CZ292037B6

CZ292037B6 - Analogy oligonukleotidů a způsob jejich výroby a jejich použití

Info

Publication number: CZ292037B6
Application number: CZ1996743A
Authority: CZ
Inventors: Anuschirwan Dr. Peyman; Eugen Dr. Uhlmann; Gerhard Dr. Breipohl; Holger Dr. Wallmeier
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-03-13
Filing date: 1996-03-11
Publication date: 2003-07-16
Also published as: UA44253C2; HUP9600647A3; JP3917680B2; NO961006L; NO328646B1; CA2171589C; CN1060781C; ES2165446T3; EP0739898A2; BR9600993A; CZ74396A3; US5874553A; PT739898E; JPH08259579A; NO961006D0; NZ286150A; IL117423A; EP0739898A3; KR100434213B1; AU706470B2

Abstract

Analogy oligonukleotid obecn ho vzorce I a zp soby jejich v²roby a jejich pou it jako inhibitor exprese gen (antisense-oligonukleotid , ribozym , sense-oligonukleotid a oligonukleotid tvo° c ch triplexy), jako sond pro d kazy nukleov²ch kyselin a jako pomocn²ch l tek v molekul rn biologii. Popisuje se rovn pou it t chto slou enin pro l en onemocn n , kter jsou zp sobovan viry, kter jsou ovlivn na integriny nebo adhezn mi receptory bu ka-bu ka, nebo kter jsou zp sobena faktory jako je TNF-alfa, nebo pro l en rakoviny nebo resten zy.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových analogů oligonukleotidů s cennými fyzikálními, biologickými a farmakologickými vlastnostmi, jakož i způsobu jejich výroby. Jejich upotřebení zahrnuje použití jako inhibitorů exprese genů (antisense-oligonukleotidů, ribozymů, sense-oligonukleotidů a oligonukleotidů tvořících triplexy), jako sond pro důkazy nukleových kyselin a jako pomocných látek v molekulární biologii.

Dosavadní stav techniky

Oligonukleotidy nacházejí ve vzrůstajícím rozsahu použití jako inhibitory exprese genů (J. F. Milligan, M. D. Matteucci a J. C. Martin, J. Med. Chem. 36 (1993) 1923; E. Uhlmann a A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; S. T. Crooke, Annu. Řev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1992)329).

Antisense-oligonukleotidy jsou fragmenty nukleové kyseliny, jejichž sekvence bází je komplementární k mRNA, která má být inhibována. Tato cílová mRNA může být buněčného původu, virového původu, nebo původu z jiných patogenů. Jako buněčné cílové sekvence přicházejí v úvahu například sekvence receptorů, enzymů, růstových faktorů, imunomodulátorů, iontových kanálů nebo onkogenů. Inhibice množení virů za pomoci antisense-oligonukleotidů byla popsána například pro RSV (Rous Sarcoma virus), HSV-1 a -2 (Herpes Simples Virus typ I a II), HIV (Human Immunodeficiency Virus, virus lidské imunodeficience) a chřipkové viry. Přitom se nasazují ty oligonukleotidy, které jsou komplementární k virové nukleové kyselině.

Sense-oligonukleotidy mají naproti tomu tak koncipovanou sekvenci, že se vážou („zachycují“) například na proteiny vázající nukleové kyseliny nebo enzymy zpracovávající nukleové kyseliny a tak inhibují jejich biologickou aktivitu (C. Hélěne a J. J. Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Jako virové cílové proteiny zde lze jmenovat například reverzní transkriptázy, DNApolymerázy a transaktivátorové proteiny. Cílem oligonukleotidů tvořících triplexy je obecně DNA, a po navázání na tuto DNA vytvářejí trojšroubovicovou (tripelhelikální) strukturu.

Zatímco s pomocí antisense-oligonukleotidů je obecně zbrzďováno zpracování (sestřih apod.) mRNA nebo její translace do proteinů, zbrzďují oligonukleotidy tvořící triplexy transkripci nebo replikaci DNA (N. T. Thuong, a C. Hélěne, Angew Chem. 105 (1993) 697); Uhlmann a Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543). Je však rovněž možné vázat jednořetězcové nukleové kyseliny při první hybridizaci s antisense-nukleotidem za vytvoření dvojitých řetězců, které potom při druhé hybridizaci s oligonukleotidem vytvářejícím triplexy vytvářejí triplexovou strukturu. Antisense- a triplex- vazebné oblasti mohou být přitom přítomny buďto ve dvou odlišných oligonukleotidech nebo též v jednom oligonukleotidů.

Dalším použitím syntetických oligonukleotidů jsou takzvané ribozymy, které v důsledku jejich ribonukleázové aktivity rozrušují cílovou RNA (D. Castanotto, J. J. Rossi, J. O. Deshler, Critical Rev. Eukar. Gene Expr. 2 (1992) 331).

V DNA-diagnostice se fragmenty nukleových kyselin s vhodným značením používají jako takzvané DNA-sondy nebo DNA-próby pro specifickou hybridizaci na dokazovanou nukleovou kyselinu. Specifické vytváření nových dvojitých řetězců se přitom sleduje za použití značení, které výhodně není radioaktivní. Tímto způsobem se dají dokázat genetické, maligní, virové nebo jinými patogeny způsobované choroby.

-1 CZ 292037 B6

Pro nejčastější uvedená použití jsou oligonukleotidy v jejich přirozeně se vyskytující formě málo vhodné nebo zcela nevhodné. Musí být chemicky tak modifikovány, že odpovídají speciálním požadavkům. Aby bylo možné použít oligonukleotidy v biologických systémech, například k inhibici množení virů, musí splňovat následující předpoklady:

1. Musí za in vivo podmínek, tedy jak v séru tak rovněž intracelulámě, vykazovat dostatečně vysokou stabilitu.

2. Musí být uzpůsobeny tak, aby mohly procházet buněčnou a jadernou membránu.

3. Musí se za fyziologických podmínek vázat bázově specifickým způsobem na jejich cílovou nukleovou kyselinu, aby se rozvinul inhibiční účinek.

Pro DNA-sondy nejsou tyto předpoklady nevyhnutelné, oligonukleotidy je však nutno derivatizovat tak, aby byl možný jejich důkaz, například pomocí fluorescence, chemiluminiscence, kolorimetrie nebo specifického zbarvení (Beck a Koster, Anal. Chem. 62 (1990) 2258).

Je známá řada chemických obměn oligonukleotidů, které jsou syntetizovány s cílem lépe splňovat výše uvedené požadavky než nemodifikované oligonukleotidy. Chemické změny oligonukleotidů se provádějí obvykle tím způsobem, že se odpovídajícím způsobem změní fosfátová kostra, jednotka ribózy nebo nukleosidové báze (Uhlmann a Peyman, Chemical Review 90 (1990) 543). Mezi modifikacemi se nacházejí rovněž takové, při kterých je jak fosfátový můstek tak cukerní jednotka nahrazena jinými skupinami, například „morfolinonukleosidovými“ oligomery (E. P. Stirchak a kol., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129) nebo „PNA“ (P. E. Nielsen a kol., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3). Obzvláště se PNA vyznačují neobvykle vysokými afinitami k cílové RNA, trpí však jinými nepříznivými vlastnostmi, jako je nedostatek rozpustnosti nebo nedostatek penetrace do buněk (W. Wang a kol., Tetrahedron Letters 36 (1995) 1181; M. Egholm a kol., v „Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins, Nucleic Acids“, Roger Epton, Ed. Mayflower Worldwide Limited, Birmingham, 1994, 145 - 148).

Úkolem tedy je nalézt nové analogy oligonukleotidů s příznivými vlastnostmi.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou tudíž sloučeniny obecného vzorce I

(I), ve kterém n je číslo od 0 do 100, symboly B představují vždy nezávisle na sobě atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, alkoxylovou skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, alkylthio

-2CZ 292037 B6 skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku, arylalkylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylalkoxylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, arylalkylthioskupinu se 6 až 20 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aromatickou skupinu nebo heterocyklickou skupinu, přičemž alkyl, aryl nebo/a aromatická nebo heterocyklická skupina mohou být popřípadě jednou nebo vícekrát substituovány hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinou -NR⁹R¹⁰, karboxylovou skupinou, oxoskupinou, skupinou -C(O)OR⁸, -C(O)NR⁹R¹⁰, kyanoskupinou, fluorem, chlorem, bromem, nitroskupinou, alkoxyalkylovou skupinou se 2 až 6 atomy uhlíku, skupinou S(O)mR⁸, skupinou -alkyl-S(O)mR⁸ s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, skupinou -NHC(=NH)NHR⁸, -C(=NH)NHR⁸, -NR⁹C(=O)R⁸, =NOR⁸, NR⁹C(=O)OR'°, -OC(=O)NR⁹R¹⁰ nebo -NR⁹C(=O)NR⁹R¹⁰, nebo symboly B představují vždy nezávisle na sobě přirozenou nukleosidovou bázi, nepřirozenou nukleosidovou bázi nebo reportérový ligand,

A-B může rovněž znamenat přes karboxylovou skupinu vázanou D- nebo L-aminokyselinu nebo peptid tvořený těmito aminokyselinami s délkou až 5 aminokyselinových zbytků, symboly L představují vždy nezávisle na sobě atom dusíku nebo skupinu RA, a

R¹ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která může být substituována hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkylthioskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aminoskupinou, výhodně znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu, symboly A představují vždy nezávisle na sobě jednoduchou vazbu, methylenovou skupinu nebo

(Ha) (lib)

Y' znamená skupinu =0, =S, =CH2, =C(CH3)2 nebo =NR’, kde R¹ je definováno výše,

M představuje jednoduchou vazbu, atom kyslíku, atom síry nebo skupinu -NR¹-, kde R¹je definováno výše, symboly R² a R³ znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkylthioskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoskupinu, atom halogenu, jako fluoru, chloru či bromu, nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která může být popřípadě substituována hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alkylthioskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, výhodně však znamenají vždy atom vodíku, symboly p a <j nezávisle na sobě mají hodnotu 0 až 5,

-3CZ 292037 B6 symboly ras nezávisle na sobě mají hodnotu 0 až 5, symboly D a G představují vždy nezávisle na sobě skupinu CR³R⁶, symboly R⁵ a R⁶ znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku, arylalkylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku, v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, hydroxylovou skupinu, alkoxylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alkylthioskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž alkyl a aryl mohou být popřípadě substituovány skupinou SR¹ nebo NR’r’ , kde

R¹ má výše definovaný význam, a

R¹ má nezávisle na R¹ stejný význam jako R¹, avšak symboly R⁵ a R⁶ výhodně znamenají vždy atom vodíku,

X představuje atom kyslíku, atom síry nebo skupinu -NR¹-, kde R¹ je definováno výše,

Y znamená skupinu =0 nebo =S,

Z představuje skupinu -OR⁸, -NR⁹R¹⁰ nebo X'Q, kde X' má význam definovaný pro X a Q má význam definovaný pro Q,

R⁸ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu se 2 až 18 atomy uhlíku, alkinylovou skupinu se 3 až 18 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku nebo arylalkylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž alkyl může být jednou nebo vícekrát substituován hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem nebo bromem a aryl může být jednou až třikrát substituován hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem, bromem, nitroskupinou, skupinou -NR⁹R¹⁰, karboxylovou skupinou, skupinou -C(O)O-alkyl obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku nebo skupinou -C(O)NR⁹R¹⁰, výhodně však znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku nebo arylalkylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž aryl může být jednou substituován alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem, bromem nebo nitroskupinou, a zvláště výhodně znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu, symboly R⁹ a R¹⁰ představují vždy nezávisle na sobě atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, alkinylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku nebo arylalkylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž alkyl může být jednou nebo vícekrát substituován hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem nebo bromem, nebo mohou symboly R⁹ a R¹⁰ společně s atomem dusíku, který je nese, tvořit čtyř- až sedmičlenný kruh, symboly Q a Q' znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupinu R⁸, konjugáty, které příznivě ovlivňují vlastnosti antisense-oligonukleotidů nebo oligonukleotidů tvořících trojšroubovici nebo slouží jako značení DNA-sondy nebo při hybridizaci analogu oligonukleotidu na cílovou nukleovou kyselinu tuto napadají za vzniku vazby nebo příčného

-4CZ 292037 B6 zesítění, nebo znamenají oligonukleotidy, které mohou být nemodifikované nebo modifikované, s tím, že alespoň dva ze symbolů B přítomné ve sloučenině obecného vzorce I představují přirozenou nebo nepřirozenou nukleosidovou bázi, nebo alespoň jeden ze symbolů Q a Q' znamená oligonukleotid.

Následující varianty mají příkladně představovat některé modifikace oligonukleotidů (například popsáno vE. Uhlmann a A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543: Protocols for Oligonucleotides and Analogs“, Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993):

a) úplné nebo částečné nahrazení 3'- nebo/a 5'-diesterových můstků fosforečné kyseliny, například fosforothioátovými můstky, fosforodithioátovými můstky, NR⁴R⁴-fosforamidátovými můstky, boranofosfátovými můstky. fosfát-O-alkylesterovými můstky s 1 až 21 atomy uhlíku v alkylové části, fosfát-[aryl-O-alkyl]esterovými můstky se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 21 atomy uhlíku v alkylové části, 2,2,2-trichlordimethylethylfosfonátovými můstky, alkylfosfonátovými můstky s 1 až 8 atomy uhlíku v alkylové části nebo arylfosfonátovými můstky se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části, přičemž symboly R⁴ a R⁴ nezávisle na sobě znamenají vždy atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku, arylalkylovou skupinu se 6 až 14 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 8 atomy uhlíku v alkylové části nebo skupinu -(CH₂)_c-[NH(CH₂)_c]<r-NR⁷R⁷, kde c je celé číslo od 2 do 6, d je celé číslo od 0 do 6, a symboly R⁷ nezávisle na sobě představují vždy atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alkoxyalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, výhodně symboly R⁴ a R⁴ znamenají vždy atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku nebo methoxyethylovou skupinu, obzvláště výhodně znamenají vždy atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo methoxyethylovou skupinu, nebo symboly R⁴ a R⁴ mohou rovněž společně s atomem dusíku, který je nese, tvořit pěti- až šestičlenný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom ze skupiny zahrnující kyslík, síru a dusík,

b) úplné nebo částečné nahrazení 3'- nebo/a 5'-diesterových můstků fosforečné kyseliny „defosfo“-můstky (viz například Uhlmann a Peyman v „Methods in Molecular Biology“, svazek 20, „Protocols for Oligonucleotides and Analogs“, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, kapitola 16, 355 a další), například formacetalovými skupinami, 3'-thioformacetalovými skupinami, methylhydroxylaminovými skupinami, oximovými skupinami, methylendimethylhydrazoskupinami, dimethylensulfonovými skupinami nebo silylovými skupinami,

c) úplné nebo částečné nahrazení cukrfosfátové kostry například „morfolinonukleosidovými“ oligomery (Ε. P. Stirchak a kol., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129) nebo „PNA“ (P. E. Nielsen a kol., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3), nebo PNA-DNA-hybridy jak je popsáno například v DE-P 44 08 528.1 popřípadě EP-A 0 672 677,

-5CZ 292037 B6

d) úplné nebo částečné nahrazení |3-D-2'-desoxyri béžových jednotek, například ct-D-2'desoxyribózou, L-2'-desoxyribózou, 2'-F-2'-desoxyribózou, 2'-O-alkylribózou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 2'-O-alkenylribózou se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 2'-NH₂-2'-desoxyribózou, β-D-xylofuranózou, α-arabinofuranózou, 2,4-dideoxyβ-D-erythrohexopyranózou, a karbocyklickými cukernými analogy (například Froehler. J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320) a cukernými analogy s otevřeným řetězcem (například Vandendriessche a kol., Tetrahedron 49 (1993) 7223) nebo bicyklickými cukernými analogy (například M. Tarkov a kol., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481),

e) úplné nebo částečné nahrazení přirozených nukleosidových bází, například 5-(hydroxymethyl)uracilem, 5-aminouracilem, pseudouracilem, dihydrouracilem, 5-alkyluracilem s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku valkinylové části (například popsaném v Glutierrez a kol., J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 540 nebo Sagi a kol., Tetrahedron Lett. 34 (1993) 2191), 5-alkylcytosinem s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové Části (Gutierrez a kol., J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 540 nebo Sagi a kol., Tetrahedron Lett. 34 (1993) 2191), 5-fluoruracilem, 5-fluorcytosinem, 5-chloruracilem, 5-chlorcytosinem, 5-bromuracilem, 5-bromcytosinem nebo 7-deaza-7-substituovaným purinem (například popsaném v Seela, Nucl. Acids Res. 20 (1992) 2297; Heterocycles 34 (1992)229).

Symboly Q a Q' mohou rovněž představovat konjugáty, které příznivě ovlivňují vlastnosti antisense-oligonukleotidů nebo oligonukleotidů tvořících trojšroubovici (jako například penetraci do buněk, odbourávání nukleázami, afinitu k cílové RNA či DNA, farmakokinetiku) nebo slouží jako značení DNA-sondy nebo při hybridizaci analogu oligonukleotidu na cílovou nukleovou kyselinu tuto napadají za vzniku vazby nebo příčného zesítění. Mezi příklady těchto konjugátů patří konjugáty s poly-lysinem, s interkalátory jako je pyren, acridin, fenazin, fenathridin, s fluoreskujícími sloučeninami jako je fluorescein, se zesíťujícími sloučeninami jako je psoralen, azidoproflavin, s lipofllními molekulami, jako jsou alkylové skupiny s 12 až 20 atomy uhlíku, s lipidy jako je 1,2-dihexadecyl-rac-glycerin, se steroidy jako je cholesterol nebo testosteron, s vitaminy jako je vitamin E, s póly- popřípadě oligoethylenglykolem, s alkylfosfátdiestery s 12 až 18 atomy uhlíku v alkylové části, s -O-CH₂-CH(OH)-O-alkylovými skupinami s 12 až 18 atomy uhlíku v alkylové části. Výhodně jsou konjugáty s lipofllními molekulami, jako jsou alkylové skupiny s 12 až 20 atomy uhlíku, se steroidy jako je cholesterol nebo testosteron, s póly- nebo oligo- ethylenglykolem, s vitaminem E, s interkalátoiy jako je pyren, s alkylfosfátdiestery se 14 až 18 atomy uhlíku v alkylové části, s -O-CH₂-CH(0H)-0alkylovými skupinami s 12 až 16 atomy uhlíku v alkylové části. Takové konjugáty oligonukleotidů jsou odborníkovi známé (viz například Uhlmann a Peyman, Chem. Rev. 90 (1990) 543; M. Manoharan v „Antisense Research and Applications“, Crooke a Lebleu, Eds. CRC Press, Boča Raton, 1993, kapitola 17, strana 303 a další a EP-A 0 552 766). Dále mohou tyto oligonukleotidy nést na 3'- nebo 5'-konci 3',3'- a 5',5'-inverze (popsáno například v M. Koga a kol., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757).

