) obsahuje řadu kladně nabitých zbytků (od Asn2 do Asn7) následovaných hydrofobní základní oblastí (od Thr8 do Ile34). na rozdíl od většiny známých sekrečních proteinů není insekticidní protein vip3A(a) z kmene AB88 v průběhu exportu upravován na N-konci.
Účinnost proti Ostrinia nubilalis je způsobena vegetativním insekticidním proteinem o molekulové hmotnosti 60 000 a účinnost proti Spodoptera frugiperda je způsobena vegetativním insekticidním proteinem neznámé velikosti.
-37CZ 290801 B6
Kmen Bacillus thuringiensis AB88 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research
Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria, Ilinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B21225.
Příklad 6
Izolace a biologická účinnost kmene Bacillus thuringiensis AB424.
Kmen Bacillus thuringiensis, označený AB424, byl izolován z mechem porostlé borové šišky pomocí standardních postupů známých v oboru. Subkultura AB424 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 1.
Biologická účinnost byla stanovena jak je popsáni v příkladu 2. Výsledky jsou následující:
testované druhy hmyzu procento mortality
Ostrinia nubilalis 100
Agrotis ipsilon 100
Diabrotica virgifera virgifera 0
Kmen AB424 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilionois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21439.
Příklad 7
Klonování genů VIP3A(a) a VIP3A(b), které kódují proteiny účinné proti Agrotis ipsilon
Celkové DNA z izolátů AB88 a AB424 byla izolována (Ausubel a kol. (1988), v: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York, USA)), rozštěpena restrikčními enzymy Xbal (knihovna Xbal-fragmentů velikostně frakcionovaných na 4,0 až 5,0 kb z DNA Bacillus thuringiensis AB88) respektive AcoRI (knihovna EcoRI-fragmentů velikostně frakcionovaných na 4,5 až 6,0 kb z DNA Bacillus thuringiensis AB424), ligována do vektoru pBluescript předem linearizovaného stejnými enzymy a defosforylovaného, a transformována do kmene Escherichia coli DH5a. Rekombinantní klony byly blotovány na nitrocelulózové filtry, které byly následně analyzovány za použití sondy, kterou byl 32P-značený oligonukleotid o délce 33 bází odpovídajících 11 N-koncovým aminokyselinám proteinu o molekulové hmotnosti 80 000 účinného proti Agrotis ipsilon. hybridizace byla prováděna při teplotě 42 °C v 2x SSC s 0,1 % dodecylsulfátu sodného (lxSSC = 0,15M chlorid sodný a 0,015M natrium-citrát, pH 7,4) po dobu 5 minut a dvakrát při teplotě 50 °C v lx SSC s 0,1 % dodecylsulfátu sodného po dobu 10 minut. Čtyři ze 400 rekombinantních klonů byly pozitivní. V biologických testech na hmyzu vykazovaly pozitivní rekombinanty srovnatelnou toxicitu pro larvy Agrotis ipsilon jako supematanty AB88 nebo AB424.
Plazmid pCIB7104 obsahuje Xbal-fragment z DNA AB88 o velikosti 4,5 kb. Byly zkonstruovány subklony pro stanovení oblasti kódující insekticidní protein.
Escherichia coli pCIB7105 byl zkonstruován klonováním fragmentu Xbal-AccI o velikosti 3,5 kb z pCIB7104 do vektoru pBluescript.
-38CZ 290801 B6
Plazmid pCIB7106 obsahoval Ecorl-fragment o velikosti 5,0 kb z DNA AB424. Tento fragment byl dáme rozštěpen HincII za vzniku inzertu EcoRI-HincII o velikosti 2,8 kb (pCIB7107), který stále kódoval funkční insekticidní protein.
Nukleotidová sekvence pCIB7104, pozitivního rekombinantního klon zAB88, a pCIB7107, pozitivního rekombinantního klonu z AB424, byla stanovena pomocí postup z využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5 463-5 467 (1977), za použití sekvenčních souprav PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenační soupravy PRISM Sequenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing Kit, a analyzována na automatickém sekvenátoru ABI 373.
Klon pCIB7104 obsahuje gen VIP3A(a), jehož kódující oblast je uvedena v sekvenci SEQ ID č. 1. Sekvence kódovaného proteinu je uvedena v SEQ ID č. 2. Syntetická verze kódující oblasti vytvořená tak, aby byla vysoce exprimována v oblasti vytvořená tak, aby byla vysoce exprimována v kukuřici, je uvedena v SEQ ID č. 3 (fúze mezi syntetickými a nativními sekvencemi je uvedena v SEQ ID č. 6). Na základě aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID č. 2 lze vytvořit libovolný počet syntetických genů.
Klon pCIB7107 obsahuje gen VIP3A(b), jehož kódující oblast je uvedena v sekvenci SEQ ID č. 4. Sekvence kódovaného proteinu je uvedena v SEQ ID č. 5.
Jak pCIB7104 tak pCIB7107 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21422 respektive B-21423.
Gen VIP3A(a) obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF), který sahá od nukleotidu 732 do nukleotidu 3105. Tento otevřený čtecí rámec kóduje peptid o délce 791 aminokyselin, s molekulovou hmotností odpovídající 88500 daltonům. Shine-Dalgamova sekvence (SD) je umístěna 6 bází před prvním methioninem a její sekvence svědčí o tom, že se jedná o silnou Shine-Dalgamovu sekvenci pro Bacillus.
Gen VIP3A(b) je z 98 % identický s VIP3A(a).
Při zkoumání blotů celkové DNA izolované z buněk Bacillus thuringiensis AB88 pomocí sondy, kterou je fragment o velikosti 33 bází odpovídající N-koncové oblasti insekticidního proteinu VIP3A, lze ve vzorcích štěpených různými restrikčními enzymy pozorovat jediné pásy. Tento výsledek byl potvrzen za použití větších sond odpovídajících kódující oblasti genu. Rešerší v databázi GenBank nebyla zjištěna žádná homologie se známými proteiny.
Příklad 8
Exprese insekticidních proteinů VIP3A
Časový průběh exprese insekticidního proteinu VIP3A(a) byl analyzován pomocí western blottingu. Vzorky kultur Bacillus thuringiensis AB88 byly odebírány během celé růstové křivky a sporulace. Insekticidní protein VIP3A(a) lze detekovat v supematantech kultur AB88 během logaritmické fáze, již 15 hodin po založení kultury. Jeho obsah dosahuje maximální hodnoty během počátečních stadií stacionární fáze a zůstává vysoký během sporulace a po ní. Podobných výsledků bylo dosaženi při použití supernatantů kultur Bacillus cereus AB424. Hladiny insekticidního proteinu VIP3A(a) odrážejí expresi genu VIP3A(a), jak se stanoví northem blottingem, Počátek sporulace byl stanoven přímým mikroskopickým pozorováním a analýzou přítomnosti δ-endotoxinů v buněčných peletách. Proteiny typu Cry-I lze detekovat v pozdních stadiích stacionární fáze, během sporulace a po ní.
-39CZ 290801 B6
Příklad 9
Identifikace nových genů podobných VIP3 pomocí hybridizace
Pro identifikaci kmenů Bacillus obsahujících geny příbuzné VIP3A(a) z izolátu AB88 byla pomocí hybridizace zkoumána sada izolátů Bacillus. Kultury 463 kmenů rodu Bacillus byly pěstovány v mikrotitračních jamkách až do sporulace. pro přenesení kultur na 150mm desky obsahující L-agar bylo použito zařízení s 96 hroty. Inokulované desky byly uchovávány při teplotě 30 °C přes noc. Kolonie byly přeneseny na nylonové filtry a analyzovány, kterou byl HindlII-fragment o velikosti 1,2 kb získaný z VIP3A(a). hybridizace byla prováděna přes noc při teplotě 62 °C za použití hybridizačních podmínek, které uvádějí Maniatis akol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982). Filtry byly promyty 2x SSC s 0,1 % dodecylsukfátu sodného (SDS) při teplotě 62 °C a exponovány na film citlivý na rentgenové záření.
Ze zkoumaných 463 kmenů rodu Bacillus obsahovalo 60 kmenů geny podobné VIP3, které bylo možné detekovat hybridizací. další charakterizací některých z nich (AB6 a AB426) se zjistilo, že jejich supematanty obsahují insekticidní proteiny podobné proteinu VIP3, účinné proti Agrotis ipsilon.
Příklad 10
Charakterizace kmene Bacillus thuringiensis M2194 obsahujícího kryptický gen podobný VIP3
O kmenu Bacillus thuringiensis, označeném M2194, bylo zjištěno, že obsahuje gen (nebo geny) podobné VIP3, pomocí kolonové hybridizace jak je popsána v příkladu 18C. Má se za to, že gen zM2194 podobný V1P3 je kryptický, jelikož během růstových fází bakterie nelze detekovat žádnou expresi, ať už pomocí imunoblotační analýzy za použití polyklonálních protilátek vytvořených proti proteinu VIP3A(a) izolovanému z AB88, nebo pomocí biologického testu, jak je popsán v příkladu 2.
Antisérum proti purifikovanému insekticidními proteinu VIP3A(a) bylo vytvořeno v králících, 50 pg proteinu navázaného na nitrocelulózu bylo rozpuštěno v dimethylsulfoxidu a emulgováno s Freundovým kompletním adjuvans (Difco). Dvěma králíkům byly dávány subkutánní injekce každý měsíc po dobu 3 měsíců. Byla jim odebrána krev 10 dnů po druhé a třetí injekci a ze vzorku krve bylo získáno sérum (Harlow a kol. (1988) v: Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, New York, USA)).
Gen zM2194 podobný VIP3 byl klonován do pKS za použití postupu popsaného v příkladu 3, čímž byl získán pCIB7108. Escherichia coli obsahující pCIB7108, který obsahuje gen VIP3 z M2194, byla účinná proti Agrotis ipsilon, což svědčí o tom, že tento gen kóduje funkční protein s insekticidní účinností. Plazmid pCIB7108 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRLB-21438.
Příklad 11
Insekticidní účinnost proteinů VIP3A
Spektrum účinnosti insekticidních proteinů VIP3A bylo kvalitně stanoveno v biologických testech na hmyzu, ve kterých larvy pozřely rekombinantní Escherichia coli nesoucí geny VIP A. V těchto testech byly buňky nesoucí geny VIP3A(a) a VIP3A(b) insekticidní pro Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea. Za stejných
-40CZ 290801 B6 pokusných podmínek nevykazovaly bakteriální extrakty obsahující proteiny VIP3A žádnou účinnost proti Ostmia nubilalis.
Účinek insekticidních proteinů VIP*A na larvy Agrotis ipsilon
materiál použitý pro test mortalita (v %)
TB-médium 5
supematant AB88 100
supematant AB424 100
pufr 7
Escherichia coli pKS 10
Escherichia coli pCIB7104 (AB88) 100
Escherichia coli pCIB7105 (AB88) 100
Escherichia coli pCIB7106 (AB424) 100
Escherichia coli pCIB7107 (AB424) 100
Účinek insekticidních proteinů VIP3A na larvy hmyzu z řádu motýlů
materiál použitý pro test hmyz mortalita (%)
Escherichia coli pKS AI 10
SF 5
SE 10
HV 8
HZ 10
ON 5
Escherichia coli pCIB7105
Escherichia coli pCIB7107 AI 100
SF 100
SE 100
HV 100
HZ 50
ON 10
Legenda:
AI = Agrotis ipsilon, SF = Spodoptera frugiperda, SE = Spodoptera exigua, HV = Heliothis virescens, HZ = Helicoverpa zea, ON = Ostrinia nubilalis
Příklad 12
Izolace a biologická účinnost jiných druhů Bacillus sp.
