PL184920B1

PL184920B1 - Nowe analogi oligonukleotydówĆ sposób ich wytwarzania i środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL184920B1
Application number: PL96313207A
Authority: PL
Inventors: Peyman┴Anuschirwan; Uhlmann┴Eugen; Breipohl┴Gerhard; Wallmeier┴Holger
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1995-03-13
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 2003-01-31
Also published as: UA44253C2; HUP9600647A3; JP3917680B2; NO961006L; NO328646B1; CA2171589C; CZ292037B6; CN1060781C; ES2165446T3; EP0739898A2; BR9600993A; CZ74396A3; US5874553A; PT739898E; JPH08259579A; NO961006D0; NZ286150A; IL117423A; EP0739898A3; KR100434213B1

Abstract

1. Nowe analogi oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w który m n oznacza liczbe od 0 do 100; B niezaleznie oznaczaja atom wodoru, hydroksyl, C1 -C2 0 -alkil, C1-C20alkoksyl, grupe C1 -C20 alkilotio, C6 -C2 0 -aryl , C6 -C2 0 -arylo-C1 -C6 -alkil, C6-C2 0 -arylo-C1-C 6- alkoksyl, grupe C 6-C2 0 -arylo-C1-C6 -alkilotio, przy czym alkil i/lub aryl moga byc w kazdym przypadku podstawione jednym lub wiek- sza liczba podstawników wybranych z grupy obejmuja ce j hydroksyl, C 1 -C4 -alkoksyl, -NR9 R1 0 , -C(O)OH, grupe okso, -C(O)OR8 , -C(O ) NR9R1 0 , -CN, -F, -Cl, -Br, -NO2 , C 2 - C6 -alkoksyalkil, -S(O)m R 8 , -C1 - C 6 alkilo-S(O)mR8 , -NHC(=NH)NHR8 , -C(=NH)NHR8 , -NR9C(=O)R8 , =NOR3 , -NR9C(=O)OR1 0 , -OC(=O)NR9R10 i -NR9C(=O)NR9R1 0 , wzglednie B niezaleznie oznaczaja ugrupo- wanie adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy, przy czym A-B moga takze oznaczac przylaczone poprzez karboksyl ugrupowanie D-glicyny, D-alaniny, D-waliny, D-leucyny, D-izoleucyny, D-fenyloalaniny, D-proliny, D-seryny, D-treoniny, D-cysteiny, D-metioniny, D-tryptofanu, D-tyrozyny, D-asparaginy, D-glutaminy, kwasu D-asparaginowego, kwasu D- glutaminowego, D-lizyny, D-argininy, D-histydyny, L-glicyny, L-alaniny, L-waliny, L-leucyny, L-izoleucyny, L-fenyloalaniny, L-proliny, L-seryny, L-treoniny, L-cysteiny, L-metioniny, L- tryptofanu, L-tyrozyny, L-asparaginy, L-glutaminy, kwasu L- asparaginowego, kwasu L-glutaminowego, L-lizyny, L-argininy lub L-histydyny; L niezaleznie oznaczaja N lub R1 N+ , R 1 ozna- cza atom wodoru lub C 1 -C6 -alkil ewentualnie podstawiony hydroksylem, C 1 -C6 -alkoksylem, grupa C 1 -C6-alkilotio lub grupa aminowa, korzystnie atom wodoru lub metyl, A niezaleznie oznaczaja wiazanie pojedyncze, metylen lub grupe o ogólnym wzorze 2a lub 2b, w których to wzorach Y Wzór 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe analogi oligeoykleotydów, sposób ich wytwarzania i środek fprmaceutyszny. Nowe związki według wyoclczky mają cnnon właściwości fizyczne, biologiczne i fαrmpkeiogiczon i są użyteczne jako inhibitory ekspresji genów (oligonyklnotyr cntyseosowny, rybozym, oligooyklnotyd sensowny i oligonukleotyd tworzący top^ks), jako sondy do badania kwasów nukleinowych i jako substancje pemoyniczn w biologii molekularnej.

Oligonyklnotyry znajdują zastosowanie głównie jako inhibitory ekspresji genów (J. F. Milligan, M. D. Mctteucyi i J. C. Martin, J. Med. Chem. 36 (1993) 1923; E. UMcssz i A. .Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; S. T. Crooke, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1992) 329).

Oligooukleotyry cntysyzsowoe to fragmenty kwasów nukleinowych o sekwencji zasad komplementarnej do sekwencji hamowanego mRNA. Ten docelowy mRNA może pochodzić z komórki, wirusa lub innego patogenu. Jako komórkowe sekwencje docelowe można wymienić np. sekwencje występujące w receptorach, enzymach, czynnikach wzrostu, immunomodylctoucch, kpoPcch jonowych lub ozkogeocsh. Hamowanie zpmopżpoia wirusów z użyciem oligonykleetyrów antyseosewnych opisano np. w odniesieniu do RSV (wirus mięsaka Roysa), HSV-1 i -2 (wirus opryszczki typu I i II), HIV (ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego) i wirusów grypy. W tym celu stosuje się oligenyklnotydy komplementarne do wirusowych kwasów ocklnizowych.

Oligonykleetydy sensowne mają taką sekwencję, że wiążą („wyłapują”) one np. białka wiążące kwasy nukleinowe lub enzymy puznksztαłcαjąse kwas nukleinowy, hamując ich aktywność biologiczną (C. Helene i J. J. Toulme, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Jako wirusowe obiekty docelowe można wymienić np. odwrotną Ρ^ηβΙατρΙ^, DNA-polimeupzę i białko tran salwujące. Celem eligonyαleotyrów tworzących tripleks j'est zazwyczaj DNA, po związaniu z którym tworzą one potrójną strukturę hnlikploą.

Aotysensowon oligenyαleotydy stosuje się głównie do hamowania puznαsztPcaoip (składania, itp.) mRNA lub jego t^«crzłlccji na białko, podczas gdy oligooyklnetydy tworzące ^pleks hamują transkrypcję lub replikację DNA (N. T. Thyong, i C. Helene, Angew. Chem.. 105 (1993) 697; Uhlma^ i Pnymco, Chemical Reviews 90 (1990) 543). Można jednak. także pierwszej hybrydyzacji związać jnrnoniciowy kwas oιCkleinowy z oligonyαleetydnm antysensownym, z wytworzeniem struktury rwuniyiowej, a następnie podczas drugiej hybrydyzacji z oligenykleotydem tworzącym tripleks otrzymać strukturę tjripleksową. Regiony potysensowoy i tworzący tripleks mogą się więc znajdować albo w dwóch odrębnych oligonykleotydach, albo w jednym oligonyklnotydzin.

Dalszym zastosowaniem syntetycznych eligooykłeotyrów są tak zwane rybozymy, niszczące docelowy DNA na skutek ich Pktywneści uyj^oou]αlepzy (D. Ccstpootto, J. J. Rossi, J. O. Des^er, Critical Rev. Eukar. Gene Expr. 2 (1992) 331).

W diagnostyce DNA stosuje się odpowiednio znaczone fragmenty kwasów nukleinowych jako tak zwane sondy DNA do specyficznej hybrydyzacji z kwasem oykleioowym, którego obecność chce się wykryć. Znaczniki, korzystnie mercdiocktywne, umożliwiają bαdpzin swoistych nowo utworzonych podwójnych nici. W ten sposób można wykryć choroby genetyczne, złośliwe oraz wywołane przez wirusy lub mne patogeny.

184 920

Oligonukleotydy w ich naturalnej postaci są słabo przydatne lub zupełnie nieprzydatne do wyżej wymienionych zastosowań. Trzeba je poddać takim modyfikacjom chemicznym, aby nadawały się do specjalnych celów. Po to, by oligonukleotydy w układach biologicznych mogły spełniać swą rolę, np. jako inhibitory namnażania się wirusów, muszą one odpowiadać następującym warunkom:

1. w warunkach in vivo, także w surowicy krwi i wewnątrz komórek, muszą wykazywać wystarczająco dużą trwałość;

2. muszą mieć zdolność przenikania przez błonę komórkową i jądrową;

3. w warunkach fizjologicznych muszą się wiązać w sposób zasado-specyficzny z docelowym kwasem nukleinowym dla wywarcia działania hamującego.

W przypadku sond DNA te założenia nie muszą być spełnione, jednak oligonukleotydy trzeba poddać takiej derywatyzacji, by można je było badać metodami fluorescencyjnymi, chemiluminescencyjnymi i kolorymetrycznymi lub specyficznie je barwić (Beck i Koster, Anal. Chem. 62 (1990) 2258).

Znana jest ogromna liczba zmodyfikowanych oligonukleotydów, syntetyzowanych po to, by spełniały wyżej podane wymagania lepiej niż oligonukleotydy nie zmodyfikowane. Przemiany chemiczne oligonukleotydów polegają zwykle na przemianie fosfoszkieletu, jednostek rybozy lub zasad nukleotydowych (Uhlmann i Peyman, Chemical Review 90 (1990) 543). Podczas modyfikacji nie tylko mostki fosforanowe, ale także jednostki cukrowe mogą zostać zastąpione innymi ugr^jpowaniami, np. oligomerem „morfolinomukeozydowym” (E. P. Stirchak i inni, Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129) lub „PNA” (P. E. Nielsen i inni, Bioconj. Chem. 5 (1994) 3). Szczególnie PNA odznaczają się niezwykle silnym powinowactwem do docelowego RNA, jednak mają one wady, a mianowicie niską rozpuszczalność i niską zdolność przenikania do komórek (W. Wang i inni, Tetrahedron Letters 36 (1995) 1181; M. Egholm i inni, „Imovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins, Nucleic Acids”, red. Roger Epton, Mayflower Worldwide Limited, Birmingham, 1994, 145-148).

Nieoczekiwanie okazało się, że nowe analogi oligonukleotydów cechują się polepszonymi właściwościami.

Zatem przedmiotem wynalazku są nowe analogi oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 100; B niezależnie oznacza atom wodoru, hydroksyl, C!-C20-alkii, C,-C2₀~alkoksyl, grupę ty-Cty-alkilotio, C₆-C20-aryl, C6-C2₀-aiylo-C₁-C₆-alkil, C6C20-arylo-C,-C6-alkoksyl lub grupę C6-C20-arylo-C1-C6-alkilotio, przy czym alkil i/lub aryl mogą być w każdym przypadku podstawione jednym lub większą liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, Cf-C^-^oksyl, -NR⁹R*1, -C(O)OH, grupę okso, -C(O)0R8 -C(O)NR⁹R‘1, -CN, -F, -Cl, -Br, -NO,., C2-C6-aikoksyalkil, -S(O)_R⁸, -C^^C.alkilo-S(O)raR⁸, -NHC(=NH)NHR⁸, -C(=NH)NHR⁸, -Nr9c(=O)R⁸, =NOR⁸, -Nr9c(=O)Or1, -OC(=O)NR⁹R¹⁰ i -NR⁹C(=O)NR9r’1, względnie B niezależnie oznacza ugrupowanie adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy; przy czym A-B mogą także oznaczać przyłączone poprzez karboksyl ugrupowanie D-glicyny, D-alaniny, D-waliny, D-leucyny, D-izoleucyny, D-fenyloalaniny, D-proliny, D-seryny, D-treoniny, D-cysteiny, D-metioniny, D-tryptofanu, D-tyrozyny, D-asparaginy, D-glutaminy, kwasu D-asparągnowego, kwasu D-glutaminowego, D-lizyny, D-argininy, D-histydyny, L-glicyny, L-alaniny, L-waliny, L-leucyny, L-izoleucyny, L-fenyloalaniny, L-proliny, L-seryny, L-treoniny, L-cysteiny, L-metioniny, L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-asparaginy, L-glutaminy, kwasu L-asparaginowego, kwasu L-glutaminowego, L-lizyny, L-argininy lub L-histydyny; L niezależnie oznaczają N lub R*N+; R1 oznacza atom wodoru lub U-Cg-alkil ewentualnie podstawiony hydroksylem, Cl-C6-alkoksyiem, grupą Cl-C6-aikiiotio lub grupą aminową, korzystnie atom wodoru lub metyl; A niezależnie oznaczają wiązanie pojedyncze, metylen lub grupę wzorze 2a lub 2b, w których to wzorach Y’ oznacza =O, =S, =CH2, =C(CH3)2 lub =

R1 ma wyżej podane znaczenie; M oznacza wiązanie pojedyncze, -O-, -S- lub -NR1 gdzie R1 ma wyżej podane znaczenie; R2 i R³ niezależnie oznaczają atom wodoru, hydroksyl, C_rC6alkoksyl, grupę C1-C6-alkfiotio, grupę aminową, atom chlorowca, taki jak F, Cl lub Br, albo C,C₆-alkil, przy czym każdy alkil może być podstawiony hydroksylem, Cl-C₆-aikoksylem lub grupą C1-C₆-alkilotio; p i q niezależnie oznaczają liczbę od 0 do 5; r i s niezależnie oznaczają o ogólnym NR, gdzie

184 920 liczbę od 0 do 5; D i G niezależnie oznaczają CR^SR⁶; R5 i R6 niezależnie oznaczają atom wodoru, Cj-Cg-alkil, C6-C2₀-aryll C6-C20-asalo-C,-C6-alkil, hydroksyl, Cl-C6-alkckcal’ lub grupę Ci-Cg-alkilotio, przy czym każdy alkil i aryl mogą być podstawione SRi lub NRiRi', gdzie Ri ma wyżej podane znaczenie, u Ri ma takie znaczenie jak R¹, z tym, że Ri i Ri ’ są w grupie NRlRi' jednakowe lub różne; X oznacza -O-, -S- lub -NR,-, gdzie Ri ma wyżej podane znaczenie; Y oznacza =O lub =S; Z oznacza -OR8, -NR9R^w lub X', Q”, gdzie X' ma takie znaczenie jak X, a Q” ma takie znaczenie jak Q; R⁸ oznacza atom wodoru, Cj-Cis-alkil, CS-Cisalkenyl, C3-Cl8-alkinal, C6-Cl2-aral lub C6-Cl2-asylo-Cl-C6-αlkil, przy czym alkil może być podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, Cl-C4-alkckcal, F, Cl i Br, a aryl może być pcdctuwicbe 1 - 3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej hydSckcal, Cl-C4-alkcksyl, C,-C4-alkil, F, Cl, Br, NO2, -NR⁹Ri°, -C(O)OH, -C(O)OC,-C6-alkil i -C(O)nR9r¹ , kctzactnie atom wodoru, C,-C6-alkil, C6-Cl2-asal lubC6-Cl2-asylc-ClC6-alkil, gdzie aryl może być pCdctawicba Cl-C4-ulkcksalem, Ci-C4-alkilem, F, Cl, Br lub NO2, a szczególnie kotzactbie atom wodoru, C,-C6-alkil, fenyl lub 2-(4-bittofebelo)etel; R9 i R¹⁰ niezależnie oznaczają atom wodoru, Ci-Ci8-alkil, Ci-C^-alkenyl, ^-^^ΙΕ^Ι, C6-Cl2-utyl lub C6Ci2-arylo-Ci-C6-alkil, przy czym alkil może być podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, Ci^-alkoksyl, F, Cl, Br; względnie R9 i R^w mogą tworzyć wraz z atomem azotu, do którego są przyłączone pierścień o 4-7 członach, Q i Q’ niezależnie oznaczają atom wodoru, R8 lub cligcbuklecteda, ewentualnie zmodyfikowane przez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5'-fccfcdiectscwych, np. mostkami fcsfbticestscwymi, fccfcditicectscwymi, NR⁴R4-fccfoamidabowami, fosfo-Ometalcectrowami, focfc-O-etyloestsowami, fccfo-O-izopscpalcecisowymi, metalofosfoniancwami lub fenalcfocfoniαnowami;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3'- lub 5'-fosfcdίectsowach w pozycjach pirymidynowych i na 5'-końcu i/lub hu 3'-końcu ugrupowaniem formacetalcwym i/lub 3 ^¢tiofosmαcetalcweml;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cuksowof'ocfosa.nowych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2'-dezokcysybczy 2’-F-2'dezokcaryeczą, 2'-O-Cl-C6-αlkilcraboją, 2’-O-C₂-C6-ulkebylorybozą lub 2'-NH2-2'-dezokcysybczą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guamny, hipckcubtaby, catczyny, uracylu lub tymmy 5-(Cl-C6-alkilc)utacylem, 5-(C₂-C6-ulkenylo)usacylem, 5-(C2-C₆-alkibylc)utacylem, 5-(Cl-C6-αlkilc)nytozyną, 5-(C2-C6-alkebylc)netczaną, 5-(C2-C6-alkibalc)catozybą, 5-flśosouΓutylem, 5-fluosnytczaną, 5-chlcsccytojaną, 5-ęsomcusunalem, 5ęromocyozaną, 7-deuza-7-(C2-C₇-alkinylc)guαnibą, 7-deaza-7-(C2-C₇-ulkinalc)adebiną, 7-deaza7-{C₂-C₇-alkenylo)guabibą, 7-deuja-7-(C₂-C₇-ulkenylo)adenin;e 7-dcaza-7-(C,-C₇-alkilc)gśaniną 7-deazu-7-(Cl-C₇-alkilc)udenmą, 7-deaza-7-eromogumbnąlub 7-deuzu-7-bsomoudeniną.

Korzystne są związki o ogólnym wzorze 1, w którym b oznacza liczbę od O do 50; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guaniny, hipckcantany, catcjyna, uracylu lub tymmy; L oznacza N; A oznacza grupę o ogólnym wzorze 2b, w którym s oznacza i, s cjnanju O, R² i R3 oznaczają atomy wodoru. Y* oznacza O, a M oznacza wiązanie pojedyncze; D i G niezależnie oznaczają CHR5, gdzie R5 oznacza atom wodoru; X oznacza. -O- Y oznacza =O; Z oznacza hydroksyl, metoksyl, etoksyl, 2-(4-bitrofebalo)etokcal, propoksyl, izcpsopokcyl, butoksyl, pentoksyl, fe^^yl lub alliloksyl, a Q i Q' niezależnie oznaczają atom wodoru lub oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite d c^zę^śbicz^ie zast^żenie p^c^iikćwć^kiwjh, 5'-f_Oęfc>dicstrowytSc cy.mosPkami focfctioestscwymi, fcsfoditioectsowymi, NR⁴R4-fccfoamidαbOwymi, N3' p P5’o β;«ίοamidanowymi (np. opisanymi w Gryazbov i inni, J. Am. Chem. Soc. 1,6 (1994) 3143), fosfoO-meiylocctsowymi, fosfc-O-ctyloestscwymi, fcsfo-O-izcpscpylcectsowami, meiylofocfcmanowymi lub febalofocfbniancwymi;

184 920

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3'- lub 5'-fosfodi-strowych w pozycjach pirymidynowych i na 5’-końcu i/lub na 3'-końcu ugrupowaniem foπnuc-tułowym lub 3'tioformac-tulowym;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukri^^wofosfbr^owych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2'-derbksyrybbzy 2’-F-2’d-zoksyryborą, 2’-O-Cl-C₆-alkilbrybozą, 2’-O-C2-C6-ulkenylorybozą lub 2’-NH₂-2’-d-zoksyrybozą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipbksuotyoy, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-(Cl-C₆-ulkilb)urucyl-m, 5-(C₂-C6-alkeoylb)uracylem, 5-(C₂-C6alkioylo)uracyl-m, 5-(Cl-C₆-alkilb)cytozyoą, 5-(C2-C6-ίUkenylo)cytozyoą, 5-(C2-C6-alkinylo) cytozyną, 5-fluorouracylem, 5-flubrcytoryoą, 5-chlOTouracylem, 5-ohlorbcytoryoą, 5^1^! uracylem, 5-brombcytozyną, 7-deuzd-7-(C2-C₇-alkioylo)guaniną, 7-dedru-7-(C2-C₇-alkioylo) adeniną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkenylo)gudo.ioą,, 7-d-dra-7-(C2-C₇-ulkeoylo)udeoiną, 7-d-azu-7(Ci -C^alkilo^uniną, 7-dedru-7-(Cl-C₇-alkilo)adeoiną, 7-d-dru-7-śr(lmoeuaniną lub 7-d-uza7-bromoud-nmą.

Szcz-gólni- korzystne są związki o wzorze 1, w którym n bznaczu liczbę od 0 do 30; Q i Q' ni-ruleżoie oznaczają atom wodoru lub R—, gdzie R—bzoucru atom wodoru, Ci-CT-alkil, fenyl lub 2-(4-aitrbfeaylo)etyl albo oligboukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5'-fbsfbdi-strowych mostkami fbsfbtio-strowymi, fbsfbditib-strowymi lub m-tylbfosfbniunbwymi;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3'- lub 5'-fosfodiestrowych na 5'-końcu i/lub na 3'-końcu;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cu^(^^,^ofosfor^^wych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2'-derbksyrybozy 2'-F-2'-dezoksyrybozą, 2'-O-Cl-C4-ulkilorybozą, 2'-O-C2-C4-alk-nylorybozą lub 2'-ŃH2-2'-dezoksyrybbzą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipbksuotyoy, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-(C_rC6-ulkilb)urucylem, 5-(C2-C6-alkenylo)urucylem, 5-(C2-C6ulkioylb)uracylem, 5-(C1-C6-ulkilo)cytozyną, 5-(C2-C6-^^^lo)<^^o:zy^^ 5-{C2-C5-jlkioylb)oytozyną, 7-deuzu-7-(C2-C₇-dkioylo)euaoioą, 7-d-uzu-7-{C2-C₇-alkioylb)ud-oioą, 7-deura-7-(C2-C₇ulk-oylo)etaoιiaą, 7-dejzu-7-(C2-C₇-alkeoylo)ud-nioą, 7-d-uza-7-(C₁-Ć₇-ulkilo)gt.uniną, 7-d-ura7-(Cl-C₇-ulkilo)ud-oiną, 7-deuza-7-brombeudainą lub 7-deuza-7-śromoadenin;ą

Najkorzystniejsze są związki o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 25; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, gu^iny, hipoksuntyny, cytozyny, uracylu lub tyminy; Z oznacza hydroksyl, etoksyl, 2-(4-oitrbf-oylo)-toksyl lub feobksyl; a Q i Q' niezależnie oznaczają atom wodoru, R—, gdzie R— oznacza atom wodoru, C1-C₆-alkil, fenyl lub 2-(4nitrofenylo)etyl albo oligooukl-btydy, eweotuuloi- zmodyfikowane pbprz-z·.

u) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5'-fosfodiestrowych mostkami fosfotioestrowymi;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowbfosfordnbwych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2’-d-zoksyrybozy 2’-Ometylory^zą, 2’-O-uΠiloΓlboząluś 2’-O-butyloyryborą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guu0ioy, hipoksuntyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-h-ksynylocytozyoą, 5-heksynyloura^ylem, 7-d-dra-7-prbpynyfoguuniną 7-d-ara-7-prbpyoylbudeoioą, 7-deazu-7-m-tyloguunioą, 7-deura-7-m-tyloadeniną, 7-d-ura-7-brombguuniną lub 7-d-aru-7-brombadeoiną.

