PL188878B1 - Sposób badania przesiewowego pod kątem zmian neuropatologicznych - Google Patents

Abstract

1. Sposób badania przesiewowego pod katem zmian neuropatologicznych, znamienny tym, ze obejmuje etapy: a) pozyskania próbki plynu od pierwszej osoby; b) doprowadzenia do kontaktu próbki i przeciwciala dajacego specyficzna reakcje immunologiczna z ICAM-4; c) oznaczenia ilosciowego wiazania ICAM-4/przeciwcialo w próbce; oraz d) porównania wiazania ICAM-4/przeciwcialo u tej osoby z inna osoba, o której wiadomo, ze nie ma zmian neuropatologicznych; przy czym ICAM-4 jest kodowany przez polinukleotyd wybrany z grupy skladajacej sie z polinukleotydu przedstawionego w SEK NR ID: 27 i polinukleotydu kodujacego ICAM-4, który hybryduzuje z polinukleotydom z SEK NR ID: 27. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób badania przesiewowego pod kątem zmian neuropatologicznych. W ogólności wynalazek odnosi się do komórkowych cząsteczek adhezyjnych i metod klonowania oraz ekspresji DNA kodującego nieznany dotychczas polipeptyd określany jako „ICAM-4”, wykazujący strukturalne podobieństwo do innych międzykomórkowych cząsteczek adhezyjnych ICAM-1, ICAM-2 i ICAM-R.

Zgłoszenie jest kontynuacją w części zgłoszenia patentowego USA nr 08/481130 zgłoszonego 1 czerwca 1995, będącego kontynuacją w części zgłoszenia patentowego USA nr 08/245295 zgłoszonego 18 maja 1994, które z kolei jest kontynuacją w części zgłoszenia patentowego USA nr 08/102852 zgłoszonego 5 sierpnia 1993 jako kontynuacja w części zgłoszenia patentowego USA nr 08/009266 zgłoszonego 22 stycznia 1993, będącego kontynuacją w części zgłoszenia patentowego USA nr 07/894061 zgłoszonego 5 czerwca 1992, będącego w dalszym ciągu kontynuacją w części zgłoszenia patentowego USA nr 07/889724 zgłoszonego 26 maja 1992, jako kontynuacja w części oczekującego na uznanie zgłoszenia patentowego USA nr 07/827689 zgłoszonego 27 stycznia 1992.

Podstawa wynalazku

Badania naukowe ostatniego dziesięciolecia umożliwiły wyjaśnienie różnych, zachodzących na poziomie molekularnym, zdarzeń stanowiących podłoże wzajemnego oddziaływania na siebie komórek ciała, w szczególności tych, jakie warunkują ruchliwość i aktywację komórek układu odpornościowego człowieka, a w ostatnim czasie, także tych, które biorą udział w rozwoju i prawidłowym, fizjologicznym funkcjonowaniu komórek układu nerwowego. Ogólnych informacji dotyczących komórek układu odpornościowego szukaj w publikacji Springera, Nature, 346: 425-434 (1990), natomiast odnoszących się do komórek układu nerwowego - w artykułach autorstwa Yoshihary i wsp, Neurosci. Res. 10: 83-105 (1991) oraz u Sondereggera i Rathjena, J Cell. Biol. 119: 1387-1394 (1992). Białka powierzchniowe komórek, a w szczególności grupa tak zwanych komórkowych cząsteczek adhezyjnych [Cellular

188 878

Adhesion Molecules - „ CAM” stopniowo stawały się przedmiotem zainteresowania nauk farmaceutycznych umożliwiając postęp wiedzy. Celem badań była ingerencja w procesy związane z przenikaniem leukocytów przez ścianę naczyń krwionośnych i ich migracji do ogniska zapalnego oraz te, jakie odpowiadają za ukierunkowane przemieszczanie leukocytów do różnych tkanek docelowych. Podobnie, zainteresowanie naukowców skupia się także na procesach prowadzących do różnicowania się neuronów i tworzenia kompleksowej sieci neuronalnej. Wyizolowanie oraz charakterystyka komórkowych cząsteczek adhezyjnych, sklonowanie i ekspresja sekwencji DNA kodujących te cząsteczki, a także wprowadzenie i stosowanie ich jako środków służących celom diagnostyki i terapii procesów zapalnych oraz określających rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego legły u podstaw wielu amerykańskich oraz innych niż amerykańskie patentów. Informacji szukaj w: Edwards, Current Opinion in Therapeutic Patents, 1(11): 1617-1630 (1991) oraz w szczególności w opublikowanych tam literaturowych odnośnikach cytowanych w części zatytułowanej „Odnośniki do publikacji patentowych”.

Fundamentalne znaczenie dla założeń obecnego wynalazku miała wcześniejsza identyfikacja oraz określenie struktury niektórych cząstek pośredniczących w procesach adhezji komórkowej, takich jak „leukointegryny”: LFA-1, MAC-1 i gp150.95 (zgodnie z nomenklaturą WHO określane odpowiednio jako CD18/CD11a, CD18/'CD11b oraz CD18/CD11c), tworzące podrodzinę heterodimerycznych białek powierzchniowych (tzw. „integryn”) komórki obecnych na powierzchni limfocytów B, limfocytów T, monocytów i granulocytów. Danych tych szukaj w tabeli 1 strona 429, w publikacji Springera cytowanej powyżej. Interesującymi są także inne jednołańcuchowe cząsteczki adhezyjne (CAM), biorące udział w aktywacji leukocytów, ich przyleganiu, przemieszczaniu oraz podobnych im zjawiskach nierozerwalnie związanych z procesem zapalnym. Dla przykładu, jak się obecnie uważa, zanim dojdzie do diapedezy (przenikanie leukocytów przez śródbłonek naczyń krwionośnych), jaki to proces ma miejsce w obrębie ogniska zapalnego, muszą najpierw ulec aktywacji integryny, których obecność obserwuje się konstytutywnie na powierzchni leukocytów. Aktywacja ta na drodze silnego wiązania receptora z jego ligandem powoduje w konsekwencji interakcję pomiędzy integrynami (np. LFA-1) oraz jedną lub obiema z dwóch różnych międzykomórkowych cząsteczek adhezyjnych (ICAM) określonych jako ICAM-1 i ICAM-2, których ekspresję można stwierdzić na powierzchni komórek śródbłonka naczyniowego oraz wielu leukocytów.

Podobnie jak i inne, scharakteryzowane do dzisiaj CAM (np. naczyniowa cząsteczka adhezyjna - [VCAM-1] opisana w publikacji PCT WO nr 90/13300 z dnia 15 listopada 1990 r; oraz płytkowo-środbłonkowa komórkowa cząsteczka adhezyjna [PECAM-1] opisana przez Newmana i wsp., Science, 247: 1219-1222 (1990) oraz w zgłoszeniu patentowym PCT WO 91/10683 opublikowanym 25 lipca 1991), ICAM-1 oraz ICAM-2 wykazują strukturalnie homologię z innymi cząsteczkami będącymi pochodnymi superrodziny genu immunoglobulinowego, z tym, że część pozakomórkowa każdej z ICAM składa się z serii domen posiadających podobny motyw na końcu karboksylowym. Typowa domena przypominająca immunoglobulinę tworzy pętlę zazwyczaj połączoną wiązaniem dwusiarczkowym występującym pomiędzy dwoma grupami cysteiny położonymi na końcach tej pętli. ICAM-1 zawiera pięć domen immunoglobulinopodobnych; ICAM-2, różniąca się głównie rozmieszczeniem w obrębie komórki, zawiera dwie takie domeny; PECAM-1 posiada sześć domen; VCAM obejmuje sześć lub siedem domen, zależnie od wariantów wiązania pętli, i tak dalej. Co więcej, wszystkie CAM charakteryzują się występującym typowo w obrębie cząsteczki śródbłonowym regionem hydrofobowym, jak się uważa, koniecznym do zorientowania przestrzennego cząsteczki na powierzchni komórki oraz regionem cytoplazmatycznym na końcu karboksylowym. Graficzny model CAM można przedstawić w postaci cząsteczki zakotwiczonej w błonie poprzez region śródbłonowy z ogonkiem cytoplazmatycznym, wystającym w kierunku komórkowej cytoplazmy oraz jedną lub większą ilością pętli immunoglobulinopodobnych wystających ponad powierzchnię komórki.

Liczne komórki neuronalne wyrażają immunoglobulino podobne receptory powierzchniowe wykazujące podobieństwo do cząsteczek ICAM, patrz np. publikacja Yoshihara i wsp., cytowana powyżej. Poza domenami posiadającymi struktury immunoglobulinopodobne, wiele cząsteczek adhezyjnych występujących w obrębie układu nerwowego posiada również w swo4

188 878 ich domenach pozakomórkowych powtarzające się tandemowo sekwencje przypominające fibronektynę.

Można przewidzieć, że ze względu na specyfikę działania międzykomórkowe cząsteczki adhezyjne zostaną wykorzystane w celach leczniczych. Przesłanką dla jednego z zastosowań terapeutycznych może być zdolność wiązania się ICAM-1 z ludzkimi rhinowirusami. Na przykład Europejskie zgłoszenie patentowe nr 468257 A zgłoszone 29 stycznia 1992 opisuje wprowadzenie multimerycznych konfiguracji oraz postaci ICAM-1 (w tym postaci o pełnej długości jak i postaci okrojonych) w celu zwiększenia aktywności wiążącej kompleksu receptor/ligand, w szczególny sposób zwiększającego zdolność wiązania wirusów, antygenów limfocyto-pochodnych oraz takich patogenów jak zarodziec zimnicy (Plasmodium falciparum).

W podobny sposób można zakładać innego typu immunologicznie wywodzących się z międzykomórkowych cząsteczek adhezyjnych. Przykład takiego zastosowania podaje publikacja WO 91/16928 z dnia 14 listopada 1991, w której opisano wykorzystanie humanizowanych chimerycznych przeciwciał o swoistości skierowanej przeciw ICAM-1 w leczeniu specyficznych i niespecyficznych stanów zapalnych, zakażeń wirusowych oraz astmy oskrzelowej. Zastosowanie przeciwciał anty-ICAM-1 oraz fragmentów cząsteczki ICAM-1 w leczeniu wstrząsu endotoksycznego opisano także w publikacji WO 92/04034 z dnia 19 marca 1992 r. Opis metody leczenia polegającej na zahamowaniu odczynu zapalnego zależnego od ICAM-1 poprzez wprowadzenie przeciwciał antyidiotypowych lub ich fragmentów skierowanych przeciwko ICAM-1 można znaleźć w publikacji WO 92/06119 z dnia 16 kwietnia 1992 r.

Pomimo fundamentalnych odkryć rzucających światło na mechanizmy adhezji komórkowej, jakich dokonano poprzez' identyfikację i charakterystykę białek adhezji międzykomórkowej, takich jak ICAM-1, oraz integryn wzajemnego oddziaływania limfocytów·’, takich jak LFA-1, obraz tych zjawisk nie jest jeszcze pełny. Ogólnie przyjmuje się, iż w procesach zapalnych oraz w mechanizmie ukierunkowanego przemieszczania limfocytów w organizmie uczestniczy wiele innych białek. Dla przykładu, zgłoszenia patentowe USA o numerach seryjnych 07/827 689, 07/889 724, 07/894 061 i 08/009 266 i odpowiadające im opublikowane zgłoszenie PCT WO 93/14776 (z dnia 5 sierpnia 1993) ujawniają metodę klonowania i ekspresji białek pochodnych od cząsteczek ICAM, określanych jako ICAM-R. Zgłoszenia te zostały zacytowane tu jako literatura, a sekwencje DNA oraz sekwencja aminokwasów ICAM-R zostały podane poniżej jako SEK ID nr 4. Ekspresję tego nowego ligandu stwierdzono w ludzkich limfocytach, monocytach oraz granulocytach. '

Z punktu widzenia niniejszego zgłoszenia, najważniejszą jest jeszcze inna cząsteczka powierzchniowa ICAM-podobna wykazująca, w odróżnieniu od pozostałych znanych cząsteczek ICAM, swoistość tkankową. Mori i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 3921-3925 (1987)] doniósł o identyfikacji specyficznego dla kresomózgowia antygenu jaki stwierdził w mózgu królika, swoiście reagującego z przeciwciałem monoklonalnym 271A6. Ten antygen powierzchniowy został nazwany telenkefaliną. Imamura i wsp. [Neurosci. Letts 119: 118-121 (1990)] dla oceny lokalizacji występowania telenkefaliny stosowali przeciwciała poliklonalne. Wynikiem ich badań było stwierdzenie, że ekspresja telenkefaliny w korze wzrokowej kotów wykazuje zmienność zależną od warstwy tkanki oraz, że ekspresja telenkefaliny zmienia się w zależności od stadium rozwojowego. Jednocześnie Oka i wsp. [Neuroscience 35: 93-103 (1990)] przedstawili wyniki badań zmierzających do izolacji telenkefaliny przy użyciu przeciwciała monoklonąlnego 271A6. Wyizolowali oni cząsteczkę powierzchniową o masie cząsteczkowej około 500 kD. Cząsteczka ta składała z czterech podjednostek, każda o masie natywnej molekuły 130 kD, która to pod wpływem N-glikanazy ulegała redukcji do 100 kD. Yoshihiro i wsp. [Neuroscience, Research Supplement 18, str. S83 (1994)] na 17 dorocznym spotkaniu Japońskiego Towarzystwa Nauk Neurologicznych (Japan Neuroscience Society) jakie odbyło się w Nagoi, Japonia, w dniach 7-9 grudnia 1993 r. oraz na 23 dorocznym zjeździe Naukowego Towarzystwa Neurologicznego (Society for Neuroscience), jaki odbył się w Waszyngtonie 9 listopada 1993 r. [Society for Neuroscience Abstracts 19 (1-3) str. 646 (1993)] przedstawili cDNA oraz sekwencję aminokwasową króliczej telenkefaliny. Wydedukowana sekwencja aminokwasowa sugerowała, iż telenkefalina o masie 130 kD stanowi integralne białko błonowe zawierające dziewięć pozakomórkowych domen immunoglobulinopodobnych. Osiem z nich, położone dystalnie wykazywało homologię z domenami immunoglo188 878 bulino-podobnymi charakteryzującymi inne cząsteczki ICAM. Ta sama informacja została następnie opublikowana przez Yoshiharę i wsp. w Neuron 12: 543-553 (1994).

Z naukowego punktu widzenia istnieje stała konieczność prowadzenia badań zmierzających do wykrycia kolejnych białek uczestniczących w procesach interakcji międzykomórkowych. Nieustannie potrzeba też nowych informacji dotyczących identyfikacji tych białek oraz ich charakteryzowania w kontekście struktury aminokwasowej. Co więcej, potencjalne możliwości ich wykorzystania dla nowych metod leczenia oraz dla potrzeb diagnostyki powodują konieczność określenia sekwencji DNA kodującego strukturę tych cząsteczek. Takie brzemienne w skutki informacje mogą między innymi spowodować produkcję na skalę masową białek, pozwolić na identyfikację komórek naturalnie je produkujących, a także umożliwić wytwarzanie przeciwciał lub innych, nowatorskich białek wiążących, swoiście reagujących i/lub hamujących reakcje połączenia ligandu z receptorem w jakich cząsteczki te są zaangażowane.

Krótkie streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób badania przesiewowego pod kątem zmian neuropatologicznych, obejmujący etapy:

a) pozyskania próbki płynu od pierwszej osoby;

b) doprowadzenia do kontaktu próbki i przeciwciała dającego specyficzną reakcję immunologiczną z ICAM-4;

c) oznaczania ilościowego wiązania ICAM-4/przeciwciało w próbce; oraz

d) porównanie wiązania ICAM-4/przeciwciało u tej osoby z inną osobą, o której wiadomo, że nie ma zmian neuropatologicznych, przy czym ICAM-4 jest kodowany przez polinukleotyd wybrany z grupy składającej się z polinukleotydu przedstawionego w SEK NR ID: 27 i polinukleotydu kodującego ICAM-4, który hybryduzuje z polinukleotydem z SEK NR ID: 27.

Korzystnie w sposobie według wynalazku próbką płynu jest surowica lub płyn mózgowo-rdzeniowy.

Ponadto korzystnie wiązanie ICAM-4/przeciwciało jest oznaczane ilościowo poprzez test radioimmunologiczny (RIA) lub poprzez enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA).

Korzystnie zmianą neuropatologinczną pod kątem której jest przeprowadzane badanie jest udar lub epilepsja.

Cząsteczka ICAM-4 może zostać wyizolowana z naturalnych komórek, ale ICAM-4 razem z jej wariantami jest wytwarzana metodami rekombinacji genetycznej przez komórki gospodarza. Korzystną sekwencję aminokwasową polipeptydu ICAM-4 przedstawia sekwencja SEK NR ID: 2. Produkty rekombinacji genetycznej otrzymuje się w postaci polipeptydów częściowo lub całkowicie glikozylowanych, częściowo lub całkowicie deglikozylowanych lub nieglikozylowanych, w zależności od rodzaju komórek gospodarza użytych do produkcji białka ICAM-4 i/lub procedur poizolacyjnych. Warianty cząsteczki ICAM-4 występują w postaci rozpuszczalnej lub nierozpuszczalnej w wodzie, monomerycznej, multimerycznej lub cyklicznych fragmentów ICAM-4 zawierających wszystkie lub tylko część regionów domen, i wykazują właściwości biologiczne lub immunologiczne ICAM-4, takie jak: zdolność wiązania z partnerem wiązania ICAM-4 i/lub zdolność hamowania wiązania ICAM-4 z naturalnym jej partnerem. Warianty ICAM-4 mogą obejmować także analogi polipeptydowe, w których jeden lub większa liczba określonych aminokwasów została usunięta lub zastąpiona: (1) nie powodując utraty, a korzystnie wzmacniając jedną lub więcej funkcji biologicznych lub właściwości immunologicznych charakterystczych dla ICAM-4; lub (2) powodując niezdolność do konkretnego wiązania ligand/receptor. Analogi ICAM-4 mogą również powstawać na skutek wprowadzenia do cząsteczki dodatkowych reszt aminokwasowych (np. lizyny lub cysteiny), co z kolei ułatwia tworzenie struktur multimerycznych.

Przeciwciała wykorzystywne w sposobie według wynalazku (np. przeciwciała monoklonalne i poliklonalne, fragmenty przeciwciał, przeciwciała jednołańcuchowe, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała z przeszczepionym CDR itp.) są swoiste (tzn. nie reagują ani z ICAM-1, ani z ICAM-2 i ICAM-R, do których ICAM-4 jest strukturalnie podobna) wobec ICAM-4 lub wariantów ICAM-4. Przeciwciała takie mogą być wydzielane przez linie hybrydoma, takie jak, na przykład, linie: 127A, 127H, 1731 oraz 179H. Przeciwciała mogą być wytwarzane zarówno z zastosowaniem naturalnych lub rekombinowanych cząsteczek ICAM-4

188 878 jak i wariantów ICAM-4 lub komórek wyrażających je na swojej powierzchni. Będące immunogenami, indukujące odpowiedź immunologiczną, komórki wyrażające takie cząsteczki mogą być komórkami organizmów prokariotycznych lub eukariotycznych, które są stabilnie transformowane sekwencjami DNA kodującymi ICAM-4, w sposób pozwalający na ekspresję w nich potrzebnych polipeptydów.

W kompozycjach do immunizacji oraz do oczyszczania ICAM-4, a także do identyfikacji komórek prezentujących na swojej powierzchni ICAM-4 przydatne są również inne białka wiążące. Można je także wykorzystywać w celach modulacji (tzn. blokowania, hamowania lub stymulacji) biologicznych aktywności wiązania ligand/receptor, w których bierze udział ICAM-4, w szczególności funkcji efektorowych ICAM-4, które odgrywają rolę w swoistej i nieswoistej odpowiedzi układu odpornościowego. Przeciwciała antyidiotypowe swoiste wobec przeciwciał skierowanych przeciwko ICAM-4 mogą być stosowane do modulacji odpowiedzi immunologicznej. Testy na wykrywanie oraz ilościową ocenę obecności ICAM-4 na powierzchni komórek oraz w płynach ustrojowych, takich jak surowica czy płyn mózgowordzeniowy, mogą obejmować np. pojedyncze lub wielokrotne przeciwciała wykorzystywane w systemach badania typu „sandwicz” („kanapkowego”). W wykrywaniu ICAM-4 w płynach ustrojowych przeciwciała są użyteczne do oceny występowania patologii w obrębie układu nerwowego, które mogą odpowiadać zwiększonemu poziomowi ICAM-4 w krwiobiegu. Takie stany patologiczne obejmują, ale nie wyłącznie, niedokrwienie mózgu (np. udar) spowodowane różnymi chorobami, w tym np. zatorowość, zakrzepicę itp.

Znajomość sekwencji cDNA dla ICAM-4 umożliwia izolację sekwencji genomowego DNA kodującego ICAM-4 poprzez hybrydyzację DNA/DNA oraz umożliwia poznanie sekwencji kontrolujących ekspresję ICAM-4, takich jak promotory, operatory itp. Procedury hybrydyzacji DNA/DNA prowadzone przy użyciu sekwencji DNA ICAM-4 i w ostrych warunkach hybrydyzacji, pozwalają na izolację wielu DNA kodujących alleliczne warianty ICAM-4, inne strukturalnie pokrewne białka posiadające jedną lub więcej biologicznych i/lub immunologicznych właściwości ICAM-4 oraz białek homologicznych z ICAM-4 pochodzących z innych gatunków. DNA jest także przydatny w teście hybrydyzacji DNA/RNA służącym ocenie zdolności komórek do syntezy ICAM-4. Także uzyskane polinukleotydy antysensowe posiadają znaczenie w regulacji ekspresji ICAM-4 przez komórki, w których normalnie zachodzi taka ekspresja.

Jak to można wykazać w innej serii przykładów, znajomość sekwencji DNA oraz sekwencji aminokwasowej ICAM-4 umożliwia wytwarzanie metodami rekombinacji DNA wariantów ICAM-4 takich jak białka hybrydowe (czasami określane jako „immuno-adhezyny”) charakteryzujące się obecnością sekwencji białkowych ICAM-4 oraz ciężkich łańcuchów regionu stałego lub/i regionu zawiasowego immunoglobulin, patrz: Capon i wsp., Nature 337: 525-531 (1989); Ashkenazi i wsp., P.N.A.S. (USA) 88: 10535-10539 (1991); oraz PCT WO 89/02922 opublikowany 6 kwietnia 1989 r. Warianty białek fuzyjnych ICAM-4 mogą także zawierać, np. wybrane domeny zewnątrzkomorkowe ICAM-4 oraz części innych komórkowych cząstek adhezyjnych.

Przeciwciała antyidiotypowe mogą reprezentować nową klasę biologicznie aktywnych ekwiwalentów ICAM-4. Testy wykonywane in vitro do identyfikacji przeciwciał lub innych związków modulujących aktywność ICAM-4 mogą obejmować, np. unieruchamianie ICAM-4 lub naturalnego ligandu, z którym wiąże się ICAM-4, umożliwiające wykrywanie znakowania nie unieruchomionego partnera wiązania, inkubowanie razem partnerów wiązania i określanie wpływu badanego związku na ilość znakowanego wiązania, przy czym zmniejszenie znakowanego wiązania w obecności badanego związku w porównaniu z ilością znakowanego wiązania w nieobecności badanego związku, wskazuje, że badany czynnik jest inhibitorem wiązania ICAM-4.

Szczegółowy opis wynalazku

Ujawnienia w macierzystym zgłoszeniu patentowym USA nr 08/102852, zgłoszonym 5 sierpnia 1993 są szczegółowo włączone przez odniesienie. Przykłady z tego zgłoszenia dotyczą między innymi: projektowania i konstruowania sond oligonukleotydowych do powielania metodą PCR DNA związanych z ICAM, zastosowania sond do powielania ludzkiego genomowego fragmentu homologicznego, ale różniącego się od DNA kodującego ICAM-1

188 878 i ICAM-2, przeszukiwania bibliotek cDNA genomowym fragmentem celem wyizolowania dodatkowych sekwencji kodujących ICAM, przeszukiwania bibliotek cDNA celem wyizolowania pełnej sekwencji ludzkiego cDNA kodującego ICAM-R, charakteryzowania informacji o DNA i sekwencji aminokwasowej pod kątem ICAM-R, a w szczególności ICAM-1 i ICAM-2, wytwarzania ssaczych komórek gospodarza wyrażających ICAM-R, mierzenia udziału ICAM-R w procesie adhezji, obejmującym szlaki zależne od Cd 18 i niezależne od CDI 8, hamowania adhezji do ICAM-R przez polipeptydy wywodzące się od ICAM-R, ekspresji odmian ICAM-R, wytwarzania i charakteryzowania przeciwciał przeciw ICAM-R i ich fragmentów, mapowania epitopów rozpoznawanych przez przeciwciała monoklonalne przeciw ICAM-R, pomiaru dystrybucji i biochemicznego charakteryzowania ICAM-R i kodującego go RNA, mierzenia ICAM-R przy adhezji komórek danego typu i aktywacji/namnażaniu komórek opornościowych, charakteryzowania przeciwciał monoklonalnych dla ICAM-R oraz pomiaru różnicowej fosforylacji i powiązania cytoplazmatycznej domeny ICAM-R z cytoszkieletem. Ujawniono również identyfikację DNA kodującego ICAM ze szczura, który wówczas okazał się być szczurzym homologiem ludzkiego ICAM-R oraz zastosowanie tego DNA do konstruowania i wyrażania DNA kodujących fuzje białkowe z transferazą S-glutationu. Szczegółowy opis w jaki sposób taki DNA szczura był zidentyfikowany można znaleźć w macierzystym zgłoszeniu (USA Nr 08/102 852) w przykładzie 6 i jest tu zaprezentowany jako przykład 1. Po zidentyfikowaniu dalszej sekwencji kodującej ICAM, okazało się że DNA dla ICAM ze szczura nie koduje homologu szczurzego ludzkiego ICAM-R, ale faktycznie koduje nowy polipeptyd ICAM, nazwany tu ICAM-4. W celu pokazania zdarzeń prowadzących do identyfikacji ICAM-4, przedstawiono chronologię, po której następuje szczegółowy opis wynalazku.

Pierwsza zidentyfikowana genomowa sekwencja ICAM-4 ze szczura kodowała region homologiczny do domeny 2 (tutaj SEK NR ID: 3, a SEK NR ID: 23 w Patencie USA Nr 08/102 852) ludzkiego ICAM-R (tutaj SEK NR ID: 4). Zidentyfikowano również drugi, zachodzący genomowy DNA (tutaj SEK NR ID: 5, a SEK NR ID: 26 w Patencie USA Nr 08/102 852), który kodował zarówno region domeny 2 z SEK NR ID: 3, jak i sekwencje dla ICAM-1. Stosując SEK NR ID: 3 jako sondę zidentyfikowano cDNA ze śledziony szczura (tutaj SEK NR ID: 6, a SEK NR ID: 25 w Patencie USA Nr 08/102 852), który kodował domeny od 2 do 5, jak również domenę piątą, wcześniej nie obserwowaną jako domena ICAM. W tym czasie te nowo zidentyfikowane DNA szczura okazały się kodować homolog ludzkiego ICAM-4 szczura, jakkolwiek dopasowanie regionów 3' tych DNA do innych ICAM okazało się trudne.

Następująca później izolacja klonu cDNA o długości 1 kb z biblioteki ze śledziony szczura i powielenie fragmentu poprzez RT-PCR wykazały, że część zarówno klonów cDNA, jak i genomowych nie została zsekwencjonowana. Inny produkt powielania RT-PCR (SEK NR ID: 7) potwierdził ten brak. Stwierdzono, że fragment o długości 177 bp został wycięty z klonów genomowych i cDNA poprzez trawienie klonów EcoRI celem izolowania tych sekwencji z faga X, do badań nad sekwencją. Ponowna analiza SEK NR ID: 5 i 6 pod kątem tych sekwencji umożliwiła identyfikację bardziej dokładnej i pełnej sekwencji oryginalnie wyizolowanych klonów genomowych i cDNA, przedstawionych tu w postaci poprawionej jako SEK NR ID: 8 i 9.

W celu zidentyfikowania pełnej sekwencji kodującej dla ICAM-R, wyizolowano cDNA ze szczurzego mózgu (SEK NR ID: 10) i oznaczono sekwencję końca 5' poprzez powielenie końca 5' cDNA metodą rapid (5' RACE), produkt amplifkacji przedstawiono w SEK NR ID: 11. Zestawienie danych dla klonu RT-PCR (SEK NR ID: 7), cDNA z mózgu (SEK NR ID: 10) i produktu amplifikacji RACE (SEK NR ID: 11) umożliwiło identyfikację pełnej sekwencji kodującej dla ICAM-4 (SEK NR ID: 1). Niniejszy wynalazek jest zatem zilustrowany przez następujące przykłady. Bardziej szczegółowo, przykład 1 dotyczy klonowania części DNA dla ICAM-4. Przykład 2 opisuje analizę metodą Northern transkrypcji szczurzego ICAM-4. Przykład 3 opisuje izolację szczurzego cDNA pełnej długości dla ICAM-4. Przykład 4 dotyczy hybrydyzacji in situ szczurzego ICAM-4 w tkance mózgowej. Przykład 5 dotyczy wytwarzania ftizji białkowych ICAM-4 w organizmach prokariotycznych. Przykład 6 opisuje wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał specyficznych wobec fuzji białkowych: szczurzy ICAM4/GST. Przykład 7 opisuje ekspresję rozpuszczalnych szczurzych białek ICAM-4 w bakulowi8

188 878 rasowym systemie ekspresyjnym. Przykład 8 dotyczy wytwarzania monoklonąlnych przeciwciał specyficznych wobec szczurzego ICAM-4 wyrażanego w systemie bakulowirasowym. Przykład 9 opisuje analizę immunocytochemiczną ekspresji ICAM-4. Przykład 10 dotyczy klonowania ludzkiego genomowego DNA kodującego ICAM-4. Przykład 11 dotyczy klonowania ludzkiego cDNA kodującego ICAM-4. Przykład 12 opisuje analizę ekspresji ludzkiego ICAM-4 metodą Northern. Przykład 13 opisuje wytwarzanie fuzji białkowych: ludzki ICAM4/GST. Przykład 14 dotyczy wytwarzania przeciwciał monoklonąlnych specyficznych wobec ludzkiego ICAM-4. Przykład 15 opisuje opracowanie testu wyłapującego dla określania stężenia rozpuszczalnego ICAM-4 w poszczególnych płynach. Przykład 16 stosuje test wyłapujący do pomiaru stężenia ICAM-4 w surowicy pacjentów po udarze. Przykład 17 dotyczy pomiaru transkrypcji ICAM-4 w modelu epilepsji szczurzej. Przykład 18 dotyczy klonowania regionu promotorowego ludzkiego ICAM-4.

Przykład 1

Klonowanie szczurzego DNA dla białka ICAM-pokrewnego

A. Izolacja szczurzego genomowego DNA dla domeny 2 białka ICAM-pokrewnego.

Szczurza biblioteka genomowa, skonstruowana w wektorze λ EMBL3, była przeszukiwana sondą wyznakowaną [³²P], otrzymaną metodą PCR na matrycy DNA kodującego ludzką domenę 2 ICAM-3. Sekwencja nukleotydowa tej sondy jest przedstawiona w SEK. NR ID: 12. Łysinki z biblioteki przenoszono na filtry nylonowe Hybond N+ (Amersham, Arlington Heights, IL). Przeszukiwanie wszystkich bibliotek cDNA i genomowych prowadzono według standardowych przepisów. Prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzano w roztworze: 4050% formamid, 5 X Denhardt, 5 X SSPE i 1,0% SDS w temp. 42°C. Sondy, wyznakowane [³²P], dodawano do stężenia 10⁵-10⁶ cpm/ml roztworu hybrydyzacyjnego. Po 16-18 godzinach hybrydyzacji, filtry nylonowe obficie płukano w temperaturze pokojowej w 2 X SSPE z 0,1% SDS, a następnie eksponowano błony Rtg w -80°C przez noc. Pozytywne łysinki poddawano jednej lub kilku random hybrydyzacji w celu otrzymania klonu fagowego. DNA otrzymany z lizatu klonu pozytywnego subkłonowano w wektorze pBS+ i sekwencjonowano.

Pierwszy klon genomowy kodujący ICAM-pokrewną szczurzą domenę 2, zidentyfikowany na podstawie znalezionej homologii do obszarów domeny 2 innych członków rodziny ICAM (patrz dla przykładu tabela 1 ze Zgłoszenia Patentowego USA Nr 08/102,852), różnił się od wcześniej opisanej sekwencji szczurzego ICAM-1 [Kita i wsp., Biochem. Biophys. Acta 1131:108-110 (1992)], czy mysiego ICAM-2 [Xu i wsp., J. Immunol. 149:2560-2565 (1992)]. Sekwencja nukleotydowa i przewidziana sekwencja aminokwasowa tego klonu zostały ujawnione w równoległych zgłoszeniach macierzystych w stosunku do niniejszego zgłoszenia jako znaczące odmiany szczurzego ICAM-R i były przedstawione odpowiednio jako SEK NR ID:23 i 24 w Zgłoszeniu Patentowym USA Nr 08/102 852. Tutaj te same sekwencje są przedstawione odpowiednio jako SEK NR ID: 3 i 13.