Byly izolovány další druhy rodu Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu proteiny s insekticidní účinností. Tyto kmeny byly izolovány ze vzorků jejich životního prostředí pomocí standardních postup. Byly připraveny izoláty pro biologické testy a byly testovány jak je popsáni v příkladech 1 respektive 2. Izoláty, které produkovaly v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny účinné v biologickém testu proti Agrotis ipsilon jsou uvedeny v tabulce níže. Nebyla pozorována žádná korelace mezi přítomností krystalu δ-endotoxinu a produkcí vegetativního insekticidního proteinu.
-41CZ 290801 B6
izolát Bacillus přítomnost krystalu δ-endotoxinu procento mortality
AB6 + 100
AB53 — 80
AB88 + 100
AB195 — 60
AB211 - 70
AB217 — 83
AB272 — 80
AB279 — 70
AB289 + 100
AB292 + 80
AB294 — 100
AB300 — 80
AB359 - 100
Izoláty AB289, AB294 a AB359 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collectin (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B21227, NRRL B-21229 respektive NRRL B-21226.
Izoláty Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny účinné proti Diabrotica virgifera virgifera jsou uvedeny v tabulce níže
izolát Bacillus přítomnost krystalu δ-endotoxinu procento mortality
AB52 — 50
AB59 - 71
AB68 + 60
AB78 - 10
AB122 — 57
AB218 - 64
AB256 - 64
Izoláty AB59 a AB256 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Notrhem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21228 respektive B-21230.
V patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collectin (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA byly uloženy následující kultury:
označení kmene číslo uložení datum uložení
1. Escherichia coli PL2 NRRL B-21221 9. března 1994
2. Escherichia coli PL2 NRRL B-2122IN 2. září 1994
3. Escherichia coli pCIB6022 NRRL B-21222 9. března 1994
4. Escherichia coli pCIB6023 NRRL B-21223 9. března 1994
5. Escherichia coli pCIB6022 NRRL B-21223N 2. září 1994
6. Bacillus thuringiensis HD73-78VIP NRRL B-21224 9. března 1994
7. Bacillus thuringiensis AB88 NRRL B-21225 9. března 1994
8. Bacillus thuringiensis AB359 NRLL B-21226 9. března 1994
9. Bacillus thuringiensis AB289 NRRL B-21227 9. března 1994
10. Bacillus sp. AB59 NRRL B-21228 9. března 1994
-42CZ 290801 B6 pokračování
označení kmene číslo uložení datum uložení
11. Bacillus sp. AB294 NRRL B-21229 9. března 1994
12. Bacillus sp. AB256 NRRLB-12130 9. března 1994
13. Escherichia coli P5-4 NRRL B-21059 18. března 1993
14. Escherichia coli P3-12 NRRL B-21061 18. března 1993
15. Bacillus cereus AB78 NRRL B-21058 18. března 1993
16. Bacillus thuringiensis AB6 NRRL B-21060 18. března 1993
17. Escherichia coli pCIB6202 NRRL B-21321 2. září 1994
18. Escherichia coli pCIB7100 NRRL B-21322 2. září 1994
19. Escherichia coli pCIB7101 NRRL B-21323 2. září 1994
20. Escherichia coli pCIB7102 NRRL B-21324 2. září 1994
21. Escherichia coli pCIB7103 NRRL B-21325 2. září 1994
22. Escherichia coli pCIB7104 NRRL B-21422 24. března 1995
23. Escherichia coli pCIB7107 NRRL B-21423 24. března 1995
24. Escherichia coli pCIB7108 NRRL B-2143 8 5. května 1995
25. Bacillus thuringiensis AB424 NRRL B-21439 5. května 1995
Ačkoliv byl vynález v příkladech výše popsán detailně z důvodů ilustrace a jasnosti, je zřejmé, že je možné provést určité změny a modifikace v rámci připojených nároků.
Zobrazení sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2378 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9..2375 (C) další informace: poznámka = „nativní DNA-sekvence kódující protein VIP3A(a) z AB88, jakje obsažena v pCIB7104“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:
-43CZ 290801 B6
AGATGAAC ATG AAC AAG AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACA AGA GCC TTA CCA 50
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro
10
AGT TTT ATT GAT TAT TTT AAT GGC ATT TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC 98
Ser 15 Phe lle Asp Tyr Phe 20 Asn Gly Tle Tyr Gly 25 Phe Ala Thr Gly lle 30
AAA GAC ATT ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACA GGT GGT GAT CTA 146
Lys Asp lle Met Asn Met lle Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu
35 40 45
ACC CTA GAC GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG TTA CTA AAT GAT ATT TCT 194
Thr Leu Asp Glu lle Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp lle Ser
50 55 60
GGT AAA TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG 242
Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn A$p Leu lle Ala Gin
65 70 75
GGA AAC TTA AAT ACA GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA AAA ATT GCA AAT 290
Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lle Leu Lys lle Ala Asn
80 85 90
GAA CAA AAT CAA GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA 338
Glu Gin Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lle
95 100 105 110
AAT ACG ATG CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT 386
Asn Thr Met Leu Arg Val iyr Leu Pro Lys lle Thr Ser Met Leu Ser
115 120 125
GAT GTA ATG AAA CAA AAT TAT GCG CTA AGT CTG CAA ATA GAA TAC TTA 434
Asp Val Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin lle Glu Tyr Leu
130 135 140
AGT AAA CAA TTG CAA GAG ATT TCT GAT AAG TTG GAT ATT ATT AAT GTA 482
Ser Lys Gin Leu Gin Glu lle Ser Asp Lys Leu Asp lle lle Asn Val
145 150 155
AAT GTA CTT ATT AAC TCT ACA CTT ACT GAA ATT ACA CCT GCG TAT CAA 530
Asn Val Leu lle Asn Ser Thr Leu Thr Glu lle Thr Pro Ala Tyr Gin
160 165 170
AGG ATT AAA TAT GTG AAC GAA AAA TTT GAG GAA TTA ACT TTT GCT ACA 578
Arg lle Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr
175 180 185 190
GAA ACT AGT TCA AAA GTA AAA AAG GAT GGC TCT CCT GCA GAT ATT CTT 626
Glu Thr Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp lle Leu
195 200 205
-44CZ 290801 B6
GAT GAG Asp Glu TTA ACT GAG Glu TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACA AAA AAT 674
Leu Thr 210 Leu Thr Glu Leu Ala 215 Lys Ser Val Thr 220 Lys Asn
GAT GTG GAT GGT TTT GAA TTT TAC CTT AAT ACA TTC CAC GAT GTA ATG 722
Asp Val Asp Gly 225 Phe Glu Phe Tyr 230 Leu Asn Thr Phe His 235 Asp Val Met
GTA GGA AAT AAT TTA TTC GGG CGT TCA GCT TTA AAA ACT GCA TCG GAA 770
Val Gly 240 Asn Asn Leu Phe Gly 245 Arg Ser Ala Leu Lys 250 Thr Ala Ser Glu
TTA ATT ACT AAA GAA AAT GTG AAA ACA AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT 818
Leu 255 Ile Thr Lys Glu Asn 260 Val Lys Thr Ser Gly 265 Ser Glu Val Gly Asn 270
GTT TAT AAC TTC TTA ATT GTA TTA ACA GCT CTG CAA GCC CAA GCT TTT 866
Val Tyr Asn Phe Leu 275 Ile Val Leu Thr Ala 280 Leu Gin Ala Gin Ala 285 Phe
CTT ACT TTA ACA ACA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT 914
Leu Thr Leu Thr 290 Thr cys Arg Lys Leu 295 Leu Gly Leu Ala Asp 300 Ile Asp
TAT ACT TCT ATT ATG AAT GAA CAT TTA AAT AAG GAA AAA GAG GAA TTT 962
Tyr Thr Ser 305 Ile Met Asn Glu His 310 Leu Asn Lys Glu Lys 315 Glu Glu Phe
AGA GTA AAC ATC CTC CCT ACA CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT 1010
Arg Val 320 Asn Ile Leu Pro Thr 325 Leu Ser Asn Thr Phe 330 Ser Asn Pro Asn
TAT GCA AAA GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA 1058
Tyr 335 Ala Lys Val Lys Gly 340 Ser Asp Glu Asp Ala 345 Lys Met Ile Val Glu 350
GCT AAA CCA GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA 1106
Ala Lys Pro Gly His 355 Ala Leu ile Gly Phe 360 Glu Ile Ser Asn Asp 365 Ser
ATT ACA GTA TTA AAA GTA TAT GAG GCT AAG CTA AAA CAA AAT TAT CAA 1154
Ile Thr Val Leu 370 Lys Val Tyr Glu Ala 375 Lys Leu Lys Gin Asn 380 Tyr Gin
GTC GAT AAG GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TAT GGT GAT ATG GAT AAA 1202
Val Asp Lys Asp 385 Ser Leu Ser Glu 390 Val Ile Tyr Gly Asp 395 Met Asp Lys
TTA TTG TGC CCA GAT CAA TCT GAA CAA ATC TAT TAT ACA AAT AAC ATA 1250
Leu Leu 400 Cys Pro Asp Gin Ser 405 Glu Gin Ile Tyr Tyr 410 Thr Asn Asn Ile
GTA TTT CCA AAT GAA TAT GTA ATT ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA 1298
Val 415 Phe Pro Asn Glu Tyr 420 Val ile Thr Lys Ile 425 ASp Phe Thr Lys Lys 430
-45CZ 290801 B6
ATG AAA ACT TTA AGA TAT GAG GTA ACA GCG AAT TTT TAT GAT TCT TCT 1346
Met Lys Thr Leu Arg 435 Tyr Glu Val Thr Ala Asn 440 Phe Tyr Asp Ser Ser 445
ACA GGA GAA ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG 1394
Thr Giy Glu Ile Asp 450 Leu Asn Lys Lys 455 Lys Val Glu Ser Ser 460 Glu Ala
GAG TAT AGA ACG TTA AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA 1442
Glu Tyr Arg 465 Thr Leu Ser Ala Asn 470 Asp Asp Gly Val Tyr 475 Met Pro Leu
GGT GTC ATC AGT GAA ACA TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT CTC 1490
Gly Val 480 Ile Ser Glu Thr Phe 485 Leu Thr Pro Ile Asn 490 Gly Phe Gly Leu
CAA GCT GAT GAA AAT TCA AGA TTA ATT ACT TTA ACA TGT AAA TCA TAT 1538
Gin 495 Ala Asp Glu Asn Ser 500 Arg Leu Ile Thr Leu 505 Thr Cys Lys Ser Tyr 510
TTA AGA GAA CTA CTG CTA GCA ACA GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA 1586
Leu Arg Glu Leu Leu 515 Leu Ala Thr Asp Leu 520 Ser Asn Lys Glu Thr 525 Lys
TTG ATC GTC CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG AAC GGG 1634
Leu ile Val Pro Pro 530 Ser Gly Phe Ile 535 Ser Asn Ile Val Glu 540 Asn Gly
TCC ATA GAA GAG GAC AAT TTA GAG CCG TGG AAA GCA AAT AAT AAG AAT 1682
Ser Ile Glu 545 Glu Asp Asn Leu Glu 550 Pro Trp Lys Ala Asn 555 Asn Lys Asn
GCG TAT GTA GAT CAT ACA GGC GGA GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT 1730
Ala Tyr 560 Val Asp His Thr Gly Gly 565 Val Asn Gly Thr 570 Lys Ala Leu Tyr
GTT CAT AAG GAC GGA GGA ATT TCA CAA TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA 1778
