CZ291343B6 - Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek - Google Patents
Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291343B6 CZ291343B6 CZ2001463A CZ2001463A CZ291343B6 CZ 291343 B6 CZ291343 B6 CZ 291343B6 CZ 2001463 A CZ2001463 A CZ 2001463A CZ 2001463 A CZ2001463 A CZ 2001463A CZ 291343 B6 CZ291343 B6 CZ 291343B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- erythropoietin
- ser
- epo
- isoforms
- thr
- Prior art date
Links
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical class [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 339
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 title abstract 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 287
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims abstract description 284
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims abstract description 272
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 22
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 12
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 12
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N Asn-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N 0.000 claims 1
- UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N Ser-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N 0.000 claims 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 claims 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 241
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 241
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 112
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 97
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 92
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 47
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 46
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 44
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 42
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 40
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 38
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 27
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 25
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 17
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 17
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 11
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 10
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 9
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 9
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 9
- 238000007745 plasma electrolytic oxidation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 8
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 8
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 7
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 3
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000000581 polycythemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102100021823 Enoyl-CoA delta isomerase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710199678 Enoyl-CoA delta isomerase 2 Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102220547809 Serine/threonine-protein kinase B-raf_N88T_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N dibutyl phthalate Chemical compound CCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCC DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trichloro-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- NJPMYXWVWQWCSR-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJPMYXWVWQWCSR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N Ala-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 1
- PHQXWZGXKAFWAZ-ZLIFDBKOSA-N Ala-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 PHQXWZGXKAFWAZ-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- IBLAOXSULLECQZ-IUKAMOBKSA-N Asn-Ile-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O IBLAOXSULLECQZ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical group OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N Asn-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NAAAPCLFJPURAM-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O NAAAPCLFJPURAM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 0 CC1*C*C1 Chemical compound CC1*C*C1 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- UTKICHUQEQBDGC-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UTKICHUQEQBDGC-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- COSBSYQVPSODFX-GUBZILKMSA-N Glu-His-Cys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N COSBSYQVPSODFX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GVVKYKCOFMMTKZ-WHFBIAKZSA-N Gly-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN GVVKYKCOFMMTKZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YTKOTXRIWQHSAZ-GUBZILKMSA-N His-Glu-Cys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N YTKOTXRIWQHSAZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTHAJJYOHOBUDY-GHCJXIJMSA-N Ile-Cys-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N CTHAJJYOHOBUDY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N Ile-Thr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N Lycoperodine 1 Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1CN[C@H](C(=O)O)C2 FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N Lys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N Met-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N Met-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100436270 Mus musculus Astn1 gene Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000008881 Oenanthe javanica Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102220531954 Phenylethanolamine N-methyltransferase_N9S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220552574 Phospholipase A2_N89T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KCNSGAMPBPYUAI-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KCNSGAMPBPYUAI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N Ser-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N Thr-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- 108010070096 Trp-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu Proteins 0.000 description 1
- KHCSOLAHNLOXJR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHCSOLAHNLOXJR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 239000000959 ampholyte mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 108010027485 asialoerythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005253 gamme decay Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010057760 hepatic sialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000002732 pharmacokinetic assay Methods 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Analog humánního erythropoietinu, zahrnující adici jedné nebo více aminokyselin ke karboxylovému konci erythropoietinu, přičemž v adovaných aminokyselinách je obsaženo alespoň jedno místo pro glykosylaci. Použití tohoto analogu pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta a tento farmaceutický prostředek. Sekvence DNA kódující tento analog a eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná touto sekvencí DNA způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat výše uvedený analog.ŕ
Description
Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek
Oblast techniky
Vynález se týká analogů humánního erythropoietinu a jejich použití pro výrobu léčiv, sekvencí DNA, které kódují tyto analogy, eukaryotních hostitelských buněk transfekovaných těmito sekvencemi DNA a farmaceutického prostředku na bázi výše uvedených analogů erythropoietinu.
Dosavadní stav techniky
Erythropoietin (EPO) je glykoproteinový hormon, který se podílí na maturaci erythroidních progenitorových buněk na erythrocyty. Jedná se o důležitý hormon regulující hladinu čerstvých krvinek v oběhovém systému. Přírodní erythropoietin je produkován v játrech během života plodu a v ledvinách dospělých, cirkuluje krví a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anémie je téměř vždy důsledkem selhání ledvin projevujícího se sníženou produkcí erythropoietinu v ledvinách. Zjistilo se, že rekombinantní erythropoietin vyrobený technikami genetického inženýrství, tj. expresí proteinového produktu z hostitelské buňky transformované genem kódujícím erythropoietin je účinný při léčbě anémie vyvolané chronickým selháním ledvin.
V moči člověka je normálně přítomna nízká koncentrace erythropoietinu, zatímco v moči pacientů trpících aplastickou anémií je hladina erythropoietinu (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) bylo jako výchozí látky použito moči pacientů trpících aplastickou anémií. Až dosud se však urinámí erythropoietin nestal užitečným z terapeutického hlediska.
Identifikace, klonování a exprese genů kódujících erythropoietin je popsána v patentu US 4 703 008 (Lin). Popis způsobu purifikace rekombinantního erythropoietinu z buněčného média je popsán v patentu US 4 667 016 (Lai et al.). Výše uvedené dvě citace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Exprese a izolace biologicky aktivního rekombinantního erythropoietinu ze savčích hostitelských buněk obsahujících erythropoietinový gen v rekombinantním plazmidu umožnila poprvé získat větší množství erythropoietinu vhodného pro terapeutické aplikace. Kromě toho, znalost sekvence genu a dostupnost větších množství purifikovaného proteinu vedla k lepšímu porozumění mechanismu účinku tohoto proteinu.
Mnohé buněčné povrchové proteiny a sekretorové proteiny produkované eukaryontními buňkami jsou modifikovány jednou nebo více oligosacharidovými skupinami. Tato modifikace, která je označována názvem glykosylace, může dramaticky ovlivnit fyzikální vlastnosti proteinů a může být také důležitá pro stabilitu, sekvenci a subcelulámí lokalizaci proteinu. Vhodná glykosylace může mít rozhodující význam pro biologickou účinnost. Je skutečností, že některé geny z eukaryontních organismů, pokud jsou exprimovány v bakteriích (například E. coli), kterým chybí buněčné procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, které po izolaci vykazují jen malou účinnost nebojsou úplně neúčinné, v důsledku toho, že nejsou glykosylovány.
Ke glykosylaci dochází na specifických místech hlavního řetězce polypeptidu a obvykle se jedná o dva různé typy: O-vázané oligosacharidy jsou připojeny k serinovým nebo threoninovým zbytkům, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým zbytkům, kde jsou součástí sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X představuje jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků, které se vyskytují u obou typů, jsou různé. Jedním typem cukru, který se obvykle vyskytuje u obou těchto typů, je kyselina N-acetylneuraminová (dále označovaná názvem kyselina sialová). Kyselina
-1 CZ 291343 B6 sialová tvoří obvykle terminální zbvtek jak N-vázaného, tak O-vázaného oligosacharidu a díky svému negativnímu náboji může propůjčovat glykoproteinu kyselé vlastnosti.
Jak humánní erythropoietin izolovaný z moči, tak rekombinantní erythropoietin (exprimovaný v savčích buňkách) s aminokyselinovou sekvencí 1-165 humánního erythropoietinu obsahuje tři N-vázané a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, které dohromady činí asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázaná glykosylace se vyskytuje u asparatinových zbytků umístěných v polohách 24. 38 a 83, zatímco O-vázaná glykosylace je umístěna na serinovém zbytku v poloze 126 [Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3 116 (1986); Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)]. Bylo ukázáno, že oligosacharidové řetězce jsou modifikovány terminálními zbytky kyseliny sialové. Enzymatické zpracování glykosylovaného erythropietinu za účelem odstranění všech zbytků kyseliny sialové, se projevuje ztrátou účinnosti in vivo, ale neovlivní účinnost in vitro [Lowy et al., Nátuře 185, 102 (1960); Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4 202 (1974)]. Toto chování bylo vysvětleno lychlým vymizením asialoerythropoietinu z oběhu při interakci s hepatickým proteinem, který váže asialoglykoprotein [Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1 385 (1974); Ashwell et al., Methods Enzymol 50, 287 (1978)]. Erythropoietin vykazuje tedy biologickou účinnost in vivo pouze v tomto případě, když je sialylován, čímž se zabrání jeho vazbě na hepatický vazebný protein.
Úloha jiných složek v oligosacharidových řetězcích erythropoietinu není dobře definována. Zjistilo se, že částečně deglykosylovaný erythropoietin vykazuje podstatně sníženou účinnost in vivo ve srovnání s glykosylovanou formou, ale zachovává si svou účinnost in vitro [Dordal et al., Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin, výše citovaný patent]. V jiné studii všech bylo konstatováno, že odštěpení N-vázaných nebo O-vázaných oligosacharidových řetězců, jednotlivě nebo dohromady, mutagenezí asparaginových nebo serinových zbytků, které představují glykosylační místa, výrazně snižuje in vitro účinnost modifikovaného erythropoietinu produkovaného v savčích buňkách [Dube et al., J. Biol. Chem. 263,17516 (1988)].
Glykoproteiny, jako je erythropoietin, je možno rozdělovat na formy s různým nábojem za použití takových technik, jako je izoelektrická fokusace (IEF). Několik skupin vědců publikovalo IEF studie vztahující se k surovým nebo zčásti purifikovaným erythropoietinovým přípravkům [Lukowski et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al., Biochem. med. 12, 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)]. Pomocí IEF byly při těchto studiích identifikovány nejvýše tři nebo čtyři frakce s erythropoietinovou účinností a žádná z nich nebyla charakterizována, pokud se týče obsahu uhlohydrátů. Kromě nebyla provedena žádná korelace mezi izoelektrickými body těchto frakcí a jejich biologickou účinností.
Při purifikaci erythropoietinu izolovaného z humánní moči (Miyake et al., výše uvedená citace) bylo zjištěno, že dvě frakce erythropoietinu izolované pomocí chromatografíe na hydroxylapatitu a označené symboly II a lila, vykazují podobnou specifickou účinnost. Následující analýza uhlohydrátů ve frakcích II a lila ukázala, že frakce II obsahuje vyšší průměrný obsah kyseliny sialové, než frakce lila (Dordal et al., výše uvedená citace).
Úkolem tohoto vynálezu je získat oddělené a izolované izoformy erythropoietinu s definovaným obsahem kyseliny sialové a s definovanou biologickou účinností. Tyto izoformy by měly být terapeuticky užitečné při použití ve formě farmaceutických prostředků.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je analog humánního erythropoietinu zahrnující adici jedné nebo více aminokyselin ke karboxylovému konci erythropoietinu, přičemž v adovaných aminokyselinách je obsaženo alespoň jedno místo pro glykosylaci.
-2CZ 291343 B6
Ve výhodném provedení analog humánního erythropoietinu podle vynálezu zahrnuje adici peptidového fragmentu získaného z karboxyterminální části humánního chorionického gonadotropinu, přičemž tento fragment je připojen ke karboxylovému konci erythropoietinu.
Jako konkrétní provedení analogu humánního erythropoietinu podle vynálezu je možnou vést provedení zvolená ze souboru sestávající z
a) humánního erythropoietinu, k jehož karboxylovému konci je připojena aminokyselinová sekvence Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-ProGly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln;
b) analogu charakterizovaného v odstavci a), který dále obsahuje Ser87Asn88Thr90EPO; a
c) analogu charakterizovaného v odstavci a), který dále obsahuje Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO.
Předmětem vynálezu je také sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu popsaný výše.
Dalším předmětem vynálezu je eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA uvedeno výše způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.
Předmětem vynálezu je dále také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje terapeuticky účinné množství výše uvedeného analogu erythropoietinu spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.
Konečně je předmětem vynálezu také použití terapeuticky účinného množství výše uvedeného analogu erythropoietinu pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel, na němž je provedena separace izoforem rekombinantního erythropoietinu. Gelové dráhy 1 až 11 ukazují izoformy od méně kyselých (vyšší hodnota pl) v dráze 1 ke kyselejším (nižší hodnota pl) v dráze 11. V drahách ležících u pravého a levého okraje je též obsažen purifikovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem 9 až 14.
Na obr. 2 je znázorněn vztah mezi počtem zbytků kyseliny sialové v izoformě erythropoietinu a specifickou účinností této izoformy in vivo vyjádřenou v jednotkách/mg erythropoietinového polypeptidu. Na obr. 2A je znázorněna koncentrace každé izoformy erythropoietinu zjištěná Bradfordovým stanovením proteinů. Na obr. 2B je tato koncentrace stanovena měřením absorbance při 280 nm a na obr. 2C je tato koncentrace stanovena metodou RIA.
Obr. 3 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel s definovanými směsi izoforem rekombinatního erythropoietinu připravenými chromatografii na anexu za různých podmínek. Gelové dráhy 1 až 6 představují (podle pořadí v jakém jsou uvedeny) erythropoietinové izoformy eluované v promývací kapalině s vysokým obsahem solí po promytí sloupce Q-Sepharose rychlým proudem 150mM kyseliny octové o pH 4,7, 150mM kyseliny octové, která není pufrována, 200mM kyseliny octové o pH 4,7, 300mM kyseliny octové o pH 4,7 nebo 300mM kyseliny octové, která není pufrována. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifikovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2
-3CZ 291343 B6 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agarose bylo použito chromatografie na O-Sepharose.
Obr. 4 ukazuje dělení izoforem erythropoietinu 8 až 12, které se provádí tak, že se upravené buněčné médium nanese na sloupec Q-Sepharose a eluuje gradientem s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Alikvoty sudých frakcí od frakce 2 do frakce 40 se podrobí analytické izoelektrické fokusaci. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifikovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy pospanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agarose bylo použito chromatografie na Q-Sepharose.
Na obr. 5 je znázorněna sekvence aminokyselin humánního erythropoietinu. Čtverečky označují asparaginové zbytky, knimž jsou připojeny N-vázané uhlohydrátové řetězce a hvězdička označuje serinový zbytek, který je modifikován O-vázaných uhlohydrátovým řetězcem.
Na obr. 6A, 6B a 6C je znázorněna série klonovacích stupňů použitých pro vytvoření plazmidů pro konstrukci a analýzu analogů humánního erythropoietinu. Tyto analogy obsahují aminokyseliny modifikované způsobem znázorněným a obr. 5, který jim dodává přídavná glykosylační místa.
Na obr. 7 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů erythropoietinu s humánní sekvencí a uvedených analogů erythropoietinu. Analogy [Asn9, Sern]EPO, [Asn69]EPO, [Asn125, SerI27]EPO a [Pro124, Thr125]EPO jsou zkonstruovány způsobem popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Pro125,Thr127]EPO a [Asn126, Ser128]EPO, které neobsahují přídavné uhlohydrátové řetězce.
Na obr. 8 je znázorněna analýzy Western blot COS buněčných supematantů erythropoietinu s humánní sekvencí a charakterizovaných analogů erythropoietinu po zpracování N-glykanázou. Analogy [Thrl25]EPO a [Pro124, Thr125]EPO sou zkonstruovány způsobem popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Val126]EPO, [Pro124]EPO [Pro125]EPO, [Thr127]EPO, [Pro125, Ser127]EPO a [Thr125, Ser127]EPO.
Obr. 9 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace frakcí 2, 3 a 4 získaných chromatografií na Q-Sepharose s obrácenými fázemi (C4) za použití buněčného média podporujícího růst CHO buněk transfekovaných erythropoietinovou cDNA obsahující [Thr125]-mutaci. Na levé a pravé krajní dráze gelu je také obsažen purifikovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agarose bylo použito chromatografie na QSepharose.
Na obr. 10 jer znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a zvolených analogů. Konstrukce těchto analogů je popsána v příkladu 6. Analogy N9, N14, N18, N19, N21, N24 a N39 obsahují přinejmenším jeden přídavný uhlohydrátový řetězec, což je dokumentováno nižší pohyblivostí na gelu.
Na obr. 11 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního eiythropoietinu a analogu EPO NI4 v průběhu štěpení N-glykanázou. Časové intervaly, v nichž bylo prováděno měření, jsou 0,4, 12, 45 minut a štěpení přes noc.
Obr. 12 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace přípravků obsahujících izoformy analogu EPO N14. Směs označená jako nízké izoformy obsahuje analog EPO N14 obsahující převážně 6 až 12 zbytků kyseliny sialové v molekule, směs označená jako střední izoformy obsahuje analog N14 obsahující převážně 10 až 15 zbytků kyseliny sialové v molekule a směs označená
-4CZ 291343 B6 jako vysoké izoformy obsahuje analog N14 obsahující převážně 12 až 17 zbytků kyseliny sialové v molekule.
Obr. 13 ukazuje farmakokinetiku rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14 a analogu EPO N14 (izoformy 15 až 17) po intravenosním injekčním podání krysám.
Na obr. 14 je znázorněna zkouška vytěsňování l25I-značeného rekombinantního humánního erythropoietinu z vazby z receptoru erythropoietinu prováděná za chladu za přítomnosti různého množství naznačeného rHuEPO, izolované izoformy 14 nebo analogu EPO NI4.
Obr. 15 ukazuje studii myšího hematokritu (poměr plasmy ke krvinkám), při níž se porovnává účinnost vysoké izoformy EPO N14 (0,036 až 0,0712 pg), izolované izoformy 14 (0,036 a 0,0712 pg), nízké izoformy EPO 177 (0,0712 pg) a rHuEPO (0,071 pg).
Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.
Předmětem vynálezu jsou izoformy erythropoietinu. Specifické izoformy erythropoietinu získané podle vynálezu a jejich vlastnosti se mohou měnit v závislosti na zdroji výchozího materiálu. Tak například izoformy humánního erythropoietinu izolovaného z moči se liší od izoforem rekombinatního erythropoietinu. V přednostním provedení se vynález týká izoformy erythropoietinu se specifickým počtem (tj. s pevným počtem, který je vyšší než 0) zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, přičemž toto číslo je zvoleno ze souboru zahrnujícího čísla 1 až 14. S výhodou je tímto číslem 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14. V jiném provedení je toto číslo vyšší než 14 a s výhodou leží v rozmezí od 16 do 23.
Pod označením „izoforma erythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietinový přípravek vykazující jediný izoelektrický bod (pl) a mající stejnou sekvenci aminokyselin. Pod označením „erythropoietin“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí přírodní erythropoietin, humánní erythropoietin izolovaný z moči, jakož i polypeptidy, které se nevyskytují v přírodě a které mají sekvenci aminokyselin a které jsou glykosylovány způsobem dostatečně kopírujícím přírodní erythropoietin, aby jim to udělilo in vivo biologické vlastnosti spočívající ve stimulaci buněk kostní dřeně pro zvýšenou produkci retikulocytů a červených krvinek.
Zjistilo se, že oddělené izoformy rekombinantního erythropoietinu, které mají sekvenci aminokyselin humánního erythropoietinu izolovaného z moči, odpovídají molekulám erythropoietinu obsahujícím 1 až 14 zbytků kyseliny sialové, přičemž každá z izoforem přítomných v purifikovaném rekombinantním erythropoietinu vykazuje účinnost in vivo mající vztah k počtu zbytků kyseliny sialové, které tato izoforma obsahuje.
V přednostním provedení je erythropoietin produktem exprese exogenní sekvence DNA, která byla transfekována do nehumánní eukaryotní hostitelské buňky. V přednostním provedení je tedy erythropoietinem „rekombinantní erythropoietin“. Rekombinantní erythropoietin se s výhodou produkuje postupy popsanými v patentu US 4 703 008 (Lin; stejný majitel vlastní i práva k této přihlášce). Rekombinantní erythropoietin se může purifikovat obecnými postupy stejnými v příkladu 2 patentu US 4 667 016 (Lai et al.; stejný majitel vlastní i práva k této přihlášce) nebo alternativně způsobem popsaným v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., při němž se však místo chromatografie na DEAE-Agarose použije chromatografie na Q-Sepharose.
