CZ291974B6 - Způsob in vitro screeningu na neuropatologii - Google Patents

Způsob in vitro screeningu na neuropatologii Download PDF

Info

Publication number
CZ291974B6
CZ291974B6 CZ1997292A CZ29297A CZ291974B6 CZ 291974 B6 CZ291974 B6 CZ 291974B6 CZ 1997292 A CZ1997292 A CZ 1997292A CZ 29297 A CZ29297 A CZ 29297A CZ 291974 B6 CZ291974 B6 CZ 291974B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
icam
seq
ala
leu
gly
Prior art date
Application number
CZ1997292A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ29297A3 (en
Inventor
Patrick D. Kilgannon
Michael W. Gallatin
Original Assignee
Icos Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icos Corporation filed Critical Icos Corporation
Publication of CZ29297A3 publication Critical patent/CZ29297A3/cs
Publication of CZ291974B6 publication Critical patent/CZ291974B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70525—ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Semiconductor Memories (AREA)
  • Treatment And Processing Of Natural Fur Or Leather (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Control Of Vending Devices And Auxiliary Devices For Vending Devices (AREA)

Abstract

Zp sob in vitro screeningu na neuropatologii, kter² zahrnuje tyto kroky: a) z sk n tekut ho vzorku od prvn ho individua, b) kontaktov n vzorku s protil tkou specificky imunoreaktivn s ICAM-4, c) kvantifikaci vazby protil tky na ICAM-4 ve vzorku a d) porovn n vazby protil tky na ICAM-4 v p° pad tohoto individua s vazbou v p° pad druh ho individua, o n m je zn mo, e je bez neuropatologie.\

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se obecně týká celulámích adhezních molekul a zejména klonování a exprese DNA, kódující až dosud neznámé polypeptidy označené ICAM-4, které vlastní strukturální příbuznost k intercelulámím adhezním molekulám ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R. Konkrétněji se týká způsobu in vitro screeningu na neuropatologii.
Dosavadní stav techniky
Výzkum pokrývající poslední dekádu významně objasnil molekulární události, které se zúčastňují interakcí (cell-cell) v těle, zejména ty události, které zahrnují pohyb a aktivitu buněk v imunitním systému a v poslednější době ty, které se týkají vývoje a normální fyziologické funkce buněk v nervovém systému. Představeno obecně v Springer, Nátuře, 346: 425-435 (1990) týkající se buněk v imunním systému a Yoshihara a kol., Neurosci. Res. 10: 83-105 (1991) aSonderegger a Rathjen, J. Cell. Biol. 119: 1387-1394 (1992) týkající se buněk v imunním systému. Buněčný povrch proteinů a zejména takzvané buněčné adhezní molekuly („CAMs“) byly příslušným předmětem farmaceutického výzkumu a vývoje, které měly jako svůj úkol intervenci v procesech extravazace leukocytů do míst zánětu a v pohybu leukocytů k charakteristickým cílovým tkáním stejně jako diferenciace a tvorba komplexního nervového systému. Izolace a charakterizace buněčných adhezních molekul, klonování a exprese sekvencí DNA, které kódují takové molekuly a vývoj terapeutických a diagnostických činidel týkající se zánětlívých procesů vývoje a funkce nervového systému, jsou také předmětem četných USA a cizích přihlášek patentových spisů. Porovnej sEdvardsem, Current opinion in therapeutic patents, 1 (11) : 1617-1630 (1991) a zvláště publikované v „příručkách patentové literatury“ citováno v tomto ohledu.
Základním zájmem v pozadí tohoto předloženého vynálezu jsou předchází identifikace a charakterizace určitých zprostředkovatelů buněčných adhezních průvodců „leukointegrins“ LFA-1, MAC-1 a gp 150,95 (zmíněných vWHO třídách jako CD18/CDlla, CD18/CDllb CD18 (11c resp.), které tvoří podrodinu heterodimerických “integrin” buněčných povrchů proteinů, které představují B lymfocyty, T lymfocyty, monocyty a granulocyty. Porovnej např. s tabulkou 1, na straně 429 (viz uvedeno výše, Springer). V zájmu jsou také jiné jednoduché řetězce adhezních molekul (CAMS), které byly prokázány vactivate, adhezi a pohyblivosti leukocytů apod., které jsou průvodci doprovázející zánětlivé procesy. Například v současné době je ověřeno, že před extravazací leukocytů, která charakterizují zánětlivé procesy, se vyskytuje aktivace integrinů konstitutivně exprimovaných v leukocytech a následuje pevná interakce ligand/receptor mezi integriny (např. LFA-1) a jednou nebo oběma typickými interacelulámími adhezními molekulami (ICAMs) označované jako ICAM-1 a ICAm-2, které jsou exprimované v krevních řečištích endotheliálních buněčných povrchů a do jiných leukocytů.
Jako jiné CAMs popsané až do dnešního dne [např. vaskulámí adhezní molekuly (VCAM-1 jak je uvedeno v PCT WO 90/133300 publikované 15.11. 1990; a krevní destičky endotheliálních buněčných adhezních molekul (PECAM-1) jak je uvedeno v Newman a kol., Science, 247: 1219-1222 (1990) a PCT WO 91/10683 publikované 25. 6. 1991], jsou ICAM-1 a ICAM-2 strukturálně homologní k ostatním členům nadrodiny imunoglobulinových genů, v kterých je zahrnuta každá extracelulámí část série domén udělujících podobný karboxy terminální motiv. Typické domény imunoglobulinů obsahují smyčkovou strukturu, obvykle zakotvenou pomocí disulfidové vazby mezi dvěma cysteiny na konci každé smyčky. ICAM-1 zahrnuje pět imunoglobulinových domén; ICAM-2, který se odlišuje od ICAM-1 pokud jde o distribuci buněk, která zahrnuje dvě tyto domény; PECAM-1 zahrnuje šest; VCÁM zahrnuje šest nebo sedm, které závisejí na obměnách podélných vazeb atd.. Kromě toho zahrnuje ICAMs typicky
-1 CZ 291974 B6 hydrofobní transmembránové oblasti, které jsou považovány, že se účastňují na orientaci molekul na buněčném povrchu a karboxy terminální „cytoplazmic“ oblasti. Grafické modely operativního umístění CAMs obecně ukazují molekulu zakotvenou na buněčné membráně a transmembránové oblasti cytoplazmaticky „tail“ rozšířené do buněčné cytoplazmy a jednu nebo více imunologických smyček prodloužených ven mimo buněčný povrch.
Množství nervových buněk vyjadřuje povrch receptorů s extracelulámími doménami podobnými Ig, strukturálně podobné k ICÁMs. Porovnej např. s Yoshihara a kol., (viz výše uvedeno). Kromě domén podobných Ig, obsahuje mnoho adhezních molekul nervového systému také tandemově zapojené opakující se sekvence podobné fibronektinu v extracelulámí doméně.
Různé terapeutické použití bylo navrženo pro intercelámí /adhezní molekuly, které zahrnuje použití předpokládané schopnosti vazby ICAM-1 k lidskému rhinoviru. Například Evropská patentová přihláška 468257A publikovaná 29.1.1992, se týká vývoje multimerických konfigurací a forem ICAM-1 (zahrnující plnou délku a zkrácené molekulární formy), které předkládají zvýšeno vazebnou aktivitu ligand/receptor, zejména vazbu k virům, protilátkám připojených lymfocytů a patogenům jako například Plazmodium falciparum.
Podobně bylo navrženo různé použití proteinů imunologicky příbuzných k intercelulámím adhezním molekulám. WO 91/16928, publikovaná 14. 11. 1991, je například zaměřena na humanizované chimérické anti-ICAM-1 protilátky a jejich použití v léčení specifických a nespecifických zánětů virové infekce a astmatu. Anti-ICAM-1 protilátky a jejich fragmenty jsou popsány jako užitečné pro léčení endotoxických šoků a to v přihlášce WO 92/04034, publikované 19.3. 1992. Inhibice ICAM-1 závislá na zánětlivých odpovědích spolu s anti-ICAm-1 antiidiotypických protilátkách a fragmentech protilátky je uvedena v přihlášce WO 92/06199, publikované 16. 4. 1992.
Přes základní proniknutí do fenomu buněčné adheze, které bylo získáno pomocí identifikace a charakterizace intercelulámích adhezních proteinů jako například ICAM-1 a do lymfocytově interaktivních integrinů jako například LFA-1, není obraz zcela kompletní. Je obecně ověřeno, že četné další proteiny jsou zapleteny do zánětlivých procesů a v cíleném pohybu lymfocytů v těle. Například PCT přihláška WO 93/14776 (publikovaná 5. 8. 1993) popisuje klonování a expresi proteinu příbuznému ICAM, ICAM-R. Uvedená přihláška je zde zmíněna náhradou za přenesení jeho obsahu do popisu této přihlášky. DNA a sekvence aminokyselin ICAM-R jsou vyložené v místě SEQ ID NO. 4. Tento nový ligand byl nalezen, ale doprovázel lidské lymfocyty, monocyty a granulocyty.
Ve zvláštním zájmu k převedené přihlášce byl ještě jeden podobný ICAM povrch molekuly identifikován, který má specifickou tkáňovou expresi oproti jiným známým molekulám ICAM. Moři a kol., [Proč. Natl.Acad. Sci. (USA) 84: 3921-3925 (1987)] popsal identifikaci telencephalon-specifické protilátky v mozku králíků, specificky imunoreaktivní s monoklonální protilátkou 271A6. Tato povrchová protilátka byla nazvána telepcephalin. Immura a kol., [Neurosci. Letts. 119: 118-121, (1990)] použitím polyklonální protilátky k zhodnocení lokalizované exprese potvrdil, že exprese telencephalinu ve vizuální mozkové kůře koček ukazuje změnu ve vrstvách tkáně a také podal zprávu o tom, že exprese telepcephalinu byla proměnná v závislosti na vývoji. Oka a kol., (Neuroscience 35: 93-103, 1990) následně popsal izolaci telencephalinu použitím monoklonální látky 27A6. Tato publikace popisuje molekulární váhu pro povrchovou molekulu asi 500 kD, a že molekula byla složena ze čtyř podjednotek, každá z nich s přirozenou molekulární váhou 130 kD a přibližně 100 kD následujícím zpracováním N-glycanasou. Yoshihiro a kol., (Neuroscience, Research Supplement 18, p. S83,1994) oznámil DNA a aminokyselinovou sekvenci pro telencephalin králíka na sedmnácté Výroční konferenci Japan Neuroscience Society vNagoya (Japonsko, 7-9.12. 1993) a na dvacátétřetí Výroční konferenci Society for Neuroscience ve Washingtonu, D.C., 9. 11. 1993 (Society for neuroscience Abstracts 19 (1-3) p. 646,1993). Odvozené aminokyselinové sekvence zaznamenaly, že navržený telencephalon 130kD je integrální membránový protein s devíti
-2CZ 291974 B6 extracelulámími imuglobuliny (Ig)-like (podobné) domény. Distálních osm těchto domén ukazuje homologii k ostatním ICAM Ig-like doménám. Tato stejná informace byla ohlášena u Yoshihara a kol., v Neuron 12:0543-553,1994).
V tomto tedy je pokračováno, aby byly objeveny potřebné přídavné proteiny účastňující se v lidských buněčných interakcích (cell—cell) a zejména potřeba pro informaci, která slouží pro specifické identifikování a charakterizaci těchto proteinů podle jejich aminokyselinové sekvence. Kromě toho existují takové molekuly, které mohou tvořit základ pro vývoj terapeutických a diagnostických činidel, je podstatné, že DNA, která je kóduje, je objasněna. Takové plodné io informace by mohly zajistit (inter alla) produkci proteinů ve velkém měřítku, umožnit identifikaci buněk, které je přirozeně produkují a dovolit přípravu protilátkových látek nebo jiné nové vazebné proteiny specificky reaktivní s těmito a/nebo inhibitory vázající reakce ligand/receptor, v kterých jsou tyto zahrnuty.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob in vitro screeningu na neuropatologii, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje tyto kroky:
a) získání tekutého vzorku od prvního individua
b) kontaktování vzorku s protilátkou specificky imunoreaktivní s ICAM-4
c) kvantifikace vazby protilátky na ICAM—4 ve vzorku a
d) porovnání vazby protilátky na ICAM-4 v případě tohoto individua s vazbou v případě druhého individua, o němž je známo, že je bez neutopatologie.
Jedním z aspektů tohoto předloženého vynálezu je poskytnout čištěné a izolované polynukleotidy (např. DNA sekvence, RNA transkripty a jejich antimediátorové oligonukleotidy) kódující nové polypeptidy, „ICAM-4“, jakož i polypeptidové varianty (zahrnující fragmenty a delece, substituce a přídavné analogy) a z těchto ty, které projevují jeden nebo více ligand/receptorů, které vázají biologické aktivity a/nebo imunologické vlastnosti specifické pro ICAM-4. ICAM-4 35 specifický ligand/receptor vázající biologické aktivity zahrnuje interakce obou ICAM—4 extracelulámích a cytoplazmatických domén s ostatními molekulami (např. v procesu buněčné adheze cell-cell a/nebo signální transdukce). Výhodné sekvence DNA tohoto vynálezu zahrnují genomické a cDNA sekvence, jakož i celkově nebo částečně chemicky syntetizované sekvence DNA. Polynukleotidy výhodně představené jsou vyobrazeny na SEQ ID NO: 1 a kódovány 40 krysími druhy ICAM—4. Biologické duplikáty (např., kopie izolovaných sekvencí DNA provedených v prostředí in vivo nebo in vitro) sekvencí DNA tohoto vynálezu jsou předvídány. Jsou také poskytnuty autonomně se replikující rekombinantní konstrukty jako např. plazmid a virové vektory DNA, které syntetizují sekvence ICAM-4 a zvláště vektory, kde DNA kódující ICAM-4 nebo jakoukoliv variantu ICAM-4 je operativně zapojena do endogenní nebo expresní 45 sekvence kontrolní DNA.
Podle jiného aspektu tohoto vynálezu jsou hostující buňky, zejména jednobuněčné hostující buňky jako např. prokaryotické a eukaiyotické buňky stabilně transformovány sekvencemi DNA tohoto vynálezu způsobem, který dovoluje aby byly žádané polypeptidy tímto exprimovány.
Hostující buňky, které exprimují ICAM-4 a různé produkty ICAM-4 mohou sloužit k různým užitečným účelům. Do té míry, že exprimované produkty jsou „projevené“ na povrchu hostující buňky, mohou buňky konstituovat cenný imunogen pro vývoj protilátkových látek specificky reaktivních s ICAM-4 varianty ICAM-4. Hostující buňky jsou pozoruhodně užitečné v metodách pro produkci širokého rozsahu ICAM a variant ICAm, kde jsou buňky pěstovány ve vhodném
-3CZ 291974 B6 kultivačním médiu a požadované polypeptidové produkty jsou izolované z buněk nebo z buněčného média, v kterém buňky rostou.
Nové ICAM-4 tohoto vynálezu mohou být získány jako izoláty z přirozených buněčných zdrojů, ale spolu s různými produkty ICAM-4 jsou přednostně produkované pomocí rekombinantních procedur zahrnujících hostující buňky tohoto vynálezu. Nyní jsou přednostní sekvence aminokyselin pro polypeptid ICAM-4 vyobrazeny v SEQ ID NO: 2. Produkty mohou být získány pomocí úplné nebo částečně glykosylace, částečně nebo zcela de-glykosylovatelné nebo neglykosylovatelné formy, které závisejí na hostující buňce vybrané pro rekombinantní produkci a/nebo pro post-izolační zpracování. Varianty ICAM-4 tohoto vynálezu mohou obsahovat ve vodě rozpustné nebo nerozpustné monomerické, multimemí nebo cyklické fragmenty ICAm, které zahrnují celou nebo část jedné nebo více doménových oblastí specifikované nahoře a mající biologické nebo imunologické vlastnosti ICAM-4 zahrnující např., schopnost vazby k vazebnému partneru ICAM-4 a/nebo inhibici vazebného ICAM—4 k přirozeně vazebným partnerům. Varianty ICAM-4 tohoto vynálezu mohou také zahrnovat analogy polypeptidu, kde je jedna nebo více specifických aminokyselin deletována nebo přemístěna: (1) bez ztráty a nejlépe se zvýšením jedné nebo více biologických aktivit nebo imunologických charakteristik specifických pro ICAM—4; nebo (2) se specifickým zneschopněním jednotlivých vazebných funkcí ligand/receptor. Jsou předpokládány analogní polypeptidy zahrnující přídavné aminokyseliny (např. lysin nebo cystein) zbytky, které usnadní multimemí formování.
V předloženém vynálezu jsou také zahrnuté protilátkové látky (např. monoklonální apolyklonální protilátky, fragmenty protilátky, jednoduché řetězce protilátek, chimérické protilátky, CDR-štěpené protilátky a podobně) a jiné vazebné proteiny (např. ne-reaktivní s ICAM-4, ICAM-2 a ICAM-R intercelulámí adhezní molekuly, ke kterým je ICAM-4 strukturně podobný) pro ICAM-4 nebo varianty ICAM-4. Tento vynález také zahrnuje hybridomové buněčné linie, které specificky vyměšují monoklonální protilátky tohoto vynálezu. Výhodně představují hybridomy tohoto vynálezu ty, které jsou označené jako 127A, 127H, 173E, 1791 a 179H. Protilátkové látky mohou být vyvíjeny použitím izolace přírodního nebo rekombinantního ICAM-4 nebo variant ICAM-4 nebo buňkami exprimující takové produkty na jejich povrchu. Vazebné proteiny jsou přídavně užitečné pro charakterizaci vazebných míst struktur (ry) (např. epitopů a/nebo senzitivity vazebných vlastností k modifikacím aminokyselinových sekvencí v ICAM-4).
Vazebné proteiny jsou také užitečné opět v sestavách pro imunizaci jakož i pro čištění buněk, které se projevují polypeptidy na jejich povrchu. Jsou také evidentně užitečné v modulování (např. blikování, inhibování nebo stimulování) vazebných biologických aktivit ligand/receptor zahrnujících ICAM-4, zvláště ty efektorové funkce ICAM-4 zahrnutých ve specifických a ne-specifických odpovědích imunitního systému. Anti-idiotypické protilátky specifické pro anti-ICAM-4 protilátkové látky a použití těchto antiidiotypických protilátkových látek v modulačních imunních odpovědích jsou také předpovězena. Testy pro detekci a stanovení množství ICAM-4 na povrchu buněk a v tělesných tekutinách například v séru nebo cerebrospinální tekutině mohou zahrnovat například jednoduchou protilátkovou látku nebo vícenásobné protilátkové látky v „sendvičovém“ testovém formátu. Pro detekci ICAM-4 v tělesných tekutinách jsou protilátky tohoto vynálezu také užitečné pro stanovení výskytu neuropatologií, které mohou být ve vzájemném vztahu ke zvýšeným hladinám cirkulujícího ICAM-4. Tyto neuropatologie zahrnují, ale nejsou omezeny, cerebrální ischemii (např. mrtvici) vznikající jako následek různých poruch například trombóza, embolismus a podobně.
Vědecká hodnota informace, ke které přispělo objevení aminokyselinových sekvencí DNA tohoto vynálezu, je evidentně. Jako jedna série z příkladů je, že znalost sekvence cDNA pro ICAM-4 umožňuje izolaci pomocí hybridizace DNA/DNA genomických sekvencí DNA kódujících ICAM^4 a specifikující ICAM-4 pomocí expresívních kontrolních regulátorových sekvencí jako jsou například promotory, operátory a podobně. Hybridizační procedury DNA/DNA uskutečněné se sekvencemi DNA tohoto vynálezu a pod přísnými podmínkami jsou
-4CZ 291974 B6 očekávány podobným způsobem umožnit izolaci sDNA, které kódují allelické varianty ICAM-4, jiné strukturně příbuzné proteiny mající jednu nebo více biologických a/nebo imunologických vlastností specifických k ICAM-4 a proteiny homologní k ICAM-4 z jiných druhů. DNA tohoto vynálezu jsou užitečné pro hybridizační testy DNA/RNA, aby delekovaly schopnost buněk syntetizovat ICAM-4. Pomocí tohoto vynálezu jsou také dostupné pozitivní polypeptidy důležité pro regulaci exprese ICAM-4, pomocí těchto buněk, které obyčejně exprimují stejné ICAM-4. Jako další série z příkladů je, že znalost DNA a aminokyselinových sekvencí ICAM-4 umožňuje vytvoření rekombinantních prostředků variant ICAM-4 jako hybridní fuzní proteiny (někdy popisovány jako „imunoadhezní“), které jsou charakterizované přítomností proteinových sekvencí ICAM-4 a konstantními oblastmi a/nebo pantovými oblastmi těžkého řetězce imunoglobulinu. Porovnej sCapon a kol., Nátuře, 337: 525-531 (1989); Ashkenazi a kol., P.N.A.S. (USA), 88: 1055-10539 (1991); a PCT WO 89/02922, publikované 6.4. 1989. Variantní fuzní proteiny ICAM-4 mohou také zahrnovat například selektované extracelulámí domény ICAM—4 a části ostatních buněčných adhezních molekul.
DNA tohoto vynálezu také dovoluje identifikace netranslatovaných sekvencí DNA, které podporují specificky expresi polynukleotidů operativně napojených k oblastem promotoru. Identifikace a použití těchto sekvencí promotoru jsou zejména vhodné v případech například genový transfer, který může specificky požadovat expresi heterologního genu v limitovaném prostředí nervových buněk. Tento vynález také zahrnuje vektory, které obsahují promotory tohoto vynálezu jakož i konstrukty chirurgických genů, kde je promotor tohoto vynálezu operativně napojen k heterologní polynukleotidové sekvenci a k transkripčnímu terminačnímu signálu.
Informace o DNA a aminokyselinové sekvenci poskytují podle předloženého vynálezu také možnosti systemické analýzy struktury a funkce ICAM-4 a definování těch molekul, s kterými bude reagovat na intercelulámích a extracelulámích úrovních. Idiotypy anti-ICAM-4 monoklonálních protilátek tohoto vynálezu jsou typickým příkladem těchto molekul a mohou napodobit přírodní vazebné proteiny (peptidy a polypeptidy), skrze které jsou intercelulámí a intracelulámí aktivity ICAM-4 modulovány nebo pomocí kterých ICAM-4 moduluje intercelulámí a intracelulámí případy. Alternativně mohou představovat nové třídy biologicky aktivních ekvivalentů ICAM—4. Antiidiotypické protilátky mohou opět též představovat nové třídy biologicky aktivních ekvivalentů ICAM-4. Zkoušky v prostředí in vitro pro identifikování protilátek nebo jiných sloučenin, které modulují aktivitu ICAM-4 mohou zahrnovat například imobilizování ICAM-4 nebo přírodního ligandu, ke kterému se ICAM-4 váže, zjistitelně označení neimobilizovaných vazebných partnerů, inkubování vazebných partnerů dohromady a stanovení účinku testovaných sloučenin na množství značených vazeb, kde snížení počtu značených vazeb v přítomnosti testovaných sloučenin ve srovnání s množstvím značených vazeb v nepřítomnosti testovaných sloučenin indukuje, že testovaným činidlem je inhibitor vázající ICAM-4.
Informace o sekvenci DNA poskytuje podle předloženého vynálezu také možnost vývoje strategií rekombinantní homologie nebo „knockout“ strategie (porovnej s např., Kapecchi, Science, 244: 1288-1292, 1989) hlodavců, kteří neexprimují funkční protein ICAM-4 nebo kteří exprimují variantu ICAM-4 proteinu. Tito hlodavci jsou užiteční jako modely pro studování aktivit modulátorů ICAM-4 a ICAM—4 v prostředí in vivo.
Popisy mateřské patentové přihlášky USA č. 08/102852, podané 5. 8. 1993, jsou specificky zapsané pomocí odkazu. Příklady těchto přihlášek jsou zaměřené, mimo jiné na: určení a konstrukci oligonukleotidových sond pro PCR amplifikaci DNA vztahující se k ICAM; použití nukleotidových sond k amplifíkování lidského genomického fragmentu homologního k DNA, ale odlišného od těch DNA, které kódují ICAM-1 a ICAM-2; screening cDNA knihoven sgenomickými fragmenty k izolaci přídavných sekvencí kódujících ICAM-R; screening knihoven cDNA k izolaci úplné délky lidské sekvence cDNA kódující ICAM-R; charakterizaci informace DNA a aminokyselinové sekvence pro ICAM-R, zejména těch podobných ICAM-1 a
-5CZ 291974 B6
ICAM-2; vývoj savčích hostitelských buněk exprimujících ICAM-R; stanovení označením ICAM-R účastňujících se na adhezních případech, které zahrnují cesty závislého CD 18 a nezávislého CD 18; derivovaného ICAM-R; expresi variant ICAM-R; přípravu a charakterizaci protilátek anti-ICAM-R a jejich fragmentů; mapování epitopů ICAM-R rozpoznávajících pomocí anti-ICAM-R; stanovení distribuce a biochemické charakterizace ICAM-R a RNA, která jej kóduje; stanovení ICAM-R v homotypické adhezi buněk „cell-cell“ a imunní buněčné aktivaci/proliferaci; charakterizaci monoklonálních protilátek ICAM-R a stanovení diferenční fosforylace a cytoskeletních spojení cytoplazmatické domény ICAM-R Byla také popsána identifikace hlodavčí DNA, která kóduje ICAM, a která se současně zdá být krysím homologem k lidskému ICAM-R a dále použití této DNA ke konstrukci a expresi těch DNA, které kódují fuzní proteiny gluthation-S-transferázy. Podrobný popis jak byla identifikována tato hlodavčí DNA může být nalezen v mateřské přihlášce (U.S.S.N. 08/102852) v příkladu 6 a je zde reprodukován jako příklad 1. Ačkoliv bylo identifikováno více sekvencí DNA, které kódují hlodavčí ICAM, stalo se zřejmé, že hlodavčí DNA nekódovala krysí druhy homologní k ICAMR, ale kódovala vlastně nový polypeptid ICAM, zde nazvaný ICAM-4. Proto aby se zhodnotily ty příklady, které vedly k identifikaci ICAM—4, je poskytnuta chronologie, která je následovně podrobně popsána vynálezem.
První byla identifikována hlodavčí genomická sekvence pro ICAM-4, která kóduje oblasti homologní k doméně 2 (zde SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 23 v U.S.S.N. 08/102852) lidského ICAM-R (zde jako SEQ ID NO: 4). Jako druhá byla také identifikována přečnívající se genomická sekvence DNA (zde SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 26 U.S.S.N. v 08/102852), která kóduje obě oblasti domény 2 SEQ ID NO: 3 a sekvence pro ICAM-1. Použitím SEQ ID NO: 26 jako nukleotidové sondy byla identifikována cDNA hlodavčí sleziny (zde SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 25 v U.S.S.N. 08/102852), která kóduje domény 2 až 5 jakož i pátou doménu dříve nepopsanou jako doménu ICAM. Nyní se tyto nově identifikované hlodavčí DNA zdají kódovat hlodavčí homolog lidského ICAM-R, avšak seřazení 3 oblastí těchto DNA s ostatními ICAM se ukázalo obtížné.
Následná izolace klonu 1 kb cDNA z krysí slezinné knihovny a amplifikace fragmentu RT-PCR ukázaly, že část obou cDNA a genomických klonů nebyla sekvencována. Další RT-PCR amplifikační produkt (SEQ ID NO: 7) potvrdil tuto opomenuto věc. Bylo rozhodnuto, že fragment 17 bp byl vyříznutý z genomických a cDNA klonů pomocí štěpení EcoRI klonů, aby byly izolovány sekvence z λ fágu pro sekvenční studie DNA. Opakované analýz SEQ ID NO: 5 a 6 ve světle těchto jiných sekvencí umožnily identifikaci přesnějších a kompletnějších sekvencí pro původně izolované genomické a cDNA klony, které byly přítomné v opravené formě zde jako SEQ ID NO: 8 a 9.
Aby byla identifikována kompletní kódující sekvence pro ICAM-4, byla izolována krysí mozková cDNA (SEQ ID NO: 10) a 5' konec sekvence stanoven pomocí 5' rychlé amplifikace konců (5' RACE), amplifikační produkt je vyobrazen v SEQ ID NO: 11. Kombinováním informace z klonu RT-PCR (SEQ ID NO: 10) a amplifikačního produktu RACE (SEQ ID NO: 11) umožnilo identifikaci kompletní kódující sekvence pro ICAM—4 (SEQ ID NO: 1).
Předložený vynález je takto objasněn pomocí následujících příkladů. Obzvláště příklad 1 je zaměřen na klonování částečné hlodavčí DNA pro ICAM-4. Příklad 2 popisuje analýzu northemového přenosu (Northem blot) transkripce hlodavčí ICAM-4. Příklad 3 popisuje izolaci úplné délky hlodavčí cDNA pro ICAM—4. Příklad 4 se týká hybridizace v in šitu hlodavčího ICAM-4 v mozkové tkáni. Příklad 5 je zaměřen na generaci fuzních proteinů v prokaryontech. Příklad 6 popisuje produkci monoklonálních protilátek specifických pro krysí fuzní proteiny ICAM—4/GST. Příklad 7 popisuje expresi rozpustných krysích ICAM—4 proteinů v bucalovirovém expresním systému. Příklad 8 je zamřen na produkci monoklonálních protilátek specifických pro krysí ICAM-4 exprimovaný v baculovirovém expresním systému. Příklad 9 popisuje imunocytochemickou analýzu krysí exprese ICAM-4. Příklad 10 se týká klonování lidské genomické DNA kódující ICAM—4. Příklad 11 je zaměřen na klonování lidské cDNA
-6CZ 291974 B6 kódující ICAM-4. Příklad 12 popisuje Northemovou analýzu exprese lidského ICAM-4. Příklad 13 popisuje generaci lidských fuzních proteinů ICAM-4/GST. Příklad 14 je zaměřen na produkci monoklonálních protilátek imunospecifických pro lidský ICAM—4. Příklad 15 popisuje vývoj hlavního testu pro stanovení koncentrace rozpustného ICAM-4 zejména v tekutinách. Příklad 16 aplikuje metodu hlavního testu na stanovení koncentrace ICAM-4 v séru silných pacientů. Příklad 17 se týká stanovení traskripce ICAM-1 v krysích modelech epilepsie. Příklad 18 je zaměřen na klonování promotorové oblasti pro lidský ICAM-4.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování krysí DNA vztahující se k ICAM.