Val 575 His Lys Asp Gly Gly 580 Ile Ser Gin Phe Ile 585 Gly Asp Lys Leu Lys 590
CCG AAA ACT GAG TAT GTA ATC CAA TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT 1826
Pro Lys Thr Glu Tyr 595 Val Ile Gin Tyr Thr Val 600 Lys Gly Lys Pro 605 Ser
ATT CAT TTA AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACA 1874
Ile His Leu Lys Asp 610 Glu Asn Thr Gly 615 Tyr Ile His Tyr Glu 620 Asp Thr
AAT AAT AAT TTA GAA GAT TAT CAA ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACA 1922
Asn Asn Asn 625 Leu Glu Asp Tyr Gin Thr 630 Ile Asn Lys Arg 635 Phe Thr Thr
-46CZ 290801 B6
GGA ACT Gly Thr GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAA AAT GGA 1970
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu 645 Ile Leu Lys 650 Ser Gin Asn Gly
640
GAT GAA GCT TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT 2018
Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser
655 660 665 670
GAA AAG TTA TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACA AAT AAT TGG ACG AGT 2066
Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser
675 680 685
ACG GGA TCA ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACA CTC ACT CTT TAT CAG GGA 2114
Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly
690 695 700
GGA CGA GGG ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT TTT TCA ACT 2162
Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr
705 710 715
TAT AGA GTG TAT TTT TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA 2210
Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg
720 725 730
AAT TCT AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC GGT GCT AAA 2258
Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys
735 740 745 750
GAT GTT TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT AAC TTT TAT 2306
Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr
755 760 765
ATA GAG CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT 2354
Ile Glu Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His
770 775 780
TTT TAC GAT GTC TCT ATT AAG TAA 2378
Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
785
Informace o sekvence SEQ ID č. 2:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 789 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2:
-47CZ 290801 B6
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30 •
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin
85 90 95
Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
-48CZ 290801 B6
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Gin Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr 290 Thr Cys Arg Lys Leu 295 Leu Gly Leu Ala Asp 300 Ile Asp Tyr Thr
Ser 305 Ile Met Asn Glu His 310 Leu Asn Lys Glu Lys 315 Glu Glu Phe Arg Val 320
Asn Ile Leu Pro Thr 325 Leu Ser Asn Thr Phe 330 Ser Asn Pro Asn Tyr 335 Ala
Lys Val Lys Gly 340 Ser Asp Glu Asp Ala 345 Lys Met Ile Val Glu 350 Ala Lys
Pro Gly His 355 Ala Leu Ile Gly Phe 360 Glu Ile Ser Asn Asp 365 Ser Ile Thr
Vsi Leu 370 Lys Val Tyr Glu Ala 375 Lys Leu Lys Gin Asn 380 Tyr Gin Val Asp
Lvs 385 Asp Ser Leu Ser Glu 390 Val Ile Tyr Gly Asp 395 Met Asp Lys Leu Leu 400
Cys Pro Asp Gin Ser 405 Glu Gin Ile Tyr Tyr 410 Thr Asn Asn Ile Val 415 Phe
Pro Asn Glu Tyr 420 Val Ile Thr Lys Ile 425 Asp Phe Thr Lys Lys 430 Met Lys
Thr Leu Arg Tyr 435 Glu Val Thr Ala 440 Asn Phe Tyr Asp Ser 445 Ser Thr Gly
Glu Ile 450 Asp Leu Asn Lys Lys 455 Lys Val Glu Ser Ser 460 Glu Ala Glu Tyr
Arg 465 Thr Leu Ser Ala Asn 470 Asp Asp Gly Val Tyr 475 Met Pro Leu Gly Val 480
Ile Ser Glu Thr Phe 485 Leu Thr Pro Ile Asn 490 Gly Phe Gly Leu Gin Ala 495
Asp Glu Asn Ser 500 Arg Leu Ile Thr Leu 505 Thr Cys Lys Ser Tyr 510 Leu Arg
Glu Leu Leu 515 Leu Ala Thr Asp Leu 520 Ser Asn Lys Glu Thr 525 Lys Leu Ile
Val Pro 530 Pro Ser Gly Phe Ile 535 Ser Asn Ile Val Glu 540 Asn Gly Ser Ile
Glu 545 Glu Asp Asn Leu Glu 550 Pro Trp Lys Ala Asn 555 Asn Lys Asn Ala Tyr 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
-49CZ 290801 B6
Lys Asp Gly Gly Ile Ser 580 Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2403 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není
-50CZ 290801 B6 „DNA-sekvence kódující VIP3A(a) optimalizovaná (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 11..2389 (D) další informace: poznámka = pro kukuřici“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:
GGATCCACCA ATGAACATGA ACAAGAACAA
CTTCATCGAC TACTTCAACG GCATCTACGG
CATGATCTTC AAGACCGACA CCGGCGGCGA
GCAGCTGCTG AACGACATCA GCGGCAAGCT
GATCGCCCAG GGCÁACCTGA ACACCGAGCT
GCAGAACCAG GTGCTGAACG ACGTGAACAA
CGTGTACCTG CCGAAGATCA CCAGCATGCT
GAGCCTGCAG ATCGAGTACC TGAGCAAGCA
CATCAACGTG AACGTCCTGA TCAACAGCAC
CATCAAGTAC GTGAACGAGA AGTTCGAAGA
GGTGAAGAAG GACGGCAGCC CGGCCGACAT
GGCCAAGAGC GTGACCAAGA AOGACGTGGA
CGACGTGATG GTGGGCAAČA ACCTGTTCGG
GATCACCAAG GAGAACGTGA AGACCAGCGG
GATCGTGCTG ACCGCCCTGC AGGCCCAGGC
GCTGGGCCTG GCCGACATCG ACTACACCAG
CACCAAGCTG AGCACCCGCG CCCTGCCGAG 60 CTTCGCCACC GGCATCAAGG ACATCATGAA 120 CCTGACCCTG GACGAGATCC TGAAGAACCA 180 GGACGGCGTG AACGGCAGCC TGAACGACCT 240 GAGCAAGGAG ATCCTTAAGA TCGCCAACGA 300 CAAGCTGGAC GCCATCAACA CCATGCTGCG 360 GAGCGACGTG ATGAAGCAGA ACTACGCCCT 420 GCTGCAGGAG ATCAGCGACA AGCTGGACAT 480 CCTGACCGAG ATCACCCCGG CCTACCAGCG 540 GCTGACCTTC GCCACCGAGA CCAGCAGCAA 600 CCTGGACGAG CTGACCGAGC TGACCGAGCT 660 CGGCTTCGAG TTCTACCTGA ACACCTTCCA 720 CCGCAGCGCC CTGAAGACCG CCAGCGAGCT 780 CAGCGAGGTG GGCAACGTGT ACAACTTCCT 840 CTTCCTGACC CTGACCACCT GTCGCAAGCT 900 CATCATGAAC GAGCACTTGA ACAAGGAGAA 960
-51CZ 290801 B6
GGAGGAGTTC CGCGTGAACA TCCTGCCGftC CCTGAGCAAC ACCTTCAGCA ACCCGAACTA 1020
CGCCAAGGTG AAGGGCAGCG ACGAGGACGC CAAGATGATC GTGGAGGCTA AGCCGGGCCA1080
CGCGTTGATC GGCTTCGAGA TCAGCAACGA CAGCATCACC GTGCTGAAGG TGTAOGAGGC1140
CAAGCTGAAG CAGAACTACC AGGTGGACAA GGACAGCTTG AGCGAGGTGA TCTACGGCGA1200
CATGGACAAG CTGCTGTGTC CGGACCAGAG CGAGCAAATC TACTACACCA ACAACATCGT1260
GTTCCCGAAC GAGTACGTGA. TCACCAAGAT CGACTTCACC AAGAAGATGA AGACCCTGCG1320
CTACGAGGTG ACCGCCAACT TCTACGACAG CAGCACCGGC GAGATCGACC TGAACAAGAA1380
GAAGGTGGAG AGCAGCGAGG CCGAGTACCG CACCCTGAGC GCGAACGACG ACGGCGTCTA1440
CATGCCACTG GGCGTGATCA GCGAGACCTT CCTGACCCCG ATCAACGGCT TTGGCCTGCA1500
GGCCGACGAG AACAGCCGCC TGATCACCCT GACCTGTAAG AGCTACCTGC GCGAGCTGCT1560
GCTAGCCACC GACCTGAGCA ACAAGGAGAC CAAGCTGATC GTGCCACCGA GCGGCTTCAT1620
CAGCAACATC GTGGAGAACG GCAGCATCGA GGAGGACAAC CTGGAGCCGT GGAAGGCCAA1680
CAACAAGAAC GCCTACGTGG ACCACňCCGG CGGCGTGAAC GGCACCAAGG CCCTGTACGT1740
GCACAAGGAC GGCGGCATCA GCCAGTTCAT CGGCGACAAG CTGAAGCCGA AGACCGAGTA1800
CGTGATCCAG TACACCGTGA AGGGCAAGCC ATCGATTCAC CTGAAGGACG AGAACACCGG1860
CTACATCCAC TACGAGGACA CCAACAACAA CCTGGAGGAC TACCAGACCA TCAACAAGCG1920
CTTCACCACC GGCACCGACC TGAAGGGCGT GTACCTGATC CTGAAGAGCC AGAACGGCGA1980
CGAGGCCTGG GGCGACAACT TCATCATCCT GGAGATCAGC CCGAGCGAGA AGCTGCTGAG2040
CCCGGAGCTG ATCAACACCA ACAACTGGAC CAGCACCGGC AGCACCAACA TCAGCGGCAA2100
CACCCTGACC CTGTACCAGG GCGGCCGCGG CATCCTGAAG CAGAACCTGC AGCTGGACAG2160
CTTCAGCACC TACCGCGTGT ACTTCAGCGT GAGCGGCGAC GCCAACGTGC GCATCCGCAA2220
CAGCCGCGAG GTGCTGTTCG AGAAGAGGTA CATGAGCGGC GCCAAGGACG TGAGCGAGAT2280
GTTCACCACC AAGTTCGAGA AGGACAACTT CTACATCGAG CTGAGCCAGG GCAACAACCT2340
GTACGGCGGC CCGATCGTGC ACTTCTACGA CGTGAGCATC AAGTTAACGT AGAGCTCAGA2400
TCT2403
Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2612 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární
-52CZ 290801 B6 (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 118..2484 (D) další informace: poznámka = „nativní DNA-sekvence kódující VIP3A(b) z AB424“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:
ATTGAAATTG ATAAAAAGTT ATGAGTGTTT AATAATCAGT AATTACCAAT AAAGAATTAA 60
GAATACAAGT TTACAAGAAA TAAGTGTTAC AAAAAATAGC TGAAAAGGAA GATGAAC 117
ATG AAC AAG AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACA AGA GCC TTA CCA AGT TTT 165
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys. Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
790 795 800 805
ATT GAT TAT TTC AATGGC ATT TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC AAA GAC 213
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
810 815 820
ATT ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACA GGT GGT GAT CTA ACC CTA 261
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
825 830 835
GAC GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG CTA CTA AAT GAT ATT TCT GGT AAA 309
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
840 845 850
TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG GGA AAC 357
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly Asn
855 860 865
TTA AAT ACA GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA AAA ATT GCA AAT GAA CAA 405
Leu Asn Thr Glu Leu Šer Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin
870 875 880 885
AAT CAA GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA AAT ACG 453
-53CZ 290801 B6
Asn Gin Val Leu Asn 890 Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile 895 Asn Thr 900
ATG CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT GAT GTA 501
Met Leu Arg Val 905 Tyr Leu Pro Lys Ile 910 Thr Ser Met Leu Ser 915 Asp Val
ATG AAA CAA AAT TAT GCG CTA AGT CTG CAA ATA GAA TAC TTA AGT AAA 549
Met Lys Gin 920 Asn Tyr Ala Leu Ser 925 Leu Gin Ile Glu Tyr 930 Leu Ser Lys
CAA TTG CAA GAG ATT TCT GAT AAG TTG GAT ATT ATT AAT GTA AAT GTA 597
Gin Leu 935 Gin Glu Ile Ser Asp 940 Lys Leu Asp Ile Ile 945 Asn Val Asn Val
CTT ATT AAC TCT ACA CTT ACT GAA ATT ACA CCT GCG TAT CAA AGG ATT 645
Leu 950 Ile Asn Ser Thr Leu 955 Thr Glu Ile Thr Pro 960 Ala Tyr Gin Arg Ile 965
AAA TAT GTG AAC GAA AAA TTT GAG GAA TTA ACT TTT GCT ACA GAA ACT 693