Erythropoietin purifikovaný podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. obsahuje podle analýzy IEF převážně 6 izoforem. Za použití chromatografických postupů popsaných v příkladu 4 byla kromě toho zjištěna přinejmenším jedna další izoforma s vyšší kyselostí. (Tato kyselejší forma migrující na IEF gelu při obsahu zbytků sialové kyseliny nad 14 může obsahovat záporná náboje nepocházející z sialové kyseliny, což dokládá rezistence některých nábojů ke štěpení
-5CZ 291343 B6 sialidázou). Tyto izoformy se od sebe vzájemně liší obsahem kyseliny sialové. Tato skutečnost je v příkladech demonstrována na izolaci 10 takových izoforem preparativní IEF a stanovením obsahu kyseliny sialové v 5 z nich. Zjistilo se, že v izoformách zkoušených na obsah kyseliny sialové, je počet zbytků kyseliny sialové 9, 10, 11, 12 nebo 13.
Existuje vztah mezi relativní specifickou účinností erythropoietinu in vivo a počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu z izoforem 5 až 11 (každá izoforma je zde označena počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu). Izoformy 11 až 14 vykazují přibližně stejnou relativní specifickou účinnost in vivo. Izoformy 5 až 14 byly zkoušeny na účinnost in vivo pomocí exhypoxického polycythemického biologického stanovení na myších. Množství každé z přítomných izoforem se zjistilo Bradfordovým stanovením proteinů, měřením absorbance při 280 nm nebo radioimunoesejem (RIA) pro erythropoietin. Výsledky stanovení RIA vyjádřené vjednotkách/ml se dělí hodnotou 212 770 jednotek/mg erythropoietinového polypeptidů, průměrnou specifickou účinností purifikovaného erythropoietinu stanovenou metodou RIA, a tím se získají hodnoty koncentrace proteinu v izolovaných izoformách nebo směsích izoforem, které jsou vyjádřeny v miligramech erythropoietinového polypeptidů na mililitr. Jak je to ukázáno v příkladech, relativní specifická účinnost in vivo stupňovitě stoupá od izoformy 5 k izoformě 11 (viz tabulka 2).
Hodnoty specifické účinnosti in vivo, které jsou v tomto popisu uváděny, představují hodnoty získané měřením relativní specifické účinnosti in vivo a nikoliv měřením absolutní specifické účinnosti in vivo. Hodnot specifické účinnosti se v tomto popisu používá pouze pro srovnávání relativní účinnosti izoforem zkoušených pomocí stejného stanovení za stejných podmínek, za použití stejného vnitřního standardu, stejného typu zvířete a za použití stejné analýzy dat použitých pro výpočet specifické účinnosti a za použití stejné zkoušky pro stanovení obsahu proteinu. Žádná z uvedených hodnot specifické účinnosti in vivo u kterékoliv z izoforem nepřestavuje inherentní nebo absolutní hodnotu charakteristickou pro tuto izoformu.
Předmětem vynálezu jsou také směsi obsahující dvě nebo více izoforem erythropoietinu. Podle jednoho provedení obsahují tyto směsi izoformy obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, než je předem určený počet, například vyšší počet než 11 nebo 12, například se jedná o směs izoforem 12, 13 a 14. Podle jiného provedení obsahují tyto směsi izoformy s předem určeným počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, například sméně než 12, ale více než 8 zbytky kyseliny sialové v molekule, jako je tomu například v případě směsi izoforem 9, 10 a 11. Předmětem vynálezu jsou také směsi izoforem erythropoietinu, v nichž jsou vzájemná množství izoforem stejná nebo různá. Tak například směs izoforem 9, 10 a 11 může obsahovat jednotlivé izoformy v různých poměrech, jako například 1 : 1 : 1,2:3 : 1 nebo 20: 20: 1.
S výhodou obsahují takové směsi méně než 4 izoformy a jedná se například o směsi 11, 12 a 13 nebo o směsi izoforem 12 a 14 nebo dále o směs izoforem 7 a 13.
Takové směsi izoforem erythropoietinu se vyrábějí podle vynálezu současnou izolací zvolených izoforem erythropoietinu. Tyto postupy zahrnují izolací jednotlivých izoforem takovými technikami, jako je preparativní izoelektrická fokusace nebo výrobu směsí izoforem obsahujících předem určený počet zbytků kyseliny sialové (například nad 11) takovými technikami, jako je ionexová chromatografie nebo chromatofokusace. Všechny tyto techniky jsou založeny na dělení proteinů podle náboje.
Ionexová chromatografie a chromatofokusace se obvykle provádí tak, že se buď surový humánní erythropoietin (médium zpracované buňkami), nebo purifíkovaný materiál aplikuje na sloupec pryskyřice za podmínek umožňujících vazbu některých nebo všech izoforem erythropoietinu k pryskyřici. Pokud se používá surového eryhtropoietinu, přednostně se protein aplikuje na sloupec při hodnotě pH asi 7, zatímco purifikované proteinové přípravky se mohou aplikovat na sloupec při pH v rozmezí od 7 do asi 4. Po promytí sloupce pufrem o hodnotě pH asi 4 se
-6CZ 291343 B6 izoformy erythropoietinu, které zůstanou navázány na sloupci ionexů, eluují zvýšením pH a koncentrace soli v promývacím pufru nebo aplikací gradientu se snižující se hodnotou pH a zvyšující se iontovou silou při pH asi 4. V případě chromatofokusace se izoformy eluují ze sloupce gradientem se snižující se hodnotou pH nebo promytím sloupce roztokem s vysokou koncentrací soli.
V přednostním provedení se jednotlivé izoformy izolují za použití ionexové chromatografie. Tak například izoforma 14 se izoluje za použití ionexové chromatografie způsobem popsaným v příkladu 8.
Do rozsahu vynálezu spadají také určité analog} humánního erythropoietinu. Pod označením „analog humánního erythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietin zahrnující jednu nebo více změn aminokyselinové sekvence humánního erythropoietinu, která má za následek zvýšení počtu míst připojení kyseliny sialové. Analogy se tvoří místně orientovanou mutagenezí zahrnující adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků, kterými se zvyšuje nebo mění počet míst, která jsou k dispozici pro glykosylaci. Takové analogy mohou obsahovat větší počet uhlohydrátových řetězců než humánní erythropoietin.
Analogy erythropoietinu podle vynálezu obsahují sekvenci aminokyselin, která zahrnuje přinejmenším jedno přídavné glykosylační místo. Analogy obsahující vyšší koncentraci kyseliny sialové než její obsah v humánním erythropoietinu se získávají zavedením glykosylačních míst, které nezpůsobí zmatení sekundární nebo terciární komformace potřebné pro biologickou účinnost. Analog humánního erythropoietinu s výhodou obsahuje 1, 2 nebo 3 přídavná místa pro N-glykosylaci nebo O-glykosylaci, což se projeví zavedením 1, 2 nebo 3 přídavných Nvázaných nebo 0-vázaných uhlohydrátových řetězců. Tak například leucin v poloze 69 se nahradí asparaginem, za vzniku sekvence Asn-Leu-Ser, která slouží jako čtvrté místo pro N-glykosylaci. Taková změna může obvy kle dodat až čtyři přídavné zbytky kyseliny sialové do molekuly. Jako příklady změn, kterými lze vytvořit přídavná O-glykosylační místa, je výměna alaninu v poloze 125 za threonin a alaninů v polohách 124 a 125 za prolin (v poloze 124) athreonin (v poloze 125). Je možno sestrojit analogy obsahující jeden nebo více přídavných N-vázaných a O-vázaných řetězců, jako jsou například analogy NO1 aNO2 popsané v tabulce 5. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že do rozsahu tohoto vynálezu spadá i mnoho dalších analogů humánního erythropoietinu obsahujících přídavná místa pro glykosylaci.
Analogy se zvýšenou četností připojení uhlohydrátů v glykosylačních místech rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Tyto analogy obvykle zahrnují substituci jedné nebo více aminokyselin v těsném sousedství kN-vazebnému nebo O-vazebnému místu. Díky těmto změnám aminokyselin bude větší část erythropoietinových polypeptidů obsahovat uhlohydrátovou modifikaci. Glykosylační místa mohou být přirozená nebo mohou být vytvořena mutací. Tak například analog NI3 neobsahuje přídavný uhlohydrátový řetězec, přestože do něj bylo zavedeno v poloze 88 glykosylační místo. Analogy N14 a N80, které obsahují v poloze 87 výměnu za serin (N14) nebo za valin (NI8), obsahují v poloze 88 přídavný uhlohydrátový řetězec.
Do rozsahu vynálezu spadají také analogy obsahující jednu nebo více aminokyselin, kterými je nastaven karboxylový konec erythropoietinu, přičemž toto nastavení karboxylového konce zajišťuje zavedení alespoň jednoho přídavného uhlohydrátového místa. Při jednom provedení se zkonstruuje analog fúzí 28 karboxy-terminálních aminokyselin humánního chorionického gonadotropinu (HCG) k argininovému zbytku v poloze 166 humánního erythropoietinu. HCG karboxyterminální fragment obsahuje čtvři místa pro O-glykosylaci (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254, 7907 (1979)).
V tabulkách 3, 4 a 5 jsou uvedeny analogy erythropoietinu obsahující přídavná místa pro N-vázané a/nebo O-vázané uhlohydrátové řetězce. Tyto analogy obsahují sekvenci Asn-X-Ser/Thr zavedenou substitucí do různých poloh řetězce humánního erythropoietinového
-7CZ 291343 B6 polypeptidu, za vzniku N-vazebných míst nebo obsahují zavedené zbytky šeřinu nebo threoninu, za účelem vytvoření O-vazebných míst.
V tabulce 6 jsou uvedeny analog} , umožňujícím zavedení přinejmenším jednoho přídavného
N-vázaného nebo jednoho přídavného O-vázaného uhlohydrátového řetězce nebo zavedení přídavného N-vázaného a O-vázaného řetězce současně, jak je to dokumentováno migrací těchto glykoproteinů na SDS gelech (příklad 7). Jak je zřejmé z tabulek 3 a 6, analogy obsahující jedno nebo více přídavných míst pro připojení uhlohydrátu nemusí nutně vést ke vzniku molekul erythropoietinu obsahujících přídavné uhlohydrátové řetězce. Tak například zavedení threoni10 nové substance do polohy 123 a 125 má za následek připojení O-vázaného uhlohydrátového řetězce, zatímco zavedení serinové nebo threoninové substituce do jiných poloh nevede k získání analogů s přídavnými O-vázanými řetězci (viz tabulka 4). Zavedení asparaginových substitucí do poloh 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 a 138 do sekvence humánního erythropoietinu se však projeví zavedenín N-vázaného řetězce v těchto polohách. Fúze HCG polypeptidového fragmentu 15 s argininovým zbytkem v poloze 16 humánního erythropoietinu vede ke vzniku fúzované molekuly erythropoietin-HCG obsahující přinejmenším dva přídavné O-vázané uhlohydrátová řetězce.
Analogy erythropoietinu podle vynálezu zahrnují též erythropoietin, jehož sekvence amino20 kyselin obsahuje přesmyk alespoň jednoho glykosylačního místa. Pod označením „přesmyk glykosylačního místa“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí delece jednoho nebo více glykosylačních míst v humánním erythropoietinu a zavedení jednoho nebo více nepřirozených glykosylačních míst. Jako příklad} takových přesmyků je možno uvést analogy Rl, R2 a R3, které byly sestrojeny deleci N-vazebných míst v polohách 23 (Rl), 38 (R2) nebo 83 (R3) 25 a zavedením N-vazebného místa do polohy 88. Jsou však možné i další četné typy přesmyků uhlohydrátových míst a vzniklé analogy mohou nebo nemusí být vyšší počet glykosylačních míst ve srovnání s humánním erythropoietinem.
Analogy Rl, R2 a R3 byly analyzovány na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou 30 uvedeny v tabulce 7. Zavedení N-vázaného řetězce v poloze Asn88 vrátí biologickou účinnost erythropoietinu, z něhož bylo deleci vypuštěno kterékoli ze tří přirozených N-vazebných míst. Tyto výsledky ukazují, že polohy uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu se mohou měnit za účelem získání užitečných analogů, aniž by se podstatně ovlivnila jejich biologická účinnost.
Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také sekvence DNA kódující analogy erythropoietinu obsahující přídavná míst pro N-vázané a/nebo O-vázané řetězce, analogy obsahující přesmyk alespoň jednoho místa připojení pro uhlohydrátový řetězec a analogy obsahující jedno nebo více aminokyselin prodlužujících karboxvlový konec erythropoietinu. Postupy, kterých se používá pro zavádění změn do sekvence DNA kódující humánní erythropoietin za účelem vytvoření nebo 40 změnu vazebných míst pro uhlohydrátové řetězce jsou uvedeny v příkladu 6.
Tyto analogy erythropoietinu mohou být produktem exprese exogenní sekvence DNA, tj. sekvence DNA vytvořené technologií rekombinantní DNA nebo se může jednat o syntetické produkty. Exogenní sekvence DNA zahrnuje cDNA, genomovou DNA nebo chemicky syntetizovanou 45 DNA kódující analog erythropoietinu.
Do rozsahu vynálezu spadají také rekombinantní DNA plazmidy a eukaryontní hostitelské buňky, které jsou užitečné pro expresi takových analogů. Expresní vektory zahrnují jakékoliv vektory, které jsou schopny exprimovat klonované sekvence DNA v eukaryontní hostitelské buňce, 50 zejména vektory používané pro expresi v buňkách COS a CHO. Jako příklady takových vektorů je možno uvést plazmidy pEC a pDECdelta popsané v příkladu 6 dále. Kultivace hostitelských buněk COS a CHO exprimujících analogy erythropoietinu se provádí za použití postupů, které jsou odborníkům v tomto oboru známy.
-8CZ 291343 B6
Izolované izoformy a směsi izoforem odvozené od analogů erythropoietinu se získají výše popsanými metodami pro výrobu izoforem humánního erythropoietinu. Tyto metody mohou zahrnovat izoelektrickou fokusaci. ionexovou chromatografii a chromatofokusaci. Pro výrobu jednotlivých izoforem a směsí izoforem analogů erythropoietinu se přednostně používá ionexové chromatografie.
Zvýšením počtu uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu, a tedy zvýšením počtu zbytků kyseliny sialové, vztaženého na molekulu erythropoietinu, se mohou výsledným produktům dodat výhodné vlastnosti, jako je zvýšená rozpustnost, vyšší odolnost vůči proteolýze, snížená imunogenicita, zvýšený poločas životnosti v séru a zvýšená biologická účinnost.
Média zpracovaná buňkami CHO exprimujícími analogy erythropoietinu byl analyzována na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Několik z těchto zkoušených analogů vykazuje účinnost, která je třikrát nebo vícekrát vyšší než účinnost humánního erythropoietinu. Zejména analogy obsahující přídavný N-vázaný uhlohydrátový řetězec v některé z poloh 30 nebo 88 vykazují dvojnásobně až trojnásobně vyšší účinnost než humánní erythropoietin, zatímco analogy obsahující přídavné O-vázané řetězce díky fúzi humánního erythropoietinu s fragmentem HCG polypeptidů vykazují přinejmenším dvakrát vyšší účinnost.
Dva analogy' erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce byly purifikovány a byly izolovány směsi s různým obsahem kyseliny sialové (příklad 8). Analogy Thr125 a Ser87Asn88Thr90 (EPO NI4) by ly rozděleny do tří separátních frakcí izoforem a byla stanovena biologická účinnost každé z těchto frakcí. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 8 ukazují, že izoformové frakce EPO NI s vyšším obsahem kyseliny sialové vykazují vyšší účinnost in vivo.
Frakce izoforem s vyšším obsahem kyseliny sialové z analogu EPO N14 a rekombinantní humánní erythropoietin (izoformy 9 až 14) byly studovány za použití zkoušky vazby k receptoru, farmakokinetických pokusů a pokusů zaměřených na stanovení zvýšení hematokritu u myší. Výsledky těchto zkoušek ukazují, že existuje přímý vztah mezi obsahem kyseliny sialové, poločasem životnosti a schopností zvýšit hematokrit ošetřených myší. Jak je zřejmé z obr. 13, 14, a 15, frakce izoforem s vy sokým obsahem kyseliny sialové z EPO N14 vykazuje podstatně vyšší poločas in vivo a vyvolává vyšší nárůst hematokritu než izolovaná izoforma 14 nebo rekombinantní humánní erythropoietin, přestože se frakce izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové z EPON N14 neváže k receptoru tak silně.
Předmětem vynálezu jsou také savčí hostitelské buňky [například buňky z ovarií čínského křečka (CHO)], které přednostně syntetizují izoformy humánního erythropoietinu nebo analogů erythropoietinu obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule, než je počet specifický, například nad 10 zbytků kyseliny sialové v molekule. Molekuly erythropoietinu obsahují Nvázané a O-vázané a O-vázané oligosacharidové struktury, které mohou omezovat obsah kyseliny sialové v molekule. Tak například tetraantenámí (se čtyřmi rozvětveními) N-vázané oligosacharidy nejčastěji poskytují čtyři možná místa pro připojení kyseliny sialové, zatímco biantenámí a triantenámí oligosacharidové řetězce, kterými může být nahrazena tetraantenámí forma na asparaginových vazebných místech, obvykle obsahuje nejvýše pouze 2 nebo 3 připojené zbytky kyseliny sialové. O-vázané oligosacharidy obvykle poskytují dvě míst pro připojení kyseliny sialové. Molekuly erythropoietinu tedy mohou přijmout celkem 14 zbytků kyseliny sialové, za předpokladu, že jsou všechny tři N-vázané oligosacharidy tetraantenámí. Kultuiy savčích buněk se podrobí screeningu a buňky, které přednostně zavádějí tetraantenámí řetězce do rekombinantního erythropoietinu, což má za následek maximalizaci počtu míst pro připojení zbytků kyseliny sialové.
N-vázané oligosacharidy erythropoietinu izolovaného z moči obsahují kyselinu sialovou jak s vazbou α 2,3, tak s vazbou α 2,6 ke galaktóze (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3 657 (1988)). Kyselina sialová s vazbou α 2,3 se obvykle aduje na galaktózu na mannosové větvi α
-9CZ 291343 B6
1.6 a kyselina sialová s vazbou a 2,6 se aduje na galaktózu na mannosové větvi a 1,3. Pro zavádění kyseliny sialové do mannosové a 1,6 a mannosové a 1,3 větve jsou nejúčinnější enzymy schopné vyvolávat adici sialové kyseliny (β-galaktosid a 2,3 sialyltransferáza a βgalaktosid a 2,6 sialyltransferáza).
Pro produkci rekombinantních glykoproteinů, včetně rekombinantního erythropoietinu, se jako hostitelských buněk obvykle používá buněk z ovarií čínského křečka (CHO), které jsou deficientní na dihydrofolát reduktázu (DHFR). Tyto buňky neexprimují enzym β-galaktosid a
2.6 k N-vázaným oligosacharidům glykoproteinů produkovaných v těchto buňkách (Mulsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi et al., J. Chromatogr. 400, 207 (1987)).
V důsledku toho rekombinantní erythropoietin produkovaný v buňkách CHO neobsahuje kyselinu sialovou s vazbou 2,6 ke galaktóze (Sasaki et al. (1987), výše uvedená citace; Ta keuchi et al. (198) výše uvedená citace)).
V dalším provedení tohoto vynálezu je humánní erythropoietin nebo analog erythropoietinu produkuje v buňkách CHO, které jsou transfekovány funkčním genem β-galaktosid a 2,6 sialyltransferázy, za účelem zavedení kyseliny sialové do galaktózy s vazbou a 2,6. Výsledné izoformy budou obsahovat kyselinu sialovou vázanou ke galaktóze jak vazbou a 2,3, tak vazbou a 2,6. Popis technik, kterými se vytvářejí modifikované buňky CHO nebo jiné hostitelské savčí buňky je uveden v Lee et al.„ J. Biol. Chem. 264, 13 848 (1989).
Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství specifické izoformy nebo směsi izoforem v kombinaci s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem užitečným při léčbě erythropoietinem. Do rozsahu vynálezu spadají též farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu spolu s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem. Pod označením „terapeuticky účinné množství, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí množství, s nímž se za daných podmínek a při daném režimu podávání dosáhne terapeutického účinku. Izoformy humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají parenterální cestou. Konkrétní cesta podávání bude záviset na léčené chorobě. Izoforma humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají ve formě prostředku obsahujícího vhodný nosič, jako je humánní sérový albumin, vhodné ředidlo, jako je pufrovaný roztok chlorid sodného a/nebo vhodný adjuvans. Za požadovanou dávku bude požadována dávka postačující pro zvýšení hematokritu léčených pacientů. Tato dávka se bude měnit v závislosti na závažnosti léčené choroby, použitém způsobu podávání apod.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter, a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Jako erythropoietinového standardu se při biologických zkouškách in vivo popsaných v příkladech používá rekombinantního erythropoietinového standardu standardizovaného proti částečně purifikovanému erythropoietinovému standardu z moči. Měří se tedy pouze relativní specifická účinnost in vivo. Specifická účinnost in vivo je proto také vyjadřována v ,jednotkách/ml“, ,jednotkách/mg“ a jednotkách/A28o a nikoliv v jednotkách „IU/ml“, „IU/mg“ a „IU/A28o“, poněvadž použitý erythropoietinový standard nebyl přímo korelován s žádným existujícím mezinárodním standardem.
-10CZ 291343 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace izoforem rekombinantního erythropoietinu
Rekombinantní erythropioetin se vyrobí způsobem popsaným v publikaci Lin, uvedené výše. Rekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí látka pro první a třetí izolaci izoformy se purifikuje způsobem popsaným v příkladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše. Výchozí látka pro druhou a pátou izolaci izoformy se purifikuje způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Lai et al., který je modifikován tím, že se použije chromatografie na Q-Sepharose. Tyto přípravky obsahují směsi izoforem rekombinantního erythropoietinu se stejnou aminokyselinovou sekvencí, jako má humánní erythropoietin získaný zmoci a převážně obsahují izoformy 9 až 14. Výchozí materiál pro čtvrtý preparativní postup pro získání izoformy představuje materiál eluovaný během promývání sloupce anexu z příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. 5mM kyselinou octovou/lmM glycinem/6M močovinou. Tato frakce obsahuje izoformy s počtem zbytků sialové kyseliny 9 nebo nižším a dále se před použití na preparativní izoelektrickou fokusaci purifikuje gelovou filtrační chromatografií popsanou v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. Při šesté přípravě izoformy se jako výchozího materiálu používá purifíkovaného rekombinantního erythropoietinu s obsahem 4 až 13 zbytků kyseliny sialové. Tento materiál se purifikuje způsobem popsaným v příkladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše, pouze s tím rozdílem, že se modifikuje zpracování ionexového sloupce (eluce rekombinantního eiythropoietinu se provádí gradientem chloridu sodného při pH 8,4 a vypustí se promývání kyselinou octovou/močovinou. Při tom se dosáhne retence většiny izoforem obsažených ve výchozím materiálu.
Při šesti různých preparativních postupem pro získání jednotlivých izoforem se použije preparativní izoelektrické fokusace v granulovaném gelovém loži (Ultrodex LKB). Tyto postupy se provádějí v podstatě stejně jako je to uvedeno v poznámce LKB Application Notě 198. Používá se alfolytů Pharmalyte 2.5-5 (Pharmacia a použití gelové lože obsahuje 5M močovinu.
Při první přípravě se přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20mM citranu sodném/lOOmM chloridu sodném o pH 7,0 nanese na gel a přibližně 16 hodin fokusuje při výkonu 8 W. Po izoelektrické fokusaci se pásy izoforem na gelu vizualizují přetisknutím gelového lože na papír. Získaný otisk se fixuje máčením v fixačním roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% kyselina sulfosalicylová) při celkem třech výměnách fixační lázně, přičemž zpracování v každé lázni se provádí 10 minut při teplotě místnosti, potom se provede jedna výměna za roztok o složení 40% methanol/10% kyselina octová (zpracování se provádí při teplotě 30 až 60 °C po dobu přibližně 10 minut), pásy se 15 minut barví při 60 °C 0,125% roztokem modří Coomessie Blue R-250/4% methanol/10% kyselina octová, načež se provede odbarvení v 7,5% methanolu/10% kyselině octové, aby se zviditelnily oddělené izoformy. Oblast granulovaného gelového lože obsahující izoformy (asi 50 % pryskyřice) se odstraní, smíchá s vodou (asi 16 ml) a suspenze se nalije na misku o rozměrech 14 x 62 cm a odpaří se na čistou hmotnost přibližně 40 g. Vzniklý přípravek se fokusuje podruhé a výše uvedeným způsobem se provede kontaktní otisk gelového lože. Část gelu obsahující každou ze 6 rozeznatelných izoforem se z gelového lože odstraní.
Eluce izoforem z gelu se provede přídavkem roztoku obsahující lOmM Tris-HCl o pH 7,0/5mM Chaps ke každé izoformě. Každá vzniklá suspenze se uvede do krátké kolony a eluuje pufrem Tris-Chaps. Eluáty se shromáždí a odděleně aplikují na krátké kolony (konfigurace s otevřenou kolonou) obsahující pryskyřici s obrácenou fází Vydac C4 ekvi libro vanou ve 20% ethanolu/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0, 35% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a 65% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Frakce eluovaná 65% ethanolem/lOmM Tris se zředí v poměru 1:1 lOmM Tris-HCl
-11 CZ 291343 B6 ορΗ 7,0, zkoncentruje a potom se provede výměna pufru (lOmM Tris-HCl o pH 7,0) v mikrokoncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Analytická izoelektrická fokusace tohoto přípravku se provádí v podstatě způsobem popsaným v poznámce LKB Technical Notě 250 za použití Servalyte 3-5 amfolinů (Serva) na polyakrylamidovém gelu obsahujícím 5m močovinu.
Při druhém preparativním postupu se přibližně 25 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody nanese na gel a fokusuje při 2,5 W po dobu 35 minut a při 10 W po dobu asi 17 hodin. Pásy fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži se odstraní, a tak se získá celkem 11 produktů. Objem každého z těchto produktů se upraví na 7,5 ml deionizovanou 10 vodou a 20 ml každého z výsledných supematantů se podrobí analytické izoelektrické fokusaci popsané výše. Ke každému z produktů se přidá 5 ml 1,5M Tris-HCl o pH 8,8 a každá ze suspenzí se převede do malé kolony a sloupcem se nechá protéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně 3 objemy sloupce 0,5M Tris-HCl o pH 7 a promývací roztok se spojí seluátem. Spojené eluáty se zkoncentrují a provede se výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid 15 sodný o pH 7,0 za použití ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Zkoncentrované roztoky (přibližně 0,5 ml) se potom nechají projít filtrem z acetátu celulózy s vylučovací mezí 0,22 pm. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že 5 produktů obsahuje převážně vždy jedinou izoformu 10, 11, 12, 13 a 14.
Při třetím preparativním postupu se přibližně 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21,8 ml destilované vody nanese na gel a provede se fokusace 25 minut při 2 W, 20 hodin při 10 W a 15 minut při 15 W. Pásy proteinu odpovídající jednotlivým izoformám se zjistí vizuálně a odstraní z gelového lože. K izoformám izolovaným na gelu se přidá destilovaná voda, čímž 25 vznikne suspenze a výsledné supematanty se analyzují analytickou izoelektrickou fokusaci. Ke každé suspenzi se přidá stejný objem 1M Tris-HCl o pH 7,2, suspenze se převedou do separátních krátkých kolon a kapalná fáze se nechá protéci kolonou, aby se eluovaly izoformy. Každý eluát se zkoncentruje, provede se výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0 za použití ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) s vylučovací mezí 30 molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že byly získány produkty obsahující převážně jednotlivé izoformy 9, 10, 11, 12, 13 a 14.
Při čtvrtém preparativním postupu pro získání izoforem se jako výchozího materiálu použije erythropoietinu obsahujícího izoformy 3 až 9 (vyrobeného výše popsaným způsobem). Před 35 preparativní izoelektrickou fokusaci, která se provádí v podstatě způsobem popsaným v souvislosti s preparativními postupy 1 až 3, se amfolyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionují v izoelektrické fokusační cele s kapalnou fází Rotofor (Βίο-Rad, Richmond, Kalifornie, USA), aby se získalo amfolytové rozmezí vhodnější pro nižší izoelektrické body výchozího materiálu. Prekrakcionace se provádí tak, že se 6,7 ml Pharmalyte 2,5-5 smíchá s 15 g močoviny a objem 40 směsi se purifíkovanou vodou doplní na 50 ml. Vzniklá směs se frakcionuje v zařízení Rotofor při 10 W, teplotě 1 °C po dobu 5,5 hodiny za použití 0,lM kyseliny fosforečné, jako anolytu a 0,lM hydroxidu sodného jako katolytu. Amfolytové frakce s naměřenými hodnotami v rozmezí od 4,5 do asi 6 se použití na izoelektrickou fokusaci v plochém loži.
Amfolyty se odstraní z izoforem za použití zařízení Centrieluter (Amicon, Danvers, Massachusetts, USA) a za použití zařízení Centricon s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton (Amicon). Přitom se pracuje za těchto podmínek: 0,18 Tris-pufr o pH 8,8, 100 V, 25 až 30 mA, 3 hodiny. U izoforem se provede výměnu pufru (0,lM chlorid sodný) pomocí gelové filtrace za použití náplně Sephadex G-25 (Pharmacia). Analytická izoelektrická fokusace 50 5 výsledných produktů ukazuje, že tyto produkty obsahují izoformy 4, 5, 6, 7 a 8. Izoforma 4 přechází ve formě několika pásů, což ukazuje, že u ní mohla proběhnout v určitém rozsahu degradace.
Pátý preparativní postup pro získání izoforem se modifikuje zařazením prefokusačního stupně do 55 izoelektrického fokusačního postupu na plochém loži. Při této modifikaci se protein nepřidá ke
-12CZ 291343 B6 směsi amfolytu, močoviny a gelu před elektroforézou, ale zavede se do izoelektrického fokusačního zařízení po vytvoření gradientu pH v gelovém loži. Po provedení prefokusace (75 ml, 1 500 Volt-hodin) se úsek gelového lože v rozmezí od 2,25 do 4,25 cm od katody vyjme, smíchá s roztokem erythropoietinu a vrátí zpět do gelového lože. Po izoelektrické fokusaci se z gelového lože izolují izoformy 10, 11, 12, 13 a 14 a oddělí se od amfolytu ultrafiltrací za použití zařízení Centricon-10 (Amicon).
Modifikace prefokusací se provádí z toho důvodu, aby se charakteristiky ultrafialové absorbance izoformových přípravků připodobnily charakteristikám výchozího rekombinantního erythropoietinu. Toto zlepšení spektrální charakteristik je zřejmé z poměru absorbance izolovaných izoforem pří 280 a 260 nm. Průměrný poměr absorbance při 280 nm k absorbanci při 260 nm (A280/A260) u izoforem z preparativních postupů 2 a 3 (bez prefokusace) je 1,36 ± 0,11, zatímco průměrný poměr A280/A260 u preparativních postupů 5 a 6 (s prefokusací) je 1,68 ± 0,20. Když se z výpočtu vyloučí izoforma č. 14, dosáhne se průměrného poměru A280/A260 v případě preparativních postupů 5 a 6 hodnoty 1,74 ± 0,09 (izoforma 14 má možná nejvíce atypické spektrum, poněvadž je přítomna v nejmenším množství a je tedy náchylnější k interferencím stopovými nečistotami složek amfolytu nebo z toho důvodu, že je nejblíže elektrodě v průběhu izoelektrické fokusace na plochém loži. Průměrná hodnota poměru A280/A260 pro rekombinantní erythropoietin vyrobený podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. (za použití modifikace popsané výše, která spočívá v tom, že se jako anoxové pryskyřice použije 0-Sepharose) je 1,91 ± 0,04.
Jak již bylo uvedeno výše, výchozím materiálem pro šestý preparativní postup pro výrobu izoforem je rekombinantní erythropoietinový přípraven obsahující izoformy 4 až 13. Amfolyty se prefokusují v zařízení Rotofor tak, jako v případě čtvrtého přípravku. Frakce amfolytu s naměřenými hodnotami pH v rozmezí 3,7 až 4,8 se podrobí izoelektrické fokusaci na plochém loži. Ploché lože se prefokusuje tak, jako v případě pátého preparativního postupu a po ultrafiltrací (Centricon 10) pro odstranění nosičových amfolytů se získají izoformy č. 9, 10, 11, 12 a 13.
Příklad 2
Obsah kyseliny sialové v izoformách rekombinatního erythropoietinu
U izoforem izolovaných způsobem popsaným v příkladu 1 a erythropoietinu purifíkovaného způsoby popsanými ve výše uvedené publikaci Lai et al. (směs izoforem 9 a 14) se provede výměna pufru za použití 0,10 až 0,15M chloridu sodného a provede se analýza na obsah kyseliny sialové za použití modifikovaného postupu popsaného v Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Zbytky kyseliny sialové se odštěpí od glykoproteinů hydrolýzou pomocí 0,35M kyseliny sírové (80 °C, 30 minut) a vzniklé roztoky se neutralizují před analýzou hydroxidem sodným. Za účelem odhadu množství přítomného erythropoietinového proteinu se provede Bradfordovo stanovení proteinů (Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976) za použití rekombinantního erythropoietinu s aminokyselinovou sekvencí humánního erythropoietinu, jako standardu. Použije se zkouškových činidel a mikrometody Bio-Rad. Výsledky vyjádřené v mol kyseliny sialové na mol erythropoietinu jsou zřejmé z tabulky 1. Izoformy se označí podle počtu zbytků sialové kyseliny v molekule a vykazují rozmezí od nejméně kyselých (izoforma 9) do nejkyselejších (izoforma 13).
Izoformy 9 až 13 jsou přítomny v gelových drahách 6 až 10 (viz obr. 1). Množství izoformy 14 není dostatečné pro přesné změření obsahu kyseliny sialové. Obsah kyseliny sialové v této izoformě se dedukuje na základě migrace této izoformy na IEF gelech vzhledem k ostatním izoformám. Obsah kyseliny sialové v izoformách 5 až 8 (přípravek č. 4) nebyl měřen, ale podobně se dedukuje na základě migrace na IEF gelech.
-13CZ 291343 B6
Tabulka 1
Izoforma erythropoietinu izoforma 13 izoforma 12 izoforma 11 izoforma 10 izoforma 9
Obsah kyseliny sialové [mol/mol erythropoietinu] směs izoforem (9 až 14)
12,9 ± 0,5
11,8 ±0,2
11,0 ±0,2
9.8 ± 0,3
8.9 ± 0,6
11,3 ±0,2
Příklad 3
Účinnost izoforem rekombinantního erythropoietinu
Izoformy izolované způsobem popsaným v příkladu 1 se zkoušejí postupem využívajícím absorbanci při 280 nm, Bradfordovým stanovením proteinů a metodou RIA pro erythropoietin, aby se zjistilo množství přítomného rekombinantního erythropoietinu. Pro stanovení relativní biologické účinnosti in vivo se použije exhypoxického polycytohemického biostanovení na myších (Cotes et al., Nátuře, 191, 1065 (1961)). Při kvantitativním stanovení množství přítomného erythropoietinového proteinu za použití radioimunoeseje pro eiythropoietin se u některých izoforem naměří vyšší relativní specifické účinnosti in vivo v důsledku zjevně snížené imunoreaktivity imunoforem obsahujících velké množství kyseliny sialové, což vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu, a tedy nadhodnocení relativní specifické účinnosti in vivo u většiny negativních izoforem. Výsledky biostanovení na myších, vyjádřené vjednotkách/ml, se dělí odpovídajícími koncentracemi proteinu, přičemž se získají specifické účinnosti in vivo vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového polypeptidu. Hodnoty specifické účinnosti jsou uvedeny v tabulce 2.
V tabulce 2 znamená index „n“ počet nezávislých izoformových přípravků jejichž výsledky přispívají k výsledné hodnotě specifické účinnosti. Ve většině případů bylo s každým izoformovým přípravkem provedeno několik stanovení in vivo. Stejná data in vivo přispívají k výpočtům specifické účinnosti ve všech tří sloupcích. Obsah erythropoietinového polypeptidu v jednotkách/mg se stanoví na základě absorbance při 280 nm, na základě potence při radioimunoeseji nebo z výsledků Bradfordova stanovení proteinu. Jako standardu pro Bradfordovo stanovení proteinů se používá purifikovaného rekombinantního erythropoietinu obsahujícího izoformy 9 až 14. Hodnota indexu „n“ může být u výpočtů pořízených za použití dat z Bradfordova stanovení proteinů nižší, poněvadž některé přípravky již v době provádění Bradfordova stanovení nebyly k dispozici.
Jako standardu pro radioimunoeseje a pro stanovení in vivo se používá erythropoietinu purifikovaného způsoby popsanými v Lai et al. (výše uvedená publikace), který obsahuje směs izoforem až 14.
Hodnoty relativní specifické účinnosti, které jsou vyjádřeny v jednotkách/mg (U/mg) erythropoietinového polypeptidu, je možno převést na jednotky/A280 vynásobením hodnotou 0,807 mg erythropoietinového polypeptidu/A28o· Tento převodní faktor se získá vynásobením extinkčního koeficientu pro erythropoietin (1,345 mg/A28o) obsahem proteinu v erythropoietinovém glykoproteinu (přibližně 60 % hmotnostních, Davis et al., Biochemistry, 26, 2633 (1987)) a tím se získá hodnota v mg erythropoietinového polypeptidu/A28o (tj. 1,345 mg erythropoietinu/ A28o x 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinu = 0,807 mg polypeptidu/A280). Kromě toho je možno hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového polypeptidu vynásobit faktorem 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu, a tím se získají hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového glykoproteinu.
-14CZ 291343 B6
| ti | CN | tn | m | m | CM | rH | rH | rH | |
| r. | o | o | o | o | o | O | |||
| bO | o | o | o | o | o | O | |||
| cn | CN | to | 0* | KO | 10 | O | o | o | |
| -5 **! | O | o | o | ||||||
| tó | m | o | 04 | CM | rH | cn | tn | to | |
| tn | kO | cn | m | m | m | rH | |||
| XD Ό Ό •ti d | |||||||||
| -H | 44 | Ή | Ή | Ή | +1 | 44 | 44 | 44 | |
| Ή rH | O | o | o | o | o | o | |||
| o | o | o | o | o | o | o | o | O | |
| Φ oJ P< N | r* | CN | χτ | σι | tO | o o | O co | o m | |
| £ d | CO | t- | c- | rH | rH | M | CM | m | |
| o β | vo | m | CD | tn | r- | rH | rH | ||
| PH x_z | cn | m | CN | CM | rH | rH | to | rH |
CM in m T 04
£>
d
H — ba o E a> cm □ <
| O | o | o | o | o | ||||
| O | o | o | o | o | O | |||
| r- | tn | r | cn | tn | o | o | o | o |
| γ- | o | o | o | |||||
| γ- | σι | rH | γ- | xr | rH | cn | cn | |
| γο | tn | V | ιο | tn | ιο | |||
| xr | to | rH | ||||||
| -H | 44 | 44 | +1 | 44 | +1 | Ή | +1 | H |
| o | o | o | o | o | ||||
| o | o | o | o | o | o | o | o | o |
| CD | r- | xr | CO | cn | o | o | o | o |
| CO | to | cn | cn | |||||
| ΙΩ | to | eo | m | o | ||||
| o | tn | tn | tn | Γ- | to | o | o | CD |
| CM | CM | CM | CM | rH | σι | r- | m | rH |
c\l xr *T fn rH
| o | o | o | ||||
| O | o | o | o | o | ||
| o | to | 10 | rH | o | O | o |
| rH | <n | O | o | |||
| o | tn | rH | co | co | ||
| ΓΊ | cn | tn | xr | rH | ||
| m | ||||||
| -H | Ή | •H | +1 | 44 1 | 1 44 | 44 |
| o | o | o | o | o | ||
| o | o | o | o | o | o | o |
| ať | to | 04 | t- | o | o | o |
| CM | 04 | |||||
| 0) | Γ- | m | CM | eo | ||
| CD | Ο | r- | co | co | tn | to |
| CM | cn | CM | CM | rH | Ό | xr |
O O r+1
600
| V | <n | CM | rH | o λ co r- cn |
| rH | rH | rH | rH | rH |
Data uvedená v tabulce 2 jsou také zpracována graficky na obr. 2A, 2B a 2C. Tato data ukazují, že relativní účinnost erythropoietinu in vivo stoupá v závislosti na obsahu kyseliny sialové až do izoformy č. 11. Izoformy 11 až 14 vykazují v podstatě stejnou relativní biologickou účinnost invivo (to je nejzjevnější, když se koncentrace izoformy 14 vyjádří za použití hodnoty z Bradfordova stanovení. Bradfordova hodnota může být pro izoformu 14 přesnější s ohledem na obecně nízkou dosaženou koncentraci a v důsledku toho na obtížnost stanovení A28o a nejzjevněji sníženou reaktivitu při RIA u velmi negativních forem, viz výše uvedená diskuse.) Vyšší relativní specifická účinnost in vivo izoforem erythropoietinu s větším množstvím sialové kyseliny je nej pravděpodobněji způsobena delším poločasem životnosti těchto forem v oběhu. Izoformy 9 a 13 byly označeny radioaktivním jodem (,25I) a byla změřena jejich rychlost clearance u krysy. Poločas životnosti v oběhu je v případě izoformy 13 podstatně delší než v případě izoformy 9.