Aromatickými skupinami jsou například fenylová, naftylová, pyrenylová, anthracenylová, fenanthrylová, bifenylová, binaftylová, tetracenylová, pentacenylová, hexacenylová, trifenylenová, chrysenylová nebo benzopyrenylová skupina.

Termínem heterocyklické skupiny se rozumí například chromanylová, chromenylium-l-ylová, furanylová, izochromanylová, izochromenylová, izochinolylová, piperazinylová, chinolinylová, pyridinylová, pyrrolidinylová, imidazylová, pyrimidinylová, thielanylová, thiazolylová, azepinylová, pyrrolylová, tetrahydropyrrolylová, benzofuranylová, indolylová, izoindolylová, izatinylová, dioxindolylová, indoxylylová, kumarinylová, kumaronylová, karbazolylová, pyrazolylová, pyrrolylová, indazolylová, oxazolylová, izoxazolylová, thiazolylová, 1,2,4-triazolylová, 1,2,3-6CZ 292037 B6 triazolylová, tetrazolylová, pentazolylová, piperidinylová, pyradizinylová. fenazinylová, fenoxazinylová, fenothiazinylová, morfolinylová, thiazinylová, benzodiazepinylová, purinylová, xanthinylová, hypoxanthinylová, theofyllinylová, theobrominylová, kofeinylová. pteridinylová, pterinylová, pteridinylová, alloxazinylová a norttropinylová skupina.

Termínem přirozené nukleosidové báze se rozumí například uráčil, cytosin. 5-methyluracil, adenin a guanin, a termínem nepřirozené nukleosidové báze se rozumí například 5-nitroindol, 5-(hydroxymethyl)uracil, 5-aminouracil, pseudouracil, dihydrouracil, 5-alkyluracily s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracily se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracily se 3 až 6 atomy uhlíku v alkinyiové části, 5-alkylcytosiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenylcytosiny se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosiny se 3 až 6 atomy uhlíku v alkinyiové části, 5-fluoruracil, 5-fluorcytosin, 5-chloruracÍl, 5-chlorcytosin, 5-bromuracil, 5-bromcytosin a 7-deaza-7-substituované puriny, jako 7-deaza-7-alkinylguaniny se 3 až 7 atomy uhlíku v alkinyiové části, 7-deaza-7-alkinyladeniny se 3 až 7 atomy uhlíku v alkinyiové části, 7-deaza-7-alkenylguaniny se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkenyladeniny se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkylguaniny s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-alkyladeniny s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-bromguanin a 7-deaza-7-bromadenin.

Výhodně představují nepřirozené nukleosidové báze 5-alkyluracily s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracily se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracily se 3 až 6 atomy uhlíku v alkinyiové části, 5-alkylcytosiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenylcytosiny se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosiny se 3 až 6 atomy uhlíku v alkinyiové části, 5-fluoruracil, 5-fluorcytosin, 5-chloruracil, 5-chlorcytosin, 5-bromuracil, 5-bromcytosin nebo 7-deaza-7-substituované puriny, jako 7-deaza-7-alkinylguaniny se 3 až 7 atomy uhlíku v alkinyiové části, 7-deaza-7-alkinyladeniny se 3 až 7 atomy uhlíku v alkinyiové části, 7-deaza-7-alkenylguaniny se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkenyladeniny se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkylguaniny s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-alkyladeniny s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-bromguanin a 7-deaza-7-bromadenin, zvláště výhodně 5-alkyluracily se 3 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracily se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracily se 3 až 6 atomy uhlíku v alkinyiové části, 5-alkylcytosiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenylcytosiny se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosiny se 3 až 6 atomy uhlíku v alkinyiové části nebo 7-deaza-7-substituované puriny a obzvláště výhodně 5-pentinylcytosin, 5-hexinyluracil, 5-hexinylcytosin, 7-deaza-7-propinylguanin, 7-deaza-7-propinyladenin, 7-deaza-7-methylguanin, 7-deaza-7-methyladenin, 7-deaza-7propinyladenin, 7-deaza-7-bromguanin nebo 7-deaza-7-bromadenin.

Reportérovými ligandy jsou například fluorescein, biotin, acridin, fenanthrolin, fenanthridin a eosin.

Pod označením D- a L-aminokyseliny jsou, pokud není uvedeno jinak, uváděny obzvláště následující aminokyseliny (srov. Schroder, Liibke, Peptides, svazek 1, New York 1965, strany XXII -XXIII; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, svazek XV / 1 a 2, Stuttgart 1974);

Aad, Abu, yAbu, ABz, 2ABz, eAca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, pAib, Ala, pAla, AAla, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg, Asn, Asp, Asu, Áze, Azi, Bai, Aph, Can, Cit, Cys, Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Ďasu, Djen, Dpa, Dtc, Fel, Gin, Glu, Gly, Guv, hAla, hArg, hCys, hGln, hGlu, His, hile, hLeu, hLys, hMet, hPhe, hPro, hSer, hThr, hThp, hTyr, Hyl, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise, Iva, Kyn, Lant, Len, Leu, Lsg, Lys, pLys, ÁLys, Met, Mim, Min, hArg, Nle, Nva, Oly, om, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pie, Pro, APro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, Sec, Sem, Ser, Thi, pThi, Thr, Thy, Thx, Tia, Tle, Tly, Trp, Trta, Tyr, Val atd., kteréžto zkratky bez uvedené stereochemického údaje představují zbytek v L-formě,

-7CZ 292037 B6 nebo rovněž cyklické aminokyseliny, jako například pyrrolidin-2-karboxylová kyselina, piperidin-2-karboxylová kyselina, 1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3-karboxylová kyselina, dekahydroizochinolin-3-karboxylová kyselina, oktahydro5 indol-2-karboxylová kyselina, dekahydrochinolin-2-karboxylová kyselina, oktahydrocyklopenta[b]pyrrol-2-karboxylová kyselina, 2-azabicyklo[2,2,2]oktan-3-karboxylová kyselina, 2-azabicyklo[2,2,1 ]heptan-3-karboxylová kyselina, 2-azabicyklo[3,1,0]hexan-3-karboxylová kyselina, 2-azaspiro[4,4]nonan-3-karboxylová kyselina, 2-azaspiro[4,5]dekan-3-karboxylová kyselina, spiro[(bicyklo[2,2,l]heptan)-2,3-pyrrolidin-5-karboxylová kyselina], spiro[(bicyklo10 [2,2,2]oktan)-2,3-pyrrolidin-5-karboxylová kyselina], 2-azatricykio[4,3,0,l⁶’⁹]dekan-3-karboxylová kyselina, dekahydrocyklohepta[b]pyrrol-2-karboxylová kyselina, oktahydrocyklopenta[c]pyrrol-2-karboxylová kyselina, oktahydroizoindol-1 -karboxylové kyselina, 2,3,3a,4,6ahexahydrocyklopenta[b]pyrrol-2-karboxylová kyselina, 2,3,3a,4,5,7a-hexahydroindol-2karboxylová kyselina, tetrahydrothiazoI-4-karboxylová kyselina, izoxazolidin-3-karboxylová 15 kyselina, pyrazolidin-3-karboxylová kyselina, hydroxypyrrolidin-2-karboxylová kyselina, přičemž všechny mohou být popřípadě substituovány:

-8CZ 292037 B6

-9CZ 292037 B6

HO

i

US-A 4 344 959, US-A 4 374 847, US-A 4 350 704, EP-A 29 488, EP-A 31 741, EP-A 46 953, EP-A 49 605, EP-A 49 658, EP-A 50 800, EP-A 51 020, EP-A 52 870, EP-A 79 022, EP-A 84 164, EP-A 89 637, EP-A 90 341, EP-A 90 362, EP-A 105 102, EP-A 109 020, EP-A 111 873, EP-A 271 865 a EP-A 344 682.

Alkylové skupiny a od nich odvozené zbytky, jako například alkoxylové skupiny a alkylthioskupiny mohou být rozvětvené, nerozvětvené nebo cyklické, nasycené nebo jednou nebo vícekrát nenasycené.

Výhodné jsou sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých n je číslo od 0 do 50, symboly B nezávisle na sobě představují vždy přirozenou nukleosidovou bázi nebo nepřirozenou nukleosidovou bázi,

L znamená atom dusíku,

A představuje skupinu obecného vzorce lib, kde r má hodnotu 1, s má hodnotu 0, symboly R² a R³ znamenají vždy atom vodíku,

Y' znamená skupinu =0, a

M představuje jednoduchou vazbu,

-10CZ 292037 B6 symboly D a G nezávisle na sobě představují vždy skupinu CHR⁵,

R⁵ znamená atom vodíku,

X představuje atom kyslíku,

Y znamená skupinu =0,

Z představuje hydroxylovou skupinu, methoxylovou skupinu, ethoxylovou skupinu, (4-nitrofenol)ethoxylovou skupinu, propoxylovou skupinu, izopropoxylovou skupinu, butoxylovou skupinu, pentoxylovou skupinu, fenoxyskupinu nebo allyloxylovou skupinu, a symboly Q a Q' znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupinu R⁸, nebo oligonukleotidy, které mohou být nemodifikované nebo modifikované, přičemž

a) 3'- nebo/a 5'-diesterové můstky fosforečné kyseliny jsou zcela nebo zčásti nahrazeny fosforothioátovými můstky, fosforodithioátovými můstky, NR⁴R⁴ -fosforamidátovými můstky, N3'—>P5'-fosforamidátovými můstky (například popsanými v Gryaznov a kol., J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 3143), fosfát-O-methylesterovými můstky, fosfát-O-ethylesterovými můstky, fosfát-O-izopropylesterovými můstky, methylfosfonátovými můstky nebo fenylfosfonátovými můstky,

b) jeden, dva nebo tři 3'- nebo 5'-diesterové můstky fosforečné kyseliny na pyrimidinových pozicích a na 5'-konci nebo/a na 3'-konci jsou nahrazeny formacetalovým nebo/a 3'-thioformacetalovým seskupením,

c) cukrfosfátová kostra je zcela nebo zčásti nahrazena „PNA“ nebo PNA-DNA-hybridy,

d) p-D-2'-desoxyribózové jednotky jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 2'-F-2'-desoxyribózou, 2'-0-alkylribózou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 2'-O-alkenylribózou se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části nebo 2'-NH₂-2'-desoxyribózou,

e) přirozené nukleosidové báze jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 5-alkyluracilem s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 5-alkylcytosinem s 1 až atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 5-fluoruracilem, 5-fluorcytosinem, 5-chloruracilem, 5-chlorcytosinem, 5-bromuraciIem, 5-bromcytosinem, 7-deaza-7-alkinylguaninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkinyladeninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkenylguaninem se 2 až atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkenyladeninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkylguaninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-alkyladeninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-bromguaninem nebo 7-deaza-7-bromadeninem.

Zvláště výhodné jsou sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých n je číslo od 0 do 30, symboly Q a Q' znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku, skupinu R⁸, kde

R⁸ představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo 2-(4-nitrofenylethylovou) skupinu,

-11 CZ 292037 B6 nebo oligonukleotidy, které mohou být nemodifikované nebo modifikované, přičemž

a) 3'- nebo/a 5'-diesterové můstky fosforečné kyseliny jsou zcela nebo zčásti nahrazeny fosforothioátovými můstky, fosforodithioátovými můstky nebo methylfosfonátovými můstky,

b) jeden, dva nebo tři 3'- nebo 5'-diesterové můstky fosforečné kyseliny na 5'- a 3'-konci jsou nahrazeny,

d) P-D-2'-desoxyribózové jednotky jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 2'-F-2'-desoxyribózou, 2'-O-alkylribózou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, 2'-0-alkenylribózou se 2 až 4 atomy uhlíku v alkenylové části nebo 2'-NH2-2'-desoxyribózou,

e) přirozené nukleosidové báze jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 5-alkyluracilem se 3 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 5-alkylcytosinem s 1 až atomy uhlíku v alkylové části, 5-aIkenyIcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkinylguaninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkinyladeninem se 2 až atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkenylguaninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkenyladeninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkylguaninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-alkyladeninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-bromguaninem nebo 7-deaza7-bromadeninem.

Obzvláště výhodné jsou sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých n je číslo od 0 do 25, symboly B nezávisle na sobě představují vždy přirozenou nukleosidovou bázi,

Z znamená hydroxylovou skupinu, ethoxylovou skupinu, (4-nitrofenyl)ethoxylovou skupinu nebo fenoxyskupinu, symboly Q a Q' nezávisle na sobě znamenají vždy atom vodíku, skupinu R⁸, kde

R⁸ představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo 2-(4-nitrofenylethylovou) skupinu, nebo oligonukleotidy, které mohou být nemodifikované nebo modifikované, přičemž

a) 3'- nebo/a 5'-diesterové můstky fosforečné kyseliny jsou zcela nebo zčásti nahrazeny fosforothioátovými můstky,

d) P-D-2'-desoxyribózové jednotky jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 2'-O-methyl-, 2'-O-allyl- nebo 2'-O-butylribózou,

e) přirozené nukleosidové báze jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 5-hexinylcytosinem, 5-hexinyluracilem, 5-hexinylcytosinem, 7-deaza-7-propinylguaninem, 7-deaza-7

- 12CZ 292037 B6 propinyladeninem, 7-deaza-7-methylguaninem, 7-deaza-7-methyladeninem, deaza-7bromguaninem nebo 7-deaza-7-bromadeninem.

Dalším předmětem vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých jsou zbytky Q a Q' spojeny, tj. tvoří cyklickou molekulu, přičemž může jít i o tu možnost, že Q a Q' společně tvoří jednoduchou vazbu. Syntéza takových sloučenin se může provádět analogicky s popsanými postupy, například jak popsali Gao a kol., Nucl. Acids REs. 23 (1995) 2025 nebo Wang a Kool, Nucl. Acids Res. 22 (1994) 2326.

Dalším předmětem vynálezu jsou oligonukleotidy popřípadě modifikované oligonukleotidy, například PNA, do kterých jsou sloučeniny obecného vzorce I zabudovány na 3'-konci nebo na 5'-konci nebo na 5'- a na 3'-konci.

Spojení oligonukleotidů se sloučeninami obecného vzorce I se provádí výhodně přes 5'- nebo 3'-hydroxylovou skupinu nukleotidových stavebních prvků, a rovněž přes monoesterovou vazbu fosfonové kyseliny. V obecných vzorcích XVIII a XIX jsou znázorněny příklady spojení s oligonukleotidy.

(XVIII) kde (XIX)

R¹⁷ představuje atom vodíku, hydroxylovou skupinu, atom fluoru, 2'-O-alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo 2'-0-alkenylovou skupinu se 2 až 6 atomy uhlíku, výhodně představuje atom vodíku, methoxylovou skupinu nebo O-allylovou skupinu, zvláště výhodně atom vodíku, a všechny ostatní symboly mají výše uvedené významy.

Obecné vzorce XX a XXI, ve kterých mají obecné symboly výše uvedené významy, představují příklady spojení s PNA.

(XX)

D / G

(XXI)

- 13CZ 292037 B6

Kombinace sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu (pokud Q a Q' představují vždy atom vodíku zkracovaných PMENA) s oligonukleotidy nebo modifikovanými oligonukleotidy. jako například PNA nebo jinými modifikacemi, jak jsou popsány výše, jsou ještě jednou uvedeny schematicky (OLIGO představuje nemodifikovaný nebo modifikovaný oligonukleotid):

Příklady takových kombinací jsou:

5'-OLIGO-PMENA

5-PMENA-OLIGO 5'-OLIGO-PMENA-OLIGO.

Dále se uvádějí:

5'-OLIGO-(PMENA-OLIGO)a (a = 1 - 20)

5-PMENA-OLIGO-PMENA

5'-PMENA-(OLIGO-PMENA)_a (a = 1 - 20)

Syntéza těchto kombinovaných sloučenin se provádí tak, že se podle molekuly započne nejprve syntézou stavebního prvku PMENA, která je popsána dále, a ty se poté spojí s oligonukleotidovým stavebním prvkem. Přitom se oligonukleotidy napojují za použití odborníkovi známých metod (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další) pomocí syntézy na pevné fázi nebo syntézy v rozpouštědle jako monomemí stavební prvky nebo pomocí blokové kondenzace. Kondenzace se provádějí alternativně podle amiditové metody, H-fosfonátové metody nebo fosfortriesterového postupu (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další). Pokud se naopak stavební prvky PMENA napojují na stavební prvky OLIGO, provádí se to výhodně způsobem popsaným v bodu ή). Konjugace se stavebními prvky PNA se provádí stejným způsobem nebo se (monomemí nebo oligomemí) stavební prvky PNA napojují na prvky PMENA pomocí odborníkovi známých metod syntéz peptidů nebo syntéz esterů.