Izolace krysí genomové 2 DNA domény vztahující se k ICAM
U krysí genomové knihovny konstruované v λ EMBL3 byl proveden screening pomocí sony λα označené [ P] generované PCR z DNA kódující lidskou ICEM-3 doménu 2. Sekvence sondy je uvedena v SEQ ID NO: 12. Části knihovny byly přeneseny na nylonové membrány Hybond N+ (jAmersham, Arlinghton Heights, IL). Screening všech cDNA a genomových knihoven byl prováděn standardním způsobem. Prehybridizace a hybridizace byla prováděna v roztoku 40 až 50% formamidu, 5X Denhardtova činidla, 5X SSPE a 1,0 % SDS při 42 °C. Sondy (označené [32P]) byly přidány v koncentraci 105 až 106 cpm/ml hybridizačního roztoku. Následujících 16 až 18 hodin hybridizace byl nylonové membrány důkladně promývány při pokojové teplotě 2X SSPE s 0,1 % SDS a následně exponovány rentgenovými paprsky přes noc při -80 °C. Pozitivně reagující desky byly za účelem získání klonů fágů podrobeny jednomu nebo více cyklům hybridizace. DNA získaná z lyzátů pozitivních klonů byla subklonována do pBS+ a byla u ní stanovena sekvence.
U prvního genomového klonu kódujícího u krys doménu 2 vztahující se k ICAM bylo zjištěno, že je homologní k oblastem domény 2 u ostatních členů ICAM skupiny (viz například, tabulka 1 patentové přihlášky US 4. 08/102 852), přičemž je odlišná od dříve uvedených nukleotidových sekvencí krysího ICAM-1 [Kita a kol., Biochem. Biophys.-Acta 1131:108-110 (1992)]. Sekvence nukleových kyseliny a odvozené aminokyselinové sekvence pro tyto kmeny byly uvedeny v souběžné mateřské přihlášce této přihlášky jako funkční varianty krysího ICAM-R a dále byly uvedeny jako SEQ ID NO: 23 a 24 a U.S.S.N. 08/102 852. Stejné sekvence jsou v této přihlášce uvedeny v SEQ ID NO: 3 a 13.
Druhý, překrývající se klon byl identifikován stejnými sondami, přičemž bylo zjištěno, že obsahuje sekvenci ICAM domény 2 SEQ ID NO: 3 a 5' DNA kódující alespoň část krysího ICAM-1. Sekvence nukleových kyselin pro tento klon byla uvedena v souběžné mateřské přihlášce této přihlášky jako SEQ ID NO: 26 a v této přihlášce je uvedena jako SEQ ID NO: 5. Tento druhý klon ukazuje, že fragment genu vztahujícího se k ICAM prvního klonu a gen kódující krysí ICAM-1 jsou umístěny na stejném chromozomu do 5 kb od sebe.
B. Izolace krysí cDNA vztahující se k CIAM
Za účelem identifikace kompletnější sekvence kódující protein pro polypeptid vztahující se klCAM, sekvence DNA značená [32P] kódující doménu 2 z genomového klonu uvedeného v předchozím oddíle A (SEQ ID NO: 3), byla použita pro screening řada knihoven cDNA z různých kiysích a myších typů buněk, vztahující makrofágy (Clontech, Palo Alto, Ca), periferní
-7CZ 291974 B6 krevní lymfocyty (PBL) (Clontech), T buňky (domácí konstrukty), slezinové (Clontech), myší PBL (Clontech), T buňky (domácí konstrukty) a B buňky (domácí konstrukty).
Jednoduchý klon byl identifikován v cDNA knihovně krysí sleziny (Clontech), která obsahovala 5Ig podobných domén, přičemž pět žních bylo homologní k doméně 2 až 5 vICAM 1 a ICAM-R. Navíc tento klon obsahoval 3' DNA kódující pátou Ig podobnou doménu, která dosud nebyla identifikována v žádném ICAM polypeptidu. Navíc obsahoval klon obvyklou 3' sekvenci, o které bylo následně zjištěno, že se jedná o parciální intron (dále blíže diskutovaný) umístěný mezi doménami 4 a 5, což naznačuje, že tento klon byl produktem spojem nezralé nebo aberentní transkripce. Přítomnost unikátní domény a zjištění, že 3' oblast není správně připojen do skupiny jiných známých ICAM naznačuje, že DNA vztahující se k ICAM potenciálně kóduje nový krysí ICAM polypeptid. Sekvence nukleových kyselin tohoto klonu byla uvedena v mateřské přihlášce této přihlášky jako SEQ ID NO: 25; v této přihlášce je tato sekvence pro klon krysí slezinné cDNA uvedena v SEQ ID NO 6.
C. Opětná analýza krysí cDNA a genomové DNA
Následně po 5. srpnu 1993, kdy byla podána patentová přihláška US č. 08/102 852, bylo zjištěno, že parciální klon krysí slezinné cDNA (SEQ ID NO: 25 v mateřské a SEQ ID NO: 6 v této přihlášce) a genomový krysí jatemí klon (SEQ ID NO: 26 mateřské a SEQ ID NO: 5 v této přihlášce) postrádaly vnitřní fragment 177 bp EcoRI, který byl částí obou těchto klonů, který byl ale ztracen v kroku subklonování, kdy byly inserty knihovny odstraněny z λ vektoru pomocí štěpení EcoRI a připojeny k sekvenčnímu vektoru, ke zjištění, že cDNA a genomové klony mohou ztratit kódující fragment se dospělo srovnáním krysí genomové a cDNA sekvence s různými RT-PCR amplifikačními produkty, obsahujícími SEQ ID NO: 7, které odhalilo mezeru v krysí sekvenci.
Následná izolace a sekvenční porovnání cDNA ze slezinové knihovny za užití klonu slezinné cDNA (SEQ ID NO: 6) jako sondy poskytlo první zjištění, že části slezinné cDNA a genomických klonů nebyly sekvencovány. K dalšímu potvrzení této myšleny došlo po amplifikaci RTPCR fragmentu, přemosťující domény 3 a 5, užitím 5' primerů (RRD3 5'Xho, obsahující restrikční místo 5' Xhol usnadňující klonování), který je uveden v SEQ ID NO: 14, a 3' primerů (RRD5 3'Hind, obsahující restrikční místo Hind ΙΠ pro usnadnění klonování), který je uveden v SEQ ID NO: 15
GAACTCGAGGCCATGCCTCCACTTCC (SEQ ID NO: 14)
CCATAAGCTTTATTCCACCGTGACAGCCAC (SEQ ID NO: 15)
Porovnání těchto dvou DNA jasně prokázalo, že cDNA a genomové klony ztratily před sekvencováním fragment; tento názor byl dále podložen následující sekvenční analýzou dále uváděné RT-PCR DNA. Byl vyvozen závěr, že restrikční štěpení pomocí EcoRI pro odstranění cDNA a genomových fragmentů před sekvencováním má za následek odštěpení fragmentu 17 bp, které bylo vizuálně detekováno separací klonu od λ fágové sekvence na agarózovém gelu. Následující sekvenční analýza potvrdila umístění dvou oblastí EcoRI po boku 177 bp fragmentu u obou originálních klonů.
Fragment 177 bp EcoRI je umístěn mezi nukleotidy 719 a 896 v klonu krysí parciální cDNA, jak je uvedena v SEQ ID NO: 9 a mezi nukleotidy 2812 a 2989 v parciálním genomovém klonu, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 8:
-8CZ 291974 B6
D. DNA izolovaná pomocí RT-PCR klonu
RT-PCR byl použitý pro vytvoření úplnější informace o sekvenci pro krysí gen vztahující se k ICAM. Sekvenční informaci z genomových klonů (SEQ ID NO: 3) byla užita k určení komplementarity negativních primerů k oblasti 5' kódující protein, jak bylo určeno z cDNA klonu, a určení komplementarity pozitivních primerů ke kódující sekvenci a oblastem 3' ke kódující sekvenci klonu cDNA (SEQ ID NO: 6).
Matricová cDNA pro PCR reakce byla připravena následovně. Přibližně 2 pg póly A'RNA izolované z buněk krysí sleziny bylo denaturováno zahřátím na 65 °C v objemu 10 μΐ. Po denaturaci bylo přidáno 0,1 μΐ RNasinu (Invitrogen, San Diego, CA), 5 μΐ RX RTázového pufřu (RBL, Bethesda, MD), 2 μΐ hexameru (pd(N)6 v 100 μ g/ml)(Pharmacia, Piscataway, NJ) 6 μΐ dNTP (po 2 mM) a 2 μΐ AMV RTázy (BRL) a reakce byla udržována při 42 °C po dobu 60 až 90 minut. Po reakci byla směs až do spotřeby skladována při -20 °C.
Úvodní série pokusu byla proveden za účelem identifikace oligonukleotidových příměrových párů, které produkovaly amplifikační produkt v CR reakcích za užití krysí slezinné cDNA jako matrice. Různé 5' negativní primery byly párovány v PCR s 3' primery, které měly být komplementární k vnitřní, kódující sekvenci; 3' primer byl označen RRD2 3-1 a je uveden v SEQ ID NO: 16.
AACGTGCGGAGCTGTCTG (SEQ ID NO: 16) (V konečně izolovaném RT-PCR produktu, SEQ ID NO: 7, dále uvedeném, primer RRD2 3-1 koresponduje s nukleotidy 719 až 736). Obdobně byly různé 3' pozitivní primery párovány s 5' primery, které byly pokládány za komplementární k jiným interním kódujícím sekvencím; 5' primer v těchto reakcích byl označen RGen 3900S a je uveden v SEQ ID NO: 17.
ACGGAATTCGAAGCCATCAACGCCAGG (SEQ ID NO: 17) (Ve výše uvedené SEQ ID NO: 7 primer RGen3900S koresponduje s nukleotidy 1719 až 1736). Na základě velikosti amplifikačních produktů a schopnosti těchto produktů hybridizace s parciálním klonem cDNA, jeden pár primerů byl určen jako nejúčinnější a byl užit při následných PCR amplifikacích. Primer 5' byl označen RGen780S (SEQ ID NO: 18) a primer 3' byl označen RGen4550AS (SEQ ID NO: 19).
CATGAATTCCGAATCTTGAGTGGGATG (SEQ ID NO: 18)
ATAGAATTCCTCGGGACACCTGTAGCC (SEQ ID NO: 19) (V níže uvedené SEQ ID NO: 7 primer RGen780S koresponduje s nukleotidy 1 až 18 a primer RGen4550AS koresponduje s nukleotid 2197 až 2214).
Tento primární pár byl užit v PCR za různých podmínek, které byly užity pro optimalizaci amplifikace. Bylo použito 15 rozdílných PCR pufrů, které se lišily pH a koncentrací Mg^ při dvou odlišných teplotách a vzorky produktu z každé reakce byly separovány na 1% agarozovém gelu. Protože vizuální detekcí vybarvovacím ethidiumbromidovým gelem nebylo možno detekovat žádný amplifikační produkt za jakýchkoli reakčních podmínek, byla k detekci PCR produktů užita citlivější Southemova hybridizace.
Alikvotní díly amplifikované DNA byly separovány elektroforézou, převedeny na nylonovou membránu Hybond N+ za užití konvenčních technik Southemovy hybridizace a hybridizovány s kompletní krysí cDNA, která byla značena [32P] - Hybridizační podmínky byly v zásadě stejné, jako jsou výše popsány pro proces screeningu knihovny v sekci A. Autoradiografie ukázala, že
-9CZ 291974 B6 malé množství DNA přibližně 2,2 kb bylo generováno ve dvou z těchto reakcí, a zbytek amplifikačního produktu z těchto dvou reakcí byl separován na agarózovém gelu. Oblast 2,2 kb byla vymyta v gelu, ačkoliv při vizuálním pozorování nebyla zřejmá žádná vazba, a byla užita jako matrice při jiné PCR reakci za užití stejných primerů (SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 19), Tris-HCl pufru, pH 8,0, obsahujícím 1 mM Mg^ a teplotě 55 °C. Tento amplifikační produkt ze sekundárního PCR byl viditelný v gelu a byl vymyt a klonován do pBS+ plazmidu (Stratagene, La Jolla, CA) pro sekvenční analýzu.
Bylo zjištěno, že výsledný RT-PCR klon obsahuje 2214 bp, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 7. Klon kódoval domény 2 až 6 nalezené v klonu cDNA krysí sleziny, další amino terminální doménu 1, další karboxy terminální doménu 7 a 164 bp, která se ukázala být další karboxy terminální doménou 8. Bezprostředně následujícímu konci 5' k doméně 1 byla další sekvence 144bp, o které se předpokládá, že byla odvozena od instronu mezi vedoucí a první doménou. Tento klon neobsahoval 5' vedoucí sekvence nebo 3' transmembránové a cytoplazmatické oblasti. Hypotézu, že se jedná o nový hlodavčí ICAM, podporuje kromě prvně identifikované domény 6 v klonu slezinné cDNA také sedmá a osmá doména RT-PCR klonu.
Příklad 2
Northemova analýza.
Za účelem dalšího zjištění možnosti, že klony příbuzné ICAM uvedené v příkladu 1 kódují nový ICAM polypeptid, jak je naznačují unikátní Ig-podobné domény, tkáně specifické exprese byly podrobeny Northemově analýze, aby bylo možné srovnání s dříve popsanými expresními vzorky lidských ICAM [ICAM-1, Dustin a kol., J. Immunol. 137:245-254 (1986); ICAM-2, Staunton a kol., Nátuře 339: 61-64 (1989); ICAM-R, de Fourgerolles a Springer, J. Exp. Med. 175: 185-190(1992)].
Kompletní celulámí RNA z krysích plicních laloků, mozku, míchy, jater, zažívacího traktu, brzlfloi, lymfatických žláz a sleziny byla připravena užitím izolačních reagencií STAT60 RNA (Tel-test „B“, lne., Friendswood Texas) podle návodu doporučovaného výrobcem. PolyA^RNA byla přečištěna z celkové RNA užitím kolon oligo dT celulosy. Přibližně 5 pg RNA získané z každé tkáně bylo separováno na 1% formaldehydagarózovém gelu a převedeno na hybond-C nitrocelulosové membrány (Amersham).
Fragment krysí slezinné cDNA z příkladu 1 odpovídající doménám 2 až 4 (nukleotidy 1 až 724 v SEQ ID NO: 6) byl subklonován do pBluescript SK+ (Stratagene) a pozitivní nukleotidová sonda rRNA byla generována transkripcí v prostředí in vitro za užití UTP značené [32P] a přibližně 500 ng linearizované matrice podle postupu doporučeného výrobcem (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). Na membránu navázaná RNA byla předhybridizována v roztoku obsahujícím 50% formamid, 5X SSC, IX PE (50 mM Tris - HC1, pH 7,5, 0,1 % pyrofosfát sofný, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% ficoll, 5 mM EDTA, 1% SDS) a 150 pg/ml denaturované spermální lososové DNA. Označená sonda byla denaturována varem a přidána k předhybridizačnímu roztoku do konečné koncentrace 1 x 106 cpm/ml. Hybridizace byla ponechána probíhat po dobu 16 až 18 hodin při 65 °C. Membrány byly poté promyty při 65 °C v 2X SSC obsahujícím 0,1 % SDS a následně exponovány rentgenem po dobu 3 až 16 hodin.
Northemova analýza ukázala, že cDNA vztahující se klCAM uvedená v příkladě 1 byla exprimována pouze v krysím mozku, tkáni, která nebyla uváděna dříve v souvislosti s žádnými ICAM polypeptidy. Tento expresní vzorek v kombinaci s unikátní z jiných ICAM polypeptidů dosud neznámou Ig-podobnou doménou, naznačuje, že ICAM příbuzný klon byl nový člen rodiny ICAM bílkovin a byl pojmenován ICAM-4.
-10CZ 291974 B6
Fakt, že původně identifikované klony cDNA byly detekovány v krysí slezinné knihovně naznačuje, že část buněk ve slezině může v malém měřítku exprimovat ECAM-4. Avšak vhodně podélně spojené klony nemohou být detekovány v četných knihovnách hemopiotických cDNA, což vede k pochybnostem, zda ICAM-4 je skutečně exprimován v jiných tkáních, než je mozek. Jedno z vysvětlení pro detekci ICAM-4 cDNA ve slezině je takové, že citlivost PCR může být zvýšena stopovým množstvím transkriptu, přestože tyto tkáně neexprimují kódovaný protein.
Příklad 3
Izolace kompletní krysí ICAM-4 cDNA.
A. Identifikace klonu krysí mozkové cDNA
S ohledem na tkáňově specifickou expresi ICAM-4 byla užita při pokusu celá cDNA kódující ICAM-4 mRNA z mozkové tkáně. Dvě sondy, jedna komplementární k doménám 1 až 2 a druhá komplementární k doménám 3 až 5 klonu slezinné cDNA identifikované v příkladu 1 (SEQ ID NO: 7) byly radioaktivně označeny a užity k screeningu krysí mozkové cDNA knihovny v XgtlO, který byl předtím laboratorně připraven. Podmínky hybridizace byly popsány v příkladu 1 a pozitivní desky byly podrobeny jednomu nebo více cyklům screeningu za účelem získání klonálních fágů.
Bylo identifikováno devět pozitivních klonů, dva z nich byly hybridizovány u obou sond. Delší z těchto dvou klonů, nazvaný klon 7, obsahoval 2550 bp kódujících čtyři z pěti IG-podobných domén nalezených v sondě cDNA. Navíc klon 7 kódoval čtyři další Ig-podélné domény nenalezené v sondě. Byla identifikována domnělá transmembránová a cytoplazmatická doména následované stop kodonem, polyadenylačním signálem a póly A koncovou skupinou. Klon 7 ztratil alespoň jednu 5' Ig-podobnou doménu, jak bylo zjištěno porovnání s RT-PCR klonem (SEQ ID NO: 7 a také ztratil vedoucí sekvenci, opětným screeningem knihovny nebyly získány žádné delší klony, které obsahovaly tyto sekvence. Sekvence nukleotidových kyselin klonu 7 je uvedena v SEQ ID NO: 10:
B. Určení 5'konce
Za účelem izolace domény 1 a jiných 5'sekvencí byla užita PCR metoda nazývaná ,,5'Rapid Amplification od cDNA ENDS (RACE)“ [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a kol., (eds) Academie Press: New York (1990), str. 28 - 38)] využívající 5'RACE kit (Clontech). Tato metoda využívá vnitřní primer spárovaný s druhým primerem komplementárním sekvenci adapteru spojeného s 5' koncem molekul knihovny cDNA. PCR s tímto příměrovým párem tak zesiluje a usnadňuje identifikaci vložené sekvence. Informace přečnívající sekvence může být pak užita k vytvoření kompletní sekvence genu.
Hotová RACE cDNA z krysího mozku (obsažená v křtu) byla užita při PCR s oligonukleotidem (z kitu) a pozitivním primerem založeným na vnitřní ICAM—4 sekvenci. Pozitivní 3'primer uvedený v SEQ ID NO: 20 nazvaný Spot714AS, byl vytvořen podle ICAM-4 sekvence domény 4.
CARGGTGACAAGGGCTCG (SEQ ID NO: 20)
Amplifikační produkt získaný pomocí tohoto příměrového páru byl následně podroben sekundárnímu PCR za užití stejného 5' příměru (z kitu) spárovaného s 3' primerem komplementárním k oblasti ICAM-4 domény 1. Druhý 3' primer byl nazván RRCE2 aje uveden v SEQ ID NO: 21
-11CZ 291974 B6
TATGAAATTCAGTTGAGCCACAGCGAGC (SEQ ID NO: 21)
Každý přiměř užitý v sekundární PCR obsahovat EcoRl kk usnadnění klonování výsledných amplifikačních produktů do pBS+ (Stratagene). Výsledná plazmidová DNA, která obsahovala 5'konce genu byla identifikována hybridizací s krysí ICAM-4 doménou 1 a 2 sondy, odpovídající nukleotidům 1 až 736 v SEQ ID NO: 7. Parciální sekvenční informace pro doménu 1 a pro vedoucí hydrofobní sekvenci byla určena z výsledného amplifikačního produktu.
Produktem metody 5'RACE byl fragment DNA 222 bp obsahující 60 bp methioninový zbytek proti směsu exprese genu, 82bp vedoucí sekvence a 80 bp sekvence z domény 1. Amplifikační produkt je uveden v SEQ ID NO: 11.
C. Kompletní sekvence krysího ICAM-4.
Kompozitní klon kompletního ICAM-4 byl konstruován ze sekvenční informace odvozené z metody 5'RACE (SEQ ID NO: 11), klon RT-PCR (SEQ ID NO: 7) a klon 7 mozkové cDNA (SEQ ID NO: 10). Bylo zjištěno, že kompletní gen pro krysí ICAM-4 obsahuje 2985 bp jednoduchého otevřeného čtecího rámce kódující odvozený aminokyselinový protein 917. Odvozená Kozák sekvence je umístěna proti směru exprese genu methioninového zbytku ve vedoucí sekvenci. Hydrofobní vedoucí sekvence obsahující 27 aminokyselin je následována devíti Igpodobnými doménami, transmembránovou oblastí s 58 aminokyselinami cytoplazmatického konce. Kompozitní ICAM-4 cDNA je uvedena v SEQ ID NO: 1 a odvozená aminokyselinová sekvence je uveden a SEQ ID NO: 2:
Jako jiné ICAM polypeotidy, ICAM—4 obsahuje extracelulámí, transmembránovou a cytoplamatickou doménu. V extracelulámí doméně na N-konce ICAM-4 je vedoucí sekvence obsahující aminokyseliny 1 až 27, která je následována devíti imunoglobulin(Ig)-podobnými doménami, příznačnými pro ICAM-4, neboť ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R obsahuje pět, dvě a pět Ig-podobných domén. ICAM—4 obsahuje v doméně 1 aminokyseliny 28 až 118, doméně 2 obsahuje aminokyseliny 119 až 224; v doméně 3 obsahuje aminokyseliny 225 až 321; v doméně 4 obsahuje aminokyseliny 322 až 405; v doméně 5 obsahuje aminokyseliny 406 až 488; v doméně 6 obsahuje aminokyseliny 489 až 569; v doméně 7 obsahuje aminokyseliny 570 až 662; v doméně 8 obsahuje aminokyseliny 663 až 742; v doméně 9 obsahuje aminokyseliny 743 až 830.V každé doméně se tvoří charakteristická „smyčková“ struktura pomocí disulfidických vazeb mezi cysteinovými zbytky umístěnými obecně naproti sobě stojících koncích aminokyselinové sekvence domény. Jiné strukturální znaky ICAM—4 obsahuje transmembránová oblast obsahující aminokyseliny 831 až 859 a cytoplazmatická oblast obsahující aminokyseliny 860 až 971.
Porovnání homologních aminokyselinových sekvencí každé domény v krysím ICAM-4 s jinými členy ICAM rodiny bylo nalezeno na odpovídající sekvence lidského ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R, neboť informace pro tři hlodavčí homology nebyla zveřejněna. První doména hlodavčího ICAM—4 vykazuje 21, 30 a 28% identitu s lidským ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R. Druhá doména je více zachována, s identitou s ICAM-1, -2 a -3 dosahující 60, 42 a 62 procent. Domény 2 až 5 vykazují s ICAM-1 procentickou identitu 48, 49 a 40, s ICAM-R protentickou identitu 60, 59 a 29. Zajímavé je, že krysí ICAM-4 domény 6 až 8 jsou nejvíce homologní s doménou 5 (identické v rozsahu 29 až 42 %), která je pravděpodobně důsledkem publikací genových segmentů. Devátá a koncová extracelulámí doména se řadí ke zcela jiným ICAM doménám, ale vykazuj 22% identitu s třetí a šestou doménou lidského VCAM-1, jiného člen Ig rodiny bílkovin, který se podílí na buněčné adhezi. Cytoplazmatický konec má délku 58 aminokyselin. Je delší, než u jiných členů ICAM rodiny, neboť ICAm-1, -2 a -3 obsahují 28, 26 a 37 aminokyselin. Pokud se týká deváté domény, krysí ICAM-4 cytoplazmatický konec je nejvíce homologní s cytoplazmatickým koncem lidského VCAM-1, který obsahuje pouze 19 aminokyselin. Proximálních 19 aminokyselin krysího ICAM-4 sdílí 7 aminokyselinových zbytků s VCAM-1 (37%).
-12CZ 291974 B6
Konečně, funkční spojení sLFA-1 (SClla/CD18)spadá do první domény ICAM. Vonderheide a kol., [J. Cell. Biol., 125: 215-222 (1994)] identifikoval sekvenční motiv zahrnující integrinové spojení. Nezávisle na relativně nízkém stupni homologie mezi krysím ICAM-4 a jinými ICAM v doméně 1, tento spojovací sekvenční motiv je zachován, což naznačuje, že krysí ICAM-4 může být ligand pro LFA-1 a snad jiné integriny.
Příklad 4
Hybridizace in sítu v mozkové tkáni.
Za účelem lokalizace specifické mozkové tkáně, která exprimuje ICAM-4, byla použita hybridizace in šitu ICAM-4 domény 1 a ICAM-4 domény 3 až 4 a pozitivních sond RNA. Sondy byly označeny v prostředí in vitro transkripce za užití UTP označeného 35S.
Zmrazené části tkáně normálního krysího mozku byly fixovány v 4% paraformaldehydu po dobu 20 minut, opláchnuty a dehydratovány a fixována RNA denaturována před hybridizací po dobu 2 minut v 2X SSC, 70% formamidu při 70 °C. Části tkáně byly hybridizovány přes noc při 50 °C v roztoku obsahujícím 50% formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 10% dextransulfát, IX Denhardtova činidla, 0,5 mg/ml kvasničné RNA, 100 mM DTT a při koncentraci sondy 50 000 cpm/μΐ. Podložní sklíčka byla promyta jedenkrát v 4X SSC, 10 mM DTT při pokojové teplotě po dobu 60 minut, jednou v 50% formamidu, 2X SSC, 10 mM DTT při 60 °C po dobu 40 minut a jednou jak v 2X SSC, tak v IX SSC po dobu 30 minut, pokaždé při pokojové teplotě. Rozlišovací schopnost hybridizace byla zjišťována paralelními experimenty prováděnými stejným způsobem, ale také zahrnujícími důraznější promytí v 50% formamidu, IX SSC, 10 mM DTT při 60 °C po dobu 40 minut. Po promytí byla podložní sklíčka ponořena do emulze NTB2 (kodak, Rochester, NY a exponována od 2 do 21 dnů před vyvoláním a zpětným obarvením. Negativní kontrolní vzorky zahrnovaly negativní nukleotidové sondy získané z ICAM-4 domény 1 a ICAM-4 domény 3 až 4 negativní sondy RNA, navíc kRNA sondě lidského imunodeficientního viru (HIV-1).
Signál detekovaný v mozkové tkáni byl primárně lokalizován v oblasti šedé kůry s nej silnějším signálem v oblasti cerebrálního cortexu a hippocampu. Hybridizační profil byl totožný hlavně s expresí ICAM-4 v cerebrálních neuronech.
Příklad 5
Tvorba ICAM—4 fuzních proteinů.
Krysí ICAM-4/glutathion S-transferázové (GST) fůzní proteiny byl vytvořeny užitím prokaiyotního expresního vektoru pGEX (Pharmacia, Alameda, CA), aby se vytvořily monoklonální protilátky proti specifickým fragmentům polypeptidu ICAM-4.
PCR primery odpovídající 5'a 3' koncům domény 1 a 5' a 3' koncům domény 2 byly užity k zvětšení DNA fragmentů kódujících individuální domény. Výsledné fragmenty byly odděleně klonovány do ECoRI míst pGEX-2T; Sekvenční analýza potvrdila správnou orientaci a čtecí rámec. Produkty transformace byly následně podrobeny screeningu z hlediska jejich schopnosti produkovat fuzní protein vhodné molekulové hmotnosti.
Jak fuzní protein ICAM-4 domény 1/GST, tak fuzní protein ICAM-4 domény 2/GST zůstávaly po lyži bakterií sonifikací v PBS obsahujícím 1 % SDS v nerozpustné frakci. Nerozpustné proteinové frakce ze 100 ml kultur byly vařeny v SDS barvivu a odděleny na 10% preparativním polyakrylamidovém-SDS gelu, gel byl exponován v ledovém 0,4 M KC1 a byly získány pásy
-13CZ 291974 B6 fuzních proteinů. Fúzní proteiny byly získány elektroelucí z plátků gelu zdialyzační trubicí v pufru obsahujícím 25 mM Tris-HCl a 192 mM glycinu. Přibližná koncentrace proteinu byla zjištěna pomocí OD2go a čistota preparátu byla určena na SDS-PAGE obarvením Coomasiovou modří.
Příklad 6
Produkce monoklonálních protilátek proti krysím ICAM-4/GST fúzním proteinům.
Myši Balb/c byly imunizovány subkutánní injekcí pomocí 40 až 50 pg fúzního proteinu ICAM-4 domény-2/GST (popsaný v příkladu 5), který byl emulgován ve Freundově kompletním činidla (FCA). Po dvou týdnech byly myši znovu imunizovány subkutánní injekcí stejným proteinem, emulgovaným však ve Freundově nekompletním činidla. Dvě závěrečné intraperitoneální imunizace byly provedeny po dalších dvou týdnech po druhé imunizaci pomocí rozpustného antigenu bez adjuvans v dvoutýdenním intervalu. Sérum z každé imunizované myši bylo zkoumáno ELISA testem na jejich schopnost specificky reagovat s krysím ICAM-4 produkovaným níže popsaným baculovirovým expresním systémem.
Slezina myši #1654 byla sterilně vyjmuta a umístěna do 10 ml bezsérového RPMI 1640. Suspenze buněk byla vytvořena rozmělněním slezinné tkáně mezi dvěma chlazenými mikroskopiovými podložními sklíčky ponořenými do bezsérového RPMI 1640 (Gibco, Burlingron, Ottawa, Kanada) obsahujícího 2 mM L-glutaminy, 1 mM pyruvátu sodného, 100 jednotek/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu. Buněčná suspenze byla přefiltrována přes sterilní Nitexovo buněčné síto o pórech 70 mesh (Becton Dickinson, Parsipany, NJ) a dvakrát promyta RPMI, načež následovalo odstředění při 200 x g po dobu 5 minut. Výsledné pelety po konečném promytí byly resuspendovány v 20 ml bezsérového RPMI. Thymocyty získané z tří myší, se kterými nebyly dosud činěny žádné pokusy, byly získány obdobnými způsobem.