Příklad 4
Selekce směsí izoforem rekombinantního erythropoietinu chromatografii na Q-Sepharose
Média zpracovaná buňkami produkujícími rekombinantní erythropoietin (získaná postupy popsanými ve výše uvedené publikaci Lín) se zkoncentrují a diafiltrují proti lOmM Tris o pH 7,2. Koncentrace proteinu se stanoví Bradfordovým proteinovým mikrostanovením za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. K 19,6 ml roztoku obsahujícímu 40 mg celkového proteinu se přidá síran měďnatý do koncentrace 20μΜ, roztok se přefiltruje přes filtr s vylučovací mezí 0,45 pm a nanese na sloupec (1,05 cm - výška; 2,2 cm - průměr) obsahující 4ml lože náplně O Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrované s lOmM Tris o pH 6,8 až 7,0 při 4 °C. Po nanesení vzorku se sloupec promyje dvěma objemy sloupce stejného pufru. Průtok sloupcem je přibližně 1 ml/min. Při tomto postupu se pro selekci definovaných směsí izoforem erythropoietinu použije 6 oddělených kolon.
Kolony se promyjí 6 až 9 objemy sloupce pufru s nízkým pH, který se v případě kolony 1 skládá z 150mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 2 z 200mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 3 z 250mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 4z300mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 5 z 150mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny a v případě kolony 6 z 300mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny. Hodnota pH v kolonách se zvýší na asi pH 7 promytím každé kolony 8 až 11 objemy sloupce lOmM Tris-HCI, 55mM chloridu sodného, 20μΜ síranu měďnatého o pH 7. Definované směsi izoforem erythropoietinu se eluují ze sloupců promytím lOmM Tris-HCI, 140mM chloridem sodným a 20μΜ síranem měďnatým o pH 7,0.
Eluované izoformové produkty z každé kolony se zkoncentrují a rozpouštědlo se vymění za vodu za použití mikrokoncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Výsledky analytické izoelektrické fokusace těchto zkoncentrovaných produktů jsou uvedeny na obr. 3. V gelových drahách 1 až 6 jsou v uvedeném pořadí obsaženy definované směsi izoforem erythropoietinu eluované ze sloupců 1 až 6. Směs izoforem obsažená v gelové dráze u levého okraje obr. 3 představuje buněčné médium aplikované na sloupec Q-Sepharose popsaný výše, přičemž sloupec je promyt 5mM kyselinou octovou, lmM glycinem, 20μΜ síranem měďnatým, 6M močovinou a směs izoforem erythropoietinu je eluována ze sloupce za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs izoforem se dále purifikuje způsoby popsanými ve výše citované publikaci Lai et al. před prováděním analytické izoelektrické fokusace.
-16CZ 291343 B6
Příklad 5
Frakcionace izoforem rekombinantního erythropoietinu za použití gradientu s nízkou hodnotou pH na Q-Sepharose
Při dalším postupu se izoformy erythropoietinu dělí za použití gradientu s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Koncentrované diafiltrované médium obsahující erythropoietin se nanese na sloupec Q-Sepharose v přibližném poměru 40 mg celkového proteinu na ml gelu. Potom se sloupec promyje přibližně 2 objemy sloupce lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a následně přibližně 10 objemy sloupce 2mM kyseliny octové/lmM glycinu/20pM síranu měd’natého/6M močoviny (o pH přibližně 4,8), aby se odstranily kontaminační proteiny a izoformy erythropoietinu obsahující méně než asi 7 zbytků kyseliny sialové. Izoformy obsahující přibližně 8 až 12 zbytků kyseliny sialové se eluují ze sloupce za použití gradientu od přibližně 2mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatém do 40mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatém (o pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů sloupce a sbírají se frakce o přibližném objemu jednoho sloupce do nádob obsahujících Tris pufr v objemu postačující pro úpravu pH na hodnotu v rozmezí od 6 do 8,5, aby se zabránilo dlouhodobé expozici zachycených frakcí nízké hodnotě pH. Dělení se monitoruje anahtickou izoelektrickou fokusaci alikvotních vzorků frakcí. Na obr. 4 je znázorněno dělení izoforem 8 až 11, které lze tímto postupem provést. Izoformy 12 až 14, které zůstanou po skončení gradientova eluce vázány ke sloupci, se eluují promytím pufrem obsahujícím lOmM Tris-HCl, 140mM chlorid sodný a 20mM síran měďnatý (o pH 7,0). Izoformy (oddělené gradientovou eluci nebo eluované roztokem chloridu sodného) se zbaví kontaminačních proteinů chromatografií na obrácených fázích a následnou gelovou chromatografií (viz příklad 2 výše uvedené publikace Lai et al.).
Příklad 6
Konstrukce analogů humánního erythropoietinu
Existující míst připojení uhlohydrátových zbytků v aminokyselinové sekvenci humánního erythropoietinu jsou uvedena na obr. 5 (SEQ ID NO: 26). Postupy, kterými se vytvářejí přídavná glykosylační místa v erythropoietinu, jsou souhrnně uvedeny na obr. 6A až 6C a jsou popsány dále.
Pro použití při in vitro mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové primery.
-17CZ 291343 B6 (Asn4, Ser6] EPO: 5' CGCCCACCAAACCTCAQQTGTGACAGCCGA 3’ (SEQ ID NO; 1) [Asn9, Serll] EPO: 5’ ATCTGTAC£ACCGAAS£CTGGAGAGGT 3' (SEQ ID. NO: 2) [Asn69] EPO: 5’ GGGCCTGGCCAAQCTGTCGGAAG 3‘ (SEQ ID. NO: 3) [Asn12*] E?O: 5’ TCCCCTCCAGATAAIGCCTCAGCTGC 3' (SEQ ID. NO: 4) [Asn125, Serl27] EPO: 5' CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3' (SEQ ID. NO: 5) [Asn163, Serl65j EPO: 5> AGGCCTGCAGGfiAXGGGASCAGATGACCAGGTG 3' (SEQ ID. NO: 6} [Thr125] EPO: 5’ TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3' (SEQ ID. NO: 7) [Pro12*, Thrl25] EPO: 5’ CCTCCAGATQCG&CCTCAGCTGC 3' (SEQ ID. NO: 8)
Podtržené kolony ukazují chybně párované oblasti, v nichž aminokyseliny uvedené v závorkách zahrnují aminokyseliny divokého typu.
Produkt [Asn4, Ser6]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 4. Produkt [Asn9, Sern]EPO se konstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 9. Produkt [Asn69]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 69. Produkt [Astn125, Ser127]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 125. Produkt [Thr125]EPO io a [Pro124,Thr125]EPO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr125.
Pro použití při in vitro mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové primery.
-18CZ 291343 B6 [Asn6*, Thr71] EPO: 5’ GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC. 3’ (SEQ ID. NO: 9) [Ser68, Asn69, Thr7i] EPO:
5’ CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' (SEQ ID. NO: 10) [Asn3-25/ Thrl27] £pO: 5' CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3' (SEQ ID. NO: 11) [Asnl25, Thr 127f Thr 131] EPO:
51ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3' (SEQ ID. NO: 12) [Prol24, Asni25, Seri27] EPO:
5’ CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3’ (SEQ ID. NO: 13) [Prol24, ASI1125, Thrl27] EPO:
5’ CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3’ (SEQ ID. NO: 14) [Thrl25, Thrl26] EPO: 5’ CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3’ (SEQ ID. NO: 15) [Pro3·2^, Thr3·2^, Thr126, Thr13:1-]EPO
Pomocí [Pro124, Thr125]EPO cDNA, jako výchozí látky se oligonukleotidový primer 5 5-AGATCCGACCACCGTGCTCCAC 3' (SEQ ID. NO: 16) převede na [Pro124, Thr125,
Thr126]EPO. Oligonukleotidového primeru 5'TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' (SEQ ID. NO: 17) se potom použije pro vytvoření [Pro124, Thr125, Thr126, ThR131]EPO.
Produkty [Asn69, Thr71]EPO a [Ser68, Asn69, Thr71]EPO se zkonstruují za účelem zavedení 10 N-glykosylačního místa do Asn 69 a pro zvýšení stupně N-glykosylace v tomto místě. Produkty [Asn125, Thr127]EPO, [Asn125, Thr127,Thr’31]EPO, [Pro124, Asn125, Ser,27EPO a [Pro124, Asn125, Thr127,EPO se zkonstruují za účelem zavedení N-glykosylačního místa do Asn 125 a pro zvýšení stupně glykosylace v tomto místě. Produkty [Thr125, Thr126]EPO a [Pro124, Thr125, Thr126, Ser131] EPO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr a za 15 účelem zvýšení glykosylace v tomto místě.
-19CZ 291343 B6
Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenezi je plazmid Hul3, což je klon humánní erythropoietinové cDNA v pUC 8 (Law et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). Plazmidová DNA získaná z Hul3 se štěpí restrikčními enzymy BstEII a BglII, vzniklé fragmenty DNA se podrobí elektroforéze na agarosovém gelu a fragment erythropoietinové DNA o délce 810 bázových párů (bp) se izoluje z gelu za použití soupravy GeneClean(R) a postupů poskytnutých výrobcem (BIO 101, lne.). Plazmid pBRgHuEPO obsahuje genomový gen erythropoietinu, jakožto fragment BamHI vložený do derivátu pBR322 (použitý způsob je popsán ve výše citovaném patentu, původce Lin). pBRgHuEPO se také štěpí BstEII a GblII a izoluje se vektorový fragment o délce 6 517 bp. Ligací těchto dvou fragmentů se získá IGT1. Při konstrukci pEC-1 se pDSVL (který je popsán ve výše uvedeném Línově patentu a který je znázorněn na obr. 5B) štěpí BamHI a liguje se do něj izolovaný 2.8kb fragment BamHI sIGTl obsahující erythropoietinovou cDNA.
Pro vytvoření jednořetězcové DNA pro in vitro mutagenezi se pEC-1 štěpí BamHI a BglII a izoluje se 820pb fragment erythropoietinové cDNA. Tento fragment se liguje do místa BamHI ml3mpl8 za vzniku ml3-EC-l. Jednořetězcová DNA se získá ze supematantů E. coli kmene RZ1032, který byl infikován ml3-EC-l způsobem popsaným vKunkel et al., Methods inEnzymol. 154, 367 (1987) a Messing, Methods in Enzymol 101, 20 (1983). Pro in vitro mutagenezi se přibližně 1 pg jednořetězcové DNA a 0.2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše smíchá se 6 μΐ pufru (250mM Tris o pH 7,8, 50mM chlorid hořečnatý a 50mM dithiothreitol). Teplotní hybridizace primeru ktemplátu se provede tak, že se reakční objem doplní vodou do 10 μΐ, směs se 5 minut zahřívá na 65 °C a potom se nechá zchladnout na teplotu místnosti. Prodlužovací reakce se provede přídavkem vždy 2.5 μΐ dTTP, dATP, dGTP, dCTP a ATP (vždy o koncentrace 10μΜ) a následným přídavkem 1 μΐ (1 jednotky) E. coli DNA polymerázy (Klonowův fragment) a 1 μΐ (1 jednotky T4 DNA ligasy. Směs se inkubuje přes noc při 14 °C a použije sejí pro transformaci E. coli kmene JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 (1985)) způsobem popsaným ve výše uvedené Messingově publikaci.
Pro identifikaci mutantních klonů diferenciální hybridizací se plaky na živném agaru přenesou na filtry Gene Screen (New England Nuclear). Filtry se usuší pod infralampou a potom jednu hodinu inkubují v 6x SSC s obsahem 1% SDS při 60 °C. Pro hybridizací se výše uvedený oligonukleotidový primer (8 pmol) označí na konci T4 polynukleotid kinázou a gamma 32P-značeným ATP a inkubuje s filtry přes noc v 6x SSC, 0,5% SDS a lOOmg/ml DNA lososího spermatu při 37 °C, za účelem mutace [Asn124], při 55 °C, za účelem mutace [Asn4, Ser6], při 65 °C za účelem mutací [Thr125] a [Pro124, Thr125] a při 70 °C za účelem mutací [Asn9, Ser11] a [Asn163, Ser165]. Následující den se filtry třikrát promyjí 6x SSC při teplotě místnosti a provede se audiodiografie. Je-li to zapotřebí, promyjí se filtráty 6x SSC při postupně se zvyšující teplotě, až již není pozorována žádná, nebo je pozorována jen malá hybridizace k plakům se sekvencí erythropoietinové cDNA divokého typu. Kolony poskytující pozitivní hybridizační signály za těchto podmínek se identifikují a retransfekují do JMI09, za účelem izolace čistého kolonu. Dideoxyanalýza terminace řetězců ukazuje, že jsou přítomny mutace na asparaginový, serinový, threoninový a prolinový zbytek.
Vyvařovací metodou (Holmes et al., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)) se z transfekovaných buněk JMI09 získají dvouřetězcové ml3 EC-1 DNA obsahující změny [Asn4, Ser6], [Asn9, Ser11], [Asn69], [Asn124], [Asn125], [Ser127], [Asn163, Ser165], [Thr125] a [Pro124, Thr125]. Tyto DNA se štěpí BstEII a XhoII a izolují se 81 Obp fragmenty erythropoietinové DNA. pEC-1 se štěpí BstEII a potom částečně BglII a 5'-konce výsledných fragmentů se defosforylují bakteriální alkalickou fosfatázou v lOmM Tris o pH 8 při 60 °C v průběhu 60 minut. Vektorový fragment o délce 7 kb, který neobsahuje 81 Obp fragment BstEII-BglII, se izoluje a liguje kerythropoietinovým fragmentům popsaným výše. Výsledné plazmidy (označené pEC-X, kde X je číslo analogu) obsahují DNA kódující analogy erythropoietinu se změněnými aminokyselinovými zbytky v uvedených polohách.
-20CZ 291343 B6
Alternativně se zkonstruuje analog erythropoietinu (pEC34) in vitro mutagenezí, při níž se deletují aminokyselinové zbytky 41 až 55. Přitom vznikne menší (775 bp) fragment BstEII-BglII obsahující EPO. Tento fragment se výše uvedeným způsobem vloží do pECl. Za účelem klonování analogů erythropoetinu se pEC34 štěpí BstEII, částečně štěpí BglII, defosforyluje 5 a vektor se izoluje (tento způsob je popsán výše). Vektorový fragment o délce 7 kb se potom liguje k fragmentům erythropoietinu, jak je to popsáno výše. Klonování s pEC34 umožňuje snadné rozlišení mezi rekombinanty a jednoduchým novým uzavřením. Pouhým novým uzavřením vzniká menší fragment BstEII-BglII než jsou analogy, což lze snadno rozlišit na agarosovém gelu.
io
Těchto obecných postupů se použije pro konstrukci analogů erythropoietinu, které jsou uvedeny v tabulkách 3, 4 a 5. U každého analogu jsou uvedeny změny sekvence DNA; jinak mají oligonukleotidové primery použité na mutagenezi sekvenci, která je komplementární k humánnímu erythropoietinu.