Przykładowe warianty modyfikacji (opisane np. w E. UhJmuon i A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; „Pr<^^^<^<eols for Oligooucl-btid-s and Aoalogs”, Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, red. S. Agrawal, Humana Press, Tbtbwu, USA 1993) podano poniżej:

u) całkowate lwb nzuśnicwe zao-ąpiuniemostków tf- i/lub SMosfcdiestrowych. np. mostkami fosfotib-strowymi, fosfoditib-strowymi, NR^U/fosfoumidanowymi, borowodoro184 920 fosforanowymi, fosfu-O-Cι-C2,-ólkiluestrowomi, fosfu-O-(C₆-C₁l-órylo-Cl-C2,-ólkilu)estruwomi, 2,2,2-trichlurodίmetoluetolufosfohióhowymi, Cl-C8-alkilufosfohióhuwomi lub C6-C,1órzlofosfuhiónowymi, gdzie R⁴ i R⁴’ niezależnie oznaczają atom wodoru, P-C^-alkil, C6-C20aryl, C6-C!4-órolu-C,-C8-ólkil lub - (CH2)c-[NH(CH2)c]d-NR⁷R⁷, gdzie c oznacza liczbę całkowitą 2-6, d oznacza liczbę całkowitą 0-6, a R7 niezależnie oznaczają atom wodoru, C,-C6-alkil lub C--C4-alkuksy-Cl-C6-ólkil, z tym, że kureosthie R4 i R4’ oznaczają atom wodoru, C,-C8alkil lub metoksyetyl, a szczególne korzystnie atom wodoru, C,-C4-alkil lub metoksoetyl, a ponadto R4 i R⁴’ mogą ponadto z atomem azotu, do którego są przyłączone tworzyć heterocykliczny pierścień o 5-6 członach, ewentualnie zawierający dodatkowy heteroatom wybrany spośród O, S i N;

b) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3’- i/lub 5’-fosfodiestrowoch mostkami „defosfo” (patrz np. U0lmóhh i Peyman, „Methods in Molecular Biologo”, Vol. 20, „Protocols for Oligunucleotides and Ahalugs”, red S. Agrawal, Humana Press, Totowa 1993, rozdział 16,355ff), np. ugrupowaniami formacetalowym, 3’-tiofoΓmacetólowym, metyluOydruksoluómmuwom, oksomowom, metylenudimetyloOodraeu, dimetylenosufonowom lub sililuwom;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowycO np. oligomerami „morfolinomddeozydowymi” (E. P. Stirchak i inni. Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129) lub „PNA” (P. E. Nielsen i inni, Bioconj. Chem. 5 (1994) 3) lub hybrydami PNA-DNA, jak to opisano np. w DE-P 44 08 528.1 i EP-A O 672 677;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek P-D-2’-dezoksorybozo' np. α-D-2’denokszrobuzą, 1.-2^0^^0^0^^¾ 2’-F-2’-dezoksoroWuzą, 2’-O-C,-C₆-alkiΊurobozą, 2’-OC2-C6-alkenoluroWuzą, 2’-NH2-2’-denokszrobueą, β-D-ksylofuróhozą, α-órabinofurónozą, 2,4dideoksy-β-D-erytroheksupirónozą albo karbocyklicznymi (patrz np. Froehler, J Am. Chem.. Soc. 114 (1992) 8320) lub otwartołańcuchowomi analogami cukrowymi (np. VóndehdriesscOe i inni, Tetrahedron 49 (1993) 7223) lub bicokliczhomi analogami cukrowymi (np. M. Tarkov i inni. Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481);

e) całkowite lub częściowe zastąpienie naturalnych zasad hukleotyduwocO np. 5-(0ydroksymetylo)uracylem, S-ammouracylem, pseudouraczlem, diOydrouracylem, 5-(C,C6-alkilo)urócylem, 5-(C2-C₆-alkenolo)uracylem, 5-(C2-C₆-alkmolu)urócylem (patrz np. Gutierrez i inni. J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 540 lub Sagi i inni, Tetrahedron Lett.. 34 (1993) 2191), 5-(C,-C6-ólkilu)cztozohą, 5-(C_;-C6-ólkenylu)cotozohlą, 5-(C₂-C6-ólkinylu)cytuzohą (Gutierrcz i inni. J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 540 lub Sagi i inni, Tetrahedron Lett. 34 (1993) 2191), 5-fluuruurócolem, 5-fluorcotunohą, 5-chlurourócylem, 5-chlurocytozyną, 5-Wrumourócolem, 5-Wromocotozoną lub 7-deaza-7-pudstawiuhą-puryną (patrz np. Seela, Nucl. Acids Res. 20 (1992) 2297; Heterocycles 34 (1992) 229).

Grupy alkilowe i zawierające alkil większe grupo, jak np. alkoksyl i grupa ólkilotio, mogą być prostołabcuchowe, rozgałęzione lub cykliczne, nasycone albo jednokrotnie lub wielokrotnie nienasycone.

Ponadto przedmiotem, wynalazku jest sposób wytwarzania nowych analogów uliguhukleotodów o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają wyżej podane znaczenie, którego cechąj'est to, że a, ) związek o ogólnym wzorze 3, w którym D, G, L i X mają wyżej podane znaczenie, a S¹ oznacza odpowiednią grupę zabezpieczającą korzystnie dimetoksytrityl, mohumetuksotrityl, trityl, piksyl, t-butuksykarWohyl lub fluurenylometoksokórtbunyl₎puddóje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 4, w którym R5 i R6 mają wyżej podane znaczenie, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze 0-100°C, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 5a lub 5b;

b, ) związek o wzorze 5a lub 5b poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6a lub 6b, w których to wzorach Y ma wyżej podane znaczenie, X’ i X” są jednakowe lub różne i mają znaczenie zdefiniowane powożej dla X, S2 i S³ niezależnie oznaczają grupy zabezpieczające, a L oznacza grupę odszczepiającą się, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze 0-100°C, ewentualnie w obecności zasady, zasady kompleksowej lub nie mającej ładunku elektrycznego, perólkiluwahej zasady puliómmo-fosfóeenowej, z wytworneniem

-84 920 związku o ogólnym wzorze 7, w którym D, G, L, R5, R6, S- S2, Sb, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

cj bwiąbek o wberbe 7 poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 8, w którym A ma wyżej podane znaczenie, B^pR ma takie samo znaczenie jak B i ewentualnie występuje w postaci zabebpikObonej, a L2 oznacza znaną grupę odszczeplajece się lub oznacza hydroksyl, gdy A oznacza grupę o wzorze 2b, w odpowiednim rozpuszczalniku organicbcpm, w temperaturze od -20°C do -00°C, ewentualnie w ebkcceśoi zasady, zasady kompleksowej lub nie mającej ładunku elektrycznego, pkrαlkllewackj zasady pellamlne-festazkcewkj lub bez dodatku zasady, w obecności znanego środka sprzęgającego ułatwiającego powstawanie wiązań peptydowych, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 9, w którym A, B^I>R, D, G, L, R5, R6, S- S2, Sb, X, X’, X” i Y mają wyżej pedαnk znaczenie;

dj ze związku o wberbk 9 usuwa się grupę zabezpieczającą Sb z użyciem znanych sposobów, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 10, w którym A, B™, D, G, L, R5, R6, SS2, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

e— ze związku o wzorze 9 usuwa się grupę zabezpieczającą S- z użyciem znanych sposobów, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze -1, w którym A, B^ra, D, G, L, R5 R6, S², Sb, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

fj) związek o wzorze 11 i związek o wberzk 10 poddaje się reakcji według znanej w chemii oligenukleotydów „metody tesfetriestrenej^,, w odpowiednim rozpuszczalniku organoznpm, w temperaturze od -20°C do -00°C, w obecności środka sprzęgającego lub związku o ogólnym wzorze 12, w którym R- oznacza C6-C--aryl, ewentualnie podstawiony 1-4 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej Cj-C^alkil, C,-C6-alkokspl, grupę nitrową, atom chloru i atom bromu i w którym 1-b atomy węgla można ewentualnie zastąpić heteroatomami, a R- oznacza grupę edszozepiające się, ewentualnie w obecności katalizatora, przy czym środek sprzęgający można wytwarzać in situ lub można go wytworzyć oddzielnie i dodawać roztwór zaktywewanpch związków w odpowiednim rozpuszczalniku, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze -b, w którym A, B^1>!R D, G, L, R5, R6, S- S2, §b, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

g[) związek o wzorze ib poddaje się reakcji wydłużania łańcucha sposobem podanym w punktach ej i f,) do uzyskania żądanej długości tego łańcucha, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 14, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R6, S- S2, Sb, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

hj edszczkpla się grupy zabezpiecbająok S-, S2 i Sb oraz grupy zabebpieczajece w podstawniku B^pr z użyciem znanych sposobów;

po czym ewentualnie wprowadza się grupy Q i Q’ z użyciem znanych sposobów i ewentualne otrzymany związek poddaje się cyklizacji, z wytworzeniem związku o wzorze 1.

ponadto przedmiot wynalazku stanowi sposób wytwarzania nowych analogów oligecukleetpdów o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają wyżej podane znaczenie, a n oznacza liczbę 1-100, którego cechejkst to, że związek o ogólnym wzorze -5 lub -6, w których to wzorach A, B^pR, D, G, L, R5, R6, S- S², Sb, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, a o i p niezależnie ebcaczaje liczbę od 0 do 50, przy czym o + p + 1 = n, poddaje się następującym reakcjom:

a,) w związku o wzorze 15 odszazepia się grupę zabezpieczającą S- sposobem opisanym w punkcie ej;

b2) w związku o wzorze 16 odszczepia się grupę zabezpieczającą Sb sposobem opisanym w punkcie dj; i c₇) sprzęga się ze sobą tak otrzymane związki sposobem opisanym w punkcie fj, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 14, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R6, S- S2, Sb, X, X’, X”, Y i n mają wyżej podane znaczenie;

d₂) powstały związek przeprowadza się w związek o wzorze 1 sposobem opisanym w punkcie h,).

Dodatkowo przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych analogów ellgonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają wyżej podane znaczenie, którego cechąjest to, że związek o ogólnym wzorze 10, w którym A, B, D, G, L, R5,

184 920

R⁶, S¹, S2, S³, X, X’, X”, Y mają wyżej podane znaczenie, sprzęga się z użyciem znanych sposobów z mostkiem SPACER na stałym nośniku, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 17, w którym A, B^PR D, G, L, R5, R6, S1 S2, X, X’, X”, Y mają wyżej podane znaczenie, SS oznacza stały nośnik odpowiedni do użycia w syntezie w fazie stałej, a SPACER oznacza grupę dającą się udszczepiać od nośnika po syntezie, względnie SPACER oznacza dwufunkcyjną cząsteczkę koniugatową Q, którą można poprzez znaną grupę odszczepiającą się związać ze stałym nośnikiem;

b₃) ze związku o wzorze 17, w którym A, B^PR D, G, L, R5, R⁶, S1 S2, SS, SPACER, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, odszczepia się grupę zabezpieczającą S1 sposobem opisanym w punkcie e,);

c₃) powstały związek poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 10, w którym A, B^PR, D, G, L, R⁵, R6, S¹, S2, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, sposobem opisanym w punkcie fj);

d₃) przedłuża się do żądanej długości łańcuch sposobami podanymi w punktach b₃) i C3); e₃) ewentualnie wprowadza się koniugat Q’ drogą sprzęgania z użyciem znanych sposo bów;

f3) tak otrzymany związek odszczepia się znanymi sposobami ze stałego nośnika, a grupy zabezpieczające udszczepin się sposobami opisanymi w punkcie h,), przy czym odszczepianie grup zabezpieczających można prowadzić przed odszczepianiem ze stałego nośnika, po czym ewentualnie wprowadza się koniugat Q drogą znanej reakcji sprzęgania, z tym, że kolejność sprzęgania koniugatów Q i Q’ metodami według punktów e3) i f₃) można zmienić i ewentualnie powstały związek cyklizuje się.

Grupy Q i Q’ po połączeniu mogą razem tworzyć cząsteczkę cykliczną, przy czym jest też możliwe, że Q i Q’ tworzą razem wiązanie pojedyncze. Takie związki można wytworzyć sposobem analogicznym do opisanego przez Gao i innych. Nucl. Acids Res. 23 (1995) 2025 lub Wang i Kool, Nucl. Acids Res. 22 (1994) 2326.

Inną jeszcze postać wynalazku stanowią oligosuklputydy lub zmodyfikowane oligonukleotydy, np. PNA, które na 3’-końcu lub na lub na 5’-kuńcu i na U-końcu mają przyłączone związki o wzorze 1.

Przyłączanie związków o wzorze 1 do uligunśkleutydów prowadzi się korzystnie poprzez grupę hydroksylową w pozycji 5’ lub 3’ jednostki nukleotydowpj, również przez wytworzenie wiązań fυsfowosupstruwych. Ilustrację przyłączania do oligusuklputydów stanowią związki o wzorach 18 i 19, w których R” oznacza atom wodoru, hydroksyl, F, 2’-O5C₁-C65 alkil lub 2’-O-C2-C65alkenyl, korzystnie atom wodoru, metoksyl lub O-allil, a szczególnie korzystnie atom wodoru, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie.

Ilustrację przyłączania do PNA stanowią związki o ogólnych wzorach 20 i 21, w których wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie.

Poniżej przedstawiono dalsze schematyczne wyjaśnienie połączeń związków o wzorze 1, w którym Q i Q’ oznaczają atomy wodoru (zwanych w skrócie PMENA) z uligunukleotydami lub zmodyfikowanymi oligonukleutydami, takimi jak, np. PNA lub inne wyżej opisane zmodyfikowane uligunukleutydy, przy czym OLIGO oznacza ewentualnie zmodyfikowany uligunukleutyd. Tak więc przykładowymi połączeniami są:

5’-OLIGO-PMENA

5’-PMENA-OLIGO

5’-OLIGO-PMENA-OLIGO.. a ponadto ó’-C>LIGO-(PMENA-QLIGO)_;i (a = 1-20)

5’-PMENA-OLIGO-PMENA 0’-PMENA-(OLIGO-PMENA)a(a = 1-20)

Syntezę takich kombinowanych związków prowadzi się w ten sposób, że w zależności od rodzaju cząsteczki, zaczyna się od syntezy jednostki PMENA, po czym prowadzi się sprzęganie jednostek oligosśkleutydowych. Te uligusśkleutydy sprzęga się z użyciem znanych sposobów (Sunveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff) drogą syntezy w fazie stałej lub w rozpuszczalniku w przypadku jednostek monomer/oznych albo drogą kondensacji Slukuwpj. Kondensację prowadzi się wybiórczo metodą awidynuwą, metodą H-fosfusianobą

184 920 lub metodą fosfotriestrową (Senvecyχ, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff). Gdy z kolei jednostki P.M..ENA sprzęga się z jednostkami OLIGO, to korzystnie stosuje się metodę opisaną w punkcie f,). Sprzęganie z jednostkami PNA prowadzi się tak samo, względnie gdy mooemnuyczuą lub oligomeryczoą jednostkę PNA sprzęga się z jednostką PNEMA, stosuje się zosne sposoby syntezy peptydów lub syntezy estrów.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania związków o wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają wyżej podaoe /00^0^, polega na tym, że aj związek o ogólOym wzorze 3, w którym D, G, L i X mają wyżej podane znaczenie, c S¹ oznacza odpowiednią grupę zabnzpieyzająyą, taką jck dimnteksytrityl, mooomnteksytrityl, trit^yl, piksyl, t-bytoksykprbooyl lub fluoreoylometoksykαrbeoyl, korzystnie mooometoksytrityl lub t-butoksykurt>ooyl, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 4, w którym R⁵ i R⁶ mają wyżej percnn zosczeoie, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, tPkim jck np. metanol, etanol, izopropanol, butanol, aceteoitryl, dichlorometan (DCM), chloroform, bnnzno, dimetyloformamid (DMF), dimetylosulfotlnnek (DMSO), eter dietylowy, octan etylu (EE), tntuchyrrofUrpo (THF), N-metylopirolireo, eter naftowy, ksylen lub tolyno, względzie ich mieszaniny, korzystnie w metanolu lub etanolu, w temperaturze 0-100°C, korzystnie 10-50°C, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 5a lub 5b; przy czym przy doborze warunków rePkcji, znanych fachowcom (patrz np. S. R. Spodler, W. Karo „Organic Functional Group Preparations”, Vol. II, Seco^ Edition, Academic Press, Londyn, 1986, Rozdział 12 („Imines”)), należy uważać, by były one odpowiednie ze względu na użytą grupę zabezpieczającą S\ to znaczy gdyby np. wybrano grupę zabezpieczającą ointuwpłą w obecności kwasu, taką jck monomntoksytUityl, to wówczas w środowisku reakcji oie powiono być kwasu;

b,) związek o wzorze 5a lub 5b poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6a lub 6b, korzystnie ze związkiem o wzorach 6s, w których to wzorach Y ma wyżej porann znacznnin, X’ i X” sąjedoakowe lub różne i mają znaczenie zdefiniowane powyżej dla X, S²i S³ niezależnie ezopczcją grupy zabezpieczające, takie jsk np. metyl, etyl, fenyl, 2shleuefnnyl, 2,5-diyhlorofnoyl, 2,4-rishlorofnoyl, 4-nitrofeoyl, 4-metoksyfeoyi, 2-yyjsoentyl,

2-(4-oitrofenylo)ntyl, allil, benzyl, 2,2,2-trichleua-1,1 -rimntylentyl, 4-mnteksybeozyl, 2,2,2trichlorontyl, 8-hyruoksychioolioyl lub inoe znane grupy zabezpieczające ugrupowania fesfouaoown (Soovecyx, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff), korzystnie metyl, etyl, fenyl, 2(4-oitrofenylo)ntyl, allil lub 2,2,2-trichloreetyl, a L1 oznacza grupę orszczepiająsą się, korzystnie C_rC4-clkil, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, op. w metanolu, etanolu, izopropaoely, butanolu, acntooituylu, benzenie, DMF, DMSO, DCM, Ee, chloroformie, eterze rintylewym, THF, N-mntylopiuolirooin, eterze naftowym, ksylenie lub toluenie albo w ich mieszaninach, korzystnie w THF, w temperaturze 0-100°C, korzystnie 50-80°C, ewentualnie w obnsoośyi zssPdy, op. tri(C1-C6-alkilo)amioy, N-clkilomorfolioy, pirydyny, N,Ndimetylosmioopirydyny, butylolity, diizopuopylosmidky litu (LDA), wodorku sodowego, amidku sodowego, węglanu wapniowego, węglanu ce/owego, t-butanolsou wapniowego lub zasad kompleksowych, takich jak smidek sodowy-R1'ONs, gdzie Rⁿ oznacza C2C6-clkil lub CH₃CH2-O-CH₂CH3, względnie oie mających ładunku elektrycznego, peralkilowsnych zasad poli^nofosfazeoowych (Schw^^er, Nachr. Chem. Techn. Lab. 38 (1990) 1214; Angew. Chem. 99 (1987) 1212), korzystnie jednak bez dodatku zasady, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 7, w którym D, G, L, R⁵, R6, S1 S2, S3, X, X’, X” i Y mają wyżej podane zoacznoin;

cj związek o wzorze 7 poddaje się reakcji (op. sposobem zoaoym z pracy Dueholm i iooi. J. Org. Chem. 59 (1994) 5767) ze związ:kinm o ogólnym wzorze 8, w którym A mc wyżej porcon znaczenie, B^PR mc takie samo znaczenie jsk B i ewentualnie występuje w postaci zabezpieczonej, to znaczy gdy B oznacza naturalną zasadę oykleotyrową, to wówczas B^pR ozoccza zasadę oyklnotyrową, której grupa aminowa lub hydroksylowa są zpbezpinszoon odpowiednimi znanymi grupami zabezpieczającymi, takimi jsk p-oitrofeoyleetyl, beozeil, allil lub p-(t-bytylo)-bnozeil w przypadku grup hydroksylowych i acetyl, benzoil, p-(t-butyle)bnozeil, p-mntoksybeozoil, p-oitrofnoylontoksykarbeuyl, izobutyryl, p-(t-butylo)feoylecsntyl, grupa N,N-dimntyloformsmiryoowp flyornoylomnteksykcrbooyl, bnozyloksykjubeoyl