Před vlastní fúzí byly myelomové buňky NS-1 udržovány v log fázi růstu v RPMI s 11 % Fetaclon séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, utah) po dobu tří dnů. Při zpracování byly buňky odstředěny při 200 x g po dobu 5 minut a pelety byly dvakrát promyty obdobným způsobem, jak je uvedeno v předchozím odstavci. Po promytí byla buněčná suspenze převedena do konečného objemu 10 ml bezsérového RPMI, a 20 μΐ alikvotm díl odebrán a zředěn 1 : 50 bezsérovým RPMI a 20 μΐ alikvotního podílu tohoto roztoku bylo odebráno, smíseno s 20 μΐ 0,4% trypanové modři v 0,85% fyziologickém roztoku (Gibco), zavedeno na hemacytometr (Baxter healthcare, Deerfield, IL) a buňky byly spočítány. Přibližně 2,425 x 10* slezinných buněk bylo zkombinováno s 4,85 x 107 NS-1 buněk, směs byla odstředěna a supematant byl odstraněn. Výsledné pelety byly přemístěny pomocí punkce trubice a během 1 minuty byly přidány za stálého míchání 2 ml 50% PEG 1500 v 75 mM Hepes, pH 8,0 (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). Následně bylo během 7 minut přidáno 14 ml bezsérového RPMI. Buněčná suspenze byla odstředěna při 200 x g po dobu 10 minut a supematant byl odstraněn. Pelety byly resuspendovány v 200 ml RPMI obsahujícím 15 % FBS, 100 μΜ hypoxanthinu sodného, 0,4 μΜ aminopterinu, 16 μΜ thymidinu (HAT) (Gibco), 25 jednotek/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 106 thymocytů/ml. Suspenze byla nejprve umístěna do 225 cm2 baňce (Coming, Essex, Velká Británie) při 37 °C po dobu čtyř hodin před nanesením na deset 96 jamkových desek pro tkáňové kultury „96 well fiat bottom tissue culture“ (Coming) v množství 200 μΐ/jamku. Buňky na deskách byly zásobeny ve třetím, čtvrtém, pátém a šestém dnu po fúzi odebráním přibližně 100 μΐ z každé jamky pomocí 20 g jehly (Becton Dickinson) a přídavkem 100 μΐ/jamku plotnového média popsaného výše s výjimkou obsahu 10 jednotek/ml IL-6 a tím, že chyběly thymocyty.
Fúzní desky byly podrobeny screeningu a to nejprve pomocí dále uvedeného antigenového testu ELISA. Deska při 4 °C 100 ng/jamku buď fúzním proteinem domény 1-GST, nebo domény
-14CZ 291974 B6
2-GST v 50 mM uhličitanovém pufru. Desky byly fixovány pomocí 100 μΐ/jamku 0,5 % želatiny z ryzí kůže (Sigma, St Louis, MO) v PBS po dobu 30 minut při 37 °C. Po fixaci byly desky promyty 3X s PBS obsahujícím 0,05 % Tween 20 (PBST) a bylo přidáno 50 μΐ/jamku hybridního supematantu z každé fuze. Po inkubaci při 37 °C po dobu 30 minut byly desky opláchnuty, jak bylo výše popsáno a bylo přidáno 50 μΐ peroxidázy z křenu konjugované s kozím anti-myším IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) a ředění 1:3500. Desky byly opět inkubovány po dobu 30 minut a promyty 4X s PBST. Bylo přidáno 100 μΐ a 0,1 μΐ (ml 30% H2O2 v 100 mM citrátu o pH 4,5. Barevná reakce byla ponechána probíhat 10 minut a byla zakončena přídavkem 50 μΐ/jamku 15% kyseliny sírové. Na automatickém detekčním přístroji (Dynatech) byla zjištěna absorbance při 490 nm.
U jamek, které byly pozitivní na protein domény 2-GST, ale ne na protein domény 1-GST byly podrobeny screeningu testem ELIS A byl proveden výše popsaným způsobem s výjimkou, že desky Immudlon 4 byly v úvodu pokryta přes noc baculovirovm supematantem zředěným 1 : 4 v 50 mM uhličitanovém pufru. Tři jamky (103A, 103 a 103F) byly úspěšně klonovány dva až tři krát dvojitým zředěním RPMI, 15% FBS, 100 μΜ hypoxanthinu sodného, 16 μΜ thymidinu a 10jednotek/ml IL-6. Jamky desek sklony byly vyhodnoceny vizuálně po 4 dnech a bylo spočteno množství kolonií v jamce s posledním vhodným zředěním. Vybrané jamky z každého klonování byly opět podrobeny testu ELISA po 7 až 10 dnech proti proteinu domény 1-GST a proteinu domény 2-GST nebo baculovirového supematantu.
Monoklonální protilátky produkované hybridomy byly izotypovány testem ELISA. Desky Immulon 4 (Dynatech) byly pokryty při 4 °C 50 μΐ/jamku kozím anti-myším IgA, IgG, nebo IgM (Organon Teknika, Durham, NC) zředěném 1 : 5000 v 50 mM uhličitanovém pufru o pH 9.6. Jamky byly fixovány po dobu 30 minut při 37 °C pomocí 1% BSA v PBS, a promyty 3X PBST.
Zředění 1 : 10 supematantu hybridomové kultury (50 μΐ) bylo přidáno ke každé desce, inkubováno a promyto výše uvedeným způsobem. Po odstranění posledního zbytku promytí bylo přidáno 50 μΐ křenové peroxidázy konjugované s králičím anti-myším IgGi, G2a, G2b, nebo G3 (Zymed, San Francisco, CA) (zředěno 1 : 1000 v PBST s 1% normálního kozího séra). Desky byly inkubovány výše uvedeným způsobem, promyty 4X PBST a bylo přidáno 10 μΐ substrátu, barevná reakce byla zastavena po 5 minutách přídavkem 50 μΐ 15% kyseliny sírové a automatickým přístrojem (Dynatech) byla zjištěna absorbance při 490 nm.
Výsledky naznačují, že protilátky 103A, 103B a 103f byly všechny izotypy IgGi. Tyto protilátky byly následně užity v imunocytochemické analýze pomocí Westernová přenosu a pro purifikaci proteinu exprimovány v baculoviru.
Příklad 7
Baculovirová exprese krysího ICAM-4.
Baculovirový expresní systém (Invitrogen) byl užit k tvorbě rozpustného proteinu odpovídajícího doménám 1 až 6 ICAM-4. Protože v této době nebyla známa vedoucí sekvence pro ICAM-4, expresní konstrukt byl vyroben s tím, že obsahoval kódující sekvenci pro ICAM-4 fúzovanou s vedoucí sekvencí ICAM-1 ve vhodném čtecím rámci. Konkrétní detaily týkající se konstrukce ICAM-l/ICAM-4 expresního plazmidu jsou uvedeny dále.
Krysí ICAM-1 DNA kódující pět Ig-podobných domén byla namnožena PCR užitím primerů, které obsahovaly některé znaky k usnadnění konstrukce fuzních plazmidů. 5' oligonukleotidový primer obsahující Hindin a Bg/II navíc ve shodě s Kozák sekvencí proti směru exprese genu od prvního methioninu ve vedoucí sekvenci. 3' oligonukleotidkový primer obsahoval kódující sekvenci pro šest histidinů následovanou stop kodonem a klonujícím místem HindHl. PCR
-15CZ 291974 B6 amplifikační produkt byl klonován do vektoru HindUI-štěpeném pBS+, přičemž sekvenční analýza potvrdila vhodnost konstrukce. Vnitřní místo Smál v ICAm—1 vedoucí sekvenci a další Smál místo ve vektorové vícenásobné klonující oblasti (3' ICAm-1 Ig-podobná doména 5) byly rozštěpeny, což odstranilo většinu ICAM-1 kódující sekvence. Po této manipulaci, linerizovaný vektor se zarovnanými konci obsahoval část oblasti proti směru exprese genu vícenásobné klonující oblasti (tato restrikční místa 5' původního HindUI místa ve vícenásobné klonující oblasti), Kozák sekvenci a většinu ICAM-1 vedoucí sekvence.
Kódující sekvence pro krysí ICAM-4 domény 1 až 6 byla amplifikována PCR užívajících primerů k umožnění klonování této sekvence do výše uvedeného linearizovaného vektoru. 5'oligonukleotidový primer obsahoval EcoRV místa a kodony potřebné k doplnění CIAM-1 vedoucí sekvence. 3'oligonukleotidový primer obsahovat kodony pro šest histidinových zbytků, stop kodon a Hindin a EcoRV restrikční místa. Amplifikační produkt z této PCR byl štěpen EcoRV za vzniku sekvence se zarovnanými konci, které byly navázány do Smal-štěpeného pBS+ linearizovaného vektoru se zarovnanými konci. Kompletní sekvence obsahující ICAM-1 vedoucí sekvenci 5' k ICAM-4 doménám 1 až 6 byla odstraněna z konstruktu pomocí Bg/Π a HindllI štěpení a purifikovaná fuzní sekvence ICAm-l/ICAm-4 byla klonována přímo do Bg/n/Hindm-štěpeného pBluesac ΙΠ vektoru (Invitrogen).
Proteinová produkce rekombinantního viru byla zkoumána metodou ELISA, za užití immunosér z myší imunizovaných pomocí krysího ICAm—4domény-2/GSt fuzního proteinu popsaného v příkladu 5. Při další práci byly monoklonální protilátky vytvořené těmito myšmi užity k purifikaci proteinu ICAM—4 produkovaného rekombinantním baculovirem v buňkách SF9.
Příklad8
Produkce monoklonálních protilátek proti baculovirem exprimovanému krysímu ICAM-4.
Krysí ICAM-4 domény 1-6 byly exprimovány v baculovirovém expresním systému, jak je popsán v příkladu 7. Rekombinantní protein byl purifikován za užití monoklonální protilátky 103A (jak je popsáno v příkladu 6).
Ve stručnosti, 30 mg purifikované monoklonální protilátky 103A (v 100 mM) borátu sodného, 500 mM chloridu sodného) bylo spojeno se třemi gramy přípravku Activated Cynogen Bromide Sepharose 4B (Pharmacina, Piscataway, NJ). Baculovirový supematant obsahující rekombinantní krysí ICAM-4 (domény 1 až 6) byl nanesen na kolonu se Sepharosou a při 4 °C ponechán přes noc. Kolona byla promývána fosfátově pufrovaným fyziologickým roztokem bez obsahu vápníku a hořčíku (CMF-PBS) a navázaný materiál byl eluován v 50 mM citrónové kyselině, 500 mM NaCl o pH 4,0. Vzorek byl neutralizován pomocí 1/10 objemu Tris pH 10 a uložen při -20 °C. Purifikovaný protein oddělený na SDS-PÁGE vykazoval větší než 90% čistotu a pohyboval se v okolí 80 kD.
Myši byly imunizovány pomocí purifikovaného rekombinantního krysího ICAm-4 doména 1-6 proteinu obdobným způsobem, jako je popsáno v příkladu 6. Slezina z myší #1945 byla užita pro fúzi #127. Postup fuze byl stejný, jako v příkladu 6. Fůzní jamky byly podrobeny screeningu metodou ELISA na rekombinantní ICAM-4 protein. Sekundární screening zahrnoval imunocytochemii částí krysího mozku (jak je dále popsáno v příkladu 9). Touto fůzí byly vyklonovány další čtyři protilátky specifické pro krysí ICAM-4: 127A, 127E, 127F a 127H. Imunocytochemický obsah každé z těchto protilátek částí krysího mozku byl stejný, jako bylo zjištěno u monoklonální protilátky 103A (viz příklad 9). Monoklonální protilátky byly testovány na svoji schopnost vázat Dl/GST a D2/GST fuzní proteiny (popsané v příkladu 5). Monoklonální protilátka 127A rozpoznávala Dl/GST fuzní protein a 127H rozpoznávala D2/GST fuzní protein. Tyto dvě rozdílné vazebné specifikace spolu sjinými, které se navázaly s žádným GST
-16CZ 291974 B6 proteinem naznačují, že byly nalezeny alespoň 3 různé epitopy. Hybridomy 127A a 127H byly uloženy 31. května 1995 a 1. června 1995 do Američan Type Culturea Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod číslem HB11905 a HB11911.
Příklad 9
Imunocytochemie exprese krysího ICAM-4.
Za účelem lokalizace produkce proteinu v krysím mozku byla provedena imunocytochemie pomocí monoklonální protilátky 103 A.
Mozek byl získán z normální dospělé samice Lewisovy krysy, šípovitě rozdělen a promýván v bez-RNázovém IX PBS na ledu po dobu 30 minut. Části mozku byly umístěny do kryoforem v Tissue Tek Π (Mlles Laboratories, lne., Naperville, IL) do malého množství sloučeniny O.C.T. (Miles, lne, Elkhart, IN). Mozky byly umístěny do středu kryoforem, ty byly naplněny sloučeninou OCT, umístěny do zásobníku s 1-methylbutanem (Aldrich Chemical Company, In., Milwaukee, WI) a kontejner byl umístěn do kapalného dusíku. Po zmrznutí tkání a OCT sloučeniny v kiyoformách byl bloky skladovány při -80 °C do rozdělení na sekce.
Tkáně byly rozděleny na sekce o tloušťce 6 pm, přichyceny na podložní sklíčka pokrytá přípravkem Vextabond (Vector Laboratories, lne. Burlingame, CA) a podrobeny přes noc sušení na vzduchu při pokojové teplotě až do použití. Sekce byly fixovány v ethyletheru (Malinckrodt, Paris, KY) po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Po vyjmutí sklíček z etheru byl reagent ponechán odpařit. Každá ze sekcí tkáně byla zablokována pomocí 150 pl 50% normálního krysího séra (Sigma) a 2% hovězího serumalbuminu (BSA) (Sigma) v IX PBS (vyrobeném pouze s fosforečnanem sodným) po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Po blokaci byl roztok jemně odsát ze sekcí a purifíkovaná supematantová protilátka 103A (165 mg/ml) byla zředěna v poměru 1:10 v blokovacím roztoku a na každou sekci tkáně bylo aplikováno 150 μΐ. Podložní sklíčka byla umístěna ve zvlhčovači komůrce a inkubována přes noc při 4 °C.
Následující den byl protilátkový roztok jemně odsát ze sekcí a podložní sklíčka byla promyta třikrát v IX PBS po dobu čtyř mnut při každém promývání. Přebytek PBS byl ze sklíček odsát a na každou tkáň bylo aplikováno 100 μΐ sekundární krysí anti myší-biotin konjugované protilátky (Jackson Immuno-Research Laboratories), zředěné 1:100 v roztoku 10% normálního krysího séra a 2% BSA v IX PBS. Inkubace probíhala po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě. Sekce byly promyty dvakrát v IX PBS po dobu čtyř minut u každého promývání, poté bylo na každou sekci aplikováno 100 μΐ ABC reagentu zkitu Elitě Rat IgG Vectastain ABC (Vector Laboratories, lne., Burlingame, CA), připraveného podle návodu výrobce. Inkubace byla ponechána probíhat po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Po inkubaci byla podložka sklíčka promyta dvakrát v IX PBS (čtyři minuty každé promytí) a na každou sekci bylo po dobu asi deseti minut aplikováno 150 μΐ Vector VIP Peroxidase Substráte Solution (Vector Laboratoeis, lne., Burlingame, CA). Po barevné reakci byly sekce oplachovány pod tekoucí vodou po dobu pěti minut, podbarveny pomocí Mayerova hematoxylinu (Sigma) po dobu 20 sekund a opět jemně oplachovány pod tekoucí vodou po dobu pěti minut. Podložní sklíčka byla dehydratována přes série se stoupající koncentrací ethanolu, protáhnuta xylenem a překryta pomocí Accumount 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).
Imunohistochemie sekcí krysího mozku zpracovaných pomocí mAbl03A ukazuje, že ICAM-4 se exprimován v buňkách neuronů hippocampu. Obarvený vzorek ukazuje, že protein může být omezen na neuronuální procesy (dendrity). Sekce mozku obarvené podobným způsobem pomocí irelevantních protilátek nebo samotným činidlem použitým v druhém kroku nevykazují jasné expresní vzory, jako je tomu u MAb 103 A.
-17CZ 291974 B6
Příklad 10
Klonování lidské ICAM-4 genomické DNA.
Během klonování krysího ICAM-4 z genomické DNA bylo zjištěno, že ICAM-4 a ICAM-1 jsou místěny do 5 kb od sebe a tato informace byla užita při pokusu klonovat lidský homolog ICAM-4.
Genome Systems lne. (St. Louis, MO) amplifikují fragmenty v lidské PÍ knihovně pomocí PCR za použití lidských primerů ICAM-1 domény 3, negativních primerů navržených komplementárně k lidské ICAM-1 doméně 3 (H-1/D3 S) a pozitivního primerů navrženého komplementárně k lidské ICAM-1 doméně 3 (H-1/D3 AS). Tyto primery jsou uvedeny v SEQ ID NO: 22 a 23.
CCGGGTCCTAGAGGTGGACAACGCA (SEQ ID NO: 22)
TGCAGTGTCTCCTGGCTCTGGTTC (SEQ ID NO: 23)
Byly identifikovány dva klony, nazvané 1566 a 1567, které byl dále podrobeny další analýze. Oba PÍ klony obsahovaly přibližně 75 až 95 kb insertů genomické DNA. Klony byly rozštěpeny pomocí BamHl, separovány pomocí elektroforézy na agarózovém gelu a nastříknuty na nylonovou membránu. Southemova hybridizace byla provedena při mírnějších (30% formamid) a drsnějších (60% formamid) podmínkách při 42 °C s radioaktivně značenými sondami lidského ICAM-1, ICAM-3 nebo krysího ICAM-4; další složky hybridizačního roztoku byly stejné jako v příkladu 1. Série podrobena mírnějším hybridizačním podmínkám byla promyta při pokojové teplotě v 2X SSPE obsahujícím 0,1 % SDS. U drsněji hybridizovaných bylo promytí provedeno při 65 °C v 0,2 X SSPE obsahujícím 0,1 % SDS. Promyté membrány byly vystaveny rentgenu po dobu 3,5 hodin.
Diferenciální hybridizace ukázala, že lidský ICAM-1 je obsahem v 5,5 kb BamHl fragmentu, zatímco lidský ICAM—4 je umístěn na 4,0 kb a 1,5 kb BamHl fragmentu. Lidské ICAM 1 a ICAM-R fragmenty byly subklonovány po pBS+ a jejich totožnost byla potvrzena sekvenční analýzou.
Fragment 7,0 kg BamHl Hybridizovaný s krysím ICAM-4 za drsnějších podmínek byl subklonován a dále fragmentován pomocí Rsal restrikčního štěpení. Byly identifikované tři Rsal fragmenty hybridizované s krysím ICAM-4 a byly určeny jejich sekvence. Založeno na homologii s krysím CIAM4, zdá se, že tyto fragmenty obsahují domény 2, 3, 4, 6 a část domény 6.
Přikladli
Klonování lidské ICAM-4 cDNA.
Fragmenty genomické DNA odpovídající doménám 2-5 lidského ICAm-4 (popsáno v příkladu 10) byly užity jako sondy pro screening knihovny XgtlO lidské hippocampové cDNA (clontech, Palo Alto, CA). Postup při screeningu byl v zásadě stejný, jako je popsáno v příkladě 1.
Nejdelší klon lidského ICAM-4 (#18), který byl nalezen v této knihovně měl pouze 992 bp (SEQ ID: 24) a odpovídal v zásadě středu předpokládaného 3 kb genu. Insert 992 bp DNA z klonu 18 (SEQ ID NO: 24) byl užit jako sonda po screening knihovny λΖΑΡΠ lidské hippcampové cDNA (Stratagene, La Jolla, CA). Tato knihovna poskytovala množství pozitivních klonů. Nejdelší klon, #34, měl 275 bp (SEQ ID: 25). Založeno na srovnání s kompletním krysím
-18CZ 291974 B6
ICAM-4, byl vysloven předpoklad, že tento klon ztratil vedoucí sekvenci a přibližně 30 bp na 5' konci domény 1. Chyběly póly A+ konec na 3' konci, ale translační stop kodon byl přítomen.
Jako sonda k screeningu knihovny XgtlO cDNA odvozené z lidského cerebrálního cortexu (clontech, Palo Alto, CA) bylo použito fragmentu DNA odpovídajícího prvním 3 doménám (nukleotidy 1 až 850 v klonu #34). Bylo zjištěno, že jeden klon 16-1 (SEQ ID: 26) má 1557 bp, a zahrnuje 39 bp 5' netranslatované DNA, vedoucí sekvenci a sekvenční informace páté domény. Překrývající se klony #34 (SEQ ID: 25) a 16-1 (SEQ ID: 26) byly použity k tvorbě kompozitu kompletní sekvence lidského ICAM-4 (SEQ ID: 27).
Kompletní gen je dlouhý 2927 bp a kódují protein o 924 aminokyselinách. Nukleotidová sekvence ICAM-4 je uvedena v SEQ ID NO: 27 a aminokyselinám sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 28. Sekvenční porovnání s kompletním genem krysího ICAM-4 prokázala celkovou identitu DNA 82 % a identitu na aminokyselinové úrovni 85 %. Zjevná 9 lb podobná extracelulámí doménová struktura proteinu je zachována u krysy i u člověka. Vedoucí sekvence sahá od aminokyselin 1 k 28, doména 1 od aminokyseliny 29 k aminokyselině 117; doména 1 od aminokyseliny 29 k aminokyselině 117; doména 2 od aminokyseliny 118 k aminokyselině 11224; doména 3 od aminokyselin 225 k aminokyselině 320; doména 4 od aminokyseliny 321 k aminokyselině 405; doména 5 od aminokyseliny 406 k aminokyselině 488; doména 6 od aminokyseliny 489 k aminokyselině 570; doména 7 od aminokyseliny 571 k aminokyselině 663; doména 8 od aminokyseliny 664 k aminokyselině 743; doména 9 do aminokyseliny 744 k aminokyselině 837; transmembránová oblast od aminokyseliny 837 k aminokyselině 837 a cytoplazmatický konec od aminokyseliny 858 k aminokyselině 924.
Lidské ICAM-4 (HuICAM-4) navíc k tomu, že jsou geneticky svázané s ICAM-1 a ICAM-R také vykazují některé strukturální znaky, které je pojí dohromady jako rodinu molekul. Domény při porovnání domén HuICAM-4 s jinými členy ICAM rodiny vykazují rozdílný stupeň homologie. Doména 1 aminokyselinové sekvence HuICAM-4 je z 21, 30 a 26 % identická s doménou 1 ICAM 1, 2 a 3. Doména 2 aminokyselinové sekvence HuICAM-4 je z 61, 39 a 62 % identická s doménou 2 ICAM 1, 2 a 3. Doména 3 aminokyselinové sekvence HuICAM-4 je z 50 a 65 % identická s doménou 3 ICAM 1 a 3. Doména 4 aminokyselinové sekvence HuICAM-4 je z 54 a 65 % identická s doménou 4 ICAM 1 a 3. Domény 5 až 8 aminokyselinové sekvence HuICAM-4 jsou nejvíce homologní kpáté doméně ICAM-1 a 3 s procentickým vyjádřením identity pohybujícím se od 3 do 47 % pro ICAM-1 doménu 5 a od 21 do 31 % pro ICAM-R doménu 5. Devátá doména HuICAM-4 se podobá málo jiným členům ICAM rodiny, aleje homologní k doméně 3 (z 24 % identická) a 6 (z 23 % identická) HuICAM-1.
Příklad 12
Northemova analýza exprese lidského ICAM-4.
Dvě soupravy lidské dvojité tkáně pro Northemovu hybridizaci byly pořízeny u firmy Clontech (Palo Alto, CA). Obsahovaly alespoň 2 pg póly A+RNA z 16 různých lidských tkání (jak je uvedeno v tabulce 1) zpracované v denaturovaném formaldehydovém 1,2% agarózovém gelu a přemístěny na nylonovou membránu. Skvrny byly předhybridizovány po dobu tří hodiny při 42 ;C v 10 ml roztoku obsahujícího 5X SSPE, 10X Denhardtsův roztok, 50 % formaldehydu, 2% DSD a 100 pg/ml denaturované DNA z lososového spermatu. Skvrny byly hybridizovány ve výše uvedeném roztoku s radioaktivně značenou sondou lidského ICAM-4 (klon #18, SEQ ID: 24) po dobu 16 hodin při 42 °C. Následující den byly skvrny promyty v roztoku 0,lX SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě, načež následovalo promytí při 50 °C. Skvrny byly exponovány rentgenovým zářením při 80 °C po dobu 24 hodin. Výsledky analýz jsou níže uvedeny v tabulce 1.
-19CZ 291974 B6
Pouze pruh obsahujíc RNA z mozku hybridizovanou se sondou ICAM-4 poskytoval jednoducho vazbu přibližně o 3 kb. Delší expozice (pět dní) potvrdila, že pouze mozek měl detekovatelnou úroveň odezvy. Aby se zjistilo, zda všechny pruhy obsahovaly srovnatelné množství RNA srovnatelné kvality, stejné skvrny byly hybridizovány pomocí kontrolní β-aktinovou sondou. Skvrny byly odstraněny ICAm-4 sondou zpracováním vroucím roztokem 0,1% SDS po dobu 15 minut a následně zpracovány stejným způsobem s β-aktivitou sondou. Až na nepatrné rozdíly v množství všechny pruhy vykazovaly dobrou kvalitu RNA.
Tabulka 1
Northemova analýzy tkáně expresí lidského ICAM-4.
sonda
Tkáň ICAM-4 β-aktin
srdce — +++
mozek + -H-
placenta — +++
plíce - +++
játra - 4-H-
tělesná svalovina - ++++
ledviny - +++
pankreas — 4-4-
slezina - 4-H-
brzlík - -H-H-
prostata - 4-H-
varle — 4-H-
vaječník — 4-H-
tenké střevo — 4-H-
tračník - +++
periferní krevní leukocyty - 4-H-
Dvě další Northemovy soupravy byly pořízeny od firmy Clontech, které obsahovaly póly A+ RNA z 16 různých částí lidského mozku (jak je uvedeno v tabulce 2). Skvrny byly zpracovány obdobným způsobem, jak byl užit pro analýzu tkání a výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. Kvalita a množství RNA byla zkontrolována zkouškou skvrn pomocí β-aktinové sondy.
Všechny oblasti, které vykazovaly expresi ICAM-4 jsou částmi telencephalonu s výjimkou tkalamu, který je považován za část diencephalonu. Hippocampus a kůra mozková vykazovaly nejvyšší úroveň exprese. Velikost transkriptu byla ve všech případech stejná, 3 kb. Výborná distribuce tkání při expresi ICAM-4 naznačuje, že promotorové oblasti mohou obsahovat částice, které umožňují zjištěnou vývojovou a prostorovou expresi genových produktů. Využití takových informací může přispět k porozumění řízení genové exprese obecně.
-20CZ 291974 B6
Tabulka 2
Northemova analýza typu mozkové buňky expresí lidského ICAm-4.
sonda
oblast mozku ICAM-4 β-aktin
amygdala ++ +++
nucleus candatus -H- +++
corpus sallosum + +++
hippocampus ++ +++
hypothalamus — +++
substantia nigra - +++
subthalamické jádro + +++
thalamus + +++
malý mozek — +++
cerebrální cortex +++ +-H-
prodloužená mícha — +++
mícha — +++
okcipitální pól ++ +++
přední lalok ++ +++
temporální lalok ++ +-H-
putamen ++ +++
Příklad 13
Vytváření lidských ICAM-4/IgG fúzí proteinů.
Expresní plazmidy lidského ICAM—4/IgGl fuzních proteinů byly zkonstruovány za účelem produkce proteinu pro výrobu monoklonálních protilátek a pro použití v adhezních zkouškách k identifikaci potenciálních ICAM-4 ligandů. Byly připraveny dva konstrukty; první obsahoval DNA kódující domény 1 až 3 HuICAM-4 a druhý domény 4—8. Oba byly napojeny na Fc oblast lidského IgGl ve vektoru pDCSl, který užívá cytomegalovirovový (CMV) promotor křížení exprese a signální sekvence z IgG4 k usnadnění sekvence molekul.
PCR primery (dále uvedena jako SEQ ID NO: 29 až 32) byly vytvořeny k tvorbě nezbytných DNA fragmentů pro subklonování. ,,Negativní“ primer pro 5' konce domény 1 (HI4-Dl(s), SEQ ID NO: 29) byl vytvořen k vyplnění 39 párů bází domény 1 chybějících v klonu #34. Primer HI4-D1(S) (SEQ ID N: 29) a HI4-D3 (AS) (SEQ ID NO: 30) byly užity k tvorbě DNA fragmentů kódujících domény 1 až 3 lidského ICAM-4, odpovídajícího oblasti v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 130 k nukleotidu 996. Primery HI4-D(3) (SEQ ID NO: 31) a HI4-D8 (AS) (SEQ ID NO: 32) byly užity k vytvoření DNA fragmentů kódujících domény 4 až 8 lidského ICAM-4, odpovídající oblasti v SEQ ID NO: 30 od nukleotidu 997 k nukleotidu 2268. Každý 5' primer kódoval BamHI restrikční místo (CGATCC, níže uvedeno tučně) každý 3' (pozitivní) primer obsahovatl Xhol místo (CTCGAG, níže uvedeno tučně) k usnadnění subklonování 5' do IgGl genu. Všechny oligonukleotidy obsahují sparové nukleotidy (níže podtrženo) a 5' konce k umožnění restrikčního štěpení.