-21 CZ 291343 B6
Tabulka 3
Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
| Analog číslo | Substituce aminokyselin | Změny v sekvenci |
| NI | Asn*Ser6 | CGC-4AAC ATC—1AGC |
| N2 | Asn9Sern | AGC—>AAC GTC-dAGC |
| N3 | Asni9Thr2i | GCC—MLAC GAG-dACG |
| N4 | Asn30Thr32 | GCT—>AAT CAC-^ACG |
| N5 | Asn*2 | CCA—>AAT |
| N6 | Ser*2Asn*3Thr*5 | CCA-^TCA GAC—>AAC ΆΑΑ—»ACA |
| N7 | Ser* 9 | TAT—»TCT |
| N8 | Asn51Thr33 | TGG—»AAT AGG—>ACG |
| N9 | Asn57Thr59 | GGG—>AAC CAG—>ACG |
| N10 | Asn69 | CTG—>AAC |
| Nil | Asnfi9Thr71 | CTG—>AAC TCG—žACA |
| NI 2 | Ser68Asn69Thr7i | Nil plus GCC—>TCC |
| NI 3 | Asn88Thr90 | TGG—1AAT CCC-4ACC |
| NI 4 | Ser87Asn88Thr90 | N13 plus CCG—žTCG |
| N15 | Ser87Asn88Thr90Thr92 | NI4 plus CAG—>ACG |
-22CZ 291343 B6
Tabulka 3 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
| Analog číslo | Substituce aminokyselin | Změny v sekvenci |
| NI 6 | Ser87Asne8Thr9°Alai-62 | N14 plus AGG-íGCG |
| N17 | Asn88Ser90 | TGG—>AAT CCC—»TCC |
| NI 8 | Val87Asn88Thr90 | CCG—žGTG TGG->AAT CCC—ACC |
| N19 | Ser07Asn88Gly89Thr9O | CCG—>TCG TGG—»AAT GAG-4GGG CCC-ACC |
| N20 | Asn89iie90Thr91 | GAG—AAC CCC—ATC CTG-» ACG |
| N21 | Ser87Asn89lle90Thr91 | N20 plus CCG—»TCG |
| N22 | Asnil3Thrii5 | GGA—AAC CAG—ACG |
| N23 | Asnii8Vali2i | GCC-AAC CCT—»GTT |
| N24 | Asni2iser122Thrl23 | CCT—AAT CCA-4TCA GAT-ACT |
| N25 | Asn!24 | GCG—»AAT |
| N26 | Serl22Asnl24 | CCA—>TCA GCG—AAC |
| N27 | Asn125serl27 | GCC-AAC GCT-»TCT |
| N28 | Asnl25Thri27 | GCC-AAC GCT-ACG |
-23CZ 291343 B6
Tabulka 3 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
| nalog číslo | Substituce aminokyselin | Změny v sekvenci |
| N29 | Leu121Seri22asni25Tíiri27 | N28 plus CCT-+CTT CCA—»TCA |
| N30 | Thri20Glyi22Leui23Asni25Thri27 | N28 plus TCC—»ACC CGC-+GGG GAT-KTC |
| N31 | Asnl26seri28 | TCA—»AAT GCT->TCT |
| N32 | Asni2SThri28vali2$ | TCA—>AAT GCT-žACT CCA-žGTA |
| N33 | Leui2iseri22Asni26Thri28vali29 | N32 plus CCT-»CTT CCA—>TCA |
| N34 | Thri2iGiyi23ser 125Asn126Thr128Vall29 | N32 plus CCT—>ACG GAT-4GGG GCC->TCC |
| N35 | Serl29Asnl30 | CCA—>AGC CTC-4AAC |
| N36 | Asn132 | ACA-4AAC |
| N37 | Asnl34Thrl36 | ACT—>AAT GAC—>ACC |
| N38 | Asnl35 | GCT-4AAT |
| N39 | Asnl36Thrl38 | GAC-4AAC TTC—>ACC |
| N40 | Asni37Thrl39 | ACT—>AAT CGC—>ACC |
| N41 | Asnl38Thrl40 | TTC—»AAC AAA—>ACA |
-24CZ 291343 B6
Tabulka 3 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog Substituce Změny
| číslo | aminokyselin | v sekvenci | |
| N42 | Asn144 | GTC—»AAC | |
| N43 | Ser143Thri49Val150 | TTC-4TCC | |
| CTC—+ACC | |||
| CGG—>GTG | |||
| N44 | Gly148Thri49 | TTC—»GGC | |
| CTC—>ACC | |||
| N45 | Asnl55 | CTG—>AAT | |
| N46 | Asn163Seri65 | ACA—>AAT | |
| N47 | Asn30Thr32Val87Asn88Thr50 | N4 a | N18 |
| N48 | Asn89Thr71Ser87Asn88Thr90 | Nil a | N14 |
-25CZ 291343 B6
Tabulka 4
Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog Substituce Změny číslo aminokyselin v sekvenci
| 01 | Ser8 | ATC—>AGC |
| 02 | Ser7 | TGT-+TCC |
| 03 | Ser8 | GAC-4AGC |
| 04 | Seru | GTC—>TCT |
| 05 | Ser18 | GAG—>TCG |
| 06 | Ser23 | GAG-žTCG |
| 07 | Ser28 | TGT-+AGC |
| 08 | Ser28 | TGT—>TCT |
| 09 | Ser30 | GC.T—>TCT |
| 010 | Ser33 | TGC—»TCA |
| 011 | Ser37 | GAG-4TCG |
| 012 | Ser48 | TAT—>TCT |
| 013 | Ser61 | GTA—»TCA |
| 014 | Ser63 | GTC-4TCC |
| 015 | Ser87 | CTG-+TCG |
| 016 | Ser68 | GCC—>TCC |
| 017 | Ser70 | CTG-»TCG |
| 018 | Ser73 | GCT—»TCT |
| 019 | Ser74 | GTC-»TCT |
| 020 | Ser75 | CTG—>TCG |
| 021 | Ser78 | GCC-+TCC |
| 022 | Ser81 | TTG—»TCG |
| 023 | Ser86 | CAG—»TCG |
| 024 | Ser87 | CCG->TCG |
| 025 | Ser83 | CTG—»TCG |
| 026 | Ser88 | GCC-+TCC |
| 027 | Ser88 | GTC-4TCC |
| 028 | Ser102 | CTT->TCT |
| 029 | Ser103 | CGC—»AGT |
-26CZ 291343 B6
Tabulka 4 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce
| Analog číslo | Substituce aminokyselin | Změny v sekvenci |
| 030 | Ser1 | CTC—>AGC |
| 031 | Ser1 | CTT->TCT |
| 032 | Šerm | GCT—?TCT |
| 033 | Ser112 | CTG—»TCG |
| 034 | Serii4 | GCC-žTCC |
| 035 | Ser128 | GCT-žTCT |
| 036 | Ser158 | TCG—) GAG |
| 037 | Ser161 | TGC—>TCC |
| 038 | Pro125Seri2? | GCC—>CCC GCT—>TCT |
| 039 | Thr62 | GAA—>ACA |
| 040 | Thr64 | TGG-4ACG |
| 041 | Thr65 | CAG—>ACG |
| 042 | Thr88 | TGG-4ACG |
| 043 | Thr98 | CCC-+ACC |
| 044 | Thr92 | CAG-4ACG |
| 045 | Thrl88 | AGT-4ACT |
| 046 | ThrllO | CGG—>ACG |
| 047 | ThrllS | CAG—>ACG |
| 048 | Thrl23 | GAT—>ACT |
| 049 | Thr124 | GCG—>ACG |
| 050 | Thr125 | GCC—>ACC |
| 051 | Thri25ser127 | GCC-+ACC GCT->TCT |
| 052 | Thr125Thr12fi | GCC—>ACA TCA—>ACA |
| 053 | Thr126 | TCA-íACC |
| 054 | Thrl27 | GCT-+ACT |
| 055 | Thrl30 | CTC—> ACC |
-27CZ 291343 B6
Tabulka 4 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo
Substituce aminokyselin
Změny v sekvenci
| 056 | Thr 131 | CGA—>ACA |
| 057 | Thri36 | GAC—?ACC |
| 058 | Thr 140 | AAA—»ACA |
| 059 | Pro124Thri25 | GCG—>CCG |
| GCC—>ACC | ||
| 060 | Pro124Thri25Thr126 | 059 plus TCA-4ACC |
| 061 | Proi24Thri25Thri26Thri3i | 060 plus CGA—» ACA |
| 062 | HGG C-terminální prodloužení |
Tabulka 5
Analogy erythropoietinu s místy pro N- a O-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo Substituce aminokyselin Změny v sekvenci
| NO1 | Ser^Asn^Thr90 HCG C-terminální prodloužení | N14a062 |
| NO2 | Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 HCG C-terminální prodloužení | N47 a 062 |
Plazmidy označené pDEC-X (kde X představuje číslo analogu) se zkonstruují insercí erythropoietinové cDNA do pDECdelta, který je derivátem plazmidu pDSa2. Expresní vektor pDSa2 je obecně popsán v mezinárodní přihlášce PCT WO90/14363. pDECdelta se získá zpDSa2 následujícím sledem stupňů:
1) Místo HindlII v pDSa2 se deletuje štěpením pDSa2 DNA HindlII, na lepivé konce HindlII se působí E. coli DNA polymerázou (Klenowův fragment) a jednotlivými dNTP a provede se religace vektoru s tupými konci. Získá se plazmid pDSa2deltaH. 2
2) pDSa2deltaH se rozštěpí Sáli a liguje se kněmu syntetický oligonukleotid obsahující sestřižený signál SV40 s Sáli linkerem připojeným k 3'-konci sestřiženého signálu. Syntetický oligonukleotid má následující sekvence (SEQ ID. NO: 18):
-28CZ 291343 B6
5' TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT
CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA
AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG
AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3 ’
Výsledným plazmidem je sestřih pDSalIdeltaH.
3) Sestřih pDSalIdeltaH se štěpí Sáli a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí T4 DNA polymerázou a jednotlivými dNTP. Stejnou metodou se otupí konce 820 bp fragmentu BamHI-BglII erythropoietinové cDNA a provede se ligace kplazmidu. Získá se plazmid pDEC-1.
4) Plazmid pDEC se rozštěpí KpnI a PvuII a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí nukleasou z bobu „Mung“. Plazmid se religuje za účelem delece vyštípnutého fragmentu Kpnl-PvuII, čímž vnikne plazmid pDECdelta.
Plazmidy pDEC-X se získají z pDECdelta úplným rozštěpením BstEII a potom částečným rozštěpením GblII. Vektorový fragment neobsahující erythropoietinové kódující sekvence se izoluje a liguje k 81 Obp fragmentů BstEII - BglII obsahujícím požadovaný plazmid.
Podrobnosti konstrukce některých analogů obsahujících několik aminokyselinových změn jsou popsány dále.
Konstrukce pDEC(N47) a pDEC(N48) pDEC(N47), který obsahuje mutace Asn30 Thr32 Val 187 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N18) a pDEC(N4). pDEC(N18) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDEc(N4) se rozštěpí BstEI a HindlI a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují po pDECdelta rozštěpeného BstEII a BglII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N47).
pDEC(N48), který obsahuje mutace Asn69 Thr71 Ser87 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N14) a pDEC(Nl 1). pDEC(N14) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDEc (Nil) se rozštěpí BstEII a HindlII a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují po pDECdelta rozštěpeného BstEII a BglII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N48).
Konstrukce pDEC(062) (fúze HCG-erythropoietin) pDEC (062) se složí zpECI a 107bp StuI-BglII linkeru ze syntetické DNA, který obsahuje 28 karboxy-terminálních aminokyselin z humánního chorionického gonatropinu (Ser-Ser-SerSer-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-ThrPro-Ile-Leu-Pro-Gln) (SEQ ID. NO: 25) (Pierce et al. Ann. Rew, Biochem. 50, 465 (1981)). Tento linker má následující sekvenci
-29CZ 291343 B6
5' CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC3' GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG5 ’ CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA (SEQ ID. NO: 19) ’ gttcaggtagggctgagggccccgggagcctgtggggctaggagggtgttactctag (SEQ ID. NO: 20) pECI se rozštěpí Stul a GblII a izoluje se 610 bp fragment DNA. Tento syntetický linker se fosforyluje ATP a polynukleotidkinázou a liguje s fragmentem pECI do pDECdelta před tím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.
Konstrukce pDEC(NOl) pDEC(NOl) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N14) (Ser87Asn88Thr90). pDEC177 se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser87Asn88Thr . pDEC(062) se rozštěpí Stul a GblII a izoluje se fragment o délce 107 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglIII způsobem popsaným výše.
Konstrukce pDEC(NO2) pDEC(NO2) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N47) (Asn30Thr32Val87Asn88Thr90). pDEC(N47) se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Asn30Thr32Val87Asn88Thr90. pDEC(062) se rozštěpí Stul a GblII a izoluje se fragment o délce 107 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.
Konstrukce pDEC(NO16) Ser87Asn88Thr90Ala162 pDEC(N16) se zkonstruuje složením pDEC(N14) (Ser87Asn88Thr90) a pDEC258 (Ala162). pDEC258 se zkonstruuje za použití výše popsaných způsobů mutageneze in vitro a v poloze 162 se kodon AGG vymění za kodon GCG. pDEC(N14) se rozštěpí Stul a GblII a pomocí GeneClean(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser87Asn88Thr90. pDEC(258) se rozštěpí Stul a GblII a izoluje se fragment o délce 210 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.
Konstrukce pDEC(Rl), (R2) a (R3)
Pro odstranění glykosylačních míst zpDEC(N14) se ml3-EPO(N14) obsahující mutace Ser87, Asn88 a Thr90 podrobí in vitro mutagenezi popsané výše za použití následujících primerů
-30CZ 291343 B6
| 5 ’ GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3’ | GLN24 |
| (SEQ ID. NO: 21) | |
| 5 ’ CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3' | GLN38 |
| (SEQ ID. NO: 22) | |
| 5'CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3' | GLN83 |
| (SEQ ID. NO: 23) |
Výsledné plazmidy se označí pDEC(Rl) (Gln24Ser87,Asn88Thr90, pDEC(R2) (Gln38Ser87Asn88Thr90) a pDEC(R3) (Gln83Ser87Asn88Thr90). ml3EC-l se také podrobí in vitro mutagenezi za použití výše uvedených oligonukleotidových primerů, a získají se tak pEClO (Gin )apEC8(Gln ). pEC9 (Gin ) se zkonstruuje za použití následujícího primeru.
’ CGTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3 ’ GLN8 3 (SEQ ID. NO: 24)
Klony cDNA humánního erythropoietinu a analogy odpovídající [Asn4, Ser6]EPO, [Asn9, Ser”]EPO, [Asn69]EPO, [Asn124]EPO, [Asn125,Ser127]EPO, [Asn163, Ser165]EPO, [Thr125]EPO a [Pro124,Thrl25]EPO a klony cDNA analogů popsaných v tabulkách 3, 4 a 5 se elektroporací přenesou do buněk COS-1 (ATCC č. CRL-1650). Buňky COS-1 se sklidí z semi-konfluentních misek, promyjí médiem (Dulbeccovo modifikované esenciální médium obsahující 5 % fetálního telecího séra a 1 % 1-glutaminu/penicilinu/streptomycinu (Irvine Scientific) a resuspendují na koncentraci 4 x 106 buněk/ml. Jeden ml buněk se přenese do elektroporační kyvety (Bio-Rad). Elektroporace se provádí pomocí zařízení Bio-Rad Gene Pulser při kapacitě 25 pF a napětí 1600 V za přítomnosti 100 až 200 pg nosičové DNA a 2 až 2 pg plazmidové DNA kódující erythropoietinový analog. Elektroporové buňky se přenesou do misek v množství 2 x 106 buněk na misku pro kultivaci tkání o průměru 60 mm s 5 ml média. 2 až 4 hodiny po přenesení do misek se médium nahradí 5 ml čerstvého média. Médium upravené buňkami se oddělí 3 až 5 dnů po elektroporací.
Příklad 7
Charakterizace analogů erythropoietinu
A. Stanovení adice uhlohydrátu
Objem supematantu obsahující 5 až 21 jednotka z buněk COS transfekovaných jednotlivými cDNA erythropoietinových analogů popsanými v příkladu 6 se přes noc při teplotě místnosti imunoprecipituje králičí protierythropoietinovou polyklonální protilátkou. 20 až 80 pl 1 : 1 Protein A-Sepharose v fosfátem pufrovaném roztoku chloridu sodného (PBS) se přidá k imunoprecipitátu a směs se 1 hodinu inkubuje při teplotě místnosti. Vzorky se odstředí, promyjí PBS a tam, kde je to uvedeno, se peleta zpracuje N-glykanázou, aby se odstranily N-vázané uhlohydrátové řetězce. Vzorky se analyzují elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, provede se přenos na nitrocelulózu a analýza Western popsaná v Bumette et al., Anal. Biochem. 112, 195 až 203 (1981) a Elliott et al., Gene 79, 167 až 180 (1989) za použití směsi myších anti-erythropoietinových monoklonálních protilátek. Jedna z takových protilátek, 9G8A, je popsána v Elliott et al. (1979) Bood 74, Supp. 1, A. 1228.
-31 CZ 291343 B6
Analýza supematantů buněk COS transfekovaných [Asn69]EPO cDNA a [Asn125,Ser127]EPO cDNA ukazuje, že proteiny mají větší velikost než erythropoietin s humánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje na přítomnost přídavného N-vázaného uhlohydrátového řetězce (obr. 7). Zpracování supematantů buněk COS transfekovaných cDNA [Thr125]EPO a cDNA [Pro124, Thr,2:>]EPO N-glykanázou ukazuje, že proteiny mají větší velikost ve srovnání s erythropoietinem s humánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje, že je přítomen přídavný O-vázaný uhlohydrátový řetězec (obr. 8). Analýza Western blot jiných vybraných analogů je uvedena na obr. 10.
Pro stanovení počtu N-vázaných uhlohydrátových řetězců, které jsou připojeny k EPO, se provede částečně rozštěpení N-glykanázou. Analogy rHuEPO se exprimují v buňkách CHO a oddělí se zpracované médium neobsahující sérum. Zkumavky obsahují 40 jednotek EPO (objem je nastaven vodou na 15 μΐ). Do každé zkumavky se přidá 10 μΐ 0,5% SDS a vzorky se 3 hodiny vaří. Potom se ke každému vzorku přidají tyto složky: 10,8 μΐ 0,5M fosforečnanu sodného o pH 8,6, 5 μΐ 7,5= Nonidetu P40 a 1,5 μΐ roztoku N-glykanázy (Genzyme) o koncentraci 250 jednotek/ml. Vzorky se inkubují uvedenou dobu při 37 °C. Reakce se zastaví přídavkem vzorkového pufru SDS-PAGE (voz výše) a potom podrobí analýze Western na SDS-PAGE (10% akrylamidu) za použití anti-EPO polyklonální protilátky a anti—králičí soustavy Wewstastain(R) (Vector Laboratories) a 4-chlomaftolu, jako substrátu. Analýza N-vázaných řetězců za použití této metody je pro humánní erythropoietin a analog N14 znázorněna na obr. 11.
B. Stanovení účinnosti analogů erythropoietinu
Provedou se radioimunoeseje (RIA) způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Egrie et al. Stanovení EIA se provádějí za použití soupravy EIA Clinigen(R) (Systémy R a D), přičemž se pracuje podle postupů dodaných výrobcem. Biologická účinnost in vivo analogů erythropoietinu se stanovuje na supematantech získaných z buněk CHO exprimujících analog erythropoietinu nebo na puntíkovaném erythropoietinu získaném z média zpracovaného buňkami CHO způsobem popsaným dále za použití exhypoxického polycythemického myšího biologického stanovení (Cotes et al., výše uvedená citace).
Účinnost erythropoietinu ín vitro se stanoví zkouškou tvorby erythroidní kolonie, kterou popsali Iscove et al., J. Cell. Physiol. 83, 309 až 320 (1974); zkouška je modifikována. Mononukleované buňky z buněk humánní kostní dřeně se částečně purifikují na „fícoll-pague cushion“, promyjí se Iscoveho médiem, aby se odstranily ulpěné buňky, a potom se nanesou na misky. Kultivační médium obsahuje 0,9 % methylcelulózy a neobsahuje žádný hovězí sérový albumin. Eryhtroidní kolonie se zjišťují po 8 až 10 dnech kultivace.
Analogy erythropoietinu transfekované a exprimované v buňkách COS způsobem popsaným v příkladu 6 se analyzují v surových supematantech buněk COS za použití RIA, EIA a stanovení s tvorbou erythroidní kolonie. Purifíkovaný erythropoietin s humánní sekvencí vykazuje in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RIA stanovenou při výše uvedených zkouškách. Analogy [Asn69]EPO, [ThrI25]EPO a [Pro124, Thr125]EPO vykazují in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RIA a poskytují důkaz, že obsahují přídavné uhlohydrátové řetězce (podle stanovení uvedeného v části A). [Thr125]EPO a analogy N4, Nil, N14, N16, N18, N47, N48, 062, NO1 a NO2 se dále analyzují tak, že se klon cDNA kódující analog erythropoietinu transfekuje do buněk CHO a supematanty buněk CHO se podrobí stanovení RIA nebo ELA a biologickému stanovení in vivo. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Účinnost in vivo analogů Rl, R2 a R3 exprimovaných v supematantech buněk CHO jsou uvedeny v tabulce 7.
-32CZ 291343 B6
Tabulka 6
Analogy erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce
| Sekvence EPO | N-vázané řetězcea | O-vázané řetězce | Účinnost in vivo RIA nebo EIA |
| 3C | ld | 0,8 | |
| Asn30Thr32 | 3 až 4C | n.t. | 1,1 |
| Asn51Thr53 | 4 | n.t. | n.t. |
| Asn37Thr39 | 4 | n.t. | n.t. |
| Asn39 | 4 | sniž.mn.® | n.t. |
| Asn39Thr7l | 4 | n.t. | 0,25-0,7 |
| Ser33Asn39Thr7l | 4 | n.t. | n.t. |
| Val®7Asn®®Thr99 | 4C | n.t. | 1,8 |
| Ser87Asn88Thr90 | 3 až 4C | normální | 1,0 |
| Ser87xsn88(;iy897hr90 | 4 | n.t. | n.t. |
| Ser87Asn88Thr99Thr92 | 4 | e smz.mn. | n.t. |
| Asn89Ile90Thr9i | 4 | n.t. | n.t. |
| Ser87Asn89iie90ihr91· | 4 | n.t. | n.t. |
| Ser87Asn88ihr90Alal·32 | 4 | n.t. | 1,8 |
| Asn133Thrl38 | 3 až 4 | n.t. | n.t. |
| A3nl38ihrl49 | 3 až 4 | n.t. | n.t. |
| Asn89Thr7ÍSer87Asn88Thr96 | 4 až 5 | n.t. | 0,025-0,25 |
| Asn30Thr32val87Asn88Thr90 | 4 až 5C | normální | 1,8 |
| Thr7· 23 | 3 | 1 a 2f | n.t. |
| Thrl25 | 3 | 1 a 2f | O,7 |
| Prol24Thr12S | 3 | 1 a 2f | n.t. |
| HCG C- terminální prodloučení | 3 | alespoň 39 | 1,0-1,3 |
| Ser87A3n88Thr99 | |||
| hcg prodloužení | 4 | alespoň 39 | 1,5 |
| Asn30Thr32vaie7^3n88rhr98 | |||
| HCG prodloužení | 4 až 3 | alespoň 39 | 0,8 |
-33CZ 291343 B6
Poznámky k tabulce 6:
aPočet přídavných N-vázaných řetězců se odhaduje na základě mobility peptidových analogů v SDS gelech způsobem popsaným v příkladu 7A.
bPoměr účinnosti analogu in vivo k množství analogu erythropoietinu. Měření účinnosti se provádějí na supematantech buněk CHO s analogy za použití myšího polycythemického biologického stanovení. Množství analogu erythropoietinu v supematantech buněk CHO se stanovuje zkouškou RIA nebo EIA popsanou v textu.
'Počet přídavných uhlohydrátových řetězců se potvrdí zkouškou migrace glykoproteinu v SDS-gelech po částečném rozštěpení N-glykanázou způsobem popsaným v příkladu 7A.
dO-vázaný řetězec v Ser126 je přítomen na 70 % molekul humánního erythropoietinu.