184 920 lub fenoksyacetyl w przypadku grup aminowych, względnie innymi znanymi w chemii oligonukleotydów grupami zabezpieczającymi zasady nukleotydowe (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff; Beaucage, Tetrahedron 49 (1993) 2223ff), przy czym korzystnie B^PRoznacza grupę o wzorze 24, 25, 26, 27, 28 lub 29, w których to wzorach R1 oznacza atom wodoru, 1-propynyl, 1-butyn.yl, ^^penty^^yl lub 1-heksynyl, korzystnie atom wodoru, 1-propynyl lub 1-heksynyl; R⁰ oznacza atom wodoru, difenylokarbamoil lub 2-(4-nitrofenylo)etyl; R¹⁴ oznacza acetyl, benzoil, p-(t-butylo)benzoil, p-(metoksy)benzoil, p-nitrofenyloetoksykarbonyl, izobutyryl, p-(t-butylo)fenyloacetyl, benzyloksykarbonyl lub fenoksyacetyl; a L2 oznacza znaną grupę odszczepiającą się, taką jak np. Cl, Br, O-SO2-metyl, O-SO2trifluorometyl, O-tosylan lub O-CJty względnie może oznaczać także hydroksyl gdy A oznacza grupę o wzorze 2b; w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, takim jak np. acetonitryl, benzen, DMF, DMSO, DCM, EE, chloroform, eter dietylowy, tetrametylomocznik, THF, N-metylopirolidon, eter naftowy, ksylen lub toluen albo ich mieszaniny, korzystnie w DMF, w temperaturze od -20°C do 100°C, korzystnie 0-50°C, ewentualnie w obecności zasady, np. tri(C1-C₆-alkilo)-aminy, N-alkilomorfoliny, pirydyny, N,N-dimetyloaminopirydyny, butylolitu, diizopropyloamidku litu (LDA), wodorku sodowego, amidku sodowego, węglanu wapniowego, węglanu cezowego, t-butanolanu wapniowego lub zasad kompleksowych, takich jak amidek sodowy -R1’ONa, gdzie R oznacza C2-C6-alkil lub CH₃CH₂-O-CH₂CH3, względnie nie mających ładunku elektrycznego, peralkilowanych zasad poliamino-fosfazenowych (Schwesinger, Nachr. Chem. Techn. Lab. 38 (1990) 1214; Angew. Chem. 99 (1987) 1212), gdy A oznacza grupę o wzorze 2b, a L2 oznacza hydroksyl, korzystnie w obecności trietyloaminy, diizopropyloetyloaminy lub N-etylomorfoliny lub bez dodatku zasady, w obecności znanego środka sprzęgającego ułatwiającego powstawanie wiązań peptydowych, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 9, w którym A, B^pR, D, G, L, R, R⁶, S1 S2, S³, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

d, ) ze związku o wzorze 9 usuwa się grupę zabezpieczającą S³ z użyciem znanych sposobów (patrz np. Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley & Sons, Nowy Jork 1991), np. na związek o wzorze 9, w którym S² i S3 oznaczają 2-(4nitrofenylo)etyle działa się 0,1M 1,8-diazabicykło[5,4,0]undec-7-enem (DBU) w pirydynie lub acetonitrylu w temperaturze pokojowej, na związek o wzorze 9, w którym s2 ' S3 oznaczają fenyl lub etyl, działa się wodnym roztworem amoniaku, na związek o wzorze 9, w którym S²oznacza 2-(4-nitrofenylo)etyl, a S3 oznacza allil, działa się Pd[P(C_ńH₅)3]₄ i trifenylofosfiną w DCM (Hayakawa i inni. J. Org. Chem. 58 (1993) 5551), na związek o wzorze 9, w którym S² oznacza 2-(4-nitrofenylo)etyl, a S3 oznacza allil, działa się 0,5M DBU w pirydynie lub acetonitrylu, na związek o wzorze 9, w którym S² oznacza 2-cyjanoetyl, a S3 oznacza allil, działa się trietyloaminą w pirydynie, a na związek o wzorze 9, w którym S² oznacza 2-(4nitrofenyło)etyl, a S3 oznacza 2,2,2-tπchloro-1,1-dimetyloetyi działa się tributylofosfiną, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 10, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R6, S¹, S², X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

e, ) ze związku o wzorze 9 usuwa się grupę zabezpieczającą S' z użyciem znanych sposobów (Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley & Sons, Nowy Jork 1991, Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff), np. na grupę monometoksytrityłową działa się kwasem, takim jak 80% kwas octowy, 1-4% kwas dichlorooctowy w chlorku metylenu lub chloroformie, 2% kwas p-toluenosulfonowy w DCM/metanolu lub 1% kwas trifluorooctowy w chloroformie, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 11, w którym A, B^pR, D, G, L, R5 r6, s², S³, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

fj) związek o wzorze 11 i związek o wzorze 10 poddaje się reakcji według znanej w chemii oligonukleotydów „metody fosfotriestrowej” (Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff, Reese, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1993, 2291ff), w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, takim jak acetonitryl, benzen, DMF, DMSO, DCM, EE, chloroform, eter dietylowy, tetrametylomocznik, THF, N-metylopirolidon, eter naftowy, ksylen lub toluen albo ich mieszaniny, korzystnie w pirydynie, w temperaturze od -20°C do 100°C, korzystnie 0-50°C, w obecności środka sprzęgającego, takiego jak np. heksafluorofosforan (6-nitrobenzotriazol-1-iloksy)tns(dimetyloamino)fosfoniowy (NBOP, Hashmi, Nucleosides & Nucleotides 13 (1994) 1059), heksafluorofosforan

184 920 (benjotri;ujol-i-Ucksy)tris(dimetyloαmino)fosfcbiowa (BOP, B. Castro, J. R. Dcsmoy, G. Evin i C. Selve, Tetrahedron Lett. 1975, 1219-1222), heksuflucsofccfcsan (benzotsiazc1-iilckca)tripirolld)yofosfbniowa (PyBOP, J. Coste, D. LeNguyen i B. Castro, Tetrahedron Lett:. 1990, 205-208), heksufluoscfccfosαb O-(7-aza)benzotrίiUjol-i-i1otctsametylouromowy (HATU, L. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397), chlorek N,N-bis(2-okcc-3-cksazolidynylo] diamidu kwasu fosforowego (Katti, Tetrahedron Lett. 26 (1985) 2547), 2-nhloso-5,5-dimctalo2-ckso-i,3,2-dickcufocfosinan (Stawiński, Nucl. Acids Res., Symp. Ser. 24, 1991, 229) lub związek o ogólnym wzorze 12, w którym R, oznacza C6-C₁i-asal, ewentualnie podstawiony 1-4 podstawnikami waesαnami z grupy obejmującej Ci-C6-alkil, C,-C6-αlkcksal, grupę nitrową atom chloru i atom bromu i w którym i-3 atomy węgla można ewentualnie zastąpić heteroatomami, korzystnie atomami azotu, korzystnie fenyl, tolil, 2,4,6-trimetylofenyl, 2,4,6-tsiizcpropy^eny! lub 2,3,5,6-tetramety1ofena1 (Losse, Liebigs Ann. Chem. 1989, 19ff), 4-bromofenyl, 2-nitrofenyl, 4-niirofenyl lub Ś-chinolil, kcszacinie 2,4,6-tsimety1ofcna1 lub 2,4,6triizopropyłofenyl, u R’⁶ oznacza grupę odczepiającą się, taką jak atom chloru, atom bromu, imidazolil, triazolil, 4-mtroimidazolil, UJAtetruOlil lub 3-niiro-i,2,4-tsiuzolil, kcszactbic związku o wzorze 12, BOP, PyBOP lub HATU, ewentualnie w obecności katalizatora (Reese, J. Chem. Soc. Perkin Trans. ,993, 2291ff), takiego juk np. N-metyloimidazol, N-tlenAi jriiry^dyny, takie jak N-tlenek 4-mctoksepisadyby lub N-tlenek 4-ctckcapisydyny, 4,6-dinitro-ihydroAsybenzctsiuzc1, i-hydsoAsy-5-fkny1ctetsajc1, K-hadsoksy-5-(4-mtsofenalc)tctsαzol, 3ntro-1H-K2,4-triazol, 5-(3-nitrofeny 10)-^^^001, 5-(3,5-dinitrofcnylo)-iH-tetsuzcl, 5-(1mcte1cimid^αjol-2-ilo)-il·I-ictsazc1, 5-[(i-meta1cimiduzc1-2-i1c)mcte1o)-iH-tctsazo1 lub 1hadsoksy-4-bitro-6-(tsif'1uosomcty1o)bebzotsiαzc1, koszacinie N-tlenek 4-etckcypisydyny lub N-tlenek 4-metokcepisydyna, przy czym środek sprzęgający można wytwarzać in situ lub można go wytworzyć oddzielbie i dodawać roztwór zαktywcwanych związków (związku o wzorze 10 i środku sprzęgającego), z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 13, w którym A, B™, D, G, L, R5, R, S, S², S³, X, X’, X” i Y mują ważcj podane znaczenie;

g, ) związek o wzorze 13 poddaje się reakcji wydłużania łańcuchu sposobem podanym w punktach e,) i f, do uzyskaniu żądanej długości tego łańcucha, z wytworzeniem związku o ogólnymwznem w4,w kti4yw A, B^pC A, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S’, IX, X’, X’, iY mają wyżaj podane znaczenie;

h, ) cdczczepiu się grupy zabezpieczające S, S² i Ί oruz grupy zabezpieczające w podstawniku B^pR z użyciem znanych sposobów (np. Greene, Wuts, Protec^e Groups in Organic

J. Wiley & Sons, Nowy Jork 1991), np. grupę zabezpieczającą Ί odczepia się sposobem opisanym w punkcie e,), grupy zabezpieczające S² lub S^;’ oznaczające 2-(4mtsofenylc)eiy1e poddaje się działaniu 0,5M i,8-diuzabicyklo-[5,4,0] undec-7-enu (DBU) w pirydynie lub acetonitrylu w temperaturze pokojowej, grupy ’2 lub S^;’ oznaczające fenyle poddaje się działaniu wodnego roztworu amoniaku, grupy zabezpieczające S² lub S³ oznaczające allil poddaje się działaniu Pd[P(C6H5)3j4, trfenylofosfma w DCM (Hayakawa i inni, I. 58 (1993) 5551), grupy S² lub Ί oznaczające 2^)^0^^ podduje się działaniu tsieta1oumme w pirydynie, a grupy S² lub Ί oznaczające 2,2,2-tsich1oso-K,i-dimety1oety1k poddaje się działaniu ήΠη^Ιοή^β^, natomiast w przypadku grup zabezpieczających w podstawniku B^pR np. grupę R, oznaczającą p-mtsofenyloetoAcykαsboba1 poddaje się działaniu 0,5M DBU w pirydynie, grupę R, oznaczającą izobutyryl, benzoil lub p-metokcyęenjoi1 poddaje się działaniu stężonego NH4OH w 20-60°C, a grupę R¹³ oznaczającą 2-(4-mtsofenylc)kty1 poddaje się działaniu 0,5M DBU w pirydynie lub αnetcnitsy1u, przy czym gdy Ί oznacza monometcAcatsity1, u ’2 oznacza 2-(4-bitsofeby1o)eta1, kcszactnie najpierw odczepia się grupę mobometcksatrtyIową sposobem podanym w punkcie e,), a potem cdczczepia się grupę S²wyżej opisanymi sposobami, po czym usuwa się pozostałe grupy zabezpieczające, np. w ugrupowaniach zasad nuk1cotydcwynh;

po czym ewentualnie wprowadza się grupy Q i Q’ z uże'niem znanych sposobów (patrz np. Uhlmann & Peymun, Chem. Rev. 90 (1990) 543; M. Manoharan, Antisense Research and

Applications, red. C-ronke and Lebleu, cRc Press, Boca Raton, 1993, Rozdział 17, str. 303ff;

EP-A 0 552 766; S. Agrawal, Methods in Molecular Biology, Vol. 26, str. 93 f f, Hmanua

-84 920 press, Totowa 1994) i ewentualnie otrzymany związek poddaje się cpklibacji sposobem opisanym w Wang, Nucl. Acids Res. 22 (1994), 2b26, z wytworzeniem związku o wzorze 1.

przykładowo związki o wzorze 22, w którym Q’ oznacza alkil można wytworzyć drogą reakcji związku o wzorze 2b ze związkiem o wzorze 6a lub 6b, a następnie przeprowadziwszy reakcje analogiczne dla tych opisanych w odniesieniu do związków o wberach 5a lub 5b.

Związki o wzorze 22 można też wytworzyć ze związków o wzorze 9 drogą edszozepienia grupy zabezpieczającej S- i wprowadzenia grupy Q’ znanymi sposobami (J. March, „Advanced Organic Chemistry”, Fourth Ed., J. Wiley & Sons, 1992).

Środki sprzęgające ułatwiające powstawanie wiązań peptydowych (patrz cj opisano np. w Ho^en-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/2, Georg Thieme Verlag Stuttgart -974, a opis innych środków można również znaleźć w literaturze, jak np. BOp (B. Castro, J.R. Dormoy, G. Evin i C. Selve, Tetrahedron Lett. 1975, 1219-1222), pyBOp (J. Coste,

D. Le-Nguyen i B. Castro, Tetrahedron Lett. 1990, 205-208), Brop (J. Coste, M.-N. Dufour,

A. pantaloni i B. Castro, Tetrahedron Lett. 1990, 669-672), pyBrop (J. Coste, E. Frerot, p. Jouin i B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 1967-1970), reagenty uroniowe, np. HBTU (V. Dourtoglou, B. Gross, V. Lambropoulou, C. Zioudrou, Synthesis -984, 572-574), TBTU, TpTU, TSTu i TNTU (R. Knorr, A. Trzeciak, W. Bannwarth i D. Gillessen, Tetrahedron Letters 1989, 1927-1930), TOTU (Ep-A-0460446), HATU (L.A. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 199b, 115,4397-4398), HApyU i TApipU (A. Ehrlich, S. Rothemund, M. Brudel, M. Beyermann, L. A. Carpino i M. Bienert, Tetrahedron Lett. -99b, 4781-4784), BOI (K. Akaji, N. Kuriyama, T. Kimura, Y. Fujiwara i Y. Kiso, Tetrahedron Lett. -992, 3177-3180), chlorki lub fluorki kwasowe (L. A. Carpino, H. G. Chao, M. Beyermann i M. Bienert, J. Org. Chem., 56 (1991), 26b5; J.-N. Bertho, A. Loffet, C. pinel, F. Reuther i G. Sennyep w Peptides -990, red.

E. Giralt i D. Andreu, Escom Science publishers B.V. 1991, str. 5b-54; J. Green i K. Bradlkp, Tetrahedron 199b, 4141-4146), 2,4,6-mezptylecesulfonylo-3-nltro-1,2,4-triazolld (MSNT) (B. Blankemeyer-Menge, M. Nimitz i R. Frank, Tetrahedron Lett. 1990, 1701-1704), ditlenek 2,5-dlfecyle-2,b-dihydre-3-oy.se-4-hydroksytiefenu (TDO) (R. Kirstgen, R. C. Sheppard,

W. Steglich, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1987, -870--871) i zaktywewαne estry (D. Hudson, Peptide Res. 1990, 51-55).

Korzystnie stosuje się karbodiimidy, np. dicykloheksylokarbodiimid lub dlizopropylekarbodiimid.

Korzystnie stosuje się także reagenty fosfeniowe, takie jak np. pyBOp lub pyBrop i reagenty uroniowe, takie jak HBTU, TBTU, TpTU, TSTU, TNTU, TOTU, HATU lub BOI.

Reakcję sprzęgania można przeprowadzić bezpośrednio drogą addycji związków o wzorze 8 i środka aktywującego, ewentualnie w obecności takich środków jak np. --hydrokspbenzotriazel (HOBt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (-970)) lub b-hydroksy-4okso-b,4-dihydrebknbetriabyna (HO-Obt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2034 (1970)), jednostki można osobno zaktywować w postaci aktywnych estrów i zaaktywowane związki dodawać jako roztwór w odpowiednim rozpuszczalniku.

Zgodnie z innym sposobem wytwarzania związków o ogólnym wzorze 1, w którym n oznacza liczbę 1-100, związek o wzorze 15 lub 16, w których to wzorach A, B^pR, D, G, L, R5, R6, S-, S², Sb, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, a o i p niezależnie oznacbaje liczbę od 0 do 50, korzystnie od 0 do 20, przy czym o + p + 1 = n, poddaje się następującym reakcjom:

a-) w związku o wzorze 15 odszczepia się grupę zabezpieczającą S- sposobem opisanym w punkcie ej;

b2) w związku o wzorze 16 edszobepia się grupę zabezpieczającą Sb sposobem opisanym w punkcie dj; i c2) sprzęga się ze sobą tak otrzymane związki sposobem opisanym w punkcie fj, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 14, w którym A, B^PR, D, G, L, R⁵, R6, S- S2, S³,

X, X’, X”, Y i n mają wyżej· podane znaczenie;

d2) powstały związek przeprowadza się w związek o wzorze 1 sposobem opisanym w punkcie hj.

184 920

Ponadto zgodnie z jeszcze innym sposobem wytwarzania związków o ogólnym wzorze 1, według wynalazku, związek o’ ogólnym wzorze 10, w którym A, B^pR, D, G, L, R⁵, R6, S”, S2, β3, X, X’, X” , ó” ma,w wąźąj podaneznaczenćz, sprzępa sia z użyciem pwannahsphsobów z mostkiem SPACER na stałym nośniku, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 17, w któryw A, BP, D, G, L, R⁵, R6, S”, S2, S³, X, X’, X”, Y mają wyżej podane znaczenie, SS oznacza stały nośnik odpowiedni do użycia w syntezie w fazie stałej, np. awinopropylu-CPG (CPG = RCntrolled Pore Glass) lub irentagel, a SPACER oznacza grupę dającą się odęzczepiać od nośnika po syntezie, znaną fachowcom (SonvenuXr Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff), np. grupę Sls(hyer<^ł^^i^<^t^e^^^lu)^iśł^'o;^yyll^wą (patrz np. EP-A 0552766), względnie SPACER oznacza dwufunkcyjną cząsteczkę koniugati^wą Q, którą wożna poprzez znaną grupę udszczeaiaaąąąsię związać ze stałym nośnikiem, np. nukleotyd lub uligunukleotyd związany ze stałyW nośnikiem poprzez ugrupowanie kwasu bursztynowego (SonvenuXr Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274ff) albo poli- lub oligoglikol etylenowy związany ze stałym nośnikiem poprzez ugrupowanie kwasu bursztynowego (Jaschke, Tetrahedron Lett. 34 (1993) 301) lub np. pochodną cholesterolu związaną ze stałym nośnikiem poprzez ugrupowanie kwasu bursztynowego (MacKellar, Nucl. Acids Res. 20 (1992) 3411);

b₃) ze związku o wzorze 17, w którym A, B”R D, G, L, R5, R6, S¹, S2, SS, SPACER, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, odęzczepia się grupę zabezpieczającą S¹ sposobem opisanym w punkcie ej);

c₃) powstały związek poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 10, w któryw A, bp^r, D, G, L, R5, R6, S1 S2, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, sposobem opisanym w punkcie fj);

d₃) przedłuża się do żądanej długości łańcuch sposobami podanymi w punktach b₃) i c₃); e₃) ewentualnie wprowadza się koniugat Q’ drogą sprzęgania z użyciem znanych sposobów (patrz np. Uhlwenn & Peyman, Chem. Rev. 90 (1990) 543; M. Manoharan w „Antięenęe Reęearch and Aaplications”, red. Crooke i Lebieu, CRC Press, Boca Raton, 1993, Rozdział 17, str. t0330 EP-A 0 552 566;S; Agrawal w „Methods in νοί^ό, str. 93ff, Humana Press, Totowa 1984);

f₃) tak otrzymany związek odęzczepia się znanymi sposobami ze stałego nośnika, np. na mostkową grupę Sis(Syeroksyetylo)sulfonylobą (patrz EP-A 0552766) poddaje się działaniu DBU, mostkowe ugrupowanie kwasu bursztynowego działa się wodnym roztworem amoniaku, a grupy zabezpieczające odęzczepin się sposobami opisanymi z punktu h,), przy czyw udęzczeaianie grup zabezpieczających można prowadzić przed oeęzczepinniem ze stałego nośnika, po czyw ewentualnie wprowadza się koniugat Q drogą znanej reakcji sprzęgania, z tym, że kolejność sprzęgania kuniugatów Q i Q’ metodami z punktów Pj) i f₃) można zmienić i ewentualnie powstały związek cyklizuje się.

Związki o wzorze 1 znajdują zastosowanie jako inhibitory ekspresji genów.

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny zawierający ęuSętancjs czynną oraz fizjologicznie dopuszczalny nośnik i ewentualnie odpowiednie dodatki i/lub substancje pomocnicze, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie pudętnwniki mają wyżej podane znaczenie.

Ogólnie pod pojęciem terapeutycznie skutecznych związków rozumie się tu związki, które ze względu na kolejność jednostek B odpowiadają zasadom sukleotydubyw i pełnią funkcję ana^gów uligunukleutydów nntysenęuwnych, oligunukleotydów tworzących potrójny heliks, aatameró'b (cząsteczki RNA lub DNA zdolne do wiązania się z określonymi cząsteczkami w komórce, np. z białkami lub receptorami; patrz np. L. C. Bock i inni, Nature 1992, 355, 564) lub rybozywów (katalityczny RNA; patrz np. Cnętnnettu i inni, Critical Rev. Eukar. Gene Expr. 1992, 2, 331), a przede bęzyętkiw analogów ol·igusśkleutydów antysessuwnycS i oligonukleotydów tworzących potrójny helikę.

Związki według wynalazku są użyteczne jako środki diagnostyczne, np. do wykrywania obecności lub braku albo liczby specyficznych jeenusiciuwych lub dwuniciuwycS cząsteczek kwasów nukleinowych b próbie biologicznej.

184 920

Związki według wynalazku użyteczne juko środki mają długość (n-1) odpowiadającą, około 6-100, korzystnie około 10-40, a szcz-eóloi- korrystoi- około 12-31 oukleotydom. Z drugiej strony obowiązują tu również wyżej opisane korzystne zakresy i modyfikacje.

Środki farmaceutyczne według wynalazku można stosować np. w leczeniu chorób wywoływanych przez wirusy, np. wirusy HIV, HSV-1, HSV-2, grypy, VSV, hepatitis B lub papilloma.