Předmětem vynálezu je dále způsob výroby sloučenin obecného vzorce I, který se vyznačuje tím, že se aQ sloučeniny obecného vzorce III

ve kterém symboly D, G, L a X mají výše uvedené významy a

S¹ představuje vhodnou chránící skupinu, jako například dimethoxytritylovou, monomethoxytritylovou, tritylovou, pixylovou, terc-butoxykarbonylovou nebo fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinu, výhodně monomethoxytritylovou nebo terc-butoxykarbonvlovou skupinu, podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce IV ve kterém symboly R⁵ a R⁶ mají výše uvedené významy,

(IV),

-14CZ 292037 B6 ve vhodném organickém rozpouštědle, například v methanolu, ethanolu, izopropanolu, butanolu, acetonitrilu, dichlormethanu, chloroformu, benzenu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, diethyletheru, ethylacetátu, tetrahydrofuranu, jV-methylpyrrolidonu, petroletheru, xylenu nebo toluenu nebo směsi vhodných rozpouštědel, výhodně v methanolu nebo ethanolu, při teplotách od 0 °C do 100 °C, výhodně při 10 až 50 °C, za vzniku sloučenin obecného vzorce Va nebo Vb

přičemž při výběru reakčních podmínek, které jsou odborníkovi známé (například v S. R. Sandler, W. Káro „Organic Functional Group Preparations“, svazek II, diuhé vydání, Academie Press, Londýn, 1986, kapitola 12 („Imines“)), je třeba dbát na to, aby byly kompatibilní s chránící skupinou S¹, tj. například v případě, že je vybrána chránící skupina labilní v kyselých podmínkách, jako monomethoxytritylová chránící skupina, je třeba se při reakci vyhnout přidávání kyseliny, bi) sloučeniny obecného vzorce Va nebo Vb se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce Via nebo VIb, výhodně se sloučeninami obecného vzorce Via

(Via) (VIb), ve kterých

Y má výše definovaný význam, symboly X' a X nezávisle na sobě mají vždy význam definovaný pro symbol X, symboly S² a S³ nezávisle na sobě představují chránící skupiny, jako například methylovou, ethylovou, fenylovou, 2-chlorfenylovou, 2,5-dichlorfenylovou, 2,4-dichlorfenylovou, 4-nitrofenylovou, 4-methoxyfenylovou, 2-kyanethylovou, 2-(4-nitrofenyl)ethylovou, allylovou, benzylovou, 2,2,2-trichlor-l,l-dimethylethylovou, 4-methoxybenzylovou, 2,2,2-trichlorethylovou, 8-hydroxychinolinylovou skupinu nebo jinou chránící skupinu fosfátové funkce, jak jsou odborníkovi známy (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další), výhodně však představují vždy methylovou, ethylovou, fenylovou, 2-(4-nitrofenyl)ethylovou, allylovou nebo 2,2,2-trichlorethylovou skupinu, a

-15CZ 292037 B6

L¹ znamená odštěpitelnou skupinu, výhodně alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku.

ve vhodném organickém rozpouštědle, například v methanolu, ethanolu, izopropanolu. butanolu, acetonitrilu, benzenu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, dichlormethanu, ethylacetátu, chloroformu, diethyletheru, tetrahydrofuranu, N-methylpyrrolidonu, petroletheru, xylenu nebo toluenu nebo směsi vhodných rozpouštědel, výhodně v tetrahydrofuranu, při teplotách od 0 °C do 100 °C, výhodně při 50 až 80 °C, popřípadě za přidání bází, jako například trialkylaminu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé alkylové části, A-alkylmorfolinu, pyridinu, ΛζΎ-dimethylaminopyridinu, butyllithia, lithiumdiizopropylamidu, natriumhydridu, natriumamidu, uhličitanu draselného, uhličitanu cezného, Zerc-butoxidu draselného nebo komplexních bází jako je natriumamid-RⁿONa, kde R¹¹ znamená alkylovou skupinu se 2 až 6 atomy uhlíku nebo skupinu CH3CH2-O-CH2CH3, nebo peralkylovaných polyamino-fosfátových bází bez náboje (Schwesinger, Nachr. Chem. Techn. Lab. 38 (1990) 1214; Angew. Chem. 99 (1987) 1212), výhodně však bez přidání bází, za vzniku sloučenin obecného vzorce VII

ve kterých mají symboly D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y výše definovaný význam, ci) sloučeniny obecného vzorce VII se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce VIII

PR

L (VIII), jejichž syntéza je popsána například vDueholm a kol., J. Org. Chem. 59 (1994) 5767 a ve kterých

A má výše uvedený význam,

B^pr má stejný význam, jako symbol B, popřípadě je však v chráněné formě, tj. pokud B představuje přirozenou nebo nepřirozenou nukleosidovou bázi, potom B^PR znamená nukleosidové báze, jejichž aminoskupiny popřípadě hydroxylové skupiny jsou chráněny vhodnými známými chránícími skupinami, jako například j?ara-nitrofenylethylovou skupinou, benzoylovou skupinou, allylovou skupinou nebo />ara-(/erc-butyl)benzoylovou skupinou pro hydroxylovou skupinu a acetylovou, benzoylovou, para-(/erc-butyl)benzoylovou, ^ara-(methoxy)benzoylovou, /wa-nitrofenylethyloxykarbonylovou, izobutyrylovou, /iara-(terc-butyl)fenylacetylovou skupinou, XA-dimethylformamidinoskupinou, fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinou, benzyloxykarbonylovou skupinou nebo fenoxyacetylovou skupinou pro aminoskupinu, nebo jinými chránícími skupinami vhodnými v chemii oligonukleotidů pro nukleosidové báze (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další; Beaucage, Tetrahedron 49 (1993) 2223 a další), výhodně B^PR znamená:

-16CZ 292037 B6

kde

R¹² představuje atom vodíku, 1-propinylovou skupinu, 1-butinylovou skupinu, 1-pentinylovou skupinu nebo 1-hexinylovou skupinu, zvláště atom vodíku, 1-propinylovou skupinu nebo 1-hexinylovou skupinu,

R¹³ znamená atom vodíku, difenylkarbamoylovou skupinu nebo 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu, a

R¹⁴ představuje acetylovou, benzoylovou, para-(terc-butyl)benzoylovou, />ara-(methoxy)benzoylovou, para-nitrofenylethyloxykarbonylovou, izobutyrylovou, para-(iercbutyl)fenylacetylovou, benzyloxykarbonylovou nebo fenoxyacetylovou skupinu, a

L² znamená odborníkovi známou odštěpitelnou skupinu, jako například atom chloru, atom bromu, skupinu O-SO₂-methyl, 0-S0₂-trifluormethyl, O-tosylát nebo O-C₆F₅, nebo v případě že A představuje skupinu obecného vzorce lib může rovněž znamenat hydroxylovou skupinu, ve vhodném organickém rozpouštědle, například v acetonitrilu, benzenu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, dichlormethanu, ethylacetátu, chloroformu, diethyletheru, tetramethylmočovině, tetrahydrofuranu, 7V-methylpyrrolidonu, petroletheru, xylenu nebo toluenu nebo směsi vhodných rozpouštědel, výhodně v dimethylformamidu, při teplotách od -20 °C do 100 °C, výhodně při 0 až 50 °C, popřípadě za přidání bází, jako například trialkylaminu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé alkylové části, A-alkylmorfolinu, pyridinu, ΛζΎ-dimethylaminopyridinu, butyllithia, lithiumdiizopropylamidu, natriumhydridu, natriumamidu, uhličitanu draselného, uhličitanu cezného, terc-butoxidu draselného nebo komplexních bází jako je natriumamid-R^llONa, kde R¹¹ znamená alkylovou skupinu se 2 až 6 atomy uhlíku nebo skupinu CH₃CH₂-O-CH₂CH₃, nebo peralkylovaných polyamino-fosfátových bází bez náboje (Schwesinger, Nachr. Chem. Techn. Lab. 38 (1990) 1214; Angew, Chem. 99 (1987) 1212), v případě, že A znamená skupinu obecného vzorce lib a L² představuje hydroxylovou skupinu, výhodně za přidání triethylaminu, diizo-17CZ 292037 B6 propylethylaminu nebo V-ethylmorfolinu nebo bez přidání bází a za přidání kopulačního činidla obvyklého pro spojování peptidických vazeb, za vzniku sloučenin obecného vzorce IX

(IX), ve kterém symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, di) ze sloučenin obecného vzorce IX se známými způsoby (například Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley and Sons, New York 1991) odštěpí chránící skupina S³, takže například v případě sloučenin obecného vzorce IX, ve kterých symboly S² a S³ představují vždy 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu, se na ně působí O,1M l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7enem (DBU) v pyridinu nebo acetonitrilu při teplotě místnosti nebo v případě sloučenin obecného vzorce IX, ve kteiých symboly S² a S³ představují vždy fenylovou nebo ethylovou skupinu, se na ně působí vodným amoniakem nebo v případě sloučenin obecného vzorce IX, ve kterých S² znamená 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu a S³ znamená allylovou skupinu, se na ně působí Pd[P(C6H₅)₃]4 a trifenylfosfinem v dichlormethanu (Hayakawa a kol., J. Orch. Chem. 58 (1993) 5551) nebo v případě sloučenin obecného vzorce IX, ve kterých S² znamená 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu a S³ znamená allylovou skupinu, se na ně působí 0,5M 1,8-diazabicyklo[5,4.0]undec-7-enem v pyridinu nebo acetonitrilu nebo v případě sloučenin obecného vzorce IX, ve kterých S² znamená 2-kyanethylovou skupinu a S³ znamená allylovou skupinu, se na ně působí triethylaminem v pyridinu nebo v případě sloučenin obecného vzorce IX, ve kterých S² znamená 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu a S³ znamená 2,2,2-trichlor-l,l-dimethylethylovou skupinu, se na ně působí tributylfosfmem, přičemž se získají sloučeniny obecného vzorce X

(X), ve kterém symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X', X a Y mají výše definovaný význam, ei) ze sloučenin obecného vzorce IX se známými způsoby (například Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley and Sons, New York 1991, Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další) odštěpí chránící skupina S¹, takže se například monomethoxytritylová chránící skupina odštěpí působením kyseliny, například působením 80% kyseliny octové, 1 - 4% kyseliny dichloroctové v methylenchloridu nebo chloroformu, 2% kyseliny p-toluensulfonové ve směsi dichlormethanu a methanolu nebo působením 1% kyseliny trifluoroctové v chloroformu,

-18CZ 292037 B6 přičemž se získají sloučeniny obecného vzorce XI (XI),

ve kterém symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, fi) sloučeniny obecného vzorce XI se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce X ..fosfortriesterovým způsobem“ známým z chemie oligonukleotidů (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další, Reese, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1993, 2291 a další) ve vhodném organickém rozpouštědle, jako v acetonitrilu, benzenu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, dichlormethanu, ethylacetátu, chloroformu, diethyletheru, tetramethylmočovině, tetrahydrofuranu, A-methylpyrrolidonu, petroletheru, xylenu nebo toluenu nebo směsi vhodných rozpouštědel, výhodně v pyridinu, při teplotách od -20 °C do 100 °C, výhodně při 0 až 50 °C, za přidání kopulačního činidla, jako například 6-nitrobenzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)fosfonium-hexafluorfosfátu (NBOP, Hashmi, Nucleosides and Nucleotides 13 (1994) (1059), benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)fosfonium-hexafluorfosfátu (BOP, B. Castro, J. R. Dormoy, G. Evin a C. Selve, Tetrahedron Lett. 1975, 1219 - 1222), benzotriazol-l-yloxytripyrrolidinofosfonium-hexafluorfosfátu (PyBOP, J. Coste, D. LeNguyen a B. Castro, Tetrahedron Lett. 1990, 205-208), O-(7-aza)benzotriazol-l-yltetramethyluroniumhexafluorfosfátu (HATU, L. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397), N,N-bis[2-oxo-3-oxazolidinyljfosfordiamidchloridu (Katti, Tetrahedron Lett. 26 (1985) 2547), 2-chlor-5,5-dimethyl-2oxo-l,3,2-dioxafosforinanu (Stawinski, Nucl. Acids Res., Symp. Ser. 24, 1991, 229) nebo sloučeniny obecného vzorce XII

R~ fl fl (XII), kde

R¹⁵ představuje arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku, popřípadě jednou až čtyřikrát substituovanou alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, nitroskupinou, chlorem nebo bromem, a přičemž popřípadě jsou jeden až tři atomy uhlíku nahrazeny heteroatomy, výhodně dusíkem, tj. například znamená fenylovou, tolylovou, 2,4,6-trimethylfenylovou nebo 2,4,6-triizopropylfenylovou skupinu, zbytek 2,3,5,6-tetramethylbenzenu (Losse, Liebigs, Ann. Chem. 1989,19 a další), 4-brombenzenu, 2-nitrobenzenu nebo 4-nitrobenzenu nebo 8-chinolylovou skupinu, přičemž výhodně představuje 2,4,6-trimethylfenylovou skupinu nebo 2,4,6triizopropylfenylovou skupinu, a

R¹⁶ znamená odštěpitelnou skupinu, jako například atom chloru, atom bromu, imidazolylovou skupinu, triazolylovou skupinu, 4-nitroimidazolylovou skupinu, 1,2,3,4-tetrazolylovou skupinu nebo 3-nitro-l,2,4-triazolylovou skupinu, výhodně za přidání jako kopulačního činidla sloučeniny obecného vzorce XII, nebo BOP, PyBOP nebo HATU,

-19CZ 292037 B6 popřípadě za přidání katalyzátoru (Reese, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1993, 2291 a další), jako například Y-methylimidazolu, pyridin-N-oxidů jako například 4-methoxypyridin-A-oxidu nebo 4-ethoxypyridin-A-oxidu, 4,6-dinitro-l-hydroxybenzotriazolu, l-hydroxy-5-fenyltetrazolu, l-hydroxy-(5-(4-nitrofenyl)tetrazolu, 3-nitro-l H-l ,2,4-triazolu, 5-(3-nitrofenyl)-lH-tetrazolu, 5-(3,5-dinitrofenyl)-lH-tetrazolu, 5-(l-methylimidazol-2-yl)-lH-tetrazolu, 5-[(l-methylimidazol-2-yl)methyl]-l H-tetrazolu nebo l-hydroxy-4-nitro-6-(trifluormethyl)benzotriazolu, výhodně s 4-ethoxypyridin-ŤV-oxidem nebo 4-methoxypyridin-N-oxidem jako katalyzátorem, přičemž příprava kopulačního činidla může probíhat in šitu, nebo může probíhat rovněž odděleně a může se přidávat roztok aktivované sloučeniny (sloučenina obecného vzorce X + kopulační činidlo) ve vhodném rozpouštědle, čímž se získají sloučeniny obecného vzorce XIII s3 s(XIII), s

kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, gi) vycházeje ze sloučenin obecného vzorce XIII se opakují stupně ei) a fi) až do požadované délky řetězce, přičemž se získají sloučeniny obecného vzorce XIV

n (XIV), kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S², S³, X, X', X” a Y a n mají výše definovaný význam, a hi) chránící skupiny S¹, S² a S³ a chránící skupiny na B^PR se odštěpí pomocí známých postupů (například Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley and Sons, New York 1991), tj. například chránící skupina S¹ se odštěpí jak je popsáno ve stupni e,), chránící skupiny S² a S³se odštěpí, pokud představují 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu například působením 0,5M l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu v pyridinu nebo acetonitrilu při teplotě místnosti, pokud symboly S² a S³ představují fenylovou skupinu, odštěpí se například působením vodného amoniaku, pokud symboly S² a S³ znamenají allylovou skupinu, odštěpí se například působením Pd[P(C6H₅)3]₄ a trifenylfosfmu v dichlormethanu (Hayakawa a kol., J. Orch. Chem. 58 (1993) 5551), pokud symboly S² a S³ představují 2-kyanethylovou skupinu, odštěpí se například působením triethylaminu v pyridinu, nebo pokud symboly S² a S³ znamenají 2,2,2-trichlor-l,l

-20CZ 292037 B6 dimethylethylovou skupinu, odštěpí se například působením tributylfosfinu, a chránící skupiny na B^pr se odštěpí například, pokud R¹⁴ představuje para-nitrofenylethyloxykarbonylovou skupinu, 0,5M l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enem v pyridinu, pokud R¹⁴ znamená izobutyrylovou nebo benzoylovou skupinu nebo para-(methoxy)-benzoylovou skupinu, odštěpí se například koncentrovaným hydroxidem amonným při teplotě 20 až 60 °C, nebo v případě že R¹³ znamená 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu, odštěpí se například působením 0,5M 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu v pyridinu nebo acetonitrilu, výhodně, pokud symboly S¹ jsou stejné a znamenají vždy monomethoxytritylovou skupinu a symboly S² jsou stejné a představují vždy 2(para-nitrofenyl)ethylovou skupinu se výhodně nejprve odštěpí monomethoxytritylová skupina jak je popsáno ve stupni ei), poté se odštěpí S² jak je popsáno a poté se odstraní zbývající chránící skupiny, například na nukleosidových bázích, a popřípadě se zavedou skupiny Q a Q' pomocí odborníkovi známých postupů (viz například Uhlmann a Peyman, Chem. Rev. 90 (1990) 843; M. Manoharan v „Antisense Research and Applications“, Crooke a Lebleu, Eds., CRC Press, Boča Raton, 1993, kapitola 17, strana 303 a další; EP-A 0 552 766; S. Agrawal v Methods in Molecular Biology, svazek 26, strana 93 a následující, Humana Press, Totowa 1994), a popřípadě se získané sloučeniny cyklizují způsobem který popsal Wang, Nucl. Acids Res. 22 (1994) 2326, čímž se získají sloučeniny obecného vzorce I.

Alternativně lze konjugáty Q' vestavět pomocí odborníkovi známých postupů (J. March, „Advanced Organic Chemistry“, čtvrté vydání, J. Wiley and Sons, 1992) rovněž do monomemích stavebních prvků obecného vzorce XXII, ze kterých se poté odpovídajícími způsoby jako jsou uvedeny výše sestaví sloučeniny obecného vzorce I

S—X’ » ¹ _r _S3__XX^PV D' 'X—Q· (XXII)

Sloučeniny obecného vzorce XXII lze například v případě, že Q' představuje alkylovou skupinu, připravit reakcí sloučenin obecného vzorce XXIII se sloučeninami obecných vzorců Via nebo VIb a dalšími reakcemi analogickými jako jsou popsány pro sloučeniny obecných vzorců Va popřípadě Vb.

(XXIII)

Sloučeniny obecného vzorce XXII lze rovněž připravit ze sloučenin obecného vzorce IX odštěpením chránící skupiny S¹ a zavedením skupiny Q' pomocí známých postupů (J. March, „Advanced Organic Chemistry“, čtvrté vydání, J. Wiley and Sons, 1992).