'Analogy se sníženým stupněm O-glykosylace, které obsahují uhlohydrátový řetězec v Ser126 na méně než 70 % molekul.
fThr123EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 60 % molekul. Thr12:iEPO obsahuje dva O-vázané řetězce na přibližně 40 % molekul. Pro124Thr125EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 80 % molekul.
gTyto analogy obsahují alespoň tři O-vázané řetězce a mohou mít i čtyři nebo pět řetězců. O samotném HCG je známo, že obsahuje čtyři O-vázané řetězce.
n.t. znamená, že zkoušení nebylo prováděno.
Tabulka 7 r
Účinnost humánního erythropoietinu a analogů obsahujících přesmyky uhlohydrátových míst
| Sekvence EPO | N-vázané řetězce | Účinnost in vivo RIA nebo EIA |
| 3 | 0,69 | |
| Gin24 | 2 | 0,16 |
| Gin38 | 2 | 0,16 |
| Gin83 | 2 | 0,23 |
| Gto24Ser87Asn88Thr90 (Rl) | 3 | 0,69 |
| Gln38Ser87Asn88Thr90 (R2) | 3 | 0,41 |
| Gln83Ser87Asn88Thr90 (R3) | 3 | 0,50 |
| Ser87Asn88Thr90 | 3 až 4 | 1,48 |
Poměr účinnosti in vivo kRLA nebo EIA se stanovuje způsobem popsaným v poznámce a k tabulce 6.
C. Výroba izomorfních směsí získaných z analogů erythropoietinu [Thr125]EPO (EPO 050)
Analog erythropoietinu, [Thrl25]EPO, se zkonstruuje způsobem popsaným v části A. příkladu 6. 810bp fragment erythropoietinové cDNA nesoucí [THR125]mutaci se izoluje rozštěpením plazmidu pEC obsahující [Thr125] mutaci pomocí BstEII a BglII a ligací vzniklého fragmentu k pDECdelta (derivát pDSa2) (viz příklad 6).
-34CZ 291343 B6
Plazmid pDECdelta obsahující [Thr125] erythropoietinovou cDNA se transfekuje do DHFR-deficientních buněk CHO. 770 ml média zpracovaného buňkami CHO se zkoncentruje za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton a diafiltruje proti lOmM Tris-HCl o pH 8,6 do dosažení konečného objemu 34 ml. Alikvot vzniklého koncentrátu o objemu 17 ml se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (objem lože 5 ml), který je ekvilibrován ve stejném pufru. Eluce se provádí lineárním gradientem od 0 do 250mM chloridu sodného v lOmM Tris-HCl o pH 8,6. Alikvoty frakcí eluovaných ze sloupce, buď neupravené, nebo štěpené N-glykanázou se analyzují SDS-PAGE neb IEF a spojí se příslušné frakce podle obsahu izoforem a/nebo uhlohydrátu, přičemž vzniklé směsi se označí čísly 2, 3 a 4. Každá směs se nanese na sloupec Vydac C4 (214TPB 2030; průměr 1 cm; objem lože 1,8 až 2,5 ml; průtok 0,34 ml/min). Sloupec se promyje vždy 2 objemy sloupce 20% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se eluují lineárními gradienty 20 až 94% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Vyrobí se směsi 2, 3 a 4, tyto směsi se zředí lmM Tris-HCl o pH 7,0 a nanesou na sloupce Q-Sepharose s rychlým průtokem. Po promytí lOmM Tris-HCl o pH 7,0 se vzorky eluují 20mM citranem sodným/250mM chloridem sodným o pH 7,0. Purifikované [Thr125] směsi se analyzují výše uvedeným způsobem (Cotes et al.) na biologickou účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.
[Ser8 Asn88Thr90]EPO (EPO NI4)
Preparativní postup 1
Analog EPO N14 se purifikuje třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografii, chromatografií na obrácených fázích a gelovou filtrační chromatografií. Během stupně ionexové chromatografie se spojí vhodné frakce za účelem získání směsi izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové. Dvě další směsi se vyrobí při chromatografií na obrácených fázích s obsahem analogu s agregátem nebo bez něho. Podrobnosti tohoto purifikačního stupně jsou uvedeny dále.
1. Médium upravené buňkami CHO exprimujícími analog EPO N14 se sklidí a přibližně 2,5násobně zkoncentruje za použití míchané kyvety s membránou YM10 (Amicon) a diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.
2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 12 A280/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.
3. Po nanesení média se sloupec promyje třemi objemy sloupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejichž objem odpovídá objemu sloupce.
4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF gelu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou IEF se spojí takové frakce, aby vzniklá směs obsahovala převážně izoformy 11 až 18. K této směsi se přidá EDTA do lmM výsledné koncentrace.
5. Směs izoforem se nanese při asi 5 A28o/ml pryskyřice na sloupec s obrácenými fázemi C4 (Vydac) ekvilibrovaný ve 20% ethanolu v lOmM Tris o pH 7,0 při průtokové rychlosti 2,5 cm/mim. Sloupec se promyje jedním objemem sloupce 20% ethanolu v lOmT Tris o pH 7,0 a eluuje 30 objemy sloupce gradientu od 20 do 94% ethanolu v lOmM Tris o pH 7,0 při průtokové rychlosti 1 cm/mi. Sbírají se frakce o objemu odpovídajícím 0,2 objemu sloupce.
6. Vzorek každé frakce se analyzuje pomocí neredukujícího 12% DDS-PAGE. Na základě přítomnosti agregátu pozorovaného na SDS-gelu se vytvoří dvě oddělené směsi. Směs č. 1 obsahuje analog EPO, ale žádný agregát, a směs č. 2 obsahuje jak analog EPO, tak agregát.
-35CZ 291343 B6
7. Směs č. 1 se přibližně 65násobně zkoncentruje a směs č. 2 se přibližně 250násobně zkoncentruje za použití zařízení Centricon 10 (Amicon). U každé směsi se provede výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0.
8. Každá směs se individuální purifikuje na sloupci HPLC BioSil SEC-250 (BioRad) ekvilibrované ve 20mM citranu sodném/lOOmM chloridu sodného o pH 7,0. Směsi se nanesou při teplotě nižší než 6 A280/ml pryskyřice při průtokové rychlosti 2,26 cm/min. Při každé zkoušce se sbírají píkové frakce odpovídající monomemím analogům.
9. Změří se absorbance každé směsi a část každé směsi se zkoncentruje pro analýzu gelu SDS-PAGE a IEF. Směs č. 1 obsahuje izoformy 15 až 17 a použije seji pro farmakokinetické studie a studie vazby k receptorů.
Preparativní postup 2
Podobně se purifikuje analog EPO N14 třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografií, vysoce účinnou chromatografií na obrácených fázích a chromatografii na hydroxylapatitu. Během stupně ionexové chromatografie se analog rozdělí do tří směsí obsahujících podle obsahu izoforem. Podrobnosti tohoto purifikačního stupně jsou uvedeny dále.
1. Supematant buněk CHO exprimujících analog EPO N14 se oddělí a přibližně lOx zkoncentruje za použití zařízení Filtron MiniUltrasette s tangenciálním tokem a potom diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.
2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 10 A280/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.
3. Po nanesení média na sloupec promyje třemi objemy slupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejich objem odpovídá objemu sloupce.
4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF gelu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou EIF se jednotlivé frakce rozdělí do tří směsí. Směs označená názvem „nízké izoformy“ obsahuje izoformy 4 až 12, směs označená názvem „střední izoformy“ obsahuje izoformy 5 až 15 a směs označená názvem „vysoké izoformy“ obsahuje izoformy 6 až 18.
5. Každá směs izoforem se individuálně purifikuje na sloupci pro HPLC s obrácenými fázemi C4 (Vydac). Sloupec se vyvíjí gradientem od 0,1% kyseliny trifluoroctové ve vodě do 0,1% kyseliny trifuoroctové v acetonitrilu, přičemž zvyšování koncentrace acetonitrilu probíhá rychlostí 1 %/min.
6. Píková frakce analogu z každé směsi se shromáždí a zředí 4 objemy 80mM Tris-HCl/20mM Tris-báze a potom zkoncentruje. Provede se výměna pufru za 10 mM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 3, která jsou odolná proti rozpouštědlům.
7. Každý vzorek se zředí na hodnotu 2 A280/ml v lOmM Tris o pH 7,2 a přidá se stejný objem 4M hydrochloridu quanidinu (GuHCl, lOmM CHAMPS, lOmM Tris o pH 7,2 do koncentrace výsledného vzorku 1 A280/ml). Každý vzorek se nanese na hydroxylapatitový minisloupec ekvilibrovaný 2M GuHCl, 5mM CHAPS, lOmM Tris o pH 7,2. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem a shromažďují se frakce o objemu jednoho sloupce.
8. Změří se absorbance frakcí, vyrobí se směsi a provede se výměna pufru za lOmM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 10. Změří se absorbance každé směsi.
-36CZ 291343 B6
Výsledné směsi se analyzují na SDS-PAGE a IEF gelech. IEF gely jsou znázorněny na obr. 12. Zkoušky RIA a zkoušky účinnosti in vivo se provádějí způsoby popsaným v příkladu 7A. Účinnost výsledných směsí izoforem in vivo je uvedena v tabulce 8. Směsi izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové se použije při experimentech zaměřených na zjištění zvýšení hematokritu u myší.
Tabulka 8
Účinnost izoforem analogů erythropoietinu
Sekvence EPQ
Thr125
Ser87Asn88Thr90
Směs izoforem izoformy 8 až 12 izoformy 9 až 12 izoformy 13 až 15 izoformy 7 až 12 izoformy 10 až 14 izoformy 12 až 12
Účinnost in vivo (U/mg peptidu)3
147 000b
215 000b
111 000b
132 000+ 17 000
233 000 ± 39 000
272 000 ± 14 000
Množství erythropoietinového peptidu v mg se vypočítá z hodnoty A28o směsí izoforem Ser87Asn88Thr90EPO s použitím extinkčního koeficientu 0,93 pro 1 mg/ml roztoku.
Směrodatná odchylka u směsí izoforem Thrl25EPO není uvedena, poněvadž stanovení účinnosti bylo prováděno jednou nebo dvakrát.
Příklad 8
Biologické vlastnosti analogu EPO N14
Účinnost směsí izoforem analogu EPO NI4, rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a izolované izoformy rHuEPO 14 se srovnávají při i.v. farmakokinetických zkouškách, zkouškách vazby k receptoru a studiích hematokritu. Směsi izoforem EPO N14 se vyrobí způsobem popsaným v příkladu 7C. rHuEPO se vyrobí způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Lei et al. Izoforma 14 rHuEPO se purifíkuje následujícím způsobem: rHuEPO, který se skládá ze směsi izoforem 10, 11, 12, 13, 14 a 15 se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (průměr 2,2 cm, výška 3,4 cm) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 7,2. Sloupec s rHuEPO se ekvilibruje s 2mM kyselinou octovou/6mM močovinou (pufr A) a potom se provede eluce vícefázovým gradientem navrženým pro optimální purifikaci izoforem 13 a 14. Gradient zahrnuje 0 až 7,3 % 800mM kyseliny octové/6M močoviny (pufr B) v 750 ml, 7,3 až 11,4 % pufru B v 750 ml, 11,4 až 26,8 pufru B ve 1 250 ml, 26,8 až 62,4 % pufru B ve 1 250 ml a potom 62,4 až 100% pufru B v 700 ml. Sbírají se frakce o objemu 12,5 ml. Frakce se neutralizují hydroxidem amonným a zkouší izoelektrickou fokusací na polykiylamidových gelech. Frakce obsahující čistou izoformu 14 se spojí, zkoncentrují vmíchané kyvetě Amicon vybavené membránou YM-10 a potom se provede výměna pufru za vodu.
A. i.v. farmakokinetické studie
Provedou se dvě oddělené studie pro srovnání farmakokinetických parametrů analogu EPO N14 (izoformy 15 až 17) a izolované izoformy 14 s rHuEPO.
Při každé studii se 1 pCi buď 125I-izolované izoformy 14, analogu 125I-EPO N14, analogu 125I-EPO NI4, nebo 125I-rekombinantního humánního erythropoietinu (Amersham) intravenosně vstříkne do kanyly zavedené do krční tepny samce krysy Sprague-Dawley o hmotnosti v rozmezí od 310 do 378 g. V různých dobách po podání se odebírají krevní vzorky o objemu 0,3 ml, které
-37CZ 291343 B6 se centrifugací zpracují na sérum. Každý vzorek séra o objemu 0,1 ml se inkubuje přes noc při 4 °C z 90% ethanolem a potom se v něm stanoví koncentrace 125I-EPO (buď rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14, nebo analogu EPO NI4). Ethanolem vysrážený 125I-EPO v každém vzorku séra se spočítá v počítači gamma-rozpadů. Výsledné 5 farmakokinetické křivky jsou uvedeny na obr. 13. Pro každou krysu se stanoví farmakokinetické parametr}' za použití nelineární regresní analýzy PCNONLIN 4,0 Statistical Consultants, 1992 a výsledky pro každou skupinu szprůměrují. Výsledky farmakokinetických studií získané za použití analogu EPO NI4 a izolované izoformy 14 jsou souhrnně uvedeny v tabulce 9.
ío Jak je zřejmé z tabulky 9, existuje podstatný rozdíl mezi hodnotou sérové clearance analogu EPO N14 a hodnotou vypočtenou pro rekombinantní humánní erythropoietin. Rekombinantní humánní erythropoietin vykazuje nejrychlejší beta poločas 3,10 hodiny ve srovnání s 3,97 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 4,36 hodiny pro analog EPO N14. Skupina s rekombinantním humánním erythropoietinem vykazuje také nejrychlejší poločas clearance 1,78 hodiny ve srovnání se 15 2,40 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 3,03 hodiny pro analog EPO N14.
-38CZ 291343 B6 a
of >o o o Px ti ti
o
| 00 | t- | o | co | ||
| O· | CM | o | CM | ||
| 1-< | O | CM | o | co | O |
Přehled farmakokinetických parametrů rHuEPO, isoformy 14 rHuEPO a EPO N14 (isoformy 15 až 17) po i.v. podání o ti ti Fx ti tu r-X O
Jí ώ X
E
ε’ό 0^2 □ Λ < g 8
I
O
O
I
4-> o >
CO tí >o o fu ti +x ti m λ
Px
Φ to r-X CO
O CC CO t-X t- ttO X-4 <X> <-4
CO O
CO O
| o | cd | oo | o | o | i—i |
| o | co | 00 | CM | co | CM |
| Χφ | o | CM | O | CM | O |
| ♦» | •k | ·> | Λ | ||
| o | o | O | o | O | O |
| CD | CO | tn | CM | xsr | |
| * | * | ·> | ·* | ·* | * |
| Χφ | 00 | co | CM | 1-1 | |
| Χφ | co | co |
| i—l | r- | CD | 00 | t—1 | LO |
| O | 00 | CM | co | CO | ID |
| CD | v—< | CO | co | CM | CO |
| 00 | σ> | CO | co | CM | o |
| O | co | 00 | 1Λ | o> | |
| co | CO |
| o | t* | o | co | co | |
| r-t | o | co | co | ||
| ·» | ·> | *> | »>· | ||
| CO | o | co | o | 0 |
| CM | m | 00 | co | CM | ΙΓ5 |
| CO | to | 00 | CO | CM | CO |
| co | rH | co | 0 | ’Φ | rH |
| A | ·« | «« | * | ·» | A |
| 0 | O | 0 | 0 | O | O |
| Ό | * | |
| ti >řx | 0 | ti >řx |
| +-» | ♦ | +J |
| to | tz> | tn |
| χφ | ||
| t-X | ||
| 0 | ti E | |
| Px | tx | |
| M ti K | to II ti | «2 S |
| řx | + | K-4 |
| 6 w | •ti ti >řx +-> ti | • 0 w |
| χφ rM 7. | ||
| Χφ II | O | χφ II |
| ti | Px M | ti |
Průměrná hodnota pro skupiny, kterým byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin při farmakokinetické studii s EPO N14 (n = 4, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánr erythropoietin) a při farmakokinetické studii s izolovanou isoformou 14 (n = 2, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin).
CO
-39CZ 291343 B6
B. Stanovení vazby k receptoru
Interakce analogu EPO NI4 (izoformy 15 až 17) sreceptorem erythropoietinu se studují vytěsňovací zkouškou za chladu za použití erythroleukemických buněk OCIM1 (Papayannopoulou et al., Blood 64 (supp. 1), 116a (1984)). Zvyšující se koncentrace neznačeného EPO N14 se inkubují s buňkami OCIM1 spolu s konstantní koncentrací 125I-rHuEPO, za účelem stanovení množství EPO N14 potřebného pro soutěž s I25I rHuEPO o vazbu k receptoru. Pro srovnání se nechá s konstantní koncentrací 125I-rHuEPO soutěžit také postupně se zvyšující koncentrace neznačeného rHuEPO.
Neznačený EPO N14 se zředí zkouškovým pufrem a přidá se množství 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng a 30,0 ng (vztaženo na hmotnost peptidu). Do všech zkumavek se přidá 0,5 ng 125I-rekombinantního humánního EPO a potom se přidá vždy přibližně 0,5 x 106 buněk OCIM1. Zkumavky se inkubují při 37 °C ve třepané vodní lázni po dobu 2 hodiny. Po inkubaci se roztoky odstředí přes dibutylftalátový/biftalátový olejový roztok, aby se oddělil nenavázaný I25I-rHuEPO od 125I-rHuEPO vázaného k buňkám OCIM1. Izolují se buněčné pelety a množství 125I-rHuEPO vázaného k buňkám se stanoví spočítáním gamma-rozpad. Vypočítá se údaj charakterizující specifickou vazbu k buňkám a lineární regresní analýzou se stanoví koncentrace neznačeného proteinu, které je zapotřebí pro to, aby bylo 50% 125I-rHuEPO vázaného za nepřítomnosti kompetitoru vyřazeno ze soutěže.
Z výsledků tří zkoušek vyplývá, že v průběhu je zapotřebí 2,67 ± 0,73 ng neznačeného peptidu EPO N14 pro snížení vazby I25I-rHuEPO k buňkám OCIM1 o 50%. Při stejných třech zkouškách je zapotřebí v průměru 0,51 ± 0,15 ng neznačeného rHuEPO pro soutěž s vazbou 0,5 ns 125I-rHuEPO. Na základě těchto výsledků je zapotřebí 5,25-násobného nadbytku EPO NI4 pro soutěž s vazbou 125I-rHuEPO k receptoru EPO ve srovnání s neznačeným rHuEPO (p<0,01).
Také se provede přídavná experiment přímého srovnání vazby analogu EPO NI4, izolované izoformy 14 a rekombinantního erythropoietinu k receptoru erythropoietinu. Výsledky tohoto experimentu ukazují, že analog EPO N14 má k receptoru nižší afinitu než izolovaná izoforma 14. Ve srovnání s neznačenou izoformou 14 je při soutěži s 123I-rHuEPO o vazbu k receptoru zapotřebí přibližně dvojnásobného nadbytku analogu EPO N14 (obr. 14).
C. Studie hematokritu
Provede se in vivo studie pro srovnání schopnosti vysokých a nízkých izoforem EPO N14 (z preparativního postupu 2 popsaného v příkladu 7C), izolované izoformy 14 a rekombinantního humánního EPO zvýšit hematokrit ošetřených myší. Rozdělení izoforem ve směsích izoforem EPO N14 označených názvy „vysoké izoformy“ a „nízké izoformy“, které se používá při této studii, je uvedeno na obr. 12.
Myším CD1 (o hmotnosti asi 30 g) se po dobu celkem 6 týdnů 3 x za týden intraperitoneálně injikuje jeden z výše uvedených přípravků v 0,25% myším sérovém albuminu nebo placebo (PBS s 0,25% myším sérovým albuminem). Dávkování erythropoietinových přípravků je vztaženo na hmotnost peptidu a je upraveno tak, aby 30g myš obdržela 0,071 pg peptidu/dávka, a to buď vysokých frakcí EPO N14, nízkých frakcí EPO N14, izoformy 14, nebo standardního rHuEPO. Při zkoušení vysokých frakcí EPO N14 a izoformy N14 se použije též přídavné skupiny, které se podává 0,036 pg peptidu/dávka. Hematokrity všech myší se stanoví před zahájením pokusu a potom se zjišťují dvakrát týdně retroorbitálním odběrem krve. Na závěr pokusu se shromáždí sérum všech zvířat a zkouší se na protilátky proti vstříknutému produktu. Dat získaných u zvířat, která jsou charakterizována jako negativní s ohledem na neutralizaci protilátek, se použije při následné analýze.