Sekwencje (kblejobeć zusud) w związkach według wynalazku skutecznych przeciw takim celom to np.:

a) przeciw HIV:

ACACCCAATTCTGAAAATGG

AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA

GGTCCCTGTTCGGGCGCCA

GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA

GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA

GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG

GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGG

b) przeciw HSV-1:

GCGGGGCTCCATGGGGGTCG

GGAGGATGCTGAGGAGG

GGAGGATGCTGAGG

CAGGAGGATGCTGAGGAGG sekwencja rnn 1 sekwencja nr 2 sekwencja nr 26 sekwencja nr 3 sekwencja nr 4 sekwencja nr 5 sekwencja rr 6 sekwencja rr 7 sekwencja rr 28 sekwencja rr 29 sekwencja nr 30

Środki fdrmuceutycra- według wynalazku znajdują, zastosowanie tukże w leczeniu np.

ruka i restenozy. Przykładowo są to s-kwencj- skierowane przeciw celom odpowiedzialnym zu powstawanie i rozwój ruku.

Tymi celumi są np.:

1) onkooueleoproteioy, tukie juk np. c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120;

2) dnebproteioy cytbplurmowe/zwiąraoe z błoną, tukie juk np. EJ-ras, c-Hu-rus, N-rus, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-ubl;

3) receptory komórkowe, takie juk np. receptor EGF, c-erbA, receptory retinoidów, podjednostka regulatorowa kinuzy śidt-e, c-fins;

4) cytokiny, czynniki wzrostu, matryce zewoątrzkomórkowe, tukie jak np. CSF-1, IL-6, IL-1a, lL-1b, IL-2, IL-4, ś-FGF, mieloślustyna, fibronektynu.

Sekwencje (kolejobeć zusud) w związkach według wynalazku skutecznych przeciw takim wirusom to np.:

u) przeciw c-Ha-rus: CAGCTGCAACCCAGC	^kwan^a nn 8
c) przeciw c-myc: GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC	skwYancua nn 9
AACGTTGAGGGGCAT	-ekwancjann .10
d) przeciw c-myb: GTGCCGGGGTCTTCGGGC	-ewoncua nn 11
GTGCCGGGGTCTTCGGG	-ekwancUa nn 227
e) przeciw c-fos: GGAGAACATCATGCjTCGAAAG	-ekwancja nn 12
CCCGAGAACATCATGGTCGAAG	sekwencja nr 13
GGCCAAACCCCCCCAACCtGC	-ekwencja nn 14
f) przeciw p120: cacccgccttgccctcccac	sekwencja nr 15
g) receptory EGF: gggactcccgcgcagccc	sekwencja nr 16
GGCAAACTTTCTTTTCCTCC	sekwencja nr 17
h) supresor nowotworowy p53: GGGAAGGAGGAGGATGAGG	sekwencja rr 18

184 920

GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG sekwencjanr 19

i)bFGF:

GGCTGCCATGGTCCC sekwencja nr 31

Środki farmaceutyczne według wohólónku znajdują zastosowanie także w leczeniu chorób, na które mają wpływ integryno i receptory substancji Worących udział w przyleganiu komórek, np. VLA-4, VLA-2, ICAM lub ELAM.

Sekwencje (kolejność zasad) w związkach według wynalazku skutecznych przeciw takim celom to np.:

a) przeciw VLA-4:

GCAGTAAGCATCCATATC sekwencja nr 20

b) przeciw ICAM:

CCCCCACCACTTCCCCTCTC sełrneencja nr 21

CTCCCCCACCACTTCCCCTC sekwencja nr 22

GCTGGGAGCCATAGCGAGG nr 23

c) przeciw ELAM-1:

ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG nr 24

CAATCAATGACTTCAAGAGTTC sekwencja nr 25

Środki farmaceutyczne według wynalazku znajdują zastosowanie także w leczeniu chorób, które wywołują takie czynniki jak TNF alfa.

Sekwencje (kolejność zasad) w związkach według wyhólónku skutecznych przeciw takim celom to np.:

a) przeciw TINF-alfa:

TCATGGTGTCCTTTGCAGCC sekwencjanr 3?2

TCATGGTGTCCTTTGCAG sekwencja nr 33

Środki farmaceutyczne według wynalazku można także zastosować np. w postaci preparatów farmaceutycznych, w postaci odpowiedniej do podawania miejscowego lub doustnego, np. w postaci tabletek, drażetek, twardych lub miękkich kapsułek żelatynowych, roztworów, emulsji lub suspensji. Mogą mieć one także postać preparatów doodbytniczych, np. czopków, lub do podawania pozajelitowego, np. roztworów do wstrzyknięć. W celu wytworzenia preparatów farmaceutycznych związki według wynalazku można zmieszać z co najmniej jednym obojętnym terapeutycznie nośnikiem organicznym lub nieorganicznym. Takimi nośnikami stosowanymi w tabletkach, drażetkach i twardych kapsułkach żelatynowych są np. laktoza, skrobia kukurydziana i jej pochodne, talk i kwas stearynowy lub jego sole. Odpowiednimi huśhikómi do wotwórnóhia roztworów są woda, poliole, sacharoza, cukier inwertowany i glukoza. Odpowiednimi nośnikami do wytwarzania roztworów do wstrzyknięć są woda, alkohole, poliole, gliceryna i oleCc roślinne. Odpowiednimi nośnikami do wytwarzania czopków są oleje roślinne i oleje utwardzone, wosk, tłuszcze i półpłynne poliole. Preparaty farmaceutyczne mogą także zawierać konserwanty, rozpuszczalniki, stóWilizóturo, substancje sieciujące, emulgatory, środki słodzące, barwniki, środki smakowe, sole wpływające na ciśnienie osmotyczne, bufory, środki wytwarzające powłoczkę, óhtyutleniócee i, ewentualnie, inne środki terapeutycznie czynne.

Korzystnie środki farmaceutyczne według wynalazku podaje się doustnie lub przez wst^^oknięcie. W tym celu oliguhukleotydo ahtysehsuwne formułuje się w płynnym roztworze, korzystnie w fizjologicznie dopuszczalnym buforze, takim jak płyn Hanka lub płyn Ringera. Związkom według wynalazku można jednak także nadawać postać preparatów stałych, przeznaczonych do rozpuszczenia lub przeprowadzenia w postać suspensji przed użyciem.

Korzystna stała dawka wznosi około 0,01-50 mg/kg wagi ciała dziennie.

Lista sekwencji:

ACACCCAATTCTG.AAAATGG sekwencja in 1

AGGTCCCTGTTC^GCGCCA sekwencjami

GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA in 3

GCTATGTCGACACCCAArTCTGAAA sekwencja nr 4

GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG sekwencjanr 5

GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGG sekwencjam 6

184 920

GCCGGGCTCCATCCGGCTCG

CACCTGCAACCCACC

GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC

AACGTTGAGGGGCAT

GTCCCGGGGTCTTCCCGC

CGAGAACATCATCGTCGAAAG

CCCGAGAACATCATCGTCCAAG

GCCCAAAGCCCCGCAACGCG caccccccttcccctcccac cgcactccgccgcagccc cgcaaactttcttttcctcc gggaaggaccaccatgagg

GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG ccagtaagcatccatatc

CCCCCACCACTTCCCCTCTC

CTCCCCCACCACTTCCCCTC gctcggagccatacccacg actcctgcctcttctctcagg

CAATCAATGACTTCAAGAGTTC cgtccctgttccggcgcca gtcccggggtcttccgg

CCACGATGCTCjACGACG ccacgatgctgagc cacgaggatcctgaggagg

CGCTGCCATCGTCCC tcatcgtgtcctttccaccc tcatcgtctgctttccac sekwoncjr rr 7 skWnoycjr nr 8 sekwoycjr rr 9 sekwoncjaua 10 sdwsnccjr ra 11 nekwoncjaua 22 sekwoncjanr 33 nekwoycja na 44 sekwoncjanr 15 nełwnoyjSa na 16 sekwoncjrrr 17 sekwoncjrrr 8 8 sekwoncja na 19 nelwnoncja nr 20 nekwoncjaua 21 eelwoncja nr 22 sekwoncja nr 23 nekwoncja na 24 nekwoncja na 25 nekwoncja na 26 sekwoncja nr 27 ekk wonGja r 28 eek woneja r 29 selWsoncja sra 30 ^γνοη^ nr 31 nr 32 sekwenGja sn 33

Dokładny protokół sekwencji zamieszczono za przykładami ilustrującymi wynalazek.

Przykład 1. Ester d^^p-nitro fenyloetylowy] kwasu N-(4-mntoksytuifeoylomstoksy)etylocminemetanofosfonowego

a) N-Flyorenylometoksykαr·booylo-2-sminoetaoiil

W 250 ml dioksanu i 150 ml H₂O rozpuszczono 8,61 g (0,141 mola) 2-amiooetPoolu. W temperaturze 15-20°C dodano 17,79 g (0,212 mola) NPHCO3, a potem porcjami 50 g (0,148 mola) flyorenylomntoksyksujonylo-N-sukcy^,oimiry. Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a potem odparowano do sucha. Pozostałość rozdzielono między dichlorometan (DCM) i H₂O. Fazę organiczną wysuszono (NPJSO4), a rozpuszczalnik odparowano pod próżnią. Pozostałość mieszano z 100 ml etsry, a produkt odsączono i przemyto eterem, w wyniku czego etrzympoo 38,77 g (97%) związku tytułowego.

MS (ES+) 284,2 (M+H)+ 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 3,05 (dd, 2H, CH₂OH); 3,39 (dd, 2H, N-CH_?); 4,25 (m, 3H, Ar-CH-CH,); 4,61 (t, 1H, OH); 7,14-7,98 (m,T5H, Ar-H, NH). ’

b) N-Fhlorenylometoes5ykjr·benylo-2-amino-1 -(4-metolciyUifenylometoesiy)ePol

W 100 ml absolutnego, NN-dimetyloformamidu (DMF) rozpuszczono 10 g (35,3 mmola) N-flyerenylometoksyeprbonyk>-2-pminontanoly (przykład 1a), a następnie w 0°C dodano 5,93 g (45,93 mmola) riizopropylostylosminy (DIPEA) i 10,91 g (35,3 mmola) chlorku 4-meteksytrifenylometyly. Całość mieszano w 0°C przez 1 godzinę, a potem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną odparowano i rozdzielono między DCM i nasycony wodzy roztwór NCHCO3. Fazę organiczną przemyto H₂O i wysuszono (Na₂SO4), c rozpuszczalnik odparowano pod próżnią. Po oczyszczeniu drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (najpierw o-heptcn/octao etylu (EEl/trimtyloamioc (TEA) 70/29/1, c potem EE/TEA 99/1) otrzymano 14,4 g (73%) związey tytułowego.

MS (FAB): 562,3 (M-L Li) *1 ‘H-MRR 0200 MHz,DMSO, TMS): δ = 2,95 ftHH, CH,O-MMTr); 3,21 (dd, 2H, N-CH,); 3,75 (s, 3H, OCH,); 4,25 (m, 3H, Ar-CH-C^); 4,61 (t, 1H, OH); 6,80-7,96 (m, 23H, Ar-H, NH). ~

184 920 lc) 2-Amino-1-(4-metoksytrifenylometoksy)etan

W 50 ml absolutnego DMF rozpuszczono 5,0 g (9 mmoli) N-fluorenylometoksykarbonylo-2-£unmo-1-(4-metoksytrifenylometoksy)etanu (przykład 1b). W temperaturze pokojowej dodano 6,55 g (90 mmoli) dietyloaminy i całość mieszano przez 2 godziny. Po oczyszczeniu drogą, chromatografii na żelu krzemionkowym (najpierw n-heptan/EE/TEA 50/49/1, a potem EE/metanol/TEA 79/20/1) otrzymano 2,96 g (98,7%) związku tytułowego .

MS (ES+): 340,3 (M+Li)⁺; ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 2,75 (t, 2H, CH₂OMMTr); 2,93 (dd, 2H, N-CH₂); 3,75 (s, 3H, OCH₃); 6,83-7,47 (m, 14H, Ar-H).

ld) 2-Metyloimino~--(4-metoksytrifenylometoksy)etan (trimer)

W 10 ml metanolu rozpuszczono 2,96 g (8,9 mmola) 2-amino-1-(4-metoksytrifenylometoksy)etanu (przykład 1c), a potem w trakcie chłodzenia lodem dodano 1,08 g (13,22 mmola) 37% roztworu formaldehydu i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, w wyniku c^^c^ggo wytrącił się l<p>ki osad. Mies:ammę reakcyjną odparowimo i pt^itois^ł^śść oczyszczono drogą ctoΌmalośąofii na żęto krozmiooke)śvwyn ((^--hte5ttarn/^lS//^I^yA 50/49/1), w wyniku czego otrzymano 1,7 g (55%) związku tytułowego.

MS (FAB) 1042,8 (M+Li)⁺; 1034,8 (M-H)⁺; ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 2,60 (t, 6H, O-CH2); 2,99 (t, 6H, N-CH₂); 3,69 (s, 9H, OCH₃); 6,78-7,42 (m, 42H, Ar-H).

le) Fosforyn di[2-(4-nitrofenylo)etylu]

W atmosferze argonu i w 100°C ogrzewano przez 14 godzin 23,42 g (0,1 mola) fosforynu difenylu i 33,43 g (0,2 mola) p-nitrofenylgetanoto. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (n-heptan/EE 50/50, a potem EE/metanol 80/20). Wydajność: 55%.

MS (FAB) 403,1 (M+Na)⁺; 381,1 (M+H)+. Ή-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 3,03 (t, 4H, A-CH2); 4,20(4H, dt, O-CH2); 6,71 (d, J = 140 Hz; 1H, PH); 7,52 (d, 4H, Ar-H); 8,17 (d, 4H, Ar-H).

lf) Ester di[2-(p-nitoofenylg)etylowy] kwasu N-(4-metgksytrifenylometoksy)etyloaminometianofosfonowego

W 2 ml absolutnego tetrahyd-ofuranu (THF) rozpuszczono 500 mg (1,32 mmola) fosforynu di[2-(4-nitrofenylg)etyiu] (przykład 1e), dodano 341 mg (0,329 mmola) 2-metyioiminol -(4-metgksytoifenylometoksy)etanu (trimer, przykład 1d) i mieszaninę mieszano w 80°C przez 3 godziny. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość mieszano w 100°C przez 30 minut. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym. (najpierw EE/TEA 99/1, a potem EE/metanol/TEA 9θ/9/1). Wydajność: 83%.

MS(FAB) 732,3 (M+Li)+ ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 2,64-3,06 (m, 10H, Ar-CH₂ + P-CH2 + CH2-OMMTr + N-CH2); 3,73 (s, 3H, OCH,); 4,16 (dt, 4H, PO-CH2); 6,788,08 (m, 22H, Ar-H).

Przykład 2. Ester di[2-(p-nitrofenylo)etylowy] kwasu N-(N6-amzoilo)cytozyn--yio-acetylo-N-(4-metoksytrifenylometgksy)etyloam.inometanofosfongweąo

2a) W 60 ml absolutnego DMF rozpuszczono 2,00 g (2,76 mmola) estru di[2-(pnitr<^śfe^^^^<ś)^tt^^(^-wegg] kwasu N-(4-metoksytrifenyiometoksy)etyloaminometanofosfonowegg (przykład 1f), a potem dodano 0,952 g (8,27 mmola) N-etylomorfoliny (NEM), 0,834 g (2,76 mmola) kwasu 2- [ N6-onli2^śiίło) yy-ozynl--y-o-ocśowągo i 1Ί53 g (3,03 mmotoi heksffluorofosforanu O-(7-aza)benzotriszol---ilotetr£Hnetylouromowego (HATU, L. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Do mieszaniny dodano jeszcze HATU i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (DCM/metanoł/TEA 95/4/1). Wydajność: 2,7 g (97% .

MS(ES+): 1012,0 (M+H)*. 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 2,94 (t, 4H, P-OCH₂-CH₂-Ar); 3,06 (t, 2H, MMTr-O-CH,); 3,23-3,63 (m, 4H, P-CH, + N-CH_a); 3,75 (s, 3H, OCH3); 3,83 (s, 3H, OCH₃); 4,10 (dt, 4H,T-O-CH₂); 4,79 (s, szeroki,i2H, CO-CH2); 6,80-8,18 (m, 28H, Ar-H, cytozynyl-H); 11,03 (s, szeroki, ‘H, NH).

2b) Zastosowano tok postępowania jak w przykładzie 2a, ale zamiast HATU użyto terafluoroboranu O-[cyjsno-(etodyka0b-nylośm<iyllślnoanino]-1,1,3,3-tetr^anelylouroniowego (TOTU, EP 0 460 446). Wydajność: 57%. Dane speetrto^^<^J^(^'we takie same jak w przykładzie 2a

184 920 przykład 3. Sól trietyleameciewα moneestru [2-(p-mtrofenyloretplewege] kwasu N-(N⁶-acizollo)cptozyn-1-ple-acetplo-N-(4-meteksytrifenylometoksy)-etyleammemetanofesfenewego

W 20 ml 0,1M robtweru 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu (DBU) w absolutnym acetonltrplu rozpuszczono 1,00 g (0,99 mmola) estru di[2-(p-cltrofenylo)etylowege] kwasu N-N6-anzoilo)cytozyn-1 -ylo-acetylo-N-(4-metoysytrit’enylometoksp)etyloaminometίatofosfonowege (przykład 2) i całość mieszano w temperaturze pekejewej przez 4 godziny. Miksbanind reakcyjną rozdzielono między DCM i wodny roztwór KH₂pO4 (pH 7). Fazę organiczną wysuszono (Na^C^) i rozpuszczalnik odparowano pod próżnią. produkt eczpszczoce drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 70/29/1). Wydajność: 540 mg (57%).

MS (FAB): 906,5 (M+H+2Na)⁺; 884,6 (M+Na)⁺; 862,5 (M+H)+. 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 3,00 (m, 4H, p-O-CH₇-CH₇-Ar + MMTr-O-CHJ; 3,38-3,60 (m, 4H, p-CH + N-CH_?); 3,73 (s, 3H, OCH₃); 3,82 (s, 3H, OCH,); 4,01 (dt, 2H, p-O-CHJ; 4,79 i 5,03 (2s, szeroki, 2H, CO-CHJ; 6,78-8,20 (m, 24H, Ar-H, cptezpnpl-H); 11,00 (s szeroki, 1H, NH).

przykład 4. Ester di[2-(p-mtrofenyło)etylowy] kwasu N--(N⁶-anizoile)cptobyn-1plo-αoetple-N-(2-hydreysyetylo)αmico-metacofesfocewego

W 80 ml wodnego roztworu kwasu octowego rozpuszczono 1,00 g (0,99 mmola) estru di[2-(p-mtrofenylo)etylowego] kwasu N-(N6-amzoilo)cytozyn-1 -ylo-aoetplo-N-(4-metokspttrifenplometoksp)etyloαmmemetanofosfocewege (przykład 2) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość współodparowane z toluenem (2 x). produkt eozpszcbece drogą chromatografii na żelu kΓzemienkewρm (EE/metanol/TEA 85/14/1). Wydajność: 522 mg (71%).

MS (FAB) : 761,2 (M+Na)+ 739,3 (M+H)+. 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 2,98 (t, 4H, p-O-CH₇-CH2-Ar); 3,38-3,67 (m, 4H, N-CH₇CH2-OH); 3,80-3,89 (m, 2H, p-CH₂); 3,91 (s, 3H, OCH₃); 4,12 (dt, 4H, p-O-CHJ; 4,78 i 4,87 ~(2s, szeroki, 2H, CO-CHJ; 6,98-8,19 (m, 14H, Ar-H, cytozynyl-H); -1,02 (s, szeroki, 1H, NH).

przykład 5. 5’-MMTr-CA-p(ONpE)-CA-p (ONpE)₂

Związek tytułowy wytworbece sposobem analogicznym jak w przykładzie 17 z soli trietyloamoniowej mecekstru [2-(p-citrofenylo)etylowege] kwasu N-(N6-anίzoilo)cptozpc-1yle-αcetple-N-(4-metoksytrifkcylomkteysy)etpleamlnomktanrfosfonowege (przykład 3) i estru di[2-(p-citrofecyle)ktplewege] kwasu N-(N⁶-aniboiló)cytozpn- - -ylo-acetplo-N-(2-hydroksyktylo)aminomet;molυsfbnowege (przykład 4). produkt eczpsbczone drt^^ją chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 85/14/1). Wydajność: 73%.

MS(FAB) 1605 (M+Na)⁺; -583 (M+H)⁺; 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 2,943,18 (m, 6H, p-O-CH2-CH_2-Ar); 3,26-3,95 (m, 10H); 3,75 (s, 3H, OCHb); 3,85 (s, 6H, OCH₃); 3,99-4,36 (m, 8H, p-O-CH₂); 4,75-4,92 (m, szeroki, 4H, COCH₂); 6,83-8,18 (m, 38H, Ar-H, oytezycyl-H); -0,98 i 11,03 (2s, szeroki, 2H, NH .

przykład 6. 5’-HO-C^At-P(ONPE)-C^At-P(CNPE)2

Związek tytułowy wptwerbeno sposobem analogicznym jak w przykładzie 4 z „5’MMTr-CA-p(ONpE) -CA-p(ONpE),” (przykład 5). produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 85/14/1). Wydajność: 74%.

MS (FAB) 1332,4 (M+Na)+ 1310,3 (M+H)+.

przykład 7. Ester dlktylewy kwasu N-(4-metoksp^,trifecylomktoksy)etyleamicometacofosfonowego

Związek tytułowy wptwerzoce sposobem analogicznym jak w przykładzie -f, lecz z użyciem tesferpnu dietylu. Wydajność: 87,5%.