-21 CZ 291974 B6
HI4-D1(S) (SEQ ID NO: 29)
GTACTTACAGGATCCGCGGTCTCGCAGGAGCCCCTTCTGGGCGGACCTACAGCCTGCGT
GGCGGTTC
HI4-D3(AS) (SEQ ID NO: 30) ňlXieiCTCGAGGATGGTCACGTTCTCCCGG
HI4-D4(S) (SEQ ID NO: 31)
ATTTCTGGATCCTACAGCTTCCCGGCACCACTC
HI4-D8(AS) (SEQ ID NO: 32)
AmCICTGGAGTTCCACGCCCACAGTGACGG
PCR reakce byly provedeny v 50 μΐ objemu za užití pufrů dodávaných firmou Perkin Elmer sAmpliTaq enzymem. Primery tyly přidány v konečné koncentraci 10 pg/ml a všechny čtyři dNTP byly obsaženy v koncentraci 2 mM. Reakce pokračovaly ve 30 cyklech zahrnujících krok denaturace (94 °C po dobu čtyř minut), temperace (50 °C po dobu dvou minut) a výdrž (72 °C po dobu jedné minuty). PCR produkty byly zviditelněny na agarózových gelech a alikvotní díly z každé reakce byly užity k subklonování PCR produktů do vektoru pCRII (Invitrogen, SanDiego, CA). K detekci případných chyb následkem amplifikačního procesu a k potvrzení vhodné orientace byla provedena sekvenční analýza. Příslušné klony byly rozštěpeny pomocí BamHI a Xhol a fragmenty byly separovány pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. Purifikované fragmenty byly navázány do pCDSl vektoru předběžně štěpeného BamHI a Xhol a výsledné plazmidy byly sekvencovány za účelem potvrzení správné orientace a čtecího rámečku.
Lidské ICAM-4 doména 1 až 3 a 4 až 8/IgGl fuzní proteiny byly získány následující přechodnou transfekcí expresních plazmidů do COS7 buněk a izolací vylučovaného proteinu z kultivačního média. Transfekce byla provedena následovně. Adhezní COS7 buňky s přibližnou soudržností 50 až 60% byly promyty pomocí CMF-PBS a následně uvedeny do kontaktu s 10 až 15 pg plazmidové DNA v 7,5 ml bezsérovém DMEM médiu (Gibco, Gaithersburg, MD) obsahujícím 6 pl 0,25 M chlorchinonu (Sigma, St. Louis, MO). Bylo přidáno dalších 7,5 ml bezsérového média obsahujícím 6 pl 0,25 M chlorchinonu (Sigma, St. Louis, MO). Bylo přidáno dalších 7,5 ml bezsérového média obsahujícího 150 pl DEAE dextranu (50 mg/ml) (Sigma, St. Louis, Mo) a desky byly inkubovány 2 až 3 hodiny před tím, než bylo médium odstraněno a nahrazeno 10% DMSO (Mallinckrodt, McGaW Park, Illinois) v PBS. Po jednominutové inkubaci byl roztok DMSO odstraněn a nahrazen čerstvým médiem obsahujícím 5% PBS. Každá transfekce zahrnovala několik desek a média z každé buňky exprimující stejný protein byly shromažďovány pro izolaci proteinu.
Média byla sbírána každé tři dny po proběhnutí 3 až 4 izolací. Proteiny byly purifikovány za použití 0,4 až 0,8 ml Procep A kolony (Bioprocessing Ltd, England), předpřipravené pomocí 35 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5. Kultivační médium bylo naneseno na kolonu dvakrát a při rychlosti průtoku menším než 60 objemů kolony za hodinu. Kolona byla promývána jedenkrát 20 objemy kolony Tris/NaCl pufru, 20 objemy kolony 0,55 M diethanolaminu, pH 8,5 a 20 objemy kolony 50 mM kyseliny citrónové, pH 5,0. Fúzní proteiny byly eluované jako jednomililitrové frakce za užití 50 mM kyseliny citrónové o pH 3,0 a každá frakce byla neutralizována 1/19 objemu 1 M Tris, pH 9,5. Koncentrace proteinu byla zjištěna OD280, čistota byla stanovena za užití SDS-PAGE.
-22CZ 291974 B6
Byla zaznamenána závažná kontaminace hovězím IgG (přítomným vFBS). Přestože se předpokládalo, že domény 1 až 3 fuzního proteinu budou menší, než domény 4 až 8 fúzního proteinu, obě dvě skupiny postupovaly přibližně jako 90 kD. Jedno možné vysvětlení pro toto zjištění je, že menší domény 1 až 3 fuzního proteinu mohou být více glykosylované, než větší domény 4 až 8 fuzního proteinu.
Navíc k použití purifikovaných proteinů pro výrobu monoklonálních protilátek, která je popsána níže, může být také použito proteinů v adhezních zkouškách k identifikaci ICAM-4 ligandů.
Příklad 14
Výroba monoklonálních protilátek.
Purifikovaný protein popsaný v příkladu 13 byl použit k vytvoření monoklonálních protilátek za užití imunizačních postupu popsaného v příkladu 6.
Slezina z myši #2250 (imunizovaná pomocí HuICAm-4Dl-3/IgGl) byla použita pro fúzi 172 a slezina z myši #2272 (imunizovaná pomocí HuICAm-4 D4-8/IgGl) byla užita pro fúzi 173. Použitý postup fuze byl stejný, jako v příkladu 6. U fuzních desek byl proveden screening pomocí testu ELISA (v zásadě popsaný v příkladu 6) za použití HuICAM-4/IgGl fuzního proteinu. Fúzní supematanty, které rozpoznávaly imunogenní proteiny a žádný jiný, byly brány v úvahu pro klonování. Jako sekundární screening byla užita imunocytochemie na části lidského hippocampu.
Jeden primární klon z každé fuze byl imunocytochemicky pozitivní a byl klonován. Jeden z těchto dvou klonů během klonování přestal růst, čímž zůstal pouze jeden sledovaný objekt, klon 173E, který byl odvozen od myši imunizované HuICAM-4 D4-8/IgGl. Hybridom 173E byl deponován 1. června 1995 v Američan Type Culture Collection, 1203 Parklawn Drive, Rockville, Myryland 20852, a bylo nu přiděleno číslo HB11912.
U jiné fuze provedené pomocí myši imunizované rozpustným fragmentem ICAM-4 odpovídajícím doménám 1 až 4 bylo zjištěno, že šest klonů (179A, 179B, 179D, 179H, 1791 a 197K) je specifických pro HuICAM4 domény 1 až 4 (Dl-3). Všech šest protilátek v sérii 179 se váže k dendritickým procesům vdentálním gyru, stejně jako vrstvám polymorfních a pyramidálních buněk. Kromě dendritických procesů monoklonální protilátka 179A navíc lne k buňkám neuronů z těchto ploch.
Další fuze byly provedeny obdobně za vzniku jiných protilátek specificky imunologicky reagujících s jednotlivými oblastmi ICAM-4.
Příklad 15
Provádění záchytných zkoušek.
Šest monoklonálních protilátek z fuze 179 bylo testováno v různých kombinacích na jejich schopnost zachycovat a detekovat rozpustný ICAM-4 v roztoku. Tyto zkoušky, jak jsou popsány níže, byly provedeny, aby se vyhodnotily úrovně rozpustného ICAM-4 v tělních tekutinách lidí ve vztahu k normálním a chorobným podmínkách.
Protilátka 1791 byla nanesena na jamkové desky Immunolon 4 (Dynatech) 96 v množství 3 μΐ/ml 125 μΐ/jamku pod obu dvou hodin při 37 °C. Roztok protilátek byl odstraněn odsátím a jamky byly blokovány po dobu 30 minut při pokojové teplotě pomocí 300 μ blokovacího roztoku
-23CZ 291974 B6 obsahujícího 5 % Teleosteanové želatiny v bezkalciovém bezhořečnanovém PBS (SMS-PBS). Blokovací roztok byl odstraněn odsátím a 100 μΐ kapaliny ze vzorku rozdělen vOmmi Diluent (CMF/PBS, 1 % želatiny a 0,05 % Tween 20) bylo přidáno do každé jamky a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut. Desky byly promyty třikrát PBST (CMF-PBS, 0,05 % Tween 20). Protilátka 179H byla biotinylována v 1,5 mg/ml za užití HBS-LC-Biotin (Pierce) podle návodu výrobce, zředěném 1:2000 a přidaném do jamek (100 μΐ/jamku). Výsledná směs byla inkubována po dobu 30 minut při 37 °C a desky byly promyty třikrát PBST. Do každé jamky byl přidán Streptavidin-HRP (Pierce) (100 μΐ, 0,25 pg/ml) a tato směs byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut. Desky byly promyty čtyřikrát PBS, poté bylo přidáno 100 μΐ Tetramethylbenzidinu (Sigma) (10 mg/ml zásobního roztoku v DMSO) zředěném 1:100 v pufrovaném substrátu (13,6 g/L trihydrátu acetátu sodného, pH upraveno na 5,5 pomocí 1 M kyseliny citrónové, se 150 μΙ/L 30% peroxidu vodíku přidaného bezprostředně před reakcí). Reakce byla ponechána probíhat po dobu 30 minut při pokojové teplotě v temnu, načež byla reakce zastavena přídavkem 50 μΐ/jamku 15% kyseliny sírové. Byla zjištěna absorbance při 450 nm.
Výsledky naznačují, že zkouška byla schopna detekovat rozpustný HuICAM—4 Dl-3 rekombinantní protein v tak nízkých koncentracích jako 5 až 10 mg/ml stím, že lineární část křivky je v rozmezí 10 až 100 mg/ml. Při koncentraci 1 až 10 pg/ml nebyla zjištěna žádná křížová reaktivita s HuICAM4 D4-8.
Příklad 16
Stanovení rozpustného ICAM-4 v séru pacientů s mrtvicí.
Za účelem zjištění role ICAM-4 v neurologických chorobách a stavech bylo analyzováno sérum od dvaceti osmi pacientů trpících mrtvicí a dvaceti mladých zdravých dobrovolníků (bez udání věku), jak je popsáno výše, na rozdíly v koncentraci rozpustného ICAM-4.
Výsledky ukazují, že sérum od zdravých dobrovolníků neobsahovalo detekovatelnou úroveň ICAM-4. Dvacet z osmadvaceti pacientů s akutní mrtvicí však mělo detekovatelné množství ICAM-4. Signál u pacientů s mrtvicí odpovídá intervalu 5 až 38 ng/ml standardu (rozpustného ICAM-4 Dl-3 rekombinantního proteinu).
Příklad 17
Úroveň ICAM-4 mRNA v hippocampu u krysího modelu epilepsie
Úroveň exprese krysí ICAM-4 mRNA byly zjišťovány v hippocampu krys ošetřených takovým způsobem, aby se u nich vytvořil model vyvolané zvířecí epileptogenese [Lothman a kol., Brain Res. 360: 83 - 91 (1985)]. V tomto modelu je krysí hippocampus stimulován sériií subconvulsivních elektrických šoků pomocí elektrod implantovaných od této oblasti mozku, které postupně vyvolávají těžké záchvaty. Proces vyvolávání stavu zahrnoval dvanáct stimulací za den prováděných obden po dobu osmi dnů. Po úplném rozvinutí může jeden stimul vyvolat záchvat a histologické změny, které jsou podobné lidské epilepsii. Krysy, po proběhnutí procesu vyvolání, byly podrobovány dvěma stimulacím za den po dobu dvou týdnů a 24 hodin po poslední stimulaci byly usmrceny. Hippocampus byl odstraněn a rozdělen pro přípravu RNA.
Z každého vzorku byla připravena kompletní RNA za použití guanidinum/fenol/chloroformového extrakčního postupu [Chomezynski a Sachi, Anal. biochem. 162: 156-159 (1987)]. RNA byla separována na denaturujících formaldehydových agarózových gelech, přemístěna na nylonové membrány a hybridizována pomocí radioaktivně značených sond krysího ICAM—4 a glycer
-24CZ 291974 B6 aldehyd-3-fosfátdehydrogenázové -(GAPDH) specifické sond DNA. GGAPDH je bazálně exprimovaný gen, který je běžně používán jako kontrol k detekci změn řetězců v množství RNA nanesených na gel. Výchytky v poměru ICAM-4PGAPDH jsou interpretovány jako změny v úrovni exprese ICAM-4. Hybridizační pásma pro ICAM-4 a GAPDH byla kvantitativně určena pomocí phosphorimageru a byl stanoven poměr ICAM—4/GAPDH.
Poměr ICAM-4/GAPDH byl významně vyšší u kontrolních zvířat, které nebyly podrobeny proceduře vyvolání záchvatu (n=5) ve srovnání se skupinou, u které proběhla, což naznačuje, že ICAM-4 byl nižší jako důsledek procesu vyvolání záchvatu. Je třeba však poznamenat, že kontrolní skupina nepodstoupila žádné ošetření, takže existuje množství, že úroveň ICAM-4 mRNA byly vytvořeny jako odezva na chirurgické zákroky spojené s procesem vyvolávání záchvatu.
Příklad 18
Klonování a analýza regulační DNA proti směru exprese genu lidského ICAM-4.
Genová exprese ICAM-4 je prostorově a časově regulována expresí limitovanou do nejvíce přední nebo ventrální oblasti mozku telencephalonu. Nukleotidová oblast 5' kódující sekvence lidského ICAM—4 byla zkoumána v pokusech identifikování genových sekvencí odpovědných za restrikční transkripční regulaci ICAM-4.
A 2607 pár bází fragmentu BamHI/Pstl odvozeného od genomického 7 kb fragmentu BamHI (popsaný v příkladu 10) byl sekvencován a bylo nalezeno 1684 nukleotidů proti směru exprese genu startovacího kodonu ATG. Kompletní sekvence pro tuto oblast proti směru exprese genu je vyobrazena v SEQ ID NO: 33: S ohledem na pozici kódující oblasti pro ICAM-4 je „A“ v ATG startovacím kodonu (očíslovaný v SEQ ID NO: 33 je nukleotidy 1685-1687) označen +1 nukleotid a nukleotid nejbližší oblasti 5' k nukleotidu A+1 je označen -1. Celková sekvence je tedy ukázána jako ta, která sahá od nukleotidu 1684 až k nukleotidu +3, což odpovídá číslování v seznamu sekvencí nukleotidů od 1 do 1687 nukleotidu.
Na základě genomické sekvence HuICAM-4 byly nukleotidy syntetizovány používání v PCR pro vytvoření molekul DNA různých délek v rozmezí proti směru exprese regulační oblasti genu. Každý oligonukleotid vystavený v tabulce 3 obsahuje intergenovou oblast (vyznačeno kurzívou) přibližně 6-10 bp, aby umožnila enzymatické štěpení produktu PCR, Nhel nebo HindQl restrikční místo (vyznačeno tučně) a specifická hybridizace sekvence příměru (vyznačeno podtržené). Oligonukleotidová jména obsahují čísla, která označují jejich lokalizaci v rozmezí proti směru exprese regulační oblasti genu. V PCR amplifikacích byly oligonukleotidy párovány jak je ukázáno v tabulce 4, aby vytvořily fragmenty DNA obsahující specifické oblasti proti směru exprese regulátorové oblasti genu.
-25CZ 291974 B6
Tabulka 3
PCR primery používané k amplifikaci HuICAM-4 oblastí proti směru exprese genu.
H14-19(AS) CAGAAČTAAGCTTACAGGAGGCGAGGAGAGCGCGAG SEQ ID NO: 34
H14 -114 CAACAATGCTAGCQAAGCGCAACTCTGTCTQ SEQ ID NO: 35
H14'149 CAACAATGCTAGCQTTGGAAACCAAGTTACC SEQ ID NO: 36
H14-206 CAACAATGCTAGCAGGAGCTTAGCGCACGCTQG SEQ ID NO: 37
H14-27 0 CAACAArcCTAGCQATGCCGGCCTCCACGTAG SEQ ID NO: 38
H14-408 CAACAATGCTAGCQrCCAGCTTATTATCATQ SEQ ID NO: 39
H14-480 CAACAATGCTÁGCQTTAGTCCCCAAATGTATC SEQ ID NO: 40
H14-560 CAACAATGCTAGCQGAGAAGGATCAGTGAG SEQ ID NO: 41
H14-S17 CAACAATCCTAGCQTCCACCCACCGAGCAGAAG SEQ ID NO: 42
Restrikční místa a intergenová oblast generované uvnitř každého nukleotidu umožňují enzymatické štěpení a následující přímé klonování individuálního produktu PCR do základního vektoru pGL3 (Promega, Madison, WI), který obsahuje reportérový gen luciferasy bezprostředně exprimovaný po směru exprese genu vícenásobného klonovacího místa (MCS). Promotorová aktivita klonovaná do oblasti MCS vektoru řídí expresi reportérového genu luciferasy v transfektovaných buněčných liniích a slabá produkce zexprimované luciferasy může být měřena jako indikátor promotorové aktivity. Základní vektor pGL3 nemá promotor a proto slouží jako negativní kontrola, zatímco vektor pGL3 obsahující promotor SV40 slouží jako pozitivní kontrola. Sekvence každého expresního konstruktu překontrolována pomocí restrikční analýzy a sekvencováním DNA.
Plazmidy obsahující každou z amplifikovaných sekvencí popsaných v tabulce 4 byly tranšfektovány do savčích buněk použitím transfekce (MBS) transfekční savčí jednotkou (Stratagene, La Jolla, CA) podle návodu použití daného výrobcem. Každý plazmid byl zaveden do dvou odlišných buněčných linií, COS 7 a NT2 prekurzorových buněk (Ntera2/Dl z Stratagene). COS 7 buňky jsou běžně používané opičí buněčné linie podobné fíbroblastu transformované promotorem SV40, který je vytvoří vhodné pro řízení exprese genu pod kontrolou promotoru SV40 v buňkách transfektovaných pozitivním kontrolním promotorovým vektorem pGL3. Prekurzorové buňky NT2 jsou zecílenou nervovou prekurzorovou buněčnou linií a zatímco neexprimují ICAM-4 mohou být reprezentanty buněčného typu, kteiý exprimuje ICAM-4.
-26CZ 291974 B6
Tabulka 4
Párované primeiy a amplifíkované oblasti.
oligonukleotidové páry odpovídající regulátorová oblast proti směru exprese genu
H14—19(AS) sH14—114
H14—19(AS) s H14-149 —19—>—149
H14-19(AS) s H14-206 -19-^-206
H14-19(AS) s H14—270 -19-^-270
H14-19(AS) s H14-408 -19->-408
H14-19(AS) s H14—480 —19—>—480
H14-19(AS) s H14-560 -19—>—560
H14-19(AS) s H14-817 -19->-817
Každá jamka šestijamkové destičky potažené tkáňovou kulturou (Falcon) byla zaočkována 2,4xl05 buňkami. Transfekce buněk COS 7 a NT2 byly provedeny těsně u sebe v dvojím vyhotovení použitím 5 pg plazmidů pro každou jamku. Buňky byly kultivovány při 37 °C, po 48 hodin, lysovány a testovány na aktivitu luciferasy pomocí systému Luciferasy Assay Systém (Promega).
Výsledky těchto experimentů, které jsou přehledně uvedeny v tabulce 5, indikují vysokou úroveň promotorové aktivity, která se nalézá v oblastech -408 až do -19 a -480 až do -19 regulátorové oblast proti směru exprese genu v buňkách NT2 ICAM-4. Protože buňky NT2 jsou nervového původu, mohou exprimovat určité transkripční faktory, které rozpoznávají promotor ICAM-4, které nejsou nalezeny v ostatních buněčných typech. Nej vyšší úroveň promotorové aktivity v COS buněčných transfektantech byla docílena plazmidem, který obsahuje nukleotidy -560 až do -19. Zatímco pozitivní kontrolní promotorový vektor pGL3 pracuje dobře v buňkách COS ukazuje se velmi nízká promotorová aktivita v buňkách NT2, což ilustruje specifickou preferenci buněčného typu pro určité promotorové sekvence.
Tabulka 5: Promotorová aktivita 5' oblastí ICAM-4.
oblast proti směru exprese genu luminiscence
COS NT2
-114 až do-19 0,003 0,376
-149 až do-19 0,008 0,628
-206 až do-19 0,443 0,622
-270 až do-19 0,056 1,140
-408 až do-19 0,401 7,970
-480 až do-19 0,274 4,630
-560 až do-19 3,227 1,232
-871 až do-19 0,035 4,453
pGL3 promotorový vektor 29,070 0,063
pGL3 promotorový vektor 0,008 0,014
Neboť, ani COS ani NT2 buňky normálně neexprimují ICAM-4, byl opakován stejný experiment užitím původně kultivovaných krysích neuronů hippocampu, které exprimují ICAM—4 a bezpodmínečně exprimují transkripční mašinérii požadovanou pro promotorovou aktivitu ICAM—4. Pomocí transfekce jednotlivých promotorových konstruktů zde popsaných, jakož i ostatních, do přirozenějšího prostředí, kůže být pravděpodobné identifikovat přesněji, které
-27CZ 291974 B6 nukleotidy v regulátorové oblasti proti směru exprese genu jsou odpovědné za pevně stanovenou regulaci genu ICAN-4 v mozku.
Dříve zmínění ilustrativní příklady se týkají současně preferovaných provedení vynálezu a jejich početné modifikace a variace budou očekávány ve stejném provedení i pro odborníka znalého stavu techniky. Tudíž pouze taková omezení jak se projevuje v připojených nárocích by mělo být zaznamenáno v rozsahu předloženého vynálezu.
Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace (i) přihlašovatel: Gallatin, W. Michael
Kilganon, Patrick D.
(ii) název vynálezu: ICAM-4 materiály a metody (iii) korespondenční adresa:
(A) adresát: Marshall, O'Toole} Gerstein, Murray & Borun (B) ulice: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower (C) město: Chicago (D) stát: Illinois (E) země: United States od America (F) PSČ: 60606-6402 (v) počítačově čitelná forma:
(A) typ média: floppy disk (B) počítač, kompatibilní s IBM PC (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: Patentln Release # 1,0, verse # 1,25 (vi) údaje o současné přihlášce:
(A) číslo přihlášky:
(B) datum podání:
(C) klasifikace:
(vii) údaje o dřívější přihlášce:
(A) číslo přihlášky: US 07/827,689 (B) datum podání: 27.1.1992 (vii) údaje o dřívější přihlášce:
(A) číslo přihlášky: US 07/889,724 (B) datum podání: 26.5.1992 (vii) údaje o dřívější přihlášce:
(A) číslo přihlášky: US 07/894,061 (B) datum podání: 5. 6. 1992
-28CZ 291974 B6 (vii) údaje o dřívější přihlášce:
(A) číslo přihlášky: US 08/009,266 (B) datum podání: 22.1 1993 (vii) údaje o dřívější přihlášce:
(A) číslo přihlášky: US 08/102,852 (B) datum podání: 5.8: 1993 (vii) údaje o dřívější přihlášce:
(A) číslo přihlášky: US 08/245,295 (B) datum podání: 18. 5.1994 (vii) údaje o dřívější přihlášce:
(A) číslo přihlášky: US 08/485,604 (B) datum podání: 7.6. 1995 (viii) informace o zástupci/agentovi:
(A) jméno: Williams JR. Joseph A.