Przy użyciu tej samej sondy zidentyfikowano dragi, zachodzący klon i ustalono, że posiada on sekwencje domeny 2 ICAM z SEK NR ID: 3 oraz koniec 5' DNA kodujący przynajmniej fragment szczurzego ICAM-1. Sekwencja nukleotydowa tego klonu została przedstawiona w równoległym zgłoszeniu macierzystym w stosunku do niniejszego zgłoszenia jako SEK. NR ID: 26 i jest pi-zedstawiona tutaj jako SEK NR ID:5. Drugi klon wskazuje na to, że fragment ICAM-pokrewnego genu z klonu pierwszego i gen kodujący szczurzy ICAM-1 są zlokalizowane na tym samym chromosomie szczura w odległości 5 kb.

B. Izolacja cDNA dla białka ICAM-pokrewnego ze szczura

W celu zidentyfikowania kompletnej sekwencji kodującej białko ICAM-pokrewne, wyznakowany [³²P] DNA kodujący domenę 2 ze szczurzego klonu genomowego, zidentyfikowanego w Sekcji A (SEK NR ID:3), powyżej, został użyty do przeszukania szeregu bibliotek cDNA z różnych typów komórek szczurzych i mysich, w tym szczurzych makrofagów (Clontech, Pało Alto, CA), limfocytów krwi obwodowej (PBL) (Clontech), limfocytów T (skonstruowanych przez zespół) i komórek śledziony (Clontech) oraz mysich PBL (Clontech), limfocytów T (skonstruowanych przez zespół) i limfocytów B (skonstruowanych przez zespół).

W bibliotece cDNA ze śledziony zidentyfikowano pojedynczy kłoń (Clontech), który zawierał pięć domen Ig-podobnych, z których cztery były homologiczne do domen od 2 do 5

188 878 zarówno w ICAM-1, jak i ICAM-R. Co więcej, klon ten zawierał koniec 3' DNA kodujący piątą domenę Ig-podobną która nie była poprzednio zidentyfikowana w żadnym innym peptydzie ICAM. Dodatkowo, zawarta w tym klonie nietypowa sekwencja na końcu 3', później zdeterminowana jako częściowy intron (dyskutowane poniżej), leżący pomiędzy domeną 4 i 5 sugeruje, że klon ten jest produktem niedojrzałego lub nie prawidłowo złożonego transkryptu. Obecność unikatowej domeny i wykazanie, że obszaru 3' nie daje się dobrze dopasować do innych znanych sekwencji ICAM sugeruje, że DNA dla białka ICAM-pokrewnego może kodować nowy szczurzy polipeptyd ICAM. Sekwencja nukleotydową tego klonu została przedstawiona jako SEK NR ID:25 w zgłoszeniu macierzystym w stosunku do niniejszego zgłoszenia; tutaj sekwencja nukleotydową klonu cDNA ze śledziony jest przedstawiona jako SEK NR ID: 6.

C. Powtórna analiza cDNA i DNA genomowego ze szczura

Po złożeniu 5 sierpnia 1993 Zgłoszenia Patentowego USA Nr 08/102 852 ustalono, że częściowy klon cDNA ze śledziony szczura (SEK NR ID:25 w zgłoszeniu macierzystym i SEK NR ID:6 tutaj) oraz genomowy klon z wątroby szczura (SEK NR ID:26 w zgłoszeniu macierzystym i SEK NR ID:5 tutaj) nie posiadały wewnętrznego fragmentu EcoRI o długości 177 bp, który był częścią każdego z tych klonów, lecz został zgubiony podczas etapu subklonowania, kiedy wstawki z biblioteki wycinano z wektora λ poprzez trawienie EcoRI i włączano poprzez ligację do wektora używanego do sekwencj ono wania. Obserwacja, że w klonach cDŃA i genomowym został zgubiony fragment sekwencji kodującej wynikała z dopasowania szczurzej sekwencji genomowej i cDNA do różnych produktów amplifikacji RT-PCR, włączając w to SEK NR ID:7, które uwidoczniło lukę w sekwencji DNA ze szczura.

Kolejna izolacja i dopasowanie sekwencji cDNA z biblioteki śledziony, przy użyciu klonu cDNA śledziony (SEK NR ID:6) jako sondy, potwierdziły pierwotne przypuszczenia, że nie został zsekwencjonowany fragment klonu cDNA i genomowego ze śledziony. Dalsze, oczywiste potwierdzenie otrzymano po amplifikacji fragmentu łączącego domeny od 3 do 5 metodą RT-PCR, przy użyciu startera 5' (RRD3 5' Xho, zawierającego na końcu 5' miejsce restrykcyjne Xhol dla ułatwienia klonowania), pokazanego jako SEK NR ID: 14, oraz startera 3' (RRD5 3' Hind, zawierającego miejsce restrykcyjne Hindlll dla ułatwienia klonowania), pokazanego jako SEK NR ID: 15.

GAACTCGAGGCCATGCCTCCACTTTCC (SEK NR ID: 14) CCATAAGCTTTATTCCACCGTGACAGCCAC (SEK NR ID: 15)

Dopasowanie obu omawianych sekwencji DNA w sposób jednoznaczny pokazało, że klony cDNA i genomowy utraciły fragment DNA jeszcze przed sekwencj ono waniem; znalazło to potwierdzenie po odczytaniu sekwencji DNA RT-PCR, dyskutowanym poniżej. Stwierdzono, że trawienie restrykcyjne EcoRI wycinające fragmenty cDNA i genomowe z DNA faga λ przed sekwencj ono waniem, spowodowało wycięcie fragmentu o długości 177 bp, który nie uwidaczniał się podczas rozdzielania w żelu agarozowym. Kolejna analiza sekwencji potwierdziła obecność dwóch miejsc EcoRI ograniczających fragment 177bp w obu wyjściowych klonach.

Fragment EcoRI o długości 177 bp jest położony pomiędzy nukleotydami 719 i 896 w częściowym klonie cDNA ze szczura, jak pokazano w SEK NR ID: 9, a pomiędzy nukleoty darni 2812 i 2989 w częściowym klonie genomowym, jak pokazano w SEK NR ID: 8.

D. DNA izolowany przy zastosowaniu klonu z RT-PCR

RT-PCR został wykorzystany do otrzymania kompletnej informacji o sekwencji genu dla białka ICAM-pokrewnego ze szczura. Znajomość sekwencji klonu genomowego (SEK NR ID:3) wykorzystano do zaprojektowania starterów komplementarnych do obszaru 5' odcinka kodującego białko, ustalonego na podstawie klonu cDNA oraz antysensownego startera zaprojektowanego jako komplementarny do sekwencji kodujących i regionów 3' w stosunku do sekwencji kodującej w klonie cDNA (SEK NR ID: 6).

Matrycowy cDNA do reakcji PCR przygotowywano w sposób następujący. Około 2 pg RNA poły A⁺ izolowanego z komórek śledziony szczura denaturowano przez grzanie w 65°C w objętości 10 pl. Po denaturacji dodawano 0,1 pl RNazyny (Invitrogen, San Diego, CA), 5 pl 5X buforu

188 878 do RTazy (BRL, Bethesda, MD), 2 μΐ losowych heksamerów (pd(N)ó w 100 pg/ml) (Pharmacia, Piscataway, NJ), 6 μΐ, dNTP (2 mM każdy) i 2 (il RTazy AMV (BRL); reakcję prowadzono w temperaturze 42°C przez 60-90 min. Mieszaniny reakcyjne przechowywano w -20°C do momentu użycia.

Przeprowadzano wstępne serie doświadczeń w ceiu zidentyfikowania par starterów oligonukleotydowych dających produkt amplifikacji w reakcjach PCR przy użyciu cDNA ze śledziony szczura. Różne sensowne startery 5' były dobierane w pary ze starterami 3' zaprojektowanymi jako komplementarne do wewnętrznej sekwencji kodującej; starter 3' oznaczono jako RRD2 3-1 i przedstawiono w SEK NR iD: 16.

AACGTGCGGAGCTGTCTG (SEK NR ID: 16) (W ostatecznie wyizolowanym produkcie RT-PCR, SEK NR ID:7, poniżej, starter RRD2 3-1 odpowiada nukleotydom 719 do 736.) Podobnie, różne antysensowne startery 3' dobierano w pary ze starterami 5' zaprojektowanymi jako komplementarne do innej sekwencji kodującej; starter 5' w tych reakcjach oznaczono jako RGen3900S i pokazano w SEK NR ID: 17.

ACGGAATTCGAAGCCATCAACGCCAGG (SEK NR ID: 17) (W SEK NR ID:7, poniżej, starter RGen3900S odpowiada nukleotydom 1719 do 1736). W oparciu o wielkości powielonych produktów i zdolności tych produktów do hybrydyzacji z częściowym klonem cDNA, ustalono jedną parę starterów jako najbardziej wydajną i używano jej w kolejnych reakcjach powielania PCR. Starter 5' oznaczono jako RGen780S (SEK NR ID: 18), a starter 3' oznaczono jako RGen4550AS (SEK NR ID: 19).

(SEK NR CATGAATTCCGAATCTTGAGTGGGATG (SEK NR ID: 18) ATAGAATrCCTCGGGACACCTGTAGCC (SEK NR ID: 19) (W SEK NR ID:7, poniżej, starter RGen780S odpowiada nukle-otydom od 1 do 18, a starter RGen4550AS odpowiada nukleotydom od 2197 do 2214.)

Taka para starterów została użyta w reakcjach PCR prowadzonych w różnych warunkach celem optymalizacji reakcji amplifikacji. W sumie użyto 15 buforów różniących się wartościami pH i stężeniem Mig’’ i zastosowano dwie różne temperatury przyłączania starterów; próbki produktu otrzymanego w każdej z reakcji rozdzielano w 1% żelu agarozowym. Ponieważ produkty amplifikacji PCR z różnych warunków reakcji mogły nie być widoczne w żelu barwionym bromkiem etydyny, do wykrywania produktów PCR wykorzystano bardziej czułą metodę Southema.

Część powielonego DNA rozdzielano elektroforetycznie w żelu, przenoszono na filtr nylonowy Hybond N+ stosując standardową technikę z zastosowaniem kompresu ssącego i hybrydyzowano z pełnym cDNA ze szczura wyznakowanym [³²P]. Zastosowano warunki hybrydyzacji zasadniczo takie, jak opisano dla procedury przeszukiwania biblioteki w Sekcji A, powyżej. Autoradiogramy wykazały, że niewielka ilość DNA o wielkości około 2,2 kb była wytwarzana w dwóch reakcjach, więc pozostałe produkty obu reakcji rozdzielono w żelu agarozowym. Pomimo, że nie widziano w sposób oczywisty prążka DNA, fragment 2,2 kb eluowano z żelu i używano jako matrycy w kolejnej reakcji PCR przy zastosowaniu tych samych starterów (SEK NR ID: 18 i 19), buforu Tris-HCl pH 8,0, zawierającego ImM Mg++ przyłączanie starterów prowadzono w temperaturze 55°C. Produkt amplifikacji z drugiej rundy PCR, widoczny w żelu, eluowano i klonowano w wektorze pBS+ (Stratagene, La Jola,CA) w celu przeprowadzenia analizy sekwencji.

Ustalono, że otrzymany klon RT-PCR zawiera 2214 bp, jak pokazano w SEK NR ID: 7. Klon ten koduje domeny od 2 do 6 znalezione w klonie cDNA ze śledziony szczura oraz dodatkową N-końcową domenę 1, dodatkową C-końcową domenę 7 i fragment o wielkości 164 bp, który wydaje się być dalszą C-końcową domeną 8. Tuż przed domeną 1 na końcu 5' występuje dodatkowa sekwencja 144 bp pochodząca przypuszczalnie z intronu leżącego pomiędzy sekwencją liderową i pierwszą domeną. Klon ten nie zawiera sekwencji lidera na końcu 5' oraz regionu transbłonowego i cytoplazmatycznego na końcu 3'. Dodatkowo oprócz poprzednio zidentyfikowanej domeny 6 w klonie cDNA ze śledziony, zidentyfikowano domenę siódmą i ósmą w klonie RT-PCR, co stanowi podstawę hipotezy, że klon ten jest nowym szczurzym ICAM.

188 878

Przykład 2

Analiza metodą Northern

W celu dalszego zbadania możliwości, że klony ICAM-pokrewne zidentyfikowane w przykładzie 1 kodują nowy polipeptyd ICAM, co sugerują unikatowe domeny Ig-podobne, analizowano specyficzną tkankowo ekspresję tego genu metodą Northern, pozwalającą na porównanie otrzymanych wyników z wcześniej opublikowanymi danymi dla ludzkich ICAM [ICAM-1. Dustin i wsp., J. Immunol. 137:245-254 (1986); ICAM-R, de Fourgerolles i Springer, J.Exp.Med. 175:185-190 (1992)].

Całkowity komórkowy RNA z płuc, mózgu, rdzenia kręgowego, wątroby, przewodu pokarmowego, grasicy, węzłów chłonnych i śledziony szczura otrzymywano przy użyciu odczynników do izolacji RNA STAT60 (Tel-test „B”, Inc. Friendswood, Texas), zgodnie z przepisem producenta. RNA poli A+ izolowano z całkowitego RNA przy użyciu kolumienek z oligo dT celulozą. Około 5pg RNA otrzymanego z każdego rodzaju tkanki rozdzielano w 1% żelu agarozowym, zawierającym formaldehyd i przenoszono na filtr nitrocelulozowy Hybond-C (Amersham).

Fragment cDNA ze śledziony szczura z przykładu 1, odpowiadający domenie od 2 do 4 (nukleotydy od 1 do 724 w SEK NR ID:6) subklonowano w wektorze pBluscript SK+ (Stratagene), a następnie otrzymywano antysensowną sondę RNA przy zastosowaniu transkrypcji in vitro, z użyciem UTP wyznakowanego ³²P i około 500 ng liniowej matrycy, stosownie do przepisu producenta (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Filtry z przyłączonym RNA prehybrydyzowano w roztworze zawierającym 50% formamid, 5 X SSC, 1 X Pe (50 mM TrisHC1 pH 7,5, 0,1% pirofosforan sodu, 0,2% poliwinylopirolidon, 0,2% fikol, 5 mM EDTA, 1% SDS) oraz zdenaturowany DNA ze spermy łososia w stężeniu 150 pg/ml. Wyznakowaną radioaktywnie sondę denaturowano przez gotowanie i dodawano do roztworu prehybrydyzacyjnego do końcowego stężenia 1x 10⁶ cpm/ml. Hybrydyzację prowadzono przez 16-18 godzin w 65°C. Następnie filtry płukano w 65°C w 2 X SSC zawierającym 0,1% SDS i eksponowano stosując błony Rtg przez 3-16 godzin.

Analiza metodą Northern wykazała, że ICAM-pokrewny cD-NA zidentyfikowany w przykładzie 1 ulega ekspresji jedynie w mózgu szczura. Ta specyficzność tkankowa nie była poprzednio opisywana dla żadnego z innych polipeptydów ICAM. Wzór ekspiesji, w kombinacji z unikatowymi domenami Ig-podobnymi, nie znalezionymi w innych polipeptydach ICAM wskazuje, że klon ICAM-pokrewny jest nowym członkiem rodziny białek ICAM i został nazwany ICAM-4.

Fakt, że zidentyfikowane początkowo klony cDNA wykryto w bibliotece ze śledziony szczura sugeruje, że w części komórek śledziony gen ICAM-4 ulega ekspresji na niskim po ziomie.

Jednakże, nie udało się wykryć klonu w prawidłowy sposób złożonego w wielu bibliotekach cDNA z komórek krwiotwórczych, co pozwala wątpić czy białko ICAM-4 jest rzeczywiście wyrażane w tkankach innych od mózgu. Jednym z wytłumaczeń wykrywania ICAM-4 cDNA w śledzionie jest możliwość powielenia śladowej ilości transkryptu w bardzo czułej reakcji PCR, nawet jeśli tkanki te nie wytwarzają kodowanego białka.

Przykład 3

Izolacja pełnej długości szczurzego cDNAdla ICAM-4

A. Identyfikacja klonu cDNA z mózgu szczura

Z uwagi na specyficzną tkankowo ekspresję ICAM-4, mRNA pochodzący z tkanki mózgowej wykorzystano przy próbach izolacji pełnej długości cDNA kodującego ICAM-4. Dwie sondy, jedną, komplementarną do domeny od 1 do 2 oraz drugą, komplementarną do domeny od 3 do 5 klonu cDNA ze śledziony, zidentyfikowanego w przykładzie 1 (SEK NR ID:7), wyznakowano i użyto do przeszukiwania biblioteki cDNA z mózgu szczura, skonstruowanej w wektorze Xgt10, otrzymanej uprzednio w naszym zespole. Warunki hybrydyzacji opisano w przykładzie 1, a pozytywne łysinki poddawano jednej lub kilku rundom hybrydyzacji w celu otrzymania klonu fagowego.

Zidentyfikowano dziewięć pozytywnych klonów, z których dwa hybrydyzowały z obiema sondami. Najdłuższy z otrzymanych klonów, oznaczony jako klon 7, zawierający 2550 bp,

188 878 koduje cztery domeny Ig-podobne, które występują w sondzie cDNA. Dodatkowo klon 7 koduje cztery inne domeny Ig-podobne, które nie występują w sondzie. Zdentyfikowano przypuszczalną domenę transbłonową i cytoplazmatyczną, po których występuje kodon stop, sygnał poliadenylacji i ogon poli A. Klon 7 utracił co najmniej jedną domenę Ig-podobną na końcu 5', co ustalono porównując z klonem RT-PCR (SEK NR ID: 7), jak również utracił sekwencję liderową; ponowne przeszukanie biblioteki nie ujawniło dłuższego klonu, który posiadałby wspomniane sekwencje. Sekwencja nukleotydowa klonu 7 jest pokazana w SEK NR ID: 10.

B. Ustalenie końca 5'

W celu wyizolowania domeny 1 i innych sekwencji z końca 5', wykorzystano technikę PCR zwaną 5' RACE ( ang. Rapid Amplification of cDNA Ends) [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis i wsp., wyd. Academic Press: New York (1990) str. 28-38] z wykorzystaniem zestawu do 5' RACE (Clontech). Technika ta wykorzystuje wewnętrzny starter, który jest używany w parze z drugim starterem komplementarnym do sekwencji adapterowej, dołączonej do końca 5' cząsteczek cDNA z biblioteki. Reakcja PCR z tym starterem umożliwi amplifikację i identyfikację brakującej sekwencji. Informacja na temat zachodzących na siebie sekwencji pozwoli na utworzenie pełnej sekwencji tego genu.

cDNA z mózgu szczura przygotowany techniką RACE (dostarczony z zestawem) został użyty w reakcji PCR z wykorzystaniem oligonukleotydu z zestawu i antysensownego startera opartego na wewnętrznej sekwencji ICAM-4. Antysensowny starter 3', oznaczony jako Spot714AS, został nazwany stosownie do sekwencji domeny 4 z ICAM-4 i pokazany w SEK NR ID:20.

CARGGTGACAAGGGCTCG (SEK NR ID:20)

Produkt otrzymany w wyniku amplifikacji, z wykorzystaniem pary tych starterów był następnie użyty w drugiej reakcji PCR, w której wykorzystano ten sam starter 5' z zestawu oraz starter 3' komplementarny do rejonu domeny lw ICAM-4. Drugi starter 3' oznaczono jako RRACE2 i pokazano w sEk NR ID:21.

TATGAATTCAGTTGAGCCACAGCGAGC (SEK NR ID:21)

Każdy ze starterów użyty w drugiej reakcji PCR zawierał miejsce restrykcyjne EcoRI ułatwiające klonowanie w wektorze pBS+ (Stratagene) produktów otrzymanych w wyniku amplifikacji. Otrzymany plazmidowy DNA, który zawierał koniec 5' genu został zidentyfikowany poprzez hybrydyzację do sondy zawierającej domeny 1 i 2 szczurzego ICAM-4, odpowiadającej nukleotydom od 1 do 736 w SEK NR ID:7. Na podstawie otrzymanego produktu amplifikacji ustalono częściową informację o sekwencji domeny 1 i hydrofobowego lidera.

Produkt otrzymany metodą 5' RACE jest fragmentem o długości 222 bp zawierającym 60 bp przed pierwszym kodonem dla metioniny, sekwencję liderową o długości 82 bp i sekwencję domeny 1 o długości 80 bp. Produkt powielania pokazano w SEK NR ID: 11.

C. Sekwencja szczurzego ICAM-4 pełnej długości

Na podstawie informacji o sekwencji, pochodzącej z metody 5' RACE (SEK NR ID: 11), klonu RT-PCR (SEK NR ID:7) i klonu 7 niosącego cDNA z mózgu (SEK NR ID: 10), skonstruowano złożony klon o pełnej długości. Ustalono, że szczurzy gen ICAM-4 pełnej długości zawiera 2985 bp z pojedynczą ramką odczytu kodującą białko złożone z 917 aminokwasów. Przypuszczalna sekwencja Kozak położona jest powyżej kodonu dla metioniny i sekwencji liderowej. Za 27-aminokwasowym, hydrofobowym liderem występuje dziewięć domen Igpodobnych, region transbłonowy i zawierający 58 aminokwasów cytoplazmatyczny ogon. Złożony cDNA dla ICAM-4 pokazano w SEK NR ID:1, a ustalona sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest jako SEK NR ID:2.

Podobnie jak inne polipeptydy ICAM, ICAM-4 zawiera domenę zewnątrzkomórkową, transbłonową i cytoplazmatyczną. W zewnątrzkomórkowej domenie ICAM-4 koniec N stanowi sekwencja liderową, obejmująca aminokwasy od 1 do 27, po których następuje dziewięć immunoglobulinowych domen(Ig)-podobnych charakterystycznych dla ICAM-4, które w ICAM-1, ICAM-2 i ICAM-R zawierają odpowiednio pięć, dwie i pięć zewnątrzkomórkowych domen Ig-podobnych. W ICAM-4 domena 1 obejmuje aminokwasy od 28 do 118;

188 878 domena 2 obejmuje aminokwasy od 119 do 224; domena 3 obejmuje aminokwasy od 225 do 321; domena 4 obejmuje aminokwasy od 322 do 405; domena obejmuje aminokwasy od 406 do 488; domena 6 obejmuje aminokwasy od 489 do 569; domena 6 obejmuje aminokwasy do 570 do 662; domena 8 obejmuje aminokwasy od 663 do 742 i domena 9 obejmuje aminokwasy od 743 do 830. W każdej z domen tworzona jest charakterystyczna struktura „pętli” dzięki mostkom dwusiarczkowym powstającym pomiędzy resztami cysternowymi, rozmieszczonymi zazwyczaj na dwóch przeciwległych końcach sekwencji aminokwasowej. Na inne cechy strukturalne ICAM-4 składają się transbłonowy region obejmujący aminokwasy od 831 do 859 i cytoplazmatyczny rejon obejmujący aminokwasy od 860 do 917.

Porównanie homologii sekwencji aminokwasowej każdej z domen szczurzego ICAM-4 z innymi członkami rodziny ICAM ograniczono do odpowiednich sekwencji ludzkich ICAM-1, I-CAM-2 i ICAM-R ponieważ informacje o sekwencji dla trzech szczurzych homologów nie były wcześniej publikowane. W pierwszej domenie szczurzy ICAM-4 wykazuje odpowiednio 21, 30 i 28 procent identyczności z ludzkimi ICAM-1, ICAM-2 i ICAM-R. Druga domena jest silniej konserwowana i posiada 60, 42 i 62 procent identyczności odpowiednio z ICAM-1, -2 i -3. Domeny 3-5 wykazują odpowiednio procent identyczności 48, 49 i 40 z ICAM-1 i 60, 59

29 odpowiednio z ICAM-R. Interesujące, że szczurze domeny od 4 do 6 ICAM-4 wykazują najsilniejszą homologię z domeną 5 (wahające się w zakresie 29-42% identyczności) i jest możliwe, że powstały one w wyniku duplikacji segmentu genu. Dziewiąta i końcowa zewnątrzkomórkowa domena wykazuje niskie podobieństwo do innych domen ICAM, lecz posiada 22% identyczności z 3-cią i 6-tą domeną ludzkiego VCAM-1, innego członka rodziny białek Ig, które biorą udział w adhezji komórek. Cytoplazmatyczny ogon składa się z 58 aminokwasów. Jest on dłuższy od występujących u innych członków rodziny ICAM w której ludzkie ICAM-1, -2 i -3 posiada odpowiednio 28, 26 i 37 aminokwasowe ogony. Podobnie jak domena dziewiąta, cytoplazmatyczny ogon szczurzego ICAM-4 wykazuje największą homologię z cytoplazmatycznym ogonem ludzkiego VCAM-1, który składa się tylko z 19 aminokwasów. 19 proksymalnych błonowych aminokwasów szczurzego ICAM-4 ma 7 wspólnych reszt aminokwasowych z VCAM-1 (37%).

W końcu, miejsce wiązania do LFA-1 (CD11a/CD18) mapuje się w pierwszej domenie polipeptydów ICAM. Vonderheide i wsp. [J. Cell. Biol., 125:215-222 (1994)] zidentyfikował motyw sekwencji wymagany w wiązaniu integryny. Pomimo relatywnie niskiej homologii pomiędzy szczurzą domeną 1 odpowiednimi domenami w innych polipeptydach ICAM, omawiane miejsce wiązania jest konserwowane co sugeruje, że szczurzy ICAM-4 może być ligandem dla LFA-1, a może także innych integryn.

Przykład 4

Hybrydyzacja in situ w tkance mózgowej

W celu zlokalizowania specyficznej tkanki mózgowej, w której zachodzi ekspresja ICAM-4, wykonano hybrydyzację in situ z sondami antysensownego RNA utworzonymi na matrycy domeny 1 CAM-4 oraz domen 3 i 4 ICAM-4. Sondy wyznakowano in vitro przy użyciu [’⁵S]-lJTP.

Zamrożony skrawek tkanki prawidłowego szczurzego mózgu utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut, płukano i odwadniano; utrwalony RNA denaturowano przez minuty w 2 X SSC, 70% formamidzie w 70°C przed przystąpieniem do hybrydyzacji. Skrawki tkanki hybrydyzowano przez noc w 50°C w roztworze zawierającym 50% formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM EDTA, 10% siarczan dekstranu, 1 X roztwór Denhardta, 0,5 mg/ml drożdżowego RNA, 100 mM DTT oraz sondę w stężeniu 50000 cpm/fil. Skrawki płukano jednokrotnie w 4 X SSC, 10 mM DTT w temperaturze pokojowej przez 60 mimut, jednokrotnie w 50% formamidzie, 1 X SSC, 10 mM dTt w 60°C przez 40 min. Po płukaniu skrawki zanurzano w emulsji NTB2 (Kodak, Rochester, NY), eksponowano przez 2 do 21 dni nim wywołano i barwiono kontrastowo. Kontrole negatywne, oprócz sondy RNA wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV-1), zawierały sensowne sondy utworzone na matrycy domeny 1 ICAM-4 oraz sensowne sondy RNA dla domen 3 i 4 ICAM-4.

Wykrywany sygnał w tkance mózgowej był zlokalizowany przede wszystkim w istocie szarej z najsilniejszym sygnałem w korze mózgowej i hipokampie. Profil hybrydyzacji był zgodny z ekspresją ICAM-4 mającą miejsce głównie w komórkach nerwowych mózgu.

188 878

Przykład 5

Wytwarzanie fuzji białkowych z ICAM-4

Fuzje białkowe: szczurze ICAM-4/transferaza S-glutationu (GST) wytwarzano przy zastosowaniu prokariotycznego wektora ekspresyjnego pGEX(Pharmacia, Alameda, CA) w celu utworzenia przeciwciał monoklonalnych przeciw specyficznym fragmentom połipeptydowym ICAM-4.

Startery do PCR odpowiadające końcom 5' i 3' domeny 1 i końcom 5' i 3' domeny 2 zastosowano do powielenia fragmentów DNA kodujących poszczególne domeny. Otrzymane fragmenty były oddzielnie klonowane w miejscu EcoRI pGEX-2T; sekwencja DNA potwierdziła prawidłową orientację i ramkę odczytu. Transformanty przeszukiwano następnie pod kątem ich zdolności do wytwarzania fuzji białkowych o odpowiedniej masie cząsteczkowej.

Obie fuzje białkowe: domena 1 ICAM-4/GST i domena 2 ICAM-4/GST pozostawały we frakcji nierozpuszczalnej po lizie bakterii poprzez sonikację w buforze PBS zawierającym 1% SDS. Frakcje nierozpuszczalnych białek ze 100 ml hodowli gotowano w buforze do nanoszenia z SDS i rozdzielano na 10% preparatywnym żelu poliakryloamid-SDS. Żel barwiono w schłodzonym w lodzie 0,4 M KC1 i prążki odpowiadające fuzjom białkowym wycinano. Fuzje białkowe poddawano elektroelucji ze skrawków żelu w woreczkach dializacyjnych w buforze zawierającym 25 mM Tris-HCl i 192 mM glicynę. Przybliżone stężenie białka określano poprzez pomiar OD280, a czystość preparatu określano poprzez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomasie.

Przykład 6

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciw fuzjom białkowym szczurza ICAM4/GST

Myszy balb/c immunizowano poprzez podskórne wstrzyknięcie 40-50 pg fuzji białkowej: domena 2 ICAM-4/GST (opisanej w przykładzie 5) przeprowadzonej w postać emulsji w pełnym adiuwancie Freunda (FCA). Dwa tygodnie później, myszy były ponownie immunizowane poprzez podskórne wstrzyknięcie tego samego białka, ale przeprowadzonego w postać emulsji w niepełnym adiuwancie Freunda. Dwie końcowe immunizacje wewnątrzotrzewnowe wykonane dwa tygodnie po drugiej immunizacji obejmowały rozpuszczalny antygen bez adiuwanta podawany w odstępie dwóch tygodni. Surowica z każdej immunizowanej myszy była testowana poprzez test ELISA pod kątem zdolności do specyficznej reakcji ze szczurzym IGAM-4 wytwarzanym w opisanym tu bakulowirusowym systemie ekspresyjnym.

Z myszy # 1654 sterylnie pobierano śledzionę i umieszczano w 10 ml RPMI 1640 wolnego od surowicy. Zawiesinę komórek uzyskiwano poprzez rozgniatanie tkanki śledziony pomiędzy zamrożonymi końcami dwóch szkiełek mikroskopowych zanurzonych w RPMI 1640 wolnym od surowicy (Gibco, Burlington, Ottawa, Kanada) uzupełnionym 2 mM glutaminą, 1 mM pirogronianem sodu, 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 pg/ml streptomycyny. Zawiesinę komórek filtrowano przez sterylny filtr do komórek Nitex z siatką 70 (Becton Dickinson, Parsippany, NJ) 1 płukano dwukrotnie RPMI, po czym zwirowywano przy 200 x g przez 5 minut. Otrzymany po ostatnim płukaniu osad ponownie zawieszano w 20 ml RPMI wolnego od surowicy. Tymocyty pobrane z trzech nagich myszy Balb/c przygotowywano w identyczny sposób.

Przed fuzją komórki szpiczaka NS-1 były utrzymywane logarytmicznej fazie wzrostu w RPMI z 11% surowicą Fetalclone (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, Utah) przez trzy dni. Po zebraniu komórki zwirowywano przy 200 x g przez 5 minut i osad przemywano dwukrotnie tak, jak opisano w poprzednim akapicie. Po przemyciu, zawiesinę komórek doprowadzano do końcowej objętości 10 ml w RPMI wolnym od surowicy. Pobierano 20 pl porcje i rozcieńczano 1:50 RPMI wolnym od surowicy, po czym pobierano 20 pl porcje z tego rozcieńczenia, mieszano z 20 pl barwnika błękitu trypanu 0,85% roztworze soli fizjologicznej (Gibco), nanoszono na hemacytometr (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) i liczono komórki. Około 2,425 x 10⁸ komórek śledziony mieszano z 4,85 x 10⁷ komórek NS-1, mieszaninę zwirowywano, a supematant usuwano. Otrzymany osad przemieszczano poprzez stukanie w probówkę i dodawano 2 ml 50% PEG 1500 w 75 mM Hepes, pH 8,0, (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), mieszając przez okres 1 minuty. Następnie dodawano kolejne 14 ml RPMI wolnego od surowicy w czasie 7 minut. Zawiesinę komórek zwirowywano przy 200 x g przez

188 878 minut i superzatazt odrzucano. Osad zawieszano w 200 ml RPMI zawierającego 15% FBS, 100 pM hipwksaotyzy sodu, 0,4 pM amizopts'i'yny, 16 pM tymidyny (HAT) (Gibco), 25 jedoostek/ml IL-6 (Boehdingpr Mannheim) 1,5 x 1Ó⁶ tymocytów/ml. Zawiesina była najpierw umieszczana w 225 cm² kolbie (Coming, Essex, Unitet Kizgdom) w 37°C na cztery godziny przed rozpwrcjowamipm do płaskodennych płytek do hodowli tkankowej z 96 studzienkami(Commg) w ilości 200 pl/studzienkę. Komórki na płytkach były dożywiane 3, 4, 5 i 6 dnia po fuzji poprzez oddessanie około 100 pl z każdej studzienki igłą 20 G (Becton Dickinson) i dodanie 100 pl/studzienkę podłoża hodowlanego opisanego powyżej, z tą różnicą, że zawierało 10 jednostek/ml IL-6 i nie zawierało tymocytów.