' MS(FAB) 490,2 (M+Li)+. ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,22 (t, 6H, CH2CHj); 2,80 (t, 2H, N-CH2); 2,91 (d, J = 12,5 Hz, 2H, p-C^); 3,02 (t, 2H, CH2-OMML··); 3,75 (s, 3H, OCHb); 4,01 (dq, 4H, pO-CH,); 6,84-7,45 (m, 14H, Ar-H).

przykład 8. Ester dietyJmy kwasu N-tpmin-1-ple-acetpIo~N-(4-metoksytrifecplemeteksp)etyleaminometanofosfecewege

Do 2,04 g (4,22 mmola) estru dletylewege kwasu N-(4-meteksytriieny lorneto osy) etyleαmicometίatofosfonowego (przykład 7) rozpuszczonego w 50 ml absolutnego DMF dodano

184 920

570,3 mg (4,22 wmola) hyerokęybenzotrinzulu (HOBT), 972,1 mg (8,44 wwola) NEM, 777 mg (4,22 wwola) kwasu 2-(tymidin-1-ylu)uceowegu i 639 mg (5,06 wwola) diizoprupylukarSudiimidu. Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozpuszczono w DCM, wyekstrahowano wodnym nasyconym, roztworem NaHCO3, a potem wodnym nasyconym roztworem NaCl i wysuszono (N^SOd, a rozpuszczalnik odparowano. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EA/metanul/TAA 98/2/1). Wydajność: 2,47 g (90%).

MS (FAB): 662,3 (M+Na)+ 656,3 (M+Li)*, ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,12-1,32 (w, 6H, CH2-CHO; 1,68 i 1,75 (je. s, 3H, T-CH3); 3,10-3,40 (w, 2H, CH2OMMTr); 3,53-3,70 (w, 4H, P-CH + N-CH2); 3,75 (s, 3H, OCH3); 3,83-4,16 (m, 4H, PO-CH2); 4,62 i 4,72 (jew. s, 2H, CO-CH2); 6,83-7,42 (w, 15H, Ar-H, T-H); 11,28 (s, 1H, NH).

Przykład 9. Sól erietylonmoniowa estru wunoetyluwegu kwasu N-tywin-1-yloncetylo-N-(4-metoksyt:rifenylumetoksy)etyloawinumpeanofoęfonubego

Przeprowadzono w stan suspensj! 811 mg (1,25 wwola) estru dieeyluwego kwasu N-tymin-1-ylo-ncetylu-N-(4-meeokęytrifenylometoksy)etylonwinuwpt;nsofosfonowego (przykład 8) w 3,75 ml 1N NaOH. Całość wieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, a następnie w 50°C przez 6 godzin. Mieszaninę reakcyjną wysuszono pod próżnią, a pozostałość oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (AA/wetnnul/TAA 100/10/10, a potem 100/40/10). Wydajność: 897 wg (99,5%).

MS (ES-): 620,4 (M-H)- ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,18 (t, 9H, NCH2CH3); 1,68 i 1,74 (2s, 3H, T-CH₃); 2,96-3,08 (q, 6H, N-CH_?-CH₃); 3,35 (w, 2H, N-CH_?); 3,433,70 (d, J = 11 Hz, 2H, P-CH2); 3,63 (t, 2H, CR-OMMTrj; 3,75 (s, 3H, OCH₃); 3,78 (dq, 2H, PO-CH2); 4,60 i 4,86 (2s, 2H, CO-CHZ); 6,82-7,41 (w, 15H, Ar-H, T-H); 11,24 (s, 1H, NH).

Przykład 10. Ester dietyloby kwasu N-tymin-1-ylUiacetylUiN-(2-hydroksyletyloaminomptnnofosfonowegu

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym jak b przykładzie 4 z estru dietylowego kwasu N-tymin-1 -ylo-ncetylo-N((4-metoksyrrifimylometukzy)etylolWlinometnnufosfonuwego (przykład 8). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol 90/101, wydajność: 80%.

MS (FAB): 400,1 (M+Na)⁺; 378,1 (M+H)*. ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,17-1,32 (w, 6H, CR-CH,); 1,78 (s, 3H, T-CH3); 3,40-3,69 (w, 4H, CH2-OH + N-CIĄ); 3,89 (d, J = 11Hz, 2H, P-CH₂); 3,92-4,19 (w, 4H, PO-CH2); 4,70 (s, 2H, CO-CH₂); 4,98 (t, 1H, OH); 7,22 i 7,30 (2s, 1H, T-H); 11,25 (s, 1H, NH).

Przykład 11. Ester difenylowy kwasu N-(4-meeoksyerifenylometoksy) etyloawinuwptnnufusfunobegu

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym jak w przykładzie 1f, lecz z użyciem fosforynu dietylu. Wydajność: 100%.

MS(FAB) 58,2 (M+Li)*.

Przykład 12. Sól trietylonwoniuwα estru munofenyluwego kwasu N-tymin-1-ylOi acptylo5N-(4-wetokęytrifenyloweeokęy)etyloaminomeeanufosfonuwego.

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym jak w przykładzie 8 z estru difenylowego kwasu N-(4-metokęytrifenylumetoksy)etylonwinuwetnnofosfonobegu (przykład 11) i kwasu 2-(tywidyn-1-ylu)octuwegu. Produkt oczyszczono drogą, chromatografii na żelu krzemionkowym (AE/wetanol/TAA/H,O 90/10/-5/0,5). Wydajność: 47%.

MS (FAB): 682,3 (M+2Li-H)+ Ή-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,16 (t, 9H, NCH2-CH3) 1,67 i 1,72 (2s, 3H, T-CH₃); 2,96-3,70 (w, 12H, N-CH2-CH3 + N-CPA + P-CH2 + CH2-OMMTrr; 3,75 (s, 3H, OCH3); 4,58 i 4,88 φ, 2H, CO-CH₂); 6,74-7,46 (m^CH, Ar-H, T-H); 11,23 (s, 1H, NH).

Przykład 13. Ester f'enyluwo-[6-(4-nitrofesylu)etyΊuwy] kwasu N-tymin-byloncetylo-Ni(4-wPtokęytπfesyk)wetuk.ęy)etyloawinowetαnofUsfosubpgu

Trzykrotnie bępółodpnrubnnu 385,4 wg (0,5 wwola) soli trietyloawoniowej estru monufenylowego kwasu N-tymin-1 -ylu-aceeylo-N-(4-metoksyrπfesylometuksy) ρtyloammometanufuęfunubpgu (przykład 12) i 92 mg (0,55 wwola) 4initrofpnyloetnnulu z absolutną pirydyną a następnie rozpuszczono w 15 wl absolutnej pirydyny. W temperaturze 0°C dodano 403,4 mg

184 920 (0,15 mmola) 3-mtro-1-(p-toluilbsulfooylo)-1H-1,2,4-tridrolu (TSNT) i cdtbeć mieszano w 0-5°C przez 16 godzin. Pirydynę oddestylowano pod próżnią, a pozostałość wyekstruhowuoo EE, u następnie przemyto kolejno wodnym nasyconym roztworem NUHCO3 i roztworem NuCl. Produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/TEA 100/2). Wydajność: 162 mg.

MS (FAB): 831,3 (M+2Li-H)⁺; (M+Li)).

Przykład 14. Ester di[2-(p-oitrofenylo)etylowy] kwusu N-tymin-1-ylb-ucetyk)-N(4-metoesytrifenylometoksyjetylbumioometdaofosfoaowego

Związek tytułowy wytworzono sposobem a^^ogicznym juk w przykładzie 8 z estru di[2-(p-oitrofenylo)etylowegb] kwasu N-(4-metoesytrifenylometoksy)etylouminbmetuoofósfonowego (przykład 1f) i kwusu 2-(tymidyn-1-ylb)octowego. Wydajność: 63%.

MS (ES+) n 898,4 (M+Li)· Ή-NMR 2200 MfflZn DMSCk TMiS) n δ = 1,65 n 1,72 C2s, 3H , T-CH₃); 2,96 (t, 4H, P-O-CĄ-CHj-Ar); 3,06 (t, 2H, N-CH_?,); 3,67 (d, J = 11Hz, 2H, P-CH2); 3,70 (m, 2H,MMMr-O-ClC_?); 3fi~3 5, 3H, OCH₃); (ń, 3H,OCH₃); fo40 0dt, 4H, P-OCH2); 4,59 i 4,62 (2s, szeroki, 2H, CO-CH₂); 6,83-8,18 (m, 23H, Ar-H, T-H); 11,30 (s szeroki, 1H, NH.

Przykład 15. Sól trietyloamoniowu moooestru 2-(4-nitrofenylo)etylowegb kwusu N-tymin-1 -yło-acetylo-N(44-meloksytrifeoylometoesy) etyklumiobmetunofosfonl)wego.

15u) W mieszaninie 1 ml TEA, 1 ml dioksanu i 80 mg p-oitrobenzuldoksymu rozpuszczono 30 mg estru difenylo-['2-(4-oitrofeoylo)etylbo^regb] kwusu N-tymin-1-ylb-ucetylb-N-(4metbksytrifenylometbksy)etyloumiobmetanofosfoobwegb (przykład 13) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Rozpuszczalnik odparowano pod próżnia u pozostałość współodparowunD trzykrotnie z pirydyną i dwukrotnie z toluenem. Pbzostutbeć oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/TEA 100/2, u potem EE/metuiol/TEA 60/40/2). Wydajność: 23 mg.

MS (FAB): 755,3 (M+2Li-H)) Ή-NMR (250 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,15 (t, 9H, NCH2-CH3); 1,60 i 1,79 (m, 3H, T-CH₃); 2,80-3,60 (m, 14H, N-CH2-CH3 + N-CH2 + P-CH2 + CH^OMMTr + Ar-CH); 3,73 (s, 3H, OCH₃); 4,01 (dt, 2H, P-O-C^); 4,58-4,92 (m, 2H, COCH2); 6,82-8,18 (m, 19H, Ar-H, T-H); 11,30 (s, 1H, NH) .

15b). Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym juk w przykładzie 3 z estru di[2-(p-oitrofenylo)etylowegb] kwusu N-tymin-1-ylo-ucetylo-N-(4-·metoksytrifenylbmetoksy)etyloumioometdκlfosfoobwego (przykład 14) z użyciem pirydyny juko rozpuszczalniku. Wydajność: 82%. Duoe spektroskopowe tukie sume jak w przykładzie 15u.

Przykład 16. Kwus N-tymio-1-ylb-uoetylb-N-(4-metbksytrifenylometoksy)etylbuminometaQofosfonbwy

Związek tytułowy wytwbrrbnb sposobem analogicznym jak w przykładzie 15b. Juko produkt uboczny otrzymano z wydajnością 18% kwus N-tymio-1-ylo-ucetylb-N-(4metoksytrifenyloInetoksy)etyloumiobmetaoofosfboowy.

MS (ES-): 592,2 (M-H)'.

Przykład 17. 5’-M'MTr-T-P(O-etylb)-T-P(O-etylo)2

Dwukrotnie wspókldpurbwuoo z absolutną pirydyną 361 mg (0,5 mmolu) soli trietyloumooiowej estru mbobetyklwego kwusu N-tymin-1-ylb-ucetylo-N-(4-metoksytrifeoylbmetoesy)etykluminometanofosfonowegb i 188,7 mg (0,5 mmolu) estru dietylowego kwusu N-tymio-1-ylb-ucetylo-N-(2-hydroesyetylo)umioometdolfosfonowegb, a oustępnie całość rozpuszczono w 10 ml absolutnej pirydyny. Do mieszaniny dodano w 5-10°C 1,5 mmola TSNT i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Pirydynę odparowuno pod próżnią, u pozostałość rozpuszczono w EE i przemyto eblejnb wodnym nasyconym roztworem NUHCO3, u potem roztworem NaCl. Po wysuszeniu (Nu₂SC4) i zatężeniu produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/metunol/TEA 92/8/2). Wydujobeć: 223 mg (46%).

MS (FAB): 987,5 (M+Li)) ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Charakterystycznymi sygnałami były: Ar-H i H tyminy: 6,82-7,43 (m, 16H); CO-CH2; 4,59-4,78 (m, 4H); CH3 tyminy: 1,63-1,80 (m, 6H)

184 920

Przykład 18. 5’-HO-r-P(O-etolo)-T-PO-etolu)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznom jak w przykładzie 4 z 5’MMTr-T-PPO-etylo)-T-P(0-ey/lo)2 (przykład 17). Produkt uczoszczuhu drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 85/15/2, a potem 100,/50/1,5). Wydajność: 95%.

MS (FAB): 731,2 (M+Na)+ 709,1 (M+H). ¹ H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Charakterystycznymi sygnałami boty: H tymmy: 7,21-7,36 (m, 2H); CO-CH,; 4,60-4,76 (m, 4H); CH3 oraamyi 1,63-1,79 (mą 6H).

Przykład 19. 5’-MMTrrT-PPO-fenylo)-T-P(0-etolo)2

Związek tyt^^<^^wo wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z estru diety lowego kwasu N-tymm-1-ylo-acetolo-N-(2-hydruksoetolu)ómihumetónofosfonowego (przykład 10) i soli trietyloómoniuwej estru muhufeholowego kwasu N-tomih---oluacetolu-N-(4-metoksytrifeholometokso)etoloómmumetóhofosfohUwego (przykład ,2). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 93/7/2). Wydajność: 58%.

MS (FAB): 1051,4 (M+Na)⁺; 1029,5 (M+H)⁺. Ή-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Charakteiystycznymi sygnałami były: Ar-H i H tymmy: 6,82-7,53 (m, 21H); CO-CH 4,52-4,82 (m, 4H); CH3 Omimy 1 1,62-1,80 (mą 6Hy

Przykład 20. Ester di[2-(4-mtrofenylo)etylowy] kwasu (N-tomin-1-olo-acetolo-N(2-Oydrokoetylu)óminumefcórofosfonowego

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z estru di[2-(p-nitrofenylo)etylowegu] kwasu M-tomm-1-ylo-ócetolu-N-(4-metoksytrifenolumetoksy)etyluómmumetónofosfonowegu (przykład 14). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol 90/10). Wydajność: 85%.

MS (ES+) : 620,3 (M+H)⁺. ‘H-NMR (500 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,73 (s, 3H, T-CH3); 2,97 (t, 4H, P-O-CH2-CH2-Ar); 3,41 (m, 2H, N-CH₂); 3,59 (m, 2H, CH_?-OH) ; 3,83 (d, 2H, J = 11 Hz; P-CH₂); 4,08-4,30 (m, 4H, P-0-CH₂); 4,54 i 4,78 (2s, szeroki, 2H, COCH2); 4,99 (t, 1H, OH); 7,14-8,19 (m, 9H, Ar-H, tymidonyl-H); 11,30 (s, szeroki, 1H, NH).

P r z y k ł a d 21. 5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(O-etylu)2

Związek tytułowy wotwornuho sposobem analogicznym do opisanego · w pzzykaadzie 17 z estru dietolowego kwasu N-tomih-1-ylu-ócetolo-N-(2-hydruksyetylu)amihumetónufosfunowego (przykład 10) i soli trietyϊoómohiowej‘ munoestru 2-(4-nitrofenylo)etyłowego kwasu N-tymin-1-olo-acetolo-N-(4-metoksotrifehylumetokso)etyloómihometórofosfonowego (przykład 15). W reakcji sprzęgania zamiast TSNT użyto 3-hitro-1-(2,4,6-triizoprupylufenolosulfonylo)-1H-1,2,4-triózulu (TIPSNT). Produkt oczyszczono droga, chromatografii na żelu krzemionkowom (EE/metanol/TEA 95/5/2, a potem 90/10/2). Wydajność: > 90%.

MS (ES+): 1109,0 (M+Li). Ή-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Charakterystycznomi sygnałami były: Ar-H i H tymmy: 6,82-8,18 (m, 20H); CO-CH2: 4,51-4,76 (m, 4H); CH3 tymino: 1,61-1,78 (m, 6H).

P r z o k ł a d 22. 5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznom do opisanego w przykładzie 21 z estru aietyluwegu kwasu N-tymm-1-ylo-ócetylo-Nty2-hy<—uksyetylo)óm.nomefóhufusfuhuwegu (przykład 10) i soli trietyloómohiuo'ej munoestru 2-(4-mtrofenylo)etyyowego kwasu Ntymin-1-olu-acetyloN-(4-metokyztrifenylometukso)etyloóminomefcótofosfonowego (przykład 15). W reakcji sprzęgania zamiast TSNT użyto 3-nitro-1-(2,4,6-triizupropylofenylo-sulfohylo)-1 H-1,2,4-triazolu (TIPSNT) . Wydniność: >90%. Dme spekUyaUouowe takie smine jak w przykładzie 21

P r z o k ł a d 23. 5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Związek tytułowy wotwurzohu sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z „J5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂” (przykład 22). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu areemiohkuwom (EE/metanol/TEA 90/10/2, a potem 80/20/2). Wydajność 75%.

MS (ES+) : 836,3 (M+Li). 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Charakterystycznymi sygnałami były: Ar-H i H tomino: 7,11-8,22 (m, 6H); CO-CH2: 4,55-4,77 (m, 4H); CH₃ tymino: 1,71 (s, szeroki, 6H).

184 920

P r z y k ł a d 24. 5'-HO-T-P(OH)-T-P(O-ety1c)2

W 1 ml 0,5M roztworu DBU w pirydynie rozpuszczono 10 mg (0,012 mmolu) ,,5’-HOT-P(ONPE)-T-P(OEt)₂” (przykład 23), u następnie całość mieszano w 4°C przez 24 godziny, u potem w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią, pozostałość waekctsuhowuno dwukrotnie pentanem i dwukrotnie eterem, a następnie produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/metunol/TEA 9/1/0,2, a potem 70/30/2 i w końcu 60/40/2). Wydajność: 10,2 mg.

MS (FAB) : 725,3 (M+2Nu-H)⁺; 703,3 (M+Na). ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Charakterystycznymi sygnałami były: H tyminy: 7,15-7,70 (m, 2H); CO-CH2: 4,67-4,92 (m, 4H); Ch₃ tymimy: 1,67-1,81 (m, 6H).

P r z y k ł a d 25. 5'-MMTr-T-P(ONPE>T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy wetwcszonc sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂” (przykład 22) i soli tsietyloumcbiowej mcncectru 2-(4mtrofenylo)etylowego kwasu N-tymin-1 -y1l)-αcetylc-N-(4-metokcytsifenylomktokca)kty1cuminometonofosfonowego (przykuł 15) z domieszką 1,5 równoważnika N-tlenku 4-metokcapisydyna (cttzamanegc jak w przykładzie 23). Produkt ccjaczczonc drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metunol/TEA 90/l0/2, a następnie 85/15/2). Wydajność: 61%.

MS (ES+) : 1555,8 (M+H)+. Ή-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Chur;Urtecystycznami sygnałami byty: Ar-H i H tyminy: 6,83-8,20 (m, 25H); CO-CH₂: 4,52-4,75 (m, 6H); CH3 tyζ1^: 1,61-1,78 (m, 9H).

P r z y k ł ud 26. 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z „5'-MMTs-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-TP(OEt)2” (przykład 25). Produkt onzaczczcnc drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 70/30/2). Wydajność 89%.

MS (ES+): 1283,1 (M+H)+ 1305,0 (M+Na)+.

P r z y k ł a d 27. 5'-MMTr^'^-^'P^’ONP^^)-toi^^(^:^]^^^))-^'^-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy watwoszonc sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-TP(OEt)2” (przykład 26) i soli trietyloumontowej monoestru 2-(4-bitsofenylo)ety1owkgo kwasu N-temm-1-y1c-acety1c-N-(4-meicAcytsifeba1cmetokcy)ety1oαmibometanofcsfonowegc (pszakłαd 15) z domieszką 1,5 równoważnika (ctrzamanego jak w przykładzie 23) N-tlenku 4-metoksypiredany. Produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/metarol/TEA 90/10/2, a potem 80/20/2). Wydajność: 15%.

MS (ES+) : 2007 (M+H)⁺; 2029 (M+Na)+ Ή-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Chusakteeystycznami sygnałami były: Ar-H i H taminy: 6,79-8,21 (m, 30H); CO-CH2: 4,53-4,87 (m, 8H); CH3 tamiba: 1,58-1,89 (m, 12H).

Przykład 28. 5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)_?

Związek tytułowy wetwcszcnc sposobem unutogicznym do opisanego w przykładzie 4 z „5'-MMTr-T-lP(OlNPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂” (przykład 27). Produkt oczyszczono chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 70/30/2). Wydujność 55%.

MS (FAB): 1735 (M+H)+ 1757 (M+Na)+

P r z y k ł u d 29. 5'-MMTs-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2

Związek tytułowy wetwotzcbc sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z estru di[2-(4-mtsofenylo)etylowegoJ kwasu N-tymin-1-y1c-uceta1c-N-(2-hydroksyetyto)αmibomktunofosfcnowegc (przykład 20) i soli irietyloamomowej monoectsu 2-(4-nitrofeny1o)ety1cwegc kwasu N-tymin-1-y1o-ucety1o-N-(4-metcksytsifeny1cmetoksy)ety1oamibcmetanofosfonowego (przykład 15). Produkt ocjycjczcno drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 100/0/1, a potem 90/10/1). Wydajność: 87%.

MS (FAB): 1356,2 (M+2Li-H)+ Ή-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). ChurU^l^eir^.stycznami sygnałami były: Ar-H i H tymmy: 6,82-8,18 (m, 28H); CO-CH2: 4,50-4,71 (m, 4H);

CH3 tyminy: 1,59-1,78 (m, 6H).

489 920

P r z y k ł c d 30. 5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(GNPE)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z ,,5’-DMTr-T-P(GΪNPE)-T-P(ONPE)₂” (przykład 29). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemioiOiowym (EE/metanol/TEA 85/15/1, a potem 80/20/1). Wydajność 78%.

MS (ES+) : 1072,7 (M+H)+. 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS). Chauakesystycznymi sygosłcmi były: Ar-H i H tyminy: 7,08-8,20 (m, 14H); CO-CH2: 4,52-4,80 (m, 4H); CH3 tymioy: 1,70 (s, szeroki, 6H).