Alternativně lze konjugáty Q a Q' vestavět pomocí odborníkovi známých postupů (J. March, „Advanced Organic Chemistry“, čtvrté vydání, J. Wiley and Sons, 1992) rovněž do monomemích stavebních prvků obecného vzorce XXIV, ze kterých se poté odpovídajícími způsoby jako jsou uvedeny výše sestaví sloučeniny obecného vzorce I

-21 CZ 292037 B6 (XXIV)

Kopulační činidla pro spojování peptidických vazeb (viz Ci)) jsou popsána například v Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, svazek 15/2, Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974 a jsou jimi též další reakční činidla jako například BOP (B. Castro. J. R. Dormoy, G. Evin a C. Selve, Tetrahedron Lett. 1975, 1219- 1222), PyBOP (J. Coste, D. Le-Nguyen a B. Castro, Tetrahedron Lett. 1990, 205- 208), BroP (J. Coste, M.-N. Dufour, A. Pantaloni a B. Castro, Tetrahedron Lett. 1990, 669 - 672), PyBroP (J. Coste, E. Frerot, P. Jouin a B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 1967- 1970) a močovinová (uroniová) reakční činidla, jako například HBTU (V. Dourtogou, B. Gross, V. Lambropoulou, C. Zioudrou, Synthesis 1984, 572 - 574), TBTU, TPTU, TSTU, TNTU (R. Knorr, A. Trzeciak, W. Bannwarth a D. Gillessen, Tetrahedron Letters 1989, 1927- 1930), TOTU (EP-A-0 460 446), HATU (L. A. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397- 4398), HAPyU, TAPipU (A. Ehrlich, S. Rothemund, M. Bradel, M. Beyermann, L. A. Carpino a M. Bienert, Tetrahedron Lett. 1993, 4781 - 4784), BOI (K. Akaji, N. Kuriyama, T. Kimura, Y. Fujiwara a Y. Kiso, Tetrahedron Lett. 1992, 3177 - 3180) nebo chloridy kyselin popřípadě fluoridy kyselin (L. A. Carpino, H. G. Chao, M. Beyermann a M. Bienert, J. Org. Chem., 56 (1991), 2635; J.-N. Bertho, A. Loffet, C. Pinel, F. Reuther a G. Sennyey v E. Giralt a D. Andreu (Eds.) Peptides 1990, Escom Science Publishers B. V. 1991, str. 53 - 54; J. Green a K. Bradley, Tetrahedron 1993,4141 - 4146, (2,4,6-mesitylensulfonyl-3nitro-1,2,4-triazolid (MSNT) (B. Blankemeyer-Menge, M. Nimitz a R. Frank, Tetrahedron Lett. 1990, 1701 - 1704), 2,5-difenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiofendioxid (TDO) (R. Kirstgen, R. C. Sheppard, W. Steglich. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1987, 1870 - 1871) nebo aktivované estery (D. Hudson, Peptide Res. 1990, 51 - 55) v současných literárních odkazech.

Výhodné je dále použití karbodiimidů, například dicyklohexylkarbodiimidu nebo diizopropylkarbodiimidu. Výhodně se používají rovněž reakční činidla obsahující fosfor, jako například PyBOP nebo PyBroP, močovinová reakční činidla, jako například HBTU, TBTU, TPT, TSTU, TNTU, TOTU nebo HATU, BOL

Přitom je kopulaci možno provádět přímo přidáním sloučenin obecného vzorce VIII s aktivačním činidlem a popřípadě za přidání aditiv, jako například 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (1970)) nebo 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazinu (HOObt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2034 (1970)) nebo lze rovněž odděleně provést předchozí aktivaci stavebního prvku jako aktivovaného esteru, a přidávat roztok aktivované sloučeniny ve vhodném rozpouštědle.

Předmětem vynálezu je dále způsob výroby sloučenin obecného vzorce I, ve kterém n má hodnotu 1 až 100, při kterém se použijí sloučeniny obecných vzorců XV a XVI

-22CZ 292037 B6 (XV)

o sχ· (XVI), s- i S ve kterých symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, symboly o a nezávisle na sobě mají hodnotu 0 až 50, výhodně 0až20ao + p+ l=n, a₂) ve sloučeninách obecného vzorce XV se odštěpí chránicí skupina S¹ jak je popsáno v bodě ei), b₂) ve sloučeninách obecného vzorce XVI se odštěpí chránicí skupina S³ jak je popsáno v bodě di), c₂) vzniknuvší sloučeniny se navzájem spojí jak je popsáno v bodě fi), přičemž se získají sloučeniny obecného vzorce XIV

kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X, Y a n mají výše definovaný význam, d₂) a tyto sloučeniny se přemění na sloučeniny obecného vzorce I jak je popsáno v bodě h]).

-23CZ 292037 B6

Předmětem vynálezu je dále způsob výroby sloučenin obecného vzorce I, který se vyznačuje tím, že se a₃) sloučeniny obecného vzorce X

(X), kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X', X a Y mají výše definovaný význam, navážou přes spojovací (spacerovou) skupinu na pevný nosič, za vzniku sloučenin obecného vzorce XVII

(XVII) kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X', X a Y mají výše definovaný význam,

SS představuje pevný nosič vhodný pro syntézu na pevné fázi, jako například AminopropylCPG (CPG znamená sklo s kontrolovanými póry, Controlled Póre Glass) nebo Tentagel, a

SPACER znamená skupinu odštěpitelnou po provedené syntéze od nosiče, jak jsou odborníkovi známé (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další), například bis(hydroxyethyl)sulfonylovou skupinu, jak je popsána v EP-A 0 552 766, nebo SPACER znamená bisfunkční konjugátovou molekulu Q, která je přes známou odštěpitelnou skupinu navázána na pevný nosič, například nukleotid nebo oligonukleotid, který je na pevný nosič navázán přes zbytek kyseliny jantarové (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 a další), nebo póly- popřípadě oligoethylenglykol, který je na pevný nosič navázán přes zbytek kyseliny jantarové (Jaschke, Tetrahedron Lett. 34 (1993) 301) nebo například derivát cholesterolu, který je navázán na pevný nosič přes zbytek kyseliny jantarové (MacKellar, Nucl, Acids Res. 20 (1992) 3411), b₃) ze sloučenin obecného vzorce XVII

-24CZ 292037 B6

i (XVII)

kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², SS, SPACER, X, X', X a Y mají výše definovaný 5 význam, se odštěpí chránící skupina S¹, jak je popsáno v bodě ei), c₃) výsledná sloučenina se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce X

kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X', X a Y mají výše definovaný význam, jak je popsáno v bodě fl), d₃) stupně b₃) a c₃) se opakují až do požadované délky řetězce, e₃) popřípadě se navážou konjugáty Q' pomocí známých postupů (viz například Uhlmann a Peyman, Chem. Rev. 90 (1990) 543; M. Manoharan v „Antisense Research and Applications“, Crooke a Lebleu, Eds., CRC Press, Boča Raton, 1993, kapitola 17, str. 303 a další; EP-A 0 552 766; S. Argrawal v „Methods in Molecular Biology“, svazek 26, str. 93 a další, Humana Press, Totowa 1994), a f₃) takto vyrobené sloučeniny se odštěpí od pevného nosiče, například v případě bis(hydroxyethyl)sulfonylového spojovníku, jak je popsáno v EP-A 0 552 766, působením 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu, v případě spojení přes kyselinu jantarovou působením vodným amoniakem, a chránící skupiny se odštěpí jak je popsáno ve stupni hj), přičemž odštěpování chránících skupin se může provádět rovněž před odštěpením od nosiče, a popřípadě se připojí konjugáty Q pomocí známých postupů (viz výše), přičemž pořadí napojování Q a Q' ve stupních e₃), f₃) lze rovněž změnit, a získané sloučeniny se popřípadě cyklizují.

Sloučeniny obecného vzorce I nacházejí použití jako inhibitory exprese genů. Předmětem vynálezu je tedy použití terapeuticky účinných sloučenin podle vynálezu k výrobě léčiva, jakož i 35 způsob výroby léčiva, který se vyznačuje tím, že se sloučeniny podle vynálezu míchají s fyziologicky přijatelnými nosičem jakož i popřípadě vhodnými přídavnými nebo/a pomocnými látkami.

Terapeuticky účinnými sloučeninami se rozumí obecně takové sloučeniny, které na základě pořadí stavebních prvků B, které odpovídají nukleosidovým bázím, fungují jako analogy antisense-oligonukleotidů, oligonukleotidů tvořících trojšroubovici, aptamerů (molekul RNA

-25CZ 292037 B6 nebo DNA, které se mohou vázat na specifické cílové molekuly, například proteiny nebo receptory (například L. C. Bock a kol., Nátuře 1992, 355, 564)) nebo ribozymů (katalytických

RNA, viz například Castanetto a kol., Critical Rev. Eukar. Gene Expr. 1992,2,331), zvláště jako analogy antisense-oligonukleotidů a oligonukleotidů tvořících trojšroubovici.

Dalším předmětem vynálezu je proto použití sloučenin podle vynálezu jako diagnostického činidla, například k detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti nebo množství specifické dvojřetězcové nebo jednořetězcové molekuly nukleové kyseliny v biologickém vzorku.

Sloučeniny podle vynálezu mají pro použití podle vynálezu délku (η— 1) přibližně 6-100, výhodně přibližně 10-40, zvláště přibližně 12-31 nukleotidů. Jinak platí i zde výše popsané výhodné významy, modifikace popřípadě konjugace.

Léčiva podle vynálezu lze použít například pro léčení onemocnění, která jsou způsobována viry, například viry HTV, HSV-1, HSV-2, chřipkovými viry, viry VSV, hepatitidy B nebo papilomovými viry.

Sekvence (pořadí bází) podle vynálezu, které jsou účinné proti takovým cílům, jsou například:

a) proti HIV, například ACACCCAATTCTGAAAATGG AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA GGTCCCTGTTCGGGCGCCA GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGG	SEQ ID č. 1 SEQ ID č. 2 SEQ ID č. 26 SEQ ID č. 3 SEQ ID č. 4 SEQ ID č. 5 SEQ ID č. 6
b) proti HSV-1, například GCGGGGCTCCATGGGGGTCG GGAGGATGCTGAGGAGG GGAGGATGCTGAGG CAGGAGGATGCTGAGGAGG	SEQ ID č. 7 SEQ ID č. 28 SEQ ID č. 29 SEQ ID č. 30

Léčiva podle vynálezu jsou vhodná například rovněž k léčení rakoviny nebo restenózy. Přitom je možno používat například sekvence (pořadí bází), které jsou zaměřeny proti cílům, které zodpovídají za vzniku rakoviny popřípadě rozvoj (růst) rakoviny. Takovými cíly jsou například:

1) jaderné onkoproteiny jako například c-myc, N-myc, c-myb, c-fosf, c-fosf/jun, PCNA, P120,

2) cytoplazmatické nebo s membránou asociované onkoproteiny, jako například EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl,

3) buněčné receptory, jako například EGF-receptor, c-erbA, retinoid-receptory, regulační podjednotky protein-kinázy, c-fms, a

4) cytokiny, růstové faktory, extracelulámí matrix, jako například CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, bFGF, myeloblastin, fibronectin.

a) proti c-Ha-ras, například CAGCTGCAACCCAGC

SEQ ID č. 8

c) c-myc, například

-26CZ 292037 B6

GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC AACGTTGAGGGGCAT	SEQ ID č. 9 SEQ ID č. 10
d) c-myb, například CTGCCGGGGTCTTCGGGC GTGCCGGGGTCTTCGGG	SEQ ID č. 11 SEQ ID č. 27
e) c-fos, například GGAGAACATCATGGTCGAAAG CCCGAGAACATCATGGTCGAAG GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG	SEQ IDč. 12 SEQ ID č. 13 SEQ ID č. 14
f) pl20, například CACCCGCCTTGGCCTCCCAC	SEQ IDč. 15
g) EGF-receptoru, například GGGACTCCGGCGCAGCGC GGCAAACTTTCTTTTCCTCC	SEQ IDč. 16 SEQ IDč. 17
h) tumorsupresoru p53, například GGGAAGGAGGAGGATGAGG GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG	SEQ IDč. 18 SEQ IDč. 19
i) bFGF, například GGCTGCCATGGTCCC	SEQIDč. 31

Léčiva podle vynálezu jsou například dále vhodná k léčení onemocnění, která jsou ovlivněna integriny nebo adhezními receptory buňka-buňka, například VLA-4, VLA-2, ICAM nebo ELÁM.

Sekvence (pořadí bází) podle vynálezu, která jsou účinné proti takovým cílům, jsou například:

a) VLA-4, například GCAGTAAGCATCCATATC	SEQ ID č. 20
b) ICAM, například CCCCCACCACTTCCCCTCTC CTCCCCCACCACTTCCCCTC GCTGGGAGCCATAGCGAGG	SEQ ID č. 21 SEQ ID č. 22 SEQ ID č. 23
c) ELAM-1, například ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG CAATCAATGACTTCAAGAGTTC	SEQ ID č. 24 SEQ ID č. 25

Léčiva podle vynálezu jsou například dále vhodná k léčení onemocnění, která jsou způsobena faktory jako je TNF-alfa.

a) TNF-alfa, například TCATGGTGTCCTTTGCAGCC TCATGGTGTCCTTTGCAG

SEQ ID č. 32 SEQ ID č. 33

Léčiva je možno použít například ve formě farmaceutických preparátů, které se podávají například místně nebo orálně, například ve formě tablet, dražé, tvrdých nebo měkkých želatinových kapslí, roztoků, emulzí nebo suspenzí. Lze je podávat rovněž rektálně například ve formě čípků nebo parenterálně například ve formě injekčních roztoků. Pro přípravu farmaceutických preparátů lze tyto sloučeniny zapracovat do terapeuticky inertních organických a anorganických nosičů. Příklady takových nosičů pro tablety, dražé a tvrdé želatinové kapsle jsou laktóza, kukuřičný škrob nebo jeho deriváty, mastek a kyselina stearová a nebo její soli. Vhodnými nosiči pro přípravu roztoků jsou voda, polyoly, sacharóza, invertní cukr a glukóza. Vhodnými nosiči pro injekční roztoky jsou voda, alkoholy, polyoly, glycerol a rostlinné oleje. Vhodnými nosiči pro čípky jsou rostlinné a ztužené oleje, vosky, tuky a polotekuté polyoly. Farmaceutické preparáty mohou obsahovat rovněž konzervační činidla, rozpouštědla, stabilizační činidla, smáčedla, emulgátory, sladidla, barviva, činidla upravující chuťové vlastnosti, soli pro úpravu osmotického tlaku, pufry, povlaky, antioxidanty, jakož i popřípadě další terapeutické účinné látky.

Výhodnou aplikací je orální aplikace. Další výhodnou formou podání je injekce. K tomuto účelu se používají antisense-oligonukleotidy formulované v kapalném roztoku, výhodně ve fyziologicky přijatelném pufru, jako například Hankově roztoku nebo Ringerově roztoku. Terapeuticky účinné sloučeniny podle vynálezu lze však formulovat rovněž v pevné formě a před upotřebením je rozpustit nebo suspendovat. Pro systémové podání činí výhodné dávky přibližně 0,01 mg / kg až přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti denně.

Seznam sekvencí
ACACCCAATTCTGAAAATGG	SEQ ID č. 1
AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA	SEQ ID č. 2
GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA	SEQ ID Č. 3
GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA	SEQ ID č. 4
GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG	SEQ ID č. 5
GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGG	SEQ ID č. 6
GCGGGGCTCCATGGGGGTCG	SEQ ID č. 7
CAGCTGCAACCCAGC	SEQ ID č. 8
GGCTGCTGGAGCGGGCACAC	SEQ ID č. 9
AACGTTGAGGGGCAT	SEQ ID č. 10
CTGCCGGGGTCTTCGGGC	SEQ ID č. 11
GGAGAACATCATGGTCGAAAG	SEQ ID č. 12
CCCGAGAACATCATGGTCGAAG	SEQ ID č. 13
GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG	SEQ ID č. 14
CACCCGCCTTGGCCTCCCAC	SEQ ID č. 15
GGGACTCCGGCGCAGCGC	SEQ ID č. 16
GGCAAACTTTCTTTTCCTCC	SEQ ID č. 17
GGGAAGGAGGAGGATGAGG	SEQ ID č. 18
GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG	SEQ ID č. 19
GCAGTAAGCATCCATATC	SEQ ID č. 20
CCCCCACCACTTCCCCTCTC	SEQ ID č. 21
CTCCCCCACCACTTCCCCTC	SEQ ID c. 22
GCTGGGAGCCATAGCGAGG	SEQ ID č. 23
ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG	SEQ ID č. 24
CAATCAATGACTTCAAGAGTTC	SEQ ID č. 25
GGTCCCTGTTCGGGCGCCA	SEQ ID č. 26
GTGCCGGGGTCTTCGGG	SEQ ID č. 27
GGAGGATGCTGAGGAGG	SEQ ID č. 28
GGAGGATGCTGAGG	SEQ ID č. 29
CAGGAGGATGCTGAGGAGG	SEQ ID č. 30

-28CZ 292037 B6

GGCTGCCATGGTCCC

TCATGGTGTCCTTTGCAGCC

TCATGGTGTCCTTTGCAG

SEQIDč. 31

SEQ ID č. 32

SEQ ID č. 33

Popis obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je znázorněna křivka UV-absorbance v závislosti na teplotě pro (PMENA-t9) za přítomnosti 1 ekvivalentu (dA)₉. Pufr obsahuje 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)piperazin-lethansulfonové kyseliny), 20 mM chloridu hořečnatého, 1 M chloridu sodného, má pH. Symbol t znamená teplotu ve °C.

Obrázek 2 představuje důkaz vazby PMENA-DNA pomocí pohyblivosti v gelu.

V dále uvedených příkladech představuje zkratka OD optickou hustotu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester 7V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

a) V-fluorenylmethyloxykarbonyl-2-aminoethanol

8,61 g (0,141 mol) 2-aminoethanolu se rozpustí ve 250 ml dioxanu a 150 ml vody. Při teplotě 15 - 20 °C se přidá nejprve 17,79 g (0,212 mol) hydrogenuhličitanu sodného a poté po částech 50 g (0,148 mol) fluorenylmethyloxykarbonyl-7V-sukcinimidu. Směs se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a poté se odpaří do sucha. Zbytek se rozdělí mezi dichlormethan a vodu, organická fáze se vysuší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Zbytek se rozmíchá ve 100 ml etheru, produkt se odsaje a důkladně se promyje etherem. Výtěžek činí 38,77 g (97 %).

Hmotová spektrometrie (ES+): 284,2 (M+H)⁺.