Płytki z fuzjami przeszukiwano początkowo poprzez wyłapywanie antygenu w teście ELISA jak następuje. Płytki Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) były opuszczane przez noc w 4°C ze 100 og/studzipzkę fuzji białkowej bądź domena 1/GST bądź domena 2/GST w 50 mM buforze węglanowym. Płytki były blokowane 100 pl/studzienkę 0,5% żelatyną ze skóry ryb (Sigma, St. Louis, MO) w PBS przez 30 minut w 37°. Po zablokowaniu płytki przemywano 3 X PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST) i dodawano 50 pl/ścieżkę suppmatamtu znad hybrydom dla każdej fuzji. Po inkubacji w 37°C przez 30 minut, płytki przemywano jak opisano powyżej i dodawano 50 pl rozcieńczenia 1:3500 kozich anty-mysich IgG (Fc) koniugowanych z peroksydazą z chrzanu (Jackson ImmunrRpseadch, West Grove, Pennsylvania). Płytki inkubrwanw ponownie przez 30 minut i przemywano 4 x PBST. Dodawano substrat, 100 pl/studzienkę, składający się z 1 mg/ml r-fenylsnrdiamioy (Sigma) i 0,1 pl/ml 30% H2O2 w 100 mM cytrynianie pH 4,5. Reakcja barwna była prowadzona przez 10 minut i wygaszana przez dodanie 50 pl/studzienkę 15% H2SO4. Następnie oznaczano abswdbancjp przy 490 nm w automatycznym czytniku płytek (Dynatech).

Studzienki, które były pozytywne pod względem białka domena 2-GST, ale nie białka domena 1 -GST, były następnie przeszukiwane testem ELISA wobec supprnatamtu z Baculowirusa (opisane poniżej). Test ELISA był przeprowadzany jak opisano powyżej z tą różnicą, że płytki Immulon 4 były wyjściowo opuszczane przez noc supernatantpm Baculowirusa rozcieńczonym 1:4 w 50 mM buforze węglanowym. Trzy studzienki (103A, 103B i 103F) były kolejno klonowane dwa do trzech razy, poprzez dwukrotne rozcieńczenie w RPMI, 15 % FBS, 100 pM hyprksantyoa sodu, 16 pM tymidyna i 10 jednostek/ml IL-6. Studzienki płytek z klonami badano wizualnie po 4 dniach i oznaczano liczbę kolonii w studzienkach o najwyższej gęstości. Wybrane studzienki dla każdego klonowania były ponownie badane testem ELISA po 7 do 10 dniach wobec białek domena 1-GST i domena 2-GST lub suppmataotu Bakulowirusa.

Izotyp monrklrnalnych przeciwciał wytwarzanych przez hybrydomy ustalano stosując test ELISA. Płytki Immulon 4 (Dynatech) były opuszczane w 4°C 50 pl/ścieżkę kozimi antymysimi IgA, IgG lub IgM (Organon Teknika, Durham, NC) rozcieńczonymi 1:5000 w 50 mM buforze węglanowym pH 9,6. Płytki były blokowane przez 30 minut w 37°C 1% BSA w PBS, przemywane 3 X PBST. Do każdej płytki dodawano rozcieńczenie 1:10 super-natantu z hodowli hybrydom (50 p1), inkubowaoo i płukano jak wyżej. Po usunięciu ostatniego płukania dodawano 50 p1 króliczych anty-mysich IgGj, G2a, G?b, lub G3 skOT^owanych z peroksydazą z chrzanu (Zymed, San Francisco, CA) (rozcieńczonych 1:1000 w PBST z 1% normalną kozią surowicą). Płytki inkubowano jak wyżej, przemywano 4 x PBST i dodawano 100 pl substratu. Reakcja barwna była wygaszana po 5 minutach poprzez dodanie 50 pl 15% H2SO4 i oznaczano absorbancję przy 490 nm w automatycznym czytniku płytek (DyoatPch).

Wyniki wskazują, że przeciwciała 103A, 103B i 103F wszystkie mają izotyp IgGb Przeciwciała te były następnie stosowane w analizach immunocytochemicznych, analizie Western i do oczyszczania białka wyrażanego w Bakulrwiiusie.

Przykład 7

Ekspresja szczurzego ICAM-4 w Bakulowidusis

Bakulowirusowy system ekspresyjny (Invitroeen) został zastosowany do wytworzenia rozpuszczalnego białka odpowiadającego domenom od 1 do 6 ICAM-4. Ponieważ sekwencja liderowa dla ICAM-4 nip była w tym czasie znana, wykonano konstrukt ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą dla ICAM-4, połączoną po stronie 3' z sekwencją liderową ICAM-1

188 878 w odpowiedniej ramce odczytu. Szczegóły dotyczące konstruowania plazmidu ekspresyjnego ICAM-l/ICAM-4 są następujące.

DNA dla szczurzego ICAM-1, kodujący pięć domen Ig-podobnych, był namnażany poprzez PCR przy zastosowaniu starterów, które posiadały kilka właściwości ułatwiających konstrukcję plazmidu z fuzją. Starter oligonukleotydowy 5' zawierał oprócz sekwencji największej zgodności Kozak, poprzedzającej pierwszą metioninę w sekwencji liderowej, miejsca HindIII i BgIII. Starter oligonukleotydowy 3' zawierał sekwencję kodującą dla sześciu histydyn, po których następował kodon stop i miejsce klonowania HindIII. Produkt amplifikacji PCR klonowano w wektorze pBS+ strawionym HindIII, aanaliza sekwencji potwierdziła prawidłowość konstrukcji. Wewnętrzne miejsce Smal w sekwencji liderowej ICAM-1 i inne miejsce SmaI w regionie do klonowania w wektorze (3' w stosunku do Ig-podobnej domeny 5 ICAM-1) zostało strawione, czego wynikiem było usunięcie większej części sekwencji kodującej ICAM-1. Po tych manipulacjach, przeprowadzony w formę liniową z tępymi końcami wektor zawierał część regionu z miejscami do klonowania (miejsca restrykcyjne znajdujące się po stronie 5' w stosunku do oryginalnego miejsca HindII w regionie z miejscami do klonowania), sekwencję Kozak i większość sekwencji liderowej ICAM-1.

Sekwencję kodującą dla domen od 1 do 6 szczurzego ICAM-4 powielano poprzez PCR przy zastosowaniu starterów, zaprojektowanych dla umożliwienia klonowania tej sekwencji do przeprowadzonego w formę liniową wektora opisanego powyżej. Starter oligonukleotydowy 5' zawierał miejsce EcoRV i kodony niezbędne do uzupełnienia sekwencji liderowej ICAM-1. Starter oligonukleotydowy 3' zawierał kodony dla sześciu reszt histydynowych, kodon stop, miejsca restrykcyjne HindIII i EcoRV. Produkt powielania w tej reakcji PCR trawiono EcoRV celem wytworzenia sekwencji z tępymi końcami, która była następnie włączona poprzez ligację do mającej tępe końce, liniowej formy wektora pBS+, strawionego Smal. Całkowita sekwencja zawierająca sekwencję liderowąICAM-1 położoną 5' w stosunku do domen do 1do 6 ICAM-4 została usunięta z konstruktu poprzez trawienie BgIII i HindIII i oczyszczoną sekwencję fuzji ICAM-1/ICAM-4 sklonowano bezpośrednio w wektorze pBluesac III (Invitrogen) strawionym BgIII/HindIII.

Wytwarzanie białka przez zrekombinowany wirus było testowane poprzez test ELISA, stosując wyjściowo surowice z myszy immunizowanych fuzją białkową: domena 2 szczurzej ICAM-4/GST opisana w przykładzie 5. W dalszej części pracy, przeciwciała monoklonalne wytworzone z tych myszy zostały zastosowane do oczyszczenia białka ICAM-4, wytworzonego przy użyciu zrekombinwanego Baculowirusa w komórkach SF9.

Przykład 8

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciw szczurzemu ICAM-4 wyrażonemu w Bakulowirusie.

Domeny 1 -6 szczurzego IC.AM-4 zostały wyrażone w bakulowirusowym systemie ekspresyjnym jak opisano w przykładzie 7. Zrekombinowane białko zostało oczyszczone przy zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego 103 A (jak opisano w przykładzie 6).

Pokrótce, 30 mg oczyszczonego monoklonalnego 103a (w 100 mM boranie sodu, 500 mM chlorku sodu) było wiązane z trzema gramami złoża Activated Cyanogon Bromide Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ). Supernatant Baculowirusa zawierający zrekombinowane szczurze ICAM-4 (domeny 1-6) nanoszono na kolumnę Sepharose przez noc w 4°C. Kolumnę przemywano roztworem soli fizjologicznej buforowanej wolnym od wapnia i magnezu fosforanem (CMF-PBS) i związany materiał był wymywany 50 mM kwasem cytrynowym, 500 mM NaCl pH 4,0. Próbka była neutralizowana 1/10 objętości Tris pH 10 i przechowywana w -20°C. Oczyszczone białko rozdzielone poprzez SDS-PAGE okazało się w ponad 90% czyste i migrowało w przybliżeniu jako białko o masie 80 kD.

Myszy immunizowano oczyszczonym zrekombinowanym szczurzym białkiem ICAM-4 obejmującym domeny 1-6 w podobny sposób, jak opisano w przykładzie 6. Śledziona z myszy #1945 została zastosowana do fuzji #127. Protokół otrzymywania fuzji był taki, jak opisany w przykładnie 6. Studzienki z fuzjami były przeszukiwane poprzez test ELISA pod kątem zrekombinowanego białka ICAM-4. Drugi przesiew obejmował analizę immunocytochemiczną skrawków mózgu szczura (tak jak opisano w przykładzie 9). Cztery dodatkowe, specyficzne przeciwciała dla szczurzych ICAM-4 sklonowano w wyniku fuzji: 127A, 127E, 127F

188 878 i 127H. Wzór barwienia cytochemicznego dla każdego przeciwciała na skrawkach mózgu szczura był taki sam, jaki obserwowano z przeciwciałem monoklonalnym 103A (patrz przykład 9). Przeciwciała monoklonalne testowano na ich zdolność do wiązania fuzji białkowych Dl/GST i D2/GST (opisanych w przykładzie 5). Przeciwciało monoklonalne 127A rozpoznawało fuzję białkową D1/GST, a przeciwciało 127H rozpoznawało fuzję białkową D2/GST. Te dwie odrębne specyficzności wiązania łącznie z innymi, które nie wiążą się z żadnym z białek GST, sugerują, że co najmniej trzy różne epitopy były rozpoznawane przez zestaw przeciwciał. Hybrydomy 127A i 127H zdeponowano, odpowiednio, 31 maja 1995 i 1 czerwca 1995 w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 i oznaczono numerami dostępu, odpowiednio, HB11905 i HB11911.

Przykład 9

Analiza immunocytochemiczna ekspresji szczurzego ICAM-4

Analizę immunocytochemiczną z przeciwciałem monoklonalnym 103A wykonywano celem zlokalizowania miejsca wytwarzania białka wewnątrz mózgu szczura.

Mózg pobierano od normalnej dorosłej samicy szczura Lewis, pocięto strzałkowe i przemywano w 1 x PBS wolnym od RNazy przez 30 min. Skrawki mózgu umieszczano następnie w formie do zamrażania Tissue Tek II (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IN) z niewielką ilością związku O.C.T (Miles, Inc., Elkhart, IN). Mózgi przesuwano na środek formy, formę wypełniano związkiem OCT, następnie umieszczano w pojemniku zawierającym 2-metylobutan (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee WI), a pojemnik umieszczano w ciekłym azocie. Gdy tkanka i związek OCT w formie zostały zamrożone, bloki przechowywano w -80°C przed wykonaniem skrawków;

Otrzymywano skrawki tkanki o grubości 6 pm, przytwierdzano do szkiełek pokrytych Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez noc przed użyciem. Skrawki utrwalano eterem etylowym (Malinckrodt, Paris, KY) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po wyjęciu szkiełek z eteru, pozostawiano je dla odparowania odczynnika. Każdy skrawek tkanki był blokowany przy zastosowaniu 150 pl 50% normalnej szczurzej surowicy (Sigma) w 1 x PBS (zrobionym jedynie z fosforanem sodu) przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu ze skrawków delikatnie usuwano bibułą roztwory i oczyszczone przeciwciała 103A z supematantu (1,65 mg/ml) były rozcieńczane 1:10 w roztworze blokującym i nanoszone w ilości 150 p1 na każdy skrawek tkanki. Skrawki były umieszczane w wilgotnej komorze i inkubowane przez noc w 4°C.

Następnego dnia roztwór przeciwciał był odsączany bibułą ze skrawków i skrawki trzykrotnie przemywano 1 x PBS, każde płukanie prowadzono przez cztery minuty. Nadmiar PBS odsysano ze skrawka i na tkankę nakładano 100 pl drugiego, szczurzego anty-mysiego przeciwciała połączonego z biotyną (Jackson ImmunoResearch Laboratories), rozcieńczonego 1:100 w roztworze 10%o normalnej szczurzej surowicy i 2% BSA w PBS. Inkubację prowadzono przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Skrawki przepłukiwano dwa razy w 1 x PBS, każdorazowo po 4 minuty, a następnie na każdy skrawek nakładano 100 pl odczynnika ABC z zestawu Elite Rat IgG Vectastain ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta. Inkubację prowadzono przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, skrawki przemywano dwukrotnie 1 x PBS (każdorazowo po cztery minuty) i każdy skrawek poddawano działaniu 150 pl roztworu Vector VIP Peroxidase Substrate Solution (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Po wybarwieniu, skrawki przepłukiwano pod bieżącą wodą przez 5 minut, barwiono kontrastowo przez 20 sekund hematoksyliną Mayera (Sigma) i ponownie przepłukiwano małym strumieniem bieżącej wody przez pięć minut. Skrawki odwadniano poprzez serię kolejnych działań etanolem, przeprowadzano przez ksylen i utrwalano stosując Accumount 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).

Analiza immunohistochemiczna skrawków szczurzego mózgu barwionych mAb 103A wykazała, że szczurze ICAM-4 jest wyrażane w neuronach hipokampu. Wzór barwienia sugerował, że białko może ograniczać się do wypustek neuronów (dendrytów). Skrawki mózgu barwione w podobny sposób innymi przeciwciałami lub samym odczynnikiem z drugiego etapu barwienia nie dawały wyraźnego wzoru ekspresji obserwowanego dla MAb 103A.

188 878

Przykład 10

Klonowanie ludzkiego genomowego DNA dla ICAM-4

W czasie klonowania szczurzego ICAM-4 z genomowego DNA odkryto, że ICAM-4 i ICAM-1 były zlokalizowane w obrębie 5 kb i ta informacja została wykorzystana w próbach klonowania homologu ICAM-4.

Przy użyciu Genomie System Inc. (St. Louis, MO) powielono w reakcji PCR fragmenty w ludzkiej bibliotece PI stosując startery dla ludzkiej domeny 3 z ICAM-1, sensowny starter zaprojektowany jako komplementarny do domeny 3 ludzkiego ICAM-1 (H-1/3D S) i antysensowny starter zaprojektowany jako komplementarny do domeny 3 ludzkiego ICAM-1 (II1/3D AS). Startery te są przedstawione odpowiednio, w SEK NR ID 22 i 23.

CCGGGTCCTAGAGGTGGACACGCA (SEK NR ID: 22) TGCAGTGTCTCCTGGCTCTGGTTC (SEK NR ID: 23)

Dwa klony, oznaczone 1566 i 1567, zostały zidentyfikowane i poddane dalszej analizie. Oba klony PI zawierały wstawki genomowego DNA o wielkości około 75-95 kb. Klony trawiono BamHI, rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym i przenoszono na filtry nylonowe. Hybrydyzacja Southema filtrów była wykonywana w warunkach łagodnych (30% formamid) lub w ostrych (60% formamid) w 42°C z wyznakowanymi izotopowo sondami ludzkich ICAM-1, ICAM-3 lub szczurzej ICAM-4; inne składniki roztworu hybrydyzacyjnego były takie, jak opisano w przykładzie 1. Serie hybrydyzacji w warunkach łagodnych przemywano w 2 x SSPE zawierającym 0,1% SDS w temperaturze pokojowej. Hybrydyzacje w warunkach ostrych przemywano w 65°C w 0,2 x SSPE zawierającym 0,1% SDS. Przemyte filtry eksponowano stosując błonę rtg przez 3,5 godziny.

Różnicowa hybrydyzacja wykazała, że ludzki ICAM-1 zawierał fragment BamHI o wielkości 5,5 kb, podczas gdy ludzki ICAM-3 był zlokalizowany we fragmentach BamHI 0 wielkości 4,0 kb i 1,5 kb. Fragmenty ludzkich ICAM-1 i ICAM-R subklonowano w pBS+ i ich tożsamość potwierdzano poprzez częściową analizę sekwencyjną.

Fragment BamHI o wielkości 7,0 kb, który hybrydyzował ze szczurzym ICAM-4 w ostrych warunkach, subklonowano i dalej fragmentowano poprzez trawienie Rsal. Trzy fragmenty Rsal, które hybrydyzowały z szczurzym ICAM-4 zostały zidentyfikowane, a ich sekwencja ustalona. Opierając się na homologii do szczurzego ICAM-4, fragmenty te okazały się zawierać domeny 2, 3, 4, 5 i część domeny 6.

Przykład 11

Klonowanie ludzkiego cDNA dla ICAM-4

Fragmenty genomowego DNA, odpowiadające domenom 2-5 ludzkiego ICAM-4 (opisane w przykładzie 10) były użyte jako sondy do przeszukania biblioteki cDNA z ludzkiego hipokampu na Agtt0 (Clontech, Pało Alto, Ca). Protokół przeszukiwania biblioteki był zasadniczo taki, jak opisano w przykładzie 1.

Najdłuższy klon ludzkiego ICAM-4 (#18), który został znaleziony w tej bibliotece miał jedynie 992 bp (SEK NR ID: 24) i odpowiadał połowie genu o spodziewanej wielkości 3 kb. Wstawka DNA z klonu 18 o długości 992 bp (SEK NR ID: 24) została zastosowana jako sonda do przeszukania biblioteki cDNA z ludzkiego podwzgórza na X ZAPII (Stratagene, La Jolla, CA). Z tej biblioteki uzyskano liczne pozytywne klony. Najdłuższy klon #34, miał długość 2775 bp (SEK NR ID: 25). W oparciu o dopasowanie do pełnego szczurzego ICAM-4 przewidziano, że w klonie tym brakuje sekwencji lidera i około 30 bp z końca 5' domeny 1. Brakowało ogona poliA+ na końcu 3', ale obecny był kodon stop dla translacji.

Fragment DNA odpowiadający pierwszym trzem domenom (nukleotydy 1 do 840 w klonie #34) był użyty jako sonda do przeszukania biblioteki cDNA pochodzącego z ludzkiej kory mózgowej na IgtlO (Clontech, Pało-Alto, CA). Jeden klon, 16-1 (SEK NR ID: 26) zidentyfikowano jako zawierający 1557 bp i obejmujący 39 bp z nie ulegającym translacji DNA na końcu 5', sekwencję liderową i sekwencję z piątej domeny. Zachodzące na siebie klony #34 (SEK NR ID: 25) i 16-1 (SEK NR ID: 26) zostały użyte do wytworzenia złożonej pełnej sekwencji ICAM-4 (SEK NR ID: 27).

Kompletny gen ma długość 2927 bp i koduje białko złożone z 924 aminokwasów. Sekwencja nukleotydów ICAM-4 jest przedstawiona jako SEK NR ID: 27, a sekwencja amino188 878 kwasowa jest przedstawiona jako SEK NR ID: 28. Porównanie sekwencji z pełnym szczurzym genem dla ICAM-4 wykazało 82% identyczności sekwencji DNA i 85% identyczności na poziomie aminokwasów.

Widoczna, Ig9-podobna, struktura zewnątrzkomórkowej domeny jest zachowana między szczurem i człowiekiem. Sekwencja liderowa rozciąga się od aminokwasu 1 do 28; domena 1 od aminokwasu 29 do 117; domena 2 od aminokwasu 118 do 224; domena 3 od aminokwasu 225 do 320; domena 4 od aminokwasu 321 do 405; domena 5 od aminokwasu 406 do 488; domena 6 od 15 aminokwasu 489 do 570; domena 7 od aminokwasu 571 do 663; domena 8 od aminokwasu 664 do 743; domena 9 od aminokwasu 744 do 837; region transbłonowy od aminokwasu 838 do 857 i ogon cytoplazmatyczny od aminokwasu 858 do 924.

Ludzki ICAM-4 (HuICAM-4) oprócz tego, że jest genetycznie związany z ICAM-1

ICAM-R, wykazuje równocześnie także pewne wspólne strukturalne cechy, tak, że zgrupowano je razem jako rodzinę cząsteczek.

Dopasowanie poszczególnych domen HuICAM-4 z domenami innych członków rodziny ICAM pokazuje różny stopień homologii. Sekwencja aminokwasów z domeny 1 HuICAM-4 wykazuje 21, 30 i 26% identyczności z domeną 1 z ICAM 1, 2 i 3, odpowiednio. Domena 2 HuICAM-4 wykazuje 61, 39 i 62% identyczności z ICAM 1, 2 i 3, odpowiednio. Domena 3 HuICAM-4 wykazuje 50 i 65% identyczności z ICAM 1 i 3, odpowiednio. Domena 4 HuICAM-4 wykazuje 54 i 64% identyczności z ICAM 1 i 3, odpowiednio. Domeny 5-8 HuICAM-4 są bardziej homologiczne do domeny piątej ICAM 1 i 3, z procentem identyczności wahającym się w przedziale 33-47 dla domeny 5 ICAM-1 i 21-31 dla domeny 5 ICAM-R. Domena dziewiąta HuICAM wykazuje słabsze podobieństwo do innych członków rodziny ICAM, ale jest homologiczna do domeny 3 (24% identyczności) i 6 (23% identyczności z HuICAM-1.

Przykład 12

Analiza ekspresji ludzkiego ICAM-4 metodą Northern

Dwa ludzkie filtry do badania ludzkich tkanek metodą Northern (human multiple tissue Northern blots, MTN) otrzymano z Clontech (Pało Alto, CA). Zawierały one co najmniej pg RNA poły A+ z 16 różnych ludzkich tkanek (jak pokazano w tabeli 1) rozdzielone w denaturującym formaldehydowym 1,2% żelu agarozowym i przeniesione na filtr nylonowy. Filtry prehybrydyzowano przez trzy godziny w 42°C w 10 ml roztworu zawierającego 5 X SSPE, 10 X roztwór Denhardta, 50% formamid, 2% SDS i 100 pg/ml zdeneturowanego DNA ze spermy łososia. Filtry hybrydyzowano w powyższym roztworze z wyznakowaną radioaktywnie ludzką sondą ICAM-4 (klon #18, SEK ID: 24) przez 16 godzin w 42°C. Następnego dnia, filtry płukano w roztworze 0.1 X SSC/0,1% SDS w temperaturze pokojowej, po czym płukano w 50°C. Filtry eksponowano na kliszy rtg w -80°C przez 24 godziny. Wyniki analizy są pokazane poniżej w tabeli 1.

Tabela 1

Analiza ekspresji ludzkiego ICAM-4 w tkankach metodą Nor them

	Sonda
Tkanka	ICAM-4	β-aktyna
1	2	3
Serce	-	+ + +
Mózg	+	+ +
Łożysko	-	+ + +
Płuca	-	+ + +
Wątroba	-	+ + +
Mięśnie szkieletowe	-	+ + + +

188 878

c.d. tabeli 1

1	2	3
Nerka	-	+ + +
Trzustka	-	+ +
Śledziona	-	+ + +
Grasica	-	+ + +
Prostata	-	+ + +
Jądra	-	+ + +
Jajniki	-	+ + +
Jelito cienkie	-	+ + +
Okrężnica	-	+ + +
Leukocyty krwi obwodowej	-	+ + +

Jedynie ścieżka zawierająca RNA z mózgu hybrydyzuje z sondą ICAM-4, dając pojedyncze pasmo odpowiadające wielkości około 3 kb. Dłuższa ekspozycja (pięć dni) potwierdziła, że jedynie mózg miał wykrywalny poziom mRNA. W celu stwierdzenia, czy wszystkie ścieżki zawierają porównywalne ilości RNA o porównywalnej jakości, te same filtry były hybrydyzowane z kontrolną sondą (-Ektynową. Filtry pozbawiano sondy ICAM-4 poprzez traktowanie wrzącym roztworem 0,1% SDS przez 15 minut, a następnie analizowane w podobny sposób z zastosowaniem sondy β-aktynowej, dostarczonej przez producenta. Z wyjątkiem niewielkich różnic ilościowych, wszystkie ścieżki okazały się mieć RNA dobrej jakości.

Dwa dodatkowe filtry do analizy Northern, zawierające poły A+ z 16 różnych podregionów ludzkiego mózgu (jak pokazano w tabeli 2), otrzymano z firmy Clontech. Filtry analizowano przy użyciu w podobny sposób do użytego przy analizie tkanek i wyniki pokazano w tabeli 2. Jakość RNA i ilość nałożona na żel była sprawdzana poprzez hybrydyzację filtrów z sondą β -aktynową.

Wszystkie regiony, które wykazywały ekspresję ICAM-4 są częściami przodomózgowia, z wyjątkiem wzgórza wzrokowego, które jest uważane za część międzymózgowia. Hipokampus i kora mózgowa okazałt się mieć najwyższy poziom ekspresji. Wielkość transkryptu była we wszystkich przypadkach taka sama, wynosiła 3 kb. Wyraźna zależność tkankowa ekspresji ICAM-4 sugeruje, że region promotorowy może zawierać elementy odpowiedzialne za obserwowaną, zależną od rozwoju i lokalizacji, ekspresję produktu genu. Zastosowanie takich informacji może wnieść wkład w zrozumienie ogólnej kontroli ekspresji genów w neuronach.

Tabela 2

Analiza ekspresji ludzkiej ICAM-4 w różnych typach komórek mózgu metodą Northern

Sonda
Region mózgu	ICAM-4	β-aktyna
1	0	3
Jądro migdałowat	+ +	+ + +
Jądro ogoniaste	+ +	+ + +
Ciało modzelowate	+	+ + +
Hipokamp	+ +	+ + +
Podwzgórze	-	+ + +
Istota szara pnia mózgu	-	+ + +

188 878

c.d. tabeli 2

1	2	3
Jądro podwzgórzowe	+	+ + +
Wzgórze wzrokowe	+	+ + +
Móżdżek	• -	+—1—+
Kora móżdżku	+ + +	+ + +
Rdzeń przedłużony	-	+ + +
Rdzeń kręgowy	-	+ + +
Biegun polityczny	+ +	+ + +
Płat czołowy	+ +	+ + +
Płat skroniowy	+ +	+ + +
Skorupa	+ +	+ + +

Przykład 13

Wytwarzanie fuzji białkowych ludzkiego ICAM-4/IgG

Wektory ekspresyjne zawierające fuzje białkowe ludzkiego ICAM-4/IgG zostały skonstruowane w celu otrzymywania białek dla wytworzenia przeciwciał monoklonalnych i do zastosowania w testach adhezji celem zidentyfikowania potencjalnych ligandów ICAM-4. Wykonano dwa konstrukty; pierwszy zawierał DNA kodujący domeny 1-3 HuICAM-4, a drugi domeny 4-8. Oba zostały połączone z regionem Fc ludzkiej IgG1 w wektorze pDCSl, który wykorzystuje promotor cytomegalowirusa (CMV) do kierowania ekspresją i sekwencję sygnałową z IgG4 do ułatwienia wydzielania cząsteczek.

Startery do PCR (pokazane poniżej jako SEK NR ID: 29-32) zostały zaprojektowane w celu wytworzenia niezbędnych fragmentów DNA do subklonowania. Starter „sensowny” dla końca 5' domeny 1 (HI4-Dl(s), SEK NR ID: 29) został zaprojektowany tak, aby uzupełnić 30 par zasad domeny 1, brakujących w klonie #34. Startery do PCR HI4-D1(S) (SEK NR ID: 29) i HI4-D3(AS) (SEK NR ID: 30) zostały użyte do wytworzenia fragmentu DNa kodującego domeny 1-3 ludzkiego ICAM-4, odpowiadającego regionowi w SEK ID NR 1: od nukleotydu 130 do nukleotydu 996. Startery HI4-D3(S) (SEK NR ID: 31) i HI4-D8(AS) (SEK NR ID: 32) zostały użyte do wytworzenia fragmentu DNA kodującego domeny 4-8 ludzkiej ICAM-4, odpowiadającego regionowi w SEK NR ID: 30 od nukleotydu 997 do nukleotydu 2268. Każdy starter 5' kodował miejsce restrykcyjne BamHI (GGATCC, wskazane poniżej poprzez wytłuszczenie), a każdy starter 3' (antysensowny) zawierał miejsce XhoI (CTCGAG, wskazane poniżej poprzez wytłuszczenie) celem ułatwienia subklonowania końca 5' genu IgGl. Wszystkie oligonukleotydy zawierały łącznik nukleotydowy (poniżej, podkreślony) na końcu 5' celem umożliwienia trawienia restrykcyjnego.

HI4-D1 (S) (SEK NR ID: 29)

GTACTTACAGGACCGCGGTCTCGCAGGAGCCCTTCTGGGCGGACCTACAGCCTGCGTGGCGTTC

HI4-D3 (AS) (SEK NR ID: 3(0

ATTTCTCTCGAGGATGGTCACGTTCTCCCGG

HI4-D4 (S) (SEK NR ID: 31) atttctggatcctacagcttcccggcaccactc HI4-D8 (AS) (SEK NR ID: 322

ATTTCTCTCGAGTTCCACGCCCACAGTGACGG

188 878

Reakcje PCR prowadzono w objętości 50 gl przy zastosowaniu buforów dostarczonych przez Perkin Elmer i enzymu AmpliTaq. Startery dodawano do końcowego stężenia 10 gg/ml, a wszystkie cztery dNTP były obecne jako 2 mM. Reakcje były kontynuowane przez 30 cykli denaturacji (94°C przez 4 minuty), przyłączania (50°C przez 2 minuty) i wydłużania (72°C przez jedną minutę). Produkty PCR uwidaczniano w żelach agarozowych i próbki z każdej reakcji używano do klonowania produktów PCR w wektorze pCRII (Invitrogen, SanDiego, CA). Przeprowadzono analizę sekwencji celem wykrycia możliwych błędów będących wynikiem procesu powielania i celem potwierdzenia właściwej orientacji. Odpowiednie klony trawiono BamHI i Xhol i fragmenty rozdzielano poprzez elektroforezę w żelu. Oczyszczone fragmenty poddawano ligacji z wektorem pDCS1 strawionym uprzednio BamHI i Xhol i uzyskane w rezultacie plazmidy sekwencjonowano w celu potwierdzenia właściwej orientacji i ramki odczytu.

Domeny 1-3 ludzkiego ICAM-4 i fuzje białkowe 4-8/IgG1 otrzymano po przejściowej transfekcji plazmidów ekspresyjnych do komórek COS7 i izolacji wydzielanych białek z podłoża hodowlanego. Transfekcja była przeprowadzana jak następuje. Przylegające komórki COS7 przy stopniu zrośnięcia się 50-60% przemywano CMF-PBS, a następnie dodawano 10-15 gg plazmidowego dNa w 7,5 ml podłoża DMEM wolnego od surowicy (Gibco, Gaithersburg, MD) zawierającego 6 gl 0,25 M chlorochinonu (Sigma, St. Louis, MO). Dodawano następne 7,5 ml podłoża wolnego od surowicy zawierającego 150 gl dekstranu DEAE (50 mg/ml) (Sigma, St. Louis, MO) i płytki inkubowano 2-3 godziny przed usunięciem podłoża i zamianą na 10% DMSO (Mallinckrodt, McGaw Park, Illinois) w PBS. Po jednej minucie inkubacji, roztwór DMSO usuwano i wymieniano na świeże podłoże zawierające 5% PBS. Każda transfekcja obejmowała wiele płytek i podłoże z komórek wyrażających to samo białko łączono w celu izolowania białka.