Przykład 31. 5’ -CA-P (ONPE) -C^As-P(ONPE)2

Związek tytułowy wytwerzooo sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z soli tristylocmooiowsj monosstuy 2-(p-oitrofenylo)etylowngo kwasu N-(N6-cnizoilo) cytozyo-1 -yle-ccntylo-N-(4-metoksytrifenylometoksy)etylopmioometaoofosfooowsgo (przykład 3) i ,,5’-MG-CAs-P (ONPE)-CAs-P (ONPE)2” (przykład 6). Produkt oczyszczono drogą chromatografii oa żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 80/19/1). Wydajność: 66%.

MS (FAB): 2155 (M+H)+ 2161 (M+Li)- 2177 /M+Na)+.

P r z y k ł a d 32. S^OCC-P (ONPE)-CA-P(GNPE)-CAs-P(GNPE)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem anaCogiczoym. do opisanego w przykładzie 4 z „5’-DDTu-CA-P(GNPE)-CAs-P(ONPE)-CA-P(ONPE)2” (przykład 31). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 85/15/1, a potem 80/20/1). Wydajność 70%.

MS (FAB): 1882 (M+H)- 1904 (M+Na)+

Przykład 33. Ester dillowo-IZ-łp-oitrofenyloetylowy] kwasu N-(Nl-pnizeilo) cytezyn-1-yla-acetylo-N-(4-metoksytU.fnnylomsteksy)stylocminometanofosfonowego

Związek tytułowy wytworzono sposobem anajogiczoym do opisanego w przykładzie 17 z soli moooestuy 2-(p-oitrofenyio)etylowego kwasu N-(N6-cnizoilo) cytezyo-1 -ylo-ccetylo-N-(4~metoesytrifeoylomstoesy)ntylocmιmometPoofosfooowego (przykład 3) i alkoholu allilewege. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 95/5/1).

MS (ES+): 902,1 (M+H)- 924,1 (M+Na)+. 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS) δ = 2,94-3,70 (m, 8H, P-0^-CH2-CH₂-Au + DDTu-O-CM2 + N-CH_? + P-CH₂); 3,75 (s, 3H, OCH₃); 3,86 (s, 3H, OCH3); 4,10-4,60 (m, 4H, P-0-CH,); 4,79 i 4,84 (2s, szeroki, 2H, COCH2); 5,02-5,39 (m, 2H, H₂C=CH-); 5,71-6,00 (m, 1H, H₂C=ęH-); 6,83-8,19 (m, 24H, Ar-H, cytozynyl-H); 11,03 (s, szeroki, 1H,nH).

Przykład 34. Ester alillowo-[2-(p-oitrofenylo)etylowy] kwasu N-(N6-^iizoilo) cytozyn-1 -ylo-ccetylo-N-(2-hyruoksystyk))amioomet;anofosfooowsgo

Związek tytułowy wytworzono sposobem anaCogiczoym do opisanego w przykładzie 4 z estru alinowo-[2-(p-oitro fenyloetylowego] kwasu N-(N6-anizeile)cytozyn-1-yle-acetylo-N(4msteksytufenylometokey)etylopminomet;psofosfonowego (przykład 33). Produkt oczyszczono drogą chromatografii oa żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 94/5/1). Wydajność 83%.

MS (ES+): 630,2 (M+H)+. ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 3,02 (t, 2H, P-OCH2-CH₂-Ar); 3,27-2,72 (m, 4H, 3,86 (s, 3H, OCH3); 3,91 (d, J =11 Hz, 2H,

P-CH₂); 4,22 (dt, 2H, P-O-CH₂-CH_?-Au); 4,40 (dd, 2H, G-CH₂-CH=CH_?); 4,78 i 5,01 (m, 2H, CO-CH2); 5,11-5,33 (m, 2H, H₂C=CH--; 5,71- 6,00 (m, Ή^^^-); 6,99-8,21 (m, 14H, Ar-H, cytezyoyl-H); 11,03 (s, szeroki, 1H, NH).

Przykład 35. Ester dlilowo-[2-(p-nitrofenyloetylowy] kwasu N-tymin-1-yleccetyle-N-(4-meteesytrifenylomntoksy)etylocminometanofosfeoowsgo

Związek tytułowy wytwouzone sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z soli tuetylocmeoiowej monoestuy 2-(4-nituefsoylo)etylowngo kwasu N-tymio-1-ylo-acetyloN-(4-metaesytrifsnylometoesy)styleaminomet;psofosfonowego (przykład 15) i alkoholu allilewngo. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu erzelcieoeowym (EE/metanol/ /TEA 97/3/2). Wydajność 100%.

MS (FAB): 805,3 ^+^)+.

Przykład 36. Ester allilewo-[2-(p-oitrofsoylo)stylowy] kwasu N-tymio-1-ylaccstyle-N-(2-hyrueksystylo)aminomstcnofesfeoewege

-84 920

Związek tytułowy wytworzono sposobem acalogicbnym do opisanego w przykładzie 4 z estru allilewo-[2-(p-mtrefecyle)etylewege] kwasu N-tymlc-1-ylo-acetplo-N-(4-metoysptrifenylometolysy)etyleaminomktacofosfecewego (przykład 35). produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA. 90/10/2). Wydajność 86%.

MS (ES+): 511,1 (M+H)⁺.

p r z y k ł a d 37. 5’-MMTr-T-PpOOTE>T-PpOWEXO-allil0)

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie -7 z estru allilowo-[2-|p>-nitrefknplo)etplewkge] kwasu N-tymic-1-ylo-acktylo-N-(2hydroteyetylojammometaofosfonowego (przykład 36) i soli Metylo-l-amoniowej mecoestru 2-(4-cltrefecylo) etylowego kwasu N-tymic---yle-acktρlo-N-(4-metoksytrifknylemeteksp) etyloammometimofosfonowego (przykład -5). produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 90/10/2). Wydajność: 90%.

MS (FAB): -257,3 (M+Na)+.

przykład 38. 5’-MMTr-T-p(ONpE)-T-j^i(O^^;)^T-^p(ONpE)-T-p(ONpE)-T-p(OEt)_ł

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie -7 z „5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ΌNPE)-TP(CEt)2” (przykład 28) i soli trietyloamonϊewej monoestru 2-(4-nitrofenylo)etylonego kwasu N-tpmlc-1-ple-aoe-tyle-N-(4metoksytrifecylometoksp)etyloammemetacofosfenowege (przykład 15). produkt eobpszczone drogą chromatografii na żelu yrzetnieckonym (EE/metmol/TEA 80/20/2). Wydajność: 57%.

MS (FAB): 2460 (M+H)⁺; 2482 (M+Na)’.

przykład 39. 5’-HO-T-P(CNPE)-T-P(CNPE)-T-P(ONPE)-T-P(CNPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z ,,5’-M.MTr-T-P(CNPE)-T-P(CNPE)-T-P(CNPE)-T-P(ΌNPE)-T-P((CEt)₂” (przykład 38). produkt eczyszczoce drogą chromatografii na żelu krzkmieckonym (EE/metanol/TEA 70/30/2). Wydajność 55%.

MS (FAB): 2209 (M+Na) + przykład 40. 5’-HC-T-P(CH)-T-P(CH)-T-P(<CH)-T-P(OH)-T-P(CEt)₂

W 1,1 ml 0,5M roztworu DBU w pirydynie rozpuszczono 4,0 mg (0,00183 mmola) „5’HC-T-P(CNPE)-T-P(ONPE)-T-P(CNPE)-T-P(CNPE)-T-P(CEt)₂” (przykład 39) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Mieszaninę re<a^«^;yj^^ odparowano pod próżnią, a pozostałość poddano mieszaniu z toluenem. Rozpuszczalnik usunięto za pomocą strzykawki, a pozostałość zmieszano z pentanem, po czym rozpuszczalnik usunięto za pomocą strzykawki. produkt wysuszono pod próżnią. Otrzymano 4 mg silnie hlgreskopijnego proszku.

MS (ES-): -589,7 (M-H-)- -611,8 (M+Na-2H)przykład 41. 5^,-MMTr-T-P(ClN»E)-T-P(OΪN^>E)-T-P(CNPE)-T-P(ONPE)-Tp(ONpE)-T-p(OEt)2

a) Związek tytułowy wptwerbece sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z „5’-HC-T-P(O^ΨE)-T-P(ONPE.)-T-P(ONPE)-T(CNPE)-T-P(CEt)2” (przykład 39) i soli trietyloamomowej monoestru 2-(4-citrofecyle)ktplowege kwasu N-tρmm---ylo-aoktple-N-(4metoksptritenylomktoksp)etploammemetacotestecewkgo (przykład 15). produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemieckΌwpm (EE/metanol/TEA 80/20/2, a potem 70/30/2).

MS (FAB): 2934 (M+Na)+, 2957 (M+2Na-H)⁺, 2978 (M+3Na-2H)⁺.

b) Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicbcpm do opisanego w przykładzie -7 z ,,5’-HC-T-P(ONPE)-T-P(CNPE)-T-P(CNPE)-TP(CEt)2” (pzzykład 28) i ,,5’-MMTr-TP(CNPE)-T-P(ONPE)(OH)” (przykład 42). produkt oczyszczono dK^ę^^ chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 80/20/2, a potem 70/30/2). Frakcję zawierajece produkt odparowano pod próżnią, a następnie roztarto z pentanem i eterem. MS jak wyżej.

p r z y k ł a d 42. 5’-MMTr-T-P(CNPE)-T-P(ONPE)(OH)

W 2 ml absolutnego DCM robpuszczece 24,7 mg (0,02 mmola) ,,5’-MMTr-Tp(0NpE)-T-P(ONpE)(O-alli’o)” (przykład 37) i 16,2 mg (0,12 mmola) b'ederewęglacu diktyleamocio'bege. Do tego roztworu w 15-20°C nkroplece w ciągu 2 minut 13,9 mg (0,012 mmola) tetrakis(tri.ienylofosfima)panadu(00) i 2,1 mg (0,008 mmola) w 2 ml

184 920 absolutnego DCM. Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 80/20/1, a potem 60/40/1). Frakcję zawierającą produkt odparowano pod próżnią, a pozostałość roztarto kolejno z pentanem, EE/eterem i pentanem i wysuszono pod próżnią. Wydajność: 57%.

MS (ES-): ‘‘93,6 (M-H)-. ’HMR (200 MHz, DMSO, τMS).ChaoskteIystyczne sygnały: δ = 1,67 i 1,71 (2s, 3H, T-CH₃); 4,60 i 4,82 (2s, 2H, CO-CH_?); 6,83-8,19 (m, 24H, Ar-H, T-H).

Przykład 43. 5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPEa-T-P(ONPEa-T-P(ONPEa-TP(ONPE)-T-P(OEt)₂

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂” (przykład 41). Po reakcji mieszaninę reakcyjną zatężono, a pozostałość trzykrotnie współ^odparowano z toluenem i zmieszano najpierw z EE/eterem, a potem z pentanem. Pozostałość wysuszono pod próżną

MS (FAB): 2662 (M+Na)+

Przykład 44. 5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-slliloa

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z 5'-MMTr-T-PpONPE))T-P(ONPE)(0-sllilg) (przykład 37). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 90/10/1, a potem 80/20/1). Wydajność 87%.

MS (FAB): 963,0 (M+H)⁺; 985,1 (M+Na)*.

Przykład 45. 5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)

a) 5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-aiiiloa

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie ‘7 z ,,5’-HO-T-P(0NPE)-T-P(ONPE)(O-slliloa” (przykład 44) i soli trietylosmomgwej mono estru 2-(4-nitrśfenylo)etylowegś) kwasu N-tymi.n---ylg-acetylo-N-(4-metoksytoifenylgmetoesyaetylgaminometaofosfonowego (przykład ‘5). Produkt oczyszczono drogą, chogmstoąrsfii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 90/10/1, a potem 85/15/1). Wydajność: 55%.

b) 5’-MMTr-T-P (ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH) „5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-alliloa” (przykład 45a) poddano reakcji sposobem opisanym w przykładzie 42 z użyciem trSlάs(trifenylofosfina)pailsdu(0a. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 80/20/2, a potem 70/30/2). Frakcję zawierającą produkt odparowano pod próżnią, a pozostałość roztarto z pentanem i eterem. Wydajność: 98%.

MS (ES+; LiCl): 1654,1 (M+Li+ .

Przykład 46. 5’-MMTr-T-P(ONPE>T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Związek tytułowy wytworzono sposobem anidogicznym do opisanego w przykładzie 17 z estru dietylgwegg kwasu N-tymin-1-ylg-acetylo-N-(2-hydroksyetyloaam^ngmetangfosfonoweąg (przykład 10) i ,,5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)>” (przykład 45b). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 90/‘0/2, a potem 80/20/2). Obróbkę, oczyszczanie i charakterystyki przeprowadzono jak w przykładzie 27.

Przykład 47. 5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-TP(ONPE)-T-P(OEt)₂

Związek tytułowy wytworzono sposobem snalogicznym do opisanego w przykładzie 17 z ,,5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂” (przykład 26) i ,,5’-MMTr-T-P(ONPE)-TP(OnPE)-T-P(ONPE)(OH)” (przykład 45b). Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 80/20/2). Frakcję zawierającą produkt odparowano pod próżnią, a następnie współgdpsrgwsno z toluenem i poddano preparatywnej HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa): (RP8 LiChrospher 60, wgda/scetonitryl (1:1); 0,1% octanu amonowego; 1 ml/min), R_f = 12,97 min.

P rzy k ła d 48. 5’-HO-T-P(OHa-T-P(OHa-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OHa-T-P(OEta₂

a) 5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPEa-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem snSogicznym do opisanego w przykładzie 4 z ,,5’-MMTr-T-P(O^N’E)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-TP(ONPE)-T-P(ONPEa-T-P(OEta₂” (przykład 47).

184 920

Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metu^ol/TEA 70/30/2, a potem 60/40/2). Frakcję zawierającą produkt odputowunc pod próżną a pozostałość mieszano najpierw z pentanem, u potem z eterem i wysuszono pod próżnią. Wydajność: 100%.

MS (FAB) : 2662 (\ENaE 2684 (M+ŻNa-H)'; 2706 (M+3Na~2H)2 b) 5 ’ -J^(O-'T-l^P(^1^--'^-I^Pi^l^;^-^'^-l^(^(^I^)--r-i^P(O^))^r-l^P(^T^H--^-i^P(^]^t)) ,,5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONTPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2” (przykład 48u) poddano działaniu DBU i obróbce sposobem analogicznym juk w przykładzie 40.

MS (ES-): 1892 (M-H-)'; 1915 (M+Nu-2H)'.

Przykład 49. 5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z „5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-TP(OEt)₂” (przyAad 28) i ,,5'-MMTr-TP(0NPE--T-P(ONPE)-T-P(0NPE)(OH)” (przykład 45b). Produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krjkmicnkcwym (EE/metanol/TEA 80/20/2, u potem 70/30/2). Frakcję zawierającą produkt odparowano pod próżnią, a następnie wcpółodpasowunc z toluenem i poddapo pαrlaratkwnuj HHLC: PRP8 I^R^/hrospł^ίίrl5<P, woda/ccrtumtk)l il:l)i 1,1)4: 0Ct%iu amonowego; 1 ml/min), R_f = 15,24 min.

MS (FAB): 3386 (M+Nu)+ 3409 (M+2Nu-H)).

Przykład 50. 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-PPONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ON^rPE)T-P(ONPE)T-P(OEt)₂

Związek tytułowy HatHctzcno sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 4 z ,,5-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OlNP))-T-P(O]NPE}-T-P(O]NPE)-T-P(ONPE)-TP(OEt)2” (przykład 49). Produkt cnjacznzcnc drogą odparowania pod próżnią i trzaAotbegc wcpółcdpαroHuniu z toluenem, u pozostałość miecjunc najpierw z pentanem, u potem z eterem i wysuszono pod próżnią. Wydajność: > 90%.

MS (FAB): 3114 (M+Nu))

Przykład 51. 5'-HO-T-P(OH')-'^^P(^Oi^)-'^k|^p,^]^;^.^·^..p_{(^j^).^T-^-^((^fH^-T-P(OH)-TP(OEt)2 „5'-HO-T-P(ONPE--T-P(ONPE--T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T'P(OlNPE)-T-P(ONPE)-TP(OEt)2” (przykład 50) poddano działaniu DBU i obróbce sposobem analogicznym juk w przyAudzie 40.

MS (ES-): 2196 (M-H-)'; 2218 (M+Nu-2Hr.

Przykład 52. 5’-MMTr-T-PpOϊN>E)-T-PpOON^>E)-T-PpOłN’E)-T-P(ONPE)-TP(ONPE--T-P(ONPE)-T-P(ONPE--T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Związek tytułowy HatHOszcbc sposobem unaiogiczbam do opisanego w przykładzie 17 z „5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE--T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OE))₂” (przykład 48a) i ,,5'-MMTr-T-P(ONPE--T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH-” (przykład 45b). Produkt ocjacjnzcbc drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 70/30/2, u potem 60/40/2). Francję zawierającą produkt odparowano pod próżnią, u następnie współodpurowuno z toluenem i poddano prepurutywnej HPLC: (RP8 LiChrospher60, wcdu/ucktonitta1 (1:1); 0,1% octanu umoncHegc; 1 ml/min), R_f = 23,95 min.

Przykład 53. 5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH--T-P(OH--T-P(OH--T-P(OH)-T-P(OH)-TP(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2

u) 5’-HO-T-P(ONTE)-T-P(ONTE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T--P(ONPE)-'T-P(ONPE)T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)₂

Związek tytułowy Hy)HoszobO sposobem unaiogicznym do opisanego w przykładzie 4 z ,,5'-MMr-T-P(OłNPE)-T-P(ONPE)-T-P(O]N’E))T-PPOiNPE)-T-P(O]N>E)-T-P(ONPE)-TPXONPE)-T-P(OONΈ)--T-P(OE))₂” (przykład 52). Produkt oczyszczono drogą odparowania pod próżnią, i trzykrotnego H·cpółodpasoH'umu z toluenem, u pozostałość mieszunc najpierw z pentanem, u potem z eterem i wysuszono pod próżną Wydajność: > 90%.

b) 5' -HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-PPOH)-T-P((OH-T-PPOJH)-T-P(Oi-)-TP(OEf)₂

184 920 „0’iHO-τ-P(ONPA)-T-P(ONPA)-T-P(ONPA)-T-P(ONPA)-TiP(ONPA)-T~P(ONPE)-TP(ON?E)iT-P(ONPA)-T-P(OAe)2” (przykład 53a) poddano działaniu DBU i obróbce sposobem analogicznym jak w przykładzie 40.

MS (ES-): 2802 (M-H-)’; 2825 (M+Na^H)’.

Przykład 54. Ester di[2-(p-nitrofenylo)etyloby] kwasu 2-(N’-t-Sueokęyknrbunyloamino)etyloαwinoweeαnofosfonowego

a) 1iMetyluiwino-2-(N’-t-butokęyknrbonylunwmo)etnn (triwer)

W trakcie chłodzenia lodem 2,0 g (12,5 wwola) 2-amino-1-(N’-t-Sutoksykarbonyloawiso)etanu rozpuszczono w 8 ml metanolu i dodano 1,52 ml (18,72 wwola) 37% roztworu formaldehydu, a następnie całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Pozostałość roztworzono w EE, przemyto dwukrotnie nasyconym roztworem NaHCO3, a potew roztworem NaCl, wysuszono, przesączono i odparowano pod próżnią. Produkt oczyszczono drogą, chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/TEA 100/0,2, a potew AA/wetanol/TΈA 90/10/0,2). Wydajność 0,8 g.

MS (FAB/LiCI) 523,4 ^+^^+ ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,38 (s, 27H, tBu-H); 2,40 (t, 6H, N-CH2); 2,99 (t, 6H, N-CR); 3,25 (t, 6H, N-CH2); 6,81 (t, szeroki, 3H, NH).

b) Ester di[2-(p-nitrofenylo)etyluwy] kwasu 2-(N^,it-butoksyknrbonyloawiso)etyloaminowpt.αnofosfonowegu

1-Metyluiwino-2-(N’-t-butokęykarbonyluawino)etnn (trimer) (przykład 54a) poddano działaniu fosforynu ei[2-(4-nitrofpnylu)etylu] (przykład 1e) zastosowawszy sposób podany w przykładzie 1f. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (najpierw tolśes/AA/TEA 20/80/0,2, a potem eE/TEA 100/0,2, a następnie EE/metanol/TEA 0,5/5/0,2). Wydajność: 25%.

MS(ES+LiCl) 553,3 (M+H)*, 559,3 (M+Li)+ ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,37 (s, 9H, tBu-H); 2,83 (d, J =12 Hz, 2H, P-CH₂); 2,55 (t, 4H, ArCH₂) ; 2,90-3,09 (w, 4H, N-CH2-CH2-N); 4,16 (dt, 4H, PO-CH2); 7,52 i 8,15 ,(2d, 8H, Ar-H).

Przykład 55. Ester di[2i(a-sitrufenylo)etyloby] kwasu Ni-tymini1iylOiαcetylu-Ni (2-N’-t-bśtoksykaIbonylo;arwino)etylo-ίnwinow.et;arofosfonobego

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 8 z estru di [2-(p-nitrofenylo)-etylobego] kwasu 2i(N’it-Sśtoksyknrbonyloamiso)etyloamisometnnofusfonubegu (przykład 54b) i kwasu 2i(tywidyn-1-ylo)-octowegOi Wydajność, 86%.

MS (FAB/LiCl): 725,3 (M+Li)+ ‘H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 1,42 (s, 9H, tBuH); 1,91 (s, 3H, T-CHj); 2,99-3,58 (w, 8H, P-O-CR-CR-Ar i N-CR-CR-N); 3,75 (d J = 12 Hz, 2H, P-CR); 4,06-4,38 (w, 4H, PO-CH2); 7,37 i 8,15 (2<R8H, Ar-H).