¹ H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 3,05 (dd, 2H, CH?OH), 3,39 (dd, 2H, N-CH₂), 4,25 (m, 3H, Ar-CH-CHA 4,61 (t, IH, OH), 7,14- 7,98 (m, 15H, Ar-H, NH).

lb) V-fluorenylmethyloxykarbonyl-2-amino-l-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethan

K 10 g (35,3 mmol) 7V-fluorenylmethyloxykarbonyl-2-aminoethanolu (z příkladu la) rozpuštěným ve 100 ml absolutního V.N-dimethylformamidu se při teplotě 0 °C přidá 5,93 g (45,93 mmol) diizopropylethylaminu a 10,91 g (35,3 mmol) 4-methoxytrifenylmethylchloridu a směs se míchá nejprve po dobu 1 hodiny při teplotě 0 °C a poté po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se odpaří a rozdělí se mezi dichlormethan a nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáze se promyje vodou, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Vyčištění se provede chromatografícký na silikagelu za použití nejprve směsi n-heptanu, ethylacetátu a triethylaminu v poměru 70 : 29 : 1 a poté směsi ethylacetátu a triethylaminu v poměru 99 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 14,4 g (73 %).

Hmotová spektrometrie (FAB): 562,3 (M+Li)⁺.

-29CZ 292037 B6 ’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,95 (t, 2H, CHiO-MMTr),

3,21 (dd, 2H, N-CH₂), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 4,25 (m, 3H, Ar-CH-CHA 4,61 (t, 1H,

OH), 6,80 - 7,96 (m, 23H, Ar-H, NH).

c) 2-amino-l-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethan

K 5,0 g (9 mmol) 7V-fluorenylmethyloxykarbonyl-2-amino-l-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethanu (z příkladu lb) rozpuštěným v 50 ml absolutního A/TV-dimethylformamidu se při teplotě místnosti přidá 6,55 g (90 mmol) diethylaminu a směs se míchá po dobu 2 hodin. Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití nejprve směsi n-heptanu, ethylacetátu a triethylaminu v poměru 50 : 49 : 1 a poté směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru : 20 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 2,96 g (98,7 %).

Hmotová spektrometrie (ES+); 340,3 (M+Li)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,75 (t, 2H, CH->O-MMTr). 2,93 (dd, 2H, N-CH₂), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 6,83 - 7,47 (m, 14H, Ar-H).

Id) 2-methylimino-l-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethan (trimer)

Ke 2,96 g (8,9 mmol) 2-amino-l-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethanu (z příkladu lc) rozpuštěným v 10 ml methanolu se za chlazení přidá 1,08 g (13,22 mmol) 37% formaldehydu a směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 4 hodin, přičemž se vytvoří tuhá sraženina. Reakční směs se odpaří a pro vyčištění se podrobí chromatografii na silikagelu za použití směsi n-heptanu, ethylacetátu a triethylaminu v poměru 50 : 49 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 1,7 g (55%).

Hmotová spektrometrie (FAB): 1042,8 (M+Li)⁺, 1034,8 (M-H)⁺.

¹ H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,60 (t, 6H, O-CH₂), 2,99 (t, 6H, N-CH₂), 3,69 (s, 9H, OCH₃), 6,78 - 7,42 (m, 42H, Ar-H).

e) di(2-(4-nitrofenyl)ethyl)fosfit

23,42 g (0,1 mol) difenylfosfitu se spolu s 33,43 g (0,2 mol) p-nitrofenylethanolu zahřívá v atmosféře argonu po dobu 14 hodin na teplotu 100 °C, a vyčištění se provede pomocí chromatografie na silikagelu za použití směsi n-heptanu a ethylacetátu v poměru 50 : 50 a poté směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 80 : 20 jako elučního činidla. Výtěžek činí 55 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 403,0 (M+Na)⁺, 381,1 (M+H)⁺.

¹ H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 3,03 (t, 4H, Ar-CH₂), 4,20 (4H, dt, O-CH₂), 6,71 (d, J = 140 Hz, 1H, PH), 7,52 (d, 4H, Ar-H), 8,17 (d, 4H, Ar-H).

f) di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester jV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

K 500 mg (1,32 mmol) di(2-(4-nitrofenyl)ethyl)fosfítu (z příkladu le) rozpuštěným ve 2 ml absolutního tetrahydrofuranu se přidá 341 mg (0,329 mmol) 2-methylimino-l-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethanu (trimeru) (z příkladu ld) a směs se míchá po dobu 3 hodin při teplotě °C. Rozpouštědlo se odpaří a směs se míchá ještě 30 minut při teplotě 100 °C. Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití nejprve směsi ethylacetátu a triethylaminu v poměru 99 : 1 a poté směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 9 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 83 %.

-30CZ 292037 B6

Hmotová spektrometrie (FAB): 732,3 (M+Li)⁺.

‘H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,64- 3,06 (m, 10H, Ar-CH₂ + P-CH₂ + CH₂-OMMTr + N-CH₂), 3,73 (s, 3H, OCH₃), 4.16 (dt. 4H, PO-CH₂), 6,78 - 8,08 (m, 22H, Ar-H).

Příklad 2 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester A-(A^/6-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-JV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

2a) Ke 2,00 g (2,76 mmol) di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru TV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny rozpuštěným v 60 ml absolutního VA-dimethylformamidu se přidá 0,952 g (8,27 mmol) A-ethylmorfolinu, 0,834 g (2,76 mmol) (A^-anizoyljcytosin-l-yloctové kyseliny a 1,153 g (3,03 mmol) 0-(7-aza)benzotriazol-l-yltetramethyluroniumhexafluorfosfátu (HATU, L. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397) a směs se míchá po dobu 12 hodin při teplotě místnosti. Poté se přidá znovu stejné množství HATU a směs se míchá po dobu dalších 3 hodin při teplotě místnosti. Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi dichlormethanu, methanolu a triethylaminu v poměru 95 : 4 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 2,7 g (97 %).

Hmotová spektrometrie (ES+): 1012,0 (M+H)⁺.

'H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,94 (t, 4H, P-O-CH₂CH,-Ar). 3,06 (t, 2H, MMTr-O-CHA 3,23 - 3,63 (m, 4H, P-CH_? + N-CHA 3,75 (s,3H, OCH₃), 3,83 (s, 3H, OCH₃), 4,10 (dt, 4H, P-O-CH₂), 4,79 (široký s, 2H, CO-CH₂), 6,80 - 8,18 (m, 28H, AR-H, cytosinyl-H), 11,03 (široký s, 1H, NH).

2b) Použijí se stejné výchozí materiály jako v příkladu 2a, avšak za použití (T-(kyan)ethoxykarbonyl)methylenamino)-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborátu (TOTU, EP 0 460 446) místo HATU. Výtěžek činí 57 %.

Spektroskopické údaje: viz příklad 2a

Příklad 3

Triethylamoniová sůl (2-(p-nitrofenyl)ethyl)monoesteru N-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-A(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny g (0,99 mmol) di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru A-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (z příkladu 2) se rozpustí ve 20 ml 0,lM roztoku l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu (DBU) v absolutním acetonitrilu a směs se míchá po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se rozdělí mezi dichlormethan a vodný roztok dihydrogenuhličitanu draselného (o pH 7), organická fáze se vysuší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Pro vyčištění se provede chromatografie na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 70 : 29 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 540 mg (57 %).

Hmotová spektrometrie (FAB): 906,5 (M-H+2Na)⁺, 884,6 (M+Na)⁺, 862,5 (M+H)⁺.

‘H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 3,00 (m, 4H, P-O-CH₂CH?-Ar + MMTr-O-CHA 3,38 - 3,60 (m, 4H, P-CH, + N-CH,). 3,73 (s, 3H, OCH₃),

-31 CZ 292037 B6

3,82 (s, 3H, OCH₃), 4,01 (dt, 2H, P-O-CH₂), 4,79 a 5,03 (vždy široký s, 2H, C0-CH₂),

6,78 - 8,20 (m, 24H, AR-H, cytosinyl-H), 11,00 (široký s, 1H, NH).

Příklad 4 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester A-íM-anizoyOcytosin-l-ylacetyl-TV-^ž-hydroxyjethylaminomethanfosfonové kyseliny

1,00 g (0,99 mmol) di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru V-fÝ-anizoyljcytosin-l-ylacetyl-V-^methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (z příkladu 2) se rozpustí v 80 ml 80% vodné kyseliny octové a směs se míchá po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří a dvakrát se provede společné odpaření s toluenem. Pro vyčištění se provede chromatografie na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 85 : 14 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 532 mg (71 %).

Hmotová spektrometrie (FAB): 761,2 (M+Na)', 739,3 (M+H)⁺.

*H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,98 (t, 4H, P-O-CH₂CHrAr), 3,38 - 3,67 (m, 4H, N-CH₂CH,-OH). 3,80- 3,89 (m, 2H, P-CHA 3,91 (s, 3H, OCH₃), 4,12 (dt, 4H, P-O-CH₂), 4,78 a 4,87 (vždy široký s, 2H, CO-CH₂),

6.98 - 8,19 (m, 14H, AR-H, cytosinyl-H), 11,02 (široký s, 1H, NH).

Příklad 5

5'-MMTr-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z triethylamoniové soli (2-(p-nitrofenyl)ethyl)monoesteru V-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-V-{4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 3) a di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru V-ýM-anizoyljcytosinl-ylacetyl-V-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 4). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 85 : 14 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 73 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1605 (M+Na)', 1583 (M+H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,94-3,18 (m, 6H, P-O-CHr-CH₂-Ar), 3,26 -3,95 (m, 10H), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 3,85 (s, 6H, OCH₃),

3.99 - 4,36 (m, 8H, P-O-CH₂), 4,75 - 4,92 (široký m, 4H, CO-CH₂), 6,83 - 8,18 (m, 38H, Ar-H, cytosinyl-H), 10,98 a 11,03 (vždy široký s, 2H, NH).

Příklad 6

5'-HO-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z „S-MMTr-C^-PíONPE^“ (příklad 5). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 85 : 14 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 74 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1332,4 (M+Na)⁺, 1310,3 (M+H)⁺.

-32CZ 292037 B6

Příklad 7

Diethylester N-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu lf, ale s diethylfosfitem. Výtěžek činí 87,5 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 490,2 (M+Li)⁺.

'H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,22 (t, 6H, CH>-CH₃), 2,80 (t, 2H, N-CH₂), 2.91 (d, J = 12,5 Hz, 2H, P-CH₂), 3,02 (t, 2H, CH₂-OMMTr), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 4,01 (dq, 4H, PO-CH₂), 6,84 - 7,45 (m, 14H, Ar-H).

Příklad 8

Diethylester 7V-thymin-l-ylacetyl-V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Ke 2,04 g (4,22 mmol) diethylesteru yV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 7), rozpuštěným v 50 ml absolutního V,V-dimethylformamidu se přidá 570,3 mg (4,22 mmol) hydroxybenzotriazolu (HOBT), 972,1 mg (8,44 mmol) V-ethylmorfolinu, 777 mg (4,22 mmol) tymidin-l-yloctové kyseliny a 639 mg (5,06 mmol) diizopropylkarbodiimidu. Směs se míchá po dobu 16 hodin při teplotě místnosti, rozpouštědlo se odpaří, zbytek se rozpustí v dichlormethanu a extrahuje se nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a poté nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Směs se vysuší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 98 : 2 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 2,47 g (90 %).

Hmotová spektrometrie (FAB): 662,3 (M+Na)⁺, 656,3 (M+Li)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,12-1,32 (m, 6H, CH>-CH₃), 1,68 a 1,75 (vždy s, 3H, T-CH₃), 3,10- 3,40 (m, 2H, CH₂-OMMTr), 3,53 -3,70 (m, 4H, P-CH₂ + N-CH₂), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 3,83 - 4,16 (m, 4H, PO-CH₂), 4,62 a 4,72 (vždy s, 2H, CO-CH,). 6,83 - 7,42 (m, 15H, Ar-H, T-H), 11,28 (s, 1H, NH).

Příklad 9

Triethylamoniová sůl monoethylesteru jV-thymin-l-ylacetyl-ŤV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

811 mg (1,25 mmol) diethylesteru A^r-thymin-l-ylacetyl-A^f-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 8) se suspenduje ve 3,75 ml IN hydroxidu sodného. Směs se míchá po dobu 3 hodin při teplotě místnosti a poté po dobu 6 hodin při teplotě 50 °C. Reakční směs se zahustí ve vakuu a zbytek se podrobí chromatografii na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 100 : 10 : 10 a poté 100 : 40 : 10 jako elučního činidla. Výtěžek činí 897 mg (99,5 %).

Hmotová spektrometrie (ES-): 620,4 (M-H).

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,18 (t, 9H, N-CHr-CH₃). 1,68 a 1,74 (vždy s, 3H, T-CH₃), 2,96- 3,08 (q, 6H, N-CH,-CH₃). 3,35 (m, 2H?

-33CZ 292037 B6

N-CH>). 3,43- 3,70 (d, J = 11 Hz, 2H, P-CH₂), 3,63 (t, 2H, CH₂-OMMTr), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 3,78 (dq, 2H, PO-CH₂), 4,60 a 4,86 (vždy s, 2H, CO-CH,). 6,82 - 7,41 (m, 15H, Ar-H, T-H), 11,24 (s, 1H, NH).

Příklad 10

Diethylester jV-thymin-l-ylacetyl-A^r-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z diethylesteru V-thymin-l-ylacetyl-V-(4methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 8). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 90 : 10 jako elučního činidla. Výtěžek činí 80 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 400,1 (M+Na)⁺, 378,1 (M+H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,17-1,32 (m, 6H, CH,-CH₃). 1,78 (s, 3H, T-CH₃), 3,40- 3,69 (m, 4H, CH₂-OH + N-CH₂), 3,89 (d, J = 11 Hz, 2H, P-CH₂), 3,92 - 4,19 (m, 4H, PO-CH₂), 4,70 (s, 2H, CO-CHA 4,98 (t, 1H, OH), 7,22 a 7,30 (vždy s, 1H, T-H), 11,25 (s, 1H, NH).

Příklad 11

Difenylester V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu lf, ale s diethylfosfitem. Výtěžek činí 100 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 58,2 (M+Li)⁺.

Příklad 12

Triethylamoniová sůl monofenylesteru V-thymin-l-ylacetyl-V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 8 z difenylesteru TV—(4—methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 11) a tymidin-l-yloctové kyseliny. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu, triethylaminu a vody v poměru 90 : 10 : 5 : 0,5 jako elučního činidla. Výtěžek činí 47 %.

Hmotová Spektrometrie (FAB): 682,3 (M+2Li-H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,16 (t, 9H, N-CHt-CH₃), 1,67 a 1,72 (vždy s, 3H, T-CH₃), 2,96 - 3,70 (m, 12H, N-CHt-CH, + N-CH, + P-CH₂, + CHr-OMMTr), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 4,58 a 4,88 (vždy s, 2H, CO-CHA 6,74 - 7,46 (m, 20H, Ar-H, T-H), 11,23 (s, 1H, NH).

Příklad 13

Fenyl-(4-nitrofenylethyl)diester A-thymin-l-ylacetyl-7V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

-34CZ 292037 B6

385,4 mg (0,5 mmol) triethylamoniové soli monofenylesteru 7V-thymin-l-ylacetyl-N-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 12) a 92 mg (0,55 mmol) 4-nitrofenylethanolu se třikrát společně odpaří s absolutním pyridinem, a poté se rozpustí v 15 ml absolutního pyridinu. Při teplotě 0 °C se přidá 403,4 mg (0,15 mmol) 3-nitro-l-(ptoluensulfonyl)-lH-l,2,4-triazolu (TSNT), směs se poté míchá po dobu 16 hodin při teplotě 0 - 5 °C, pyridin se oddestiluje ve vakuu, zbytek se vyjme ethylacetátem a postupně se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a poté roztokem chloridu sodného. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a triethylaminu v poměru 100 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 162 mg.

Hmotová spektrometrie (FAB): 931,3 (M+2Li-H)⁺, (M+Li)⁺.

Příklad 14 di(2-p-nitrofenyl)ethyl)ester A'-thymin-l-ylacetyl-V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 8 z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad lf) a tymidin-l-yloctové kyseliny. Výtěžek činí 63 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 898,4 (M+Li)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,65 a 1,72 (vždys, 3H, T-CHj), 2,96 (t, 4H, P-O-CH,-CH,-Ar). 3,06 (t, 2H? N-CHA 3,67 (d, J = 11 Hz, 2H, P-CHA 3,70 (m, 2H, MMTr-O-CHA 3,75 (s, 3H, OCH₃), 3,83 (s, 3H, OCH₃), 4,10 (dt, 4H, P-O-CHA 4,59 a 4,62 (vždy široký s, 2H, CO-CH₂), 6,83 - 8,18 (m, 23H, Ar-H, T-H), 11,30 (široký s, 1H, NH).

Příklad 15

Triethylamoniová sůl (4-nitrofenylethyl)monoesteru V-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

15a) z 30 mg (4-nitrofenylethyl)diesteru V-thymin-l-ylacetyl-V-(4-methoxytrifenyl-methoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 13) mg (4-nitrofenylethyl)diesteru 7V-thymin-l-ylacetyl-7V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 13) se rozpustí ve směsi 1 ml triethylaminu, 1 ml dioxanu a 80 mg p-nitrobenzaldoximu a směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, a zbytek se třikrát společně odpaří s pyridinem a dvakrát s toluenem. Zbytek se podrobí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a triethylaminu v poměru 100:2a poté směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 60:40: 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 23 mg.

Hmotová spektrometrie (FAB): 755,3 (M+2Li-H)⁺.

’Η-NMR (250 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,15 (t, 9H, N-CH7-CHA 1,60 a 1,79 (m, 3H, T-CH₃), 2,80 - 3,60 (m, 14H, N-CH7-CH7 + N-CH, + P-CH₂ + CHrOMMTr + Ar-CHA 3,73 (s, 3H, OCH₃), 4,01 (dt, 2H, P-O-CH₂), 4,58-4,92 (m, 2H, CO-CHA 6,82 - 8,18 (m, 19H, Ar-H, T-H), 11,30 (s, 1H, NH).

-35CZ 292037 B6

15b) z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru 7V-thymin-l-ylacetyl-jV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 14)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 3 z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru Λ'-thymin-lylacetyl-?/-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 14), ale v pyridinu jako rozpouštědla. Výtěžek činí 82 %.

Spektroskopické údaje: viz příklad 15a.