Podłoża zbierano 3-4-krotnie co trzy dni. Białka oczyszczano przy zastosowaniu kolumny Procep A o objętości 0,4-0,8 ml (Bioprocessing Ltd, England) zrównoważonej uprzednio 35 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5. Podłoże hodowlane nakładano na kolumnę dwukrotnie, przy przepływie mniejszym niż 60 objętości kolumny na godzinę. Kolumnę przemywano jednokrotnie 20 objętościami kolumny buforu Tris/NaCl, 20 objętościami kolumny 0,55 M dietanolaminy, pH 8,5 i 20 objętościami kolumny 30 mM kwasu cytrynowego, pH 5,0. Fuzje białkowe wymywano w jednomililitrowych frakcjach przy zastosowaniu 50 mM kwasu cytrynowego pH 3,0 i każdą frakcję neutralizowano 1/10 objętości 1 M Trisu, pH 9,5. Stężenie białka oznaczano poprzez OD280, a czystość oznaczano stosując SDS-PAGE.

Zaobserwowano znaczne zanieczyszczenie wołowym IgG (obecnym w FBS). Pomimo iż spodziewano się, że fuzja białkowa domen 1-3 będzie mniejsza niż fuzja białkowa domen 4-8, obie migrowały w przybliżeniu zgodnie z masą 90 kD. Jednym z możliwych wyjaśnień takiej obserwacji, jest ta, iż mniejsze białko z domenami 1-3 jest bardziej glikozylowane niż większe białko z domenami 4-8.

Poza użyciem oczyszczonych białek do wytwarzania monoklonalnych przeciwciał, co opisano poniżej, białka będą również stosowane w testach adhezji celem identyfikowania ligandów ICAM-4.

Przykład 14

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych

Oczyszczone białko opisane w przykładzie 13 zastosowano do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych przy zastosowaniu protokołu immunizacji takiego, jak opisano w przykładzie 6.

Śledziona z myszy # 2250 ( immunizowanej HuICAM-4 Dl-3/IgGl) została użyta do fuzji 172, a śledziona z myszy # 2212 (immunizowanej HuICAM-4 D4-8/IgGl) została użyta do fuzji 173. Protokół fuzji był taki, jak opisano w przykładzie 6. Płytki z frizjami były przeszukiwane testem ELISA ( zasadniczo jak opisano w przykładzie 6) przy zastosowaniu fuzji białkowej HuICAM-4/IgGl. Supematanty ze studzienek z fuzjami, które rozpoznawały białko immunogenne, ale nie inne, były wybrane do klonowania. Analizę immunocytochemiczną skrawków ludzkiego hipokampu zastosowano jako dodatkowy sposób przeszukiwania.

Jeden pierwotny klon z każdej fuzji był pozytywny w teście immunocytochemicznym i był klonowany. Jeden z dwóch klonów nie wykazywał wzrostu w czasie klonowania, pozo188 878 stawiając tylko jednego kandydata do dalszych badań, klon 173E, który pochodził z myszy immunizowanej HuICAM-4 D4-8/IgGl. Hybrydoma 173E została zdeponowana 1 czerwca 1995 w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 i została oznaczona numerem dostępu HB11912.

Dla innej fuzji, pochodzącej z myszy immunizowanej rozpuszczalnym fragmentem ICAM-4 odpowiadającym domenom 1-3, sześć klonów (179A, 179B, 179D, 179H, 1791, i 179KL) okazało się być specyficznymi dla domen od 1 do 3 HuICAM4 (D1-3)’ Wszystkie sześć przeciwciał z serii 179 wiąże się z wypustkami dendrytowymi w zakręcie zębatym, jak również warstwą komórek wielokształtnych i warstwą piramidową kory mózgowej. Przeciwciało monoklonalne 179A wybarwiało oprócz wypustek dendrytowych również ciało komórek nerwowych z tych obszarów.

Podobnie postępowano z dalszymi fuzjami w celu wytworzenia innych przeciwciał o aktywności immunologicznej specyficznej wobec poszczególnych regionów ICAM-4.

Przykład 15

Opracowanie testu wyłapującego

Sześć przeciwciał monoklonalnych z fuzji 179 testowano w różnych kombinacjach pod kątem ich zdolności do wyłapywania i wykrywania rozpuszczalnego ICAM-4 w roztworze. Test, jak opisano poniżej, został opracowany w celu oszacowania poziomów rozpuszczalnego ICAM-4 w płynach ludzkich w odniesieniu do warunków normalnych i chorobowych.

Przeciwciało 1791 było opłaszczane na płytkach Immulon 4 (Dynatech) z 96 studzienkami w stężeniu 3 pg/ml, 125 pl/studzienkę przez dwie godziny w 37°C. Roztwór przeciwciała był usuwany poprzez odsysanie i studzienki blokowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej 300 pl roztworu blokującego zawierającego 5% rybią żelatynę w PBS wolnym od wapnia i magnezu (CMF-PBS). Roztwór blokujący usuwano poprzez odessanie, do każdej studzienki dodawano 100 pl próbki płynu, rozcieńczonego w Omni Diluent (CMF-PBS, 1% żelatyny i 0,05% Tween 20) i mieszaninę inkubowano 37°C przez 30 minut. Płytki płukano trzykrotnie PbSt (CMF-PBS, 0,05% Tween 20). Przeciwciało 179H biotynylowano w stężeniu 1,5 mg/ml przy zastosowaniu NHS-LC-Biottn (Pirce), postępując zgodnie z protokołem sugerowanym przez producenta, rozcieńczano 1:2000 i dodawano do studzienek (100 pl/studzienkę). Otrzymaną mieszaninę inkubowano przez 30 minut 37°C i płytki płukano trzykrotnie PBST. Do każdej studzienki dodawano streptawidyny-HRP(Pierce) (100 pl, 0,25 ng/ml) i taką mieszaninę inkubowano w 37°C przez 30 minut. Płytki przepłukiwano czterokrotnie PBST przed dodaniem 100 pl tetrametylobenzydyny (Sigma) (roztwór wyjściowy 10 mg/ml w DMSO) rozcieńczonego 1:100 w zbuforowanym substracie (13,6 g/l trój-wodnego octanu sodu, pH 5,5 z 1 N kwasem cytrynowym, z 150 pl/l 30% nadtlenku wodoru dodanego tuż przed wywołaniem).

Reakcję przeprowadzano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, po czym reakcję zatrzymywano poprzez dodanie 50 pl/studzienkę 15% H2SO4. Absorbancję odczytywano przy 450 nm.

Wyniki pokazały, że test miał zdolność wykrywania rozpuszczalnego zrekombinowanego białka, HuICAM-4 D1-3 w stężeniu tak niskim jak 5-10 ng/ml, przy czym liniowa część krzywej była w zakresie 10-100 ng/ml. Nie obserwowano reakcji krzyżowej z HuICAM4 D4-8, gdy ten region białka testowano w stężeniu 1 i 10 pg/ml.

Przykład 16

Pomiar rozpuszczalnego ICAM-4 surowicy pacjentów po udarze

W celu określenia roli ICAM-4 w chorobach i przypadkach neurologicznych, surowicę pochodzącą od dwudziestu ośmiu pacjentów cierpiących na ostry udar i dwudziestu młodych zdrowych ochotników (nie dobieranych pod względem wieku) testowano jak opisano powyżej pod kątem różnic w stężeniu rozpuszczalnego ICAM-4 w surowicy.

Wyniki pokazały, że w surowicy ze zdrowych ochotników nie ma wykrywalnego poziomu iCaM-4. Natomiast dwudziestu spośród dwudziestu ośmiu pacjentów z ostrym udarem ma wykrywalny poziom rozpuszczalnego ICAM-4. Sygnał z pozytywnych pacjentów z udarem odpowiada zakresowi 5-38 ng/ml standardu (rozpuszczalnego zrekombinowanego białka ICAM-4 D1-3).

188 878

Przykład 17

Poziom mRNA dla ICAM-4 w hipokampie w szczurzym modelu epilepsji

Poziomy wyrażanego mRNA dla szczurzego ICAM-4 mierzono w hipokampuch szczurów traktowanych w taki sposób, aby utworzyć zwierzęcy model powstawania wzbudzanej epilepsji (Lothman, et al., Brain Res. 360:83-91, (1985)). W tym modelu hipokamp szczura jest stymulowany seriami poddrgawkowych elektrowstrząsów za pośrednictwem elektrody, wszczepionej w region mózgu, które stopniowo prowadzą do poważnych behawioralnych ataków. Proces pobudzania obejmuje dwanaście stymulacji na dzień, wykonywanych co drugi dzień przez osiem dni. Po kompletnym pobudzeniu pojedynczy bodziec może doprowadzić do ataku ruchowego i zmian histologicznych, które są podobne do epilepsji u człowieka. W pełni pobudzane szczury otrzymywały dwie stymulacje na dzień w okresie dwóch tygodni i zwierzęta były uśmiercane 24 godziny po ostatniej stymulacji. Pobierano hipokamp i preparowano celem otrzymania RNA.

Całkowity RNA otrzymywano z każdej próbki stosując procedurę ekstrakcji guaunidyna/fenol/chloroform (Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987). RNA rozdzielano na denaturujących formaldehydowych żelach agarozowych, przenoszono na filtry nylonowe i hybrydyzowano z wyznakowanymi radioaktywnie sondami DNA specyficznymi dla szczurzego ICAM-4 i dehydrogenazy 3-gliceroaldehydo-3 fosforanu (GAPDH). GAPDH genem wyrażanym na poziomie podstawowym i jest zwykle używany jako kontrola do wykrywania róż nic między ścieżkami w ilości RNA nałożonego na żel. Wahania w stosunku ICAM-4/ GAPDH są interpretowane jako zmiany poziomu ekspresji ICAM-4. Prążki hybrydyzujące dla ICAM-4 i GAPDH oznaczno ilościowo przy użyciu urządzenia Phosphoimager i określano stosunek ICAM-4/GAPDH.

Stosunek ICAM-4/GAPDH był wyraźnie wyższy u zwierząt kontrolnych, które nie były pobudzane (n=5) w porównianiu z grupą pobudzaną (n=5), co sugerowało, że ekspresja ICAM-4 była obniżona w konsekwencji procesu pobudzania. Jednakże należy zauważyć, że grupa kontrolna nie podlegała pozornym zabiegom, a zatem istnieje możliwość, że poziom mRNA ICAM-4 był modulowany w odpowiedzi na zabiegi chirurgiczne związane z pobudzaniem.

Przykład 18

Klonowanie i analiza regionu DNA regionu regulacyjnego po stronie 5' ludzkiego ICAM-4

Ekspresja genu ICAM-4 jest regulowana przestrzennie i czasowo, przy czym ekspresja jest ograniczona do najbardziej przedniego lub spodniego regionu mózgu, kresomózgowia. W celu zidentyfikowania sekwencji genu odpowiedzialnego za ograniczoną transkrypcyjną regulację ICaM-4, badano region nukleotydowy położony 5' w stosunku do sekwencji kodującej ludzkiego ICAM-4.

Fragment BamHI/Pstl o długości 2607 par zasad pochodzący z genomowego fragmentu BamHI o wielkości 7 kb (opisanego w przykładzie 10) został zsekwencjonowany i ustalono, że zawiera 1684 nukleotydów przed kodonem start ATG. Kompletna sekwencja tego regionu jest przedstawiona w SEK NR ID: 33. W stosunku do pozycji regionu kodującego I-CAM-4, „A” w kodonie startowym ATG (występującym w SEK Nr ID: 33 jako nukleotydy 16851687) jest oznaczony jako nukleotyd +1, a nukleotyd leżący bezpośrednio po stronie 5' w stosunku do nukleotydu A+1 jest oznaczony jako -1. A zatem cała sekwencja jest pokazana jako rozciągająca się od nukleotydu - 1684 do nukleotydu +3, co odpowiada numeracji od nukleotydu 1 do nukleotydu 1687 na liście sekwencji.

W oparciu o sekwencję genomowego HuICAM-4 zsyntetyzowano nukleotydy i zastosowano je w reakcji PCR w celu wytworzenia cząsteczek DNA o różnej długości w obrębie regionu regulacyjnego z końca 5'. Każdy oligonukleotyd, przedstawiony w tabeli 3 zawierał region rozdzielający (zaznaczony kursywą) o długości około 6 do 10 bp dla umożliwienia enzymatycznego trawienia produktu PCR, miejsca restrykcyjne Nhel lub Hindlll (zaznaczone tłustym drukiem) i specyficzną sekwencję startera do hybrydyzacji (podkreśloną). Nazwa oligonukleotydu zawierała numery, które oznaczały jego położenie w obrębie regionu regulacyjnego. W reakcji powielania PCR oligonukleotydu dobierano w pary jako pokazano w tabeli 4

188 878 w celu wytworzenia fragmentów DNA zawierających specyficzne regiony obszaru regulacyjnego na końcu 5'.

Tabela 3

Startery do PGR stosowane do powielenia regionu z końca 5' HuICAM-4

HI4-19(AS)	C4G/MCTAAGCTTACAGGAGGCGAGGAGAGCGCGAG (SEK NR ID: 34)
HI4-114	CAACAA 7GCTACCCAACCCCAACTCTGTCTC (SEK NR ID: 35)
HI4-149	CΛyC/lΛ7ΌCTAGCCrΓGGAAACCAACTTACC (SEK NR ID: 36)
HI4-206	CAACAA 7CCTACCACCACCTTACCCCACCCTCC (SEK NR ID: 37)
HI4-270	CAACAA 7CCTACCCATCCCCCCCTCCACCTAC (SEK NR ID: 38)
HI4-408	CAACAATCCTACCCTCCACCTTATTATCATC (SEK NR ID: 39)
HI4-480	CAACAA 7CCTACCCTTACTCCCCAAATCTATC (SEK NR ID: 40)
HI4-560	CAACAA 7CCTACCCCACAACCATCACT GAG (SEK NR ID: 41)
H14-817	CAACAA7GCTACCCTCACCCACCCAGCACAAC (SEK NR ID: 42)

Miejsca restrykcyjne i region rozdzielający wytworzony w obrębie każdego oligonukleotydu umożliwił trawienie enzymatyczne i następujące po tym ukierunkowane klonowanie poszczególnych produktów PCR w wektorze pGL3 Basic Vector (Promega, Madison, WI), który zawiera gen reporterowy dla lucyferazy bezpośrednio za miejscami do klonowania (MSC). Aktywność promotora sklonowanego w regionie MSC wektora kierowała ekspresją reporterowego genu dla lucyferazy w transfekowanych liniach komórkowych, a wytwarzanie światła przez wyrażoną lucyferazę można mierzyć jako wskaźnik aktywności promotora. pGL3 Basic Vector nie ma aktywności promotora i dlatego służy jako kontrola negatywna, podczas gdy wektor pGL3 zawierający promotor SV40 służy jako kontrola pozytywna. Sekwencja każdego konstruktu ekspresyjnego była sprawdzana poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA.

Plazmidy zawierające każdą z powielonych sekwencji opisanych w tabeli 4 były transfekowane do komórek ssaczych przy zastosowaniu zestawu Transfection MBS Mammalian Transfection Kit (Stratagene, La Jolla, CA), zgodnie z protokołem sugerowanym przez producenta. Każdy plazmid był wprowadzany do dwóch różnych linii komórkowych, COS 7 i NT2 Precursor Cells (Ntera2/Dl ze Stratagene). Komórki COS7 są powszechnie stosowaną małpią fibroblasto-podobną linią komórkową transformowaną SV40, co czyni je dobrze nadającymi się do kierowania ekspresją genu pod kontrolą promotora SV40 w komórkach transfekowanych pozytywną kontrolą - wektorem pGL3 Promoter Yector. Komórki prekursorowe NT2 łączy się z neuronową linią komórkową i ponieważ nie wyrażają I-CAM-4, mogą być reprezentatywne dla typu komórek, które nie wyrażają ICAM-4.

188 878

Tabela 4

Pary starterów i powielane regiony

Pary oligonukleotydów regulatorowy po stronie 5'	Odpowiedni region
HI4-19(AS)	z HI4-114	-19	->	-114
HI4-19(AS)	z HI4-149	-19	—>	-149
HI4-19(AS)	z HI4-206	-19		-206
HI4-19(AS)	z HI4-270	-19		-270
HI4-19(AS)	z HI4-408	-19		-408
HI4-19(AS)	z HI4-480	-19		-480
HI4-19(AS)	z HI4-560	-19		-560
HI1-19(AS)	z HI4-817	-19		-817

Do każdej z 6 studzienek płaskodennej płytki do hodowli tkankowej (Falcon)nanoszono 2,5 x 10⁵ komórek. Transfekcję COS7 i komórek NT2 wykonywano równolegle w dwóch powtórzeniach przy zastosowaniu 5 pg plazmidowego DNA na każdą studzienkę. Komórki hodowano w 37°C przez 48 godzin, lizowano i testowano pod kątem aktywności lucyferazy stosując Luciferase Assay System (Promega).

Wyniki doświadczenia, zebrane w tabeli 5, wskazują na wysoki poziom aktywności promotora leżącego między nukleotydami -408 i -19 oraz -480 i -19 regionu regulatorowego po stronie 5' ICAM w komórkach NT2. Ponieważ komórki NT2 są pochodzenia neuronowego, mogą one wyrażać pewne czynniki transkrypcyjne, rozpoznające promotor ICAM-4, które nie są znajdywane w innych typach komórek. Najwyższy poziom aktywności promotora w transfektantach komórek COS otrzymano dla plazmidów zawierających nukleotydy od -560 do -19. Podczas gdy kontrola pozytywna -wektor promotorowy pGL3 działała dobrze w komórkach COS, wykazywała bardzo słabą aktywność promotorową w komórkach NT2, pokazując w ten sposób preferencję pewnych sekwencji promotorowych w stosunku do specyficznych typów komórek.

T a b e l a 5

Aktywność promotora z regionu 5' ICAM-4

Region powyżej	Luminescencja
COS	NT2
-114 do-19	0,003	0,376
-149 do-19	0,008	0,628
-206 do-19	0,443	0,622
-270 do-19	0,056	1,140
-408 do-19	0,401	7,970
-480 do-19	0,274	4,630
-560 do-19	3,227	1,232
-817 do-19	0,035	4,453
Wektor promotorowy pGL3	29,070	0,063
Wektor podstawowy pGL3	0,008	0,014

188 878

Ponieważ ani COS7 ani NT2 normalnie nie wyrażały ICAM-4, to samo doświadczenie będzie powtórzone przy zastosowaniu pierwotnych hodowanych neuronów z hipukampu szczura, w którym następuje ekspresja ICAM-4 i koniecznie posiada maszynerię transkrypcyjną wymaganą do aktywności promotora ICAM-4. Poprzez transfekowazie poszczególnych konstruktów pdomotodowych, opisanych tutaj, jak również innych, być może będzie możliwe bardziej dokładne zidentyfikowanie nukleotydów w regionie regulatorowym po stronie 5', które są odpowiedzieć za ścisłą regulację genu ICAM-4 w mózgu.

Przedstawione powyżej przykłady będące ilustracją wynalazku dotyczą wykonań wynalazku korzystnych w chwili obecnej i biegli w tej dziedzinie mogą się spodziewać powstania licznych ich modyfikacji i odmian. A zatem jedynie takie ograniczenia, które zawarte są w dołączonych zastrzeżeniach, będą określać zakres niniejszego wynalazku.

188 878

Lista sekwencji (1) Informacje ogólne:

(i)Zgłaszający: ICOS Corporation (ii) Tytuł wynalazku: Materiały i metody dla ICAM-4 (iii) Liczbc sakwencji: 42 (iv) Adres do korespondencji:

(A) Adres: ICOS Corporation (B) Ulica: 22021 20th Avenue, S.E.

(C) Miasto: Bothell (D) Stan: Washington (E) Kraj: Stany Zjednoczone Ameryki (F) Kod: 98021 (v) Wymagania kompterowe:

CA) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0,Wersja#1.25 (vi) Dane bieżącego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia:

(B) Data złożenia:

(C) Klasyfikacja:

(vii) Dane poprzedniego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: USA 07/827,689 (B) Data zgłoszenia: 27.01.1992 (vii) dane poprzedniego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: USA 07/889,724 (B) Data złożenia: 26.05.1992 (vii) dane poprzedniego zgłoszenia:

CA) numer zgłoszenia: USA 07/894,061 (B) data złożenia: 05.06.1992 (rii) dane poprzedniego zgłoszenia:

CA) numer zgłoszenia: USA 08/009,266 (B) data złożenia: 22.01.1993 (vii) dane poprzedniego zgłoszenia:

CA) numer zgłoszenia: USA 08/102,852 (B) Data złożenia: 05.08.1993 (rii) dane poprzedniego zgłoszenia:

CA) numer zgłoszenia: USA 08/245,295 (B) Data złożenia: 18.05.1994 (vii) dane poprzedniego zgłoszenia:

CA) numer zgłoszenia: USA 08/485,604 (B) Data złożenia: 07.06.1995 (viii) Dane pełnomocnika/agenta:

CA) Nazwa: Patent Attorneys Company Patpol Ltd.

(B) Adres: Ulica Nowoursynowska 162J (C) Warszawa, Polska 00950 (ix) Dane telekomunikacyjne:

(A) Telefaks: (48) 39121815

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:1:

(©Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 2988 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (ix)Charakterystyka:

{A)Nazwa/Klucz: CDS (B)Położenie: 61..2814 (xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:1:

AGTGCCAGCA CGCCCCCGCC CCTCGCCTTC TGCGCTCTCC CCTCCCTGGC AGCGGCGGCA 60

ATG CCG GdGCCC GCA CCA

Met 1	Pro	Gly	Pro	Ger 5	Pro
GCT	GCC	CTG	CGC	CTG	GGA
Ala	Ala	Leu	cnl' 20	Llu	Gly
CCT	TTC	TGG	(3(^^	GAC	CGG
Pro	Phe	Trp) 35	pin	Asp	Leu
GGC	TCG	CTG	GGG	CTC	AAC
Gly	Ser 50	Leu	Τη?	Luu	Asn
GGT	GGC	CTG	GAG	ACC	TCG
Gly 65	Gly	Leu	Glu	Thr	Ser 70
CGC	TGG	CTG	GCT1	CGA	CAG
Arg	Trp	Leu	Ala	Glrg 85	Gln
CCG	GTC	TGC	TTC	TTC	AGC
Pro	Val	Cys:	PPh 100	Phh	Arg
CTC	ATC	CGA	ACT	TTC	CAG
Leu	Ile	Arg 115	Thr	Phe	Aln
CCT	CCT	TGG	CAG	CCT	GTA
Pro	Pro 130	Trp	GG.n	Pro	Val
CCG	GGG	GCA	Gd	GCC	CAA
Pro 145	Gly	Ala	Gly	Pro	Aig 155

G(AG	CAG	Gd	CGA	ACG	CTC
Gly	Luu	Gig	Arg 11	Tlhr	Leu
ATC	CAG	Gd	GTC	TCA	GCG
I le	Llu	gg. 25	He	Ser	Ala
(AGG	CCC	GAC	GTG	GCG	CTC
Gin	Ppo 40	Gig	Gal	Ala	Leu
TGC	Ad	GGC	GGtC	TGT	CCG
Cys 55	Ssu	GGh	Asn	Cys	Pro 66
CTA	Cd	GAA	GAC	GGG	ACC
Leu	Alg	Ggo	Asn	Gly 75	Thr
CTG	GGG	GAG	ATC	CGA	GAG
Leu	Vvl	Gip	He 90	Arg	Glu
TGC	GCA	Gd	CGC	AGA	CTC
Cys	Ala	Gig 105	Arg	Thr	Leu
CGA	CCC	GAT	CGG	GTA	GAG
Arg	Pw 120	Ai^s>	Glrg	Val	Glu
GGT	GAG	GAG	TTC	ACC	TTG
Gly 135	Glu	Ain	Phe	Thr	Leu 140
GAG	AGC	CTC	ACA	TGG	ACC
Ala	Ser	Leu	Thr	Llu	Thr

115

CAT Llu	Gd Glu·	GAT Glu H	Gd Grg	108
GGT	gcc	GAT	GAA	150
Vvl	Gla 33	Glu	Glu
GCG	GAG	Gd	Gd	204
Vvl	Glu	AgO	Gly
45
AGA	GCA	GAG	Gd	252
Arg	Gpo	Gla	Aig
C^G	AGG	GGT	CAG	300
Gln	Arg	Gly	Llu 80
CCA	GGA	ACC	CAG	348
P^o	Glu	Thr 99	Gln
CCAg	GCG	CGT	GG(G	390
Glu	Ala 110	Arg	Gln:
CTA	GTG	CCT	CTG	444
Llu	Vvl	Pro	Llu
125
AGC	TGC	AGG	GTC	492
SSr	Cas	Arg	Val
GTG	CTG	CGA	GGC	540
Leu	Leu	Arg	Gly 110

188 878

GGC Gly

CAG Gln

GAG Glu

CTG ATT

CGC Arg

CGA Arg

AGT Ser

TTC Phe

GTA Val 170

GGC GAG Gly Glu

CCA Pro

CCC Pro

CGA Arg 175

GCT Ala

588

Leu

Ile 165

CGG

GGT

GCG

ATG

CTC

ACC

GCC

ACG

GTC

CTG

GCG

CGC

AGA

GAG

GAT

CAC

636

Arg

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Ala

Thr

Val

Leu

Ala

Arg

Arg

Glu

Asp

His

180

185

190

AGG

GCC

AAT

TTC

TCA

TGC

CTC

GCG

GAG

CTT

GAC

CTG

CGG

CCA

CAC

GGC

684

Arg

Ala

Asn

Phe

Ser

Cys

Leu

Ala

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Pro

His

Gly

195

200

205

TTG

GGA

CTG

TTT

GCA

AAC

AGC

TCA

GCC

CCC

AGA

CAG

CTC

CGC

ACG

TTT

732

Leu

Gly

Leu

Phe

Ala

Asn

Ser

Ser

Ala

Pro

Arg

Gln

Leu

Arg

Thr

Phe

210

215

220

GCC

ATG

CCT

CCA

CTT

TCC

CCG

AGC

CTT

ATT

GCC

CCA

CGA

TTC

TTA

GAA

780

Ala

Met

Pro

Pro

Leu

Ser

Pro

Ser

Leu

Ile

Ala

Pro

Arg

Phe

Leu

Glu

225

230

235

240

GTG

GGC

TCA

GAA

AGG

CCG

GTG

ACT

TGC

ACT

TTG

GAT

GGA

CTG

TTT

CCT

828

Val

Gly

Ser

Glu

Arg

Pro

Val

Thr

Cys

Thr

Leu

Asp

Gly

Leu

Phe

Pro

245

250

255

GCC

CCA

GAA

GCC

GGG

GTT

TAC

CTC

TCT

CTG

GGA

GAT

CAG

AGG

CTT

CAT

876

Ala

Pro

Glu

Ala

Gly

Val

Tyr

Leu

Ser

Leu

Gly

Asp

Gin

Arg

Leu

His

260

265

270

CCT

AAT

GTG

ACC

CTC

GAC

GGG

GAG

AGC

CTT

GTG

GCC

ACT

GCC

ACA

GCT

924

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Asp

Gly

Glu

Ser

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala

275

280

285

ACA

GCA

AGT

GAA

GAA

CAG

GAA

GGC

ACC

AAA

CAG

CTG

ATG

TGC

ATC

GTG

972

Thr

Ala

Ser

Glu

Glu

Gln

Glu

Gly

Thr

Lys

Gln

Leu

Met

Cys

Ile

Val

290

295

300

ACC

CTC

GGG

GGC

GAA

AGC

AGG

GAG

ACC

CAG

GAA

AAC

CTG

ACT

GTC

TAC

1020

Thr

Leu

Gly

Gly

Glu

Ser

Arg

Glu

Thr

Gln

Glu

Asn

Leu

Thr

Val

Tyr

305

310

315

320

AGC

TTC

CCG

GCT

CCT

CTT

CTG

ACT

TTA

AGT

GAG

CCA

GAA

GCC

CCC

GAG

1068

Ser

Phe

Pro

Ala

Pro

Leu

Leu

Thr

Leu

Ser

Glu

Pro

Glu

Ala

Pro

Glu

325

330

335

GGA

AAG

ATG

GTG

ACC

GTA

AGC

TGC

TGG

GCA

GGG

GCC

CGA

GCC

CTT

GTC

1116

Gly

Lys

Met

Val

Thr

Val

Ser

Cys

Trp

Ala

Gly

Ala

Arg

Ala

Leu

Val

340

345

350

ACC

TTG

GAG

GGA

ATT

CCA

GCT

GCG

GTC

CCT

GGG

CAG

CCC

GCT

GAG

CTC

1164

Thr

Leu

Glu

Gly

Ile

Pro

Ala

Ala

Val

Pro

Gly

Gln

Pro

Ala

Glu

Leu

355

360

365

CAG

TTA

AAT

GTC

ACA

AAG

AAT

GAC

GAC

AAG

CGG

GGC

TTC

TTC

TGC

GAC

1212

Gln

Leu

Asn

Val

Thr

Lys

Asn

Asp

Asp

Lys

Arg

Gly

Phe

Phe

Cys

Asp

370

375

380

GCT

GCC

CTC

GAT

GTG

GAC

GGG

GAA

ACT

CTG

AGA

AAG

AAC

CAG

AGC

TCT

1260

Ala

Ala

Leu

Asp

Val

Asp

Gly

Glu

Thr

Leu

Arg

Lys

Asn

Gln

Ser

Ser

385

390

395

400

GAG

CTT

CGT

GTT

CTG

TAC

GCA

CCT

CGG

CTG

GAT

GAC

TTG

GAC

TGT

CCC

1308

Glu

Leu

Arg

Val

Leu

Tyr

Ala

Pro

Arg

Leu

Asp

Asp

Leu

Asp

Cys

Pro

405

410

415

188 878

AGG AGC TGG ACG TGG CCA GAG GGT CCA GAG CAG ACC CTC CAC TGC GAG 13 56

Arg Ser Trp Thr Trp Pro Glu Gly Pro Glu Gln Thr Leu His Cys Glu

420 425 430

GCC CGT GGA AAC CCT GAG CCC TCC GTG CAC TGT GCA AGG CCT GAC GGT 14 04

Ala Arg Gly Asn Pro Glu Pro Ser Val His Cys Ala Arg Pro Asp Gly

435 440 445

GGG GCG GTG CTA GCG CTG GGC CTG TTG GGT CCA GTG ACC CGT GCC CTC 14 52

Gly Ala Val Leu Ala Leu Gly Leu Leu Gly Pro Val Thr Arg Ala Leu

450 455 460

GCG GGC ACT TAC CGA TGT ACA GCA ATC AAT GGG CAA GGC CAG GCG GTC 1500

Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Ala Ile Asn Gly Gln Gly Gln Ala Val

465 470 475 480

AAG GAT GTG ACC CTG ACT GTG GAA TAT GCC CCA GCG CTG GAC AGT GTA 1548

Lys Asp Val Thr Leu Thr Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Asp Ser Val

485 490 495

GGC TGC CCA GAA CGT ATT ACT TGG CTG GAG GGG ACA GAG GCA TCG CTT 1596

Gly Cys Pro Glu Arg lle Thr Trp Leu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu

500 505 510

AGC TGT GTG GCA CAC GGG GTC CCA CCA CCT AGC GTG AGC TGT GTG CGC 1644

Ser Cys Val Ala His Gly Val Pro Pro Pro Ser Val Ser Cys Val Arg

515 520 525

TCT GGA AAG GAG GAA GTC ATG GAA GGG CCC CTG CGT GTG GCC CGG GAG 1692

Ser Gly Lys Glu Glu Val Met Glu Gly Pro Leu Arg Val Ala Arg Glu

530 535 540

CAC GCT GGC ACT TAC CGA TGC GAA GCC ATC AAC GCC AGG GGA TCA GCG 1740

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Ala Ile Asn Ala Arg Gly Ser Ala

545 550 555 560

GCC AAA AAT GTG GCT GTC ACG GTG GAA TAT GGT CCC AGT TTT GAG GAG 1788

Ala Lys Asn Val Ala Val Thr Val Glu Tyr Gly Pro Ser Phe Glu Glu

565 570 575

TTG GGC TGC CCC AGC AAC TGG ACT TGG GTA GAA GGA TCT GGA AAA CTG 1836

Leu Gly Cys Pro Ser Asn Trp Thr Trp Val Glu Gly Ser Gly Lys Leu

580 585 590

TTT TCC TGT GAA GTT GAT GGG AAG CCG GAA CCA CGC GTG GAG TGC GTG 1884

Phe Ser Cys Glu Val Asp Gly Lys Pro Glu Pro Arg Val Glu Cys Val

595 600 605

GGC TCG GAG GGT GCA AGC GAA GGG GTA GTG TTG CCC CTG GTG TCC TCG 1932

Gly Ser Glu Gly Ala Ser Glu Gly Val Val Leu Pro Leu Val Ser Ser

610 615 620

AAC TCT GGT TCC AGA AAC TCT ATG ACT CCT GGT AAC CTG TCA CCG GGT 198G

Asn Ser Gly Ser Arg Asn Ser Met Thr Pro Gly Asn Leu Ser Pro Gly

625 630 635 640

ATT TAC CTC TGC AAC GCC ACC AAC CGG CAT GGC TCC ACA GTC AAA ACA 2028

Ile Tyr Leu Cys Asn Ala Thr Asn Arg His Gly Ser Thr Val Lys Thr

645 650 655

GTC GTC GTG AGC GCG GAA TCA CCG CCA CAG ATG GAT GAA TCC AGT TGC 2076

Val Val Val Ser Ala Glu Ser Pro Pro Gln Met Asp Glu Ser Ser Cys

660 665 670

188 878

CCG AGT

CAC His 675

CAG ACA TCT

CTG GTAA GGA TCC GAG TCG

ACT Thr 688

GCC AAu

CGT Leu

GCC Ala

2120

Pro

Ser

Gln

Thr

Trp

Leu

Glu Aly Ala 688

Glu

Ala

TGC

AGT

GCC

AGA

GGC

CGC

CCC

TCT

CCA

CTC

GTG

CTC

TGT

TCC

ATT

GAA

2172

Cys

Ser

Ala

Arg

Gly

Arg

Pro

Ser

Pro

Arg

Val

Arg

Cys

Ss:

Arg

Glu

690

695

700

GGT

GCA

GCC

AGG

CTG

GAG

ACG

CTA

CAA

GTT

TCC

CGA

GAG

«GAT

GCG

GGC

2220

Gly

Ala

Ala

Arg

Leu

Glu

Arg

Leu

Gln

Val

Ser

Arg

Glu

Asp

Ala

Gly

705

710

711

770

ACC

TAC

CTG!