(B) registrační číslo: 38,659 (C) garant/číslo rejstříku: 27866/33321 (ix) telekomunikační informace:
(A) telefon: 312-474-6300 (B) telefax: 312-474-0448 (C) telex: 25-3856 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) charakterizace sekvence:
(A) délka: 2988 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) charakteristika:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 61..2814 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
-29CZ 291974 B6
AÁŤTCGATCA CTCGCGCTCČ CCTCGCCTTC TGČGCTCTCC CCTCCCTGGC AGCGGCGGCA
ATG CCG GGG CCT TCA CCA GGG CTG CGC CGA ACG CTC CTC GGC CTC TGG 108
Met Pro Gly Pro Ser Pro Gly Leu Arg Arg Thr Leu Leu Gly Leu Trp
1 5 10 15
GCT GCC CTG GGC CTG GGG ATC CTA GGC ATC TCA GCG GTC GCG CTA GAA 156
Ala Ala Leu Gly Leu Gly Xle Leu Gly Ile Ser Ala Val Ala Leu Glu
20 25 30
CCT TTC TGG GCG GAC CTT CAG ccc CGC GTG GCG CTC GTG GAG CGC GGG 2 04
Pro Phe Trp Ala Asp Leu Gin Pro Arg Val Ala Leu Val Glu Arg Gly
35 40 45
GGC TCG CTG TGG CTC AAC TGC AGC ACT AAC TGT CCG AGG CCG GAG CGC 252
Gly Ser Leu Trp Leu Asn Cys Sér Thr Asn Cys Pro Arg Pro Glu Arg
50 55 60
GGT GGC CTG GAG ACC TCG CTA CGC CGA AAC GGG ACC CAG AGG GGT CTG 300
Gly Gly Leu Glu Thr Ser Leu Arg Arg Asn Gly Thr Gin Arg Gly Leu
65 70 75 80
GGC TGG CTG GCT CGA CAG CTG GTG GAC ATC CGA GAG CCT GAA ACC CAG 348
Arg Trp Leu Ala Arg Gin Leu Val Asp Ile Arg Glu Pro Glu Thr Gin
85 30 ?5
CCG GTC TGC TTC TTC CGC TGC GCG CGC CGC ACA CTC CAA GCG CGT GGG 396
Pro Val Cys Phe Phe Ars Cys Ala Arg Arg Thr Leu Gin Ala Arg Gly
100 105 110
CTC ATC CGA ACT TTC CAG CGA CCG GAT CGG GTA GAG CTA GTG CCT CTG 444
Leu li· Thr Phe Gin Arg Pro Ásp Arg Val Glu Leu Val Pro Leu
115 120 125
-30CZ 291974 B6
CCT Pro ecG Pro 145 CCT Pro 130 GGG Gly TGG CAG Trp Gin CCT Pro CCC Pro GTA GGT Val Gly GAG AAC TTC ACC Glu Asn Phe Thr TTG AGC TGC Leu Ser Cys 140 ACC TTG ČTG AGG Arg CGA Arg GTC Val GGC Giy 160 492 540
CGA Arg 150 135 GCG Ala
GCA Ala GGA Gly AGC Ser' CTC ACA Leu Thr TTG Leu 155
Thr Leu Leu
GGC CAG GAG CTG ATT CGC CGA AGT TTC GTA GGC GAG CCA CCC CGA GCT 588
Gly Gin Glu Leu Ilé Atg Arg Sér' Phe Val Gly Glu Pro Pr o Arg Ala
165 170 175
CGG GGT GCG ATG CTC ACC GCC ACG GTC CTG GCG CGC AGA GAG GAT GAG 636
Arg. Gly Ala Met Leu Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Arg Glu Asp His
iao 185 190
AGG GCC AAT TTC TCA TGC CTC GCG GAG CTT GAC CTG CGG CCA CAC GGC 684
Arg Ala Asn Phe Ser Cye Leu Ala Glu Leu Αερ Leu Arg Pro His Gly
195 200 205
TTG GGA CTG TTT GCA AAC AGC TCA GCC CCC AGA CAG CTG CGC ACG TTT 732
Leu Gly Leu Phe Ala Asn Ser Šer Ala Pro Arg Gin Leu Arg Thr Phe
210 215 220
GCC ATG CCT CCA CTT TCC CCG AGC CTT ATT GCC CCA CGA TTC TTA GAA 780
Ala Met Pro Pro Leu Ser Pro Ser Leu Zle Ala Pro Arg Phe Leu Glu
225 230 235 240
GTG GGC TCA GAA AGG CCG GTG ACT TGC ACT TTG GAT GGA CTG TTT CCT 828
Val Gly Ser G1U Arg Pro Val. Thr Cys Thr Leu Ásp Gly Leu Phe Pro
245 250 GGA 255 CAT
GCC CCA GAA GCC GGG GTT TAC CTC TCT CTG GAT CAG AGG CTT 876
Ala Pro Glu Ala Gly Val tyt Leu Ser Leu Gly Asp Gin Arg Leu His
260 265 270
CCT AAT GTG ACC CTC GAC GGG GAG AGC CTT GTG GCC ACT GCC ACA GCT 924
pro Asn Val Thr Leu Asp Gly Glu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Ala
275 280 285
ACA GCA AGT GAA GAA CAG GAA GGC ACC AAA CAG CTG ATG TGC ATC GTG 972
Thr Ala Ser Glu Glu Gin Glu Gly Thr Lys Gin Leu Met Cys Zle Val
290 295 300
ACC CTC GGG GGC GAA AGC AGG GAG ACC CAG GAA AAC CTG ACT GTC TAC 1020
Thr Leu Gly Gly Glu Ser Arg Glu Thr Gin G1U Asn Léu Thr Val Tyr
305 310 315 320
AGC TTC CCG GCT CCT CTT CTG ACT ΤΓΑ AGT GAG CCA GAA GCČ CCC GAG 1068
Ser Phe Pro Ala Pro Leu Leu Thr Leu Ser Glu Pro G1.U Ala Pro Glu
325 33 Q 335
GGA AAG ATG GTG ACC GTA AGC TGC TGG GCA GGG GCC CGA GCC CTT GTC 1116
Gly Lys Met Vál Thr Val Ser Cys Trp Ala Gly Ala Arg Ala Léu val
340 345 350
ACC TTG GAG GGA ATT CCA GCT GCG GTC CCT GGG CAG CCC GCT GAG CTC 1164
Thr Leu Glu Gly Ile Pro Ala Ala Val Pro Gly Gin Pro Ala G1U Leu
355 360 365
-31 CZ 291974 B6
ČAG Gin TTA AAt GTC Val ACA Thr ÁAG Lys áat Asn 375 GAC GAC AAG Lys CGG GGC Arg Gly 380 TTC TTC Phe Phe TGC Cys GAC Asp 1212
Leu 370 Asn Asp Asp
GCT GCC CTC GAT GTG GAC GGG GAA ACT CTG AGA AAG AAC CAG AGC TCT 1260
Ala Ala Leu Asp Vai Aso Gly Glu Thr Leu Arg Lys Asn Gin Ser Ser
385 39*0 395 4 00
GAG CTT CGT GTT CTG TAC GCA CCT CGG CTG GAT GAC TTG GAC TGT CCC 1308
Glu Leu Arg Val Leu Tyr Ala Pro Ařg Leu Asp Asp Leú Asp: Cys Pró
405 410 415
AGG AGČ TGG ACG TGG CCÁ GAG GGT CCA GAG CAG ACC CTC CAC TGC GAG 1356
Arg Ser Trp Thr Trp Pro Glu Gly Pro Glu Gin Thr LeU His Cys Glu
420 425 430
GCC CGT GGA AAC CCT GAG CCC TCC GTG CAC TGT GCA AGG CCT GAC GGŤ 1404
Ala Arg Gly Asn Pró Glu Pro Šer Val His Cys Ala Arg Pro Asp Gly
435 44 0 445
GGG GCG GTG CTA GCG CTG GGC CTG TTG GGT CCA GTG ACC CGT GCC CTC 1452
Gly Ala Val Leu Ala Leu Gly Leu Leu Gly Pro Val Thr Arg Ala Leu
450 455 460
GCG GGC ACT TAC CGA TGT ACA GCA ATC AAT GGG CAA GGC CAG GCG GTC 1500
Ala Gly Thr Tyr Arg CVs Thr Ala Ile Asn Gly Gin Gly Gin Ala Val
465 470 475 480
AAG GAT GTG ACC CTG ACT GTG GAA TÁT GCC CCA GCG CTG GAC: AGT GTA 1548
Lys Asp Val Thr Leu Thr Val G1U Tyr Ala Pro Ala Leu Asp Ser Val
485 490 495
GGC TGC CCA GAA CGT ATT ACT TGG CTG GAG GQG ACA GAG GCA TCG CIT 1596
Gly Cys Pro Glu Árg Ile Thr Trp Leu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu
ŠOO 505 510
AGC TGT GTG GCA CAC GGG GTC CCA CCA CCT AGC GTG AGC TGT GTG CGČ 1644
Ser Cys val Ala His Gly Val Pro Pro pro Ser Val Ser Cys Val Arg
515 520 525
TCT GGA AAG GAG GAA GTC ATG GAA GGG CCC CTG CGT GTG GCC CGG GAG 1692
Šer Gly Lys Glu Glu Val Hec Glu Gly Pro Leu Arg Val Ala Arg Glu
530 535 540
CAC GCT GGC ACT TAC CGA TGC GAA GCC ATC AAC GCC AGG GGA TCA GCG 1740
Hiš Ala Gly Thr Tyr Arg cys Glu Ala Ile Asn Ala Arg Gly Ser Ala
545 550 555 560
GCC AAA AAT GTG GCT GTC ACG GTG GAA TAT GGT CCC AGT ΤΓΤ GAG GAG 1788
Ala Lys Asn Val Ala Val Thr Val Glu Tyr Gly pro Ser Phe Glu Glu
565 570 575
TTG GGC TGC CCC AGC AAC: TGG ACT TGG GTA GAA GGA TCT GGA .AAA CTG 1836
Leu Gly Cys Pro Ser Asp Trp Thr Trp Val Glu Gly Ser Gly Lys Leu
580 585 590
rrr TCC TGT GAA GTT GAT GGG AÁG CCG GAA CCA CGC GTG GAG TGC GTG 1BB4
Phe Ser Cys Glu Val Asp Gly Lys Pro Glu Pro Arg Val Glu Cys Val
595 £00 €05
-32CZ 291974 B6
GGC TCG GAG GGT Gly GCA AGC GAA GGG GTA GTG TTG CCG GIG GTG TCC TCG 2932
Gly Ser Glu 610 Ala Ser Glu: 615 Gly Val Val Leu Pro Leu 620 Val Seř Ser
AAC TCT GGT TCC AGA AAC TCT ATG ACT CCT GGT AAC CTG TCA. CCG GGT 19'80
Asn Ser Gly Ser Arg Asn Ser Met Thr Pro Gly Asn Leu Ser Pro Gly
625 630 635 64 0
ATT TAC CTC TGC AAC GCC ACC AAC CGG CAT GGC TCC ACA GTC AAA ACA 2028
ile Tyr Leu Cys Aen Ala Thr Asn Arg His Gly Ser Thr val Lys Thr
645 650 655
GTC GTC GTG AGC GCG GAA. TCA CCG CCA CAG ATG GAT GAA TCC AGT TGC 2076
Val Val Val Sér Ala Glu Ser Pro Pro Gin Met Asp Glu Ser Ser Cys
660 665 670
CCG AGT GAC CAG ACA TGG CTG GAA GGA GCC GAG GCT ACT GCG CTG GČC 2124
Pro Ser His Gin Thr Trp. Leu Glu Gly Ala Glu Ala Thr Ala Leu Ala
675 68 0 685
TGC .AGT GCC AGA GGC CGC CCC TCT CCA CGC GTG CGC TGT TCC AGG GAA 2172
cys Ser Ala Arg Gly Arg Pro Sér Pro Arg Val Arg Cys Ser Arg Glu
690 695 700
GGT GCA GCC AGG CTG GAG AGG CTA CAG GTG TCC CGA GAG GAT GCG GGG 2220
Gly Ala Ala Arg Leu Glu Árg Leu Gin Val Ser Arg Glu Asp Ala Gly
705 710 715 720
ACC TAC CTG TGT GTG GCT ACC AAC GCG CAT GGC ACG GAT TCA CGG ACC 2268
Thr Tyr Leu cys Val Ala Thr Asn Ala His Gly Thr Asp Ser Arg Thr
725 730 735
GTC ACT GTG GGT GTG GAA TAC CGG CCT GTG GTG GCT GAG CTG GCA GCC 2316
Val Thr Val Gly Val Glu Tyr Arg Pro Val Val Ala G1U Leu Ala Ala
740 745 750
TCG CCC CCA AGC GTG CGG CCT GGC GGA •AAC TTC ACT CTG ACC TGC. CGT 2364
Ser Pro Pro Ser Val Arg Pro Gly Gly Asn Phe Thr Leu Thr Cys Arg
755 760 765
GCA GAG GCC TGG CCT CCA GCC: CAG ATC AGC TGG CGC GCG CCC CCG GGA 2412
Ala Glu Ala Trp Pro Pro Ala Gin Ile Ser Trp Arg Ala Pro Pro Gly
770 775 780
GCT CTC AAC CTC GGT CTC TCC AGC AAC AGC ACG CTG AGC GTG GČG 24 60
Ala Leu Asn Letí Gly Leu Ser Ser Asn Asn Ser Thr Leu Ser Val Ala
785 790 795 800
GGT GCC ATG GGC AGC CAT GGT GGC GAG TAT GAG TGC GCA GCC ACC AAT 2508
Gly Ala Met Gly Ser His Gly Gly Glu Tyr Glu Cys Ala Ala Thr Asn
805 810 815
GCG CAT GGG CGC CAC. GCA CGG CGC ATC ACG GTG CGC GTG GCC GGT CCA 2556
Ala His Gly Arg His Ala Arg Arg Ile Thr Val Arg Val Ala Gly Pro
820 825 830
TGG CTG TGG GTC GCT GTG GGC GGT GCG GCA GGG GGC GCG GCG CTG CTG .2604
Trp Leu Trp Val Ala Val Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu
835 840 845
-33CZ 291974 B6
GCC GCA GGG GCC GGC CTG GCC TTC TAC GTG CAG TCC ACC GCT TGC AAG 2652
Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Val Gin Ser Thr Ala Cys Lys
850 855 860
AAG GGA GAG TAC AAC GTC CAG GAG GCT GAG AGC TCA GGC GAG GCG GIG 2700
Lys Gly Glu Tyr Asn val Gin Glu Ala Glu Ser Ser Gly Glu Ala Val
845 870 875 880
TGT CTC AAT GGC GCG GGC GGG ACA CCG GGT GCA GAA GGC GGA GCA GAG 2748
Cys Leu Asn Gly Ala Gly Gly Thr Pro Gly Ala GlU Gly Gly Ala Glu
885 890 895
ACC CČC GGC ACT GCC GAG TCA CCT GCA GAT GGC GAG GTT TTC GCC ÁTC 2796
Thr Pro Gly Thr Ala G1U Ser Pro Ala Asp Gly Glu Val Phe Ala Ile
900 905 910
CAG CTG ACA TCT TCC TGAGCCTGTA TCCAGCTCCC CCAGGGGCCT CGAAAGCACA 2851
Gin Leu Thr Ser Ser
915
GGGGTGGACG ŤATGTATTGT TCACTCTCTA TTTATTCAAC TCCAGGGGCG TCGTCCCCGT 2911
ITTCTACCCA TTCCCTTAAT AAAGTTTTTA TAGGAGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2971
AAAAAAAAAA ΑΑΑΆΑΑΑ 2988 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) charakterizace sekvence:
(A) délka: 917 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2
Met Pro Gly Pro Ser Pro Gly Leu Arg Arg Thr Leu Leu Gly Leu Trp
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Leu Gly Ile Leu Gly Ile Ser Ala val Ala Leu Glu
20 25 30
Pro Phe Trp Ala Asp Leu Gin Pro Arg Vil Ala Leu Val Glu Arg Gly
35 40 45
Gly Ser Leu Trp Leu Asn Cys Ser Thr Asn Cys Pro Arg Pro Glu Arg
50 55 60
Gly Gly Leu Glu Thr Ser Leu Arg Arg Asn Gly Thr Gin Arg Gly Leu
65 70 75 80
Arg Trp Leu Ala Arg Gin Leu Val Asp Ile Arg Glu Pro Glu Thr Gin
85 90 95
Pro Val Cys Phe Phe Arg Cys Ala Arg Arg Thr Leu Gin Ala Arg Gly
100 105 110
Leu Ile Arg Thr Phe Gin Arg Pro Asp Arg Val Glu Leu Val Pro Leu
lis 120 125
Pro Pro Trp Gin Pro Val, Gly Glu Asn Phe Thr Leu Set Cy« Arg Val
130 13 s 140
-34CZ 291974 B6
Pro 145 Gly Ala Gly Pro Arg Ala ser Leu 150 Thr Leu 155 Thr Leu Leu Arg Gly 160
Gly Gin Glu Leu Ile Arg Arg Ser Phe Val Gly Glu Pro Pro Arg Ala
165 170 175
Arg Gly Ala Met Leu Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Arg Glu Asp His
180 185 190
Arg Ala Asn Phe Ser Cys Leu Ala Glu Leu Asp Leu Arg Přo His Gly
195 200 205
Leu Gly Leu Phe Ala. Asn Sér Ser Ala pro Arg Gin. Leu Arg Thr Phe
210 215 220
Ala Met Pro Pro Leu Ser Pro Ser Leu Ilé Ala Pro Arg Phe Leu Glu
225 230 235 240
val Gly ser Glu Arg Pro Val Thr Cys Thr Leu Asp Gly Leu Phe Pro
24 5 250 255
Ala Pro Glu Ala Gly Vál Tyt Leu Šer Leu Gly Asp Gin Arg Leu His
260 265 270
Pro Asn val Thr Leu Asp Gly Glu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Ala
275 280 285
Thr Ala Ser Glu Glu Gin Glu Gly Thr Lye Gin Leu Met Cys Ile Vál
290 295 300
Thr Leu Gly Gly Glu Ser Arg Glu Thr Gin Glu Asn Leu Thr Val Tyr
305 310 315 320
Šer Phe Pro Ala Pro Leu Leu Thr Leu Ser Glu pro Glu Ala Pro Glu
325 330 315
Gly Lys Met Val Thr Val §er Cys Trp Ala Gly Ala Arg Ala Leu Val
340 345 350
Thr Leu Glu Gly Ile Pro Ala Ala Val Pro Gly Glh Pro Ala Glu Leu
355 360 365
Gin Leu Asn Val Thr Lys Asn Asp Asp Lys Arg Gly Phe Phe Cys Asp
370 375 380
Ala Ala Leu AEp Vál Asp Gly Glu Thr Leu Arg Lys Asn Gin Ser Ser
385 390 395 400
Glu Leu Arg Vál Leu Tyr Ala Pro Arg Leu Asp Asp Leu Asp Cys Pro
405 410 415
Arg Sér Trp Thr Trp Pro Glu Gly Pro Glu Gin Thr Leu His cys Glu
420 425 430
Ala Arg Gly Asn Pro Glu Pro Ser Val His Cys Ala Arg Pro Asp, Gly
435 440 445
35CZ 291974 B6
Gly Ala Val Leu Ala Leu Gly Leu Leu Gly Pro Val Thr Arg Ala Leu
450 455 460
Ala Giy Thr Tyr Arg Cys Thr Ala Ile Asn Gly Gin Giy Gin Ala Val
465 470 475 480
Lys Asp Val Thr Leu Thr Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Asp Ser Val
4 65 490 495
Gly Cys Pro Glu Arg Xle Thr Trp Leu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu
500 505 510
Ser Cys Val Ala HÍS Gly Val Pro Pro Pro Ser Val Sér Cys Val Arg
515 520 525
Ser Gly Lys Glu Glu Val Met Glu Gly Pro Leu Arg Val Ala Arg Glu
530 535 540
His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Ala ne Asn Ala Arg Gly Sér Ala
545 550 555 560
Ala Lys Asn Val Ala Val Thr Val Glu Tyr Giy Pro Ser Phe Glu Glu
565 570 575
Leu Gly Cys Pro Ser Asn Thr Trp Val Glu Gly Ser Gly Lys Leu
580 5áš 590
Phe ser Cys Glu Val Asp Gly Lys Pro Glu Pro Arg Val Glu Čys Val
595 600 605
Gly Ser Glu Gly Ala Ser Glu Gly Val Val Leu Pro Leu Val Ser Ser
610 615 620
Asn Ser Gly Šer Árg Asn Ser Met Thr Pro Gly Asn Leu Ser Pro Gly
625 630 635 640
ile Tyr Leu Cys Asn Ala Thr Asn Arg His Gly Ser Thr Val Lys Thr
645 650 655
Val Val Val Ser Ala G1U Ser Pro Pro Gin Met Asp Glu Ser Ser Cys
660 665 670
Pro Ser His Gin Thr Trp Leu Glu Gly Ala Glu Ala Thr Ala Leu Ala
675 680 685
Cys Šer Ala Arg Gly Arg Pro Ser Pro Arg val Arg Cys Ser Arg Glu
690 695 700
Glý Ala Ala Arg Leu Glu Arg Leu Gin Val Ser Arg Glu Asp Ala Gly
7Q5 710 715 720
Thr Tyr Leu Cys Val Ala Thr Asn Ala His Gly Thr Asp Ser Arg Thr
725 730 735
Val Thr Val Gly val Glu Tyr Arg Pro Val Val Ala Glu Leu Ala Ala
740 745 750
Ser Pro Pro Sér Val Arg Pro Gly Gly ASh Phe Thr Léu Thr Cys Arg
755 760 765
-36CZ 291974 B6
Ala Glu Ala Trp Pro Pro Ala Gin Ile Sér Trp Arg Ala Pro Pro Gly
770 775 780
Ala Leu Asn Leu Gly Leu Ser Ser Asn Asn Ser Thr Leu Ser Val Ala
7BS 790 795 800
Gly Ala Het Gly Ser His Gly Gly Glu T/r G1U Cys Alá Ala Thr Asn
805 810 815
Ala His Gly Arg His Ala Arg Arg Ile Thr Val Arg Val Ala Gly Pro
830 825 830
Trp Leu Trp Val Ala Val Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu
835 840 845
Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Val Gin Ser Thr Ala Cys Lys
850 855 860
Lys Gly Glu Tyr Asn Val Gin Glu Ala Glu Ser Ser Gly Glu Ala Val
865 870 875 880
Cys Leu Asn Gly Ala Gly Gly Thr Pro Gly Ala 61u Gly Gly Ala Glu
805 890 895
Thr Pro Gly Thr Ala Glu Ser Pro Ala Asp Gly Glu Val Phe Ala Zlé
900 905 910
Gin Leu Thr Ser Ser
915 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 315 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomická) (ix) charakteristika:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1 ..315 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
CCG GAT CGG GTA GAG CTA GTG CCT CTG CCT CCT TGG CAG CCT GTA GGT 48
Pro Asp Arg Val Glu Leu Val Pro Leu Pro Pro Trp Gin Pro Val Gly
1 5 10 15
GAG AAC TTC ACC TTG AGC TGC AGG GTC CCG GGG GCA GGA CCC CGA GCG 96
Glu Asn Phe Thr Leu Ser Cys Arg Val Pro Glý Ala Gly Pro Arg Ala
20 25 30
AGC CTC ACA TTG ACC TTG CTG. CGA GGC GGA CAG GAG CTG ATT CGC CGA 144
Ser Leu Thr Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gly Gin Glu Leu Ile Arg Arg
35 40 45
AGT TTC GTA GGC GAG CCA CCC CGA GCT CGG TGT GCG ATG CTC ACC GCC 19.2
Ser Phe Val Gly Glu Pró Pro Arg Ala Arg cys Ala Hec Leu Ihr Ala
50 55 60
-37CZ 291974 B6
ACG GTC CTG GCG CGC AGA: GAG GAT CAC AGG GAC AAT TTC TCA TGC CTC 240
Thr Val Leu Ala Arg Arg Glu Asp His Arg Asp Asn Phe Šer Cys Leu
65 70 75 80
GCG GAG CTT GAC CTG CGG ACA CÁC GGC TTG GGA CTG TTT GCA AAC AGC 288
Ala Glu Leu Asp Leu Arg Thr His Gly Leu Gly Leu Phe Ala Asn Ser
es só 55
TCA GCC CCC AGA CAG CTC CGC ACG ΤΤΓ 315
Šer Ala Pro Arg Gin Leu Arg Thr Phe
100 105
(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 1781 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 16..1659 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
CAGCTCTCTG TCAGA ATG GCC ACC ATG GTA Met Ala Thr Met Val 1 5
CCA TCC GTG TTG TGG CCC AGG Pro Ser Val Leu Trp Pro Arg 10
GCC TGC TGG ACT CTG CTG GTC Leu Val TGC TGT CTG CTG ACC CCA GGT GTC CAG 99
Ala Cys Ttp 15 Thr Leu cye 20 Cys Leu Leu Thr Pro 2Š Gly Val Gin
GGG CAG GAG TTC CTT TTG CGG GTG GAG CCC CAG AÁC CCT GTG CTC TCT 147
Glý Gin Glu Phe Leu Leu Arg Val Glu Pro Gin Asn Pro val Leu Ser
30 35 40
GCT GGA GGG TCC CTG TTT GTG AAC TGC AGT ACT GAT TGT CCC AGC TCT 195
Ala Gly Gly Ser Leu Phe Val Afin Cys Ser Thr Asp Cys Pro ser Ser
45 50 55 60
GAG AAA ATC GCC TTG GAG ACG TCC CTA TCA AAG GAG CTG GTG GCC AGT 243
Glu Lys Ile Ala Leu Glu Thr Ser Leu Ser Lvs Glu Leu Val Ala Ser
65 70 75
GGC ATG GGC TGG GCA GCC TTC AAT CTC AGC AAC GTG ACT GGC AAC AGT 291
Gly Met Gly Trp Ala Ala Phe Asn Leu Ser Asn Val Thr Gly Asn Ser
80 85 30
CGG ATC CTC TGC TCA GTG TAC TGC AAT GGC TCC CAG ATA ACA GGC TCC 339
Arg Ile Leu Cys Ser Val Tyr Cys Asn Gly Ser Gin Ile Thr Gly Ser
95 100 105
TCT AAC ATC ACC GTG TAC GGG CTC CCG GAG CGT GTG GAG. CTG GCA CCC 387
Ser Asn Ile Thr Val Tyr Gly Leu Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro
110 115 120
CTG CCT CCT TGG CAG CCG GTG GGC CAG AAC TTC ACC CTG CGC TGC CAA 435
Leu Pro Pro Trp Gin Pro Val Gly Gin Asn Phe Ťhr Leu Arg Cys Gin
125 130 135 140
-38CZ 291974 B6
GTG Val GAG GGT Glú Gly GGG Gly TCG CCC CGG ACC AGC CTC Ser Leu 150 ACG Thr GTG Val GTG Val CTG CTT Leú Leu 155 CGČ Arg 483
Ser Pro 145 Arg Thr
TGG GAG GAG GAG CTG AGC CGG CAG CCC GCA. GTG GAG GAG CCA GCG GAG 531
Trp Glu Glu Glu 160 Leu Ser Arg Gin Pro 165 Ala Val Glu G1U Pro 170 Ala Glu
GTC ACT GCC AČT GTG CTG GCC AGC AGA GAC GAC CAC GGA GCC CCT TTC 579
Val Thr Ala 175 Thr Val Leu Ala Ser 180 Arg Asp Asp His Gly 185 Ala Pro Phe
TCA TGC CGC ACA GÁA CTG GAC ATG CAG CCC CAG GGG CTG GGA CTG TTC 627
Ser Cys 190 Arg Thr Glu Leu Asd. Met 195 Gin Pro Gin Gly 200 Leu Gly Leu Phe
GTG AAČ ACC TCA GCC CCC CGC CAG CTC CGA ACC TTT GTC CTG CCC GTG 675
Val 205 Asn Thr Ser Ala Pro 210 Arg Gin Leu Arg' Thr 215 Phe Val Leu Pro Val 220
ACC ČČC CCG CGC CTC GTG GCC CCC CGG TTC TTG GAG GTG GAA ACG TCG 723
Thr Pro Pro Arg Leu 225 Val Ala Pro Arg Phe 230 Leu Glu Val Glu Thr 235 Ser
TGG CCG GTG GAC TGC ACC CTA GAC GGG CTT TTT CCA GCC TCA GAG GCC 771
Trp Pro Val Asp 240 Cys Thr Leú Asp Gly 245 Leú Phe Pro Álá Ser 250 Glu Ala
CAG GTC TAC CTG GCG CTG GGG GAC CAG ATG CTG AAT GCG ACA GTC ATG 819
Gin val Tyr 255 Leu Ala Leu Gly Asp 260 Gin Met Leu Asn Ala 265 Thr Val Met
AAC CAC GGG GAC ACG CTA ACG GCC ACA GCC ACA GCC ACG GCG CGC GCG 867
Asn His 270 Gly Asp Thr Leu Thr Ala 275 Thr Ala Thr Ala 280 Thr Ala Arg Ala
GAT CAG GAG GGT GCC CGG GAG ATC GTC TGC AAC GTG ACC CTA GGG GGC 915
Asp 285 Gin Glu Gly Ala Arg 290 Glu Ile Val Cys Asii 295 Val Thr Leu Gly Gly 300
GAG AGA CGG GAG GCC CGG GAG AAC TTG ACG GTC TTT AGC TTC CTA GGA 963
Glu Arg Arg Glu Ala Arg 305 Glu Asn Leu Thr 310 Val Phe Ser Phe Leu 315 Gly
CCC ATT GTG AAC ctc AGC GAG CCC ACC GCC CAT GAG GGG TCC ACA GTG 1011
Pro Ile Val Asn 320 .Leu Ser Glu Pro Thr 325 Ala His Glu Gly Ser 330 Thr Val
ACC GTG AGT TGC ATG: GCT GGG GCT CGA GTC CAG GTC ACG CTG GAC GGA 1059
Thr Val Ser 335 Cys Met Ala Gly Ala 34 0 Arg Val Gin Val Thr 345 Leu Asp Gly
GTT CCG GČC GCG GCC CCG GGG CAG ACA GCT CAA CTT CAG CTA AAT GCT 1107
Val Pro 350 Ala Ala Ala Pro Gly Gin 355 Thr Ala Gin Léu 360 Gin Leu Asn Ala
ACC GAG AGT GAC GAC GGA CGC AGC TTC TTC TGC AGT GCC ACT CTC GAG 1155
Thr 365 Glu Sér Asp Asp Gly 370 Arg .Ser Phe Phe cys 375 Sér Ala Thr Leu G1U 380
GTG GAC GGC GAG TTC TTG CAC AGG AAC AGT AGC GTC CAG CTG CGA GTC. 1203.