Příklad 16 jV-thymin-l-ylacetyl-V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonová kyselina

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 15b. Jako vedlejší produkt se s výtěžkem 18% získá 7V-thymin-l-ylacetyl-jV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonová kyselina.

Hmotová spektrometrie (ES-): 592,2 (M-H)~.

Příklad 17

5'-MMTr-T-P(OEthyl)-T-P(OEthyl)₂

361 mg (0,5 mmol) triethylamoniové soli monoethylesteru 7V-thymin-l-ylacetyl-W-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (sloučenina obecného vzorce IX) a 188,7 mg (0,5 mmol) diethylesteru V-thymin-l-ylacetyl-V-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (sloučenina obecného vzorce X) se společně dvakrát odpaří s absolutním pyridinem a poté se rozpustí v 10 ml absolutního pyridinu. Při teplotě 5- 10 °C se přidá 1,5 mmol TSNT a směs se míchá po dobu 16 hodin při teplotě místnosti. Pyridin se oddestiluje ve vakuu, zbytek se rozpustí v ethylacetátu a postupně se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a poté roztokem chloridu sodného. Zbytek se vysuší nad síranem sodným, zahustí se a vyčistí se chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 92 : 8 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 223 mg (46 %).

Hmotová spektrometrie (FAB): 987,5 (M+Li)⁺.

'H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H athymin-H: 6,82 - 7,43 (m, 16H), CO-CH₂: 4,59- 4,78 (m, 4H), thymin-CH₃: 1,63-1,80 (m,6H).

Příklad 18

5'-HO-T-P(OEthyl)-T-P(OEthyl)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z 5'-MMTr-T-P(OEthyl)-T-P(OEthyl)₂(příklad 17). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 85 : 15 : 2 a poté 100 : 50 : 1,5 jako elučního činidla. Výtěžek činí 95 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 731,2 (M+Na)⁺, 709,1 (M+H)⁺.

-36CZ 292037 B6 ’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou:

thymin-H: 7,21 - 7,36 (m, 2H), CO-CH₂: 4,60- 4,76 (m, 4H), thymin-CH₃:

1,63- 1,79 (m, 6H).

Příklad 19

5'-MMTr-T-P(Ofenyl)-T-P(OEthyl)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z diethylesteru A-thymin-l-ylacetyl-/V-(2hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 10) a triethylamoniové soli monofenylesteru V-thymin-l -ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 12). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 93 : 7 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 58 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1051,4 (M+Na)⁺, 1029,5 (M+H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H a thymin-H: 6,82 - 7,53 (m, 21H), CO-CH₂: 4,52- 4,82 (m, 4H), thymin-CH₃: 1,62-1,80 (m, 6H).

Příklad 20 di(4-nitrofenylethyl)ester 7V-thymin-l-ylacetyl-V-(2-hydroxyethyl)aminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru A-thymin-lylacetyl-N-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 14). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 90 : 10 jako elučního činidla. Výtěžek činí 85 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 620,3 (M+H)⁺.

‘H-NMR (500 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,73 (s, 3H, T-CH₃), 2,97 (t, 4H, P-O-CHz-CIh-Ar), 3,41 (m, 2H, N-CH₂), 3,59 (m, 2H, CH₇-OH), 3,83 (d, J = 11 Hz, P-CH_?), 4,08 - 4,30 (m, 4H, P-O-CH₂), 4,54 a 4,78 (vždy široký s, 2H, CO-CH₂), 4,99 (t, 1H, OH), 7,14 - 8,19 (m, 9H, Ar-H, thymidinyl-H, 11,30 (široký s, 1H, NH).

Příklad 21

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEthyl)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z diethylesteru A^ř-thymin-l-ylacetyl-jV-(2hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 10) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru 2V-thymin-l-ylacetyl-A^r-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15). Místo TSNT se pro kopulaci použije 3-nitro-l-(2,4,6triizopropylfenylsulfonyl)-lH-l,2,4-triazol (TIPSNT). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 95 : 5 : 2 a poté 90 : 10 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí více než 90 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 1109,0 (M+Li)⁺.

-37CZ 292037 B6 'H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H athymin-H: 6,82 - 8.18 (m, 20H), CO-CH₂: 4,51 - 4,76 (m, 4H), thymin-CH₃:

1,61-1,78 (m, 6H).

Příklad 22

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 21 z diethylesteru V-thymin-l-ylacetyl-A-(2hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 10) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru 7V-thymin-l-ylacetyl-7V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15). Místo TSNT se pro kopulaci použije 3-nitro-l-(2,4,6-triizopropylfenylsulfonyl)-lH-l,2,4-triazol (TIPSNT). Výtěžek činí více než 90 %.

Spektroskopické údaje: viz příklad 21.

Příklad 23

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky' jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 22). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10:2a poté 80 : 20 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 75 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 836,3 (M+Li)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H athymin-H: 7,11 - 8,22 (m, 6H), CO-CH₂: 4,55- 4,77 (m, 4H), thymin-CH₃: 1,71 (široký s, 6H).

Příklad 24

5'-HO-T-P(OH)-T-P(OEthyl)₂ mg (0,012 mmol) ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 23) se rozpustí v 1 ml 0,5M roztoku l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu v pyridinu a směs se míchá nejprve po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C a poté po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, zbytek se digeruje dvakrát spentanem a poté dvakrát s etherem, a poté se vyčistí chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 9 : 1 : 0,2 a poté 60 : 40 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 10,2 mg.

Hmotová spektrometrie (FAB): 725,3 (M+2Na-H)⁺, 703,3 (M+Na)⁺.

*H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: thymin-H: 7,15 - 7,70 (m, 2H), CO-CH₂: 4,67 - 4,92 (m, 4H), thymin-CH₃: 1,67-1,81 (m, 6H).

-38CZ 292037 B6

Příklad 25

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 22) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15) za přidání 1,5 ekvivalentu (vztaženo na příklad 23) 4-methoxypyridin-A-oxidu. Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10 : 2 a poté 85 : 15 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 61 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 1555,8 (M+H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H athymin-H: 6,83 - 8,20 (m, 25H), CO-CH₂: 4,52 - 4,75 (m, 6H), thymin-CH₃: 1,61-1,78 (m, 9H).

Příklad 26

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 25). Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 70:30: 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 89 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 1283,1 (M+H)⁺, 1305,0 (M+Na)⁺.

Příklad 27

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 26) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15) za přidání 1,5 ekvivalentu (vztaženo na příklad 23) 4-methoxypyridin-TV-oxidu. Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10:2a poté 80 : 20 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 15 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 2007 (M+H)⁺, 2029 (M+Na)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H athymin-H: 6,79- 8,21 (m, 30H), CO-CH₂: 4,53 - 4,87 (m, 8H), thymin-CH₃: 1,58- 1,89 (m, 12H).

Příklad 28

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 27). Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za

-39CZ 292037 B6 použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 70 : 30 : 2 jako elučního činidla.

Výtěžek činí 55 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1735 (M+H)⁺, 1757 (M+Na)⁺.

Příklad 29

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z di(4-nitrofenylethyl)esteru A-thymin-l-ylacetyl-7V-(2-hydroxyethyl)aminomethanfosfonové kyseliny (příklad 20) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru 7V-thymin-l-ylacetyl-N-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 100 : 0 : 1 a poté 90 : 10 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 87 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1356,2 (M+2Li-H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H athymin-H: 6,82 - 8,18 (m, 28H), CO-CH,: 4,50 - 4,71 (m, 4H), thymin-CH₃: 1,59- 1,78 (m, 6H).

Příklad 30

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2“ (příklad 29). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 85 : 15 : 1 a poté 80 : 20 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 78 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 1072,7 (M+H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály jsou: Ar-H athymin-H: 7,08- 8,20 (m, 14H), CO-CH₂: 4,52 - 4,80 (m, 4H), thymin-CH₃: 1,70 (široký s, 6H).

Příklad 31

5'-MMTr-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE>-C^An-P(ONPE)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z triethylamoniové soli (2-(p-nitrofenyl)ethyl)monoesteru7V-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-IV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 3) a ,,5'-HO-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)2“ (příklad 6). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 19 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 66 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2155 (M+H)⁺, 2161 (M+Li)\ 2177 (M+Na)⁺.

-40CZ 292037 B6

Příklad 32

5'-HO-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ..S-MMTr-C^-PÍONPEj-C^-PíONPE)C^An-P(ONPE)₂“ (příklad 31). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 85 : 15 : 1 a poté 80 : 20 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 70 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1904 (M+Na)⁺.

Příklad 33

Allyl-(2-(p-nitrofenyl)ethyl)diester A-(7V⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kysel iny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z triethylamoniové soli (2-(p-nitrofenyl)ethyl)monoesteru A-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-7V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 3) a allylalkoholu. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 95 : 5 : 1 jako elučního činidla.

Hmotová spektrometrie (ES+): 902,1 (M+H)⁺, 924,1 (M+Na)*.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,94 - 3,70 (m, 8H, P-O-CH,-CH₂-Ar + MMTr-O-CH_? + N-CH, + P-CHA 3,75 (s, 3H, OCH₃), 3,86 (s,3H, OCH₃), 4,10- 4,60 (m, 4H, P-O-CH₂), 4,79 a 4,84 (vždy široký s, 2H, CO-CH₂), 5,09 - 5,39 (m, 2H, H^CH-), 5,71 - 6,00 (m, 1H, H₂C=CH-), 6,83 - 8,19 (m, 24H, Ar-H, cytosinyl-H), 11,03 (široký s, 1H, NH).

Příklad 34

Allyl-(2-(p-nitrofenyl)ethyl)diester.N-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-V-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z allyl-(2-(p-nitrofenyl)ethyl)diesteru N-ýN⁶anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 33). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 94 : 5 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 83 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 630,2 (M+H)⁺.

‘H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 3,02 (t, 2H, P-O-CH₂CH?—Ar). 3,37 - 3,72 (m, 4H, HO-CHr-CH,). 3,86 (s, 3H, OCH₃), 3,91 (d, J = 11 Hz, 2H, P-CH?). 4,22 (dt, 2H, P-O-CH,-CH,-Ar). 4,40 (dd, 2H, O-CH,=CH-CH,). 4,78 a 5,01 (m,2H, CO-CH₂), 5,11- 5,33 (m, 2H, H₂C=CH-). 5,71 - 6,00 (m, 1H, H₂C=CH-), 6,99 - 8,21 (m, 14H, Ar-H, cytosinyl-H), 11,03 (široký s, 1H, NH).

-41 CZ 292037 B6

Příklad 35

Allyl-(2-(p-nitrofenyl)ethyl)diester JV-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminoniethanfosfonové kyseliny (příklad 15) a allylalkoholu. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 97 : 3 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 100 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 805,3 (M+Na)⁺.

Příklad 36

Allyl-(2-(p-nitrofenyl)ethyl)diester A-thymin-l-ylacetyl-A-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z allyl-(2-(p-nitrofenyI)ethyl)diesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 35). Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 86 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 511,1 (M+H)⁺.

Příklad 37

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OAllyl)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z allyl-(2-(p-nitrofenyl)ethyI)diethylesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 36) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15). Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 90 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1257,3 (M+Na)⁺.

Příklad 38

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE>-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2“ (příklad 28) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15). Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 :20 :2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 57 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2460 (M+H)⁺, 2482 (M+Na)⁺.

-42CZ 292037 B6

Příklad 39

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2“ (příklad 38). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 70 : 30 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 55 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2209 (M+Na)⁺.

Příklad 40

5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)₂

4,0 mg (0,00183 mmol) ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 39) se rozpustí v 1,1 ml 0,5M roztoku l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu (DBU) v pyridinu a směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Reakční směs se odpaří ve vakuu a zbytek se opakovaně míchá s toluenem. Rozpouštědlo se odsaje stříkačkou, zbytek se ještě jednou rozmíchá s pentanem a rozpouštědlo se znovu odsaje stříkačkou. Produkt se vysuší ve vakuu. Výtěžek činí 4 mg silně hygroskopického prášku.

Hmotová spektrometrie (ES-): 1589,7 (M-H“)~, 1611,8 (M+Na-2H)~.

Příklad 41

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

a) Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 39) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-A’-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 20 : 2 a poté 70 : 30 : 2 jako elučního činidla.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2934 (M+Na)⁺, 2957 (M+2Na-H)⁺, 2978 (M+3Na-2H)⁺.

b) Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 28) a ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)“ (příklad 42). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 20 : 2 a poté 70 : 30 : 2 jako elučního činidla. Cílová frakce se odpaří ve vakuu a poté se rozetře s pentanem a etherem.

Hmotová spektrometrie: viz výše.

Příklad 42

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)

24,7 mg (0,02 mmol) ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-(OAllyl)“ (příklad 37) se spolu s 16,2 mg (0,12 mmol) diethylamoniumhydrogenkarbonátu rozpouští ve 2 ml absolutního

-43 CZ 292037 B6 dichlormethanu. Při teplotě 15 - 20 °C se v průběhu 2 minut přikape roztok 13,9 mg (0,012 mmol) tetrakis(trifenylfosfín)palladia a 2,1 mg (0,008 mmol) trifenylfosfinu ve 2 ml absolutního dichlormethanu. Směs se míchá po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 20 : 1 a poté 60 : 40 : 1 jako elučního Činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří ve vakuu, zbytek se rozetře s pentanem, poté se směsí ethylacetátu a etheru a poté opět s pentanem a vysuší se ve vakuu. Výtěžek činí 57 %.

Hmotová spektrometrie (ES-): 1193,6 (M-H)l· ’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): charakteristické signály: hodnoty δ:

1,67 a 1,72 (vždy s, 3H, T-CH₃), 4,60 a 4,82 (vždy s, 2H, CO-CHA 6,83 - 8,19 (m, 24H, Ar-H, T-H).

Příklad 43

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z „5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt₂)“ (příklad 41). Po proběhnutí reakce se reakční směs zahustí, zbytek se třikrát odpaří společně s toluenem, poté se rozmíchá nejprve se směsí ethylacetátu a etheru a pak s pentanem. Zbytek se vysuší ve vakuu.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2662 (M+Na)⁺.

Příklad 44

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OAllyl)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OAllyl)“ (příklad 37). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10 : 1 a poté 80 : 20 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 87 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 963,0 (M+H)⁺, 985,1 (M+Na)’.

Příklad 45

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)

a) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OAllyl)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OAllyl)“ (příklad 44) a triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru V-thymin-l-ylacetyl-N-(4methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15). Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10 : 1 a poté 85 : 15 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 55 %.

b) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH).

-44CZ 292037 B6 ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OAllyl)“ (příklad 45a) se podrobí reakci s tetrakis(trifenylfosfm)palladiem jako je popsáno v příkladu 42. Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru : 20 : 2 a poté 70 : 30 : 2 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří ve vakuu a zbytek se rozetře s pentanem a etherem. Výtěžek činí 98 %.

Hmotová spektrometrie (Es+, LiCl): 1654,1 (M+Li⁺).

Příklad 46

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z diethylesteru V-thymin-l-ylacetyl-N-(2hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 10) a ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)“ (příklad 45b). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10:2a poté 80 : 20 : 2 jako elučního činidla. Zpracování, vyčištění a charakterizace je jako v příkladu 27.

Příklad 47

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z „5-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 26) a ,,5'-MTTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)“ (příklad 45b). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 20 : 2 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří ve vakuu, odpaří se spolu s toluenem a vyčistí se pomocí preparativní vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na RP8 LiChrospher 60 za použití směsi vody a acetonitrilu v poměru 1 : 1 s 0,1 % octanu amonného jako elučního činidla, s průtokem 1 ml / minutu.

Rf = 12,97 minut.

Příklad 48

5'-HO-T-P(OH>-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)₂

a) 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 47). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 70 : 30 : 2 a poté 60:40: 2 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří ve vakuu, zbytek se rozetře nejprve s pentanem a poté s etherem a vysuší se ve vakuu. Výtěžek činí 100 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2662 (M+Na)⁺, 2684 (M+2Na-H)⁺, 2706 (M+3Na-2H)⁺.

b) 5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)₂

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂ (příklad 48a) se analogicky jako v příkladu 40 podrobí reakci s l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7enem (DBU) a zpracuje.

Hmotová spektrometrie (ES-): 1892 (M-H)~, 1915 (M+Na-2H)“.

-45CZ 292037 B6

Příklad 49

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 28) a ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)“ (příklad 45b). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80: 20 : 2 a poté 70 : 30: 2 jako elučniho činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří ve vakuu, odpaří se spolu s toluenem a vyčistí se pomocí preparativní vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na RP8 LiChrospher 60 za použití směsi vody a acetonitrilu v poměru 1 : 1 s 0,1 % octanu amonného jako elučniho činidla, s průtokem 1 ml / minutu.

Rf= 15,24 minut.

Hmotové spektrometrie (FAB): 3386 (M+Na)⁺, 3409 (M+2Na-H)⁺.

Příklad 50

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 49). Pro vyčištění se provede odpaření ve vakuu, třikrát společné odpaření s toluenem, zbytek se rozetře nejprve s pentanem a poté se etherem a vysuší se ve vakuu. Výtěžek činí více než 90 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 3114 (M+Na)⁺.

Příklad 51

5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T—P(OH)-T-P(OEt)₂

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂ (příklad 50) se analogicky jako v příkladu 40 podrobí reakci s 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enem (DBU) a zpracuje.

Hmotová spektrometrie (ES—): 2196 (M-H), 2218 (M+Na-2H)~.

Příklad 52

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 48a) a ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)“ (příklad 45b). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 70 : 30 : 2 a poté 60 : 40 : 2

-46CZ 292037 B6 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří ve vakuu, odpaří se spolu s toluenem a vyčistí se pomocí preparativní vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na RP8

LiChrospher 60 za použití směsi vody a acetonitrilu v poměru 1 : 1 s 0,1 % octanu amonného jako elučního Činidla, s průtokem 1 ml /minutu.

Rf = 23,95 minut.

Příklad 53

5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-TP(OEt)₂

a) 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-TP(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE}-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂“ (příklad 52). Pro vyčištění se provede odpaření ve vakuu, třikrát společné odpaření s toluenem, zbytek se rozetře nejprve s pentanem a poté s etherem a vysuší se ve vakuu. Výtěžek činí více než 90 %.

b) 5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2

5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2 (příklad 53a) se analogicky jako v příkladu 40 podrobí reakci s l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enem (DBU) a zpracuje.

Hmotová spektrometrie (ES-): 2802 (M-H)“, 2825 (M+Na-2H)“.