-40CZ 291343 B6
Jak ukazuje obr. 15, zvířata, kterým byly podány vysoké izoformy EPO N14, vykazují nejvyšší průměrnou hodnotu hematokritu ve skupině ve srovnání se zvířaty kterým bylo podány ostatní přípravky. Izoforma 14, rekombinantního humánního EPO a nízké izoformy EPO N14 zvyšují hematokrit v menším rozsahu.
Za účelem porovnání různých erythropoietinových přípravků kvantitativnějším způsobem se vypočítá průměrná počáteční rychlost vzrůstu hematokritu (0 až 11 dnů), změří se plocha pod křivkou (0 až 39 dnů) a vypočítá se celkové zvýšení hematokritu (tabulka 10). Ať již se použije kteréhokoliv z těchto kriterií, zdá se být směs „vysoké izoformy“ EPO N14 účinnější (vztaženo 10 na hmotnost peptidu) než kterýkoliv z ostatních zkoušených přípravků. Jak směs „vysoké izoformy“ EPO N14, tak izoforma 14 je účinnější než rekombinantní humánní EPO. Směs „nízké izoformy“ EPO N14 vykazuje nejnižší účinnost při srovnávání za použití kterékoliv z těchto analýz.
-41 CZ 291343 B6
Účinek EPO N14 (směsi vysoké isoformy a nízké isoformy) isoformy 14 a rHuEPO na hematokrit myší n
| 1 | 3 |
| 0) | 4J |
| >w | •rl |
| M Aí — | |
| N | 0 >i +> Ό |
| XD | tU O |
| > | S Λ |
| o | 0) — |
| Aí rd | Λ |
| Φ | VI |
| O | α |
Ό O OJ
Λ 0 O ctí aí Λ > O -rl O rd Al Λ
M £ > O xn >rd > N •P ω O rd
Φ
H Ol M
P4
| xT | Μ | Γ* | LO | |
| κ | κ | |||
| ω | 04 | Ch | Ο | Γ* |
| 04 | OJ | r-4 | r-d |
| σ> | 03 | xf | τΤ | οι | |
| γΗ | XI* | OJ | 00 | οι | rJ |
| kD | ΙΓ) | Μ· | ΟΙ | Μ* | CM |
| kO | σ» | OD | vo | ||
| r—1 | 0* | o | in | ||
| K | K | ||||
| ιΗ | rH | o | o | r4 | o |
| rd | r-4 | U3 | i—1 | «—1 | |
| Γ- | r* | 03 | co | ||
| O | o | O | C3 | o | o |
| *» | *» | K | «te | *» | |
| o | o | O | O | o | o |
| 1 | xr | 1 | xr | |||
| 0 | rd | o | rH | 1 | ||
| ω xr | W Xi* | 0 | XJ* | |||
| •rl rd | Ctí | -rl rd | ctí | w | rd | |
| % | g | s | ε | •rl | E | |
| XD | HP | O | ||||
| A4 | 0 | Aí >1 | 0 | Pj | XD | >1 |
| O ε | <M | o ε | Úd | w | Aí | ε |
| ω μ | 0 | <0 fi | 0 | a | N | M |
| >ιθ | o | >1 0 | m | M | Sd | 0 |
| > Ή | H | > ΨΙ | H | E | Ή |
Počáteční rychlost zvyšování hematokritu se vypočítá metodou lineární regrese z výsledků od dne 0 do dne 11.
Plocha pod křivkou se vypočítá trapezoidní sumací z výsledků od dne 0 do dne 39.
Celkové zvýšení hematokritu se vypočítá jako rozdíl průměrné hodnoty hematokritu u skupiny v den 39 a průměrné hodnoty hernatokrytu u skupiny při zahájení pokusu.
co
Vynález byl sice popsán za použití přednostních provedení, odborníkům v tomto oboru je však zřejmé, že jej lze různým způsobem obměňovat a modifikovat, přičemž všechny takové variace spadají do rozsahu tohoto vynálezu, pokud jsou kryty následujícími patentovými nároky. Tyto patentové nároky je třeba vykládat na podkladě ekvivalentů.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Elliott, Steven G.
Byme, Thomas E.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Analogy erythropoietinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 26 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Amgen lne., U.S. Patent
Operations/rbw (B) ULICE: 1840 DeHavilland Drive (C) MĚSTO: Thousand Oaks (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 91320-1789 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze #1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/108, 016 (B) DATUM PODÁNÍ: 17. srpna 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-43CZ 291343 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
TCCCCTCCAG ATAATGCCTC AGCTGC 26
-44CZ 291343 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
CAGATGCGAA CTCATCTGCT CCAG 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG 33 (2) INFORMACE O SEQ ID ΝΌ: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázo\ých párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina
-45CZ 291343 B6 (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:
GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:
CAGGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-46CZ 291343 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:
CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:
ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:
CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:
CCAGATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC
-47CZ 291343 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:
CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:
AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:
TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 184 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina
-48CZ 291343 B6
GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:
TCGAGGAACT GAAAAACCAG AAAGTTAACT
AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA TGTTGCCTT120
ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC
TGCTCTAAAA GCTGCTGCAA CAAGCTGGTC
180
GACC
134 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 107 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:
CCTGTAGGAC AGGGGACAGA TCCTCTTCCT CAAAGGCCCC TCCCCCCAGC CTTCCAAGTC
CATCCCGACT CCCGGGGCCC TCGGACACCC CGATCCTCCC ACAATGA
107 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 108 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:
GATCTCATTG TGGGAGGATC GGGGTGTCCG AGGGCCCCGG GAGTCGGGAT GGACTTGGAA 60
GGCTGGGGGG AGGGGCCGAG GAAGAGGATC TGTCCCCTGT CCTACAGG
108
-49CZ 291343 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:
GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:
CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID NO: 23 :
CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina
-50CZ 291343 B6 (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:
CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:
| Ser | Ser | Ser | Ser | Lys | Ala Pro | Pro | Pro | Ser | Leu | Pro Ser Pro Ser Arg |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||
| Leu | Pro | Gly | Pro | Ser | Asp Thr | Pro | Ile | Leu | Pro | Gin |
| 20 | 25 |
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 193 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:
-51 CZ 291343 B6
| Met Gly Val His Glu | Cys | Pro | Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu | ||||||||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | Ser | Leu | Pro | Leu | Gly | Leu | Pro | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Pro | Arg | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ile | Cys | Asp | Ser | Arg | Val | Leu | Glu | Arg | Tyr | Leu | Leu | Glu | Ala | Lys | Glu |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ala | Glu | Asn | Ile | Thr | Thr | Gly | Cys | Ala | Glu | His | Cys | Ser | Leu | Asn | Glu |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Thr | Val | Pro | Asp | Thr | Lys | Val | Asn | Phe | Tyr | Ala | Trp | Lys | Arg |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Met | Glu | Val | Gly | Gin | Gin | Ala | Val | Glu | Val | Trp | Gin | Gly | Leu | Ala | Leu |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Ser | Glu | Ala | Val | Leu | Arg Gly | Gin | Ala | Leu | Leu | Val | Asn | Ser | Ser | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Gin | Pro | Trp | Glu | Pro | Leu | Gin | Leu | His | Val | Asp | Lys | Ala | Val | Ser | Gly |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Leu | Arg | Ser | Leu | Thr | Thr | Leu | Leu | Arg | Ala | Leu | Gly | Ala | Gin | Lys | Glu |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ala | Ile | Ser | Pro | Pro | Asp | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala | Pro | Leu | Arg | Thr | Ile |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Ala | Asp | Thr | Phe | Arg | Lys | Leu | Phe | Arg | Val | Tyr | Ser | Asn | Phe | Leu |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys | Leu | Lys | Leu | Tyr | Thr | Glv | Glu | Ala | Cys | Arg | Thr | Gly | Asp |
| 180 | 185 | 190 |
Arg
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Analog humánního erythropoietinu, zahrnující adici jedné nebo více aminokyselin ke karboxylovému konci erythropoietinu, přičemž v adovaných aminokyselinách je obsaženo alespoň jedno místo pro glykosylaci.
- 2. Analog humánního erythropoietinu podle nároku 1 zahrnující adici peptidového fragmentu získaného z karboxyterminální části humánního chorionického gonadotropinu, přičemž tento fragment je připojen ke karboxylovému konci erythropoietinu.
- 3. Analog humánního erythropoietinu podle nároku 2 zvolený ze souboru sestávajícího za) humánního erythropoietinu, k jehož karboxylovému konci je připojena aminokyselinová sekvence Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-ProGly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln;87 88 90b) analogu charakterizovaného v odstavci a), který dále obsahuje Ser Asn Thr EPO; a30 32 87 88 90c) analogu charakterizovaného v odstavci a), který dále obsahuje Asn Thr Val Asn Thr EPO.
- 4. Sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu podle nároku 1.
- 5. Sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu podle nároku 3.
- 6. Eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA podle nároku 4 způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.
- 7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 3 spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.
- 8. Použití terapeuticky účinného množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 4 pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta.19 výkresů-53CZ 291343 B6Obr.1TTT1 Π Π Π xrtOcj-r- o o co r*. co m m· g 1-T-T-T- T—-54CZ 291343 B6 cd &>>cs
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10801693A | 1993-08-17 | 1993-08-17 | |
| CZ1995917A CZ291229B6 (cs) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | Analog humánního erythropoietinu a jeho pouľití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ291343B6 true CZ291343B6 (cs) | 2003-02-12 |
Family
ID=22319789
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1995917A CZ291229B6 (cs) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | Analog humánního erythropoietinu a jeho pouľití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
| CZ2001462A CZ291342B6 (cs) | 1993-08-17 | 2001-02-06 | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
| CZ2001463A CZ291343B6 (cs) | 1993-08-17 | 2001-02-06 | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1995917A CZ291229B6 (cs) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | Analog humánního erythropoietinu a jeho pouľití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
| CZ2001462A CZ291342B6 (cs) | 1993-08-17 | 2001-02-06 | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0640619B2 (cs) |
| JP (3) | JP2938572B2 (cs) |
| KR (2) | KR100328769B1 (cs) |
| CN (1) | CN1057534C (cs) |
| AT (1) | ATE155796T1 (cs) |
| AU (1) | AU677097B2 (cs) |
| CA (1) | CA2147124C (cs) |
| CZ (3) | CZ291229B6 (cs) |
| DE (2) | DE69404401T3 (cs) |
| DK (1) | DK0640619T4 (cs) |
| ES (1) | ES2105442T5 (cs) |
| FI (1) | FI117136B (cs) |
| GR (1) | GR3024815T3 (cs) |
| HK (1) | HK1001589A1 (cs) |
| HU (1) | HU220334B (cs) |
| IL (4) | IL192290A0 (cs) |
| LU (1) | LU90850I2 (cs) |
| LV (1) | LV10972B (cs) |
| NL (1) | NL300075I2 (cs) |
| NO (2) | NO323104B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ273134A (cs) |
| RU (1) | RU2159814C2 (cs) |
| SI (1) | SI0640619T2 (cs) |
| SK (1) | SK282003B6 (cs) |
| UA (1) | UA49793C2 (cs) |
| WO (1) | WO1995005465A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA946122B (cs) |
Families Citing this family (245)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7217689B1 (en) | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US5614184A (en) | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| US5696250A (en) * | 1995-02-15 | 1997-12-09 | Amgen Inc. | DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs |
| US5989538A (en) * | 1995-02-15 | 1999-11-23 | Amgen Inc. | Mpl ligand analogs |
| AU6964196A (en) * | 1995-10-09 | 1997-04-30 | Pharmacia & Upjohn Company | An acceptor polypeptide for an n-acetylgalactosaminyltransferase |
| KR100400637B1 (ko) * | 1996-02-06 | 2004-03-10 | 씨제이 주식회사 | 생물학적으로유용한펩타이드 |
| DE69724241T2 (de) | 1996-03-14 | 2004-06-09 | Genentech, Inc., South San Francisco | Gdnf-rezeptor und dessen verwendung |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| ES2208798T3 (es) * | 1997-09-01 | 2004-06-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Eritropoyetina humana recombinante con un perfil de glicosilacion ventajoso. |
| ES2590912T3 (es) | 1997-12-08 | 2016-11-24 | Merck Patent Gmbh | Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario |
| DE69933216T2 (de) | 1998-06-15 | 2007-09-20 | GTC Biotherapeutics, Inc., Framingham | Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein |
| AU774989B2 (en) * | 1998-10-23 | 2004-07-15 | Amgen, Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| DE19857609A1 (de) | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Hannelore Ehrenreich | Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen |
| AU781460B2 (en) * | 1999-02-12 | 2005-05-26 | Amgen, Inc. | Glycosylated leptin compositions and related methods |
| US7309687B1 (en) | 1999-04-13 | 2007-12-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Methods for treatment and prevention of neuromuscular and muscular conditions by peripherally administered erythropoietin |
| US7345019B1 (en) | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
| US7604960B2 (en) | 1999-04-15 | 2009-10-20 | Crucell Holland B.V. | Transient protein expression methods |
| US8236561B2 (en) | 1999-04-15 | 2012-08-07 | Crucell Holland B.V. | Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells |
| US6855544B1 (en) | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
| US7297680B2 (en) | 1999-04-15 | 2007-11-20 | Crucell Holland B.V. | Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content |
| MXPA01011264A (es) * | 1999-05-07 | 2002-07-02 | Genentech Inc | Nuevos polipeptidos de eritropoyetina de chimpance (chepo) y aciodos nucleicos que codifican los mismos. |
| US6555343B1 (en) | 1999-05-07 | 2003-04-29 | Genentech Inc. | Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| US6831060B2 (en) | 1999-05-07 | 2004-12-14 | Genentech, Inc. | Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| RU2232163C2 (ru) * | 1999-07-02 | 2004-07-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции |
| JO2291B1 (en) * | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
| CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| MXPA02001417A (es) | 1999-08-09 | 2002-08-12 | Lexigen Pharm Corp | Complejos multiples de citosina-anticuerpo. |
| CA2391080A1 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Erythropoietin forms with improved properties |
| US7192759B1 (en) | 1999-11-26 | 2007-03-20 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7521220B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-04-21 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7527961B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-05-05 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| HUP0204475A2 (en) | 2000-02-11 | 2003-04-28 | Merck Patent Gmbh | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| EP2213743A1 (en) | 2000-04-12 | 2010-08-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| PT1274728E (pt) * | 2000-04-21 | 2008-06-20 | Amgen Inc | Métodos e composições para a prevenção e tratamento de anemia |
| ME00673B (me) * | 2000-05-15 | 2011-12-20 | Hoffmann La Roche | Nova farmaceutska smjesa |
| US7259146B2 (en) | 2000-05-26 | 2007-08-21 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Neuroprotective peptides |
| KR20030064275A (ko) | 2000-06-29 | 2003-07-31 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 면역싸이토카인 흡수 증강제와의 조합 치료에 의한항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응 증강 |
| JP5490972B2 (ja) | 2000-08-04 | 2014-05-14 | 中外製薬株式会社 | タンパク質注射製剤 |
| JP5485489B2 (ja) | 2000-08-11 | 2014-05-07 | 中外製薬株式会社 | 抗体含有安定化製剤 |
| KR101229995B1 (ko) * | 2000-12-11 | 2013-02-06 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| EP1342730B1 (en) * | 2000-12-11 | 2006-03-15 | Cheil Jedang Corporation | Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin |
| AU2002233230B2 (en) * | 2000-12-20 | 2007-02-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Erythropoietin conjugates |
| PA8536201A1 (es) | 2000-12-29 | 2002-08-29 | Kenneth S Warren Inst Inc | Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina |
| US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| US6531121B2 (en) | 2000-12-29 | 2003-03-11 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| US20030072737A1 (en) | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
| DE60219961T8 (de) | 2001-02-02 | 2008-04-17 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Behandlung von neurologischen funktionsstörungen mit fructopyranosesulfamaten und erythropoetin |
| RU2003129528A (ru) | 2001-03-07 | 2005-04-10 | Мерк Патент ГмбХ (DE) | Способ экспрессии белков, содержащих в качестве компонента гибридный изотип антитела |
| WO2002072615A1 (en) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of purifying protein |
| DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
| US7531358B2 (en) | 2001-04-17 | 2009-05-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of quantifying surfactant |
| EP1383785B1 (en) | 2001-05-03 | 2011-03-16 | Merck Patent GmbH | Recombinant tumor specific antibody and use thereof |
| US6930086B2 (en) | 2001-09-25 | 2005-08-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Diglycosylated erythropoietin |
| US7214660B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| US6818613B2 (en) | 2001-11-07 | 2004-11-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Aqueous sustained-release formulations of proteins |
| WO2003045423A1 (en) | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Erythropoietin dosing regimen for treating anemia |
| KR100467750B1 (ko) * | 2001-11-29 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| KR100467751B1 (ko) | 2001-12-03 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| DK1454138T3 (da) | 2001-12-04 | 2012-02-13 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokiner med moduleret selektivitet |
| PT1465987E (pt) | 2001-12-07 | 2008-04-15 | Crucell Holland Bv | Produção de vírus, isolados virais e vacinas |
| WO2005003296A2 (en) | 2003-01-22 | 2005-01-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU2002364586A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Delta Biotechnology Limited | Albumin fusion proteins |
| DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| WO2003078959A2 (en) | 2002-03-11 | 2003-09-25 | Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc | Methods for shp1 mediated neuroprotection |
| US20030191056A1 (en) | 2002-04-04 | 2003-10-09 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
| EP1552298A4 (en) * | 2002-07-01 | 2006-11-08 | Kenneth S Warren Inst Inc | RECOMBINANT TISSUE-PROOFING CYTOKINS AND NUCLEIC ACIDS COORDINATING THEREOF FOR THE PROTECTION, RECOVERY AND IMPROVEMENT OF CELLS, TISSUE AND ORGANS THEREOF |
| AU2003246486A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-02-09 | Cangene Corporation | Pegylated erythropoietic compounds |
| DE10234192B4 (de) | 2002-07-26 | 2009-11-26 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Verwendung von Erythropoetin |
| EP1541165A4 (en) | 2002-08-27 | 2009-06-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD FOR STABILIZING PROTEIN PREPARATION |
| US7459435B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| DE60332358D1 (de) | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| BR0314227A (pt) | 2002-09-11 | 2005-10-25 | Fresenius Kabi De Gmbh | Derivados de amido de hidroxialquila |
| EP3225625A1 (en) | 2002-09-11 | 2017-10-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein purification method |
| DE20321793U1 (de) | 2002-09-11 | 2010-06-02 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hydroxyalkylstärke-Derivate |
| US7538092B2 (en) | 2002-10-08 | 2009-05-26 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates |
| AU2003301332B2 (en) * | 2002-10-17 | 2008-06-12 | Pharming Intellectual Property B.V. | Protein modification |
| US7459436B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| WO2004055056A1 (en) | 2002-12-17 | 2004-07-01 | Merck Patent Gmbh | Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2 |
| PL1615945T3 (pl) | 2003-04-09 | 2012-03-30 | Ratiopharm Gmbh | Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami |
| WO2004099396A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-11-18 | Crucell Holland B.V. | Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom |
| US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
| KR100632985B1 (ko) * | 2003-07-26 | 2006-10-11 | 메덱스젠 주식회사 | 생리활성 조절 단백질의 효능 향상 방법 및 그 예시변이체들 |
| WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
| WO2005032467A2 (en) | 2003-09-29 | 2005-04-14 | Warren Pharmaceuticals, Inc. | Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| ATE469654T1 (de) | 2003-12-30 | 2010-06-15 | Augustinus Bader | Verwendung des erythropoietins zur regeneration von lebergewebe |