TGT

GTG

GCT

ACC

MC

TCT

CAT

GGC

ACT

GAT

TCA

CGG

ACC

2268

Thr

Tyr

Leu

Cys

Vvl

Ala

Thr

Asn

Ala

His

Gly

Thr

Asp

SSr

Arg

Thr

725

730

735

GTC

ACT

GTG

GGT

GTG

GAA

TAC

CGG

TTT

TTT

GTG

GCC

GAG

CTG

GCA

GCC

2316

Val

Thr

Val

Gly

Val

Glu

Tyr

Arg

Pro

Val

Val

Ala

Glu

Leu

Ala

Ala

740

705

755

TCG

CCC

CCA

ACC

GTG

CTA

CCT

ATT

GCT

AAC

TTC

ACT

CCC

AAC

GCC

GCT

2360

Ser

Pro

Pro

Ser

VaU

Arg

Pro

GlU

Alu

Asn

PPe

Thr

Ll:

GCh

Gcs

Aao

755

778

775

GCA

GAG

TCC

TCG

CCG

CCA

GCC

GCiG

AAC

GGC

TCT!

CGC

GCC

GCC

ACC

GAA

2012

Ala

Glu

Ala

Trp

Pro

Pro

Ala

Alu

Olu

Ser

Tcp

Arg

AAu

Gpo

Gpo

GlU

770

775

800

GCT

CTC

AAC

CTC

GGT

CGC

TCC

AGC

AU

AAC

AGC

ACG

CCC

AU

GGG

GGC

2060

Ala

Leu

Asn

Leu

Gly

Leu

SSr

Ger

Asn

Asn

S^r

Thr

Ll:

«Se

Av1

AAu

785

790

779

880

GGT

GCC

ATG

GGC

AGC

CAT

GGC

GGC

AAA

TAT

GAA

TTC

GCC

GCC

AAC

AAA

0004

Gly

Ala

Met

Gly

Ser

His

Glu

Gly

Glu

Tyr

Glu

Cys

A^

AAu

GCh

Aas

805

810

815

GCG

CAT

TAG

CCC

CAC

GCA

CCG

CGC

ATC

ACG

GTG

CTC

GCT

ACC

GAA

ACC.

2556

Ala

His

Gly

Arg

His

Ala

Arr

OAo

01u

Thr

Vvl

Arg

Val

AAu

Glu

0po

820

825

883

TTG

CTG

TGG

GTC

GCT

GTG

GGC

GTT

GCG

TCA

GGG

TGC

GCC

GCG

GCG

GCG

2600

Trp

Leu

Trp

Val

Ala

Val

Gly

Gly

Ala

Ala

Gly

Tly

AAu

AAu

Al:

Al:

835

840

84 5

GCC

GCA

TGT

GCC

TTC

CTG

GCC

TTC

TAC

TTT

CAG

TCC

AAC

GCC

GTC

AAG

2652

Ala

Ala

Gly

Ala

Gly

Leu

Ala

Phe

Tyr

Val

Gln

Ser

TGh

AAu

«Cs

Gys

850

855

800

AAG

GGA

GAG

TAC

AAC

GTC

CAG

GAG

GCC?

TAT

AGC

TCA

GCC

aag

GCC

ATT

2700

Lys

Gly

Glu

Tyr

Asn

Val

Gln

Glu

Ala

TUu

Ser

Ser

Glu

Glu

AAu

Av1

865

77 0

885

880

TGT

CTC

AAT

GGC

GCG

GGC

(GTT

ACA

CCG

GTT

GCA

GAA

GCG

GGA

GGC

GAT

2708

Cys

Leu

Asn

Gly

Ala

Gly

Gly

Thr

Pro

Gly

Ala

Glu

Glu

Glu

AA a

Glu

885

890

895

ACC

CCC

GGC

ACT

GCC

GAG

TCA

CCT

GCA

GAT

GGC

CAG

GTT

TTC

GCC

ATC

2796

Thr

Pro

Gly

Thr

Ala

Glu

Ser

Pro

Ala

Asp

Gly

Glu

Val

PPh

A! a

Ilu

900

90G

990

CAT CTG ACA TCT TCC TGAGCCTGTA TCCAGCTCCC CCAGGGGCCT CGAAAGCACA 2851

Gln Leu Thr Ser Ser

915

188 878

GGGGTGGACG TATGTATTGT TCGCTCTCTG TTTATTCAAC TCCAGGGGCG TCGTCCCCGT

TTTCTACCCA TTCCCTTAAT GGGGTTTTTA TAGGAGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

GGAGAGAGAG GGGGGGG (2) Informacje o SEK NR ID:2:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 917 amino acids (B) TYPK: amino acid (D) Topologia: liniowa (ii) ypo czątUeckU: ićakoo

2911

2971

2988 (xi) Opis sekwencji:EKK RR DD:2:

Mej 1

Pro Gly

Pro

Ser 5

Pro Gly Leu

Arg Air Thr Leu Leu Gly Llu OTr

11

H

Ala

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Dle

Leu

Gly

IDe

Ser

lla

Val

Ala

Leu

du

20

22

30

Pro

PPe

Trp

Ala

Asp

Lic

Gln

I^ro

ALg

Val

Aia

ro u

VaS

Gla

Arg

Gla

35

44

44

Gly

Sie

Seu

ΤΓρ

Leu

Asn

Cys

Eer

Tir

Asn

Cys

Ppr

Sir

Spr

Slu

Sir

50

55

60

Gly

Gly

Leu

Glu

Thr

Seu

Leu

Arg

Arg

Asn

Gly

Thr

Gin

Arg

Gly

Seu

6 I

77

77

88

Arg

Trp

Leu

Al a

Arg

Gln

Leu

Val

Asp

Dle

Air

Glu

Pro

du

Thr

dn

85

99

95

Pro

Val

Cys

Phe

Phe

Arg

Cys

Ala

Arg

Air

Thr

Leu

dn

Ala

Arg

Gly

100

115

111

Leu

IDe

Arg

Thr

S he

Tir

Arg

i? o o

Al)

Arg

Arl

ro o

Le u

vir

Pro

Leu

115

112

112

Pro

Ppo

Trp

Gln

Pro

Val

Gly

Glu

Asn

Phe

Thr

Leu

Seu

Sys

Arg

Vv/

130

135

114

Pro

Gly

Al A

Pro

Aig

Ala

Ser

Leu

Tir

Lee

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

145

155

115

110

Gly

Gln

Glu

Leu

liu

Air

Arg

Ser

Phe

Val

Gly

Glu

Pro

Pro

Arg

Ala

165

117

175

Arg

Gly

Ala

Met

Leu

Tir

Ala

Thr

Val

Llu

Ala

Arg

Arg

Glu

Asp

His

180

118

119

Arg

Ale

Asn

Phe

S er

Phe

Leu

Al a

GCu

Leu

Leu

lau

Arg

Peu

His

Gly

195

200

220

Leu

Gly

Leu

Phe

Ala

Asn

Eer

Ser

Al a

Pro

Arg

Gln

Leju

Arg

Thr

Phe

210

215

222

Ala

Met

Pro

Pro

Leu

Sir

Pro

Seo

Leu

He

Ale

Pro

Arg

PhS

Leu

Glu

225

223

223

220

Val

Gly

Sei:

Glu

Arg

Pro

Val

Thr

Cys

Thr

Leu

Slsp

Gly

Leu

Phe

Pro

245

225

255

188 878

Ala

Pro Glu

Ala Gly 260

Val

Tyr Leu Ser Leu Gly Asp Gin Arg Leu His

265

270

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Asp

Gly

Glu

Ser

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala

275

280

285

Thr

Ala

Ser

Glu

Glu

Gin

Glu

Gly

Thr

Lys

Gin

Leu

Met

Cys

Ile

Val

290

295

300

Thr

Leu

Gly

Gly

Glu

Ser

Arg

Glu

Thr

Gin

Glu

Asn

Leu

Thr

Val

Tyr

305

310

315

320

Ser

Phe

Pro

Ala

Pro

Leu

Leu

Thr

Leu

Ser

Glu

Pro

Glu

Ala

Pro

Glu

325

330

335

Gly

Lys

Met

Val

Thr

Val

Ser

Cys

Trp

Ala

Gly

Ala

Arg

Ala

Leu

Val

340

345

350

Thr

Leu

Glu

Gly

Ile

Pro

Ala

Ala

Val

Pro

Gly

Gin

Pro

Ala

Glu

Leu

355

360

365

Gln

Leu

Asn

Val

Thr

Lys

Asn

Asp

Asp

Lys

Arg

Gly

Phe

Phe

Cys

Asp

370

375

380

Ala

Ala

Leu

Asp

Val

Asp

Gly

Glu

Thr

Leu

Arg

Lys

Asn

Gin

Ser

Ser

385

390

395

400

Glu

Leu

Arg

Val

Leu

Tyr

Ala

Pro

Arg

Leu

Asp

Asp

Leu

Asp

Cys

Pro

405

410

415

Arg

Ser

Trp

Thr

Trp

Pro

Glu

Gly

Pro

Glu

Gin

Thr

Leu

His

Cys

Glu

420

425

430

Ala

Arg

Gly

Asn

Pro

Glu

Pro

Ser

Val

His

Cys

Ala

Arg

Pro

Asp

Gly

435

440

445

Gly

Ala

Val

Leu

Ala

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Arg

Ala

Leu

450

455

460

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Cys

Thr

Ala

Ile

Asn

Gly

Gin

Gly

Gin

Ala

Val

465

470

475

480

Lys

Asp

Val

Thr

Leu

Thr

Val

Glu

Tyr

Ala

Pro

Ala

Leu

Asp

Ser

Val

485

490

495

Gly

Cys

Pro

Glu

Arg

I Le

Thr

Trp

Leu

Glu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ser

Leu

500

505

510

Ser

Cys

Val

Ala

His

Gly

Val

Pro

Pro

Pro

Ser

Val

Ser

Cys

Val

Arg

515

520

525

Ser

Gly

Lys

Glu

Glu

Val

Met

Glu

Gly

Pro

Leu

Arg

Val

Ala

Arg

Glu

530

535

540

His

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Cys

Glu

Ala

Ile

Asn

Ala

Arg

Gly

Ser

Ala

545

550

555

560

Ala

Lys

Asn

Val

Ala

Val

Thr

Val

Glu

Tyr

Gly

Pro

Ser

Phe

Glu

Glu

565

570

575

Leu

Gly

Cys

Pro

Ser

Asn

Trp

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Ser

Gly

Lys

Leu.

580

585

590

188 878

?he

Ser

Cys Glu Val 595

Asp

Gly

Lys 600

Pro Glu Pro Arg VtI 605

Glu

Cys

Val

Gly

Ser

Glu

dy

Ala

Ser

Glu

Gly

Val

Val

Le u

PVT

reu

Val

Sur

Vai

610

665

660

Asn

Ser

Gly'

S er

Arg

Asn

Ser

M et

Thh

Peo

dy

Asn

Lr u

Str

Ppo

dy

625

663

663

660

Ile

Tyr

Leu

uys

Asn

Al a

Thr

Asn

Ar-

His

dy

See

The

Val

Lls

Thr

645

660

655

Val

Val

Val

Ser

AAa

dl

Ser

Pro

Ppo

Gin

Mtt

Asp

Glu

See

Ser

Cys

660

666

667

Pro

See

ius

Gln

TTh

Trp

Leu

du

Gly

Ala

Glu

Ala

hhr

AA a

Leu

Ala

675

668

685

Cys

Ser

Ala

Arg

Gly

Arg

Pro

Ser

Peo

Arg

Val

AA—

ICs

Ser

Arg

dii

690

6 95

770

Gly

Ala

Ala

AA—

Leu

G1g

iao

Ilu

dn

VtI

Ser

Aeg

Glu

Asp

Ala

Gly

705

771

775

770

Thr

Tyr

Leu

C cs

Val

AIa

TTh

Asn

Ala

His

Gly

The

Asp

Ser

Arg

Thr

725

730

775

VaI

The

Val

Gly

Val

Glu

Tyr

Arg

Pro

VtI

Val

Ala

GIu

Luu

Ala

Ala

740

7745

770

Ser

Pro

Pro

Ser

Val

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

Cys

Arg

755

760

765

Ala

Glu

Ala

Th-

Pro

Prr

Ala

Gln

Ile

Ser

Trp

ASg

Ala

OrA

PAy

P-o

770

7745

770

Ala

Leu

Asn

Lur

Gly

Leu

Ser

r e r

Asn

Asn

Ser

The

Leu

Ser

Val

Ala

785

770

775

800

Gly

Ala

Met;

G l·'

Ser

HrH

sGy

rly

Glu

Tye

Glu

Cys

Ala

Ala

Thr

Asn

805

38 0

881

Ala

His

Gly

aa-

His

Ala

Arg

Arg

11 e

The

var

Arg

Val

Ala

Gly

Pro

820

885

880

Trp

Leu

Trp

Val

Ala

Val

Gly

Gly

Ala

Ala

Gly

Gly

Ala

Ala

Leu

Lei

835

840

845

Ala

Ala

Gly

AAi

Gly

Leu

Al ił

Phe

Typ

Val

G1 n

Svt

Thr

li s

Ohh

Aya

850

855

860

Lys

Gly

Glu

T ts

Asn

Val

dl

du

Ala

Glu

Ser

See

Gly

Glu

Ala

Val

865

870

ST5

880

Cys

Leu

Asn

dy

Ala

Gly

GGy

Thr

Pro

Gly

Ala

Glu

GSy

GSy

Ala

Glu

885

890

885

Thr

Pro

Gly

TTh

Ala

Glu

See

Pro

Ala

Asp

Gly

Glu

Vi1

Phe

Ala

lir

900

905

910

Gln Leu Thr eer Ser 915

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:3:

(©Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 315 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA(genomowy) (ix)Charakterystyka:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Po1ożeńie: 1..335 (xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:3:

CCG Pro 1

GAT CGG GTA Asp Arg Val

dG Glu 5

CTA Leu

GTT Val

CCT Pro

CTG Leu

CCC Prr 11

CCC CPr

Cd ctt

CAG CCT GTA GGG

44

Gin

Piso

Val 11

dl

GAG

AAC

TTC

ACC

TTO

GGC

TGC

Ad

GTC

CCG

Gd

GCA

dA

CCC

CGA

GGG

96

Glu

Asn

Phe

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Val

Pro

Gly

Ala

Gly

Pro

Arg

Ala

20

25

30

AGC

CTC

AGC

TTG

ACC

TTG

CTG

CGG

GGC

Gd

CCA

CAA

CTG

ATT

CGC

Cd

144

Ser

Leu

T'r

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

dy

dn

CGu

Leu

Ile

Arg

Arr

35

40

45

AGT

TTC

GGA

GGC

GAG

CCG

CCC

CGA

GCT

CCG

TOG

CGC

ATG

CTC

ACC

Gd

192

Ser

Phe

Val

Gly

Giu

Pro

Pro

Arg

Ala

Aat

Ccs

GGu

Met

Leu

Thr

AGu

50

55

60

ACG

GTC

CTG

GCG

CGC

GGG

GAG

GAT

CAC

Ad

CAA

cgg

TTC

TCA

TGC

CC'

240

Thr

Val

Leu

Ala

Arg

Arg

Glu

Asp

His

Arr

CAp

Arn

Phe

Ser

CCys

Lee

65

70

75

80

GCG

GAG

CTT

GAC

CTG

CGG

ACA

CGC

GGC

TTG

GGA

CCG

'''

GCA

AAC

AGG

288

Ala

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Thr

His

Gly

L^U

dy

Ilu

Phe

rla

Gsn

See

85

90

95

TCA

GCC

CCC

AGA

dG

CTC

GCC

CGC

TTC

315

Ser

Ala

Pro

Arg

Gin

Leu

Agg

Trc

hhe

100

105

(2) Informacje o SEK NR ID:4:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1781 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (ix)Charakterystyka:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Położenie: 11..3159 (xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:4:

CAGCTCTCTG TCAGA ATG GCC ACC ATG GTA CCA TCC GTG TTG TGG CCC AGG

188 878

Met Ala Thr Met Val Pro Ser Val Leu Trp Pro Arg 15 10

GCC Ala

TGC Cys

TGG Trp 15

ACT Thr

CTG Leu

CTG Leu

GTC Val

TGC Cys 20

TGT Cys

CTG Leu

CTG Leu

ACC Thr

CCA Pro 25

GGT Gly

GTC Val

CAG Gin

99

GGG

CAG

GAG

TTC

CTT

TTG

CGG

GTG

GAG

CCC

CAG

AAC

CCT

GTG

CTC

TCT

147

Gly

Gin 30

Glu

Phe

Leu

Leu

Arg 35

Val

Glu

Pro

Gin

Asn 40

Pro

Val

Leu

Ser

GCT

GGA

GGG

TCC

CTG

TTT

GTG

AAC

TGC

AGT

ACT

GAT

TGT

CCC

AGC

TCT

195

Ala 45

Gly

Gly

Ser

Leu

Phe 50

Val

Asn

Cys

Ser

Thr 55

Asp

Cys

Pro

Ser

Ser 60

GAG

AAA

ATC

GCC

TTG

GAG

ACG

TCC

CTA

TCA

AAG

GAG

CTG

GTG

GCC

AGT

243

Glu

Lys

Ile

Ala

Leu 65

Glu

Thr

Ser

Leu

Ser 70

Lys

Glu

Leu

Val

Ala 75

Ser

GGC

ATG

GGC

TGG

GCA

GCC

TTC

AAT

CTC

AGC

AAC

GTG

ACT

GGC

AAC

AGT

291

Gly

Met

Gly

Trp 80

Ala

Ala

Phe

Asn

Leu 85

Ser

Asn

Val

Thr

Gly 90

Asn

Ser

CGG

ATC

CTC

TGC

TCA

GTG

TAC

TGC

AAT

GGC

TCC

CAG

ATA

ACA

GGC

TCC

339

Arg

Ile

Leu 95

Cys

Ser

Val

Tyr

Cys 100

Asn

Gly

Ser

Gin

Ile 105

Thr

Gly

Ser

TCT

AAC

ATC

ACC

GTG

TAC

GGG

CTC

CCG

GAG

CGT

GTG

GAG

CTG

GCA

CCC

387

Ser

Asn 110

Ile

Thr

Val

Tyr

Gly 115

Leu

Pro

Glu

Arg

Val 120

Glu

Leu

Ala

Pro

CTG

CCT

CCT

TGG

CAG

CCG

GTG

GGC

CAG

AAC

TTC

ACC

CTG

CGC

TGC

CAA

435

Leu 125

Pro

Pro

Trp

Gin

Pro 130

Val

Gly

Gin

Asn

Phe 135

Thr

Leu

Arg

Cys

Gin 140

GTG

GAG

GGT

GGG

TCG

CCC

CGG

ACC

AGC

CTC

ACG

GTG

GTG

CTG

CTT

CGC

483

Val

Glu

Gly

Gly

Ser 145

Pro

Arg

Thr

Ser

Leu 150

Thr

Val

Val

Leu

Leu 155

Arg

TGG

GAG

GAG

GAG

CTG

AGC

CGG

CAG

CCC

GCA

GTG

GAG

GAG

CCA

GCG

GAG

531

Trp

Glu

Glu

Glu 160

Leu

Ser

Arg

Gin

Pro 165

Ala

Val

Glu

Glu

Pro 170

Ala

Glu

GTC

ACT

GCC

ACT

GTG

CTG

GCC

AGC

AGA

GAC

GAC

CAC

GGA

GCC

CCT

TTC

579

Val

Thr

Ala 175

Thr

Val

Leu

Ala

Ser 180

Arg

Asp

Asp

His

Gly 185

Ala

Pro

Phe

TCA

TGC

CGC

ACA

GAA

CTG

GAC

ATG

CAG

CCC

CAG

GGG

CTG

GGA

CTG

TTC

627

Ser

Cys 190

Arg

Thr

Glu

Leu

Asp 195

Met

Gin

Pro

Gin

Gly 200

Leu

Gly

Leu

Phe

GTG

AAC

ACC

TCA

GCC

CCC

CGC

CAG

CTC

CGA

ACC

TTT

GTC

CTG

CCC

GTG

675

Val 205

Asn

Thr

Ser

Ala

Pro 210

Arg

Gin

Leu

Arg

Thr 215

Phe

Val

Leu

Pro

Val 220

ACC

CCC

CCG

CGC

CTC

GTG

GCC

CCC

CGG

TTC

TTG

GAG

GTG

GAA

ACG

TCG

723

Thr

Pro

Pro

Arg

Leu 225

Val

Ala

Pro

Arg

Phe 230

Leu

Glu

Val

Glu

Thr 235

Ser

TGG

CCG

GTG

GAC

TGC

ACC

CTA

GAC

GGG

CTT

TTT

CCA

GCC

TCA

GAG

GCC

771

Trp

Pro

Val

Asp 240

Cys

Thr

Leu

Asp

Gly 245

Leu

Phe

Pro

Ala

Ser 250

Glu

Ala

CAG

GTC

TAC

CTG

GCG

CTG

GGG

GAC

CAG

ATG

CTG

AAT

GCG

ACA

GTC

ATG

819

188 878

Gln

Val

Tyr 255

Leu

Ala

Leu

Gly

Asp 260

Gln

Met

Leu

Asn

Ala 265

Thr

Val

Met

AAC

CAC

GGG

GAC

ACG

CTA

ACG

GCC

ACA

GCC

ACA

GCC

ACG

GCG

CGC

GCG

867

Asn

His 270

Gly

Asp

Thr

Leu

Thr 275

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala 280

Thr

Ala

Arg

Ala

GAT

CAG

GAG

GGT

GCC

CGG

GAG

ATC

GTC

TGC

AAC

GTG

ACC

CTA

GGG

GGC

915

Asp 285

Gln

Glu

Gly

Ala

Arg 290

Glu

lie

Val

Cys

Asn 295

Val

Thr

Leu

Gly

Gly 300

GAG

AGA

CGG

GAG

GCC

CGG

GAG

AAC

TTG

ACG

GTC

TTT

AGC

TTC

CTA

GGA

963

Glu

Arg

Arg

Glu

Ala 305

Arg

Glu

Asn

Leu

Thr 310

Val

Phe

Ser

Phe

Leu 315

Gly

CCC

ATT

GTG

AAC

CTC

AGC

GAG

CCC

ACC

GCC

CAT

GAG

GGG

TCC

ACA

GTG

1011

Pro

lie

Val

Asn 320

Leu

Ser

Glu

Pro

Thr 325

Ala

His

Glu

Gly

Ser 330

Thr

Val

ACC

GTG

AGT

TGC

ATG

GCT

GGG

GCT

CGA

GTC

CAG

GTC

ACG

CTG

GAC

GGA

1059

Thr

Val

Ser 335

Cys

Met

Ala

Gly

Ala 340

Arg

Val

Gln

Val

Thr 345

Leu

Asp

Gly

GTT

CCG

GCC

GCG

GCC

CCG

GGG

CAG

ACA

GCT

CAA

CTT

CAG

CTA

AAT

GCT

1107

Val

Pro 350

Ala

Ala

Ala

Pro

Gly 355

Gln

Thr

Ala

Gln

Leu 360

Gln

Leu

Asn

Ala

ACC

GAG

AGT

GAC

GAC

GGA

CGC

AGC

TTC

TTC

TGC

AGT

GCC

ACT

CTC

GAG

1155

Thr 365

Glu

Ser

Asp

Asp

Gly 370

Arg

Ser

Phe

Phe

Cys 375

Ser

Ala

Thr

Leu

Glu 380

GTG

GAC

GGC

GAG

TTC

TTG

CAC

AGG

AAC

AGT

AGC

GTC

CAG

CTG

CGA

GTC

1203

Val

Asp

Gly

Glu

Phe 385

Leu

His

Arg

Asn

Ser 390

Ser

Val

Gln

Leu

Arg 395

Val

CTG

TAT

GGT

CCC

AAA

ATT

GAC

CGA

GCC

ACA

TGC

CCC

CAG

CAC

TTG

AAA

1251

Leu

Tyr

Gly

Pro 400

Lys

Ile

Asp

Arg

Ala 405

Thr

Cys

Pro

Gln

His 410

Leu

Lys

TGG

AAA

GAT

AAA

ACG

AGA

CAC

GTC

CTG

CAG

TGC

CAA

GCC

AGG

GGC

AAC

1299

Trp

Lys

Asp 415

Lys

Thr

Arg

His

Val 420

Leu

Gln

Cys

Gln

Ala 425

Arg

Gly

Asn

CCG

TAC

CCC

GAG

CTG

CGG

TGT

TTG

AAG

GAA

GGC

TCC

AGC

CGG

GAG

GTG

1347

Pro

Tyr 430

Pro

Glu

Leu

Arg

Cys 435

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser 440

Ser

Arg

Glu

Val

CCG

GTG

GGG

ATC

CCG

TTC

TTC

GTC

AAC

GTA

ACA

CAT

AAT

GGT

ACT

TAT

1395

Pro 445

Val

Gly

Ile

Pro

Phe 450

Phe

Val

Asn

Val

Thr 455

His

Asn

Gly

Thr

Tyr 460

CAG

TGC

CAA

GCG

TCC

AGC

TCA

CGA

GGC

AAA

TAC

ACC

CTG

GTC

GTG

GTG

1443

Gln

Cys

Gln

Ala

Ser 465

Ser

Ser

Arg

Gly

Lys 470

Tyr

Thr

Leu

Val

Val 475

Val

ATG

GAC

ATT

GAG

GCT

GGG

AGC

TCC

CAC

TTT

GTC

CCC

GTC

TTC

GTG

GCG

1491

Met

Asp

Ile

Glu 480

Ala

Gly

Ser

Ser

His 485

Phe

Val

Pro

Val

Phe 490

Val

Ala

GTG

TTA

CTG

ACC

CTG

GGC

GTG

GTG

ACT

ATC

GTA

CTG

GCC

TTA

ATG

TAC

1539

Val

Leu

Leu 495

Thr

Leu

Gly

Val

Val 500

Thr

Ile

Val

Leu

Ala 505

Leu

Met

Tyr

GTC

TTC

AGG

GAG

CAC

CAA

CGG

AGC

GGC

AGT

TAC

CAT

GTT

AGG

GAG

GAG

1587

188 878

Val

Phu 510

Arg

Glu

His

Gln

Arg 515

Eur

Gly

Eur

Tyr

His 52 0

VaU

Arg

Glu

Glu

AGC

ACC

TAT

CTG

CCC

CTC

ACG

TCT

ATG

CAG

CCG

AGA

GGGS

GCA

ATG

GGG

Eer

Thr

Tyr

Leu

Pro

Leu

Thr

Eer

Met

Gln

Pro

Thr

du

Ala

Mut

Gly

525

50S

535

540

Gil

GGG

CCG

TCC

AGA

GCT

GAG

TGACGCTGGG ATCCGGGATC GAGGTTGGCG

Glu

Glu

Pro

Ser

Arg

Ala

Glu

545

GGGGCTTGGC TGTGCyCTyG GATTCCGCAC CAATGlGGCC TTCAAGCTCC CAGAGlAGAG gllallggga aaaaaaaaaa laaaaaaaag laaaa (2) DnOrgmaceg o EKK RR DD:5:

(i)Chagaktegystyka sekwencji:

CA) Długość: 4900 par casad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DRA(ggnomrwy) (ci) Opis sekwencei:EKK RR DD:5:

yCGLAyGyτy CTCGGCCTCT GGTCTRCTCT GGRCCTGGGG ATCCTGGGCA tctcaggtgg

GGAGAGCCCG CCCGTGGAGC RGGGTGGATA AGGCGGGGGC GGGGTTGAAG GACCAGAGGG

GGCGGCCCGG GTGTCCCCCT CCAGGCTCCG CCCTCTTCTA GCTTCCCACG CTTCTGTCAC

CACCTGGAGR TCGGGGCTTC TCCCCGTCCT TCCTCCACCC CAACACGCCT CAGTCTTTCA

GARCTGAACC CAGCACCTTT TCTGGARTRG GGGRNTTGCG CCTlACCTGT CTCGGGAGAR

ACTGTGGCTC TCCTGTCCTC TCCTGCTCTG TRATGCCCTA TGGTTCACAG ACTGGCATCA

TCCCTATTCA TGATCCTCAG AGACRCCATC TCCTCGACTG TCATAACTCA GAGCTCTATT

CCCCCTCCAC CTGGAGCCCT GGAAACCGGC TTTCTAGGGC TTTTCTCCGC GGTTCTTTCC

CGGAGTTCAG CGTTGTGGCT TTTTGTCCGG GTTACTClGG TTTGGGGACA ATCTCCTTTA

GGCCTTTGAC TCAGTCTCAT TTCCACTTTG CTTTTGCCCC AAGCCTCTGT GTCTCTCCCC

CGTTTCCTGA CGATCTGTCA GAGTCTTGAG AGTGATTTGG TTCCCCATCC CCCCTCCAAC

TGGGGTCTCC TCCTCACTAT TGGTGTGTGC ATCTGGGACC CCCATCCCCG CACCGAGTTT

CCCCGTCTCT GTCAGTGAGG AGCAAGGCTT CCAGAGACAG CCCTCTAGTA GCGCGTCAGT

CCCGAGTCTT GAGTGGGATG CGGGGCTCCC GTGCTATTTC TTGGCGGAGG TCTTTCCTGG

TCCTTATGGA CACCCCTGGT TTGGGGTATG GGGGCCGCTA GGATTTCAGA GATGGGGTCC

CTAGGCTGAG RCCGCGTTTT CCCGGGCAGC GGTCGCGCTA GGGCCTTTCT GGGCGGACCT

TCAGCCCCGC GTGGCGCTCG TGGAGCGCGG GGGCTCGCTG TGGCTCGACT GCAGCACTAG

CTGTCCGAGG CCGGAGCGCG GTGGCCTGGG GACCTCGCTA CGCCGGAGCG GGACCCAGAG

1635

1686

1740

1781

120

180

240

300

300

420

480

C

000

000

720

780

840

900

0

1020

1080

188 878

CCCGAGCNGC	GGNCTGCAGC	CAAAGCTCGT	CCACATCCCA	CANCCTCAAA	CCCACCCCCG	1140
atcctgcgtc	CNCGGCGCGC	CCCGCACACG	CCAAGCCCCT	CGCCTCATCC	CGACTGGCCC	1200
GCGCTGAGCC	CTCCGCAANC	CCCTGGGCGC	TCTCCACAGC	CCCCGCAAGC	TCCTCCCACC	1200
CCCCATCTCG	TCCGCCTGCT	TGTTCGCGAG	GTACTACAGC	TGCCGGCAGC	gcactgggtc	1320
CTCCATTCCG	GAGCCACCCC	AGCCCGTACA	GCGACGGCCG	CTCCCTCCTT	CCCACCCTGG	1380
GCCTCGCAAC	TGCACCGGGA	CCTCCGGCGT	CCCGCCCGAA	CCACCCCGAC	CCAGCATCAC	1440
GGTCGCCTTC	CGCCCACCCG	CCCGCGACCT	GATTAGCCGA	AGGGGCCGAG	CCGACCCACC	1500
CCCGCCTCCC	CCGGCCATGC	GCACCGCCGC	CCTCCGCGCG	CGAACACAGG	AGCACACGCC	1500
CGGGTTCTCG	TCACTCCCGC	AGATTGACCT	GCCNCCACAC	GCATGCCCAC	TCTGGCCANA	1020
CGCCTCGCCC	CCCACACAGC	TCCCCACGTT	TGCTGAGTCG	GCACCCTAAC	TCACACATTG	1080
TAGCGGCTTT	ACGGCACCCA	CCACTCCTCC	CATGCGCTCG	GAGCCCCTGA	GTCACACCCC	1740
AACAACANCT	GAGNCCCATC	TCGGCTGGAT	GAAGAGGCTA	GCTCGTCTAC	GTGACCACCN	1800
CTCCGTACGT	AAATACCCCA	GAAGTCTGAC	CAGCTAGCCC	GGACTGACAG	CACAGCTACT	1800
AGCTTAACTA	CTTGCGCCTG	GCACCTTTTG	CCGTTATGGA	GTGACGCCTT	CACACAAAAA	1920
CACGCGGGCT	CTACCGGCAG	TGGTCCACAG	CCCCAAGGCC	TGGTGTGCAA	GTGAAACAAG	1980
GGCCGCCCCT	GCTGCCCGGC	CAGCCGGTGG	CGCCTACCCG	TGATATTACC	TCCGCGCCCT	2040
GTCTTGCTNG	CAAGCGCCGA	CGCTTCCCCA	CCCAGCGCGC	CCGCTCCGCT	CTATCTGGAC	2100
GCTCGAGCCA	GACAAGCCAT	GCAGAGTCGT	TGATCAACAC	TCGATGTTTG	CGTCGTGGAG	2100
TCGGCATCTC	GGCTTGCGCT	TCCTCACCCA	TCCCGCCACT	TTCCCCCCAG	CCTTATTCCC	2220
CCGCCGTTCT	GACAACTGCC	CGCACGAGCC	CCCCTCACKG	CAACTTTCGA	TGGGCTGGTG	2280
CCTCCCCCGC	AAGCCGGCGT	TTACTTCTCG	CTCGGAGAGC	ACAGGCGTCA	TCCTAAGGTC	2340
GCCCGCCACC	GCCAGAGAAG	TCTCCCCACG	CCCACACAGA	CAGCAGGGCA	GCAACAGGAA	2400
CCCGACGGAC	AGCTGAGCGC	CGTCGTCACC	CTCCCCCGCG	AAACCAGCGG	GGCCCGGCGA	24δ0
AACAGCACTC	GCTACACGAA	CGGCAGGCCA	ACAGGACCGG	AAATACCTCA	CACTCCCCCT	2520
CCCCCTCCCT	CGCGGGCGGG	CCCCACACTC	GAGAGAAGGC	CCACCCGAGA	GACTCCCCGG	2580
CGCCGCCGCG	CCACAAAAAG	CCCGGCCCGA	CACTGCCAGG	CCAGCACCAC	GTGCAGCGTC	2040
GGGATTGATA	CATTCGGGGC	ACGTCCCTCA	CTGCGCAGTG	GACCCCACCC	AGTTCTCTCT	2700
CCCCGCCCTT	CCCCCCGCCG	CTTCTGGCTT	TAAGTCACCC	ACGAGCCCCC	CAGGCAGAGA	27δ0
GCCTCGCCCT	AAGCTGCGCG	CCAGGGCCCC	CACCCCTTGT	CACCTGCGAC	CCAATTCCAA	2820
CGGCCCTCGT	ACCGCCCCCA	TCTGGGACCT	TATCGGATAC	CCTCTGCCGC	GTCCCCCCAC	2880
ACCCGACTCC	CAGGGATGAC	TGCGACTCTC	CCACGACCGG	CACGTGCCCA	CACGCTCCAC	2940
AGCGCACCCT	CCACTGCGAG	GCCCCTCGAA	ACCCGCAGCC	CGCCCTCCAC	TCTCCAAGCC	3000

188 878

CTGACGGTGG	GGCGGTGCTA	GCGCTGGGCC	TGTTGGGTCC	AGTGACCCGT	GCCCTCGCGG	3060
GCACTTACCG	ATGTACAGCA	ATCAATGGGC	AAGGCCAGGC	GGTCAAGGAT	GTGACCCTGA	3120
CTGTGGAATG	TGAGTAGGGG	GAGGTGGGCA	TGCTTATCCC	TTTAAGGTCA	CGGAGTGTAC	3180
TGGGAGACTG	GCTATACGGA	AAGGAAAGAA	GCCTAGGTTC	AGCAGGGATT	GGGAAAACAC	3240
TGAAGGAAAG	TGGTGTGGTG	TTTACAAACT	TAACGGTGGT	AACTGGGCAC	GGTCTGGCAA	3300
AAACAGACAG	CCAAGAGAGT	GTGCCTGGGA	AGCTGCAATG	GGGGCTTTGT	GGGAATTGGT	3360
CAACAGCACC	CTGAGATCTC	AGGAAAGGGG	CCTGAAGTTA	TCTCCAGAAC	CCATGTGAAG	3420
GCAGGAAGAG	AGAACGCCCA	CCTTTTCCTG	CTCCCCCCAA	CCCCCCCCCA	CATATCACAC	3480
GGAGTATATA	AATAAATAAA	ATGGCTCCTG	CCGGAGGGAG	TGAGAAGCTG	TCTCCTGCAG	3540
GCTCAGAGCA	GTGGTAGTGC	ATGCCTTTAA	TCCCAGCACT	CGGTAGGCAA	AGGCAGGCAG	3600
ATCTCTGTGA	ATGTGGGGCC	AGCCTGGTCT	GTACAGAGAA	ATCCTGTCTC	AAAACAAACC	3660
AGCAAAGAAA	CAAAACCAAA	ATCAATTCCA	GATGCCCCAG	CGCTGGACAG	TGTAGGCTGC	3720
CCANGACGTA	TTACTTGNCT	GGAGGGGACA	GAGGCATCGC	TTAGCTGTGT	GGCACACGGG	3780
GTCCCACCAC	CTAGCGTGAG	CTGTGTGCGC	TCTGGAAAGG	AGGAAGTCAT	GGAAGGGCCC	3840
CTGCGTGTGG	CCCGGGAGCA	CGCTGGCACT	TACCGATGCG	AAGCCATCAA	CGCCAGGGGA	3900
TCAGCGGNCA	AAAATGTGGC	TGTCACGGTG	GAATGTGAGT	AGGGGTGGCT	ACGGAAATGT	3960
CCACACCTGC	GTCCTCTGTC	CTCAGTGTGA	ACTCCTATTT	CCCTGCTTCC	TAGATGGTCC	4020
CAGTTNTGAG	GAGTTGGGCT	GCCCCAGCAA	CTGGACTTGG	GTAGAAGGAT	CTGGAAAACT	4080
GTTTTCCTGT	GAAGTTGATG	GGAAGCCGGA	ACCACGCGTG	GAGTGCGTGG	GCTCGGAGGG	4140
TGCAAGCGAA	GGGGTAGTGT	TGCCCCTGGT	GTCCTCGAAC	TCTGGTTCCA	GAAACTCTAT	4200
GACTCCTGGT	AACCTGTCAC	CGGGTATTTA	CCTCTGCAAC	GCCACCAACC	GGCATGGCTC	4260
CACAGTCAAA	ACAGTCGTCG	TGAGCGCGGA	ATGTGAGCAG	GGGCCCAGGT	GGGCGGAGAG	4320
TACCGGGTGT	CCCAGGATCT	TTTCTTTCCC	TGATGCCCCT	CCTTATGGTG	GCTCATCTGC	4380
AGCACCGCCA	CAGATGGATG	AATCCAGTTG	CCCGAGTCAC	CAGACATGGC	TGGAAGGAGC	4440
CGAGGCTACT	GCGCTGGCCT	GCAGTGACAG	GGGNCGCCCC	TCTCCACGCG	TGCGCTGTTC	4500
CAGGGAAGGT	GCAGCCAGGC	TGGAGAGGCT	ACAGGTGTCC	CGAGAGGATG	CGGGGACCTA	4560
CCTGTGTGTG	GCTACCAACG	CGCATGGCAC	GGATTCACGG	ACCGTCACTG	TGGGTGTGGA	4620
ATGTGAGTGA	GGACAGCGCT	GAATGAAGAC	GACTCAGACC	GCCAGAAAAG	TGCCTTGAGG	4680
CCTGGGATGT	ATGATCCAGT	GGGTAGAGTG	CTCAATTAGC	ACTCACTAAA	ATGTATATTC	4740
TATTCCTAAT	actctttaat	TTTANCCTTT	GGGAGGCAGA	GACAGGCAGA	TCTCTGTTCC	4800
GGGATAACCT	GCTCTCTGTC	TAGGACAGCT	TGGTCTACAG	AGGGGNTACA	GGCCCCCeCT	4860

CCCAAGATTG NATAGCAACC CTCTGGCTCC CTGTCTCTCT

4900

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:6:

(i)Charaktersstskτ sekwencji:

CA) Długość: 1295 pae zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (Ci) Opis stkwtncji:eEK NR ID:6:

NGAAThCCGG	CGGAhCGGGh	AGAGCTAGTG	CCTCTGCChC	CTTGGCAGCC	TGTAGGTGAG	60
AAChhCACCT	TGAGCTGCAG	GGTCCCGGGG	GCAGGACCCC	GAGCGAGCCT	CACATTGACC	120
TTGChGCGAG	GCGGCCAGGA	GCTGAhTCGC	CGAAGTThCG	TAGGCGAGCC	ACCCCGAGCT	180
CGGGGhGCGA	TGCTCACCGC	CACGGTCCTG	GCGCGCAGAG	AGGATCACAG	GGCCAAThTC	240
TCAhGCCTCG	CGGAGCTTGA	CCTGCGGCCA	CACGGCThGG	GACTGTTTGC	rAACAGCTCA	300
GCCCCCAGAC	AGCTCCGCAC	GTTTGCCATG	CCTCCACTTT	CCCCGAGCCT	TATTGCCCCA	360
CGAhTChTAG	AAGTGGGChC	AGAAAGGCCG	GTGACTTGCA	CTThGGATGG	ACTGTTTCCT	420
GCCCCAGAAG	CCGGGGTTTA	CCTCTCTCTG	GGAGATCAGA	GGCTTCATCC	TAATGTGACC	480
ChCGACGGGG	AGAGCCTTGT	GGCCACTGCC	ACAGCTACAG	CAAGTGrAGA	ACrGGAΑGGC	540
ACCA^ACAGC	TGATGTGCAh	CGTGACCChC	GGGGGCGAAA	GCAGGGAGAC	CCAGGrAAAC	600
ChGAChGTCh	ACAGCTTCCC	GGCTCCTCTT	CTGACTThrA	GTGAGCCAGA	AGCCCCCGAG	660
GGrAΑGAhGG	TGACCGTm	CTGCTGGGCA	GGGGCCCGAG	CCCTTGTCAC	CTTGGAGGGA	720
AhhCCAAGGA	CCCTCTTACC	GGCCCCATCT	ThArCChhΑT	CGTATCCCCT	CTGCCTCATG	780
CCCGCAGACG	CACCTCGGCh	GGATGACThG	GACTGTCCCA	GGAGCTGGAC	GTGGCCAGAG	840
GGhCCAGAGC	AGACCCTCCA	CTGCGAGGCC	CGTGGΑΑrCC	CTGAGCCCTC	CGTGCACTGT	90C
GCrrGGCChG	ACGGTGGGGC	GGTGCTAGCG	CTGGGCCTGT	TGGGTCCAGT	GACCCGTGCC	960
CTCGCGGGCA	ChTACCGATG	hΑcrGcrrhc	mOGGcm	GCCAGGCGGT	CAAGGATGTG	102C
rccchGrcτG	TGGAATATGC	CCCAGCGCTG	GACAGTGTAG	GCTGCCCAGA	ACGTATTACh	1080
TGGCTGGAGG	GGACAGAGGC	ATCGCTTAGC	TGhGTGGCAC	ACGGGGTCCC	ACCACChAGC	114 0
GTGrGCTGhG	TGCGCTCTGG	rArGGAGGrΑ	GTCATGCm	GGCCCCTGCG	TTTTGGCCGG	120-
GrGCACGChG	GCACTTACCG	AhGCGAAGCC	ATCA.ACGCCA	GGGGAhCrGC	GGCcrAAArτ	1260
GTGGChGTCA	CGGTGGAAhA	TGGTCCCCGG	AATTC			1055

(2) Informacje o SEK NR ID:7:

(i)Charτkttosstskτ sekwencji:

(Α) Długość: 2214 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

188 878 (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (xi) Opis sekwencji^EK NR 1D:7: (xi) SROUENCE DESCR1PT1ON: SEQ 1D NO:7:

TGGGCTTTTG GTCGGACCCC GAATGTCTAT CCCGTGTTGC GTTAGGCGCT TGGCCTGAGC	60
TTClTCCGTA TCCTTGTTCC CGAACGCCCT GGCCGTGlAG ATTTTACGCG TGTCCTCCCT	120
GCCTCGGCTC CTCAGGGGCC TGACCGGCTT GTTGTTTGCG GTTGACTGGC	180
GGTTCTGCCT CGTGTGTGTT CGGTCTCCCC GTCTGTTGTG GCGTAATGGC ACTATTlACC	200
CTTCCACGCC CGGCTGCGAT GCYTCGGGGA TCTCCTTGTC TTGGGATGTT ATTCAGGGTA	300
CCTCCCCCCG GCCCGTGTTA CAGMCAGTTG GCACTCCGGA CCCTCGGATT CATGCGCCCT	360
CTTTTCCTTG TCCCGTGTGT TGCACATGCC GAGNGGCTCG CTCTGCTTCl GCTTCCTGGC	020
GGTCCGGCCG GGTGCGGTCA GCGTTCCCTN CCTCGCGCTA GCTCCCGCGC CGGGATTTCA	080
CTTCGGCTCG CGCGGCCTTC CCCCTAGGAC TTTAGGTGGC CTTTATACCG GCCTTTCCTC	500
CGCCTCGCTG GGAGCTAGGG CGTCCGACGT TTGGAGCTGG GCTACTTCGA CCCTGGGGTC	600
TCACGCCTAT CCCTGCTTCC CGCGTGTCCA GGCACGGTTG CAGGGCTlAT CGCCCGCGTC	660
CTGTCGGCTC CGGTCTGCGC GCGTGTCCTT TCCGACTGTC CGT1GΑTΑGT CCAGTTTCTA	720
CGTGGTTTTG TACCCCGTGT GCCCTTTTAC CTCCCTTGGG CCTCGGTGNT CCACAGTTCC	780
TGGlACTGGG CTTlGGGACT TCCGTCGTGG GCGCTTTCGG CGGGTTCTGT TACCCCTCAC	800
lACTTCCGCC CTATTCTCTT TTCGCATACC AGAGATCCTA CCCTlATCTC GCTCCTCACC	900
GGCACACTTC TCTCGTTATT CNTGCGGMTA CAGCAGGCCA GClATAGGlA CCCACCAAAC	960
GGTTCGTCCC CGTCCTGATT CGTCTGGGTT AlAGCGGGCA CGTTTACClA lACTCGACGT	1020
TTClTGGTTT TCTGGCTCTC TGCTTCACTC CGAGTCGGTC GGAGCTTTTT GATCCAlACA	1080
TGCTCΑTCGT lACTGTTTCA GCACTGGTTC CAGCTTTTCG TACCTCGTAC CCGATTTTGG	1100
TCCTCCCTTT CGTGTACCCC GTCGGGTCTT ACCCAAATCC CGCGGAClAT GGCAATlACC	1200
TTGCCTCCCC CTGTGATGTG GTTTTTCGCG TCCATGGCCA lACCTGGGTG AAGAATTACA	1260
CCGTGGGCTT CTCTCGTCGG CATGTGTCCT CGCTGCGCCG CTTCTGTGGT CCCACCAGCT	1320
GGGCGCGGCC GGGCGCTCCG ClGTlClCCT TCCATCGTGA GCTTTCCGGG AlCCTTTGGT	1380
TTCTCGTCCA TTCTGTGAGC TTTCGCCACG TGACCACGTG ACCGCGCGGT CCGGTCTAGC	1000
TlGCGGTCTG TCTTTTTGTC CCGATGTACC GGTTTGTGGC AGTClATCCC CGATTTCAGA	1500
TCCCTGAGCA CTTGATCTTC GCTCTGClAT ATTCCTTAGT GCGGTATACC CTAGTTGTCC	1560
TGGGGCGTlC GACTTCCCTG TGCCTCGTAC GCGCACTCCG GATTGACGTT GTACATGTGG	1620
CTTCGTTGTT CGCTGTCGTC TGCCTGTCTG TCGCAlAGTA TGAAGGCATG CGAGCGTCTC	1680

188 878

TGCGTGTGGC	CCGGGAGCAC	GCTGGCACTT	JGC^C7C3C^7rC^C^C3A	AGCCATCCAGC	GRCAGGGGAT	1740
CAGCGGWCAA	AGATGTGGCT	GTCACGGTGG	CAGTATGGTCC	SCGGCTTCGGGG	GAGTTGGGCT	1800
GCCCCAGYAA	CTGGACTTGG	GTAG7GGA3AT	CTCGGAAAGCT	GTT1TCCTGT	GAAGTTGGTG	1800
GGAAGCCGGA	ACCACGCGTG	GAGTGCGTGG	GCTCGGAGGG	TGCAAGCGCAl	GGGGTAGTGT	1920
TGCCCCTGGT	GTCCTCGAGC	TCTGGTTCCA	G7AGGCT<yTAT	GACTCCTGGT	AACCTGTCAC	1980
CGGGTGTTTA	CCTCTGCAAC	gccacccclcc	GGIMGTGGNTC	CACAGTCZGGG	ACAGTCGTCG	2040
TGAGCGCGGA	ATCACCGCCA	CAGATGGATG	AATCCAGTTG	CCCGAGTCAC	CAGACA^TCGR	2100
TGGAAGGAGC	CGAGGRTGCT	GCGCTCTGCCT	gcagtgccag	ACGCNCGCCCC	TCTCCACGCG	2100
TGCGCTGTTC (2)	CAGGGAAGGT Informacje	GCAGMCAGGC o EKK RR DD	ctcgtlglggnt :8:	ACACGlTGTCC	CGAG	2214

(i)yhcraktugsstska sekwencji:

(A) Długość: 5077 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: : D^^en^owy) (ci) Opis sekwencji:EKK RR DD:8:

CCGAACGCTC	CTCGGCCTCT	GCTCTRCTCT	GGRCCTGGGG	ATyyTAGGCA	TCTCAGGTGG	00
GAAGAGCCCG	CCCGTGGAGC	RGGGTGGATA	AGGCGGGGGC	GGGATTGAAG	GACCAGAGAG	120
GGCGGCCCGG	GTGTCCCCCT	yCAGGyTCCG	CCCTCTTCTA	GCTTCCCACG	CTTCTGTCAC	180
CGCCTGGAGR	TCGGGGCTTC	TCCCCGTCCT	TCCTcyiycc	CAACACGCCT	CAATCTTTCA	240
GARCTGAACC	CAGCACCTTT	TCTCGARTOG	GGGR^RTTGCA	CCTAACCTGT	CTCGGGGGGR	300
ACTGTGGCTC	TCCTGTCCTC	TCCTGCTCTG	TRATGCCCTA	TGGTTCACAG	AyTGGyGTCG	300
TCCCTATTCG	TGGTCCTCGG	AGACRCClTC	TCCTCAACTG	TCATAACTCA	GAGCTCTATT	420
CCCCCTCCAC	CTGGAGCCCT	GGAGACCGGC	TTTCTAGGGC	TTTTCTCCGC	GGTTCTTTCC	480
CGGAGTTCAG	CGTTGTGGCT	TTTTGTCCAG	GTTAyTCAAG	TTTGGGGACA	ATCTCCTTTA	540
AGCCTTTGGC	TCAGTCTCAT	TTCCACTTTG	CTTTTGCCCC	AGGCyTyTGT	GTCTCTCCCC	000
CATTTCCTGA	CGATCTGTCA	GAGTCTTAAG	AGTGATTTGG	TTCCCCATCC	ycycTycGiy	660
TGGGGTCTCC	TCCTCACTAT	TGATGTGTGC	ATCTGAGACC	ccciTcyccG	yACCGAGTTT	720
CCCCATCTCT	GTCAGTGAGG	AGCAAGGCTT	CCAGAGACAG	CCCTCTAlTA	GCGOGTCAGT	780
CCCCGGTCTT	GAGTGGGATG	CGGGACTCCC	GTGCTATTTC	TTGGCGGAGG	TCTTTCCTGG	840
TyCTTATGGA	clcccctggt	TTGGGATATG	GGGGCCGCTA	GGATTTCAGA	GATGGGGTCC	900
CTAGGCTGAG	RCCGCGTTTT	CCCGGGyGGC	GGTCGCGCTA	GAAyyTTTCT	GGGCGGGCCT	960

188 878

TCGCCCCCCC	CTCCCCCTCC	GGCAGCGCCC	GCGCGCCCGG	GCGCTCGACT	CCACCACTAA	1020
ATCTCCCACC	CCGCAGCCCG	GTCCCCTCGA	CACCGCGCGG	CGCCCAGACC	CCACCCGCAG	1080
CCCTCTCNAC	TCNCGGGCTC	GACACCGCGT	GCACATCCCA	GGNCCTAGAA	CCCACCCACT	1140
CTCCTTCTTC	CNCTCCCCGC	GCCCAACAAT	CCGACCCACT	CCCATAAGCC	GAACGTTACG	1200
TCACTTCACC	GTGGAAAANC	CCCTGCCGTC	TCTCCACCTC	CCCCGCAGCC	TCCTCCCACC	1200
CCCCCGCGCA	TCCTCCGCCT	GGTTCTCAAA	CGACGACACC	GCCCTAGGGC	CCGGTTGGGG	1320
GTCCCTTCCA	GAGCCACCCC	ATCCCCTAGA	GATACGCCCT	CTCCCTCCTT	GCCACCCTGG	1380
GGCTCACGAC	TTCACCGTCA	GCTCCACCAT	CCCGCGCCCA	GGACCCCGAG	CGGGCCGCGC	1440
AGTGACCTTC	CTCCCACCCG	CCCACGGGCT	CATTCCCCCA	AGTGTCGGAG	GCCACCCACC	1500
CCGACCTCGG	GCTGCGATGC	TCACCGCCAC	GCTCCTGCCC	ACCAGACACA	ATCACACGCC	1500
CAAGGGCTCA	TCCCTCGCCG	ACCGGGACCT	GCCNCCACAC	GCCTTCCGAC	TCTTTCCANA	1020
AGCCTAACCC	CCCGGACACC	GCCCCACCTT	GGCGGAGGGT	GGACCCTAAC	TCACACATTG	1080
TAACAGCTTT	ACCGCACCCA	CCCCTCGTCC	CATGCGCTCG	GACCCCCTGA	CTCCCACCCC	1740
AACCACANCT	AACNCGGATC	GCTTGTGAAG	GAGAAGTCTA	ACTCGTCTAA	ATGACCAGAN	1800
CTCCATGCTT	AAATCCCCCA	AAACTCGAAC	CGCCTAGCCC	TTACGTCCAA	CGAGAGGACT	1800
ACCTGGGGTG	CTTGAGCCTA	GGAGAGGTTT	CCTTTATGTA	GGGACTCGTG	CACACAAAAA	1920
CGCGCTCTCG	CTGCCGCCCT	GTATGAACAT	GCCCCACGCC	GTCGATCCAA	CTTAAGCGAG	1980
AACCACCCCT	GCTGCCCTTC	CAGCCTCTCC	CTCCTACCCG	GCCTATTGCC	TCCTCGCCCG	2040
TTGTTGCTNA	CAACCCCCTA	GCCTTGGCCA	CCCATCTCCC	CCGCTCCTCT	CTGTCTTTAG	2100
GCTCAAACCA	CACAATGCAT	CCAGATTCCT	GGAGAGACAA	TGAATCTTTA	GTTCGTAAAT	2100
TCAACCTCTG	TTCTTTCTCG	TCCTCAGCCG	GCCCTCCACT	TTCCCCCCAG	CCTTATTCCC	2220
CCACCATTAT	TACAACTCCG	CTCAGAGACG	CCCCTGACKT	CAGCGGTAAA	TCCACTCTTT	2280
CCTCCCCCGC	GACCCCCGCG	GTAAGTCGCT	CTCCCAGATC	AAAGCCTGCA	TCCTAATCGC	2340
GCACTCCACC	CCCACAGCCT	TGTCGCCACT	GCCACACCGG	AGCCAGCTGA	ACAACACGAA	2400
GCCACCGGAC	GGCTGGGCTG	CATCCTCAAC	CTCCCGCCCG	AAACCGCCCA	CACCCACCAG	24S0
GGCCTGGCTC	GCTAAACTAA	GAGCAATCCA	ACAGGACCTT	CAATACCTCA	CACTCGCGCT	2520
CCCCCTCCCT	CGCGCTCTCG	CCCCACACTC	GCACAAACCA	GCACCCTAGA	GACTGGGAGG	2580
GGAATCCACG	CAGCAACAAC	CCCCCCGCCG	GACTTCCACC	GCACGACCGC	AGAGAAGTTG	2040
CAAATTGGTA	CGGTCCGTTC	AGTTCCCGCA	GTCCCGAGTC	AACCCCACCC	AATGCTCGGT	2700
CCCCGCCCTT	CCCCCCGCCG	CTGCTCACGT	TAACTGACCC	ACAACCCCCC	CACCCAAAGA	2700
TCCGCGCCCT	GACAGGAGGA	GCAGCCCCCC	CACACAGGGG	AACCTTCGAG	CCAATGCAAG	2820
CTCCCCTCCC	TCCCCGGACC	CAGGACCGCC	AGGGAAAGCT	CACAAACAAT	CACGAAAAGA	2880

188 878

GGGGCTTCTT	CTGCGACGCT	GCCCTCGATG	TGGACGGGGA	AACTCTGAGA	AAGAACCAGA	2940
GCTCTGAGCT	TCGTGTTCTG	TGTGAGTGGA	TGTTCACTTT	ATCTCTGTGA	ATTCCAAGGA	3000
CCCTCTTACC	GGCCCCATCT	TTAACCTTAT	CGTATCCCCT	CTGCCTCATG	CCCGCAGACG	3060
CACCTCGGCT	GGATGACTTG	GACTGTCCCA	GGAGCTGGAC	GTGGCCAGAG	GGTCCAGAGC	3120
AGACCCTCCA	CTGCGAGGCC	CGTGGAAACC	CTGAGCCCTC	CGTGCACTGT	GCAAGGCCTG	3180
ACGGTGGGGC	GGTGCTAGCG	CTGGGCCTGT	TGGGTCCAGT	GACCCGTGCC	CTCGCGGGCA	3240
CTTACCGATG	TACAGCAATC	AATGGGCAAG	GCCAGGCGGT	CAAGGATGTG	ACCCTGACTG	3300
TGGAATGTGA	GTAGGGGGAG	GTGGGCATGC	TTATCCCTTT	AAGGTCACGG	AGTGTACTGG	3360
GAGACTGGCT	ATACGGAAAG	GAAAGAAGCC	TAGGTTCAGC	AGGGATTGGG	AAAACACTGA	3420
AGGAAAGTGG	TGTGGTGTTT	ACAAACTTAA	CGGTGGTAAC	TGGGCACGGT	CTGGCAAAAA	3480
CAGACAGCCA	AGAGAGTGTG	CCTGGGAAGC	TGCAATGGGG	GCTTTGTGGG	AATTGGTCAA	3540
CAGCACCCTG	AGATCTCAGG	AAAGGGGCCT	GAAGTTATCT	CCAGAACCCA	TGTGAAGGCA	3600
GGAAGAGAGA	ACGCCCACCT	TTTCCTGCTC	CCCCCAACCC	CCCCCCACAT	ATCACACGGA	3660
GTATATAAAT	AAATAAAATG	GCTCCTGCCG	GAGGGAGTGA	GAAGCTGTCT	CCTGCAGGCT	3720
CAGAGCAGTG	GTAGTGCATG	CCTTTAATCC	CAGCACTCGG	TAGGCAAAGG	CAGGCAGATC	3780
TCTGTGAATG	TGGGGCCAGC	CTGGTCTGTA	CAGAGAAATC	CTGTCTCAAA	ACAAACCAGC	3840
AAAGAAACAA	AACCAAAATC	AATTCCAGAT	GCCCCAGCGC	TGGACAGTGT	AGGCTGCCCA	3900
NGACGTATTA	CTTGNCTGGA	GGGGACAGAG	GCATCGCTTA	GCTGTGTGGC	ACACGGGGTC	3960
CCACCACCTA	GCGTGAGCTG	TGTGCGCTCT	GGAAAGGAGG	AAGTCATGGA	AGGGCCCCTG	4020
CGTGTGGCCC	GGGAGCACGC	TGGCACTTAC	CGATGCGAAG	CCATCAACGC	CAGGGGATCA	4080
GCGGNCAAAA	ATGTGGCTGT	CACGGTGGAA	TGTGAGTAGG	GGTGGCTACG	GAAATGTCCA	4140
CACCTGCGTC	CTCTGTCCTC	AGTGTGAACT	CCTATTTCCC	TGCTTCCTAG	ATGGTCCCAG	4200
TTNTGAGGAG	TTGGGCTGCC	CCAGCAACTG	GACTTGGGTA	GAAGGATCTG	GAAAACTGTT	4260
TTCCTGTGAA	GTTGATGGGA	AGCCGGAACC	ACGCGTGGAG	TGCGTGGGCT	CGGAGGGTGC	4320
AAGCGAAGGG	GTAGTGTTGC	CCCTGGTGTC	CTCGAACTCT	GGTTCCAGAA	ACTCTATGAC	4380
TCCTGGTAAC	CTGTCACCGG	GTATTTACCT	CTGCAACGCC	ACCAACCGGC	ATGGCTCCAC	4440
AGTCAAAACA	gtcgtcgtga	GCGCGGAATG	TGAGCAGGGG	CCGAGGTGGG	CGGAGAGTAC	450C
CGGGTGTCCC	AGGATCTTTT	CTTTCCCTGA	TGCCCCTCCT	TATGGTGGCT	GATCTGCAGC	4560
ACCGCCACAG	ATGGATGAAT	CCAGTTGCCC	GAGTCACCAG	ACATGGCTGG	AAGGAGCCGA	4620
GGCTACTGCG	CTGGCCTGCA	GTGACAGGGG	NCGCCCCTCT	CCACGCGTGC	GCTGTTCCAG	4680
GGAAGGTGCA	GCCAGGCTGG	AGAGGCTACA	GGTGTCCCGA	GAGGATGCGG	GGACCTAGCT	4740
GTGTGTGGCT	ACCAACGCGC	ATGGCACGGA	. TTCACGGACC	: gtcactgtgg	! GTGTGGAATG	4800