Lys Tyr Val Asn Glu 970 Lys Phe Glu Glu Leu 975 Thr Phe Ala Thr Glu 980 Thr
AGT TCA AAA GTA AAA AAG GAT GGC TCT CCT GCA GAT ATT CGT GAT GAG 741
Ser Ser Lys Val 985 Lys Lys Asp Gly Ser 990 Pro Ala Asp Ile Arg 995 Asp Glu
TTA ACT GAG TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACA AAA AAT GAT GTG 789
Leu Thr Glu Leu 1000 Thr Glu Leu Ala Lys 1005 Ser Val Thr Lys Asn 1010 Asp Val
GAT GGT TTT GAA TTT TAC CTT AAT ACA TTC CAC GAT GTA ATG GTA GGA 837
Asp Gly Phe 1015 Glu Phe Tyr Leu Asn 1020 Thr Phe His Asp Val 1025 Met Val Gly
AAT AAT TTA TTC GGG CGT TCA GCT TTA AAA ACT GCA TCG GAA TTA ATT 885
Asn Asn 1030 Leu Phe Gly Arg Ser 1035 Ala Leu Lys Thr Ala 1040 Ser Glu Leu Ile 1045
ACT AAA GAA AAT GTG AAA ACA AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT GTT TAT 933
Thr Lys Glu Asn Val Lys 1050 Thr Ser Gly Ser Glu 1055 Val Gly Asn Val Tyr 1060
AAC TTC CTA ATT GTA TTA ACA GCT CTG CAA GCA AAA GCT TTT CTT ACT 981
Asn Phe Leu Ile Val 1065 Leu Thr Ala Leu Gin 1070 Ala Lys Ala Phe Leu 1075 Thr
TTA ACA CCA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT TAT ACT 1029
Leu Thr Pro Cys 1080 Arg Lys Leu Leu Gly 1085 Leu Ala Asp Ile Asp Tyr 1090 Thr
TCT ATT ATG AAT GAA CAT TTA AAT AAG GAA AAA GAG GAA TTT AGA GTA 1077
Ser Ile Met 1095 Asn Glu His Leu Asn Lys 1100 Glu LyS Glu Glu 1105 Phe Arg Val
-54CZ 290801 B6
AAC ATC CTC CCT Pro ACA CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT TAT GCA 1125
Asn Ile 1110 Leu Thr Leu Ser 1115 Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
1120 1125
AAA GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA GCT AAA 1173
Lys Val Lys Gly Ser A.sp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
1130 1135 1140
CCA GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA ATT ACA 1221
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
1145 1150 1155
GT.A TTA AAA. GTA TAT GAG GCT AAG CTA AAA CAA AAT TAT CAA GTC GAT 1269
Val Leu Lys Val Tvr Glu Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Val Asp
1150 1165 1170
AAG GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TA.T GGC GAT ATG GAT AAA TTA TTG 1317
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
117! 1180 1185
TGC CCA GA.T GAA TCT C-GA CAA ATC TAT TAT ACA AAT AAC ATA GTA TTT 1365
Cys Pro .Aso Gin Ser Gly Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
1190 1195 1200 1205
CCA AAT GAA. GTA £ <r*-' ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA ATG AAA 1413
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
1210 1215 1220
ACT TTA AGA TAT GAG GTA ACA GGG AAT TTT TAT GAT TCT TCT ACÁ GGA 1461
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Aso Ser Ser ΤΠΣ* Gly
1225 1230 1235
GAA ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG GAG TAT 1509
Glu Ile -Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
1240 1245 1250
AGA ACG TTA. AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA GGT GTC 1557
Arg 'Tb — Leu Ser Ala Asn .Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
125! 3 1260 1265
ATC AGT GAA ACA TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT GGC CTC CAA GCT 1605
Ile SeT Glu Thr Phe Leu Thr Pro ile Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala
1Z < \j 1275 1280 1285
GAT GAA AAT TCA AGA TT** ATT ACT TTA ACA TGT AAA TCA TAT TTA AGA 1653
Asp Glu As n Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
1290 1295 1300
GAA CTA CTG CTA GCA ACA GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA TTG ATC 1701
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
1305 1310 1315
GTC CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG AAC GGG TCC ATA 1749
val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
1320 1325 1330
-55CZ 290801 B6
GAA GAG GAC Glu Glu Asp 1335 AAT Asn TTA GAG CCG TGG AAA GCA AAT AAT AAG AAT GCG TAT 1797
Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
1340 1345
GTA GAT CAT ACA GGC GGA GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT GTT CAT 1845
Val Aso His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
1350 1355 1360 1365
AAG GAC GGA GGA ATT TCA CAA TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA CCG AAA 1893
Lys Asp Gly Gly lle Ser Gin Phe lle Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
1370 1375 1380
ACT GAG TAT GTA ATC CAA TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT ATT CAT 1941
Thr Glu Tyr Val lle Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser lle His
1385 1390 1395
TTA AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACA AAT AAT 1989
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lle His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
1400 1405 1410
AAT TTA GAA GAT TAT CAA ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACA GGA ACT 2037
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr lle Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
1415 1420 1425
GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAA AAT GGA GAT GAA 2085
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu lle Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu
1430 1435 1440 1445
GCT TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT GAA AAG 2133
Ala Trp Gly Asp Asn Phe lle lle Leu Glu lle Ser Pro Ser Glu Lys
1450 1455 1460
TTA TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACA AAT AAT TGG ACG AGT ACG GGA 2181
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Tle Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
1465 1470 1475
TCA ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACA CTC ACT CTT TAT CAG GGA GGA CGA 2229
Ser Thr Asn lle Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
1480 1485 1490
GGG ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT TTT TCA ACT TAT AGA 2277
Gly lle Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
1495 1500 1505
GTG TAT TTC TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA AAT TCT 2325
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg lle Arg Asn Ser
1510 1515 1520 1525
AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC GGT GCT AAA GAT GTT 2373
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
1530 1535 1540
TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT AAC TTC TAT ATA GAG 2421
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr lle Glu
-56CZ 290801 B6
1545
1550
1555
CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT ΤΊΤ TAC Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr 1560 1565 1570
GAT GTC TCT ATT AAG TAAGATCGGG ATCTAATATT AACAGTTTTT AGAAGCTAAT Asp Val Ser Ile Lys
1575
TCTTGTATAA TGTCCTTGAT TATGGAAAAA CACAATTTTG TTTGCTAAGA TGTATATATA
GCTCACTCAT TAAAAGGCAA TCAAGCTT
2469
2524
2584
2612
Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 789 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: protein (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin
85 90 95
Asn Gin Val Leu Asn Asp' Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn val Asn Val
145 150 155 160
-57CZ 290801 B6
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn 180 Glu Lys Phe Glu Glu 185 Leu Thr Phe Ala Thr 190 Glu Thr
Ser Ser Lys 195 Val Lys Lys Asp Gly 200 Ser Pro Ala Asp Ile 205 Arg Asp Glu
Leu Thr 210 Glu Leu Thr Glu Leu 215 Ala Lys Ser Val Thr 220 Lys Asn Asp Val
Asp Gly 225 Phe Glu Phe Tyr 230 Leu Asn Thr Phe His 235 Asp Val Met Val Gly 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg 245 Ser Ala Leu Lys 250 Thr Ala Ser Glu Leu 255 Ile
Thr Lys Glu Asn 260 Val Lys Thr Ser Gly 265 Ser Glu Val Gly Asn 270 Val Tyr
Asn Phe Leu 275 Ile Val Leu Thr Ala 280 Leu Gin Ala Lys Ala 285 Phe Leu Thr
Leu Thr 290 Pro Cys Arg Lys Leu 295 Leu Gly Leu Ala Asp 300 Ile Asp Tyr Thr
Ser 305 Ile Met Asn Glu His 310 Leu Asn Lys Glu Lys 315 Glu Glu Phe Arg Val 320
Asn Ile Leu Pro Thr 325 Leu Ser Asn Thr Phe 330 Ser Asn Pro Asn Tyr 335 Ala
Lys Val Lys Gly 340 Ser Asp Glu Asp Ala 345 Lys Met Ile Val Glu 350 Ala Lys
Pro Gly His 355 Ala Leu Ile Gly Phe 360 Glu Ile Ser Asn Asp 365 Ser Ile Thr
Val Leu 370 Lys Val Tyr Glu Ala 375 Lys Leu Lys Gin Asn 380 Tyr Gin Val Asp
Lys 385 Asp Ser Leu Ser Glu 390 Val Ile Tyr Gly Asp 395 Met Asp Lys Leu Leu 400
Cys Pro Asp Gin Ser 405 Gly Gin Ile Tyr Tyr 410 Thr Asn Asn Ile Val 415 Phe
Pro Asn Glu Tyr 420 Val Ile Thr Lys Ile 425 Asp Phe Thr Lys Lys 430 Met Lys
Thr Leu Arg 435 Tyr Glu Val Thr Ala 440 Asn Phe Tyr Asp Ser 445 Ser Thr Gly
-58CZ 290801 B6
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro •Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val Sis
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lvs Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Aso Glu
645 650 65*5
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Are
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
-59CZ 290801 B6
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2444 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 17..2444 (D) další informace: produkt = „fúze 3A(a) syntetickýmaivní“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:
GGATOCACCA ATGAAC ATG AAC AAG AAC AAC ACC AAG CTG AGC ACC CGC49
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg 1510
GCC CTG CCG AGC TTC ATC GAC TAC TTC AAC GGC ATC TAC GGC TTC GCC97
Ala Leu Pro Sex Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly PheAla
2025
ACC GGC ATC AAG GAC ATC ATG AAC ATG ATC TTC AAG ACC GAC ACC GGC145
Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp ThrGly
3540
-60CZ 290801 B6
GGC GAC CTG ACC CTG GAC GAG ATC CTG AAG AAC CAG CAG CTG CTG AAC 193
Gly Asp Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn
45 50 55
GAC ATC AGC GGC AAG CTG GAC GGC GTG AAC GGC AGC CTG AAC GAC CTG 241
Asp Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu
60 65 70 75
ATC GCC CAG GGC AAC CTG AAC ACC GAG CTG AGC AAG GAG ATC CTT AAG 289
Ile Ala Gin Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys
80 85 90
ATC GCC AAC GAG CAG AAC CAG GTG CTG AAC GAC GTG AAC AAC AAG CTG 337
Ile Ala Asn Glu Gin Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu
95 100 105
GAC GCC ATC AAC ACC ATG CTG CGC GTG TAC CTG CCG AAG ATC ACC AGC 385
Asp Ala ile Asn Thr Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser
110 115 120
ATG CTG Met Leu 125 AGC Ser GAC GTG Asp Val ATG Met AAG CAG AAC TAC GCC CTG AGC CTG CAG ATC 433
Lys Gin 130 Asn Tyr Ala Leu 135 Ser Leu Gin Ile
GAG TAC CTG AGC AAG CAG CTG CAG GAG ATC AGC GAC AAG CTG GAC ATC 481
Glu 140 Tyr Leu Ser Lys Gin 145 Leu Gin Glu Ile Ser 150 Asp Lys Leu Asp Ile 155
ATC AAC GTG AAC GTC CTG ATC AAC AGC ACC CTG ACC GAG ATC ACC CCG 529
Ile Asn Val Asn Val 160 Leu Ile Asn Ser Thr 165 Leu Thr Glu Ile Thr 170 Pro
GCC TAC CAG CGC ATC AAG TAC GTG AAC GAG AAG TTC GAA GAG CTG ACC 577
Ala Tyr Gin Arg 175 Ile Lys Tyr Val Asn 180 Glu Lys Phe Glu Glu 185 Leu Thr
TTC GCC ACC GAG ACC AGC AGC AAG GTG AAG AAG GAC GGC AGC CCG GCC 625
Phe Ala Thr 190 Glu Thr Ser Ser Lys 195 Val Lys Lys Asp Gly 200 Ser Pro Ala
GAC ATC CTG GAC GAG CTG ACC GAG CTG ACC GAG CTG GCC AAG AGC GTG 673
Asp Ile 205 Leu Asp Glu Leu Thr 210 Glu Leu Thr Glu Leu 215 Ala Lys Ser Val
ACC AAG AAC GAC GTG GAC GGC TTC GAG TTC TAC CTG AAC ACC TTC CAC 721
Thr 220 Lys Asn Asp Val Asp Gly 225 Phe Glu Phe Tyr 230 Leu Asn Thr Phe His 235
GAC GTG ATG GTG GGC AAC AAC CTG TTC GGC CGC AGC GCC CTG AAG ACC 769
Asp Val Met Val Gly 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg 245 Ser Ala Leu Lys 250 Thr
GCC AGC GAG CTG ATC ACC AAG GAG AAC GTG AAG ACC AGC GGC AGC GAG 817
Ala Ser Glu Leu 255 Ile Thr Lys Glu Asn 260 Val Lys Thr Ser Gly 265 Ser Glu
GTG rn*» AAC GTG TAC AAC TTC CTG ATC GTG CTG ACC GCC CTG CAG GCC 865
Val Gly Asn 270 Val Tyr Asn Phe Leu 275 Ile Val Leu Thr Ala 280 Leu Gin Ala
CAG GCC TTC CTG ACC CTG ACC ACC TGT CGC AAG CTG CTG GGC CTG GCC 913
Gin Ala 285 Phe Leu Thr Leu Thr 290 Thr cys Arg Lys Leu 295 Leu Gly Leu Ala
GAC ATC GAC TAC ACC AGC ATC ATG AAC GAG CAC TTG AAC AAG GAG AAG 961
Asp 300 Ile Asp Tyr Thr Ser 305 Ile Met Asn Glu His 310 Leu Asn Lys Glu Lys 315
GAG GAG TTC CGC GTG AAC ATC CTG CCG ACC CTG AGC AAC ACC TTC AGC 1009
Glu Glu Phe Arg Val 320 Asn Ile Leu Pro Thr 325 Leu Ser Asn Thr Phe 330 Ser
AAC CCG AAC TAC GCC AAG GTG AAG GGC AGC GAC GAG GAC GCC AAG ATG 1057
Asn Pro Asn Tyr 335 Ala Lys Val Lys Gly 340 Ser Asp Glu Asp Ala 345 Lys Met
-62CZ 290801 B6
ATC GTG GAG GCT AAG CCG GGC CAC GCG TTG ATC GGC TTC GAG ATC AGC 1105
Ile Val Glu 350 Ala Lys Pro Gly His 355 Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser 360
AAC GAC AGC ATC ACC GTG CTG AAG GTG TAC GAG GCC AAG CTG AAG CAG 1153
Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin
365 370 375
AAC TAC CAG GTG GAC AAG GAC AGC TTG AGC GAG GTG ATC TAC GGC GAC 1201
Asn Tyr Gin Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp
380 385 390 395
ATG GAC AAG CTG CTG TGT CCG GAC CAG AGC GAG CAA ATC TAC TAC ACC 1249
Met Asp Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr
400 405 410
AAC AAC ATC GTG TTC CCG AAC GAG TAC GTG ATC ACC AAG ATC GAC TTC 1297
Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val· Ile Thr Lys Ile Asp Phe
415 420 425
ACC AAG AAG ATG AAG ACC CTG CGC TAC GAG GTG ACC GCC AAC TTC TAC 1345
Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr
430 435 440
GAC AGC AGC ACC GGC GAG ATC GAC CTG AAC AAG AAG AAG GTG GAG AGC 1393
Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser
445 450 455
AGC GAG GCC GAG TAC CGC ACC CTG AGC GCG AAC GAC GAC GGC GTC TAC 1441
Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr
460 465 470 475
ATG CCA CTG GGC GTG ATC AGC GAG ACC TTC CTG ACC CCG ATC AAC GGC 1489
Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly
480 485 490
TTT GGC CTG CAG GCC GAC GAG AAC AGC CGC CTG ATC ACC CTG ACC TGT 1537
Phe Gly Leu Gin Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys
495 500 505
AAG AGC TAC CTG CGC GAG CTG CTG CTA GCC ACC GAC CTG AGC AAC AAG 1585
Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys
510 515 520
GAG ACC AAG CTG ATC GTG CCA CCG AGC GGC TTC ATC AGC AAC ATC GTG 1633
Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val
525 530 535
GAG AAC GGC AGC ATC GAG GAG GAC AAC CTG GAG CCG TGG AAG GCC AAC 1681
Glu Ajn Gly Ser Ile Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn
540 545 550 555
AAC AAG AAC GCC TAC GTG GAC CAC ACC GGC GGC GTG AAC GGC ACC AAG 1729
Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys
560 565 570
GCC CTG TAC GTG CAC AAG GAC GGC GGC ATC AGC CAG TTC ATC GGC GAC 1777
Ala Leu Tyr Val His Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp
575 580 585
-63CZ 290801 B6
AAG CTG AAG CCG AAG ACC GAG TAC GTG ATC CAG TAC ACC GTG AAG GGC 1825
Lys Leu Lys 590 Pro Lys Thr Glu Tyr Val Ile 595 Gin Tyr Thr 600 Val Lys Gly
AAG CCA TCG ATT CAC CTG AAG GAC GAG AAC ACC GGC TAC ATC CAC TAC 1873
Lys Pro 605 Ser Ile His Leu Lys 610 Asp Glu Asn Thr Gly 615 Tyr Ile His Tyr
GAG GAC ACC AAC AAC AAC CTG GAG GAC TAC CAG ACC ATC AAC AAG CGC 1921
Glu 620 Asp Thr Asn Asn Asn 625 Leu Glu Asp Tyr Gin 630 Thr Ile Asn Lys Arg 635
TTC ACC ACC GGC ACC GAC CTG AAG GGC GTG TAC CTG ATC CTG AAG AGC 1969
Phe Thr Thr Gly Thr 640 Asp Leu Lys Gly Val 645 Tyr Leu Ile Leu Lys 650 Ser
CAG AAC GGC GAC GAG GCC TGG GGC GAC AAC TTC ATC ATC CTG GAG ATC 2017
Gin Asn Gly Asp 655 Glu Ala Trp Gly Asp 660 Asn Phe Ile Ile Leu 665 Glu Ile
AGC CCG AGC GAG AAG CTG CTG AGC CCG GAG CTG ATC AAC ACC AAC AAC 2065
Ser Pro Ser 670 Glu Lys Leu Leu Ser 675 Pro Glu Leu Ile Asn 680 Thr Asn Asn
TGG ACC AGC ACC GGC AGC ACC AAC ATC AGC GGC AAC ACC CTG ACC CTG 2113
Trp Thr 685 Ser Thr Gly Ser Thr 690 Asn Ile Ser Gly Asn 695 Thr Leu Thr Leu
TAC CAG GGC GGC CGG GGG ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT 2161
Tyr 700 Gin Gly Gly Arg Gly 705 Ile Leu Lys Gin Asn 710 Leu Gin Leu Asp Ser 715
TTT TCA ACT TAT AGA GTG TAT TTT TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA 2209
Phe Ser Thr Tyr Arg 720 Val Tyr Phe Ser Val 725 Ser Gly Asp Ala Asn 730 Val
AGG ΑΊΤ AGA AAT TCT AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC 2257
Arg Ile Arg Asn 735 Ser Arg Glu Val Leu 740 Phe Glu Lys Arg Tyr 745 Met Ser
GGT GCT AAA GAT GTT TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT 2305
Gly Ala Lys Asp 750 Val Ser Glu Met 755 Phe Thr Thr Lys Phe 760 Glu Lys Asp
AAC TTT TAT ATA GAG CTT tct CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT 2353
Asn Phe 765 Tyr ile Glu Leu Ser 770 Gin Gly Asn Asn Leu 775 Tyr Gly Gly Pro
ATT GTA CAT TTT TAC GAT GTC TCT ATT AAG NAA GAT CGG GAT CTA ATA 2401
Ile 780 Val His Phe Tyr Asp 785 Val Ser Ile Lys Xaa 790 Asp Arg Asp Leu Ile 795
TTA ACA Leu Thr GTT Val TTT Phe AAA Lys 800 AGC Ser NAA Xaa TTC Phe TTG Leu TAT AAT Tyr Asn 805 GTC CTT GAT Val Leu Asp T 2444
-64CZ 290801 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:
(i) charakteristiky sekvence;
(A) délka: 809 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID
Met 1 Asn Lys Asn Asn 5 Thr
Ile Asp Tyr Phe 20 Asn Gly
Ile Met Asn 35 Met Ile Phe
Asp Glu 50 Ile Leu Lys Asn
Leu 65 Asp Gly Val Asn Gly 70
Leu Asn Thr Glu Leu 85 Ser
Asn Gin Val Leu 100 Asn Asp
Met Leu Arg 115 Val Tyr Leu
Met Lys 130 Gin Asn Tyr Ala
Gin 145 Leu Gin Glu Ile Ser 150
Leu Ile Asn Ser Thr 165 Leu
Lys Ttyr Val Asn 180 Glu Lys
Ser Ser Lys 195 Val Lys Lys
Leu Thr Glu Leu Thr Glu
Leu Ser Thr 10 Arg Ala Leu Pro Ser 15 Phe
Tyr Gly 25 Phe Ala Thr Gly Ile 30 Lys Asp
Thr 40 Asp Thr Gly Gly Asp 45 Leu Thr Leu
Gin Leu Leu Asn Asp 60 Ile Ser Gly Lys
Leu Asn A^p Leu 75 Ile Ala Gin Gly Asn 80
Glu Ile Leu 90 Lys Ile Ala Asn Glu 95 Gin
Asn Asn 105 Lys Leu Asp Ala Ile 110 Asn Thr
Lys 120 Ile Thr Ser Met Leu 125 Ser Asp Val
Ser Leu Gin Ile Glu 140 Tyr Leu Ser Lys
Lys Leu Asp Ile 155 Ile Asn Val Asn Val 160
Glu Ile Thr 170 Pro Ala Tyr Gin Arg 175 Ile
Glu Glu 185 Leu Thr Phe Ala Thr 190 Glu Thr
Gly 200 Ser Pro Ala Asp Ile 205 Leu Asp Glu
Ala Lys Ser Val Thr 220 Lys Asn Asp Val
210
-65CZ 290801 B6
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Gin Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tvr Glu Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly ASD Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tvr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
-66CZ 290801 B6
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu iyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp iyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu LyS Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys Xaa Asp Arg Asp Leu Ile Leu Thr Val Phe Lvs
785 790 795 800
Ser Xaa Phe Leu Tyr Asn Val Leu Asp

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula DNA, která kóduje pesticidní protein izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, nebo varianty a fragmenty tohoto proteinu zachovávající si pesticidní účinnost, kterýžto protein je izolovatelný z kapalného kultivačního média a kterýžto protein je kódován nukleotidovou sekvencí hybridizující s nukleotidovou sekvencí SEQ ID č. 1, 3 nebo 4 při 65 °C vpufru obsahujícím 7% dodecylsulfátu sodného a fosforečnan sodný v 0,5M koncentraci, nebo kterýžto protein cross-reaguje s protilátkami vytvořenými proti proteinům ze SEQ ID č. 2 nebo 5.