Příklad 54 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester 2-(V-terc-butyloxykarbonylamino)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

a) l-methylamino-2-(/V'-fórc-butyloxykarbonylamino)ethan (trimer)

Ke 2,0 g (12,5 mmol) 2-amino-l-(/V’-terc-butyloxykarbonylamino)ethanu, rozpuštěným v 8 ml methanolu se za chlazení ledem přidá 1,52 ml (18,72 mmol) 37% formaldehydu a směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Zbytek se vyjme ethylacetátem, dvakrát se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a poté roztokem chloridu sodného, vysuší se, zfiltruje a odpaří ve vakuu. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a triethylaminu v poměru 100 : 0,2 a poté směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 90 : 10 : 0,2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 0,8 g.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 523,4 (M+2Li-H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,38 (s, 27H, terc.Bu-H), 2,40 (t, 6H, N-CH₂), 2,99 (t, 6H, N-CH₂), 3,25 (t, 6H, N-CH₂), 6,81 (široký s, 3H, NH).

b) di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester 2-(7V'-/erc-butyloxykarbonylamino)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

-47CZ 292037 B6 l-methylimino-2-(7V-/erc-butyloxykarbonylamino)ethan (trimer) (příklad 54a) se analogicky jako v příkladu lf podrobí reakci s di(2-(4-nitrofenyl)ethyl)fosfitem (příklad le). Vyčištění se provede chromatografícký na silikagelu za použití nejprve směsi toluenu, ethylacetátu a triethylaminu v poměru 20 : 80 : 0,2, poté směsi ethylacetátu a triethylaminu v poměru 100 : 0,2 a poté směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 0,5 : 5 : 0,2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 25 %.

Hmotová spektrometrie (ES+/L1C1): 553,3 (M+H)⁺, 559,3 (M+Li)⁺.

*H-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,37 (s, 9H. terc.Bu-H), 2,83 (d, J = 12 Hz, 2H, P-CH₂), 2,55 (t, 4H, Ar-CH₂), 2,90 - 3,09 (m, 4H, N-CH₂-CH₂-N), 4,16 (dt, 4H, PO-CH₂), 7,52 a 8,15 (vždy d, 8H, Ar-H).

Příklad 55 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester V-thymin-l-ylacetyl-V-(2-7V'-rerc-butyloxykarbonylamino)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 8 z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru 2-(V-tercbutyloxykarbonylamino)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 54b) a tymidin-l-yloctové kyseliny. Výtěžek činí 86 %.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 725,3 (M+Li)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 1,42 (s, 9H, terc.Bu-H), 1,91 (s, 3H, T-CHj), 2,99- 3,58 (m, 8H, P-O-CH,-€H₇-Ar a N-CHr-CHr-N), 3,75 (d, J = 12 Hz, 2H, P-CH₂), 4,06 - 4,38 (m, 4H, PO-CH₂), 7,37 a 8,15 (vždy d, 8H, Ar-H).

Příklad 56

Interakce s DNA: Křivka teplotní denaturace měřená UV-světlem

Interakce sloučenin podle vynálezu s komplementárními nukleovými kyselinami se demonstruje například sestrojením křivky teplotní denaturace měřené UV-světlem pro „5'-HO-T-P(OH)-TP(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)₂“ (příklad 53b) s (dÁ)₉. Ktomu se připraví roztoky vždy 0,3 OD ,,5'-HO-T-P(OH}-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)₂“ a (dA)₉ v 1 ml pufru (1 M chloridu sodného, 20 mM chloridu hořečnatého, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-ethansulfonová kyselina), pH 7,5) a zaznamenává se změna extinkce při 260 nm v závislosti na teplotě (od teploty 0 °C do vyznačené teploty). Výsledek je znázorněn na obrázku 1. Ze získané křivky teplotní denaturace se stanoví hodnota poloviční teploty denaturace (T_m) přibližně 23 °C.

Příklad 57

Interakce s DNA: Experiment pohyblivosti v gelu

Interakce sloučenin podle vynálezu s komplementárními nukleovými kyselinami se demonstruje například hybridizací ,,5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)₂“ (příklad 53b) s (dA)₉ v experimentu pohyblivosti v gelu. Přitom se na nedenaturovaný polyakrylamidový gel (20%, pufr sloužící pro pohyb: lx TBE, 10 mM

-48CZ 292037 B6 chlorid hořečnatý) nanese ,,5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2“ (příklad 53b) a (dA)₉ vždy samotné a ve směsi v poměru 1 : 1, 1 : 2, 1 : 5 a 1 : 10, a sleduje se pohyblivost. Výsledek je znázorněn na obrázku 2: (dA)₉ se pohybuje rychleji než ,,5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2“, ve směsi v poměru 1 : 1 jsou obě tyto látky ještě slabě patrné, přičemž vzniká pomalejší pás, který odpovídá komplexu obou těchto komponent. Ve směsi v poměru 2 : 1 již není patrný pás (dA)₉, přičemž nový pás je tím zřetelnější. Totéž platí pro směsi v poměru 5: 1 popřípadě 10 : 1, ve kterých lze navíc rozeznat zřetelný přebytek ,,5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-TP(OEt)₂“.

Příklad 58

5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEthyl)2 (viz rovněž příklad 21, alternativní syntézy)

a) 8,44 mg (10 pmol) triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-A-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 15), 3,77 mg (10 pmol) V-thymin-l-ylacetyl-n-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 10) a 64,6 mg (500 pmol) A-ethyldiizopropylaminu (DIPEA) se rozpustí v 0,3 ml absolutního 7V,7V-dimethylformamidu. Přidá se 44,2 mg (100 pmol) benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)fosfonium-hexafluorfosfátu (BOP). Směs se míchá po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Po chromatografii na tenké vrstvě za použití směsi ethylacetátu. methanolu a triethylaminu v poměru 100 : 20 : 2 jako elučního činidla (Rf= 0,5) činí výtěžek přibližně 70 %.

b) Postupuje se analogicky jako v příkladu 58a, ale s 30 pmol HATU (O-(7-azabenzotriazoll-yl)-V,V,V'V-tetramethyluronium-hexafluorfosfátu) místo 100 pmol BOP. Po chromatografii na tenké vrstvě činí výtěžek přibližně 65 %.

Příklad 59 [2-(p-nitrofenyl)ethyl]-[5'-(3'-levuloylthymidin]diester A^r-thymin-l-ylacetyl-N-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z triethylamoniové soli (4-nitrofenylethyl)monoesteru A-thymin-l-ylacetyl-7V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfbsfbnové kyseliny (příklad 15) a 3'-levuloylthymidinu. Vyčištění se provede chromatografícky na silikagelu za použití směsi dichlormethanu, methanolu a triethylaminu v poměru 98 : 2 : 0,25 jako elučního činidla. Výtěžek činí 46 %.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 1071,4 (M+Li)⁺.

Příklad 60 [2-(p-nitrofenyl)ethyl]-[5'-thymidin]diester V-thymin-l-ylacetyl-V-(4-methoxjtrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny mg (0,06 mmol) [2-(p-nitrofenyl)ethyl]-[5'-(3'-levuloylthymidin]diesteru AMhymin-l-ylacetyl-A^L(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 59) se rozpustí v 0,5 ml dioxanu. Přidá se 9 mg (0,23 mmol) natriumborohydridu v 0,12 ml vody a směs se míchá po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, zbytek se vyjme dichlormethanem, extrahuje se vodou a vysuší. Vyčištění se provede chromatografícky na

-49CZ 292037 B6 silikagelu za použití směsi dichlormethanu, methanolu a triethylaminu v poměru 98 : 2 : 0,5 jako elučního činidla. Výtěžek činí 72 %.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 973,4 (M+Li)“, 979,4 (M+2Li-H)⁺, 985,4 (M+3Li-2H)⁺.

Příklad 61 [2-(p-nitrofenyl)ethyl]-[5'-thymidin-(3'-(kyanethyl-W-diizopropylfosforamidit]diester V-thymin-l-ylacetyl-N-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny mg (0,032 mmol) [2-(p-nitrofenyl)ethyl]-[5'-thymidin]diesteru N-thymin-l-ylacetyl-V-)4methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 60) se dvakrát odpaří společně s acetonitrilem a poté se rozpustí v 0,4 ml absolutního tetrahydrofuranu. Přidá se nejprve 12,4 mg (0,096 mmol) diizopropylethylaminu a poté 9,8 mg (0,045 mmol) kyanethylchlordiizopropylfosforamiditu. Směs se míchá po dobu 3 hodin, zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Výtěžek činí 63 %.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 1173,34 (M+Li)⁺, 1180,4 (M+2Li-H)⁺, 1186,4 (M+3Li2H)⁺.

Příklad 62 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester yV-[7V⁶-O⁶-difenylkarbamoyl-?/²-acetylguanin]acetyl-7V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 2 z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad lf) a ČA-difenylkarbamoylV²-acetylguaninoctové kyseliny. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a triethylaminu v poměru 98 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 87 %.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 1154,8 (M+H)⁺, 1160,7 (M+Li)⁺.

Příklad 63 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester V-[7V⁹-(7V⁴-anizoyladenin]acetyl-V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 2 z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad lf) a //-anizoyladěninoctové kyseliny. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi dichlormethanu, methanolu a triethylaminu v poměru 95 : 4 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 82 %.

Hmotová spektrometrie (ES+): 1035,7 (M+H)⁺.

’Η-NMR (200 MHz, dimethylsulfoxid, tetramethylsilan): hodnoty δ: 2,93 (t, 4H, P-O-CH₂CHj-Ar), 3,09 (t, 2H, MMTr-O-CHA 3,23 - 3,75 (m, 4H, P-CH, + N-CH,). 3,75 (s, 3H, OCH₃), 3,87 (s, 3H, OCH₃), 4,08 (dt, 4H, P-O-CH₂), 5,28 -5,42 (m, 2H, CO-CH₂), 6,81 - 8,20 (m, 28H, Ar-H, A-H), 11,00 (široký s, 1H, NH).

-50CZ 292037 B6

Příklad 64

Mono(2-(p-nitrofenyl)ethyl)ester V-[7V⁹-(A⁴-anizoyladenin]acetyl-V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 3 z di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esteru 7V-[7V⁹-(7V⁴-anizoyladenin]acety|-.iV-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfbnové kyseliny (příklad 63). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethvlaminu v poměru 65 : 35 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 52 %.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 874,3 (M+2Li-H)⁺.

Příklad 65 di(2-(p-nitrofenyl)ethyl)esterA’-thymin-l-ylacetyl-A^r-(2-methoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 2 z di(2-(/?-nitrofenyl)ethyl)esteru A-(2-methoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (připraveného analogicky jako v příkladu 1 vycházeje z 2-methoxyethylaminu, reakcí s formaldehydem a di(2-(4-nitrofenyl)ethyl)fosfitem) a thymidin-l-yloctové kyseliny. Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 90 : 10 jako elučního činidla. Výtěžek činí 64 %.

Hmotová spektrometrie (FAB/LiCl): 640,3 (M+Li)⁺.

Příklad 66 δ'-ΜΜΤΓ-ϋ^-ΡίΟΝΡΕΗΑ-ΡίΟΝΡΕ) (OAllyl)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z triethylamoniové soli (2-(p-nitrofenyl)ethyl)monoesteru A^/-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-V-(4-methoxytrifenylmethoxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 3) a allyl-(2-(p-nitrofenyl)ethyl)diesteru A-(A⁶-anizoyl)cytosin-l-ylacetyl-V-(2-hydroxy)ethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 34). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 85 :14:1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 36 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1474 (M+H)⁺, 1496 (M+Na)⁺.

Příklad 67

5'-HO-C^-P(ONPE)-C^-P(ONPE) (OAllyl)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 4 z „S-MMTr-to-P/ONPEj-C^-P/ONPE) (OAllyl)“ (příklad 66). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 19 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 55 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 1201,3 (M+H)⁺, 1223,3 (M+Na)⁺.

-51 CZ 292037 B6

Příklad 68

S^MMTr-C^-PÍONPEy-C^-PÍONPEj-C^-PCONPE) (OAllyl)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z triethylamoniové soli (2-(p-nitrofenyl)ethyl)monoesteru A-ř/Ý-anizoyljcytosin-l-ylacetyl-N-^methoxytrifenylmethoxyjethylaminomethanfosfonové kyseliny (příklad 3) a „ó-HO-C^-PÍONPEj-C^-PÍONPE) (OAllyl)“ (příklad 67). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 20 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek činí 58 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2046 (M+H)⁺, 2068 (M+Na)’.

Příklad 69

5'-MMTr-C^An-P(ONPE)-C^AMXONPE)--C^An-P(ONPE) (OH)

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 42 z „S-MMTr-C^-PÍONPEj-C^-PíONPE}C^-PíONPE) (OAllyl)“ (příklad 68). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 60 : 38 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 66 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 2027 (M+Na)⁺, 2049 (M+2Na-H)⁺.

Příklad 70

5'-MMTr-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^Ari-P(ONPE)-C^A<:-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-MMTr-C^Ar-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)C^-PÍONPE) (OH)“ (příklad 69) a „5'-HO-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂“ (příklad 32). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 70 : 30 : 2 jako elučního činidla. Výtěžek činí 58 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 3892 (M+Na)⁺, 3914 (M+2Na-H)⁺.

Příklad 71

5'-MMTr-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE>-C^An-P(ONPE)-C^A-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OH)“ (příklad 45) a ,,5'-HO-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂“ (příklad 32). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 60 : 40 : 2 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří ve vakuu a vyčistí se pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na RP8 LichrospheróO za použití směsi vody a acetonitrilu v poměru 1 : 1 s 0,1 % octanu amonného jako elučního činidla, s průtokem 1 ml / minutu.

Rf = 16,6 minutu.

Hmotová spektrometrie (FAB): 3534 (M+Na)⁺, 3556 (M+2Na-H)⁺.

-52CZ 292037 B6

Příklad 72

5'-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-C^An-P(OH>-C^An-P(OH)-C^An-P(OH)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 40 ze 2 mg ,,5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂“ (příklad 71).

Hmotová spektrometrie (ES-): 2466,4 (M-H).

Příklad 73

5'-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)₂

K přibližně 1 mg „S^MMTr-T-PíOHj-T-PíOHj-T-PÍOHj-C^-PíOHj-C^-PÍOHj-C^-P(OH)₂“ (příklad 72) se přidají 3 ml 33% vodného hydroxidu amonného a směs se míchá po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se odpaří ve vakuu. Výtěžek činí přibližně 0,6 mg (OD 19).

Hmotová spektrometrie (ES-): 206,5 (M-H)\

Příklad 74

5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)₂

OD ,,5'-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH}-C-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)₂“ (příklad 73) se rozpustí v 0,5 ml vody a nanese se na PolyPak (Glen Research, č. 60-1100-10). MMTr-skupina se odštěpí podle pokynů výrobce (Glen Research User Guide). Výtěžek činí přibližně 0,35 mg (11 OD).

Hmotová spektrometrie (ES—): 1792,6 (M-H).

Příklad 75

5'-MMTr-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE}-C^Ac-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)-C^An-P(ONPE)₂

Syntéza se provádí analogicky jako v příkladu 17 z ,,5'-MMTr-C^AM^>(ONPE)-C^An-P(ONPE)C^-PÍONPE) (OH)“ (příklad 69) a „5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE>-T-P(OEt)₂“ (příklad 26). Vyčištění se provede chromatograficky na silikagelu za použití směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v poměru 80 : 20 : 2 a poté 70 : 30 : 2 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt se odpaří společně s toluenem, odpaří se ve vakuu a rozetře se s pentanem. Výtěžek činí 48 %.

Hmotová spektrometrie (FAB): 3744 (M+Na)⁺, 3766 (M+2Na-H)⁺.