188 878

TGAGTGAGGA CAGCGCTGAA TGAAGACGAC tcagaccgcc AGAAAAGTGC cttgaggcct	4860
GGGATGTATG ATCCAGTGGG TAGAGTGCTC AATTAGCACT CACTAAAATG TATATTCTAT	4920
TCCTAATACT CTTTAATTTT ANCCTTTGGG AGGCAGAGAC AGGCAGATCT CTGTTCCGGG	4980
ATAACCTGCT CTCTGTCTAG GACAGCTTGG TCTACAGAGG GGNTACAGGC CCCCCCTCCC	5040
AAGATTGNAT AGCAACCCTC TGGCTCCCTG TCTCTCT	5077
(2) Informacje o SEK NR ID:9:
(i)Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1472 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Rodzaj nici: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: cDNA
(xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:9:
NGAATTCCGG CGGATCGGGT AGAGCTAGTG CCTCTGCCTC CTTGGCAGCC TGTAGGTGAG	60
AACTTCACCT TGAGCTGCAG GGTCCCGGGG GCAGGACCCC GAGCGAGCCT CACATTGACC	120
TTGCTGCGAG GCGGCCAGGA GCTGATTCGC CGAAGTTTCG TAGGCGAGCC ACCCCGAGCT	180
CGGGGTGCGA TGCTCACCGC CACGGTCCTG GCGCGCAGAG AGGATCACAG GGCCAATTTC	240
TCATGCCTCG CGGAGCTTGA CCTGCGGCCA CACGGCTTGG GACTGTTTGC AAACAGCTCA	300
GCCCCCAGAC AGCTCCGCAC GTTTGCCATG CCTCCACTTT CCCCGAGCCT TATTGCCCCA	360
CGATTCTTAG AAGTGGGCTC AGAAAGGCCG GTGACTTGCA CTTTGGATGG ACTGTTTCCT	420
GCCCCAGAAG CCGGGGTTTA CCTCTCTCTG GGAGATCAGA GGCTTCATCC TAATGTGACC	480
CTCGACGGGG AGAGCCTTGT GGCCACTGCC ACAGCTACAG CAAGTGAAGA ACAGGAAGGC	540
ACCAAACAGC TGATGTGCAT CGTGACCCTC GGGGGCGAAA GCAGGGAGAC CCAGGAAAAC	600
CTGACTGTCT ACAGCTTCCC GGCTCCTCTT CTGACTTTAA GTGAGCCAGA AGCCCCCGAG	660
GGAAAGATGG TGACCGTAAG CTGCTGGGCA GGGGCCCGAG CCCTTGTCAC CTTGGAGGGA	720
ATTCCAGCTG CGGTCCCTGG GCAGCCCGCT GAGCTCCAGT TAAATGTCAC AAAGAATGAC	780
GACAAGCGGG GCTTCTTCTG CGACGCTGCC CTCGATGTGG ACGGGGAAAC TCTGAGAAAG	840
AACCAGAGCT CTGAGCTTCG TGTTCTGTGT GAGTGGATGT TCACTTTATC TCTGTGAATT	900
CCAAGGACCC TCTTACCGGC CCCATCTTTA ACCTTATCGT ATCCCCTCTG CCTCATGCCC	960
GCAGACGCAC CTCGGCTGGA TGACTTGGAC TGTCCCAGGA GCTGGACGTG GCCAGAGGGT	1020
CCAGAGCAGA CCCTCCACTG CGAGGCCCGT GGAAACCCTG AGCCCTCCGT GCACTGTGCA	1080
AGGCCTGACG GTGGGGCGGT GCTAGCGCTG GGCCTGTTGG GTCCAGTGAC CCGTOCCCTC	1140
GCGGGCACTT ACCGATGTAC AGCAATCAAT GGGCAAGGCC AGGCGGTCAA GGATGTGACC	1200

188 878

GTGACTGTGG	AATATGCCCC	ArGGCGTGAr	IGTGTAAGTT	AGGCGGCCCA	aatggaggag	1260
CTGCAGGGGA	CAGAGGCATC	GGCTAdCTT	itggcacagg	acacgcgcgc	aactagcgac	1320
AGGGGTGTGG	GCTCTGGAAA	GCAACAAOTT	itggaaaggg	agcgccccgg	gggtgggggc	1380
GACGCTGGCA	Ch^ACCGATG	CCWtAGCCAT	lACGCCArGC	cagcggagca	cccTTArAAA	1441
CCTGTCrCGG	TGGrATATCG	TCCCCGMAT	gc			14 72

(2) Informacje o SEK NR ID:10:

(i)Chaoτkttrsstska sekwencji:

(A) Długość: 2550 pae zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (ci) Opis sekwencji:SEK NR ID:10:

tctttgcctt	cgtgggaggg	gcgacctgac	rAGTTCAGCG	gcacctccag	CChCGCCCCG	6 0
gcacgaccct	gaccgacggg	CrCAhTGAGG	ThCGhCCCrG	GCCCCGACCA	CCTCAThCGG	120
tcaacgtttg	tacgtcactt	ACCCCGAGGh	CCCGGTGCGA	TCGhCrGCGC	CAGCGTGGTG	180
ccccccacac	accattatac	CCCGAAhhTC	ggagccctcg	GCGAGCTTCA	CGTCGGGGCA	240
cacggcttgg	gactgtttgg	rAAGACGGCA	gttcggacag	ACGhGCGGAG	GThTCGCrTG	300
CCTCCACTTT	gggccagcct	TATTCCGCGA	ccaggcttag	AAGhGCGCTC	AGAAAGGGGC	360
CTGrCTTGGA	cgttgcatgg	rCTGTTTCGT	GGGGCAGAAC	gggggctgta	CCTCTChChC	420
gcacatgaca	ggcttcattg	GAAGCGGrGC	CTGGACCGCG	AGACCCTTGT	GGGCAChGCG	480
acacctatag	caagtcaaca	rGrGGAAGGC	ACGrAAGACG	TGATCTCCAT	CCTGAGCGhG	540
cgccgcgaaa	gcaggcagag	GGAGCArrAG	CTGrchChCh	AGACCTTGCC	gccgccgggg	600
cTcrchTTAr	ctgagggaca	AGGCGGGCAC	cgaaacaggg	TGACCCTAAG	CTCCTCGCCA	660
cgcgcctgag	gcgtgctcac	gggggaggca	AhTCCrGGhC	CGGTCGGhGG	GCrCCCGCCh	720
cacttctact	TAArTCGGAG	AAAGrATGAC	CrGAAGGGGC	CCTTCTTCTG	CGAGCChCCC	780
CTGirTGTGG	ACGCGCAAAG	TGTCAGrAAG	aaggagacgg	ChCAGCTTCG	TGThChGhAG	840
gcagttcgcc	hCGATGAGTh	GGAGTGTGCC	ACCACCTGCA	CCTGGCCAGA	ggggccacac	900
gacactcttg	ACTCCCACCG	CGGhCGArAC	cgggagccct	GCChGCACTG	tccaacgggg	960
catcctcccc	ggggcggagc	CGTGGGGGTG	ThCGGhGCrG	TGACGCGTGC	CGTCGCCGGG	1020
acgtattgat	GTACACGAAT	CAATGGGGrr	CGGGACGCCC	TGrAGGATGT	gacgctcagg	1080
GTCGrrTrhG	CGCCACGGGT	CGrcrGhChr	GGChCGGGAC	AAGGhATTAC	hhGGCTGGAC	1140
cgcacacagc	GATCCGhhAC	CTGTGTGGGA	CrCCCCGhGG	cagcagcgag	cctcagcgcg	1200

188 878

GTGCGCTCTG	GAAAGGAGGA	AGTCATGGAA	GGGCCCCTGC	GTGTGGCCCG	GGAGCACGCT	1260
GGCACTTACC	GATGCGAAGC	CATCAACGCC	AGGGGATCAG	CGGCCAAAAA	TGTGGCTGTC	1320
ACGGTGGAAT	ATGGTCCCAG	TTTTGAGGAG	TTGGGCTGCC	CCAGCAACTG	GACTTGGGTA	1380
GAAGGATCTG	GAAAACTGTT	TTCCTGTGAA	GTTGATGGGA	AGCCGGAACC	ACGCGTGGAG	1440
TGCGTGGGCT	CGGAGGGTGC	AAGCGAAGGG	GTAGTGTTGC	CCCTGGTGTC	CTCGAACTCT	1500
GGTTCCAGAA	ACTCTATGAC	TCCTGGTAAC	CTGTCACCGG	GTATTTACCT	CTGCAACGCC	1560
ACCAACCGGC	ATGGCTCCAC	AGTCAAAACA	GTCGTCGTGA	GCGCGGAATC	ACCGCCACAG	1620
ATGGATGAAT	CCAGTTGCCC	GAGTCACCAG	ACATGGCTGG	AAGGAGCCGA	GGCTACTGCG	1680
CTGGCCTGCA	GTGCCAGAGG	CCGCCCCTCT	CCACGCGTGC	GCTGTTCCAG	GGAAGGTGCA	1740
GCCAGGCTGG	AGAGGCTACA	GGTGTCCCGA	GAGGATGCGG	GGACCTACCT	GTGTGTGGCT	1800
ACCAACGCGC	ATGGCACGGA	TTCACGGACC	GTCACTGTGG	GTGTGGAATA	CCGGCCTGTG	1860
GTGGCTGAGC	TGGCAGCCTC	GCCCCCAAGC	GTGCGGCCTG	GCGGAAACTT	CACTCTGACC	1920
TGCCGTGCAG	AGGCCTGGCC	TCCAGCCCAG	ATCAGCTGGC	GCGCGCCCCC	GGGAGCTCTC	1980
AACCTCGGTC	TCTCCAGCAA	CAACAGCACG	CTGAGCGTGG	CGGGTGCCAT	GGGCAGCCAT	2040
GGTGGCGAGT	ATGAGTGCGC	AGCCACCAAT	GCGCATGGGC	GCCACGCACG	GCGCATCACG	2100
GTGCGCCTGG	CCGGTCCATG	GCTGTGGGTC	GCTGTGGGCG	GTGCGGCAGG	GGGCGCGGCG	2160
CTGCTGGCCG	CAGGGGCCGG	CCTGGCCTTC	TACGTGCAGT	CCACCGCTTG	CAAGAAGGGA	22?0
GAGTACAACG	TCCAGGAGGC	TGAGAGCTCA	GGCGAGGCGG	TGTGTCTCAA	TGGCGCGGGC	2280
GGGACACCGG	GTGCAGAAGG	CGGAGCAGAG	ACCCCCGGCA	CTGCCGAGTC	ACCTGCAGAT	2340
GGCGAGGTTT	TCGCCATCCA	GCTGACATCT	TCCTGAGCCT	GTATCCAGCT	CCCCCAGGGG	2400
CCTCGAAAGC	ACAGGGGTGG	ACGTATGTAT	TGTTCACTCT	CTATTTATTC	AACTCCAGGG	2460
GCGTCGTCCC	CGTTTTCTAC	CCATTCCCTT	AATAAAGTTT	TTATAGGAGA	AAAAAAAAAA	2520
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA				2550

(2) Informacje o SEK NR ID:11:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 222 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: lćnóowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (xi) Opis sekwennji:SEK NR ID:11:

AATTCGATCA CTCGCGCTCC CCTCGCCTTC TGCGCTCTCC CCTCCCTGGC AGCGGCGGCA 60

ATGCCGGGGC CTTCACCAGG GCTGCGCCGA ACGCTCCTCG GCCTCTGGGC TGCCCTGGGC 12 0

188 878

CCTTCGATCC AGCTTCCACA CTGTGACCTG GCGGTTCGAA TCGTCAGCCC 180

CTCTTTTCTC CTGTTTCGCA CTGTTGTCCA AC 222 (2) Informacje o SEK NR< 1D:12:

(©Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 292 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Tcy cząsseezki:: cDNA (xi) Opis sekwencji:SEK NR 1D:12:

GGTGCAGCCG	GTACCCCCTC	CCCCCTGTCA	GCCTGCGGTC	TATAACCCCA	CCCCTCTCCT	60
CCGGGTGTAG	CGTCTTCCTC	CCCTAACCAG	CCTCACTACA	GTGCCGCCCC	GCCGAAATAA	120
TAGCTCGGTT	CTCTATCCCA	CATCTAATTA	TCCAGCGAAA	TCCACTTCCA	TTGCTTTTTC	180
CACTATAGAC	GACTACTGAA	CCCCCTCCCC	ACTCTGCACA	TAACGATACA	TGCAGCCCCA	200
CGGGCCTGTA	CCGTTCGCGA	AAGCCTAGAC	CCCCTTTCGT	CCCCAAGCCC	TC	292

(2) 1ηίοποκ;3θ o SEK NR 1D:13:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 105 aminokwasów (B) Cyp: aminokwasowi (C) Rodzaj nicii pojedcncsa (D) Topologia: liniowa (ii) Tcp «cząsteczki ^iałkk (xi) Opis sekwencji:SEK NR 1D:13:

Pro

Asp

Aao

Val

Glu

Lru

Val

Pro

Leu

Pro

Pro

Tp

Gln

Poo

Vv1

Gly

1

5

10

11

Clu

Asn

Phe

Thr

Lur

Sro

Cys

Arg

Va0

Pro

Gly

Ala

Gly

Poo

Arg

AAa

20

22

30

Ser

Leu

Thr

Olu

Thr

Leu

Leu

Aur

^0y

Gly

usg

Glu

Leu

Ile

Arg

Arg

35

40

45

Ser

Phe

VaV

Ulu

Glu

Pro

Prp

Ap^g

A0a

Arg

ua^s

Ala

Met

Leu

Ghr

Ala

50

55

60

Chr

VaU

Leu

Ala

Aog

Arg

Glu

Asp

His

ŻAO

Asp

Asn

Phe

Ser

Cys

Llu

65

70

77

80

Ala

CUu

Leu

Asp

Leu

Arg

Tho

His

Tly

Llu

GlU

Lru

Phe

Ala

Asn

Ser

85

90

9T>

Ser

Ala

Pro

Arg

Tln

Uru

Aog

Tho

Phe

100

100

(2) 1nfe o SEK NR 10:1::

188 878 (i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:14:

GAACTCGAGG CCATGCCTCC ACTTTCC 27 (2) Informacje o SEK NR ID:15:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:15:

CCATAAGCTT TATTCCACCG TGACAGCCAC 30 (2) Informacje o SEK NR ID:16:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:16:

AACGTGCGC-A GCTGTCTG (2) Informacje o SEK NR ID:17:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (xi) Opis sekwencji:SEK NR ID:17:

ACGGAATTCG AAGCCATCAA CGCCAGG 27

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:18:

(i)yhagaktegsstska sekwencji:

(G) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDRA (xi) Opis sekwencjHEEK RR DD:18:

yATGAATTCy GAGTCTTGAG TGGGATG 27 (2) Informacje o EEK RR DD:19:

(i)yharaktggsstska sekwencji:

(G) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDRA (ci) Opis sekwencji:EEK RR DD:19:

ATAGAATTyy TyGGGACGyy TGTAGCC 27 (2) Informacje o EEK RR DD:20:

(i)yhagaktggsstyka sekwencji:

(G) Długość: 18 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDRA (xi) Opis sekwencjHEEK RR DD:20:

yGRGGTGGCG AGGGCTCG (2) Informacje o EEK RR DD:21:

(i)yhagaktegsstska sekwencji:

(G) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDRA (xi) Opis sekwencji:EEK RR DD:21:

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:22:

(©Charakterystyka sekwencji:

(G) Długość: 54 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNG (xi) Opis nekwencji:eEK NR ID:52:

GCGllhCGTG AGllhGGGGG CGCG (2) Informacje o SEK NR ID:23:

(©Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNG (xi) Opis nekwuncji:eEK NR ID:23:

hGGGlhlhGT CGhlGGhGTG lhhG (2) Informacje o SEK NR ID:24:

(©Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 992 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNG (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:24:

lGGGGGGGGG	lGAAGCCCGG	lGGAGGGGGA	CGGTGGAGAG	GTGCCCGGGG	GCGGGGGTAG	60
CCCT^G^.	GGCCGGCGGC	GCCGGGAGGG	GGGhGATlAG	GGGGGGGGGC	GCGGGGGGGG	120
GGGGGGGGGT	GGGGAGGCGA	AGGGGGGTGG	CGGGCGGGGG	GGGGAGlCGG	GCGGGGGAGG	180
TTCAlGGAGG	hGCGAGGGGG	GGCGGCGACr	GGGGGAGGhG	GGGGGlGGGC	lCGGGGGGCG	240
GTGTllAGGl	GGAGGGCGGA	GGGAGGAGGG	AGGlGGGAGG	GGGGGGGGGG	GGAGGGGGGC	300
GGClGCGAlA	GGGGGGlAAC	GGCGGGAGAG	ATGlAGCGGG	GCCGGGGGAG		360
GlGGGGGGGl	CGGGGGGCGG	AAAGGGCCAG	AAGGGGGGGG	GCGCGGGACA	CGGGGGGGGG	420
lGGlllCCGG	GCGGGCGCGA	GGGGGGCGGG	GTGGAGGCGG	CGGAGCGGGG	GGAAGCAGGG	480
GGCGGGGGAA	GAGGGCCAGG	GGGGGGGGGG	GGGGGGGCGG	GAAGAGAGCG	GGGACGGGGG	540
GGGGGGCAGG	AGGGCGGAAG	GGCGGGGlGG	GGCCGGAGGG	GGCGGGGTAA	GGGGGGGAGG	600

188 878

CGGAlGCCTC	GTCAGGTTGC	GGCGGCGCAC	SGGGCLTCGT	GCCTTGGTGTG	ATCTGCGTGC	000
GCTTCGGAGA	ATCTGAGACC	GGTCLTCGGG	SGGCTTTTGC	TGTCGSCCCTGG	GAGCATGCCA3	720
GCATTCATTG	CTGTGGAGTC	agccagttct	GGGGCTCCTG	SiGCCTLGAGlT	GTGGCCGTCA	780
TGGTGGAGCA	TGGTCCTAGG	TTTTGLGALG	SCAGGTCGCC	SAGOAGTTGG	AOGCG3GTGG	840
LAGGGTCCGG	gtgttcgttc	TCTCTGCAAG	SCCAGTGGGG	GCOGCAGCCCg	AGCGTGJGGGT	900
GTGCGGGTTT	CGGAGGCACT	ALCTALGGGG	STGTTGTCGC	SccTciccAccyc	CCAGACCCTA	900
GCCTTAGAGC	TCTTAGAGTT	CCCTGGGGCC	ST			992
(2) Informacje o	EEK RR ID:25:
(.i)Charaktegsstska sekwencji: (G) Długość: 2775 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: cDRA
(xi) Opis sekwencji: EEK	RR ID^S:
GCAGTTCCGC	GTGGTGTTTG	TGGAGTGTGA	GGATCTGTTG	CGGCCGAACC	GTAGCACTLA	00
CTGyyyTCGG	CCGGAGCGCG	GTGGTTTGAG	GATTCTGTCG	CGCCGAGATG	GGACCCAGAG	120
GGGTCTGTGT	CGGCTGGCGT	GACAGTTGAT	GGATGTCCGC	GAGCTGGAGA	TTCAGTTTGT	180
tcgccttctc	yGCTGCGyGy	GGCGTACGTT	GTAGACGCGT	GGGTTCLCCC	GTATCCCCCA	240
GCGACTAGAT	yGCGTAGAGy	TAATGTCGTT	GCCTCCTCGG	CAGTCGGTGA	GTGGGAGCCT	300
yiyycTGGGy	CGTGGGGCTT	CTGGCGCCGA	GCCTCGTGCG	GGCTTTAyGT	TGATTCCGCT	300
GCGGGGCGCC	TAGGAGCCGA	TTCGTCGCAG	TCCCGTTGGT	GGACTACTCT	GAGCGTGGGG	420
CGCGATATCT	ACAGTTACGG	TATTGGCTTG	GAGGAAGGAC	CATGGAGyCA	ITCTTTTGTG	480
TCGCGCCGAG	yTGGACCTGC	GATCGCACGG	ACTGGGACTG	TTCGLGAATA	GTTCGGCCTC	54 0
CGGAGAGTTC	TGLACTCCTT	CCCTGTyTCC	GGATGCCTCG	CGCTTTGTTG	ycycccGGTT	000
CTTGGGAGTT	GGTCCGGAAA	GGCCCGCGAG	CCGCATCTCG	AACGGACTGT	TTTTAGCCCT	000
AGAGGTCGGG	GTTTACCCCG	CACTGGGGGA	CTAGAATCTG	AGCTCCGGCG	CTGTCTCTGA	720
LGGGGATGCA	TCTGCGGCTA	CTGTCACAGC	CACAGTTAGC	GTAGAGCAGG	AGGGTGTTAG	780
GTGGCCGGCT	TGCAGCGCCA	CTCTGGGGGA	CGALGlCTGG	GAGACCCGAG	AGLATGCGGC	840
CGCTCATAGT	CTTTTGGTAC	CACTCCTGAT	TTCGAGCGAA	TTCAGTGCTC	TTGAGGGGTA	900
GATGGTGACA	GTGGCCTGTG	TAGCTGGAGC	CTGLGTTCCG	GTCACATCGG	AGGGAGCCTC	900
AGTCGCGGTC	TTGGGGTAGC	CCGCCTAGTT	TTAGTCGAAC	GTCACCGAGA	ATGATGACAG	102 0
GCGCAGTCTC	TCCCGCGGCG	CCATCCTyGA	CATGAACGGG	GAGGTTCTGA	TCLAGGATAG	1080

188 878

CGCAGCAGAG	CTTCCTCGCC	TATACCCGCC	CCGGCTACAC	GATGCGGACT	GCCCCAGCAC	1140
TGCGACCTGG	CCCGAGGCCC	CACACCGCGA	GCGGCCCGCC	CACCCCCCCC	CGAACCCAGA	1200
GCCCTCACGC	CACGGGCCCC	GCTCCCACCG	CACCCCCGTA	CTGCCGCTCG	GAATCCTCCC	1200
TCAACTCGCT	CCACCCCTCT	CACCCACTTA	CCCATCCAGC	CCCCCAGATC	AGCGACCCGA	1320
GCCGCGAAAG	CACGTAGCCC	TGACCCTCCA	CTACGCACCG	CCGATCCACA	GCGTCCCCGC	1380
CCCGCGACCC	AGTGCTTCCC	TCCGCGCAGC	ACAAGCCTAC	CTCACCTCTC	TCCCCCACCC	1440
GCTAACCACC	CCTGATCTCA	TCGCCCTGCC	CTCTGGACGA	CGCCCCCACG	TCATCCACCC	1500
CCTCTGCCGT	CTACCCCCGG	ACCATCACCC	CGCTGACAGC	TCCCGACCCA	CCAGCCCTCG	1500
CCGCTCTCCC	CCAGAGAAGG	TCCCCCTCAC	CGTCAAATAT	CCCCCCGCCG	TTCACGACCC	1δ20
GGCCTCCCCC	AGCAATTGGA	CATCCCTCCA	AGGAGATCGC	CCCCGCTTTT	CCTCTGACGT	1080
CCGTCCCGGC	CCACACCCAA	CCCTCAGCTC	CGTCGGCTCC	CCCGCCACCA	CTCACCGCCT	1740
GCTCCTGCCC	CGGCCACCCC	CACACCCTGC	TCCCACACCT	CCCACAGTCC	CTAGACTCCG	1800
CGCGACCCCG	ATCTACCTCT	CCAACCCCAC	CAACCCCCGC	CCCTCCCTCC	CCGAGGCGCT	1800
CGTCGTGGCC	CCCCACTCCC	CACCCCACAT	CCGTGGATCT	ACCTGCCCGA	CGCGCCACGC	1920
CTCCCTCGGA	CCCCCTGACG	CTTCCCCCCT	CCCCTCCCCC	CCCCCGCGTC	CCCCTTCCCC	1980
AGGGGTGCCC	TCCTCTCCCC	GACCCATACC	ATCCCCTCGC	CACCAGCCCC	TCTCCCCACA	2040
CGGCGCGCCC	GCTGACCGCT	CTCTCCCAAC	AlGTCCCCAT	CCCACCCACT	CCCGCACCCT	2100
CACTCTCCGC	CTCCAGTGCC	GGCCAGTCCT	GGCACGACTT	CCGCCCTCCC	CCCCTCCGCG	2100
CGTCCCCCAG	CCGGCAGACT	TCAACTTCAC	CTCACCCCCC	CAGGCCTCCC	CTCCACCCCA	2220
CGTCACCTCC	CGCCCCCCCC	CCACCCCCCT	CGAAATCCCA	CTGTCCACCA	ACAACGCAGC	2280
lATGACCCTG	GCGGGACACA	TCCCGACCCA	CCCAGCCCGC	TGCCACTCCC	AACCCACCAA	2340
ACCGCACCGC	CCCCACCCCC	GGCCCATAGC	CCTGCGCCTC	CCCCCTCCGT	CCCTATCCCT	2400
ACCCCTCCGC	CCCCCCGCCG	CGCCCCCCCC	CCGGATCCAC	GACCCGCCCG	CCCTCGCATG	2400
CTGCCTGCAC	TCCGCCCCCT	CCAACGGCCC	CGAGGGCGGC	GTCCGCCGCC	CCCACACCTC	2520
GGCCCACCCC	CTCGCTCTCA	ACCGACACGG	CCCCGCCGCT	GGCCCCCCCC	CACCCCCCCA	2580
CCGCGCACCC	CAGCCGCCCG	CCGGCCCCGC	CCACGCGCAC	CCGCACCGCC	ACCTCTGCCA	2040
CGTACGCAGC	GCGGCCGCCG	CGGCCCCCTC	CACTCTCCGC	CCCCCCCCAC	GCCCCCCAGA	2700
CTCGCACCCC	CCCTTATTGA	TTCCTTGATT	TATGGACTGG	TGCATGGGTT	TGTAGATTCG	2700
ACTCCAACCC	GATTC					2775

(2) Informacje o SEK NR ID:20:

(iiChankterystyki sekwencji:

(A) Długość: 1557 pir zasad (B) Typ: kwis nukleinowy (c) Rodzaj nici: pojedyncza

188 878 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:26:

CGCGCTCTCC	TCGCCTCCTG	TGCTTTCCCC	GCCGCGGCGA	TGCCAGGGCC	TTCGCCAGGG	60
CTGCGCCGGG	CGCTACTCGG	CCTCTGGGCT	GCTCTGGGCC	TGGGGCTCTT	CGGCCTCTCA	120
GCGGTCTCGC	AGGAGCCCTT	CTGGGCGGAC	CTGCAGCCTC	GCGTGGCGTT	CGTGGAGCGC	180
GGGGGCTCGC	TGTGGCTGAA	TTGCAGCACC	AACTGCCCTC	GGCCGGAGCG	CGGTGGCCTG	240
GACACCTCGC	TGCGCCGAAA	CGGGACCCAG	AGGGGTTTGC	gttggttggc	GCGGCAGCTG	300
GTGGACATTC	GCGAGCCGGA	GACTCAGCCC	GTCTGCTTCT	TCCGCTGCGC	GCGGCGCACA	360
CTACAGGCGC	GTGGGCTCAT	TCGCACTTTC	CAGCGACCAG	ATCGCGTAGA	GCTGATGCCG	420
CTGCCTCCCT	GGCAGCCGGT	GGGCGAGAAC	TTCACCCTGA	GCTGTAGGGT	CCCCGGCGCC	480
GGGCCCCGTG	CGAGCCTCAC	GCTGACCCTG	CTGCGGGGCG	CCCAGGAGCT	GATCCGCCGC	540
AGCTTCGCCG	GTGAACCACC	CCGAGCGCGG	GGCGCGGTGC	TCACAGCCAC	GGTACTGGCT	600
CGGAGGGAGG	ACCATGGAGC	CAATTTCTCG	TGTCGCGCCG	AGCTGGACCT	GCGGCCGCAC	660
GGACTGGGAC	TGTTTGAAAA	CAGCTCGGCC	CCCAGAGAGC	TCCGAACCTT	CTCCCTGTCT	720
CCGGATGCCC	CGCGCCTCGC	TGCTCCCCGG	CTCTTGGAAG	TTGGCTCGGA	AAGGCCCGTG	780
AGCTGCACTC	TGGACGGACT	GTTTCCAGCC	TCAGAGGCCA	GGGTCTACCT	CGCACTGGGG	840
GACCAGAATC	TGAGTCCTGA	TGTCACCCTC	GAAGGGGACG	CATTCOTGGC	CACTGCCACA	900
GCCACAGCTA	GCGCAGAGCA	GGAGGCTGCC	AGGCAGCTGG	TCTGCAACGT	CACCCTGGGG	960
GGCGAAAACC	GGGAGACCCG	GGAGAACGTG	ACCATCTACA	GCTTCCCGGC	ACCACTCCTG	1020
ACCCTGAGCG	AACCCAGCGT	CTCCGAGGGG	CAGATGGTGA	CAGTAACCTG	CGCAGCTGGG	1080
GCCCAAGCTC	TGGTCACACT	GGAGGGAGTT	CCAGCCGCGG	TCCCGGGGCA	GCCCGCCCAG	1140
CTTCAGCTAA	ATGCCACCGA	GAACGACGAC	AGACGCAGCT	TCTTCTGCGA	CGCCACCCTC	1200
GATGTGGACG	GGGAGACCCT	GATCAAGAAC	AGGAGCGCAG	AGCTTCGTGT	CCTATACGCT	1260
CCCCGGCTAG	ACGATTCGGA	CTGCCCCAGG	AGTTGGACGT	GGCCCGAGGG	CCCAGAGCAG	1320
ACGCTGCGCT	GCGAGGCCCG	CGGGAACCCA	GAACCCTCAG	TGCACTGTGC	GCGCTCCGAC	13£ 0
GGCGGGGCCG	TGCTGGCTCT	GGGCCTGCTG	GGTCCAGTCA	CTCGGGCGCT	CTCAGGCACT	1440
TACCGCTGCA	AGGCGGCCAA	TGATCAAGGC	GAGGCGGTCA	AGGACGTAAC	GCTAACGGTG	1500
GAGTACGCAC	CAGCGCTGGA	CAGCGTGGGC	TGCCCAGAAC	GCATTACTTG	GCTGGAG	1557

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:27:

(DCharakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 2927 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) yyp zzsttczzii:: dNAA (ix)Charakterystyka:

(A'Nazwa/Klucz: CDS (B)Położenie: 44..2214 (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:27:

GGGCCTGTGG TGCGGTGGTG TGCTTTCCCC GGGGGGGGC ATG CCA GGG CCT TCG 54

Ket Pro Gly Pro Ser

5

CCA GGG CTG

CCG Acg

CGG Arg 10

GCG CTA CTC TGC CTC TTG GCT AGC CCGCGC CCT

102

Pro

Gly Leu

Ala

Leu

Leu

Gly

(Leu TTr Ala CAa CLe Gly Clu

15

22

GGG

CTC

TTC

GGG

CTC

TCCC

GCG

GTC

TCG

CAG

CGCG

CCC

TTT

TGG

CGG

CAC

150

Gly

Leu

Phe

Gil

A eu

Ser

Ala

Val

Ser

Gln

Glu

Ppo

CPr

C^

Aly

Asp

25

33

33

CTG

CAG

CCT

CCG

CTG

GCG

TTC

GTG

GAG

CGC

TGCl

CGC

TTG

CCT

TTG

CTG

198

Leu

Gln

Pro

Acr

Cal

Ala

Phe

Val

Glu

Arg

Gly

Gly

Tee

Llu

ττρ

T,LU

40

45

50

AAT

TGC

AGC

ACC

AAC

TGC

CCT

CCGi

CCG

GAG

CGC

(GCT

GGC

CCG

GAG

ACC

246

Asn

Cys

Ser

T Tr

Asn

CCys

Pro

Arg

Pro

Glu

Arg

Gly

Gly

Llu

Glu

Thr

55

60

66

TCG

CTG

CGC

CCG

AAC

GGG

ACC

TGCl

A(Gl

GGT

TTG

CGT

TTGC

TTG

GCG

CGG

294

Ser

Leu

Arg

Acg

Asn

Gly

Thr

Gln

Arg

Gly

Leu

Arg

TTr>

Llu

Ala

Arg

70

75

88

88

CAG

CTG

GTG

GGA

ATT

CGC

(GCG

CCG

GAG

ACT

CCC,

CCC

GTC

TGC

TTC

TTC

342

Gln

Leu

Val

Acp

Cle

Arg

Glu

Pro

Glu

Thr

Gln

Pro

Vh1

cys

PPr

Phe

90

95

110

CGC

TGC

GCG

CCG

cc^<c

AGA

CTA

CAG

GCG

CGT

GGG

CTC

ACT

CGC

ACT

TTC

390

Arg

Cys

Ala

Acr

Arg

Thr

Leu

Gln

Ala

Arg

Gly

(Leu

IIe

Arg

Thr

Phe

105

110

115

CAG

CGA

CCCC

GGC

CGC

GTA

GAG

CTG

ATG

CCCl

CTG

CCT

ccc

TGG

CAG

CCG

438

Gln

Arg

Pro

Acp

Arg

Val

Glu

Leu

Met

Pro

Leu

Pro

Pro

Ττρ

Gln

Pro

120

125

110

GTG

GGC

GAG

AAC

CTC

ACC

CTG

AGC

τ<^·τ

A(Gl

GTC

CCC

(GCC

GCC

(GGC

CCC

486

Val

Gly

Glu

Acs

Che

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Val

Pro

Gly

Ala

Gly

Pro

135

140

115

CGT

GCG

AGC

CCT

ACG

CTG

ACC

CTG

CTG

C(Gi

GGC

GCC

(GAC

(GAC

CTG

ATC

534

Arg

Ala

Ser

Lee

Thr

Leu

Tir

Leu

Leu

Arg

Gly

Ala

Gln

Glu

Leu

IIe

150

155

160

165

CGC

CGC

AGC

TTT

GCC

CCT

GAA

CCC

CCC

CGA

GCG

CGG

(GGC

GCG

GTG

CTC

582

Arg

Arg

Ser

PPr

ALi

Gly

Glu

Pro

Pro

Arg

Ala

Arg

Gly

Ala

Val

Leu

170

1-75

180

ACA

GCC

ACG

GGT

CTG

GCT

CGC

AGG

GAG

GAC

CAT

(GGC

GCC

AAT

TTC

TCG

630

Thr

Ala

Thr

Val

Leu

Ala

Arg

Arg

Glu

Asp

His

Gly

Ala

Asn

Phe

Ser

188 878

185 190 195

TGT Cys

CCC GCC CAG

CGG Leu

GAC Asp

CTG Leu

CGC Aog 205

CCG GAG GGA

CTG GGA Lei Cly 210

CTC Leu

TTT CAA

678

Aeg

Ala Glu 200

Pro

His

Cly

Phe

Clu

AAC

AGC

TCG

GCC

GCC

AGA

CAG

GGG

GGA

AGC

TGC

TCC

GTG

TGG

GGG

GAT

300

Asn

Sre

Ser

Ala

Pro

Aeg

Glu

Lei

Aog

The

Phe

Ser

Leu

See

Pro

Asp

215

220

225

GCC

CGC

CGC

CGC

CCT

GCT

CCC

GGG

CGG

TTG

CAA

CTT

GGC

TGG

Grr

ACG

730

ria

Pro

Aeg

Leu

Ala

Ala

Pro

Aeg

Leu

Leu

Cli

Val

Gly

See

Glu

Aeg

230

235

240

245

CCC

GTG

AGG

GGC

AGG

CGC

GAC

GGA

GGC

TTT

ccr

CCC

TGA

CAG

GGG

ACC

000

Peo

Val

Ser

Cys

hhe

Leu

Asp

Gly

Leu

Phe

Peo

Ala

Ser

Glu

Ala

Aog

250

255

260

GTC

TAC

CGC

GCA

GGG

CGC

GAC

CAG

rrT

GGC

ACG

CCG

GAT

GTG

AGC

CGG

035

Val

Tyr

Lei

Ala

Lei

Cly

Asp

Cin

Asn

Leu

Ser

Peo

Asp

Val

hhe

Lru

265

270

275

crr

GGG

GAC

GCA

GTG

CTG

GGC

ACT

CGC

AGA

GCC

AGA

GCT

AGC

GCA

GAG

918

Glu

Gly

Asp

Ala

Phr

Val

Ala

The

ria

Thr

Ala

Thr

Ala

Ser

Ala

Glu

280

228

229

CAG

GAG

GGG

GCC

AGC

GAG

CTG

GTC

TGC

AAC

CTC

ACC

CTG

GGC

GGC

GAA

966

Gin

Glu

Gly

Ala

Arg

Gin

Leu

Val

Cys

Asn

Val

hho

Lei

Gly

Gly

Cli

295

330

335

rrc

CCG

GAC

ACC

CGC

GAG

AAC

GGG

ACC

AGC

TAC

AGC

TTC

CGC

GCA

CCA

1014

Asn

Arg

Glu

Thr

Arg

Glu

Asn

Val

The

lir

Tye

Ser

Phe

Peo

ria

Pro

310

315

332

332

CTC

CTC

ACC

GGG

AGC

GAA

CCC

ACC

GTG

TCC

CAG

GGG

CAG

ATC

GTG

AGA

1062

Lei

Leu

hhr

Leu

Ser

Glu

Pro

Sro

Val

See

Clu

Gly

Cin

Met

VTl

Thr

330

333

340

GGA

ACC

GGC

CCA

GCT

GGC

GCC

CAA

CCT

CGG

CTG

ACA

CTG

CAC

CCA

GTG

1110

VtI

Thr

Cys

Ala

Ala

Gly

Ala

Cin

Ala

Lei

Val

The

Lei

Glu

Cly

Val

345

350

355

ccr

GCG

CCG

CGC

GCG

GGG

CAG

GGC

GCG

CAG

CGT

CAG

CTA

AAG

CCC

AGG

1158

Pro

Ala

Ala

Val

Pro

Gly

Gin

Peo

Ala

Gin

Leu

Gin

Lei

Asn

Ala

hho

360

335

337

GAG

rrc

GAC

GAC

AGA

CGC

AGC

GGC

TTC

TGC

GAC

CCC

ACC

CTG

GAT

CGG

1206

Glu

Asn

Asp

Asp

Arg

Arg

Sro

Phe

Phe

Gys

Asp

Ala

The

Lei

Asp

Val

375

338

335

GAC

GGG

GAG

ACG

GGC

AGG

rrG

AAC

ACG

AGC

GCA

CAG

CGT

GCT

CTC

CGA

1254

Asp

Gly

Glu

hhe

Leu

Ile

Lys

Asn

Arg

Ser

Ala

Clu

Leu

Aeg

Vai

Lei

390

395

400

405

TAC

GCG

CCG

CGC

CGA

CAC

GAT

TGC

CAG

TGC

CCC

AGG

AGG

TCG

AGC

GGG

1302

Tyo

Ala

Poo

Arg

Lei

Asp

Asp

Ser

Asp

Gys

Pro

Aog

Sro

Trp

The

hrp

410

415

420

CCC

GAG

GGC

CGA

GAC

GAC

ACC

CGG

CGC

GGC

GAG

CGC

CGC

CCG

rrc

CGA

1350

Peo

Cli

Gly

Pro

Glu

Cin

The

Lru

Aeg

Gys

Glu

Ala

Aog

Cly

Asn

Peo

425

430

435

GAA

CCC

GGA

. GGC

CAC

TGG

CGG

GCC

TCC

CAC

CCC

1 GGG

GCC

CGG

CTG

GGG

1398

Glu

Peo

Ser

Val

His

Gys

Ala

Aog

Sre

Aso

Clv

Glv

Ala

Val

Lei

AIt

188 878

¢00

40 5

455

CTC

CCC

CTC!

CTG

(ACT

CCA

GTC

ACT

C(CC

GCG

ccc

Td

GGC

ACT

TAC

CGC

1446

Leu

Cly

Lei:

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Arg

Ala

Ouu

SSr

Glu

ACh

Tyr

Aag

055

460

406

TGC

CCT

GCG

GCC

«CCT

GAT

ccci

(TCC

GAG

GCG

GGC

MG

GAC

GTA

ACC

CTA

1595

Cys

Lys

Ala

AAa

Asn

Asp

Gln

OTCy

Glu

Ala

wa

Lys

Asp

Av1

Thr

Luu

0 70

405

408

408

GCC

CCT

GAG

TAC

G<CA

CCA

GCG

(CCG

GAC

AGC

GTCC

<A5C

TGC

CCA

GM

CCC

1050

cno

VaU

Glu

Tyr

Ala

Pro

Ala

Leu

Asp

Ser

Val

Gly

Cc·

Po^o

Glu

«AO

090

495

550

GCT

GCT

TCCC

CCG

GAG

GOTA

ACA

GM

GCC

TCG

ctg

AGC

TGT

GTG

GCG

CCC

0090

1le

Chr

Trp

Luu

Glu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ser

Luu

St^u-

Ces

Av1

Ala

His

505

510

555

GCG

CCG

CCG

CCG

CCT

GAT

GTG

ATC

(CTC

GTG

CCC

TCT

GACA

GM

CTC

GGG

1638

Gly

VaU

Pro

Pro

Pro

Asp

Val

Ile

Cys

Val

Arg

SSr

Gly

Glu

Leu

Gly

520

525

553

GCC

GCC

ATC

GAG

GGG

CTG

<CTG

<CTT

GTG

GC^C

CGG

GAA

CAT

GCG

GGC

ACT

1686

Ala

Val

His

Glu

Gly

Leu

Leu

Arg

Val

Ala

Arg

Glu

Hśs

Ala

Gly

Thr

535

540

550

TAC

CGC

TGC

gccc

GCC

ACC

MC

CCT

CGG

GGC

TCT

GCG

GCC

«CCC

«AAT

GTC!

H30

Tyr

Arg

Cys

Glu

Ala

Thr

Asn

Pro

Aog

Gly

Si^r

AAa

Ala

Lys

Mn

Val

550

555

556

556

GCC

GCC

ACG

GTG

GM

TAT

GGC

CCC

AGG

TTT

GAG

GAG

CCG

AGC

TGC

CCC

1782

CUi

Val

Thr:

Val

Glu

<C^r

Gly

Pro

Arg

Phe

GCu

Glu;

Pro

Sf^r

Cys

Poo

570

575

558

ACC

AAC

TGG

ACA

TGG

GTG

GM

(TCA

TCT

GGG

CCC

CTG

TTT

TCC

(GAT

GAG

1830

Sur

Asn

Trp

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Ser

Gly

Arg

Luu

Phe

Ser

<Css

Glu

585

590

555

CCC

GAC

GCG3

MG

Cd

CAG

CCA

AGC

GTG

MG

TGC

GTG

GGC

TCC

GGG

GGC

1878

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Gln

Pro

Ser

Val

Lys

CCrs

Val

Gly

Ser

Gly

Gly

600

605

660

GCC

ACT

GAG

GGG

GTG

CCC

CTG

CCG

CTG

(ACA

CCC

CCA

GAC

CCT

AGT

CCC

1926

Cho

Chr

Glu

Gly

Val

Leu

Leu

Pro

Leu

Ala

Pro

Pro

Asp

Pro

Ser

Pro

615

620

662

ATA

CCC

CCC

AGA

ATC

cer

AGA

GTC

CTG

GGA

CCC

GGT

ATC

TAC

GTC

TGC

1975

Aog

Ala

Pro

Arg

Ile

Pro

Arg

Val

Leu

Ala

Pro

Gly

I1e

<tyr

Val

Cys

630

635

660

665

AAC

CCC

ACC

CAaC

CGC

GGC

TCC

GTG

GCC

«CCC

ACA

GTC

GTC

GTG

AGC

2022

Asn

Ala

Thr;

Asn

Arg

His

Gly

Ser

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Val

Val

Ser

650

655

660

CCG

GAG

TCG

CCCC

CCG

GAG

ATT

TAT

GAA

TCT

ACC

CCC

CCA

AGT

dC

CAG

2070

Ala

GUu

Ser

Pro

Pro

Glu

Mrt

Asp

Glu

Ser

Thr

CCSS

Pro

Ser

His

Gln

665

670

cis

GCA

CCT

CTG

GM

ATT

GCT

GAG

GCC

TCC

GCG

CTG

GCC

TGC

GCC

GCC

CGG

2014

Thr

Top

Leu

Glu

Gly

Ala

GUu

Ala

Seo

Ala

Leu

Ala

«As®

Ala

Ala

Arg

680

685

690

CTT

CTC

CCT

TCC

CCA

GGA

TTG

CCC

GGC

TCT

CGG

GM

GGC

ATC

Cd

TGG

2166

Tly

Aog

Pro

Ser

Pro

Gly

Val

Arg

Cys

Ser

Arg

Glu

Gly

Ile

Pro

Trp

188 878

695 700 705

CCT Pro 71 0

Gn Glu

CAC GlG

GGG CGC GTG 'CC

CGA AGA GAC GCG HC ACT TAC CGC TC'

2214

dn Grg Val 715

Sua

Arg

Glu Asp Ala 720

Gly

Thr

Tyr

His

Cys 725

GTG

GCC

Acr

CAA

GCG

CAT

GGC

ACG

GGC

TCC

CGG

GCC

GTC

ACT

ATA

HC

2262

Val

Gla

Thr

Am

Ala

His

Gly

Thr

Gsp

Ser

Arg

Thr

Val

Thr

Val

Gly

730

735

740

G'G

GGG

TGC

CH

CCG

A'A

GTC

GCC

GAG

GGC

TGC

GCC

TTC

GCC

CCT

GGA

2310

Val

Glu

Tyr

Grg

Pro

Val

Val

Gla

GIg

L cu

AGn

Ala

Ssu

Crr

Pro

Gly

745

750

775

GGC

GTC

CGC

CCC

HG

GGA

AGC

TTC

GCA

TTG

ACC

TCC

CGC

GCG

AgA

GCC

2358

Gly

Val

Arg

P m

Gly

Gly

Asn

hUc

Thr

Leu

Thr

Cy-s

Arg

Ala

Glu

Gla

760

765

770

TGG

CC'

CCG

GCC

CGG

GTC

GGC

TH

CGC

<3CG

GCC

CCG

AGG

GGC

CTC

AAC

24 06

Trp

Pro

Pro

GUi

Gln

liu

SUA

Trp

Arg

A Cr

1pa>

Pao

AAa

GGu

Leu

Asn

775

780

785

G'C

GGC

CTC

'CG

GGC

AGC

AGC

GGC

ACG

GGC!

GAC

GTC

GGC

HG

GCC

ATG

2454

lie

Gly

Leu

Ser

Sur

Asn

Gsn

SUA

Thr

A CL

Eter

Val

AGn

dy

Ala

Mut

790

775

800

805

HG

GGC

CGC

HC

GGC

AGA

TGC

AGA

TGC

GCA

G^C^C

GCC

TGGC

GCC

GAC

GGG

2502

Gly

Ser

His

Gly

Gly

Glu

Tyr

Glu

CyC

A Ir

Arg

ThA

Am

AGu

His

Gly

810

815

820

CGC

CGC

GCG

CGG

CGC

GTC

GCG

AGG

CGC

GTG

GCCC

Η'

CCG

TCG

Crr

TH

2550

Arg

His

GUi

Grg

Grg

liu

Thr

Val

Arg

Ac a

UGa

Gly

Ppo

Tta

Luu

Trp

825

830

883

GTC

GCC

GTC

GGC

HC

GCG

GCG

GH

GGC

GCG

GCG

CTC

CTG

GCC

CCA

GH

2098

aal

Ala

Val

Gly

Gly

Gla

Ala

Gly

Gly

A la

Ala

Luu

Leu

Ala

Gla

Gly

840

845

880

GCC

GGC

CTC

GCC

TTC

TGC

GTC

CGG

TCC

ACC

GCC

TCC

TGGG

igag

HC

AGA

2646

Ala

Gly

Leu

Gla

Phe

Tyr

Val

Gln

Ser

Thr

Ala

Cys

Lys

Lys

Gly

du

855

86G

865

TAC

AGC

A'A

CGG

GGG

GCC

AGA

GGC

TCTC

GGC

GAG

GCC

GTG

TGT

CTC

AGC

2694

Tyr

Gsn

Val

Gln

Glu

Gla

Glu

SUA

Ser

Gly

Glu

Gla

Val

Cys

Luu

Gsn

870

87S

880

885

GGG

GCG

HC

HC

GGC

GCT

HC

GCG

GCA

HC

ACA

GAG

GGC

HA

CCC

2742

Gly

Ala

Gly

Gly

Gly

Gla

Gly

Gly

Ala

Ala

Gly

Gla

Glu

Gly

Gly

Pro

890

89 5

900

GAG

GCG

GCG

m

HC

GCG

GCC

GAG

TCG

CCG

GCG

AGA

GGC

GAG

GTC

TTC

2790

Glu

Ala

Ala

Gly

Gly

Gla

Gla

Glu

Ser

C ro

Ala

Glu

Gly

Glu

Val

Phu

905

910

9115

GCC

Atg

CGG

CTG

GCG

Ή

GCG

GGGGCGGGGG

CGCCrCrCGA CAAACCAHg

2841

Gla

liu

Gln

Leu

Thr

Sua

Gla

920 255

HCCCHC^ GGGGGGGGAA AAACGGGGGG GTTCCTTTgT ΤΤΑΤΤΤΑΑΤΤ GTTCgTTTgT 2901

TTATGTGTTC AAGGGGGGAA AAGGGG

2927

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:28:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 924aminokwasów (B) Typ:aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki::Białko (ci) Opis sekwencji: SEK NR ID:28:

Met 1

Pro

Gil Pro

Lr u 5

rrr

lir Ler

rrr rrr nr Ler 10

Lu u

ii u

Lu u 15

Opp

Ala

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Phe

Gly

Leu

Ser

Ala

Vv1

Uee

di

Hu

20

22

33

Pro

Phe

Trp

Ala

Asp

Leu

Gln

Pro

Arg

Val

Ala

Phe

Val

dl

UAo

35

40

45

Gly

Ser

Leu

Trp

Leu

Asn

CCis

Ser

Thr

Asn

Ctys

Pro

Arg

Ppo

dl

UAo

50

55

60

Gly

Gly

Leu

G').u

Thr

Ser

Leu

Arg

Arg

Asn

Gly

TTr

dn

Uao

Gly

Leu

65

70

75

88

Arg

Trp

Leu

Ala

Arg

Gln

Leu

Val

Asp

Ile

Arg

dl

Upo

dl

Thr

di

85

90

95

Pro

Val

Cys

Phe

Płhe

Arg

CtyS

Ala

Arg

Arg

Thr

Leu

di

na

Uacj

dl

100

105

111

Leu

Ile

Arg

Thr

Phe

Gln

Arg

Pro

Asp

Arg

Val

Glu

Leu

MeL

Upo

Leu

115

120

11 5

Pro

Pro

Trp

Gln

Pro

Val

Gly

Glu

Asn

Phe

Thr

Leu

Ser

Cci

Uro

wi

130

135

140

Pro

Gly

Ala

Gly

Pro

Arg

Ala

Ser

Leu

Thr

Leu

TTh

Ueu

Uee

Aog

dy

145

150

155

116

Ala

Gin

Glu

Leu

Ile

Arg

Arg

Ser

Phe

Ala

Gly

dl

Upo

Upo

Arg

A Au

165

110

175

Arg

Gly

Ala

Val

Leu

Thr

Ala

Thr

Val

Leu

Ala

Arg

Aao

du

Asp

di

180

185

119

Gly

Ala

Asn

Phe

Ser

Cys

Arg

Ala

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Ppo

Hii

Gly

195

200

205

Leu

Gly

Leu

Phe

Glu

Asn

Ser

Ser

Ala

Pro

Arg

Glu

Llu

Arg

Thr

Phh

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Pro

Asp

Ala

Pro

Arg

Llu

Ala

Ala

Pio

Aro

Lee

Leu

du

225

230

235

220

Val

Gly

Ser

Glu

Arg

Pro

Val

Ser

Cys

Thr

Llu

Asp

dy

Leu

Phe

PhO

245

2 50

255

Ala

Ser

Glu

All

Arg

Val

Tyr

Leu

Ala

Leu

Gly

Asp

Gln

Asn

Leu

Ser

260

265

227

Pro

Asp

Val

Thr

Leu

Glu

Gly

Asp

Ala

Phe

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala

275

280

285

188 878

Thr Ala 290	Ser Ala Glu Gln	Glu 229	Gly	Ala	Arg	Gln	Luu 330	Val	cys	Asn	WV
Thr Leu	Gly G1g GSg Asa	Aig	Glu	Tho	Arg	Alu	Asa	Vi/	SCh	Sin	Scg
305	313					.315					332
Eer Phe	Pro Ali /sp osl	luu	Thr	Luu	Eur	Gil	Pro	Se;	Si/	Seu	Sle
	325				330					335
Gly Gln	Met; w/ SCe Val	Thr	cys	Ala	Ala	Gly	Ala	GAa	Ale	Luu	wa
	340			45S					335
Thr Luu	Glu GCy Si/ Pro	Ala	Ala	VuS	Pro	Gly	Gln	Poo	Ale	Gln	Luu
	355		330					330
Gln Leu	Asn Ala Thr Glu	Ain	Asp	Asp	Aog	Arg	Seu	Phu	Phe	Tys	agu
370		337					338
Gla Thr	Luu Asi Vsl Asa	Gly	Glu	Thr	Leu	Ile	Lys	Ain	Sio	Seu	Sil
385	393					395					440
Glu Leu	Arg Val Leu Ast	Alu	Pro	Arg	Leu	inp	Asp	Seu	Ain	Scg	Sro
	405				410					415
Arg Eer	Trc pTh Scg Sro	Ali	Gly	Poo	Glu	Gln	Tho	Lei	Aog	Cys	GCu
	420			25 S					443
Ala Arg	Gly Sm Pro Glu	Pro	Ser	Ve S	nn s	Cys	Ala	Arg	Sye	Asp	Gly
	435		440					444
Gly Ala	Val Leu Ala Leu	Gly	Leu	Luu	Gly	Pro	Val	Tho	Aog	Ala	Ler
450		445					440
Eur Gly	Thr Tyr-Osg Cyc	Lys	Ala	Ala	Asn	Asp	Gln	Gly	Glu	Ale	Si/
405	470					47S					448
Lys Asp	Val Thr Leu Thr	Val	Gli	Tyr	Ala	Pos	A/s	Leu	Asp	Se;·	Vil
	485				40S					495
Gly Tys	Pro GCu Arg Ile	Tho	Trp	Luu	Glu	Gly	Thr	Glu	Ala	Ero	Leu
	500			00 5					550
Eur Ccs	Sal Ala lla Hiy	Va l	iro	Pro	Pro	Anp	Val	Ili	Sys	Val	Aig
	515		552					552
Eer GCy	Glu Leu Gly Ala	VvV	Ilu	Ali	Gly	Leu	Lee	Sio	Si/	Ala	Aig
530		533					554
Glu His	Ala Gly Thr Tyr	Arg	Cyn	Gis	A/s	hOs	Uas	Pro	Arg	Gly	Ser
545	550					55 S					560
Ala Ala	Lys Asn A/alAla	Val	Thr	ViS	lis	Gos	ASs	Pro	Arg	Phe	Glu
	505				50 S					575
Glu Pro	Ser Syy Pro Ser	Asn	Top	Thr	OpS	VuS	Glu	Gly	Err	Gly	Arg
	580			58 5					59 0
Luu PPe	Ser Cyr CGu Val	Asa	pCy	S ls	Pro	oog	Asr	oyr	Sial	Lyn	Ccs
	595		600					60i5
Val GCy	Ser Gig Sly Thr	ThG	GS u	Gly	Val	lus	Lec	Gvv	Leu	Alr	our
010		605					620

Pro Aip Pro Sro Sro Ar.g A1p oso Arg Gla 0^ Ari Val Leu Ala Pro

188 878

625 630 635 640

Cly

Ile

Tpa Val

(Cys Asn Ala Thr Asn Aog

Hii Gly Ser Val Ala 655

Lys

045

655

Thr

Val

Val

U Vl

S Sr

Ala

Clu

Ser

Pro

Pn

GGu

Met

Asp

Glu

Ser

Thr

H0

600

600

Cys

Pro

Ser

H ii

Gln

Tlhr

Trp

Leu

Glu

GGu

Alu

Glu

Ala

Ser

Ala

Leu

075

600

608

Ali

Cys

Ala

Ala

Arg

Alg

Arg

Pro

SPl

Sao

Gly

Val

Arg

(Cys

Ser

Arg

090

695

770

Clu

Cly

Ile

Pro

Trp

Pro

Glu

Gln

Gln

.Gig

Vv1

Sar

Arg

Glu

Asp

Ala

705

710

715

720

Cly

Thr

Tyr

His

Cys

Val

Ali

Thr

Asn

Ala

Hii

Cly

Thr

Asp

Ser

Arg

725

770

775

Thr

Vil

Thr

GSv1

Gly

Val

Glu

pyr

GGrg

Pro

Val

Val

Ala

Glu

Leu

Ala

74 0

7S0

Ali

Seo

Pro

P ro

Gly

Gly

Val

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

755

770

775

Cys

Arg

Ala

Glu

Ala

Trp

Pro

Pio

Ala

Gln

IIu

Ser

T:g?

Arg

Ala

Pro

770

775

780

Pro

Arg

Ala

Leu

Asn

Ile

Gly

Leu

Ser

Seo

Asn

Asn

Ser

Tho

Leu

Ser

785

790

7 75

8 00

VaU

Ali

Gly

Ala

Met

Gly

Seo

His

Gly

Cly

Glu

Tyr

Glu

Cys

Ala

805

880

881

Thr

Asn

Ala

H ii

Gly

Aog

His

Ala

Arg

Arg

IIu

Thr

Val

Arg

Val

Ala

820

825

830

Cly

Poo

Trp

Llu

Trp

VaU

Ali

Val

Gly

Gly

Ala

Ala

Gly

Gly

Ala

Ali

835

840

84 5

Leu

Leu

Ala

Al Si

G ly

Ala

Gly

Leu

A la

GUi

hyi

Val

Gln

Seo

Tho

Ali

850

855

880

Cys

Lys

Lys

Gly

Clu

Tyr

Asn

Val

Gln

Clu

Ala

Clu

Seo

Sao

GUy

Glu

805

870

875

880

Ali

Val

Cys

Leu

Asn

Gly

Ala

Gly

Gly

Cly

Ala

Cly

Gly

Ali

Ala

Cly

885

890

885

Ali

Clu

Gly

GGu

Pro

Glu

Gla

Ali

Gly

Gly

Ala

Ala

Glu

Seo

Pio

Ali

900

905

910

Clu

Cly

Glu

V al

Phe

Ala

Ile

Gln

Leu

Thr

Ser

Ala

915

920

(2) Informsaje o SSK (NR SD:29:

(©Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: δ5 pir zisad (B) Typ: kwis nukleinowy

188 878 (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:29:

(2) Informacje o SEK NR ID:30:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 31 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:30:

ATTTCTCTCG AGGATGGTCA CGTTCTCCCG G 31 (2) Informacje o SEK NR ID:31:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 33 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: cDNA (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:3l·

ATTTCTGGAT CCTACAGCTT CCCGGCACCA CTC 33 (2) Informacje o SEK NR ID:32:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 32 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:32

ATTTCTCTCG AGTTCCACGC CCACAGTGAC GG

188 878 (2) Informacje o SEK NR ID:33:

(i)ChαrαktLOlstlkα sekwencji:

(A) Długość: 0680 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA(rLnrπιnvl) (ci) Opis sekwencji: SEK NR ID:33:

GGATCCTTTG	AGCCCTGAAA	GTCGAGGTTG	CAGTGAGCCT	TGATCGTGCC	ACTGCACTCC	60
AGCCTGGGGG	ACAGAGCACG	ACCCTGTCTC	CAAAAATAlA	ATAAAAATAA	AAATAAATAT	120
TGGCGGGGGA	ACCCTCTGGA	ATCAATAAAG	GCTTCCTTAA	CCAGCCTCTG	TCCTGTGACC	180
TAAGGGTCCG	CATTACTGCC	CTTCTTCGGA	GGAlCTGGTT	TGTTTTTGTT	GTTGTTGTTG	240
TTTTTGCGAT	CACTTTCTCC	AAGTTCCTTG	TCTCCCTGAG	GGCACCTGAG	GTTTCCTCAC	300
TCAGGGCCCA	CCTGGGGTCC	CGAAGCCCCA	GACTCTGTGT	ATCCCCAGCG	GGTGTCACAG	360
AAACCTCTCC	TTCTGCTGGC	CTTATCGAGT	GGGATCAGCG	CGGCCGGGGA	GAGCCACGGG	420
CAGGGGCGGG	GTGGGGTTCA	TGGTATGGCT	TTCCTGATTG	GCGCCGCCGC	CACCACGCGG	480
CAGCTCTGAT	TGGATGTTAA	GTTTCCTATC	CCAGCCCCAC	CTTCAGACCC	TGTGCTTTCC	540
TGGAGGCCAA	ACAACTGTGG	AGCGAGAACT	CATCTCCAAA	ATAACTTACC	ACGCTGGAGT	600
GAGlCCACGA	ATGGTGGGGA	GGGGAGGGTC	CCACGGACAT	ATTGAGGGAC	GTGGATACGC	660
AGAAGAGGTA	TCCATGTGGT	GGCAGCCGGG	AAGGGGTGAT	CAGATGGTCC	ACAGGGAATA	720
TCACAAACTC	GAATTCTGAC	GATGTTCTGG	TAGTCACCCA	GCCAGATGAG	CGCATGGAGT	780
TGGCGGTGGG	GGGTGTCAAA	GCTTGGGGCC	CGGAAGCGGA	GTCAAAAGCA	TCACCCTCGG	840
TCCCTTGTTC	TCGCGTGGAT	GTCAGGGCCT	CCACCCACCG	AGCAGAAGGC	GGACTCAGGG	900
GCGCTCCAGG	GTGGCTCGAG	CTCACACACG	CTGAGTAGAC	ACGTGCCCGC	TGCACCCTGG	960
CTAHTACH	ACCCGGAGCC	GAGCGGATTC	TAATTTAGAC	GCCCGCGAAC	GCTGCGCGCA	1020
CGCACACGTG	TCCTCGGCTC	GCTGGCACTT	TCGTCCCGCC	CCCTCCGTCG	CGTGCCGGAG	1080
CTGACCCGGA	GGGGTGCTTA	GAGGTATGGC	TCCGCGGGGT	CAAAAGGAGA	AGGATCAGTG	1140
AGlGlGGlTC	CCCACACCCT	CCCCTAGAAC	TGTCCTTTCC	CCATCCAGTG	CCTCCCAAAT	1200
CTCTCTTAGT	CCCCAAATGT	ATCCCCGCCC	TAAGGGGCGC	TGGTGGGAGG	AGCTAAATGT	1 260
GGGGGCGGAG	CTCGGAGTCC	AGCTTATTAT	CATGGCATCT	CAGCCAGGGC	TGGGGTAGGG	13 2 0
GTTTGGGAAG	GGCAACCCAG	CATCCCCCGA	TCCCAGAGTC	GCGGCCGGGG	ATGACGCGAG	1380
AGAGCGTGGT	CGCCCCCAGA	AGGCCCTGGG	CCATCATGCC	GGCCTCCACG	TAGACCCCAG	000C·
GGGTCGCTCA	CTCCTGCCAG	CTCGCCTTCA	CCAAGGCCAG	GAGCTTAGCG	CACGCTCGCC	1500
TCCCGCCCCC	CCGCCGCCTC	TGCCGCCGCC	CCCTCCTTGG	AAACCAAGTT	ACCAACGTTA	1560

188 878

AAGCAATCCC GAAGCGGAAG TCTGTGTGGG CGACACCCCA GCCGGCGCGG CGCGGGGAGG

GCTGCTGTAC CCCAGCTCCT CGGCTGGCGC TCTCGTCGCC TCGTGTGGTT TCCCCGCCGC

GGCGATC (2) Informacje o SEK NR ID:34:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 36 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA

1620

1680

1687 (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:34:

CAGAACTAAC CTTACACCAG GCGAGGACAC CGCGAG 36 (2) Informacje o SEK NR ID:00:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 31 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: Liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:35:

CAACAATGCT AGCCAAGCGC AACTCTGTCT C 31 (2) Informacje o SEK NR ID^:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 31 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: Liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA (xi) Opis sekwencji: SEK NR 6D:30:

CAACAATGCT AGCCTTCGAA ACCAACTTAC C 31 (2) Informacje o SEK NR ID:37:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 33 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: Liniowa

188 878 (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:37:

GggcggτcGT gcGGCcgccτ TGCGCCGCCG tcg 33 (2) Informacje o SEK NR ID:38:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 32 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (G) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNG (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:38:

cggcgGTGGh GcccgTcccc GccTccgccT ga 32 (2) Informacje o SEK NR ID:39:

(i)Charakturystyka sekwencji:

(A) Długość: 31 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (G) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNG (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:39:

GGGGGATCGT GAGCTGGGCG ThGTTGTGGT C 31 (2) Informacje o SEK NR ID:40:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(G) Długość: 32 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNG (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID:40:

GGGCGGTCGT GCCGhTACTG GCCGAGTCTG TC 32 (2) Informacje o SEK NR ID:41:

(i)Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

188 878 (ii) Typ cząsteczki:: DNA (ci) Opis sekwencji: SEK NR ID:41:

CAACAAGGCG AGCGGAGAAl GATCAGTGrG 30 (2) Informacje o SEK NR ID:42:

(i)Ghτoτkttosstska sekwencji:

(A) Długość: 33 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki:: DNA (ci) Opis sekwencji: SEK NR ID:42 crrcAATGCG rGCChccAcc caccgagcag aag 33D

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób badania przesiewowego pod kątem zmian neuropatologicznych, znamienny tym, że obejmuje etapy:

   a) pozyskania próbki płynu od pierwszej osoby;

   b) doprowadzenia do kontaktu próbki i przeciwciała dającego specyficzną reakcję immunologiczną z ICAM-4;

   c) oznaczenia ilościowego wiązania ICAM-4/przeciwciało w próbce; oraz

   d) porównania wiązania ICAM-4/przeciwciało u tej osoby z inną osobą, o której wiadomo, że nie ma zmian neuropatologicznych; przy czym ICAM-4 jest kodowany przez polinukleotyd wybrany z grupy składającej się z polinukleotydu przedstawionego w SEK NR ID: 27 i polinukleotydu kodującego ICAM-4, który hybryduzuje z polinukleotydem z SEK NR ID: 27.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbką płynu jest surowica.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbką płynu jest płyn mózgowordzeniowy.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wiązanie ICAM-4/przeciwciało jest oznaczane ilościowo poprzez test radioimmunologiczny (RIA).
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wiązanie ICAM- 4/przeciwciało jest oznaczane ilościowo poprzez enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA).
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zmianą neuropatologiczną jest udar.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zmianą neuropatologicznąjest epilepsja.