Val Asp Gly Glu Phe 385 Leu His Arg Asn Ser 390 Ser val Gin Leu Arg Val 395
-39CZ 291974 B6
CTG Leu TAT Tyr GGT Gly CCC AAA Pro Lys 400 ATT GAG Zle Ásp CGA Arg GCC Ala 405 ACA Thr TGC Cys CCC CAG Pro Gin CAC TTG AAA 1251
His 410 Léu Lys
TGG AAA GAT AAA ÁCG AGA ČAC GTC CTG CAG TGC CAA GCC AGG GGC AAC 1299
Trp Lys Asp Lys Thr Arg His Val Leu Gin Cys Gin Ala Arg Gly Asn
415 420 425
CCG TÁC CCC GAG CTG CGG TGT TTG AAG GAA GGC TCC AGC CGG GAG GTG 1347
Pro Tyr Pro Glu Leu Arg Cys Leu Lys Glu Gly Sér Ser Arg Glu Val
430 435 440
CCG GTG GGG ÁTC CCG TTC TTC GTC AÁC GTA ACA CAT ÁÁT GGT ACT TAT 1395
Pro Val Gly Zle PxO Phe Phe val Asn Val Thr His Asn Gly Thť Tyr
445 450 455 460
CAG TGC CAA GGG TCC AGC TCA CGA GGC AAA TAC ACC CTG GTC GTG GTG 1443
Gin Cys Gin Ala Ser Ser Sér Arg Gly Lys Tyr Thr Leu Val val Val
465 470 475
ATG GAC ATT GAG GCT GGG AGC TCC ČAC TTT GTC CCC GTC TTC GTG GCG 1491
Met ASP Zle Glu Ala Gly Ser Ser His Phe Val Pro Val Phe Val Ala
480 465 490
GTG TTA CTG ACC CTG GGC GTG GTG ACT ATC GTA CTG GCC TTÁ ATG TAC 1539
Val Leu Leu Thr Leu Gly Val Val Thr Zlé Val Leu Ala Leu Met Tyr
495 500 505
GTC TTC AGG GAG ČAC ČAA CGG AGC GG C AGT TAC CAT CIT AGG GAG GAG 1587
Val Phe Arg Glu His Gin Arg Ser Gly Ser Tyr His Val Arg Glu Glu
510 515 520
AGC ACC TAT CTG CCC CTC ÁCG TCT ATG CAG CCG ACA GAA GCA ATG GGG 1635
Ser Thr Tyr Leu Pro Leu Thr Ser Met Gin Pro Thr Glu Ala Met Gly
525 530 535 540
GAA GAA CCG TCC AGA GCT GAG TGACGCTGGG ATCCGGGATC AAAGTTGGCG1686
Glu Glu Pro Ser Arg Ala Glu
545
GGGGCTTGGC TGTGCCCTCA GATTCCGCAC CAATAAAGCC TTCAAACTCC CAAAAAAAAA:174.6
AAAAAAAAÁA AAAAAAÁAÁA AAAÁAAAAAA ΑΛΑΛΑ1781 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 4900 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomická) (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
CCGAACGČTC CTCGGCCTCT GGTCTNCTCT GGNCCTGGGG ATCCTAGGCA TCTCAGGTAA60
GAAGAGCCCG CCCGTGGAGC KAGGTGGÁTA AGGCGGGGGC GGAATTGAAG GACCAGAGAG120
GGCGGCCCGG GTGTCCCCCT CCAGGCTCCG CCCTCTTCTA GCTTCCCACG CTTCTGTCAC180
CACCTGGAGN TCGGGGCTTC TCCCCGTCCT TCCTCCACCC CAACACACCT CAATCTTTCA240
-40CZ 291974 B6
GANCTGAACC CAGCACCTTT TCTGGANTNG GGGNNTTGCA CCTAACCTGT CTCAGGAGAN JO O ACTGTGGGTC TCCTGTCCTC TCCTGCTCTG TNATGCCCTA TGGTTCACAG ACTGGCATCA 360 TCCCTATTCA TGATCCTCAA AGACNCCATC TCCTCAACTG TCA1AACTCA GAGCTCTATT 420 CCCCCTCCAC CTGGAGCCCT GGAAACCGGC TTTCTAGGGC TTTTCTCCGC GGTTCTTTCC 480 CGGAGTTCAG CGTTGTGGCT ΤΤΠΌΤΟΟΆΑ GTTACTGAAG TTTGGGGACA ÁTCTCCTTTA 540 AGCCTTTGAC TCAGTCTCAT TTCCACTTTG CTTTTGCCCC AAGCCTCTGT GTCTCTCCCC 600 CATTTCCTGA CGATCTGTCA GAGTCTTAAG AGTGATTTGG TTCCCCATCC CCCCTCCAAC 660 TGGAGTCTCC TCCTCACTAT TGATGTGTGC ATCTGAGACC CCCATCCCCG CACCGAGTTT 720 CCCGATCTCr GTCAGTAAAG AGCAAGGCTT CCAGAGACAA CCCTCTAATA GCGCGTCAGT 780 CCCGAATCTT GAGTGGGATG CGGGACTCCC GTGCTATTTC TTGGCGGAGG TCTTTCCTGG 840 TqCTTATGGA CACCCCTGGT TTGGGATATG GGGGCCGCTA AGATTTCAGA GATGGGGTCC 900 CTAGGCTGAG NCCGCGTTTT CCCGGGCAGC GGTCGCGCTA GAÁCCTTTCT GGGCGGACCT 960 TCAGCCCCGC GTGGCGČTCG TGGAGCGCGG GGGCTCGCTG TGGCTCAACT GCAGCACTAA 1020 CTGTCCGAGG CCGGAGCGCG GTGGCCTGGA GACCTCGCTA CGCCGAAACG GGACCCAGAG 1080 GGGTCTGNAC TGNCTGGCTC GACAGCTGGT GGACATCCGA GANCCTGAAA CCCAGCCGGT 1140 CTGCTTCTTC CNCTGCGCGC GCCGCACACT CCAAGCGCGT GGGCTCATCC GAACTTTCCG 1200 TGAGTTCAGG GTGGGCÁCNC CCCTTGGGTC TCTGGACCTC CCCCTCAAGC TCCTCCCACC 1260 CGCCCTCTGA TCCTCCTGCT TGTTCTGAAA GTACTACAGC TGGCTAGAfiC GGAGTTTTTG 1320 GTCCCTTGCA GAGCGACCGG ATCGGGTAGA GCTAGTGCCT CTGCČTCCTT GGCAGCCTGT 1380 AGGTGAGAAC TTCACCTTGA GCTGCAGGGT CCCGGGGGCA GGACCCCGAG CGAGCCTCAC 1440 ATTGACCTTG CTGCGAGGCG GCCAGGAGCT GATTCGCCGA AGTTTCGTAG GCGAGCCACC 1500 CCGAGCTCGG GGTGCGATGC TCACCGCCAC GGTCCTGGCG CGCAGAGAGG ATCACAGGGC 1560 CAATTTCTCA TGCCTCGCGG AGCTTGACCT GGGNCCACAC GGCTTGGGAC IVITáGCANA 1620 CAGCTCAGCC CCCAGACAGC TCCGCACGTT TGGTGAGTGT GGACCCTAAC TGACAGATTT 1680 TAAGAAGTTT AGGGCAGCCA GGCGTGGTGG CATGGTGTČG TAGGCCCTAA GTCCCAGCCC 1740 AAGCAGANCT AAGNCGGATC TCTTGTGAAT TAAAAGTCTA GCTCGTCTAC ATAACGAGGN 1800 CTGCATAGTT AAATCCCCCA AAAGTCTAAG CAGC7AGCCC TTACTTCCAA CACAAGTACT 1860 AGCTTAÁGTA CTTT.CTCCTG TGAGCTTTTT CdTTATG.TA TTTACTCGTT GAGAGAAAAA 192 0 GAGAGTGTGT GTÁCGTGCCT TTATGCACAT GCCGCAGTGC TTGTATGGAA GTTAÁAGAAT 1980 AAGGAGGCGT TCTGCCCTTC CATCCTGTGG GTCCTAGGGG TGGTATTAGC TCCTCAGGCT 2Q4P TTGTTAGTNA CAAGCGCCTA GGCITGGGGA GCCATCTCGC CCGCTCCTCT GTATCTTTAG 2100 GGTGAAACCA GACAATGCAT GCAAATTGGT TGATCAACAC TGAATGTTTA GTTCGTAAAT 2160
-41 CZ 291974 B6 tcaagctctg ttctttgtct tcctcagcca TGCCTCCACT TTCCCCCGAG CCTTATTGCC 222 0 CCACGATTCT TAGAAGTGGG CTCAGAAAGG CCGGTGACKT GCACTTTGGA TGGACTGTTT 22 B0 CCTGCCCCAG AAGCCGGGGT TTACTTCTCT CTGGGAGATC AGAGGCTTCA TCCTAATGTG 2340 ACCCTCGACG GGGAGAGCCT TGTGGCCACT GCCACAGCTA CAGOAAGTGA AGAACAGGAA 2400 GGCACCAAAC AGCTGATGTG CATCGTGACC CTCGGGGGCG AAAGCAGGGA GACCCAGGAA 2460 AACCTGACTG TCTACAGTAA GGGGAATCCA ACAAGACCTT CAATAGCTCA GACTGGGGCT 2520 GGGGGTGGGT CTGGGTCTGG ggccagagtc TCACAAAGGC GGAGCCTATA AAGTGGGCGG 25ao GACCTCCACA CCAGAACAAG CCGGGCGGGA GAGTTCQAGG GCAGGAGCAG ATAGAAGTTG ,2640 GAAATTAATA GATTGGGTTG AGTTCCCTGA GTGGGGAGTG AACCCCACCC AATTCTCTGT 2700 CCCCAGGCTT CCCGGCTCCT CTTCTGACTT TAAGTGAGCC AGAAGCCCCC GAGGGAAAGA 2760 TGGTGACCGT AAGCTGCTGG GCAGGGGCCC GAGCCCTTGT CACCTTGGAG GGAATTCCAA 2820 GGACCCTCTT ACCGGCCCCA TCTTTAACČT TATCGTATCC CCTCTGCCTC ATGCCCGCAG 2880 ACGCACCTCG GCTGGATGAC TTGGACTGTC CCAGGAGCTG GACGTGGCCA GAGGGTCCAG 2940 AGCAGACCCT CCACTGCGAG GCCCGTGGAA ACCCTGAGCC CTCCGTGCAC TGTGCAAGGC 3000 CTGACGGTGG GGCGGTGCTA GCGCTGGGCC TGTTGGCTCC AGTGACCCGT GCCCTCGCGG 3060 GCACITACCG ATGTACAGCA ATCAATGGGC AAGGCCAGGC GGTCAAGGAT GTGACCCTGA 3120 CTGTGGAATG TGAGTAGGGG GAGGTGGGCA TGCTTATCCC TTTAAGGTCA CGGAGTGTAC 3180 TGGGAGACTG GCTÁTACGGA AAGGAAAGAA GCCTAGGTTC AGCAGGGATT GGGAAAACAC 3240 TGAAGGAAAG TGGTGTGGTG TTTACAAACT TAACGGTGGT AACTGGGCAC GGTCTGGCAA 3300 AAACAGACAG CCAAGAGAGT GTGCCTGGGA AGC7GCAATG GGGGCTTTGT GGGAATTGGT 3360 CAACAGCACC CTGAGATCTC AGGAAAGGGG CCTGAAGTTA TCTCCAGAAC CCATGTGAAG 3420 GCAGGAAGAG AGAACGCCCA CCTTTTCCTG CTCCCCCCAA CCCCCCCCCA CATATCACAC 3480 GGAGTATATA AATAAATAAA ATGGCTCCTG CCGGAGGGAG TGAGAAGCTG TCTCCTGCAG 3540 GGTCAGÁGCA GTGGTAGTGC ATCCCTTTAA TCCCAGCACT CGGTAGGCAA AGGCAGGCAG 3600 ATCTCTGTGA ATGTGGGGCC AGCCTGGTCT GTACAGAGAA ATCCTGTCTC AAAACAAACC 3660 AGCAAAGAAA CAAAACCAAA ATCAATTCCA GATGCČČCAG CGCTGGACAG TGTAGGCTGC 3720 CCANGACGTA TTACTTGNCT GGAGGGGACA GAGGCATCGC TTAGCTGTGT GGCACACGGG 3780 GTCCCACCAC CTAGCGTGAS CTGTGTGCGC TCTGGAAAGG AGGAAGTCAT GGAAGGGCCC 3840 CTGCGTGTGG CCCGGGAGCA CGCTGGCACT TACCGATGCG AAGCCATCAA CGCCAGGGGA 3900 TCAGCGGNCA ÁAAATGTGGC TGTCACGGTG GAATGTGAGT AGGGGTGGCT ACGGAAATGT 3960 CCACACCTGC GTCCTCTGTC CTCAGTGTGA ACTCCTATTT CCCTGCTTCC TAGATGGTCC 4020 CAGTTNTGAG GAGTTGGGCT GCCCCAGCAA CTGGACTTGG GTAGAAGGAT CTGGAAAACT 4080
-42CZ 291974 B6
GTTTTCCTGT GAAGTTGATG GGAAGCCGGA TGCAAGCGAA GGGGTAGTGT TGCCCCTGGT GACTCCTGGT AACCTGTCAC CGGGTATTTA CACAGTGAAA ACAGTČGŤCG TGAGCGCGGA TACCGGGTGT CCCAGGATCT TTTCTTTCCC AGCACCGCCA CAGATGGATG AATCCAGTTG CGAGGCTACT GCGCTGGCCT GCAGTGACAG CAGGGAAGGT GCAGCCAGGC TGGAGAGGCT CCTGTGTGTG GCTACCAACG CGCATGGCAC ATGTGAGTGA GGACAGCGCT GAATGAAGAC CCTGGGATGT ATGATCCAGT GGGTAGAGTG TATTCCTAAT ACTCTTTAAT TTTANCCTTT GGGATAACCT GCTCTCTGTC TAGGACAGCT CCCAAGATTG NATAGCAACC CTCTGGCTCC
ACCACGCGTG GAGTGCGTGG GCTCGGAGGG GTCCTCGAAC TCTGGTTCCA GAAACTCTAT CCTCTGCAAC GCCACCAACC GGCATGGCTC ATGTGAGCAG GGGCCCAGGT GGGCGGAGAG TGATGCCCCT CCTTATGGTG GCTGATCTGC CCCGAGTCAC CAGACATGGC TGGAAGGAGC GGGNCGCCCC TCTCCACGCG TGCGCTGTTC acaggtctcc CGAGAGGATG CGGGGACCTA GGATTCACGG ACCGTCACTG TGGGTGTGGA GACTCAGACČ GCCAGAAAAG TGCCTŤGAGG CTCAATTAGC ACTCACTAAA ATGTÁTATTČ GGGAGGCAGA GACAGGCÁGA TCTCTGTTCC TGGTCTACAG AGGGGNTACA GGCCCCCCCT CTGTCTCTCT
4140
4200
4260
4320
4380
4440 .4500
4560
4820
4680
4740
4800
4860
4900 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 1295 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
NGAATTCCGG CGGATCGGGT AGAGCTAGTG
AACTTCACCT TGAGCTGCAG GGTCCCGGGG
TTGCTGCGAG GCGGCCAGGA GCTGATTCGC
CGGGGTGCGA TGCTCACCGC CACGGTCCTG
TCATGCCTCG CGGAGCTTGA CCTGCGGCCA
GCCCCCAGAC AGCTCCGCAC GTTTGCCATG
CGATTCTTAG AAGTGGGCTC AGAAAGGCCG
GCCCCAGAAG CCGGGGTTTA CCXCSCTCTG
CTCGACGGGG AGAGCCT7GT GGCCACTGCC
ACCAAACAGC TGATGTGCAT CGTGACCCTC
CTGACTGTCT ACAGCTTCCČ GGCTCCTCTT
GGAAAGATGG TGACCGTAAG CTGCTGGGCA
CCTCTGCCTC CTTGGCAGCC ŤGTAGGTGAG 60 GCAGGACCCC GAGCGACCCT CACATTGACC 120 CGAAGTFTCG TAGGCGAGCČ ACCCCGAGCT 180 GCGCGCAGAG AGGATCACAG GGCCAATTTC 240 CACGGCTTGG GACTGTIŤGC AÁACÁGČTCA 300 CCTCCACTTT CCCCGAGCCT TATTGCCCCA 360 GTCACTTGCA CTTTGGATGG ACTGTTTCCT 420 GGAGATÚAGA GGCTTCATCC TAAŤGTGACC 480 ACAGCTACAG CAAGTGAAGA ACAGGAAGGC 540 GGGGGCGAAA GCAGGGAGAC CCAGGAAAAC 600 CTGACmAA GTOAGCCAGA AGCCCCCGAG 660 GGGGCCCGAG CCCTTGTCAC CTTGGAGGGA 720
-43CZ 291974 B6
ATTCCAAGGA CCCTCTTACC GGCCCCATCT CCCGCAGACG ČACCTCGGCT GGATGACTTG GGTCCAGAGC AGACCCTCCA CTGCGAGGCC GCAAGGCCTG ACGGTGGGGC GGTGCTAGCG CTCGCGGGCA CTTACCGATG TACAGCAATC ACCCTGACTG TGGAATATGC CCCAGCGCTG TGGCTGGAGG GGACAGAGGC ATCGCTTAGC GTGAGCTGTG TGCGCTCTGG AAAGGAGGAA GAGCACGCTG GCACTTACCG ATGCGAAGCC GTGGCTGTCA CGGTGGAATA TGGTCCCCGG
TTAACCTTAT CGTATCCCCT CTGCCTCATG Gačtgtccca ggagctggac gtggccagag CGTGGAAACC CTGAGCCCTG CGTGCACTGT CTGGGCCTGT tgggtccagt gacccgtgcc AATGGGCAAG GCCAGGCGGT CAAGGATGTG GACAGTGTAG GCTGCCCAGA ACGTATTACT TGTGTGGCAC ACGGGGTCCC ACCACCTAGC GTCATGGAAG GGCCCCTGCG TTTTGGCCGG ATCAACGCCA GGGGATCAGC GGCCAAAAAT AATTC
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1295 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 2214 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
CGAATCTTGA GTGGGATGCG GGACTCCCGT GCTA7TTCTT GGCGGAGGTC TTTCCTGGTC CTTATGGACA CCCCTGGTXT GGGATATGGG GGCCGCÍAAG ÁTTTCAGAGA TGGGGTCCCT AGGCTGAGCC CGCGTITrCC CGGGCAGCGG TCGCGCTAGA ÁCCTTTCTGG GCGGACCTTC AGCCCCGCGT GGCGCTCGTG GAGCGCGGGG GCTCGCTGTG GCTCAACTGC AGCACTAACT GTCCGAGGCC GGAGCGCGGT GGYCTGGAGA CCTCGCTACG CCGAAACGGG ACCCAGAGGG GTCTGCGCTG GCTGGCTCGA ÓÁGMTGGTGG ACATCCGÁGA GCCTGAAACC CAGTCGGTCT GCTTCTTCCG CTGGGCGČGČ CGCACACTCC AAGNGAGTGG GCTCATCCGA ACTTTCCAGC GACCGGATCG GGTAGAGCTA GTGCCTCTGlí CTCCTTGGCA GCCTGTAGGT GAGAACTTCA CCTTGAGCTG CAGGGTCCCG GGGGCAGGAC CCCGAGCGAG CCTCACATTG ACCTTGCTGC GAGGCGGCCA ggagctgatt cgccgaagtt tcgtaggcga gccaccccga GCTCGGGGTG CGATGCTCAC CGCCACGGTC CTGGCGCGCA GAGAGGATCA CAGGGCCAAT TTCTCATGCC TCGCGGAGCT TGACCTGCGG ÁCACACGGCT TGGGACTGTT TGOAAACAGC TCAGCCCCCA GACAGCTCCG CACGTTTGGC ATOCCTCCAC TTTCCCCGAG CCTTATTGNC CCACGATTCT TAGAAGTGGG CTCAGAAAGG CCGGTGACTT GCACTTTOGA TGGACTGTTT CCTGCCCCAG AAGCCGGGGT TTACCTCTCT CTGGGAGATC AGAGGCTTCA TCCTAATGTG ACCCTČGACG GGGAGAGCCT TGŤGGCCACT GNCACAGMTA CAGCAAGTGA AGAACAGGAA GGCACCAAAC
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
0
900
960
-44CZ 291974 B6
AGCTGATGTG CATCGTGACC
CTCGGGGGČG
AAAGCAGGGA GACCCAGGAA AACCTGAČTG
1020
TCTACAGCTT CCCGGCTCCT
CTTGTGACTT
TAAGTGAGCC
AGAAGCCCCC GAGGGAAAGA
1080
TGGTGACCGT AAGCTGCTGG
GCAGGGGCCC
GAGCCCTTGT
CACCTTGGAG GGAATTCCAG
1140
CTGCGGTCCC TGGGCAGCCC
GCTGAGCTCC
AGTTAAATGT
CACAAAGAAT GACGACAAGC
1200
GGGGCTTCTT CTGCGACGCT
GČCCTCGATG TGGACGGGGA AACTCTGAGA AAGAACCAGA
1260
GČŤCTGÁGCT
TACGCACCTC GGCTGGATGA CTTGGACTGT CCCAGGAGCT
1320
GGACGTGGCC AGAGGGTCCA GAGCAGACCC TCCACTGCGA GGCCCGTGGA AACCCTGAGC
1380
CCTCCGTGCA CTGTGCAAGG CCTGACGCTG GGGCGGTGCT
AGCGCTGGGC CTGTTGGGTC
1440
CAGTGACCCG TGCCCTCGCG GGAACTTACC GATGTACAGC
AATCAATGGG CAAGGCCAGG
1500
CGGTCAAGGA TGTGACCCTG ACTGTGGAAT ATGCCCCAGC
GCTGGACAGT
GTAGGCTGCC
1560
CAGAACGTAT TACTTGGCTG GaGGGGACAG aggcatcgct
TAGCTGTGTG
GGACACGGGG
1520
TCCCACCACC TAGCGTGAGC TGTGTGCGCT CTGGAAAGGA
GGAAGTCATG
GAAGGGCCCC
16B0
TGCGTGTGGC CCGGGAGCAC GCTGGCACTT ACCGATGCGA agccatcaac
GNCAGGGGAT
1740
CAGCGGWCAA AAATGTGGCT GTCACGGTGG AATATGGTCC
CAGTTTGGAG GAGTTGGGCT
1800
GCCCCAGYAA CTGGACTTGG
GTAGAAGGAT
CTGGAAAACT
GTT7TCCTGT GAAGTTGATG
1860
GGAAGCCGGA ACCACGCGTG
GAGTGCG7GG
GCTCGGAGGG
TGCAAGCGAA GGGGTAGTGT
1920
TGCCCCTGGT GTCCTCGAAC
TCTGGTTCCA
GAAACTCTAT
GACTCCTGGT AACCTGTCAC
1980
CGGGTATTTA
CCTCTGCAAC
GCCACCAACC
GGMATGGNTC
CACAGTCAAA
ACAGTCGTCG
2040
TGAGCGCGGA
ATCACCGCCA
CAGATGGATG
AATCCAGTTG
CCCGAGTCAC
CAGACATGGN
2100 tggaaggagc
CGAGGNTACT gcgctggcct gcagtgccag aggncgcccc
7CTCCACGCG
2160
ŤGCGcTGTre
CAGGGAAGGT GCAGMCAGGC
TGGAGAGGNT ACAGGTGTCC
CGAG
2214 (2) Informace pro SEQ DD NO: 8:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 5077 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (genomická) (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
CGGAACGCTC CTCGGCCTCT GGTCXNCTCT GAAGAGCCCG CCCGTGGAGC NAGGTGGATA GGCGGCCCGG GTGTCCCCCT CCAGGCTCCG CACCTGGAGN TCGGGGCTTC TCCCCGTCCT GANCTGAACC CAGCACCTTT TCTGGANTNG
GGNCCTGGGG ATCCTAGGCA TCTCAGGTAA 60 AGGCGGGGGC GGAATTGAAG GACCAGAGAG 120 CCCTCTTCTA GCTTCCCACG CTTCTGTCAC 180 TCCTCCACCC CAACACACCT CAATCTTTCA 24 0
GGGNNTTGCA CCTAACCTGT CTCAGGAGAN 300
-45CZ 291974 B6
ACTGTGGCTC TCCTGTCCTC TCCTGCTCTG TNATGCCCTA TGGTTGACAG ACTGGCATCA 360 TCCCTATTCA TGATCCTCAA AGACNCCATC TCCTCAACTG TCATAACTCA GAGCTCTATT 420 CCCCCTCCAC CTGGAGCCCTC-GAAACCGGC TTTCTAGGGC TTTTCTCCGC GGTTCTTTCC 480 CGGAGTTCAG CGTTGTGGCT TTTTGTCCAA GTTACTCAAG TTTGGGGACA ATCTCCTTTA 540 AGCCTTTGAC TCAGTCTCAT TTCCACTTTG CTTTTGCCCC AAGCCTCTGT GTCTCTCCCC 600 CATTTCCTGA CGATCTGTCA GAGTCTTAAG AGTGATTTGG TTCCCCATCC CCCCTCCAAC 660 TGGAGTCTCC TCCTCACTAT TGATGTGTGC ATCTGAGACC CCCATCCCCG CACCGAGTTT 720 CCCCATCTCT GTCAGTAAAG AGCAAGGCTT CCAGAGACAA CCCTCTAATA GCGCGTCAGT 780 CCCGAATCTT GAGTGGGATG CGGGACTCCC GTGCTATTTC TTGGCGGAGG TCTTTCCTGG 840 TCCTTATGGA CACCCCTGGT TTGGGATATG GGGGCCGCTA AGATTTCAGA GATGGGGTCC 900 CTAGGCTGAG NCCGCGTTTT CCCGGGCAGC GGTCGCGCTA GAACCTTTCT GGGCGGACCT 960 TCAGCCCCGC GTGGCGCTCG TGGACCGCGG GGGCTCGCTG TGGCTCAACT GCAGCACTAA 1020 CTGTCCGAGG CCGGAGCGCG GTGGCCTGGA GACCTCGCTA CGCCGAAACG GGACCCAGAG 1080 GGGTCTGNAC TGNCTGGCTC GACAGCTGGT GGACATCCGA GANCCTGAAA GCGAGCCGGT 1140 CTGCTTCTTC CNCTGCGCGC GCCGCACACT CCAAGCGCGT GGGCTCATCC GAACTTTCCG 1200 TGAGTTCAGG GTGGGCACNC CCCTTGGGTC TCTGGACCTC CCCCTCAAGC TCCTCCCACC 1260 CGCCCTCTGA TCCTCCTGCT TGTTCTGAAA GTACTACAGC TGGCTAGAGC GGAGTTTTTG 1320. GTCCCTTGCA GAGCGACCGG ATCGGGTAGÁ GCTAGTGCCT CTGCCTCCTT GGCAGCCTGT 1380 AGGTGAGAAC TTCACCTTGA GCTGCAGGGT CCCGGGGGCA GGACCCCGAG CGAGCCTCAC 1440 ATTGACCTTG CTGCGAGGCG GCCAGGAGCT GATTCGCCGA AGTTTCGTAG GCGAGCCACC 1500 CCGAGCTCGG GGTGCGATGC TCACCGCCAC GGTCCTGGCG CGCAGAGAGG ATCACAGGGC 1560 CAATTTCTCA TGCCTCGCGG ÁGCTTGACCT GCGKCCACAC GGCTTGGGAC TGTTTGCANA 1620 CAGCTCAGCC CCCAGACAGC TCCGCACGTT TGGTGAGTGT GGACCCTAAC TGACAGATTT 1680 TAAGAAGTTT AGGGCAGCCA GGCGTGGTGG CATGGTGTCG TAGGCCCTAA G7CCCAGCCC 1740 AAGCAGANCT AAGNCGGÁŤC TCTTGTGAAT TAAAAGTCTA GCTCGTCTAC ATAACGAGGN .1800 CTGCATAGTT AAATCCCCGA AAAGTCTAAG CAGCTAGCCC TTACTTCCAA CACAAGTACT .1860 AGCTTAAGTA CTTTCTCCTG TGAGCTTITT CCTTTATGTA TTTACTCGTT GAGAGAAAAA 1920 GAGAGTGTGT GTACGTGCCT TTATGCACAT GCCGCXGTGC TTGTATGGAA GTTAAAGAÁT 1980 AAGGAGGCGT TCTGCCCTTC CATCCTGTGG GTCČTÁGGGG TGGTATTAGC TCCTGAGGCT 2040. TTGTTAGTNA CAAGCGCCTA GGCTTŠGGGA GCCÁŤCTCGČ ČCGCTCCTCT GTATCTTTAG 2100 GGTGAAACCA GACAATGCAT GCAAATTGGT TGATCAACAC TGAATGTTTA GTTCGTAAAT 2160 TCAAGCTCTG TTCTTTGTCT ŤCCTCAGCCA TGCCTCCACT TTCCCCCGAG CCTTAtTGCC 2220
-46CZ 291974 B6
CCACGATTCT TAGAAGTGGG GTCAGAAAGG CCGGTGACKT GČÁCTTTGGA TGGACTGTTT 2280 CCTGCCCCAG AAGCCGGGGT TTACTTCTCT CTGGGAGAŤC ÁGAGGCTTCA TCČTÁAŤGTG 2340 ACCCTCGACG GGGAGAGCCT TGTGGCCACT GCCACAGCTA CAGCAAGTGA AGAACAGGAA 24 00 GGCACCAAAC AGCTGATGTG CATCGTGACC CTCGGGGGCG AAAGCAGGGA GACCCAGGAA 2460 AACCTGACTG TCTACAGTAA ggggaatcca acaagacctt gaatagctca GACTGGGGCT 2520 GGGGCTGGGT CTGGGTCTGG GGCCAGAGTČ TCÁČAAAGGC GGAGCCTÁTA AAGTGGGCGG 2580 GACCTCCACA CCAGAACAAG CCGGGCGGGA GAG1TCCÁGG GCAGGAGCAG ATAGAAGTTG 264 0 GAAATTAATA GATTGGGTTG AGTTCCCTGA GTGGGGAGTG AACCCCACCC AATTCTCTGT 2700 CCCCAGGCTT CCCGGCTCCT CTTďGACTT TAAGTGAGCC AGAAGCCCCC GÁGGGAAAGA 2760 TGGTGACCGT AAGCTGCTGG GCAGGGGCCC GÁGCCCTTGT CACCTTGGAG GGAATTCCAG 2620 CTGCGGTCCC TGGGCAGČCC GCTGAGCTCC AGTTAAATGT CACAAAGAAT GACGACAAGC 2880 GGGGCTTCTT CTGCGACGCT GCCCTCGATG TGGACGGGGA AACTCTGAGA AAGAACCAGA 2940 GCTCTGAGCT TCGTGTTCTG TGTGAGTGGA TGTTCACTTT ATCTCTGTGA ATTCCAAGGA 3000 CCCTCTTAČC GGCCCCATCT TTAACCTTAT CGTATČCCCT CTGCCTCATG CCČGČAGACG 3060 CACCTCGGCT GGATGACTTG GACTGTCCCA GGAGCTGGAC GTGGCCAGAG GGTCCAGAGC 3120 AGACCCTCCA CTGCGA.GGCC CGTGGAAACC CTGAGCCCTC CGTGCACTGŤ GCAAGGCCTG 3.180 ACGGTGGGGC GGTGCTAGČG CTGGGCCTGT TGGGTCČAGT GACCCGTGCC CTCGCGGGCA 3240 CTTACCGATG TACAGCAATC AATGGGCAAG. GCCAGGCGGT CAAGGATGTG ACCCTGACTG 3300 TGGAATGTGA GTAGGGGGAG GTGGGCATGC TTATCCCTTT AAGGTCACGG AGTGTACTGG 3360 GAGACTGGCT ATACGGAAAG GAAAGAAGCC TAGGTTCAGC AGGGATTGGG ARAACACTGA 3426 AGGAAAGTGG TGTGGTGTTT ACAAACTTAA CGGTGGTAAC TGGGCACGGT ČTGGCAÁAAA 3480 CAGACAGCCA AGAGAGTGTG CCTGGGAAGC TGCAATGGGG GCTITGTGGG AÁTTGGTCAA 3540 CAGČAČCCTG AGATČTCAGG ÁAAGGGGCCT GAAGTTATCT CCAGAACCCÁ TGTGAAGGCA .360.0 GGAAGAGAGA ACGCCCACCT TTTCCTGCTC CCCCCAACCC CCCCCCACAT ATCACACGGA 3660 GTATATAAAT AAATAAAATG GCTCCTGCCG GAGGGAGTGA GAAGCTGTCT CCTGCAGGCT 3720: CAGAGCAGTG GTAGTGCATG CCTTTAÁTCe CAGCACTCGG TAGGCAAAGG CAGGCAGATC .3780 TCTGTGAATG TGGGGCCAGC CTGGTCTGTA CAGAGAAATC CTGTCTCAAA ACASACCAGC 3840 ÁAAGAAACAA AACCAAAATC AATTCCAGAT GCCCCAGOGC TGGACAGTGT AGGCTGCCCA 3900 SGAČGTATTA CTTGNCTGGA GGGGACAGAG GCATCGCTTA GCTGTGTGGC ACACGGGGTC 3960 CCACCACCTA GCGTGAGCTG TGTGCGCTCT GGAAAGGAGG AAGTCATGGA AGGGCCCČTG 4020 CGTGTGGCCC GGGAGCACGC TGGCAČ7TAC CGATGCGAAG CCATCAACGC CAGGGGATCA 4080 GCGGNCAAAA ATGTGGCTGT CACGGTOGAA TGTGAGTAGG GGTGGCTACG GAAATGTCCA 4140
47CZ 291974 B6
CACCTGCGTC CTCTGTCCTC TTNTGAGGAG TTGGGCTGCC TTCCTGTGAA GTTGATGGGA AAGCGAAGGG GTAGTGTTGG TCCTGGTAÁC CTGTCACCGG AGTCAAAACA GTCGTCGTGA CGGGTGTCCC AGGATCTTTT ACCGCCACAG ATGGATGAAT GGCTACTGCG CTGGCCTGCÁ GGAAGGTGCA GCOAGGCTGG GTGTGTGGCT ACCAACGCGC TGAGTGAGGA CAGCGCTGAA GGGATGTATG ATCCAGTGGG TCCTAATACT εΤΤΤΑΑΤΓΓΤ ATAACCTGCT CTCTGTCTAG AAGATTGNAT AGCAACCCTC
AGTGTGAACT CCTATTTCCC CCAGCAACTG GACTTGGGTA AGCCGGAACC ACGCGTGGAG CCCTGGTGTC CTCGAACTCT GTATTTACCT CTGCAACGCC GCGCGGAATG TGAGCAGGGG CTTTCCCTGA TGCCCCTCCT CCAGTICCCC GAGTCACCAG GTGACAGGGG NCGCCCCTCT agaggctaca ggtgtcccgá ATGGCACGGA TTCACGGACC TGAAGACGAC TCAGACCGCC TAGAGTGCTC AATTAGCACT ANCCrrTGGG AGGCAGAGAC GACAGCTTGG TCTACAGAGG TGGCTCCCTG TCTCTCT
TGCTTCCTAG ATGGTCCCAG GAAGGATCTG GAAAACTGTT TGCGTGGGCT CGGAGGGTGC GGTTCCAGAA ACTCTATGAC ACCAACCGGC ATGGCTCCAC CCCAGGTGGG CGGAGAGTAC TATGGTGGCT GATCTGCAGC ACATGGCTGG AAGGAGCCGA CCACGCGTGC GCTGTTCCAG GAGGATGCGG GGAČCTACCT GTOACTGTGG GTGTGGAATG AGAAAAGTGC CTTGAGGCCT CACTAAAATG TATATTCTAT AGGCÁGATCT CTGTTCCGGG GGNTACAGGC CCCCCCTCCC
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4740
4800
860
4920
4980
5040
5077 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 1472 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
CGGATCGGGT AGAGGTAGTO
NGAATTCCGG
AACTTCACCT TGAGCTGCAG GGTCCCGGGG TTGCTGCGAG GCGGCCAGGA GCTGA2TCGC CGGGGTGCGA TGCTCACCGC CACGGTCCTG TCATGCCTCG CGGAGCTTGA CCTGCGGCCÁ GCCCCCAGAC AGCTCCGCAC GTTTGCCATG CGATTCTTAG AAGTGGGCTC AGAAAGGCCG GCCCCAGAAG CCGGGGTTTA CCTCTCTCTG CTCGACGGGG AGAGCCTTGT GGCCACTGCC ACCAAAOAGC TGATGTGCAT CGTGACCCTC
CJTOGCMSCC TGTAGGTCAG