  2. 2. Molekula DNA podle nároku 1, která kóduje protein definovaný SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 2, SEQ ID č. 4, SEQ ID č. 5, SEQ ID č. 6 a SEQ ID č. 7.
  3. 3. Molekula DNA podle nároku 2, která má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 4 nebo SEQ ID č. 6.
  4. 4. Molekula DNA podle nároku 1, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která byla zcela nebo zčásti optimalizována pro expresi v rostlině za použití kodónů preferovaných rostlinou.
  5. 5. Molekula DNA podle nároku 4, která má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 3 nebo SEQ ID č. 6.
  6. 6. Molekula DNA podle nároku 1, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která byla zcela nebo zčásti optimalizována pro expresi v mikroorganismu za použití kodónů preferovaných hostitelem.
  7. 7. Molekula DNA podle nároku 1, kterou lze získat způsobem zahrnujícím (a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pesticidní protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou získatelnou z molekuly DNA definované v SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 4 nebo SEQ ID č. 6, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
  8. 8. Expresivní kazeta, která obsahuje molekulu DNA podle libovolného znátoků 1 až 7, operabilně spojenou s rostlinnými expresivními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.
  9. 9. Expresivní kazeta podle nároku 8, kde je uvedeným hostitelským organismem rostlina.
  10. 10. Vektorová molekula, která obsahuje expresivní kazetu podle nároku 8.
  11. 11. Pesticidní protein kódovaný molekulou DNA podle nároku 1.
  12. 12. Pesticidní protein podle nároku 11, který má molekulovou hmotnost 60 000 až 100 000.
  13. 13. Pesticidní protein podle nároku 12, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 2 nebo SEQ ID č. 5.
  14. 14. Pesticidní protein podle nároku 11, který je izolovaný v průběhu fáze vegetativního růstu z Bacillus thuringiensis AB88 uloženého pod přírůstkovým číslem NRRL B-21225, nebo z Bacillus thuringiensis AB424 uloženého pod přírůstkovým číslem NRRL B-21439.
    -68CZ 290801 B6
  15. 15. Hostitelský organismus, který obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 1 až 7, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.
  16. 16. Hostitelský organismus podle nároku 15, který je vybrán ze skupiny zahrnující buňky rostlin a hmyzu, bakterie, kvasinky, baculoviry, prvoky, hlísty a řasy.
  17. 17. Hostitelský organismus podle nároku 15, kterým je mikroorganismus transformovaný expresivní kazetou podle libovolného z nároků 8 nebo 9 nebo vektorovou molekulou podle nároku 10, přičemž tímto mikroorganismem je výhodně mikroorganismus, který se množí na rostlinách.
  18. 18. Hostitelský organismus podle nároku 17, kde mikroorganismem je bakterie kolonizující kořeny nebo kmen rodu Pseudomonas.
  19. 19. Hostitelský organismus podle nároku 17, kde mikroorganismem je Bacillus thuringiensis AB88 uložený pod přírůstkovým číslem NRRL B-21225, nebo Bacillus thuringiensis AB424 uložený pod přírůstkovým číslem NRRL B-21439.
  20. 20. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, stabilně transformovaná molekulou DNA podle libovolného z nároků 1 až 7 nebo expresivní kazetou podle nároku 9.
  21. 21. Rostlina podle nároku 20, která exprimuje pesticidní protein podle nároku 11.
  22. 22. Rostlina podle nároku 21, která dále exprimuje druhou odlišnou látku kontrolující hmyz, jako δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis.
  23. 23. Rostlina podle libovolného z nároků 20 až 22, vybraná ze skupiny zahrnující kukuřici, čirok, pšenici, slunečnici, bavlník, rýži, sóju, ječmen a řepku olejku.
  24. 24. Rostlina podle nároku 23, kterou je rostlina kukuřice.
  25. 25. Rostlina podle nároku 23, kterou je rostlina bavlníku.
  26. 26. Rostlina podle libovolného z nároků 20 až 25, kterou je hybridní rostlina.
  27. 27. Semeno rostliny podle libovolného z nároků 20 až 25, které je ošetřeno obalem chránícím semena.
  28. 28. Způsob izolace molekuly DNA podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m , že zahrnuje (a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pesticidní protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou získatelnou z molekuly DNA definované v SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 4 nebo SEQ ID č. 6, a (c) izolaci hybridizované DNA.
  29. 29. Způsob zvýšení rozsahu spektra insekticidního účinku k cílovému hmyzu, vyznačující se t í m , že se v rostlině exprimuje expresivní kazeta podle nároku 8, v kombinaci s alespoň jedním druhým insekticidním proteinem, který se liší od pesticidního proteinu kódovaného touto expresivní kazetou.
    -69CZ 290801 B6
  30. 30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že uvedený druhý insekticidní protein je vybrán ze skupiny zahrnující δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis, inhibitory proteáz, lektiny, α-amylázy a peroxidázy.
  31. 31. Způsob ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, vyznačující se tím , že se pěstuje rostlina transgenická pokud jde o molekulu DNA kódující pesticidní protein, která hybridizuje za mírně přísných podmínek s oligonukleotidovou sondou získanou z molekuly DNA definované v SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 4 nebo SEQ ID č. 6 podle nároku 1, a exprimující tento pesticidní protein.
  32. 32. Způsob vytvoření rostliny nebo rostlinné buňky exprimující pesticidní protein, vyznačující se tím, že se tato rostlina nebo rostlinná buňka transformuje expresivní kazetou podle nároku 9 nebo vektorovou molekulou podle nároku 10.
CZ1997908A 1994-09-28 1995-09-27 Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují CZ290801B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31459494A 1994-09-28 1994-09-28
US08/463,483 US5849870A (en) 1993-03-25 1995-06-05 Pesticidal proteins and strains

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ90897A3 CZ90897A3 (cs) 2000-02-16
CZ290801B6 true CZ290801B6 (cs) 2002-10-16

Family

ID=26979445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1997908A CZ290801B6 (cs) 1994-09-28 1995-09-27 Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují

Country Status (24)

Country Link
US (9) US5849870A (cs)
EP (3) EP0792363B2 (cs)
JP (1) JPH10506532A (cs)
KR (1) KR100419438B1 (cs)
CN (1) CN1255539C (cs)
AT (1) ATE256743T1 (cs)
AU (1) AU692934B2 (cs)
BG (1) BG101384A (cs)
BR (1) BR9509099A (cs)
CA (1) CA2199049C (cs)
CZ (1) CZ290801B6 (cs)
DE (1) DE69532333T3 (cs)
DK (1) DK0792363T4 (cs)
ES (1) ES2213162T5 (cs)
HU (1) HU222264B1 (cs)
IL (2) IL115382A (cs)
MX (1) MX228013B (cs)
PH (2) PH11995051386B1 (cs)
PT (1) PT792363E (cs)
RO (1) RO119835B1 (cs)
RU (1) RU2196824C2 (cs)
SI (1) SI0792363T2 (cs)
TR (1) TR199501182A2 (cs)
WO (1) WO1996010083A1 (cs)

Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406690B1 (en) * 1995-04-17 2002-06-18 Minrav Industries Ltd. Bacillus firmus CNCM I-1582 or Bacillus cereus CNCM I-1562 for controlling nematodes
GB9600786D0 (en) * 1996-01-15 1996-03-20 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US6677135B1 (en) * 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
GB9611777D0 (en) * 1996-06-06 1996-08-07 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
KR20000022459A (ko) * 1996-07-01 2000-04-25 칼튼 제이. 에이블 밤나방과 해충에 대해 활성적인 바실루스 츄린겐시스 독소
US6369213B1 (en) 1996-07-01 2002-04-09 Mycogen Corporation Toxins active against pests
US6242669B1 (en) * 1996-10-30 2001-06-05 Mycogen Corporation Pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US6603063B1 (en) * 1999-05-07 2003-08-05 Mycogen Corp. Plants and cells transformed with a nucleic acid from Bacillus thuringiensis strain KB59A4-6 encoding a novel SUP toxin
AU5098398A (en) * 1996-10-30 1998-05-22 Mycogen Corporation Novel pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US7129212B2 (en) * 1996-10-30 2006-10-31 Mycogen Corporation Polynucleotides, pesticidal proteins, and novel methods of using them
US6002068A (en) * 1996-12-19 1999-12-14 Novartis Finance Corporation Methods for conferring insect resistance to a monocot using a perioxidase coding sequence
EP0973944A1 (en) 1997-03-31 2000-01-26 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the gastrointestinal tract
IL132039A0 (en) * 1997-04-03 2001-03-19 Novartis Ag Plant pest control
US6103228A (en) 1997-05-09 2000-08-15 Agraquest, Inc. Compositions and methods for controlling plant pests
PL198772B1 (pl) * 1997-05-09 2008-07-31 Agraquest Biologicznie czysta kultura Bacillus subtilis, jej metabolit i supernatant z hodowli szczepu, kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, sposób ochrony lub leczenia roślin i owoców, agrastatyny, sposób izolowania supernatantu o aktywności owadobójczej
ES2229513T3 (es) * 1997-06-04 2005-04-16 Syngenta Participations Ag Sistema de rastreo de plaguicidas.