-53CZ 292037 B6

Zobrazení sekvencí:

Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:

ACACCCAATT CTGAAAATGG 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2:

AGGTCCCTGT TCGGGCGCCA 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 28 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová)

-54CZ 292037 B6 (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..28 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:

GTCGACACCC AATTCTGAAA ATGGATAA 28

Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 25 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..25 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:

GCTATGTCGA CACCCAATTC TGAAA 25

Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 26 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..26 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:

GTCGCTGTCT CCGCTTCTTC TTCCTG 26

Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 27 párů bází

-55CZ 292037 B6 (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..27 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:

GTCTCCGCTT CTTCTTCCTG CCATAGG 27

Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:

GCGGGGCTCC ATGGGGGTCG 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 8:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..15 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:

CAGCTGCAAC CCAGC 15

-56CZ 292037 B6

Informace o sekvenci SEQ ID č. 9:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..21 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:

GGCTGCTGGA GCGGGGCAC A C 21

Informace o sekvenci SEQ ID č. 10:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..15 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:

AACGTTGAGG GGCAT 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 11:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano

-57CZ 292037 B6 (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..18 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:

CTGCCGGGGT CTTCGGGC 18

Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..21 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:

GGAGAACATC ATGGTCGAAA G 21

Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 22 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..22 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13:

CCCGAGAACA TCATGGTCGA AG 22

Informace o sekvenci SEQ ID č. 14:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová

-58CZ 292037 B6 (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 14:

GGGGAAAGCC CGGCAAGGGG 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 15:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1 ..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 15:

CACCCGCCTT GGCCTCCCAC 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 16:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1„18 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 16:

GGGACTCCGG CGCAGCGC 18

-59CZ 292037 B6

Informace o sekvenci SEQ ID č. 17:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 17:

GGCAAACTTT CTTTTCCTCC 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 18:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 19 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..19 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 18:

GGGAAGGAGG AGGATGAGG 19

Informace o sekvenci SEQ ID č. 19:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon

-60CZ 292037 B6 (B) lokace: 1..21 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 19:

GGCAGTCATC CAGCTTCGGA G 21

Informace o sekvenci SEQ ID č. 20:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (i i) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..18 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 20:

GCAGTAAGCA TCCATATC 18

Informace o sekvenci SEQ ID č. 21:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 21:

CCCCCACCAC TTCCCCTCTC 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 22:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární

-61 CZ 292037 B6 (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 22:

CTCCCCCACC ACTTCCCCTC 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 23:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1.. 19 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 23:

GCTGGGAGCC ATAGCGAGG 19

Informace o sekvenci SEQ ID č. 24:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..21 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 24:

ACTGCTGCCT CTTGTCTCAG G 21

Informace o sekvenci SEQ ID č. 25:

-62CZ 292037 B6 (i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..22 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 25:

CAATCAATGA CTTCAAGAGT TC 22

Informace o sekvenci SEQ ID č. 26:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..19 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 26:

GGTGGGTGTTCGGGCGCCA 19

Informace o sekvenci SEQ ID č. 27:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 17 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1 ..17

-63CZ 292037 B6 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 27:

GTGCCGGGGT CTTCGGG 17

Informace o sekvenci SEQ ID ě. 28:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..17 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 28:

GGAGGATGCT GAGGAGG 17

Informace o sekvenci SEQ ID č. 29:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 14 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..14 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 29:

GGAGGATGCT GAGG 14

Informace o sekvenci SEQ ID č. 30:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 19 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová)

-64CZ 292037 B6 (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1 ..19 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 30:

CAGGAGGATG CTGAGGAGG 19

Informace o sekvenci SEQ ID č. 31:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..15 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 31: GGCTGCCATG GTCCC 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 32:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) jméno/klíč: exon (B) lokace: 1..20 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 32:

TCATGGTGTC CTTTGCAGCC 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 33:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 18 párů bází

-65CZ 292037 B6 (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) druh molekuly: DNA (genomová) (iii) antisense: ano (ix) vlastnosti:

(A) j méno/kl íč: exon (B) lokace: 1 ..18 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 33:

Claims

1. Analogy oligonukleotidů obecného vzorce I (I), ve kterém n je číslo od 0 do 100, symboly B nezávisle na sobě představují vždy atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, alkoxylovou skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, alkylthioskupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku, arylalkylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylalkoxylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, arylalkylthioskupinu se 6 až 20 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aromatickou skupinu nebo heterocyklickou skupinu, přičemž alkyl, aryl nebo/a aromatická nebo heterocyklická skupina mohou být popřípadě jednou nebo vícekrát substituovány hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinou -NR⁹R¹⁰, karboxylovou skupinou, oxoskupinou, skupinou -C(O)OR⁸, C(O)NR⁹R¹⁰, kyanoskupinou, fluorem, chlorem, bromem, nitroskupinou, alkoxyalkylovou skupinou se 2 až 6 atomy uhlíku, skupinou S(O)mR⁸, skupinou -alkyl-S(O)raR⁸ s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, skupinou -NHC(=NH)NHR⁸, -C(=NH)NHR⁸, -NR⁹C(=O)R⁸, =NOR⁸, NR⁹C(=O)OR¹⁰, -OC(=O)NR⁹R¹⁰ nebo -NR⁹C(=O)NR⁹R¹⁰, nebo

-66CZ 292037 B6 symboly B představují vždy nezávisle na sobě přirozenou nukíeosidovou bází, nepřirozenou nukleosidovou bázi nebo reportérovy ligand,

A-B může rovněž znamenat přes karboxylovou skupinu vázanou D- nebo L-aminokyselinu nebo peptid tvořený těmito aminokyselinami s délkou až 5 aminokyselinových zbytků, symboly L představují vždy nezávisle na sobě atom dusíku nebo skupinu R¹^, a

R¹ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která může být substituována hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkylthioskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aminoskupinou, výhodně znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu, symboly A představují vždy nezávisle na sobě jednoduchou vazbu, methylenovou skupinu nebo /

(Ha) (lib)

Y' znamená skupinu =0, =S, =CH₂, =C(CH₃)₂ nebo =NR', kde R¹ je definováno výše,

M představuje jednoduchou vazbu, atom kyslíku, atom síry nebo skupinu -NR¹-, kde R¹ je definováno výše, symboly R² a R³ znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkylthioskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoskupinu, atom halogenu, jako fluoru, chloru či bromu, nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která může být popřípadě substituována hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alkylthioskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, výhodně však znamenají vždy atom vodíku, symboly p a g nezávisle na sobě mají hodnotu 0 až 5, symboly ras nezávisle na sobě mají hodnotu 0 až 5, symboly D a G představují vždy nezávisle na sobě skupinu CR⁵R⁶, symboly R⁵ a R⁶ znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku, arylalkylovou skupinu se 6 až 20 atomy uhlíku, v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, hydroxylovou skupinu, alkoxylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alkylthioskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž alkyl a aryl mohou být popřípadě substituovány skupinou SR¹ nebo NR'r‘ , kde

R¹ má výše definovaný význam, a

R¹ má nezávisle na R¹ stejný význam jako R¹,

-67CZ 292037 B6

Y znamená skupinu =0 nebo =S,

R⁸ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu se 2 až 18 atomy uhlíku, alkinylovou skupinu se 3 až 18 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku nebo arylalkylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž alky l může být jednou nebo vícekrát substituován hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem nebo bromem a aryl může být jednou až třikrát substituován hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem, bromem, nitroskupinou, skupinou -NR⁹R¹⁰, karboxylovou skupinou, skupinou -C(O)O-alkyl obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku nebo skupinou -C(O)NR⁹R¹⁰, výhodně však znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku nebo arylalkylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž aryl může být jednou substituován alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem, bromem nebo nitroskupinou, a zvláště výhodně znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo 2-(4-nitrofenyl)ethylovou skupinu, symboly R⁹ a R¹⁰ představují vždy nezávisle na sobě atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, alkinylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku, arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku nebo arylalkylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž alkyl může být jednou nebo vícekrát substituován hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, fluorem, chlorem nebo bromem, nebo mohou symboly R⁹ a R¹⁰ společně s atomem dusíku, který je nese, tvořit čtyř- až sedmičlenný kruh, symboly Q a Q' znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupinu R⁸, konjugáty, které příznivě ovlivňují vlastnosti antisense-oligonukleotidů nebo oligonukleotidů tvořících trojšroubovici nebo slouží jako značení DNA-sondy nebo při hybridizaci analogu oligonukleotidu na cílovou nukleovou kyselinu tuto napadají za vzniku vazby nebo příčného zesítění, nebo znamenají oligonukleotidy, které mohou být nemodifikované nebo modifikované, stím, že alespoň dva ze symbolů B přítomné ve sloučenině obecného vzorce I představují přirozenou nebo nepřirozenou nukleosidovou bázi, nebo alespoň jeden ze symbolů Q a Q' znamená oligonukleotid.

2. Analogy podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém n je číslo od 0 do 50, symboly B nezávisle na sobě představují vždy přirozenou nukleosidovou bázi nebo nepřirozenou nukleosidovou bázi,

L znamená atom dusíku,

-68CZ 292037 B6

Y' znamená skupinu =0, a

M představuj e j ednoduchou vazbu, symboly D a G představují vždy nezávisle na sobě skupinu CHR⁵,

R⁵ znamená atom vodíku,

X představuje atom kyslíku,

Y znamená skupinu =0,

a) 3'- nebo/a 5'-diesterové můstky fosforečné kyseliny jsou zcela nebo zčásti nahrazeny fosforothioátovými můstky, fosforodithioátovými můstky, NR⁴R⁴-fosforamidátovými můstky, N3'->P5'-fosforamidátovými můstky (například popsanými v Gryaznov a kol., J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 3143), fosfát-O-methylesterovými můstky, fosfát-O-ethylesterovými můstky, fosfát-O-izopropylesterovými můstky, methylfosfonátovými můstky nebo fenylfosfonátovými můstky,

d) P-D-2'-desoxyribózové jednotky jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 2'-F-2'-desoxyribózou, 2'-0-alkylribózou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 2'-O-alkenylribózou se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části nebo 2'-NH2-2'-desoxyribózou,

e) přirozené nukleosidové báze jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 5-alkyluracilem s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 5-alkylcytosinem s 1 až

6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 5-fluoruracilem, 5-fluorcytosinem, 5-chloruracilem, 5-chlorcytosinem, 5-bromuracilem, 5-bromcytosinem, 7-deaza-7-a!kinylguaninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkinyladeninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkenylguaninem se 2 až

7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkenyladeninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkylguaninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části,

-69CZ 292037 B6

7-deaza-7-alkyladeninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-bromguaninem nebo 7-deaza-7-bromadeninem.

3. Analogy podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I, ve kterém n je číslo od 0 do 30, symboly Q a Q' znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku, skupinu R⁸, kde

R⁸ představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo 2-(4-nitrofenylethylovou) skupinu, nebo Q a Q' znamenají oligonukleotidy, které mohou být nemodifikované nebo modifikované, přičemž

d) (3-D-2'-desoxyribózové jednotky jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 2'-F-2'-desoxyribózou, 2'-O-alkylribózou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, 2'-O-alkenylribózou se 2 až 4 atomy uhlíku v alkenylové části nebo 2'-NH₂-2'-desoxyribózou,

e) přirozené nukleosidové báze jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 5-alkyluracilem se 3 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinyluracilem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 5-alkylcytosinem s 1 až

6 atomy uhlíku v alkylové části, 5-alkenylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, 5-alkinylcytosinem se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkinylguaninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkinyladeninem se 2 až

7 atomy uhlíku v alkinylové části, 7-deaza-7-alkenylguaninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkenyladeninem se 2 až 7 atomy uhlíku v alkenylové části, 7-deaza-7-alkylguaninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-alkyladeninem s 1 až 7 atomy uhlíku v alkylové části, 7-deaza-7-bromguaninem nebo 7-deaza-7-bromadeninem.

4. Analogy podle nároků 1 až 3 obecného vzorce I, ve kterém n je číslo od 0 do 25, symboly B představují vždy nezávisle na sobě přirozenou nukleosidovou bázi,

Z znamená hydroxylovou skupinu, ethoxylovou skupinu, (4-nitrofenyl)ethoxylovou skupinu nebo fenoxyskupinu, symboly Q a Q' znamenají vždy nezávisle na sobě atom vodíku, skupinu R⁸, kde

-70CZ 292037 B6 nebo oligonukleotidy, které mohou být nemodifikované nebo modifikované, přičemž

d) P-D-2'-desoxyribózové jednotky jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 2'-O-methyl-, 2'—O—ally 1— nebo 2'-O-butylribózou,

e) přirozené nukleosidové báze jsou zcela nebo zčásti nahrazeny 5-hexinylcytosinem, 5-hexinyluracilem, 5-hexinylcytosinem, 7-deaza-7-propinvlguaninem, 7-deaza-7-propinyladeninem, 7-deaza-7-methylguaninem, 7-deaza-7-methyladeninem, deaza-7-bromguaninem nebo 7-deaza-7-bromadeninem.

5. Způsob výroby analogů obecného vzorce I podle nároků laž4, vyznačující se tím, že se ai) sloučeniny obecného vzorce ΠΙ ve kterém symboly D, G, L a X mají význam definovaný v nárocích 1 až 4 a

S¹ představuje vhodnou chránící skupinu, jako například dimethoxytritylovou, monomethoxytritylovou, tritylovou, pixylovou, /erc-butyloxykarbonylovou nebo fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinu, podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce IV

O (IV), ve kterém symboly R⁵ a R⁶ mají význam definovaný v nárocích 1 až 4, ve vhodném organickém rozpouštědle, při teplotách od 0 °C do 100 °C, za vzniku sloučenin obecného vzorce Va nebo Vb

-71 CZ 292037 B6 bi) sloučeniny obecného vzorce Va nebo Vb se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce Via nebo VIb (Via) (VIb), ve kterých

Y má význam definovaný v nárocích 1 až 4, symboly X' a X mají vždy nezávisle na sobě význam definovaný pro symbol X, symboly S² a S³ představují nezávisle na sobě chránící skupiny, a

L¹ znamená odštěpitelnou skupinu, ve vhodném organickém rozpouštědle, při teplotách od 0 °C do 100 °C, popřípadě za přidání bází, komplexních bází nebo paralkylovaných polyamino-fosfátových bází bez náboje, za vzniku sloučenin obecného vzorce VII

Y (VII), ve kterém mají symboly D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y význam definovaný v nárocích 1 až 4,

Ci) sloučeniny obecného vzorce VII se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce VIII (VIII),

-72CZ 292037 B6 ve kterém

A má význam definovaný v nárocích 1 až 4,

B^pr má stejný význam jako symbol B, popřípadě je však v chráněné formě, a

L² znamená odštěpitelnou skupinu, nebo v případě že A představuje skupinu obecného vzorce lib může rovněž znamenat hydroxylovou skupinu, ve vhodném organickém rozpouštědle, při teplotách od -20 °C do 100 °C, popřípadě za přidání bází, komplexních bází nebo peralkylovaných polyamino-fosfátových bází bez náboje, nebo bez přidání báze, a za přidání kopulačního činidla obvyklého pro spojování peptidických vazeb, za vzniku sloučenin obecného vzorce IX ve kterém symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, di) ze sloučenin obecného vzorce IX se odštěpí chránící skupina S³, za získání sloučenin obecného vzorce X (X), ve kterém symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X' a X a Y mají výše definovaný význam, ei) ze sloučenin obecného vzorce IX se odštěpí chránící skupina S¹, za získání sloučenin obecného vzorce XI (XI), ve kterém symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam,

-73CZ 292037 B6 fi) sloučeniny obecného vzorce XI se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce X „fosfortriesterovým způsobem“ známým z chemie oligonukleotidů ve vhodném organickém rozpouštědle, při teplotách od -20 °C do 100 °C, za přidání kopulačního činidla nebo sloučeniny obecného vzorce XII

O kde

R¹⁵ představuje arylovou skupinu se 6 až 12 atomy uhlíku, popřípadě jednou až čtyřikrát substituovanou alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, nitroskupinou, chlorem nebo bromem, a přičemž popřípadě jsou jeden až tři atomy uhlíku nahrazeny heteroatomy, a

R¹⁶ znamená odštěpitelnou skupinu, popřípadě za přidání katalyzátoru, přičemž příprava kopulačního činidla může probíhat in šitu, nebo může probíhat rovněž odděleně a může se přidávat roztok aktivované sloučeniny ve vhodném rozpouštědle, za vzniku sloučenin obecného vzorce XIII (XIII),

S kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, gi) vycházeje ze sloučenin obecného vzorce XIII se opakují stupně ej) a fi) až do požadované délky řetězce, za vzniku sloučenin obecného vzorce XIV — —1 n kde (XIV) symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, a n má význam definovaný v nárocích 1 až 4,

h]) chránící skupiny S¹, S² a S³ a chránící skupiny na B^PR se odštěpí

-74CZ 292037 B6 a popřípadě se zavedou skupiny Q a Q' a popřípadě se získané sloučeniny cyklizují, za vzniku sloučenin obecného vzorce I.

6. Způsob výroby analogů obecného vzorce I podle nároků 1 až 4, ve kterých n má hodnotu 1 až 100, vyznačující se tím, že se použijí sloučeniny obecných vzorců XV a XVI (XV) ve kterých symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X a Y mají výše definovaný význam definovaný v nárocích 1 až 4, symboly o a p nezávisle na sobě mají hodnotu 0 až 50, a o + g + 1 = n, a₂) ve sloučeninách obecného vzorce XV se odštěpí chránící skupina S¹ jak je popsáno v nároku 5 v bodě e0, b₂) ve sloučeninách obecného vzorce XVI se odštěpí chránící skupina S³ jak je popsáno v nároku 5 v bodě di), c₂) vzniknuvší sloučeniny se navzájem spojí jak je popsáno v nároku 5 v bodě fi), za vzniku sloučenin obecného vzorce XIV

-75CZ 292037 B6

X

R⁵ R (XIV) symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X', X, Yan mají výše definovaný význam, d2) a tyto sloučeniny se přemění na sloučeniny obecného vzorce I jak je popsáno v nároku 5 v bodě hj).

7. Způsob výroby analogů obecného vzorce I podle nároků laž4, vyznačující se tím, že se a₃) sloučeniny obecného vzorce X symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X', X a Y mají význam definovaný v nárocích 1 až 4, navážou přes spojovací skupinu na pevný nosič, za vzniku sloučenin obecného vzorce XVII (XVII), kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X', X a Y mají výše definovaný význam,

SS představuje pevný nosič vhodný pro syntézu na pevné fázi, a

SPACER znamená skupinu odštěpitelnou po provedení syntéze od nosiče, jak jsou odborníkovi známé, nebo SPACER znamená bisfunkční konjugátovou molekulu Q, která je přes známou odštěpitelnou skupinu navázána na pevný nosič,

-76CZ 292037 B6 bj) ze sloučenin obecného vzorce XVII (XVII), kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², SS, SPACER, X, X', X a Y mají výše definovaný význam, se odštěpí chránící skupina S¹, jak je popsáno v nároku 5 v bodě e₍),

C3) výsledná sloučenina se podrobí reakci se sloučeninami obecného vzorce X kde symboly A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², X, X', X a Y mají výše definovaný význam, jak je popsáno v nároku 5 v bodě fi), d₃) stupně b₃) a C3) se opakují až do požadované délky řetězce,

63) popřípadě se navážou konjugáty Q' a f₃) takto vyrobené sloučeniny se odštěpí od pevného nosiče, a chránící skupiny se odštěpí jak je popsáno ve stupni hi), přičemž odštěpování chránících skupin se může provádět rovněž před odštěpením od nosiče, a popřípadě se připojí konjugáty Q, přičemž pořadí napojování Q a Q' ve stupních e₃) a f₃) lze rovněž změnit, a získané sloučeniny se popřípadě cyklizují.

8. Analogy obecného vzorce I podle nároků 1 až 4 pro použití jako inhibitory exprese genů.

9. Analogy obecného vzorce I podle nároků 1 až 4 pro použití jako diagnostická činidla, pro léčení onemocnění, která jsou způsobovaná viry, která jsou ovlivněna integriny nebo adhezními receptory buňka-buňka, nebo která jsou způsobena faktory jako je TNF-alfa, nebo pro léčení rakoviny nebo restenózy.

10. Analog nukleotidu jednoho z následujících obecných vzorců

5'-OLIGO-PMENA

5-PMENA-OLIGO

5'-OLIGO-PMENA-OLIGO

5'-OLIGO-(PMENA-OLIGO)_a

-77CZ 292037 B6

5-PMENA-OLIGO-PMENA, nebo

5'-PMENA-(OLIGO-PMENA)_a ve kterých a má hodnotu 1 až 20,

OLIGO představuje popřípadě modifikovaný oligonukleotid, a ίο PMENA znamená sloučeninu obecného vzorce I podle nároků 1 až 4, kde symboly Q a Q' znamenají vždy atom vodíku.