GCAGGACCCC GAGCGAGCCT CACATTGACC CGAAGTTTCG TAGGCGAGCC ACCCCGAGCT gcgcgcagag aggatcacag ggccaatttc CACGGCTTGG GACTGTTTGC AAACAGCTCA CCTCCACITT CCCCGAGCCT TATTGCCCCA GTGACTTGCA CTTTGGATGG ACTGTTTCCT GGAGATCAGA GGCTTCATCC TAATGTGACC ACAGCTACAG CAAGTGAAGA ACAGGAAGGC GGGGGCGAAA GCAGGGAGAC CCAGGAAAAC £0
120
180
240
300
360
420
480
540
600
-48CZ 291974 B6
CTGACTGTCT ACAGCTTCCC GGCTCCTCTT ggaaagatgg tgaccgtaag ctgctgggca ATTCCAGCTG CGGTCCCTGG GCAGCCCGCT GACAAGCGGG GCTTCTTCTG CGACGCTGCC AACCAGAGCT CTGAGCTTCG TGTTCTGTGT CCAAGGACCC TCTTACCGGC CCCATCTTTA GCAGACGCAC CTCGGCTGGA TGACTTGGAC CCAGAGCAGA CCCTCCACTG CGAGGCCCGT AGGCCTGACG GTGGGGCGGT GCTAGCGCTG GCGGGCACTT ACCGATGTAC AGCAATCAAT CTGACTGTGG AATATGCCCC AGCGCTGGAC CTGGAGGGGA CAGAGGCATC GCTTAGCTGT AGCTGTGTGC GCTCTGGAAA GGAGGAAGTC CACGCTGGCA CTTACCGATG CGAAGCCATC GCTGTCACGG TGGAATATGG TCCCCGGAAT ctgactttaa gtgagccaga agcccccgag GGGGCCCGAG CCCTTGTCAC CTTGGAGGGA GAGCTCCAGT TAAATGTCAC AAAGAATGAC CTCGATGTGG ACGGGGAAAC TCTGAGAAAG GAGTGGÁTGT TQACTTTATC TCTGTGAATT ACCTTATCGT ATCCCCTCTG CCTCATGCCC TGTCCCAGGA GCTGGACGTG GCCAGAGGGT GGAAACCCTG AGCCCTCCGT GCACTGTGCA GGCCTGTTGG GTCCAGTGAC CCGTGCCCTC GGGCAAGGCC AGGCGGTCAA GGATGTGACC AGTGTAGGCT GCCCAGAACG TATTACTTGG. GTGGCACACG GGGTCCCACC ACCTAGCGTG ATGGAAGGGC CCCTGCGTTT TGGCCGGGAG AACGCCAGGG GATCAGCGGC CAAAAATGTG 7C
660
720
780
840
900
960 1020 1060 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1472 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 2550 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
CCTCTGCCTC CTTGGCAGCC TGTAGGTGAG GCAGGACCCC GAGCGAGCCT CACATTGACC CGAAGTTTCG TAGGCGAGCC ACCCCGAGCT GCGCGCAGAG AGGATCACAG GGCCAATTTC CACGGCTTGG GACTGTTTGC AAACAGCTCA cctccacttt ccccgagcct tattgcccca GTGACTTGCA CTTTGGATGG AETGTTTCCT GGAGATCAGA ggcttcatcc taatgtgacc ACAGCTACAG CAAGTGAAGA ACASGÁAGGC gggggcgaaa gcagggagac ccaggaaaac CTGACTTTAA GTGAGCCAGA AGCCCCCGAG
AAC7TCACCT TGAGCTGCAG GGTCCCGGGG 60 TTGCTGCGAG GCGGCCAGGA GCTGATTCGC 120 CGGGGTGCGA TGCTCACCGC CACGGTCCTG 180 TCATGCCTCG CGGAGCTTGA CCTGCGGCCA 240 GCCCCCAGAC AGCTCCGCAC GTTtGCCATG 300 CGATTCTTAG AAGTGGGCTC AGAAAGGČCG 360 GCCCCAGAAG CCGGGGTTTA CCTCTCTCTG 420 ČTCGACGGGG AGAGCCŤTGT GGCCACTGCC 4 B 0 ACCAAACAGC TGATGTGCAT CGTGÁCCCTC 540 CTGACTGTCT ACAGCTTCCC GGCTCCTCTT 600 GGAAAGATGG TGACCGTAAG CTGCTGGGCA 660
-49CZ 291974 B6
GGGGCCCGAG CCCTTGTCAC CTTGGAGGGA ATTCCAGCTG CGGTCCCTGG GCAGCCCGCT 720 GAGCTCCAGT TAAATGTCÁČ AAAGAATGAC GACAAGCGGG; GCTTČTTCTG. CGACGCTGCC 760 CTCGATGTGG ACGGGGAAáČ TCTGAGAAAG AACCAGAGCT CTGAGCTTCG TGTTCTGTAC 840 GCACCTCGGC TGGAtGACTT GGACTGTCCC AGGAGCTGGA CGTGGCCAGA GGGTCCAGAG 300 CAGACCCTCC ACTGCGAGGC CCGTGGAAAC CCTGAGCCCT CCGTGCACTG TGCAAGGCCT 960 GACGGTGGGG CGGTGCTAGC GČTGGGCCŤG TTGGGTCCÁG TGAČCCGTGC CCTCGCGGGC 1020 ACTTACCGAT GTAČAGGAAT CAATGGGCAA GGCCAGGGGG TCAAGGATGT GACCCTGACT 1080 GTGGAATATG CCCCAGCGCT GGACAGTGTA GGCTGCCCSG AACGTATTAC TTGGCTOGAG 1140 GGGACAGAGG CATCGCTTAG CTGTGTGGCA CACGGGGTCC CACCACCTAG CGTGAGCTGT 1200 GTGCGCTCTG GAAAOGAGGA AGTCATGGAA GGGCCCCTGC GTGTGGCCCG GGAGČACGCT 1260 GGCACTTACC GATGCGAAGC CATCAACGCC AGGGGATCÁG CGGCCAAAAA TGTGGCTGTC 1320 ACGGTGGAAT ATGGTCCCAG TTTTGAGGAG TTGGGCTGCC CCAGOAACTG GACTTGGGTA 1380 GAAGGATCTG GAAAACTGTT TTCCTGTGAA GTTGATGGGA AGCCGGAACC ACGCGTGGAG 1440 TGCGTGGGCT CGGAGGGTGC AAGCGAAGGG GTAGTGTTGC CCCTGGTGTC CTCGAACTCT 1500 GGTTCCAGAA ACTCTATGAC TCCTGGŤAAC CTGTCACCGG: GTATCTACCT CTGCAACGCC 1560 ACCAACCGGC ATGGCTCCAC AGTCAAAACA GTCGTCGTGA GCGCGGAATC ACCGCCACAG 1620 ATGGATGAAT CCAGTTGCCC GAGTCACCAG ACATGGCTGG AAGGAGCCGA GGCTACTGCG 1680 CTGGCCTGCA GTGCCAGAGG CCGCCCCTCT CCACGCGTGC GCTGTTCCAG GGAAGGTGCA 1740 GCCAGGCTGG AGAGGGTACA GGTGTCCCGA GAGGATGCGG GGACCTACCT GTGTGTGGCT 1800 ACCAACGCGC ATGGCACGGA TTCACGGACC GTCACTGTGG GTGTGGÁATA CCGGCCTGTG 1860 GTGGCTGAGC TGGCAGCCTČ GCCCCCAAGC GTGCGGCCTG GCGGAAACTT CACTCTGACC 1920 TGCCGTGCAG AGGCCTGGCC TCCAGCCCAG ATCAGCTGGC GCGCGCCCCC GGGAGCTCTC 1980 AACCTCGGTC TCTCCAGCAA CAACAGCACG CTGAGCGTGG CGGGTGCCAT GGGCAGCCAT 2040 GGTGGCGAGT ATGAGTGCGC AGCCACCAAT GCGCATGGGC GCČAGGCAGG GCGCATCAČG 2100 GTGCGČGTGG CCGGTCCATG GCTGTGGGTC GCTGTGGGCG GTGCGGCAGG GGGCGCGGCG 2160 CTGCTGGCCG CAGGGGCCGG CCTGGCCTTC TACGTGČAGT CCACCGCTTG CAAGAAGGGA 2220 GAGTACAACG TCCAGGAGGC TGAGAGGTCA GGCGÁGGCGG TGTGTCTCAA TGGCGČGGGC 2280 GGGACACCGG GTGCAGAAGG CGGAGCAGAG ACCCCCGGCA CTGCCGAGTC ACCTGCAGAT 2340 GGCGAGGTTT TCGCCATCCA GCTGACATCT TCCTGAGCCT GTATCCAGCT CCCCCAGGGG 24 00 CCTCGAAAGC ÁČAGGGGTGG ACGTATGTAŤ TGTTCACTCT CTATTTATTC AACTCCAGGG 2460 GCGTCGTCCC CGUTTCTAC CCATTCCCTT AATAAAGTTT TTATAGGAGA ΑΑΑΑΑΑΆΆΑΑ 2520 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2550
-50CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 222 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
AATTCGATCA CTCGCGCTCC CCTCGCCTTC TGCGCTCTCC CCTCCCTGGC AGCGGCGGCa 60 ATGČCGGGGC CTTGACCAGG GCTGCGCCGA ACGCTCCTCG GCCTCTGGGC TGCCCTGGGC 120 CTGGGGÁTČC TAGGCA.TCTC AGČGGTCGCG CTAGAACCTT TCTGGGCGGA CC7TCAGCCC 180 CGCGTGGCGC TCGTGGAGCG CGGGGGCTCG CTGTGGCTCA AC 222 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 292 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
TGTGGAGCTG GCACCCCTGC CTCGZTGGCA GCČGGTGGGC ČAGAACTTČA CCČTGCGCTG 60 CCAAGTGGAG GGTGGGTCGC CCCGGACCAG CCTCACGGTG GTGCTGCTTC GCTGGGAGGA 120 GGAGCTGAGC CGGCAGCCGG GAGTGGAGGA GCCAGCGGAG GTCACTGCCA CTGTGCTGGC 180 CAGCAGAGAC GACCACGGAG CCCCTTTCTC ATGCCGCACA GAACTGGACA TGCAGCCCCA 24 0 GGGGCTGGGA CTGTTCGTGA ACACCTCAGC CCCCCGCCAG CTCCGAACCV ΤΓ 232 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 105 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein
-51 CZ 291974 B6 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Pro Asp Arg Val Clu Leu val Pro Leu Pro Pro Trp Gin Pro Val Gly
5 10 15
Glu Asn Phe Thr Leu Ser Cys Arg Val Pro Gly Ala Gly Pro Arg Ala
25 30
Ser Leu Thr Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gly Gin Glu Leu IIe Arg Arg 35 40 45
Sér Phe Val Gly Glu Pro Pro Arg Ala Arg Cys Ala Her Leu Thr Ala
50 55 60
Thr Val Leu Ala Arg Arg Glu Asp His Arg Asp Asn Phe Šer Cys Leu
65 70 75 80
Ala Glu Leu Asp Leu Arg Thr His Gly Leu Gly Leu Phe Ala Asn Ser
85 90 95
Ser Ala Pro Arg Gin Leu Arg Thr Phe
100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 27 párů bází ίο (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
GAACTCGAGG CCATGCCTCC ACTTTCC (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 30 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
CCATAAGCTT TATTCCACCG TGACAGCCAC
-52CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
AACGTGCCGGA GCTGTCTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
ACGGAATTCG AAGCCATCAA CGCCAAGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
CATGAATTCC GAATCTTGAG TGGGATG (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý
-53CZ 291974 B6 (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
ATAGAATTCC TCGGGACACC TGTAGCC (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
CARGGTGACA AGGGCTCG (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
TATGAATTCA GTTGAGCCAC AGCGAGC (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 22 :
CCGGGTCCTA GAGGTGGACA CGCA
-54CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
TGCAGTCT CCTGGCTCTG GTTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 24:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 992 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
-55CZ 291974 B6
GCGAAAACCG GGAGACCCGG GAGAACGTGA CCCTGAGCGA ACCCAGCCTC TCCGAGGGGC CCCAAGCTCT GGTCACACTG GAGGGAGTTC TTCÁGCTÁÁA TGCCACCGAG AACGACGACA ATGTGGACGG GGAGACCCTG ATCAAGAACA CCCGGCTAGA CGATTCGGAC TGCCCCAGGA CGCTGCGCTG CGAGGCCCGC GGGAACCCAG GCGGGGCCGT GCTGGCTCTG GGCCTGCTGG ACCGCTGCAA GGCGGCCAAT GATGAAGGCG agtacgcacc agcgctggac AGCGTGGGCT CAGAAGCCTC GCTGAGCTGT GTGGCGCACG gctctggaga actcggggcc gtcatcgagg gcacttaccg ctgcgaagcc accaaccctc
CCATCTACAG CTTCCCGGCA CCACTCCTGA 60 agatggtgac AGTAACCTGC GCAGCTGGGG 120 CAGCCGCGGT CCCGGGGCAG CCCGCCCAGC 180 GACGCAGCTT CTTCTGCGAC GCCACCCTCG 240 GGAGČGCRGA GCTTCGTGTC CTATACGCTC 300 GTTGGACGTG GCCCGAGGGC CCAGAGCAGA 360 AACCCTCAGT GCACTGTGCG ČGCTCCGACG 420 GTCSSGTCAC TCGGGCGCTC TCAGGCACTT 480 AGGCGGTCAA GGACGTAACG CTAACGGTGG $40 GCCCAGAACG CATTACTTGG CTGGAGGGAA 600 GGGTACCGCC GCCTGATGTG ATCTGCGTGC 660 GGC7G7TGCG TGTGGCCCGG GAGCATGCGG 720 GGGGCTCTGC GGCCAAAAAT GTGGCCGŤCA 780
CGGŤGGAATA TGGCCCCAGG TTTGAGGAGC CGAGCTGCCC CAGCAATTGG ACATGGGTGG AAGGATCTGG GCGCCTGTTT TCCTGTGAGG TCGATGGGÁÁ GCCÁCAGCCÁ AGCGTGAAGT GCGTGGGCTC CGGGGGCACC ACTGAGGGGG TGCTGCTGCC GCTGGCÁČCC CCAGACCCTA GTCÓÓAGAGC TČCCAGAATC CCTAGAGTCC TG
840
900
960
992 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 2775 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA
-56CZ 291974 B6 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
GCAGCCTCG GTGGCGTTCG TGGAGCGCGG GGGCTCGCTG TGGCTGAATT GGAGCACCAA 60
CTGCCCTCGG CCGGAGCGCG GTCGCCTGGA GACCTCGCTG CGCCGAAACG GGACCCAGAG120
GGGTTTGCGT TGGTTGGCGC GGCAGCTGGT GGACATTCGC GAGCCGGAGA CTCAGCCCGT160
CTGCTTCTTC CGCTGCGCGC GGCGCACACT ACAGGCGCGT GGGCTCATTC GCACTTTCCA240
GCGACCAGAT CGCGTAGAGC TGATGCCGCT GCCTCCCTGG CAGCCGGTGG GCGAGAACTT300'
CRCGCTGAGC TGTAGGGTCC CCGGCGCCGG GCCCCGTGCG AGCCTCACGC TGACCCTGCT360
GCGGGGCGCC CAGGAGCTGA TCČGCCGCAG CTTCGCCGGT GAACCACCCC GAGCGCGGGG420
CGCGGTGCTC ACAGCCACGG TACTGGCTCG GAGGGAGGAC CATGGAGCCA ATTTCTCGTG480
TCGCGCCGAG CTGGACCTGC GGCCGCACGG ACTGGGACTG TTTGAAAACA GCTCGGCCCC540
CAGAGAGCTC CGAACCITCT CCCTGTCTCC GGATGCCCCG CGCCTCGCTG CTCCCCGGCT600
CTTGGAAGTT GGCTCGGAAA GGCCCGTGAG CTGCACTCTG GACGGACTGT TTCCAGCCTC660
AGAGGCCAGG GTCTACCTCG CACTGGGGGA CCAGAATCTG AGTCCTGATG TCACCCTCGA720
AGGGGACGCA TTCGTGGCCA CTGCCACAGC CACAGCTAGC GCAGAGCAGG AGGGTGCCAG780
GCAGCTGGTC TGCAACGTCA CCCTGGGGGG CGAAAACCGG GAGACČCGGG AGAACGTGAC840
CATCTACAGC TTCCCGGCAC CACTCCTGAC CCTGAGCGAA CCCAGCGTCT CCGAGGGGCA900
GATGGTGACA GTAACCTGCG CAGCTGGGGC CÓWfiCTCTG GTCACACTGG AGGGAGTTCC960
AGCCGCGGTC CCGGGGCAGC CCGCCCAGCT TCAGCTAAAT GCCACCGAGA ACGACGACAG1C20
ACGCAGCTTC TTCTGCGACG CCACCCTCGA TGTGGACGGG GAfiACCCTGA TCAAGAACAG10e0
GAGCGCAGAG CTTCGTGTCC TATACGCTCC CČGGCTAGAC GATTCGGACT GCCCCAGGAG1140
TTGGACGTGG CCCGAGGGCC CAGAGCAGAC GCTGCGCTGC GAGGCCCGCG GGAAČCCAGA1200
ACCCTCAGTG CACTGTGCGC GCTCCGACGG CGGGGCCGTG CTGGCTCTGG GCCTGCTGGG1260
TČCAGTCACT CGGGCGCTCT CAGGCACTTA CCGCTGCAAG GCGGCCAATG ATCAAGGCGA1320
GGCGGTCAAG GACGTAACGC TAACGGTGGA GTACGCACCA GCGCTGGÁCA GCG7GGGCTG1380
CCCAGAACGC ATTACTTGGC TGGAGGGAAC AGAAGCCTCG CTGAGCTGTG TGGCGCACGG1440
GGTACCGCCG CCTGATGTGA TCTGCGTGCG CTCTGGAGAA CTCGGGGCCG TCATCGAGGG1500
GCTGTTGCGT GTGGCCCGGG AGCATGCGGG CACTTACCGC TGCGAAGCCA CCAACCCTCG15 60
GGGCTCTGCG GCCAAAAATG TGGCCGTCAC GGTGGAATAT GGCCCCAGGT TTGAGGAGCC1620
GAGCTGCCCC AGCAATTGGA CATGGGTGGA AGGATCTGGG. CGCCTGTTTT CCTGTGAGGT1680
CGATGGGAAG CCAČAGCCAA GCGTGAÁGTG CGTGGGCTCC GGGGGCACČA CTGAGGGGGT1740
GCTGCTGCCG CTGGCACCCC CAGACCCTAG TCCCAGAGCT CCCAGAATCC CTAGAGTCCT1800.
GGCACCCGGT ATCTACGTCT GCAACGCCAC CAACCGCCAC. GGCTCCGTGG CCAAAACAGT1860
CGTCGTGAGC GCGGAGTCGC CACCGGAGAT GGATGAATCT ACCTGCCCAA GTCACCAGAC19 20
GTGGCTGGAA GGGGCTGAGG CTTCCGCGCT GGCCTGČGCC GCCCGGGGTC GCCCTTCCCC1980
-57CZ 291974 B6
AGGAGTGCGC TGCTCTCGGG AAGGCATCCC
GGACGČGGGC ACTTACCACT GTGTGGCCAC
CACTGTGGGC GTGGAATACC GGCCAGTGGT
CGTGCGCCCA GGAGGAAACT TCACGTTGAC
GATCAGCTGG CGCGCGCCCC CGAQGGCCCT
ACTGAGCGTG GCAGGCGCCA TGGGAAGCCA
CGCGCACGGG CGCCACGCGC GGCGCATCAC
CGCCGTGGGC GGCGCGGCGG GGGGCGCGGC
CTACGŤGCAG TCCACCGCCT GCAAGAAGGG
AGGCGAGGCC GTGTGTCTGA ACGGAGCGGG
GGGCGGACCC GAGGCGGCGG GGGGCGCGGC
CATACAGCTG ACATCGGCGT GAGCCCGCTC
CTCACACGGG GGCTTATTTA TTGCTTTATT
ACTCCAAGGG AATTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 1557 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
ATGGCCTGAG CAGCAGCGCG TGTCCCGAGA 2040
CAATGCGCAT GGCACGGACT CCCGGACCGT2100
GGCCGAACTT GCTGCCTCGC CCCCTGGAGG2160
CTGCCGCGCG GAGGCCTGGC CTCCAGCCCA2220
CAACATCGGC CTGTCGAGCA ACAACAGCAC2280
CGGCGGCGAG TACGAGTGCG CACGCACCAA2340
GGTGCGCGTG GCCGGTCCGT GGCTATGGGT2400
GCŤGCTGGCC GCGGGGGCCG GCCTGGCCTT2460
CGAGTACAAC GTGCAGGAGG CCGAGAGCTC2520
CGGCGGCGCT GGCGGGGCGG CAGGCGCGGA2580
CGAGTCGCCG GCGGAGGGCG AGGTCTTCGC2640
CCCTCICCGC GGGCCGGGAC GCCCCCCAGA2700
TATrTACTTA TTCATTTATT TATGTATTCA2760
2775
CGCGCTCTCC TCGCCTCCTG TGCTTTCCCC GCCGCGGCGA TGCCAGGGCC TTCGCCAGGG
CTGCGCCGGG CGCTACTCGG
GCGGTCTCGC
GGGGGCTCGC
GAGACCTCGC
GTGGACATTC
CTACAGGCGC
CTGCCTCCCT
AGGAGCCCTT
TGTGGCTGAA
TGCGCCGAAA
GCGAGCCGGA
GTGGGÚTCAT
G3CAGCCGGT
GGGCCCCGTG CGAGCCTCAC
AGCTTCGCCG GTGAACCACC
CCTCTGGGCT
CTGGGCGGAC
TTGCAGCACC
CGGGACCCAG
GACTCAGCCC tcgcactttc
GGGCGAGAAC
GCTGACCCTG
GCTCTGGGCC TGGGGCTCTT CGGCCTCTCA
CTGCAGCCTC GCGTGGCGTT CGTGGAGCGi
AACTGCCCTC GGCCGGAGCG
AGGGG7TIGC GTTGGTTGGC
GTCTGCTTCT TCCGCTGCGC
CAGCGACCAG
TTCACCCTGA
CTGCGGGGCG
120 isó
ATCGCGTAGA
GCTGTAGGGT
CGGTGGCCTG
GCGGCAGCTG
GCGGCGCACA
GCTGATGCCG
CCCCGGCGCC
CCCAGGAGCT GATCCGCCGC
CCGAGCGCGG GGCGCGGTGC TCACAGCCAC GGTACTGGCT
240
300
360
420
480
540
600
-58CZ 291974 B6
CGGAGGGAGG ACCATGGAGC GGACTGGGAC TGTŤTGAAAA CCGGATGCCC CGCGCCTCGC AGCTGCACTC TGGACGGACT GACCAGAATC TGAGTCCTGA GCCACAGCTA GCGCAGAGCA GGCGAAAACC GGGAGACCCG ACCCTGAGCG AACCCAGCCT GCCCAAGCTC TGGTCAČAČT CTTCAGCTAA ATGCCACCGA GATGTGGACG GGGAGACCCT CCCCGGCTAG ACGATTCGGA ACGCTGCGCT GCGAGGCCCG GGCGGGGCCG TGCTGGCTCT ŤACCGCTGCA AGGCGGCCAA GAGTACGCAC CAGCGCTGGA
CAATTTCTCG TGTCGCGCCG CAGCTCGGCC CCCAGAGAGC TGCTCCCCGG CTCTTGGAAG GTTTCCAGCC TCAGAGGCCA TGTCACCCTC GAAGGGGACG GGAGGGTGCC AGGCAGCTGG GGAGAACGTG ACCATCTACA CTCCGAGGGG CAGATGGTGA GGAGGGAGTŤ CCAGCCGCGG GAACGACGAC AGACCCACCT GATCAAGAAC AGGAGCGCAG CTGCCCCAGG AGTTGGACGT CGGGAACCCA GAACCCTCAG GGGCCTGCTG GGTCCAGTCA TGATCAAGGC GAGGCGGTCA CAGCGTGGGC TGCCCAGAAC
AGCTGGACCT GCGGCCGCAC TCCGAACCTT CTCCCTGTCT TTGGCTCGGA AAGGCCCGTG GGGTCTACCT CGCACTGGGG CATTCGTGGC CACTGCCACA TCTGCAACGT CACCCTGGGG GCTTCCCGGC ACCACTCCTG CAGTAACCTG CGCAGCTGGG TCCCGGGGCA GCCCGCCCAG TCTTCTGCGA CGCCACCCTC AGCTTCGTGT CCTATACGCT GGCCCGAGGG CCCAGAGCAG TGCACTGTGC GCGCTCCGAC CTCGGGCGCT CTCAGGCACT AGGACGTAAC GCTAACGGTG GCATTACTTG GCTGGAG
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1557 (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 2927 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomická) (ix) charakteristika:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 40..2814 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
CGCGCTCTCC TCGCCTCCTG TGCTTTCCCC GČCGCGGCG ATG CCA GGG CCT TCG Met Pro Gly Pro Ser 1 5
CCA GGG CTG CGC CGG GCG CTA CTC GGC CTC TGG GCT GCT CTG GGC CTG
Pro Gly Leu Arg Arg Ala Leu Leu Gly Leu Trp Ala Ala Leu Gly Leu
15 20
GGG CTC TTC GGC CTC TCA GCG GTC TCG CAG GAG CCC TTC TGG GCG GAC
Gly Leu Phe Gly Leu Ser Ala Val Ser Gin Glu Pro Phe Trp Ala Asp
30 JS
102
150
-59CZ 291974 B6
CTG Leu CAG Gin CCT Pro 40 CGC Arg GTG Val GCG Ala TTC Phe GTG GAG CGC Arg GGG Gly GGC Gly TCG Ser SQ CTG Leu TGG Trp CTG Leu 198
Val 45 Glu
AAT TGC AGC ACC AAC TGC CCT CGG CCG GAG CGC GGT GGC CTG GAG ACC 246
Asn Cys Ser Thr Asn Cys Pro Arg Pro G1U Arg Gly Gly Léu G1U Thr
55 60 65
TCG CTG CGC CGA AAC GGG ACC CÁG AGG GGT TTG CGT TGG TTG GCG CGG 254
Ser Leu Arg Arg Asn Gly Thř Gin Arg. Gly Leů Arg Trp Leu Ala Arg
70 75 80 65
CAG CTG GTG GAC ATT CGC GAG CCG GAG ACT CAG CCC GTC TGC TTC TTC 342
Gin Leu val Asp Ile Arg Glu Pro Glu Thr Gin Pro Val Cys phe Phe
90 95 100
CGC TGC GCG CGG CGC ACA CTA CAG GCG CGT GGG crč ATT CGC ACT ttc 390
Arg Cys Ala Arg Arg Thr Leu Gin Ala Arg Gly Leu Ile Arg Thr 1?he
105 110 115
CAG CGA CCA GAT CGC GTA GAG CTG ATG ccg CTG CCT CCC TGG CAG CCG 438
Gin Ařg Pro ASP Arg val G1U Leu Met Pro Léu Pro Pro Trp Gin Pro
120: 125 130
.GTG GGC GAG AAC TTC ACC CTG AGC TGT AGG GTC CCC GGC GCC GGG CCC 436
Val Gly Glu Asn: Phe Thr Leů ser Cys Arg Val Pro ciy Ala Gly Pro
135 140 145
CGT. GCG AGC CTC ACG CTG ACC CTG CTG CGG GGC GCC CAG GAG CTG ATC 534
Arg Ala Ser Leu Thř Leu Thr Leu Leu Arg Gly Ala Gin Glu Leu Ile
150 155 160 165
CGC CGC AGC TTC GCC GGT GAA CCA CCC CGA GCG CGG GGC GCG GTG CTC 582
Arg: Arg Ser Phe Ala Gly Glu Pro Pro Arg Ala Árg Gly Ala val Leu
170 175 180
ACA GCC ACG GTA OTG GCT CGG AGG GAG GAC CAT GGA GCC AAT TTC TCG 630
Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Arg Glu Asp His Gly Ala Asn Phe Ser
185 190 195
TGT CGC GCC GAG CTG GAC CTG CGG CCG CAC GGA CTG GGA CTG GAA 678
Cys Arg Ala Glu Leu Asp Leu Pro His Gly Leu Gly Leu Phe Glu
200 205 210
AAC AGC TCG GCC CCC AGA GAG CTC CGA ACC TTC TCC CTG TCT CCG GAT 726
Asn Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Arg Phe Ser Leu Ser Pro Asp
215 220 225
60CZ 291974 B6
GCC Ala 230 CCG CGC CTC GCT GCT CCC CGG CTC TTG GAA GTT GGC TCG GAA Glu AGG Arg 245 774
Pro Arg Leu Ala Ala Pro Arg Leu Leu Glu Val Gly Ser
'235 .240
CCC GTG AGC TGC ACT CTG GAC GGA CTG TTT CCA GCC TCA GAG GCC AGG 822
Pro Val Ser Cýs Thr Leu 250 Asp Gly Leu PHe 255 Pro Ala Ser Glu Ala Arg 260
GTC TAC CTC GCA CTG GGG GAC CAG AAT CTG AGT CCT GAT GTC ACC CTC 870
Val Tyr Leu Ala 265 Leu Gly Asp Gin Ásn 270 Leu Ser Pro Asp Val 275 Thr Leu
GAA GGG GAC GCA- TTC GTG GCC ACT GCC ACA GCC ACA GCT AGC GCA GAG 918
Glu Gly Asp Ala 280 Phe Val Ala Thr 285 Ala Thr Ala Thr Ala Sér 290 Ala Glu
CAG GAG GGT GCC AGG CAG CTG GTC TGC AAC GTC ACC CTG GGG GGC GAA 966
Gin Glu Gly 295 Ala Arg Gin Leu Val 300 cys Asn Val Thr 305 Leu Gly Gly Glu
AÁC CGG GAG ACC CGG GAG AÁC GTG ACC ATC TAC AGC TTC CCG GCA CCA 1014
Asn 310 Arg Glu Thr Ařg Glu 315 Asn Val Thr Zle Tyr Sér 320 Phe Pro Ala Pro 325
CTC CTG ACC CTG AGC GAA CCC AGC GTC TCC GAG GGG CAG ATG GTG ACA 1062
Leu Leu Thr Leu Ser Glu 330 Pro Ser Val Ser 335 Glu Gly Gin Met Vál 340 Thr
GTA ACC TGC GCA GCT GGG GCC CAA GCT CTG GTC ACA CTG GAG GGA GTT 1110
Vál Thr Cys Ála 345 Ala Gly Ala Gin Ala 350 Leu Val Thr Leu Glu Gly 355 Vel
CCA GCC GCG GTC CCG GGG CAG CCC GCC CAG CTT CAG CTA AAT GCC ACC 1158
Pro Ala Ala 360 Val Pro Gly Gin Pro 365 Ala Gin Leu Glh Leu Asn 370 Ala Thr
GAG AAC GAC GAC AGA CGC AG C TTC TTC TGC GAC GCC ACC CTC GAT GTG 1206
Glu Asn Asp 375 Asp Arg Arg Ser Phe 380 Phe cys Asp Ala 385 Thr Leu Asp Val
GAC GGG GAG ACC CTG. ATC AAG AAC AGG AGC GCA GAG CTT CGT GTC CTA 1254
Asp 390 Gly Glu Thr Leu Zle 395 Lys Asn Arg Ser Ala GlU 400 Leu Arg Val Leu 405
TAC GCT CCČ CGG CTA GAC GAT TCG GAC TGC CCC AGG AGT TGG ACG TGG 1302
Tyr Ala· Pro Arg Leu Asp 410 Asp Ser Asp Cys 415 Pro Arg Ser Trp Thr 420 Trp
CCC GAG GGC CCA GAG CAG ACG CTG CGC TGC GAG GCC CGC GGG AAC CCA 1350
Pro Glu Gly Pro 425 G1U Gin Thr Leu Arg 4 30 Cys Glu Ala Arg Gly 435 Asn Pro
GAA CCC TCA GTG CAC TGT GCG CGC TCC GAC GGC GGG GCC GTG CTG GCT 139.8
Glu Pro Sér 440 Val His Cys Ala Arg 445 Ser Asp Gly Gly Ala Val 450 Leu Ala
CTG GGC CTG CTG GGT CCA GTC ACT CGG GCG CTC TCA GGC ACT TAC CGC 1446
Leu Gly Leu 455 Leu Gly Pro Val Thr 4 60 Arg Ala Leu Šer 465 Gly Thr Tyr Arg
TGC AAG GCG GCC AAT GAT CAA GGC GAG GCG GTC AAG GAC GTA ACG CTA 1494
Cys 470 Lys Ala Ala Asn Asp 475 Gin Gly Glu Ala Val Lys 480 Ásp Val Thr Leu 485
-61 CZ 291974 B6
ACG GTG GAG TAC Tyr GCA Ala 490 CCA GCG CTG Pro Ala Leu GAC AGC Asp Ser 495 GTG GGC TGC CCA GAA CGC Arg 1542
Thr Val Glu Val Gly Cys Pro Glu 500
ATT ACT TGG CTG GAG GGA ACA GAA GCC TCG CTG AGC TGT GTG GCG CAC 139 0
Ile Thr Trp Leu G1U Gly Thr Glu Ala Ser Leu Ser Cys Val Ala His
505 510 515
GGG gta CCG CCG, CCT GAT GTG ATC TGC GTG. CGC rcr GGA GAA CTC GGG 1638
Gly Val Pro Pro Pro Asp Val Ile Cys Val Arg Ser Gly Glu Leu Gly
520 525 530.