US6027723A (en) * 1997-08-22 2000-02-22 Agraquest, Inc. Rhodococcus globerulus strain for controlling corn rootworm
US5906818A (en) * 1997-08-22 1999-05-25 Agraquest, Inc. Bacillus mycoides strain for controlling corn rootworm
US6015553A (en) * 1997-08-22 2000-01-18 Agraquest, Inc. Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests
US6001637A (en) * 1997-08-22 1999-12-14 Agraquest, Inc. Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworm infestations
GB9725556D0 (en) * 1997-12-03 1998-02-04 Ciba Geigy Ag Organic compounds
US6972350B1 (en) 1998-07-15 2005-12-06 The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Pest-resistant plants comprising a construct encoding a vacuole targeting sequence and avidin or streptavidin
AR020141A1 (es) * 1998-08-10 2002-04-10 Mycogen Corp Toxinas y genes pesticidas de cepas de bacillus laterosporus
US6468523B1 (en) * 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
AUPP841199A0 (en) * 1999-02-02 1999-02-25 Pinnock, Professor Dudley Edwin Control of mange
US6245551B1 (en) 1999-03-30 2001-06-12 Agraquest, Inc. Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi
HUP0200562A2 (en) 1999-03-30 2002-06-29 Agraquest Inc A strain of baccilus pumilus for controlling plant diseases
GB9909796D0 (en) * 1999-04-28 1999-06-23 Plant Bioscience Ltd Pesticidal fumes
US6706860B2 (en) 2000-05-18 2004-03-16 Bayer Bioscience N.V. Toxins
US7091399B2 (en) * 2000-05-18 2006-08-15 Bayer Bioscience N.V. Transgenic plants expressing insecticidal proteins and methods of producing the same
US7390458B2 (en) * 2000-10-13 2008-06-24 Irm Llc High throughput processing system and method of using
EP1988099B1 (en) * 2001-01-09 2012-11-14 Bayer CropScience NV Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
US7711002B2 (en) * 2001-06-26 2010-05-04 Link Us All, Llc Transcoding SMS-based streamed messages to SIP-based IP signals in wireless and wireline networks
US20030110840A1 (en) * 2001-07-24 2003-06-19 Arriaga Edgar A. Systems and methods for detecting a particle
ATE539084T1 (de) 2001-11-07 2012-01-15 Syngenta Participations Ag Promotoren zur regulierung der genexpression in pflanzenwurzeln
US6589524B1 (en) 2002-02-07 2003-07-08 Ecomicrobials, Llc Strains of Bacillus for biological control of pathogenic fungi
CN101508725B (zh) * 2002-03-22 2013-08-07 拜尔作物科学公司 新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质
MXPA04009206A (es) * 2002-03-22 2004-11-26 Bayer Bioscience Nv Nuevas proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis.
MXPA04012647A (es) * 2002-06-26 2005-03-23 Du Pont Genes que codifican proteinas con actividad pesticida.
US7462760B2 (en) * 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
US7205454B2 (en) 2002-07-31 2007-04-17 Bayer Bioscience N.V. Corn root preferential promoters and uses thereof
GB0225129D0 (en) 2002-10-29 2002-12-11 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
US20040220268A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Yoe-Sik Bae Compound that directly stimulates phospholipase C activity
CA2531400A1 (en) * 2003-07-07 2005-03-03 Monsanto Technology, Llc Insecticidal proteins secreted from bacillus thuringiensis and uses therefor
US7718415B1 (en) * 2003-09-23 2010-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Acetyl esterase producing strains and methods of using same
AU2004295386A1 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Syngenta Participations Ag Insect resistant cotton plants and methods of detecting the same
ATE487372T1 (de) 2003-12-16 2010-11-15 Monsanto Technology Llc Sekretiertes protein und genzusammensetzungen aus bacillus thuringiensis und deren verwendungen
RU2286385C2 (ru) * 2004-11-23 2006-10-27 Центр "Биоинженерия" Ран РЕКОМБИНАНТНАЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯ УНИКАЛЬНЫЙ ТРАНСФОРМАЦИОННЫЙ АКТ МЕЖДУ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ГЕН cryIIIa, И ГЕНОМНОЙ ДНК КАРТОФЕЛЯ СОРТА ЕЛИЗАВЕТА, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И СОДЕРЖАЩИЕ ЭТУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТКА, ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ И ЕГО ПОТОМСТВО
RU2277586C2 (ru) * 2004-12-30 2006-06-10 Александр Константинович Гапоненко Способ создания растений пшеницы, устойчивой к клопу-вредной черепашке (eurygaster integryceps puton)
RU2286386C1 (ru) * 2005-02-14 2006-10-27 Центр "Биоинженерия" Ран РЕКОМБИНАНТНАЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯ УНИКАЛЬНЫЙ ТРАНСФОРМАЦИОННЫЙ АКТ МЕЖДУ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ГЕН cryIIIa, И ГЕНОМНОЙ ДНК КАРТОФЕЛЯ СОРТА НЕВСКИЙ, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И СОДЕРЖАЩИЕ ЭТУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТКА, ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ И ЕГО ПОТОМСТВО
AU2006221823B2 (en) 2005-03-11 2011-06-09 Syngenta Limited Rodent pest control
AU2006225065B2 (en) * 2005-03-14 2012-08-16 Ectotec Pty Ltd Control of sucking lice
US9393274B2 (en) * 2005-03-14 2016-07-19 Ectotec Pty Ltd Control of sucking lice
BRPI0613111A2 (pt) 2005-07-08 2010-12-21 Univ Mexico Nacional Autonoma proteìnas bacterianas com atividade pesticida
CA2618430A1 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Monsanto Technology Llc Insecticidal compositions and methods for making insect-resistant transgenic plants
WO2007147096A2 (en) 2006-06-15 2007-12-21 Athenix Corporation A family of pesticidal proteins and methods for their use
AR062019A1 (es) * 2006-07-21 2008-08-10 Pioneer Hi Bred Int Gen de bacillus thuringiensis con actividad contra lepidopteros
RU2337529C1 (ru) * 2007-03-26 2008-11-10 Центр "Биоинженерия" Ран РЕКОМБИНАНТНАЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯ УНИКАЛЬНЫЙ ТРАНСФОРМАЦИОННЫЙ АКТ МЕЖДУ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ГЕН cryIIIA, И ГЕНОМНОЙ ДНК КАРТОФЕЛЯ СОРТА ЛУГОВСКОЙ, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И СОДЕРЖАЩИЕ ЭТУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТКА, ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ И ЕГО ПОТОМСТВО
US20080300210A1 (en) * 2007-05-16 2008-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of Controlling Insects and Virus Transmission
US20110023194A1 (en) * 2007-12-11 2011-01-27 Syngenta Participations Ag Engineering zymogen for conditional toxicity
US9133251B2 (en) 2008-02-22 2015-09-15 The Curators Of The University Of Missouri Bacillus based delivery system and methods of use
US8110608B2 (en) 2008-06-05 2012-02-07 Ecolab Usa Inc. Solid form sodium lauryl sulfate (SLS) pesticide composition
JP2011526791A (ja) 2008-07-02 2011-10-20 アテニックス・コーポレーション Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来のＶｉｐ３Ａ殺昆虫性タンパク質であるＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、ＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ−１６３およびＡＸＭＩ−１８４並びにその使用法
US20100199383A1 (en) * 2008-09-18 2010-08-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Coleopteran Activity
US20100077507A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
EP2379724B1 (en) 2008-12-23 2015-01-21 Athenix Corporation Axmi-150 delta-endotoxin gene and methods for its use
CN102317461A (zh) 2009-02-19 2012-01-11 先锋国际良种公司 通过杂交种子生产期间的操纵进行的混合庇护区部署
CA3081727A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Pesticidal proteins and methods for their use
EP2666866A3 (en) 2009-03-06 2014-03-05 Athenix Corporation Methods and compositions for controlling plant pests
US20100298211A1 (en) 2009-03-11 2010-11-25 Athenix Corporation Axmi-001, axmi-002, axmi-030, axmi-035, and axmi-045: toxin genes and methods for their use
ES2609332T3 (es) * 2009-07-02 2017-04-19 Athenix Corporation Gen pesticida AXMI-205 y métodos para su uso
CA2769643C (en) 2009-07-31 2020-01-07 Athenix Corp. Axmi-192 family of pesticidal genes and methods for their use
CA2775582A1 (en) 2009-10-02 2011-04-07 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
ES2659086T3 (es) 2009-12-23 2018-03-13 Bayer Intellectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD
WO2011076877A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Cropscience Ag Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
EA201290559A1 (ru) 2009-12-23 2013-01-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd
ES2659085T3 (es) 2009-12-23 2018-03-13 Bayer Intellectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD
AR079883A1 (es) 2009-12-23 2012-02-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
RU2434939C1 (ru) * 2010-08-23 2011-11-27 Сергей Ананьевич Тюрин Штамм бактерий bacillus thuringiensis биос-1, обладающий инсектоакарицидной активностью
US8968757B2 (en) 2010-10-12 2015-03-03 Ecolab Usa Inc. Highly wettable, water dispersible, granules including two pesticides
MX2013007532A (es) 2010-12-28 2013-09-16 Pioneer Hi Bred Int Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad contra el orden lepidoptera.
CN103459601A (zh) 2011-02-11 2013-12-18 先锋国际良种公司 具有对抗玉米根虫的活性的合成杀昆虫蛋白
US8878007B2 (en) 2011-03-10 2014-11-04 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
MX2013010908A (es) 2011-03-25 2013-10-07 Bayer Ip Gmbh Uso de n-(tetrazol-4-il)- o n-(triazol-3-il)arilcarboxamidas o de sus sales para combatir plantas no deseadas en areas de plantas de cultivo trangenicas tolerantes a los herbicidas inhibidores de la hppd.
CA2830802A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of n-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides
EP2794887A2 (en) 2011-03-30 2014-10-29 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Mutant bacillus thuringiensis cry genes and methods of use
BR112013025665B8 (pt) 2011-04-05 2022-07-05 Athenix Corp Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, microrganismo transgênico, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, métodos para controlar ou exterminar uma população de pragas, para proteger uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta
MX2013012709A (es) 2011-05-02 2013-12-06 Pioneer Hi Bred Int Estrategia de analisis de arnm bacteriano para descubrir nuevas moleculas de acido nucleico codificante de pesticidas.