| RU2370276C2 (ru) | 2003-12-31 | 2009-10-20 | Мерк Патент Гмбх | Fc-ЭРИТРОПОЭТИН СЛИТЫЙ БЕЛОК С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ |
| DE102004004509B4 (de) | 2004-01-23 | 2010-07-01 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Einsatz von niedrig dosiertem Erythropoietin zur Stimulation endothelialer Vorläuferzellen sowie zur Organregeneration und Progressionsverlangsamung von Endorganschäden |
| JP5191729B2 (ja) | 2004-03-11 | 2013-05-08 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート |
| US20080300173A1 (en) | 2004-07-13 | 2008-12-04 | Defrees Shawn | Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1] |
| US7597884B2 (en) | 2004-08-09 | 2009-10-06 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
| WO2006050247A2 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-11 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
| US9029331B2 (en) | 2005-01-10 | 2015-05-12 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| US9988427B2 (en) | 2005-05-13 | 2018-06-05 | Charite Universitaetsmedizen-Berlin | Erythropoietin variants |
| EP1736481A1 (en) | 2005-05-13 | 2006-12-27 | Charite Universitätsmedizin-Berlin | Erythropoietin variants |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| CN100432107C (zh) * | 2005-10-25 | 2008-11-12 | 北京大学 | 具有促红细胞生长因子活性的蛋白质及其用途 |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| WO2007067564A2 (en) | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Amgen Inc. | Improved host cells and culture methods |
| EP2495308A1 (en) | 2005-12-08 | 2012-09-05 | Amgen Inc. | Improved production of glycoproteins using manganese |
| DE102006004008A1 (de) | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich | Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose |
| JP5553506B2 (ja) | 2006-03-22 | 2014-07-16 | 中外製薬株式会社 | エリスロポエチン溶液製剤 |
| CN101062407A (zh) | 2006-04-29 | 2007-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途 |
| US7851438B2 (en) | 2006-05-19 | 2010-12-14 | GlycoFi, Incorporated | Erythropoietin compositions |
| EP2049144B8 (en) | 2006-07-21 | 2015-02-18 | ratiopharm GmbH | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| US20090173876A1 (en) | 2006-07-21 | 2009-07-09 | Amgen Inc. | Method of detecting and/or measuring hepcidin in a sample |
| CA2661054A1 (en) | 2006-08-22 | 2008-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Prophylactic and/or therapeutic agents for peripheral neuropathy |
| EP2054521A4 (en) | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | PROCESS FOR CLEANING POLYPEPTIDE CONJUGATES |
| CN101337988B (zh) * | 2006-10-31 | 2013-01-09 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 一种新的促红细胞生成素类似物 |
| WO2008058942A2 (en) | 2006-11-13 | 2008-05-22 | Charite - Universitätsmedezin Berlin | Method of cell culture and method of treatment comprising a vepo protein variant |
| WO2008065372A2 (en) | 2006-11-28 | 2008-06-05 | Nautilus Biotech, S.A. | Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment |
| AR065613A1 (es) | 2007-03-09 | 2009-06-17 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes de proteccion para organos transplantados |
| HRP20130382T1 (hr) | 2007-04-03 | 2013-05-31 | Biogenerix Ag | Postupci lijeäśenja pomoä†u glikopegiliranog g-csf |
| CA2690611C (en) | 2007-06-12 | 2015-12-08 | Novo Nordisk A/S | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| WO2008151841A2 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-18 | University Of Zurich | Treatment for alzheimer' s disease |
| RU2335296C1 (ru) * | 2007-06-26 | 2008-10-10 | Сергей Марович Дудкин | Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний |
| CN103113464B (zh) * | 2007-07-02 | 2014-08-20 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 天然人促红细胞生成素类似物 |
| CN103073631A (zh) * | 2007-07-02 | 2013-05-01 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 一种促红细胞生成素类似物 |
| WO2009010107A1 (en) | 2007-07-19 | 2009-01-22 | Hannelore Ehrenreich | Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis |
| EP2205280B1 (en) | 2007-09-27 | 2019-09-04 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations |
| US8796206B2 (en) | 2007-11-15 | 2014-08-05 | Amgen Inc. | Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration |
| EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
| WO2009094551A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Amgen Inc. | Ferroportin antibodies and methods of use |
| MX344166B (es) | 2008-02-08 | 2016-12-07 | Ambrx Inc | Leptina-polipeptidos modificados y sus usos. |
| EP2095829A1 (en) | 2008-02-27 | 2009-09-02 | LEK Pharmaceuticals D.D. | Selenium containing modifying agents and conjugates |
| PL2257311T3 (pl) | 2008-02-27 | 2014-09-30 | Novo Nordisk As | Koniugaty cząsteczek czynnika VIII |
| US20110137011A1 (en) | 2008-04-21 | 2011-06-09 | Novo Nordisk A/S | Hyperglycosylated human coagulation factor ix |
| US9315577B2 (en) | 2008-05-01 | 2016-04-19 | Amgen Inc. | Anti-hepcidin antibodies and methods of use |
| CN102164954B (zh) | 2008-09-23 | 2018-04-06 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 促红细胞生成素的纯化 |
| BR122012024318A2 (pt) | 2008-09-26 | 2019-07-30 | Ambrx, Inc. | Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos |
| JP6018753B2 (ja) | 2008-11-13 | 2016-11-02 | ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイションＴｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｂｍｐ−６の調節によって鉄の恒常性を制御するための方法および組成物 |
| DK2398817T4 (da) * | 2009-02-19 | 2021-08-23 | Xellia Pharmaceuticals Aps | Fremgangsmåde til rensning af lipopeptider |
| US20100272816A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-10-28 | Wolfgang Rudinger | Microcapsules comprising liver cells and erythropoietin, methods for preparing said microcapsules and methods for treating a patient comprising applying said microcapsules to the patient |
| WO2011011674A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Dr. Reddy's Laboratories Ltd. | Production of erythropoiesis stimulating protein using metal ions |
| WO2011024025A1 (en) * | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Avesthagen Limited | An erythropoietin analogue and a method thereof |
| WO2011050333A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| SG186094A1 (en) | 2010-06-07 | 2013-01-30 | Amgen Inc | Drug delivery device |
| US8193296B2 (en) | 2010-06-30 | 2012-06-05 | Nike, Inc. | Golf balls including crosslinked thermoplastic polyurethane |
| US20120115637A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-05-10 | Nike, Inc. | Golf Balls Including A Crosslinked Thermoplastic Polyurethane Cover Layer Having Improved Scuff Resistance |
| RU2451071C1 (ru) * | 2010-12-10 | 2012-05-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) |
| AU2012236573B2 (en) | 2011-03-31 | 2016-06-02 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| HUE042822T2 (hu) | 2011-04-20 | 2019-07-29 | Amgen Inc | Automata befecskendezõ szerkezet |
| US8979676B2 (en) | 2011-08-23 | 2015-03-17 | Nike, Inc. | Multi-core golf ball having increased initial velocity at high swing speeds relative to low swing speeds |
| US9089739B2 (en) | 2011-08-23 | 2015-07-28 | Nike, Inc. | Multi-core golf ball having increased initial velocity |
| PL3045187T3 (pl) | 2011-10-14 | 2019-09-30 | Amgen Inc. | Wstrzykiwacz i sposób montażu |
| KR101443257B1 (ko) * | 2011-10-18 | 2014-09-19 | 주식회사 종근당 | 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법 |
| CN102788720B (zh) * | 2012-06-05 | 2016-01-06 | 西北大学 | 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全n-连接糖链及其鉴别方法 |
| ES2860954T3 (es) | 2012-11-21 | 2021-10-05 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármacos |
| CN103864913A (zh) * | 2012-12-18 | 2014-06-18 | 联亚生技开发股份有限公司 | 重组蛋白 |
| US10646664B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | Amgen Inc. | Body contour adaptable autoinjector device |
| WO2014152006A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Intrinsic Lifesciences, Llc | Anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
| JP6336564B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-06-06 | アムゲン・インコーポレーテッド | 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム |
| TWI614041B (zh) | 2013-03-15 | 2018-02-11 | 安美基公司 | 用於注射器之匣盒 |
| WO2014149357A1 (en) | 2013-03-22 | 2014-09-25 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
| CA3168888A1 (en) | 2013-10-24 | 2015-04-30 | Amgen Inc. | Drug delivery system with temperature-sensitive control |
| SG11201602876WA (en) | 2013-10-24 | 2016-05-30 | Amgen Inc | Injector and method of assembly |
| KR101414897B1 (ko) | 2013-11-29 | 2014-07-04 | 씨제이헬스케어 주식회사 | 다베포에틴 알파의 정제 방법 |
| US10994112B2 (en) | 2014-02-05 | 2021-05-04 | Amgen Inc. | Drug delivery system with electromagnetic field generator |
| AU2015256082C1 (en) | 2014-05-07 | 2020-09-10 | Amgen Inc. | Autoinjector with shock reducing elements |
| CN111840696B (zh) | 2014-06-03 | 2022-12-20 | 安姆根有限公司 | 可控制药物递送系统和使用方法 |
| EP3194429A4 (en) * | 2014-09-18 | 2018-06-13 | Askgene Pharma, Inc. | Novel feline erythropoietin receptor agonists |
| US10323088B2 (en) | 2014-09-22 | 2019-06-18 | Intrinsic Lifesciences Llc | Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
| EP3206739B1 (en) | 2014-10-14 | 2021-12-01 | Amgen Inc. | Drug injection device with visual and audio indicators |
| US11357916B2 (en) | 2014-12-19 | 2022-06-14 | Amgen Inc. | Drug delivery device with live button or user interface field |
| EP3848072A1 (en) | 2014-12-19 | 2021-07-14 | Amgen Inc. | Drug delivery device with proximity sensor |
| JP6484345B2 (ja) | 2015-02-17 | 2019-03-20 | アムジエン・インコーポレーテツド | 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置 |
| WO2016138434A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Amgen Inc. | Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement |
| WO2017039786A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Amgen Inc. | Syringe assembly adapter for a syringe |
| JP7082568B2 (ja) | 2015-12-09 | 2022-06-08 | アムジエン・インコーポレーテツド | 信号伝達キャップ付き自動注射器 |
| US11154661B2 (en) | 2016-01-06 | 2021-10-26 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling electronics |
| JP6906497B2 (ja) * | 2016-03-09 | 2021-07-21 | Ｊｃｒファーマ株式会社 | 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法 |
| DK3429663T3 (da) | 2016-03-15 | 2020-09-28 | Amgen Inc | Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler |
| WO2017189089A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Amgen Inc. | Drug delivery device with messaging label |
| US11389588B2 (en) | 2016-05-02 | 2022-07-19 | Amgen Inc. | Syringe adapter and guide for filling an on-body injector |
| AU2017263558B2 (en) | 2016-05-13 | 2022-12-22 | Amgen Inc. | Vial sleeve assembly |
| WO2017200989A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Amgen Inc. | Data encryption in medical devices with limited computational capability |
| GB2550418A (en) | 2016-05-20 | 2017-11-22 | Laing Peter | An improved vaccine against flaviviruses avoiding elicitation or stimulation of infection-enhancing antibodies |
| US11541176B2 (en) | 2016-06-03 | 2023-01-03 | Amgen Inc. | Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices |
| EP3478342B1 (en) | 2016-07-01 | 2025-03-12 | Amgen Inc. | Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events |
| WO2018034784A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement detection |
| US20200261643A1 (en) | 2016-10-25 | 2020-08-20 | Amgen Inc. | On-body injector |
| AU2018210301A1 (en) | 2017-01-17 | 2019-08-01 | Amgen Inc. | Injection devices and related methods of use and assembly |
| WO2018151890A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Amgen Inc. | Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly |
| CA3052204A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Amgen Inc. | Insertion mechanism for drug delivery device |
| JP6258536B1 (ja) | 2017-03-03 | 2018-01-10 | 協和発酵キリン株式会社 | ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 |
| EP3592403B1 (en) | 2017-03-06 | 2025-08-20 | Amgen Inc. | Drug delivery device with activation prevention feature |
| US11571511B2 (en) | 2017-03-07 | 2023-02-07 | Amgen Inc. | Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device |
| AU2018230486B2 (en) | 2017-03-09 | 2023-05-11 | Amgen Inc. | Insertion mechanism for drug delivery device |
| EP3570871B1 (en) | 2017-03-20 | 2020-11-18 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein |
| ES3023742T3 (en) | 2017-03-28 | 2025-06-03 | Amgen Inc | Plunger rod and syringe assembly system |
| AU2018281334A1 (en) | 2017-06-06 | 2019-12-19 | Kindred Biosciences, Inc. | Erythropoietin and analogs for veterinary use |
| US11590294B2 (en) | 2017-06-08 | 2023-02-28 | Amgen Inc. | Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly |
| JP7200134B2 (ja) | 2017-06-08 | 2023-01-06 | アムジエン・インコーポレーテツド | トルク駆動式薬物送達デバイス |
| JP7195276B2 (ja) | 2017-06-22 | 2022-12-23 | アムジエン・インコーポレーテツド | デバイス起動による衝突／衝撃の低減 |
| WO2018237225A1 (en) | 2017-06-23 | 2018-12-27 | Amgen Inc. | Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly |
| IL270784B2 (en) | 2017-07-14 | 2023-11-01 | Amgen Inc | Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system |
| JP7649105B2 (ja) | 2017-07-21 | 2025-03-19 | アムジエン・インコーポレーテツド | 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法 |
| US11617837B2 (en) | 2017-07-25 | 2023-04-04 | Amgen Inc. | Drug delivery device with gear module and related method of assembly |
| MA49676A (fr) | 2017-07-25 | 2020-06-03 | Amgen Inc | Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé |
| MA49838A (fr) | 2017-08-09 | 2020-06-17 | Amgen Inc | Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre |
| EP3668567B1 (en) | 2017-08-18 | 2026-02-18 | Amgen Inc. | Wearable injector with sterile adhesive patch |
| US11103636B2 (en) | 2017-08-22 | 2021-08-31 | Amgen Inc. | Needle insertion mechanism for drug delivery device |
| WO2019070472A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Amgen Inc. | FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE |
| ES2971450T3 (es) | 2017-10-06 | 2024-06-05 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente |
| US11464903B2 (en) | 2017-10-09 | 2022-10-11 | Amgen Inc. | Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly |
| IL273582B2 (en) | 2017-11-03 | 2024-12-01 | Amgen Inc | Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device |
| EP3707075A1 (en) | 2017-11-06 | 2020-09-16 | Amgen Inc. | Fill-finish assemblies and related methods |
| EP3706830B1 (en) | 2017-11-06 | 2024-08-07 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement and flow sensing |
| MA50557A (fr) | 2017-11-10 | 2020-09-16 | Amgen Inc | Pistons pour dispositifs d'administration de médicament |
| MX2020005066A (es) | 2017-11-16 | 2020-08-20 | Amgen Inc | Autoinyector con deteccion de detencion y punto final. |
| JP7370969B2 (ja) | 2017-11-16 | 2023-10-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構 |
| US10835685B2 (en) | 2018-05-30 | 2020-11-17 | Amgen Inc. | Thermal spring release mechanism for a drug delivery device |
| US11083840B2 (en) | 2018-06-01 | 2021-08-10 | Amgen Inc. | Modular fluid path assemblies for drug delivery devices |
| US12303677B2 (en) | 2018-07-24 | 2025-05-20 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation |
| WO2020023336A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with grip portion |
| MA53375A (fr) | 2018-07-24 | 2021-06-02 | Amgen Inc | Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments |
| CA3103681A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Delivery devices for administering drugs |
| CA3103105A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Amgen Inc. | Fluid path assembly for a drug delivery device |
| US20210346601A1 (en) | 2018-09-24 | 2021-11-11 | Amgen Inc. | Interventional dosing systems and methods |
| AR113091A1 (es) | 2018-09-27 | 2020-01-22 | Univ Nacional Del Litoral | Eritropoyetina humana modificada |
| CA3110371A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Amgen Inc. | Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device |
| EP3860685A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Amgen Inc. | Injection systems for drug delivery with internal force transmission |
| US12151089B2 (en) | 2018-10-05 | 2024-11-26 | Amgen Inc. | Drug delivery device having dose indicator |
| WO2020081480A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Amgen Inc. | Platform assembly process for drug delivery device |
| TW202541859A (zh) | 2018-10-15 | 2025-11-01 | 美商安進公司 | 具有阻尼機構之藥物遞送裝置及自動注射器 |
| MA54048A (fr) | 2018-11-01 | 2022-02-09 | Amgen Inc | Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament |
| TWI831847B (zh) | 2018-11-01 | 2024-02-11 | 美商安進公司 | 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法 |
| EP3873563A1 (en) | 2018-11-01 | 2021-09-08 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
| AU2020263289B2 (en) | 2019-04-24 | 2025-05-22 | Amgen Inc. | Syringe sterilization verification assemblies and methods |
| WO2021041067A2 (en) | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Amgen Inc. | Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods |
| WO2022159414A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-28 | University Of Rochester | Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction |
| JP2024523779A (ja) | 2021-05-21 | 2024-07-02 | アムジェン インコーポレイテッド | 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法 |
| WO2023209074A1 (en) | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing |
| WO2024094457A1 (en) | 2022-11-02 | 2024-05-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing glycoprotein compositions |
| WO2026030152A1 (en) | 2024-07-29 | 2026-02-05 | Amgen Inc. | System and method for assessing transferability of a fill recipe |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| KR100221066B1 (ko) * | 1989-10-13 | 1999-10-01 | 스튜어트 엘.왓트 | 에리트로포이에틴 유사체와 그를 포함하는 제약학적 조성물 |
-
1994
- 1994-08-15 CN CN94109128A patent/CN1057534C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-15 ZA ZA946122A patent/ZA946122B/xx unknown
- 1994-08-15 IL IL192290A patent/IL192290A0/en unknown
- 1994-08-15 IL IL110669A patent/IL110669A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-08-16 WO PCT/US1994/009257 patent/WO1995005465A1/en not_active Ceased
- 1994-08-16 DE DE69404401T patent/DE69404401T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 JP JP7507153A patent/JP2938572B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 DK DK94112732T patent/DK0640619T4/da active
- 1994-08-16 NZ NZ273134A patent/NZ273134A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-08-16 CZ CZ1995917A patent/CZ291229B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-08-16 SI SI9430078T patent/SI0640619T2/xx unknown
- 1994-08-16 DE DE2001199059 patent/DE10199059I2/de active Active
- 1994-08-16 AU AU76327/94A patent/AU677097B2/en not_active Expired
- 1994-08-16 EP EP94112732A patent/EP0640619B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 HU HU9501435A patent/HU220334B/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1994-08-16 UA UA95058432A patent/UA49793C2/uk unknown
- 1994-08-16 SK SK502-95A patent/SK282003B6/sk unknown
- 1994-08-16 KR KR1019950701453A patent/KR100328769B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 AT AT94112732T patent/ATE155796T1/de active
- 1994-08-16 CA CA002147124A patent/CA2147124C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 RU RU95115239/14A patent/RU2159814C2/ru active
- 1994-08-16 ES ES94112732T patent/ES2105442T5/es not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-12 NO NO19951445A patent/NO323104B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-04-13 FI FI951792A patent/FI117136B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-04-15 KR KR1019957001453A patent/KR960701994A/ko active Pending
- 1995-04-17 LV LVP-95-99A patent/LV10972B/en unknown
-
1997
- 1997-09-22 GR GR970402449T patent/GR3024815T3/el unknown
-
1998
- 1998-01-21 HK HK98100522A patent/HK1001589A1/en not_active IP Right Cessation
- 1998-08-24 JP JP25324498A patent/JP3664590B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-05-16 IL IL13618900A patent/IL136189A0/xx unknown
- 2000-05-16 IL IL13618800A patent/IL136188A0/xx unknown
-
2001
- 2001-02-06 CZ CZ2001462A patent/CZ291342B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-02-06 CZ CZ2001463A patent/CZ291343B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-11-07 LU LU90850C patent/LU90850I2/fr unknown
- 2001-12-06 NL NL300075C patent/NL300075I2/nl unknown
-
2004
- 2004-06-25 JP JP2004188815A patent/JP3664723B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-06-29 NO NO2007008C patent/NO2007008I2/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ291343B6 (cs) | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek | |
| US7217689B1 (en) | Glycosylation analogs of erythropoietin | |
| KR100221066B1 (ko) | 에리트로포이에틴 유사체와 그를 포함하는 제약학적 조성물 | |
| US5856298A (en) | Erythropoietin isoforms | |
| HK1001589B (en) | Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites | |
| JP4345077B2 (ja) | 有利なグリコシル化プロフィルを有する組換えヒトエリスロポエチン | |
| Goldwasser et al. | Erythropoietin: the primary regulator of red cell formation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20140816 |