GCC GTC ATC GAG GGG CTG TTG CGT GTG GCC CGG GAG CAT GCG GGC ACT 1686
Ala Val ile Glu Gly Leu Leu Arg Val Ala Arq Glu His Ala Gly Thr
535 540 545
TAC CGC TGC GAA GCC ACC AAC CCT CGG GGC TCT GCG GCC AAA AAT GTG 1734
Tyr: Arg Cys Glu Ala Th r As n Pro Arg Gly Ser Ala Ala Lys Asn Val
550 555 560 565
GCC GTC ACG GTG GAA TAT GGC CCC AGG TTT GAG GAG CCG AGC TGC ČČČ 1782
Ala Val Thr Val G1U Tyr Gly Pro Arg Phe Glu Glu Pro Ser Cys Pro
570 575 580
AGC AAT TGG AGA TGG GTG GAA GGA TCT GGG CGC CTG TTT TCC ŤGT GAG 1830
Ser Asn Trp Thr Trp Val Glu Gly Ser Gly Arg Leu Phe Ser Cys Glu
585 590 595
GTC GAT GGG AAG CCA CAG CCA AGC GTG AAG TGC GTG GGC TCC GGG GGC 1878
val Asp Gly Lys Pro GIS Pro Ser Val Lys Cyš Val Gly Šer Gly Gly
600 605 610
ACC ACT GAG GGG GTG CIG CTG CCG CTG GCA. CCC CCA GAC CCT AGT CCC 1926
Thr Thr Glu Gly val Leu Leu Pro Leu Ala Pro Pro ASp Pro Ser Pro
615 620 625
AGA GCT CCC AGA ATC CCT AGA GTC CTG GCA CCC GGT ATC TAC GTC TGC 1974
Árg Ala Pro Arg Ile Pro Arg Val Leu Ala Pro Gly Ile Tyr Val Cys
630 635 640 645
AAC GCC ACC AAC CGČ CAC GGC TCC GTG GCC AAA ACA GTC GTC GTG AGC 2022
Asn ‘Ala Thr Asn Arg His Gly Sěr Val Ala Lýs Thr Vál Val Val Sěr
650 655 660
GCG GAG TCG CCA CCG GAG ATG GAT GAA TCT ACC TGC CCA AGT CAC CAG 2070
Ala Glu Ser Pro Pro Glu Hec Asp Glu Sex Thr Cys Pro Ser His Gin
665 670 675
ACG TGG CTG GAA GGG GCT GAG GCT TCC GCG CTG GCC TGC GCC GCC CGG 2118
Thr Trp Leu Glu Gly Ala Glu Ala Ser AÍa Le u Al a Cys Ala Ala Arg
680 685 690
GGT CGC CGT TCC CCA GGA GTG CGC TGC TCT CGG GAA GGC ATC CCA TGG 2166
Gly Arg Pro Ser Pro Gly Val Arg Čys Ser Arg Glu Gly Ile Pro Trp
695 700 705
CCT GAG CAG CAG CGC GTG TCC CGA GAG GAC GČG GGC ACT TAC CAC TGT 2214
Pro Glu Gin Gin Arg Val Ser Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr His Cys
710 715 720 725
GTG GCC ACC AAT GCG ČAT GGC ACG GAC TCC CGG ACC GTC ACT GTG GGC 2262
Val Ala Thr Asn Ala His Gly Thr Asp Ser Arg Thr Val Thr Val Gly
730 735 740
-62CZ 291974 B6
GTG GAA TAC CGG CCA GTG GTG GCC GAA CIT GCT GCC TCG CCC CCT GGA 2310
Val Glu Tyr Arg Pro val Val Ala G1U Leu Ala Ala Ser Pro Pro Gly
745 750 755
GGC Gly GTG CGC CCA GGA GGA AAC TTC ACG TTG ACC TGC CGC Arg GCG GAG GCC Ala 2358
Val Arg Pro Gly Gly Ásn Phe Thr Leu Thr cys Ala Glu
760 765 770
TÓG CCT CCA GCC CAG ATC ile AGC TGG CGC GCG CCC CCG AGG GCC Ala CTC .AAC 2406
Trp Pro 775 Pro Ala Gin Ser 780 Trp Arg Ala Pro Pro 785 Arg Leu Asn
ATC GGC CTG TCG AGC AAC AAC AGC ACA CTG AG C GTG GCA GGC GCC ATG 2454
Tle Gly Leu Šer Šer Asn Ásn Šer Thr Leu Ser Vál Ala Gly Ala Met
790 795 800 805
GGA AGC CAC GGC GGC GAG TAC GAG TGC GGA CGC ACC AAC GCG CAC GGG 2502
Gly Ser Hiš Gly Gly Glu Tyr Glu Cys Ala Arg Thr Asn Ala His Gly
BIO 815 820
CGC CAC GCG CGG CGC ATC ACG GTG CGC GTG GCC GGT CCG TGG CTA TGG 2550
Arg His Ala •Arg· Arg ile Thr Val Arg Vál Alá Gly Pro Trp Leu Trp
825 830 835
GTC GCC GTG GGC GGC GCG GCG GGG GGC GCG GCG CTG. CTG GCC GCG GGG 2598
Val Ala Val Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Leu Léu Ala Ala Gly
84 0 845 850
GCC GGC CTG GCC TTC TAC GTG CAG TCC ACC GCC TGC AAG AAG GGC GAG 2646
Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Vál Gin Šer Thr Ala Cys Lys Lys Gly Glu
855 860 865
TAC AÁC GTG CAG GAG GCC GAG AGC TCA GGC GAG GCC GTG TGT CTG AAC 2694
Tyr Asn Val Gin Glu Ala Glu Ser Ser Gly Glu Ala Val cys Leu A$n
870 875 880 SBS
GGA GCG GGC GGC 'GGC GCT GGC GGG GCG GCA GGC GCG GAG GGC GGA CCC 2742
Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Glu Gly Gly Pro
890 895 900
GAG GCG GCG GGG GGC GCG GCC GAG TCG CCG GCG GÁG GGC GAG GTC TTČ 2790
Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Glu Ser pro Ala G1U Gly Glu val Phe
905 910 915
GCC ΑΤΆ CAG CTG ACA TCG GCG TGAGCCCGCT CCCCTCTCCG CGGGCCGGGA2841
Ala ile Gin Leu Thr Ser Ala
920925
CGCCCČCCAG ACTCACACGG GGGCTTATTT ATTGCITIAT TTATTTACTT ATTCXTTTAT 2901
TTATGTÁTTC AACTCCAAGG GAATTC2927 (2) Informace pro SEQ ID NO: 28:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 924 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární to (ii) typ molekuly: protein
-63CZ 291974 B6 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 28:
Met Pro Gly Pro Ser Pro Gly Leu Arg Arg Ala Leu Leu Gly Leu Trp
1 5 16 15
Ala Ala Leu Gly Leu Giy Leu Phe Gly Leu Ser Ala Val Šer Gin Glu
20 25 30
Pro Phe Třp 35 Ala ÁSp Leu Gin Pro 40 Arg val Ala Phe Val 45 Glu Arg Gly
Gly Ser Leu Trp Leu Asn Cys Sér Thr Asn Cys Pro Ařg Přo Glu •Arg
50 55 60
Gly Gly Leu G1U Thř Ser Léu Arg Arg Asn Gly Thr Gin Arg Gly Leu
65 70 75 80
Arg Trp Leu Ala Arg Gin Leu Val Asp Ile Arg Glu Pro Glu Thř Glh
85 90 95
Pro Val Cys Phe Phe Arg Cys Ala Arg Arg Thř Leu Glh Ala Arg Gly
100 105 110
Leu ile Arg Thr Phe Gin Arg Pro Asp Arg Val Glu Leu Met Pro Leu
115 120 125
Pro Pro Trp Gin Pro Val Gly Glu Asn Phe Thr Leu Ser Cys Arg Val
130 135 140
Pro Gly Ala Gly Pro Arg Ala Ser Leu Thr Leu Thr Leu Léu Arg Gly
145 150 155 160
Ala Glh Glu Leu Ile Arg Arg Ser Phe Ala Glý Glu Přo Pro Arg Ale
165 170 175
Arg Glý Ala Val Leu Thr Ala Thr Val Leu Ala Ařg Arg Glu Asp His
180 185 190
Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Ala Glu Leu Asp Leu Arg Pro His Gly
195 200 205
Leu Gly Leu Phe Glu Asn Ser Šer Ala Pro Arg Glu Leu Arg Thr Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Asp Ala Pro Arg Leu Ala Ala Pro Arg Léú LeU G1U
225 230 235 240
Val Gly Ser Glu Arg Pro Val Sér Cys Thr Leu Asp Gly Leu Phe Pro
245 250 255
Ala Ser Glu Ala Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly Asp Gin Asn Leu Sér
260 26$ 270
Pro Asp Val Thr Leu Glu Gly Asp Ala Phe Val Ala Thr Ala Thr Ala
275 280 285
Thr Ala Ser Ala Glu Gin Glu Gly Ala Arg Glh Léu Val Cys Ash val
290 295 300
Thr Leu Gly Gly Glu Asn Arg Glu Thr Arg Glu Asn Val Thr Ile Tyr
305 310 315 320
Sex Phe Pro Ala Pro Leu Leu Thr Leu Ser Glu Pro Ser val Ser Glu
325 330 335
-64CZ 291974 B6
Gly Gin Met Val Thr Val 340 Thr Cys Ala Ala 345 Gly Ala Gin Ala Leu 350 Vál
Thr Leu Glu Gly Val Pro Ala Ala Val Pro Gly Gin Pro Ala Gin Leu
355 3S0 365
Gin Leu Asn Ala Thr Glu Asn Asp Asp Arg Arg Ser Phe Phe Cys Asp
370 375 380
Ala Thr Leu Asp Vál Asp Gly Glu Thr Leu Ile Lys Asn Arg Ser Ala
385 39 0 395 4 00
Glu Leu Arg Val Leu Tyr Ala Pro Arg Leu Asp Asp Ser Asp Cys Pro
4 05 410 415
Arg Sér Trp Thr Trp Pro Glu Gly Pro Glu Gin Thr Leu Arg Cys Glu
420 425 430
Ala Arg Gly Asn Pro Glu Pro Ser Val His Cys Ala Arg Ser Asp Gly
435 440 445
Gly Ala Val Leu Ala Leu Gly Leu Leu Gly Pro Val Thr Arg Ala Leu
450 455 4 60
Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Ala Ala Asn Asp Gin Gly Glu Ala val
465 470 475 4 80
Lys Asp val Thr Leu Thr Val Glu Tyr Ala pro Ala Leu Asp Ser Val
4 85 490 495
Gly cys Pro Glu Arg Ile Thr Trp Leu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu
500 505 510
Ser Cys Val Ala His Gly Val Pro Pro Pro Asp Val Ile Cys Val Arg
515 520 525
Ser Gly Glu Leu Gly Ala Val Ile Glu Gly Leu Leu Ar g Val Ala Arg
530 535 540
Glu His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Ala Thř Asn Pro Arg Gly Ser
545 550 555 560
Ala Ala Lys Asn Val Ala Val Thr val Glu Tyr Gly Pro Arg Phe Glu
565 570 575
Glu Pro Ser Cys Pro Ser Asn Trp Thr Trp Val Glu Gly Ser Gly Arg
580 585 590
Leu Phe Ser Cys Glu Val Asp Gly Lys Pro Gin Pro Ser Val Lys Cys
595 600 605
Val Gly Sér ;Glý Gly Thr Thr Glu Gly Val Leu Leu Pro Leu Ala Pro
610 615 620
Pro Asp Pro Ser Pro Arg Ala Pro Arg Ile Pro Arg Val Leu Ala Pro
625 630 635 640
Gly Ile Tvr Val Cys Asn Ala Thr Asn Arg His Gly Ser Vál Ala Lys
£45 650 655
Thr Val Val Val Ser Ala Glu Ser Pro Pro Glu Mát Asp Glu Ser Thr
660 665 670
-65CZ 291974 B6
Cys Pro Ser His Gin Thr Trp. Leu Glu Gly Ala Glu Ala Ser Ala Leu
675 680 685
Ala Cys 690 Ala Ala Arg Gly Arg 695 Pro Ser Pro Gly val 700 Arg Cys ser Arg
Glu Gly Ile Pro Trp Pro Glu Gin Gin .Arg val Ser Arg Glu Asp Ala
705 710 715 720
Gly Thr Tyr His Cys val Ala Thr Asn Ala His Gly Thr Asp Ser 715 Arg
725 730
Thr Val Thr Val Gly Val Glu Tyr Arg Pro Val Val Ala Glu Leu Ala
740 745 750
Ala Ser Pro Pro Gly Gly Val Arg Pro Gly Gly Asn Phe Thr Leu Thr
755 760 765
cys Arg Ala Glu Ala Trp Pro Pro Ala Gin Ile Ser Trp Arg: Ala pro
770 775 780
Pro Arg Ala Leu Asn Ile Gly Leu Ser Ser Asn Asn Ser Thr Leu Ser
785 790 795 800
Val Ala Gly Ala Gly Ser His Gly Gly Glu Tyr Glu Cys Ala Arg
805 810 815
Thr Asn Ala His Gly Arg. His Ala Arg Arg Ile Thr Val Arg Val Ala
820 82S 830
Gly Pro TrP Leu Trp val Ala val Gly Gly Ala Ala Giy Gly Ala Ala
835 840 845
Leu Leu Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Val Gin Ser Thr Ala
,850 855 860
Cys Lys Lys Gly Glu Tyr Asn Val Gin Glu Ala G1U Ser Ser ciy Glu
865 870 875 880
Ala Val Cys Leu Asn Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly
885 890 895
Ala Glu Gly Gly pro Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Glu Ser Pro Ala
900 905 910
Glu Gly Glu Val Phe Ala Ile Gin Leu Thr. Ser Ala
9X5 920 (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 65 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 29:
GTACTTACAG GATCCGCGGT CTCGCAGGAG CCCTTCTGGG AGGACCTACA GCCTGCGTGGCGTTC 65
-66CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 30:
15 (2) ATTTCTCTCG AGGATGGTCA CGTTCTCCCG C Informace pro SEQ ID NO: 31 : 31
20 (i) sekvenční charakteristiky:
25 (A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: cDNA
30 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 31: ATTTCTGGAT CCTACAGCTT CCCGGCACCA CTC 33
35 (2) Informace pro SEQ ID NO: 32: (i) sekvenční charakteristiky:
40 (A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: DNA
45 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 32:
ATTTCTCTCG AGTTCCACGC CCACAGTGAC GG 32
-67CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NÓ: 33:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 1687 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární io (ii) typ molekuly: DNA (genomická) (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 33:
GGATCCTTTG agccctgaaa gtcgaggttg CAGTGAGCCT TGATCGTGCC ACTGCACTCC60
AGCCTGGGGG ACAGAGCRČG ACCCTGTCTC ČAAÁAATAAA ATAÁAAATAA AAATAAATAT120
TGGCGGGGGA ACCCTCTGGA ATCAATAAAG GCTTCCTTAA CCAGCCTCTG TCCTGTGACČ180
TAAGGGTCCG CÁŤTÁCTGCC CTTC7TCGGA GGAACTGGTT TGTTTTTGTT GTTGTTGTTG240 rmTGCGAT CACTTTCTCC AAGTTCCTTG TCTCCCTGAG GGCACCTGAG GTTTČCTCAC300
TCAGGGCCCA CCTGGGGTCC CGAAGCCCCA GACTCTGTGT ATCCCCAGCG GGTGTCACAG360
AAACCTCTCC TTCTGCTGGC CTTATCGAGT GGGATCAGCG CGGCCGGGGA GAGCCACGGG420
CAGGGGCGGG GTGGGGTTCA TGGTATGGCT TTCCTGATTG GCGCCGCCGC CACCACGCGG4B0
CAGCTCTGAT TGGATGTTAA GTTTCCTATC CCAGCCCCAČ CTTCAGACCC TGTGCTTTCC540
TSGAGGCCAA ACAACTGTGG AGCGAGAACT CATCTCCWA ATAACTTACC ACGCTGGAGT600
GAGACCACGA ATGGŤGGGGA GGGGAGGGTC CCACGGACAT ATTGAGGGAC GTGGATACGC660
AGAAGAGGTA TCCATGTGGT GGCAGCCGGG AAGGGGTGAT CAGATGGTCC ACAGGGAATA720
-68CZ 291974 B6
TCACAAACTC GAATTCTGAC GATGTTCTGG TAGTCACCCA GCCAGATGAG CGCATGGAGT 780 TGGCGGTGGG GGGTGTCAAA GCTTGGGGCC CGGAAGCGGA GTCAAAAGCA TCACCCTCGG 840 TCCCTTGTTC TCGCGTGGAT GTCAGGGCCT CCACCCACCG AGCAGAAGGC GGACTCAGGG 900 GCGCTGCAGG GTGGCTCGAG ČTCACÁCACG CTGAGTAGAC ACGTGCČCGC TGCACCCTGG 960 GTAAATACAG ACCCGGAGCC GAGCGGATTC TAATTTAGAC GCCCGCGAAC GCTGCGCGCA 1020 CGCACAČGTG TCCTCGGCTC GCTGGCACTT TCGTCCCGCC CCCTCCGTCG CGTGCCGGAG 1080 CTGACCCGGA GGGGTGCTTA GAGGTATGGC TCCGCGGGGT CAAAAGGAGA AGGATCAGTG 1140 AGAGAGGATC CCCACACCCT CCCCTAGAAC TGTCCTTTCC CCATCCAGTG CCTCCCAAAT 1200 CTCTCTTAGT CCCCAAATGT ATCCCCGCCC TAAGGGGCGC TGGTGGGAGG AGCTAAATGT 1260 GGGGGCGGAG CTCGGAGTCC AGCTTATTAT CATGGCATCT CAGCCAGGGC TGGGGTAĎGG 1320 GTTTGGGAAG GGCAACCCAG ČATCCCCCGA TCCCAGAGTC GCGGCCGGGG ATGACGCGAG 1380 AGAGCGTGGT CGCCCCCAGA AGGCCCTOGG CCATCATGCC GGCCTCCACG TAGACCCCAG 1440 GGGTCGCTCA CTCCTGČČAG CTCGCCITCA CCAAGGCCAG GAGCZTAGCG CACGCTCGCC 1500 TCCCGCCCCC CCGCCGCCTC TGCCGCCGCC CCCTCCTTGG AAACCAAGTT ACCAACGTTA 1.560 AACCAATCCC CAAGCGCAAC TCTGTCTCCC CCACACCCCA CCCGCCGCGC CGCGCGGAGC 1620 CGTCCTCTAG CCCAGČTCCT CGGCTCGCGC TCTCCTCGCC TCCTGTGCTT TCCCCGCCGC 1680 GGCGATG 1687 (2) Informace pro SEQ ID NO: 34:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 36 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 34:
CAGAACTAAG CTTACAGGAG GCGAGGAGAG CGCGAG 36
-69CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 35:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 35:
CAACAATGCT AGCCAAGCGC AACTCTGTCT C 31 (2) Informace pro SEQ ID NO: 36:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 36:
CAACAATGCT AGCCTTGGAA ACCAAGTTAC C 31 (2) Informace pro SEQ ID NO: 37:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 37:
CAACAATGCT AGCAGGAGCT TAGCGCACGC TCG 33
-70CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 38:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 38:
CAACAATGCT AGCCATGCCG GCCTCCACGT AG 32 (2) Informace pro SEQ ID NO: 39:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 39:
CAACAATGCT AGCGTCCAGC TAATTATCAT G 31 (2) Informace pro SEQ ID NO: 40:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 40:
CAACAATGCT AGCCTTAGTC CCCAAATGTA TC 32
-71 CZ 291974 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 41:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 30 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 41:
CAACAATGCT AGCGGAGAAG GATCAGTGAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 42:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 42:
CAACATGCT AGCCTCCACC CACCGAGCAG AAG 33
-72CZ 291974 B6

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob in vitro screeningu na neuropatologii vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:
    a) získání tekutého vzorku od prvního individua
    b) kontaktování vzorku s protilátkou specificky imunoreaktivní s ICAM-4
    c) kvantifikaci vazby protilátky na ICAM-4 ve vzorku a
    d) porovnání vazby protilátky na ICAM-4 v případě tohoto individua s vazbou v případě druhého individua, o němž je známo, že je bez neuropatologie.
  2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že tekutý vzorek je mozkomíšní mok.
  3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že tekutý vzorek je sérum.
  4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že kvantifikace vazby protilátky na ICAM-4 se stanoví pomocí radioimunologického stanovení (RIA).
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kvantifikace vazby protilátky na ICAM-4 se stanoví pomocí enzymaticky spřaženého imunostanovení na pevném nosiči (ELISA).
CZ1997292A 1995-06-07 1996-06-06 Způsob in vitro screeningu na neuropatologii CZ291974B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/481,130 US5702917A (en) 1992-01-27 1995-06-07 Polynucleotides encoding human ICAM-4
PCT/US1996/009146 WO1996040916A1 (en) 1995-06-07 1996-06-06 Icam-4 materials and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ29297A3 CZ29297A3 (en) 1997-10-15
CZ291974B6 true CZ291974B6 (cs) 2003-06-18

Family

ID=23910735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1997292A CZ291974B6 (cs) 1995-06-07 1996-06-06 Způsob in vitro screeningu na neuropatologii

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5702917A (cs)
EP (2) EP0789763B1 (cs)
JP (2) JP3349514B2 (cs)
CN (2) CN1597950A (cs)
AT (1) ATE224448T1 (cs)
AU (1) AU721316B2 (cs)
BR (1) BR9606440A (cs)
CA (2) CA2196431C (cs)
CZ (1) CZ291974B6 (cs)
DE (1) DE69623746T2 (cs)
DK (1) DK0789763T3 (cs)
ES (1) ES2183961T3 (cs)
FI (1) FI970503A7 (cs)
HU (1) HUP9901123A3 (cs)
IL (2) IL120095A0 (cs)
MX (1) MX9700941A (cs)
NO (1) NO317150B1 (cs)
PL (2) PL188878B1 (cs)
RU (2) RU2155345C2 (cs)
SK (1) SK284161B6 (cs)
WO (1) WO1996040916A1 (cs)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5702917A (en) * 1992-01-27 1997-12-30 Icos Corporation Polynucleotides encoding human ICAM-4
GB9715164D0 (en) * 1997-07-19 1997-09-24 Medical Res Council Improvements in or relating to expression of nucleic acid sequences in cerebellar cells
ES2201547T3 (es) * 1997-10-02 2004-03-16 Icos Corporation Icam-4 y usos diagnosticos de las mismas.
JP2001506139A (ja) * 1997-10-22 2001-05-15 アイコス コーポレイション Ｉｃａｍ−６物質及び方法
TR200101538T2 (tr) * 1998-11-30 2001-12-21 Ivf Sciences Colorado, Inc. In vitro dölleme sistemi ve sıralı kültür ortamı.
BRPI0408774A (pt) * 2003-03-24 2006-03-28 Scripps Research Inst vacinas de dna contra crescimento tumoral e seus usos
RU2238025C1 (ru) * 2003-06-18 2004-10-20 Государственное учреждение Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова Способ ранней диагностики нейропатии зрительного нерва при отечном экзофтальме

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE128727T1 (de) * 1987-05-04 1995-10-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Interzellulare adhäsions-moleküle und deren bindungsliganden.
PT88641B (pt) * 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
US5272263A (en) * 1989-04-28 1993-12-21 Biogen, Inc. DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS)
US5264554A (en) * 1990-01-19 1993-11-23 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Platelet cell adhesion molecule and variants thereof
GB9009548D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
ES2134762T3 (es) * 1990-07-20 1999-10-16 Bayer Ag Formas multimericas de proteinas receptoras de rinovirus humanos.
DE69129460T2 (de) * 1990-08-31 1998-10-15 Boehringer Ingelheim Pharma Verwendung von Anti-ICAM Antikörpern zur Herstellung eines Präparats für die BEHANDLUNG VON ENDOTOXINSCHOCK
RU2130782C1 (ru) * 1991-06-11 1999-05-27 Сентер Фор Блад Рисерч, Инк. Рекомбинантная молекула днк, кодирующая молекулу iсам-3, молекула адгезии iсам-3, антитело, способное связываться с такой молекулой, фармацевтическая композиция
US5702917A (en) * 1992-01-27 1997-12-30 Icos Corporation Polynucleotides encoding human ICAM-4
EP0578819A4 (en) * 1992-01-27 1994-10-12 Icos Corp Icam-related protein.

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996040916A1 (en) 1996-12-19
PL188612B1 (pl) 2005-03-31
CN1597950A (zh) 2005-03-23
RU2000111744A (ru) 2002-09-10
SK284161B6 (sk) 2004-10-05
ES2183961T3 (es) 2003-04-01
CZ29297A3 (en) 1997-10-15
NO970546L (no) 1997-04-07
CN1152960C (zh) 2004-06-09
EP1308514A3 (en) 2004-01-02
NO970546D0 (no) 1997-02-06
MX9700941A (es) 1998-01-31
DE69623746D1 (de) 2002-10-24
AU6256096A (en) 1996-12-30
CA2288401A1 (en) 1996-12-19
PL188878B1 (pl) 2005-05-31
RU2155345C2 (ru) 2000-08-27
JPH10505508A (ja) 1998-06-02
JP3349514B2 (ja) 2002-11-25
EP0789763A1 (en) 1997-08-20
BR9606440A (pt) 1997-09-30
CA2196431C (en) 2000-08-15
HUP9901123A3 (en) 2001-10-29
AU721316B2 (en) 2000-06-29
EP1308514A2 (en) 2003-05-07
IL146447A0 (en) 2002-07-25
IL120095A0 (en) 1997-04-15
PL318545A1 (en) 1997-06-23
DK0789763T3 (da) 2003-01-27
CA2196431A1 (en) 1996-12-19
CN1164870A (zh) 1997-11-12
US5702917A (en) 1997-12-30
DE69623746T2 (de) 2003-05-08
HUP9901123A2 (hu) 1999-07-28
NO317150B1 (no) 2004-08-30
ATE224448T1 (de) 2002-10-15
SK16597A3 (en) 1998-02-04
FI970503L (fi) 1997-04-04
EP0789763B1 (en) 2002-09-18
FI970503A0 (fi) 1997-02-06
JP2003047493A (ja) 2003-02-18
FI970503A7 (fi) 1997-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5811517A (en) ICAM-related protein variants
US20060134121A1 (en) DII4 antagonists, assays, and therapeutic methods thereof
US5837822A (en) Humanized antibodies specific for ICAM related protein
US20010029293A1 (en) Icam-related protein
WO1993014776A1 (en) Icam-related protein
US5753502A (en) Neuron-specific ICAM-4 promoter
AU721316B2 (en) ICAM-4 materials and methods
US6040176A (en) Antibodies to ICAM-related protein
WO1994017100A1 (en) Icam-related protein
US6153395A (en) ICAM-related protein
AU735917B2 (en) ICAM-4 and diagnostic uses thereof
JP4537507B2 (ja) 結合組織増殖因子に対するモノクローナル抗体及びその医薬用途
US5773293A (en) Anti-ICAM-4 antibodies and hybridomas
US20030068659A1 (en) ICAM-4 materials and methods
US5989843A (en) Methods for identifying modulators of protein kinase C phosphorylation of ICAM-related protein
US5852170A (en) ICAM-4 materials and methods
JP2001506139A (ja) Ｉｃａｍ−６物質及び方法
WO1999018441A1 (en) Icam-4 and diagnostic uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20050606