US9861105B2 (en) 2011-07-28 2018-01-09 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
CN103173370B (zh) * 2011-12-06 2015-02-18 高小文 芽胞杆菌Gxw4-2培育及其防治害虫方法
CN104145020B (zh) 2012-02-16 2020-06-02 先正达参股股份有限公司 工程化的杀有害生物蛋白质
UA115235C2 (uk) 2012-03-08 2017-10-10 Атенікс Корп. Ген токсину axmi335 bacillus thuringiensis та спосіб його застосування
WO2013134651A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Board Of Trustees Of Michigan State University Method of enhancing plant drought tolerance by expression of ndr1
CN102633884B (zh) * 2012-04-21 2013-07-31 中国农业科学院植物保护研究所 苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用
WO2013181647A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
US9758793B2 (en) 2012-08-30 2017-09-12 Athenix Corp. AXMI-234 and AXMI-235 delta-endotoxin genes and methods for their use
CN104884625A (zh) 2012-10-15 2015-09-02 先锋国际良种公司 增强cry内毒素的活性的方法和组合物
CN103039494A (zh) * 2012-12-05 2013-04-17 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
US9458374B2 (en) * 2012-12-18 2016-10-04 Schlumberger Technology Corporation Cystine proteases for bacterial control
US9783817B2 (en) 2013-03-04 2017-10-10 Arkansas State University Methods of expressing and detecting activity of expansin in plant cells
RU2723717C2 (ru) 2013-03-07 2020-06-17 Атеникс Корп. Гены токсинов и способы их применения
US9573980B2 (en) 2013-03-15 2017-02-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots
EP3030072B1 (en) 2013-08-08 2020-03-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof
CN104651377A (zh) 2013-11-25 2015-05-27 浙江大学 新型的杀虫蛋白
CN106536545B (zh) * 2014-02-07 2026-03-03 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
JP2017521055A (ja) 2014-06-20 2017-08-03 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 害虫防除に有用な植物性殺虫タンパク質
US20160010062A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Isolated Spodoptera Frugiperda Multiple Nucleopolyhedroviruses and Methods for Killing Insects
IL315468A (en) 2014-09-17 2024-11-01 Spogen Biotech Inc Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria
RU2017113002A (ru) 2014-09-17 2018-10-17 Байер Кропсайенс Лп Композиции, содержащие рекомбинантные клетки bacillus и фунгицид
CN114736275A (zh) 2014-10-16 2022-07-12 先锋国际良种公司 具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途
UA124757C2 (uk) 2014-10-16 2021-11-17 Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування
WO2016079739A2 (en) 2014-11-20 2016-05-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for producing polypeptides with a modified glycosylation pattern in plant cells
CN107438617A (zh) 2014-12-22 2017-12-05 农业生物群落股份有限公司 杀虫基因和使用方法
EP3283504A1 (en) 2015-04-17 2018-02-21 Agbiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
CN114644689A (zh) 2015-04-22 2022-06-21 农业生物群落股份有限公司 杀虫基因和使用方法
CA2985198A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US10364439B2 (en) 2015-06-03 2019-07-30 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
RU2021100887A (ru) 2015-06-22 2021-03-16 Агбайоми, Инк. Пестицидные гены и способы применения
JP6933641B2 (ja) * 2015-07-30 2021-09-08 モンサント テクノロジー エルエルシー 新規の昆虫阻害タンパク質
RU2746927C2 (ru) 2015-12-22 2021-04-22 Агбайоми, Инк. Пестицидные гены и способы использования
CA3221950A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Spogen Biotech Inc. Methods for promoting plant health using free enzymes and microorganisms that overexpress enzymes
RU2018137045A (ru) 2016-04-14 2020-05-14 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и пути их применения
EP3445861B1 (en) 2016-04-19 2021-12-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
EP3510159B1 (en) 2016-09-06 2023-03-01 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
BR112019010476A2 (pt) 2016-11-23 2019-09-10 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira, planta transgênica, semente transgênica, polipeptídeo recombinante, composição, método para controlar uma população de pragas, para matar pragas, para produzir um polipeptídeo, planta ou célula vegetal, método para proteger uma planta contra uma praga, para aumentar o rendimento em uma planta, uso e produto primário
US10793610B2 (en) 2017-01-30 2020-10-06 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
US11046973B2 (en) 2017-04-11 2021-06-29 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
CN110914438A (zh) 2017-05-26 2020-03-24 先锋国际良种公司 具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途
EP4230642A2 (en) 2017-08-03 2023-08-23 Agbiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
US10743535B2 (en) 2017-08-18 2020-08-18 H&K Solutions Llc Insecticide for flight-capable pests
AR113123A1 (es) 2017-09-20 2020-01-29 Spogen Biotech Inc Proteínas de fusión, bacterias recombinantes y fragmentos del exosporio para promover la salud de las plantas
EP4122947A1 (en) 2017-12-19 2023-01-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides and uses thereof
EP3728606A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 Agbiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
CN112218952A (zh) 2018-04-20 2021-01-12 农业生物群落股份有限公司 杀虫基因及使用方法
EP4461128A3 (en) 2019-10-14 2025-03-26 BASF Agricultural Solutions US LLC Novel insect resistant genes and methods of use
US12241075B2 (en) 2019-10-14 2025-03-04 Basf Agricultural Solutions Us Llc Insect resistant genes and methods of use
CA3198940A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Rebekah Deter Kelly Pesticidal genes and methods of use
BR112023023044A2 (pt) 2021-05-06 2024-01-23 Agbiome Inc Genes pesticidas e métodos de uso
IL309032A (en) 2021-06-03 2024-02-01 Mazen Animal Health Inc Oral administration of coronavirus spike protein to alter cytokine levels and provide passive immunity to newborn pigs
EP4444890A1 (en) 2021-12-07 2024-10-16 Agbiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2024044596A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
AR131334A1 (es) 2022-12-13 2025-03-12 Ag Biome Inc Genes plaguicidas y métodos de uso
AU2023408205A1 (en) 2022-12-19 2025-06-26 Basf Agricultural Solutions Us Llc Methods of identifying and evaluating genes for insect control
AU2023408197A1 (en) 2022-12-19 2025-06-26 Basf Agricultural Solutions Us Llc Insect toxin genes and methods for their use
CN120418654A (zh) 2022-12-20 2025-08-01 巴斯夫农业解决方案美国有限责任公司 鉴定和评估昆虫控制基因的方法
WO2025052302A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Mazen Animal Health, Inc. Methods and compositions for the production of mannanase in plants
WO2025074304A1 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Mazen Animal Health, Inc. Compositions and methods for in planta production of a porcine circovirus vaccine

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3651215A (en) * 1968-08-12 1972-03-21 Juro Morita Bacterial mosouito larva-killing agent
US3632747A (en) * 1968-08-20 1972-01-04 Juro Morita Bacterial fly-larva-killing agent
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4886664A (en) 1982-06-18 1989-12-12 Rhone-Poulenc, S.A. Low-water-activity inocula for biological control
DE3685968T2 (de) 1985-01-22 1993-07-01 Mycogen Corp Zellulare einkapselung biologischer pestizide.
DE3541893A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-11 Basf Ag Verfahren zur herstellung sporenfreier, konzentrierter protein-praeparate von mueckentoxischem bacillus thuringiensis serovar. israelensis sowie mikroorganismus zur durchfuehrung des verfahrens bzw. verfahren zur gewinnung des mikroorganismus
US5024837A (en) * 1987-05-06 1991-06-18 Donovan William P Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use
US4996155A (en) * 1988-03-04 1991-02-26 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin
US5011685A (en) * 1988-04-06 1991-04-30 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Baculovirus proteins and viral pesticides containing same
GB8910624D0 (en) * 1989-05-09 1989-06-21 Ici Plc Bacterial strains
TR26973A (tr) * 1990-04-16 1994-09-12 Ecogen Inc Bacillus thuringiensis cryie geni ve lepidoptera takimindan böceklere karsi zehirli protein.
CA2080584C (en) * 1990-04-18 2000-09-05 Marc Cornelissen Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
GB9023735D0 (en) * 1990-11-01 1990-12-12 Ici Plc Bacterial strain
US5277905A (en) * 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
CA2059897A1 (en) * 1991-02-25 1992-08-26 Kenneth E. Narva Bacillus thuringiensis genes encoding novel coleopteran-active protein toxins
US5262158A (en) * 1991-04-30 1993-11-16 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarida
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5384924A (en) * 1992-08-03 1995-01-31 Mallinckrodt Medical, Inc. Warming blanket having multiple inlets
RO117111B1 (ro) * 1993-03-25 2001-10-30 Ciba Geigy Ag Proteina pesticida si secventa de nucleotide, care o codifica
GB9324529D0 (en) * 1993-11-30 1994-01-19 Univ Singapore Biological control agents

Also Published As

Publication number Publication date
PH11995051386B1 (en) 2002-09-18
RU2196824C2 (ru) 2003-01-20
US5770696A (en) 1998-06-23
US5888801A (en) 1999-03-30
DK0792363T3 (da) 2004-04-26
EP1382611A3 (en) 2004-03-31
US5889174A (en) 1999-03-30
SI0792363T2 (sl) 2013-01-31
BR9509099A (pt) 1997-09-30
ES2213162T5 (es) 2013-02-12
DE69532333T3 (de) 2013-03-14
EP1382611A2 (en) 2004-01-21
JPH10506532A (ja) 1998-06-30
DE69532333D1 (de) 2004-01-29
US5990383A (en) 1999-11-23
US5840868A (en) 1998-11-24
SI0792363T1 (en) 2004-04-30
EP1754789A3 (en) 2009-11-11
BG101384A (en) 1997-10-31
CN1160420A (zh) 1997-09-24
AU3743395A (en) 1996-04-19
EP0792363A1 (en) 1997-09-03
AU692934B2 (en) 1998-06-18
CA2199049C (en) 2012-03-13
CZ90897A3 (cs) 2000-02-16
RO119835B1 (ro) 2005-04-29
US5866326A (en) 1999-02-02
IL146109A0 (en) 2002-07-25
TR199501182A2 (tr) 1996-06-21
MX228013B (es) 2005-05-25
DK0792363T4 (da) 2013-01-07
US5849870A (en) 1998-12-15
ATE256743T1 (de) 2004-01-15
MX9702212A (es) 1997-06-28
CA2199049A1 (en) 1996-04-04
EP0792363B2 (en) 2012-09-26
KR100419438B1 (ko) 2004-07-05
EP1754789A2 (en) 2007-02-21
EP0792363B1 (en) 2003-12-17
IL115382A (en) 2010-06-16
HUT77449A (hu) 1998-04-28
IL115382A0 (en) 1995-12-31
PT792363E (pt) 2004-05-31
ES2213162T3 (es) 2004-08-16
HU222264B1 (hu) 2003-05-28
US5872212A (en) 1999-02-16
PH12002000307B1 (en) 2004-01-21
US6066783A (en) 2000-05-23
CN1255539C (zh) 2006-05-10
DE69532333T2 (de) 2004-10-07
WO1996010083A1 (en) 1996-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0792363B1 (en) Novel pesticidal proteins and strains
EP0690916B1 (en) Pesticidal proteins and strains
EP1124426B1 (en) Methods of controlling cutworm pests
KR20190142453A (ko) 인시류 해충에 대해서 유독성이거나 저해성인 신규한 키메릭 살곤충 단백질
KR20010099680A (ko) 살충성 단백질
MX2011004154A (es) Proteinas derivadas de genes cry de bacillus thuringiensis.
Tokçaer Response surface optimization of Bacillus thuringiensis israelensis fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140927