Przykład 56. Oddziaływanie z DNA: krzywa topnienia UV

Wzajemne oddziaływanie związków według wynalazku z komplementarnymi kwasami nukleinowymi zademonstrowano przykładowo drogą wyznaczenia krzywej topnienia UV dla e5’-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)--TiP(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-TP(OH)-TPfOER” (przykład 53b) z (dA)₉. W tym celu wytworzono 0,3 OD r,5’-HOiT-P(OH)-Ti P(OH)-TiP(OH)-T-P(OH)iT-P(OH)-T-P(OH)-TiP(OH)-T-P(OH)-T-P(OAe)2” i (dA)g w 1 ml buforu (1M NaCl, 20 wM MgCĄ, 10 mM HEPES, pH 7,5) i wyznaczono zmiany ekstynkcji przy 260 nw w zależności od temperatury (od 0). Wyniki ilustruje fig. 1, przedstawiająca zalyżność abęurbnncji UV od temperatury dla PMENA-t9] w obecności 1 róbnubnPnika (dAR Z otrzymanej krzywej topnienia wyznaczono wartość Tm dla około 23 °C.

Przykład 57. Oddziaływanie z DNA: próba z chromatografią żelową

Wzajemne oddziaływanie związków według wynalazku z komplementarnymi kwasami nukleinowymi zademonstrowano przykładowo drogą hybrydyzacji ^'‘HO-T-P^Hj-TP(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)iTiP(OH)-TiP(OH)-T-P(OH)-TiP(OH)-T-P(OEt)2” (przykład 53b) z (dA)9 w próbie zrealizowanej z użyciem chromatografii eeluwej. W tyw celu ,,5’-HO-Ti P(OH)iTiP(OH)iT-P(OH)-T-P(OH)-TiP(O^-TiP(OH)-T-P(OH)-TiP(OH)-T-P(OAt)2” (przykład 53b) i (dA)9 sasiρęiusu, osobno lub w wipszaninip (1:1, 1:2, 1:5 lub 1:10), na niyzdenatśrobany żel auliakrylnwieoby (20%, bufor rozwijający 1 x TBE, 1,0 wM MgCl₂) i zbadano arzewieęzcznsie się substancji. Wynik przedstawia fig. 1, przedstawiająca chro184 920 matogram żelowy stanowiący dowód na wiązanie się PMENA z DNA: (dA) poruszał się szoWcieC niż ,,5’-HO-r-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-r-P(OH)-TP(OH)-T-P(OEt)2”, jednak w mieszaninie 1:1 trudno to było zaobserwować, powstało natomiast jedno wolniejsze pasmo odpowiadające kompleksowi utworzonemu przez te dwa składniki. W mieszaninie 2:1 nie widać już było (dA)₉, natomiast nowe pasmo było jeszcze WardnieJ widoczne. To samo dotyczyło mieszanin 5:1 i 10:1, w których dodatkowo było widać nadmiar „5’-HO-r-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-TP(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2”.

Przykład 58. 5’-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(O-etolo)2 (patrz także alternatywne syntezo z przykładu 21)

a) W 0,3 ml absolutnego DMF rozpuszczono 8,44 mg (10 tymoli) soli trietyluómohioweJ munuestru 2-(4-mtro.feholo)-etylowego kwasu N-tymin---yio-acetylo-N-(4-metoasotrifehylumetoksy)etoloómihometónofbsfohowego (przykład 15), 3,77 mg (10 tymoli) estru dietylowego kwasu N-tzmin---ylu-ócetolo-N—(2-ho'droksyeiylo)aminomeitalhOoufonowegu (przykład 10) i 64,6 mg (500 tymoli) N-etylodiizupropylómihy (DIPEA), a następnie dodano 44,2 mg (100 tymoli) Oeksófluurofosforóhu (Wenzotri;óeoloilo1asy)tris(dimetyloióoino)fosfΌniowego (BOP). Całość mieszano w temperaturze pokoJuo'ej przez 24 godziny. Po chromatografii (EE/metanol/TEA ,00/20/2; Rf = 0,5) otrnomónu produkt z wydajnością około 70%.

b) Zastosowawszy sposób analogiczny jak w przykładzie 58a, lecz z użyciem 30 tymoli HATU (heksófluorofosforóru O-(7-ónabenzotri&eol-1-ilu)-N,N,N’,N’-terfcaoetylóuroniowego) zamiast 100 tymoli BOP, otrzymano po chromatografii produkt z wydajnością ukułu 65%.

Przykład 59. Ester [2-(p-nitrofenylo)etylowo]-[5’-(3’-lewuluilutomidyholowo] kwasu N-tymin-1 -ylo-ócetylo-N-{4-metokso1r·ifehylometuaso)etoloóminometóhufusfbhUwegu

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z soli trietyloamomowej munuestru 2-(4-nitrofenylo1etylowego kwasu N-tomih-1-olo-ócetyloN-(4—metoksotrifehylometoasy)etyloóminometarofbsfbnowego (przykład 15) i 3’-lewuluilutymidyny. Produkt ucnyszczunu drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (DCM/ /metanol/TEA 98/-2/0,25). Wydajność 46%.

MS (FAB/LiCl): 1071,4 (M+Li).

Przykład 60. Ester [2-(p-nitrofenylo)etolowo]-(5’-tomidynzlowo) kwasu N-tyminl-ylu-ócetylu-N-(4-metoksotrifenylumetoksy)etoloóminometólofosfonowegu

W 0,5 ml dioksanu rozpuszczono 64 mg (0,06 mmola) estru [2-(p-hitrofehylu)etylowo][5’-(3 --iewu1ol1olymidyny1owegoa suasu N-tym-z- o -ylot0ceN-04N-(4-mstoksyhoóunyłometuksy)etyloómmometónofosfohowego (przykład 59) i dodano 9 mg (0,23 mmola) NóBh w 0,12 ml wody, a następnie całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią, a pozostałość roztworzono w DCM, woeaytró0owóhu wodą i wysuszono. Produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemiohauwom (DCA/metanol/TEA 92/8/0,5). Wydajność 72%.

MS (FAB/LiCl): 973,4 (M+Li) 979,4 (M+2Li-H)+ 985,4 (M+3Li-2H)+

Przykład 61. Ester [2-(p-nitrofenylo)etylowo]-[5’-tomidorylo-[3’-(cyjóhuetyluN,N-diizopropolofusfunoamiaynuwo)] kwasu N-tymin-1 -ylu-acetylo-N-(4-metuksztrifenylumetoksy)-etoluaminumetahofosfohowego

Dwukrotnie współodpórowónu 31 mg (0,032 mmola) estru [2-(p-hitrofenylo)etylowo](5 ’-tymidyholuwego) kwasu N-tymin-1 -ylo-acetylo-N-(4-metoksotrifehylumetoksy)etoloammumetarofbsfbhowegu (przykład 60) z absolutnym CH₃CN, a następnie całość rozpuszczono w 0,4 ml absolutnego THF. Dodano następnie 12,4 mg (0,096 mmola) diizopropo2oetytoammo, a potem 9,8 mg (0,045 mmola) N,N-diizupropyluc0lorofbfosfonuóOlidyhu cyjametylu. Mieszaninę mieszano przez 3 godziny, przesączono i odparowano pod próżnia. Wydajność 63%.

MS (FAB/LiCl) : 1173,3 (M+L), 1180,4 (M+2L--H, 1186,4 MU33L--2H)2

Przykład 62. Ester di[2-(p-mtrofenylo)etylowo] kwasu N-[N9-(O6-aifehzlokórWómoilu)-N-2-acetoluguómholo]acetylo-N-(4-metoasotrifenylometokso)etyloóminometanofosfohuwegu

184 920

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do odpisanego w przykładzie 2 z estru di[2-(p-mtrofenylo)etylbwegb] kwasu N-(4-metoesytrifenylometbesy)etylbuminbmetunofosfonowego (przykład 1f) i kwusu O6-difenylokurśdnoilo-N2-ucetyloguuoinylooctowego. Produkt oczyszczono drogą chromatografii oa żelu krzemionkowym (EE/TEA 98/2). Wydajność: 87%.

MS (FAB/LiCl): 1154,8 (M+H)) 1160,7 (M+Li)).

Przykład 63. Ester diPTp-nitrofeayhfoetylowy] kwusu N-[N9-(N4uoizbilbudeomyld)ucetylb-N-(4-metoesytrifeoylometoksy) etyloummomettdlofosfonowegb

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 2 z estru di[2-(p-mtro-enyło)etylowegb kwusu N-(4-metoesytri-eoylbmetoesy)etylbumiobmetuno-bs-bnowegb (przykład 1f) i kwusu N4-doirbilbudeoioylooctbwego. Produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (DCM/metanol/TEA 95/4/1). Wydajność: 82%.

MS (ES+): 1035,7 (M+H)) 'H-NMR (200 MHz, DMSO, TMS): δ = 2,93 (t, 4H, P-OCH2-CH2-Ar); 3,09 (t, 2H, MMTr-O-CH₂); 3,23-3,75 (m, 4H, P-CH + N-CH2); 3,75 (s, 3H, OCH,) ;3,87 (s, 3H, OCH3); 4,08 (dt, 4H, P-O-CHJ; 5,28-5,42 (m,2H, CO-CH₂); 6,81-8,20 (m, 28H, Ar-H, A-H); 11,00 (s szeroki, 1 H, NH).

Przykład 64. Mono-ster [2-(p-nitrofenylo)etyfowy] kwusu N-[N9-(N4-uoizoilbudeoinylb]ucetylo-N-(4-metoksytrifenylometoksy)etylouminbmetunofosfonowego

Związek tytułowy wytworzono sposobem unulogicznym do opisanego w przykładzie 3 z estru di[2-(p-nitrofenylo)etylowegb] kwusu N-[N9-(N4-unizoiloudeoi.nykl]ucetylb-N-(4metoesyrifenylometoksy)etylbuminometdlolbsfonowego (przykład 63). Produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 65/35/2). Wydajność 52%. MS (FAB/LiCl): 874,3 (M+2Li-H)+.

Przykład 65. Ester di[2-(p-oitro fenyloetylowy] kwusu N-tymio-1-ylo-ucetylo-N(2-metoksy)etylouminbmetunofbsfonbwego

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 2 z estru di[2-(p-nitrofenylo)etytowego] kwusu N-(2-metoesy)etylbuminbmetdnofosfonbwego (zastosowawszy sposób analogiczny juk w przykładzie 1, 2-metoesyety)bumioę poddano dziułuniu formaldehydu i fosforynu di [2-(4-nitrofeoyto)etylu]) i kwusu 2-(tymidio-1yfo)octowego. Produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/metunol 90/10). Wydajność: 64%.

MS nbAB/LiCrl: 640,3 (M+Li)+

Przykład 66. 5’-MMTr-CA..p(CNPE)-C^Al-P (ONPE)(O-unifo)

Związek tytułowy wytworzono sposobem unufogicznym do opisanego w przykładzie 17 z soli tr(etyloumombwej mbooestru 2-(p-aitrofenylo)etyklwegb kwusu N-(N6-umzbilb) cytoryn-1-y)o-ucetylo-N-(4-metoksytrifeoyklmetoesy)etyklumioometdaofosfonowegb (przykład 3) i estru ullilowo-[2-(p-mtrofenykl)etyklwego] kwasu N-(N⁶-unizbilo)cytozyo-1-ylo-ucetylo-N(2-hydroesyety)o)uminometalofosfooowegb (przykład 34). Produkt oczyszczono drogą chromatografii nu żelu krzemionkowym (EE/metunol/TEA 85/14/1). Wydajność: 36%.

MS (FAB): 1474 (M+H); 1496 (M+Nu)+.

Przykład 67. 5’-HO-CAi-P(0NPE)-CA-P(0NPE)(O-allil0)

Związek tytułowy wytworzono sposobem unulogioznym do opisanego w przykładzie 4 z „5’ -MMTr-C^Ai-P(ÓNPE)-C^Ai-P(ONPE)(O-ullilo)” (przykład 66). Produkt oczyszczono drogą chromatografii ou żelu krzemionkowym (EE/metunol/TEA 80/19/1). Wydajność 55%.

MS (FAB): 1201,3 (M+H), 1223,3 (M+Nu).

Przykład 68. 5’-MMTr-CAi-P (CNPE)-CAr-P(ONPE)-CAl-P(ONPE)(O-ullilo)

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z soli trietyloumootowej moooestru 2-(p-aitrofeoyto) etylowego kwusu N-(N⁶uaizoilo) cytozyn-1 -yloracetylo-N(44-meloksytriίenylometoksyjey)kdmnnometunbfosfbll(lwego (przykład 3) i 5’-H0-CAl-P(CNPE)-CAr-P(ONPE)(O-ullilo) (przykład 67). Produkt oczyszczono drogą chromatograf ii nu żelu krzemionkowym (EE/metunol/TEA 80/20/1). Wydajność: 58%.

MS (FAB): 2046 (M+H)-; 2068 (M+Nuy.

184 920 przykład 69. 5^,-MMTr-C^Λt-P(ONPE)-C^At-P(CNPE)-C^Al-P(ONPE)(OH)

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 42 z 5’-MMTr-CA-P(CNPE)-CA-P(CNPE)-CA-P(CNPE)(C-aililo) (przykład 68). produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 60/38/2). Wydajność: 66%.

MS (FAB): 2027 (M+Na)⁺; 2049 (M+2Na-H)+.

przykład 70. 5’-MMTr-CA-P(ONPE)-CA-P(CNPE)-C^At-P(ONPE)-C^At-P(ONPE)CA-p(ONpE)-CA-p(ONpE)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie -7 z „5’-MMTr-C^At-P(CNPE)-CA-P(CNPE)-C^At-P(CNPE)(OH) (przykład 69) i „5’-HO-CAP(CNPE)-C^At--P(CNPE)-C^At-P(cNPE)2” (przykład 32). produkt eczpszczone drogą chromatografii na żelu krzkmlenkenym (EE/metanol/TEA 70/30/2). Wydajność: 58%.

MS (FAB): 3892 (M+Na)⁺; 3914 /M+2Na-H)+.

przykład 71. 5’-MMTr-T-PpOCN>E)-T-P(ONpE)-T-p(ONpE)-CA-p(ONpE)-CAp(ONpE)-C^ac-p(ONpE)2

Związek tytułowy wytworzono sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 17 z „5’-MMTr-T-p(ONpE)-T-p(ONpE)-T-p(ONpE)(OH)” (przykład 45) i „5’-HO-CAP(ONPE)-C^At-P(CNPE)-C^At-P(CNPE)2” (przykład 32). produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 60/40/2). Frakcję zawierajeoe produkt edparowαce pod próżnią i poddano preparatyncej HpLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa): (Rp8 LiChresphkr 60, weda/aoktecltrpl (1:1); 0,1% octanu amonowego; 1 ml/min); Rf = 16,6 min.

MS (FAB): 3534 (M+Na)⁺; 3556 (M+2Na-H)+.

przykład 72. 5’-MMTr-T-P(CH)-T-P(OH)-T-P(OH)-CA-P(OH)-CA-P(CH)-CAp(OH)₂

Związek tytułowy nptwerzone sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie 40 z „5 ’-MMTr-T-P(CNPE)-T-P(ONPE)-T-P(^NPE)-CA-P(CNPE)-CA-P(ONPE)-C^Atp(ONpE)2’ (2 mg) (przykład 71).

MS (ES-): 2466,4 (M-H).

p r z y k ła d 73. 5’-MMTr-T-P(O¾-T-P(O]H-T-PpOH))C-P(O¾-C-P(OH)-C-P(CH)2

Do około 1,0 mg „5’-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-C^λt-P(OH)-CA-P(OH)-C^χtP(CH)2” (przykład 72) dodano 3 ml 33% wodnego roztworu Nh₄OH i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną odparowano pod próżnią. Wydajność: około 0,6 mg (19 OD).

MS (ES-): 2064,5 (M-H)'.

przykład 74. 5’-HO-T-p(OH)-T-p(OH)-T-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)-C-p(OH)2

W 8 ml wody rozpuszczono 8 OD ,,5^,-MMTr-T-PpOH))T-PpOH)-T'P(OH)-C-P(OH)C-P(CH)-C-P(OH)2” (przykład 73) i nprewαdbene po^pak™ (Glen Research, nr 60-1100-0). Grupę MMTr edszczeplene zgodnie z mstrukcóą podaną w (Glen Research User Guide). Wydajność: około 0:35 mg (11 OD).

MS (ES-): 1792,6 ((M-H)-.

przykład 75. 5’-MMTr-C^At-P(ONPE)-C^At-P(ONPE)-C^At-P(ONPE)-T-P(ONPE)-Tp(onpe)-t-p(onpe)₂

Związek tytułowy wytworzono sposobem analoglcbcpm. do opisanego w przykładzie 17 z ,,5’-MMTr-CA-p(ONpE)-CA-p(ONpE)-CA-p(ONpE)(OH)” (przykład 69) i ,,5’-HO-Tp(ONpE)-T-p(ONpE)-T-p(OEt)2” (przykład 26). produkt oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (EE/metanol/TEA 80/20/2, a potem 70/30/2). Frakcję zawierającą produkt wspó^p^^^ z toluenem pod próżnią i roztarto z pentanem. Wydajność: 48%.

MS (FAB): 3744 (M+Na)⁺; 3766 (M+2Na-H)+.

184 920

Protokół sekwencji

Informacje ogólne

Liczba sekwencji: 33

Dane komputerowe:

(A) Nośnik informacji: dyskietka (B) Komputer: PC kompatybilny z IBM (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: PatentIn Release nr 1,0, Version nr 1,25 (EPA) (1) Informacje na temat sekwencji nr 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 1:

ACACCCAATT CTGAAAATGG 20 (2) Informacje na temat sekwencji nr 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy

184 920 (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji.: Sekwencja nr 2:

AGGTCCCTGT TCGGGCGCCA (3) Informacje na temat sekwencji nr 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 28 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..28 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 3:

GTCGACACCC AATTCTGAAA ATGGATAA (4) Informacje na temat sekwencji nr 4:

(i) Charakterystyka sekwencji.:

(A) Długość:: 25 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson

41ί84 Ύ-Ό (B) Położenie: 1..25 (v) Opis seJcwencji: Sekwencja nrr 4:

GCTATGTCGA CACCCAATTC TGAAA 25 (5) Informacje na temat sekwencji nr 5:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 26 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..26 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 5:

GTCGCTGTCT CCGCTTCTTC TTCCTG 26 (6) Informacje na temat sekwencji nr 6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny!: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..27 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 6:

GTCTCCGCTT CTTCTTCCTG CCATAGG 27 (7) Informacje na temat sekwencji nr 7:

184 920 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 7:

GCGGGGCTCC ATGGGGGTCG (8) Informacje na temat sekwencji nr 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..15 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 8: CAGCTGCAAC CCAGC (9) Informacje na temat sekwencji nr 9:

(i) Chaaakttrystyya sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza

184 920 (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..21 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 9:

GGCTGCTGGA GCGGGGCACA C (10) Informacje na temat sekwencji nr 10:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..15 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 10:

AACGTTGAGG GGCAT 15 (11) Informacje na temat sekwencji nr 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

184 920 (A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..18 (v) Opis selkwencji: Selkłencja nar 11: GTGCCGGGGT CTTCGGGC (12) Informacje na temat sekwencji nr 12:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..21 (v) Opis sekwencji.: Sekwencja nr 12: GGAGAACATC ATGGTCGAAA G (13) Informacje na temat sekwencji nr 13:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie;: 1..22 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 13:

CCCGAGAACA TCATGGTCGA AG

184 920 (14) Informacje na temat sekwencji nr 14:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy!:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 14:

GGGGAAAGCC CGGCAAGGGG (15) Informacje na temat sekwencji nr 15:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 15:

CACCCGCCTT GGCCTCCCAC (16) Informacje na temat sekwencji nr 16:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy

184 920 (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysrnsoeny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..18 (v) Opis sekwencji.: Sekwencja nr 16:

GGGACTCCGG CGCAGCGC (17) Informacje na temat sekwencji nr 17:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) A^y^^owny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: e^on (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 17: GGCAAACCTTT CTTTTCCTCC (18) Informacje na temat sekwencji nr 18:

(i) Charakterystyka srkerncji:

(A) Długość: 19 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antssensoeίns: tak

184 920 (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..19 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 18: GGGAAGGAGG AGGATGAGG (19) Informacje na temat sekwencji nr 19:

(i) Charakterystyka sekwencja.:

(A) Długość:: 21 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..21 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 19: GGCAGTCATC CAGCTTCGGA G (20) Informacje na temat sekwencji nr 20:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..18 (v) Opis sekwencji.: Sekwencja nr 20:

184 920

GCAGTAAGCA TCCATATC (21) Informacje na temat sekwencji nr 21:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 21: CCCCCACCAC TTCCCCTCTC (22) Informacje na temat sekwencji nr 22:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 22: CTCCCCCACC ACTTCCCCTC (23) Informacje na temat sekwencji nr 23:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 19 par zasad

184 920 (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..19 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 23:

GCTGGGAGCC ATAGCGAGG (24) Informacje na temat sekwencji nr 24:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..21 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 24:

ACTGCTGCCT CTTGTCTCAG G (25) Informacje na temat sekwencji nr 25:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy)

184 920 (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..22 (v) Opis sekwencji.: Sekwencja nr 25:

CAATCAATGA CTTCAAGAGT TC (26) Informacje na temat sekwencji nr 26:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 19 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS {genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..19 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 26:

GGTCCCTGTT CGGGCGCCA (27) Informacje na temat sekwencji nr 27:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość:: 17 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie;: 1..17

184 920 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 27: GTGCCGGGGT CTTCGGG (28) Informacje na temat sekwencji nr 28:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 17 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..17 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 28:

GGAGGATGCT GAGGAGG (29) Informacje na temat sekwencji nr 29:

(i) Charakterystyka sekwencji.:

(A) Długość: 14 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysensowny: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..14 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 29:

GGAGGATGCT GAGG (30) Informacje na temat sekwencji nr 30:

(i) Charakterystyka sekwencji.:

184 920 (A) Długość:: 19 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Anyssrnsowzns: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..19 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 30:

CAGGAGGATG CTGAGGAGG (31) Informacje na temat sekwencji nr 31:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Postać nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowy (ii) Rodzaj cząsteczki: DNS (genomowy) (iii) Antysrnsoens: tak (iv) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..15 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 31: GGCTGCCATG GTCCC (32) Informacje na temat sekwencji nr 32:

(i) CharrkayrystySa straencji:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..20 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 32: TCATGGTGTC CTTTGCAGCC (33) Informacje na temat sekwencji nr 33:

(i) Charakterystyka sekwencji.:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Położenie: 1..18 (v) Opis sekwencji: Sekwencja nr 33:

TCATGGTGTC CTTTGCAG

184 920

Wzór 1

2 R I -C- I 3	-M-	2 R I -Οι 3
_R		R

Wzór 2a

R R C^—HM^-)—CΡ--'q

-Q' n

/

C \^K γ

s ^H2^L ^D^_G ^xX^g¹

Wzór 3

Wzór 2b 5 ^R\ ₆>=o

R

Wzór 4

X-S / —G

Wzór 5b

Wzór 5a

X

184 920 ² Υ s—X’ II >-Η S—X”

Wzór 6a

S—X’

-Y—L

S—X” Wzór 6b

Y Ί S—X< I I I S-Χ „XeD Wzór 7 ³ ,/θ R R

S—X\

PR

Y A s—X’ II | ₁

Wzór 9

PR

A

I2 L

Wzór 8

PR

Η-Χ _p5/\_R ^{6 θ} X

R

Wzór 10

PR s—x

S-Χ _r5/\_r6 ^D X

Wzór 11

184 920 ο

Wzór 12

Wzór 13

S* s^: \/

η

Wzór 14

184 920

Υ S—χ\ II

A—Β

PR j /Ρ —η^θ'-γ

S—X s/i „ ^{d χ}

Γ\ —'

Wzór 15

Υ ΑS—Χ* II I

S-Χ” ₆ ^R R

PR

-Β d^^gx

Wzór 16 ^χ; ζ_ζ ^γ α-β ⁷ R ^χ; ζζ^γ α-β

PR

PR fT^LD^GX⁵Λ^β γ

s—X’ Λ

PR ,Χ -y\>r

SS-SPACERWzór 17

184 920

Wzór 20

184 920 x/WVX—

Wzór 21

PR

S—X’

S—X ⁵/*\

Wzór 23

Wzór 22

Wzór 24

Wzór 25

184 920

Wzór 26 Wzór 27

Wzór 28

Wzór 29

184 920 *CZ5

Ο

A©

A*<® *_«*

-Λ··

Sfaiss» £.

mM HEPES, 20 mM MgCI₂; 1M NaCl; pH 7,5 0,47-j

0,46 0,450,440,430,420,41 -|-1-1-1-1-1-1-1-1-1

10 20 30 40 50 60 70 80 90

Temperatura [°C]

184 920

([P-t9]-[(dA)g]) [P-t9] [«IA)9l [(dA)g]: [P-t9] Z

OJ

LD

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowe Nodogi nliggnuklgotydów o dóólnym wnomeL w którwn n ozmicza liazba odOdo 100; B niezależnie oznaczają atom wodoru, hydroksyl, Cj-Co-alkil, C,-C₂₀-alkoksyl, grupę Cj-C2alkilotio, C₆-Cx-&yl, C₆-C2o-arylo-Ci-C2-alkil, C₆-C₂o-aty]^^C₁-C₆-alkoksyl, grupę C-C^-atylo-CC₆-alkilotio, przy czym alkil i/lub aryl mogą być w każdym przypadku podstawione jednym lub większą liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, C--C4-alkoksyl, -NRRó, -C(O)OH, grupę okso, -C(O)OR⁸, -C(O)NR9RO -CN, -F, -Cl, -Br, -NO2, C-Calkoksyalkil, -S(O)mR^r, -C-^-alkilo-StOCR⁸, -NHC(=NH)NHR⁸, -C(=NH)NHR⁸, -NR⁹C(=O)R.\ =NOR, -NR⁹C(=O)oR¹-, -OC(=O)NR9R^l'0 i -NR⁹C(=O)NR⁹Ró, względnie B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guanmy, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy; przy czym A-B mogą także oznaczać przyłączone poprzez karboksyl ugrupowanie D-glicyny, D-alaniny, D-waliny, D-leucyny, D-iboleucyny, D-tecylealanicy, D-proliny, D-seryny, D-neonmy, D-cysteiny, D-metioniny, D-tryptofanu, D-tyrozyny, D-asparagmy, D-glutaminy, kwasu D-asparaginowego, kwasu D-glutaminowego, D-lizyny, D-argininy, D-histydyny, L-glicyny, L-alaniny, L-waliny, L-leucyny, L-izoleucyny, L-fecyloalacicy, L-proliny, L-seryny, L-treoniny, L-cysteiny, L-metioniny, L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-asparaginy, L-glutaminy, kwasu L-asparaginowego, kwasu L-glutaminowego, L-lizyny, L-argininy lub L-histydyny; L niezależnie oznaczają N lub RÓN+; R¹ oznacza atom wodoru lub C--C6-alkil ewentualnie podstawiony hydroksylem, C--C6-alkoksylem, grupą C-^-alkilotio lub grupą aminową, korzystnie atom wodoru lub metyl; A niezalkżcik oznaczają wiązanie pojedyncze, metylen lub grupę o ogólnym wzorze 2a lub 2b, w których to wzorach Y’ oznacza =O, =S, =CH2, =C(CH₃)₂ lub =NRi, gdzie R1 ma wyżej podane znaczenie; M oznacza wiązanie pojedyncze, O-, -S- lub -NR-, gdzie R¹ ma wyżej podane znaczenie; R² i R³ niezależnie oznaczają atom wodoru, hydroksyl, a Ci-C6-lkoksyl, grupę C--C6-alkilotio, grupę aminową, atom chlorowca, taki jak F, Cl lub Br, albo C--C6-alkil, przy czym każdy alkil może być podstawiony hydroksylem, C-^-alkoksylem lub grupą C--C6-alkilotio; p i q niezależnie oznaczają liczbę od 0 do 5; r i s niezależnie oznaczają liczbę od 0 do 5; D i G niezależnie oznaczają CR5R6; R⁵ i R⁶niezależnie oznaczają atom wodoru, C-^-alkil, C6-C20-aryl, C6-C20-arylo-Ci-C6-alkil, hydroksyl, C--C6-alkoksyl lub grupę C--C₆-alkilotio, przy czym każdy alkil i aryl mogą być podstawione SRi lub NR-R-, gdzie R¹ ma wyżej podane znaczenie, a Ri ’ ma takie znaczenie j‘ak R-, z tym, że Ri i R- są w grupie NR’R-’ j'kdnakowe lub różne; X oznacza -O-, -S- lub -NR--, gdzie Ri ma wyżej pedack znaczknik; Y oznacza =O lub =S; Z oznacza -OR⁸ lub -NR⁹R'0 R⁸oznacza atom wodoru, C--Ci8-alkil, C2-C,8-alkenyl, C₃-Ci8-alkmyl, C6-Có-aryl lub C6-C20arple-Cl-C₆-alkil, przy czym alkil może być podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, C--C₄-alkoksyl, F, Cl i Br, a aryl może być podstawiony --3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej hydroksyl, C-C4alkoksyl, C_rC₄-al^ F, Cl, Br, NO2, -NR9<'0 -C(O)OH, -C(O)O-C--C6-alkil i -C^NRTR , korzystnie atom wodoru, C-^-alkil, C6-C₁l-aryl lub C6-Ci2-arylo- C,-C₆-alkil, gdzie aryl może być podstawiony C--C4-alkoksylem, Cl-C4-alkilkm, F, Cl, Br lub NO2, a szczególnie korzystnie atom wodoru, C--C₆-alkil, fenyl lub 2-(4-citrofkcylo)etyl; R9 i Rio niezależnie oznaczają atom wodoru, C_rC,8-alkil, C--Ci8-alkenyl, C--C^-alkinyl, C6-C₁--aryl lub C6-C₁2-aΓple-Cl-C6-alkil, przy czym alkil może być podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, Cl-C₄-alkoksyl, F, Cl i Br; względnie R9 i Rio mogą tworzyć wraz z atomem azotu, do którego są przyłączone pierścień o 4-7 członach; a Q i Q' niezależnie oznaczają atom wodoru lub oligocuklkotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkować lub czlśc iowO/o^zienie 3’ ólub Z^fosiodiestrowycr, np. moipkmoi fosfotiokstrowymi, fosfoditieesironpmi, NR⁴R4’-fesfoamidanenpmi, fosfe-O-metploestrobpmi,

184 920 fosfo-Oetyloestrowymi, fosfo-O-izopropyloestrowymi, metylofosfonianowymi lub fenylofosfonianowymi;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3’- lub 5’-fosfodiestrowych w pozycjach pirymidynowych i na 5’-końcu i/lub na 3’-końcu ugrupowaniem formacetalowym i/lub 3 ‘ tioformacetalowym;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowych ,”PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek p-D-2’-dezoksyrybozy 2’-F-2’dezoksyrybozą, 2’-O-C₁-C₆-alkilorybozą, 2’-O-C₂-C_ft-alkenylorybozą. lub 2’-NH₂-2’dezoksyrybozą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-(C_rC₆-alkilo)uracylem, 5-(C2-C₆-alkenylo)uracylem, 5-(C2-C₆alkinylo)uracylem, 5-{C₁-C₆-a]kilo)cytozyną, 5-(C₂-C₆~alkenylo)cytozyną, 5-(C2:-C6-alkmylo)cytozyną, 5-fluorouracylem, 5-fluorcytozyną, 5-chlorourracylem, 5-chlorocytozyną, 5-bromouracylem, 5-bromocytozyną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkinylo)guaniną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkinylo)adeniną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkenylo)gu^^iną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkenylo)adeniną 7-deaza-7-(Ci-C7-alkilo)guaniną, 7-deaza-7-(C,-C7-alkilo)adeniną, 7-deaza-7-bro-no-guulinąlub 7-deaza-7-bromoadeniną.
2. Związki według zastrz. 1 o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 50; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy; L oznacza N; A oznacza grupę o ogólnym wzorze 2b, w którym r oznacza 1, s oznacza O, R2 i R³ oznaczają atomy wodoru. Y oznacza O, a M oznacza wiązanie pojedyncze; D i G niezależnie oznaczają CHR⁵, gdzie R⁵ oznacza atom wodoru; X oznacza -O-; Y oznacza =O; Z oznacza hydroksyl, metoksyl, etoksyl, 2-(4-nitrofenylo)etoksyl, propoksyl, izopropoksyl, butoksyl, pentoksyl, fenoksyl lub alliloksyl, a Q i Q' niezależnie oznaczają atom wodoru lub oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5’-fosfodiestrowych, np. mostkami fosfotioestrowymi, fosfoditioestrowymi, NR⁴R⁴-fosfoamidanowymi, fosfo-Ometyloestrowymi, fosfo-O-etyloestrowymi, fosfo-O-izopropyloestrowymi, metylofosfonianowymi lub fenylofosfonianowymi;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3'- lub 5'-fosfodiestrowych w pozycjach pirymidynowych i na 5'-końcu i/lub na 3'-końcu ugrupowaniem formacetalowym i/lub

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowych ,”PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek P-D-2'-dezoksyrybozy 2’-F-2’dezoksyrybozą, 2’-O-C,-C₆-alkilorybozą 2’-O-C₂-C6-alkenylorybozą lub 2’-NH₂-2’dezoksyrybozą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-(C,-C6-alkilo)uracylem, 5-(C₂-C6-ałkenylo)uracylem, 5-(C2-C6alkinylo)uracylem, 5-(C,-C6-alkilo)cytozyną 5-(C₂-C6-alkenylo)cytozyną, 5-(C₂-C6-alkinylo) cytozyną, 5-fluorouracylem, 5-fluorcytozyną, 5-chlorourracyłem, 5-chlorocytozyną, 5-bromouracylem, 5-bromocytozyną 7-deaza-7-(C2-C₇-alkinylo)guaniną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkinylo) adeniną, 7-deaza-7-(C2-C7-alkenylo)guaniną, 7-deaza-7-(C2-C7-alkenylo)adeniną, 7-deaza-7(C]-C7-alkilo)guaniną, 7-deaza-7-(C,-C₇-alkilo)adeniną, 7-deaza-7-bromoguaniną lub 7-deaza7-bromoadeniną.
3. Związki według zastrz. 1 albo 2, o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 30; Q i Q' niezależnie oznaczają atom wodoru lub oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5'-fosfodiestrowych mostkami fosfotioestrowymi, fosfoditioestrowymi lub metylofosfonianowymi;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3'- lub 5’-fosfodiestrowych na 5'końcu i/lub na 3'-końcu;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

184 920

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek p-D-2'-dezoksyrybozy 2'-F-2'-dezoksyrybozą, 2'^O-C_rC₄-alkilorybozą, 2'-O-C2-C₄-alkenylorybozą lub 2'-NH₂-2'-dezoksyrybozą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-(C3-C₆-alkilo)uracylem, 5-(C2-C₆-alkenylo)uracylem, 5-(C2-C₆alkinylo)uracylem, 5-(C,-C6-alkilo)cytozyną 5-(C2-C6-alkenylo)cytozyną, 5-(C2-C6-alkinylo) cytozyną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkinylo)guanin.ą, 7-deaza-7-(C2-C₇-alkinylo)adeniną, 7-deaza-7(C2-C₇-alkenylo)guaniną, 7-deaza-7-(C2-C7-alkenylo)adeniną, 7-deaza-7-(C, - C7-alkilo)guaniną, 7-deaza-7-(C,-C7-alkilo)adeniną, 7-deaza-7-bromogu;ańnąlub 7-deaza-7-bromoadeniną.
4. Związki według zastrz. 1 albo 2, o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 25; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy; Z oznacza hydrok^l, etoksyl, 2-(4-nitrofenylo)-etoksyl lub fenoksyl; a Q i Q' niezależnie oznaczają atom wodoru lub oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5'-fosfodiestrowych mostkami fosfotioestrowymi;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek e-D-2'-dezoksyrybozy 2'-O-metylorybozą, 2'-O-allilorybozą lub 2'-0-butyloyrybozą

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-heksynylocytozyną, 5-heksynylouracylem, 7-deaza-7-propynyloguaniną, 7-deaza-7-propynyloadeniną, 7-deaza-7-metyloguaniną, 7-deaza-7-metyloadeniną, 7-deaza-7-bromoguaniną lub 7-deaza-7-bromoadeniną.
5. Związki według zastrz. 3, o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 25; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy·; Z oznacza hydroksyl, etoksyl, 2-(4-nitrofenylo)etoksyl lub fenoksyl; a Q i Q' niezależnie oznaczają atom wodoru lub oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5'-fosfodiestrowych mostkami fosfotioestrowymi;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek 3-D-2’-dezoksyrybozy 2'-Ometylorybozą, 2'-O-alliłoiyb°^z4 lub 2'-O-butyloyrybozą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-heksynylocytozyną, 5-heksynylouracylem, 7-deaza-7-propynyloguaniną, 7-deaza-7-propynyloadeniną, 7-deaza-7-metyloguaniną, 7-deaza-7-metyloadeniną, 7-deaza-7-bromoguaniną lub 7-deaza-7-bromoadeniną.
6. Sposób wytwarzania nowych analogów oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają znaczenie podane w zastrz. 1-5, znamienny tym, że a,) związek o ogólnym wzorze 3, w którym D, G, L i X mają znaczenie podane w zastrz. 1-5, a S¹ oznacza odpowiednią grupę zabezpieczającą, korzystnie dimetoksytrityl, monometoksytrityl, trityl lub piksyl, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 4, w którym R⁵ i R6 mają znaczenie podane w zastrz. 1-5, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze 0-100°C, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 5a lub 5b;

bj) związek o wzorze 5a lub 5b poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6a lub 6b, w których to wzorach Y ma znaczenie podane w zastrz. 1-5, X’ i X” sąjednakowe lub różne i mają znaczenie zdefiniowane powyżej dla X, S2 i S³ niezależnie oznaczają grupy zabezpieczające, a L’ oznacza grupę odszczepiającą się, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze 0-100°C, ewentualnie w obecności zasady, zasady kompleksowej lub nie mającej ładunku elektrycznego, peralkilowanej zasady poliaminofosfazenowej, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 7, w którym D, G, L, R5, r6, S1, S2, S³, X, X’, X” i Y mają znaczenie podane w zastrz. 1-5;

c,) związek o wzorze 7 poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 8, w którym

A ma znaczenie podane w zastrz. 1-5, B^PR ma takie samo znaczenie jak B i ewentualnie występuje w postaci zabezpieczonej, a L2 oznacza znaną grupę odszczepiającą się lub oznacza

184 920 hydroksyl, gdy A oznacza grupę o wzorze 2b, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze od -20°C do 100°C, ewentualnie w obecności zasady, zasady kompleksowej lub nie mającej ładunku elektrycznego, peralkilowanej zasady poliaminofosfazenowej lub bez dodatku zasady, w obecności znanego środka sprzęgającego ułatwiającego powstawanie wiązań peptydowych, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 9, w którym A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S¹, S², S³, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

d, ) ze związku o wzorze 9 usuwa się grupę zabezpieczającą S³ z użyciem znanych sposobów, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 10, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R⁶, S,

5², X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

e, ) ze związku o wzorze 9 usuwa się grupę zabezpieczającą S¹ z użyciem znanych sposobów, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 11, w którym A, B^pR, D, G, L, R5 R6, S2,

53, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

f) związek o wzorze 11 i związek o wzorze 10 poddaje się reakcji według znanej w chemii oligonukleotydów „metody fosfotriestrowej”, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze od -20°C do 100°C, w obecności środka sprzęgającego lub związku o ogólnym wzorze 12, w którym Ri⁵ oznacza C₆-C„-aryl, ewentualnie podstawiony

1-4 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej C_rC₆-alkil, C_rC_fc-alkoksyl, grupę nitrową, atom chloru i atom bromu i w którym 1-3 atomy węgla można ewentualnie zastąpić heteroatomami, a R16 oznacza grupę odszczepiającą się, ewentualnie w obecności katalizatora, przy czym środek sprzęgający można wytwarzać in situ lub można go wytworzyć oddzielnie i dodawać roztwór zaaktywowanych związków w odpowiednim rozpuszczalniku, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 13, w którym A, B^ra, D, G, L, R5, R⁶, S, S2, S3, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

g, ) związek o wzorze 13 poddaje się reakcji wydłużania łańcucha sposobem podanym w punktach e,) i f) do uzyskania żądanej długości tego łańcucha, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 14, w którym A, B^ra, D, G, L, R5, R⁶, S, S2, S3, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, a n ma znaczenie podane w zastrz. 1-5;

h, ) odszczepia się grupy zabezpieczające S¹, S² i S3 oraz grupy zabezpieczające w podstawniku B^pR z użyciem znanych sposobów;

po czym ewentualnie wprowadza się grupy Q i Q’ z użyciem znanych sposobów i ewentualnie otrzymany związek poddaje się cyklizacji, z wytworzeniem związku o wzorze 1.
7. Sposób wytwawytma nawych wiałogów oligonukleotudów o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają znaczenie podane w zastrz. 1-5, a n oznacza liczbę 1100, znamienny tym, że związek o ogólnym wzorze 15 lub 16, w których to wzorach A, BPR, D, G, L, R5, R6, S¹, S2, S3, X, X’, X” i Y mają znaczenie podane w zastrz.1-5, a o i p niezależnie oznaczają liczbę od 0 do 50, przy czym o + p + 1 = n, poddaje się następującym reakcjom:

a2) w związku o wzorze 15 udszcnepió się grupę zabezpieczającą S1 sposobem opisanym w punkcie e,) zastrz. 6;

b·,) w związku o wzorze 16 odszcnepió się grupę zabezpieczającą S3 sposobem opisanym w punkcie d, zastrz. 6; i ¢2) sprzęga się ze sobą tak otrzymane związki sposobem opisanym w punkcie f, zastrz. 6, z wylworrentem zzwiąz^u o ogólnym wwoo-re 14, w któóym A, BP D, G, L, R⁵, R , S¹, S², S3, X, X’, X”, Y i n mają wyżej podane znaczenie;

di) powstały związek przeprowadza się w związek o wzorze 1 sposobem opisanym w punkcie h,) zastrz. 6.
8. Sposóbwy0waozznia mwacn onolog(aw olioonukleotydów o ógaloym lh^(o'/etl w którym wszystkie podstawniki mają znaczenie podane w zastrz. 1-5, znamienny tym, że związek o ogólnym wzorze 10, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R⁶, S, S2, X, X’, X” i Y mają znaczenie podane w zastrz. 1-5, sprzęga się z użyciem znanych sposobów z mostkiem SPACER na stałym nośniku, z wytoΌreehiem związku o ogólnym wzorze 17, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R6 S, S2, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, SS oznacza stały nośnik odpowiedni do użycia w syntezie w fazie stałej, a SPACER oznacza grupę dającą się udszcnepiać od nośnika po syntezie, względnie SPACER oznacza dwufuhkcojhą cząsteczkę

184 920 koniugatową Q, którą można poprzez znaną grupę odszczepiającą się związać ze stałym nośnikiem;

b₃) ze związku o wzorze 17, w którym A, B^PR, D, G, L, R⁵, R⁶, S, S², SS, SPACER, X, X', X” i Y mają wyżej podane znaczenie, odszczepia się grupę zabezpieczającą S¹ sposobem opisanym w punkcie e,) zastrz. 6;

c₃) powstały związek poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 10, w którym A, B^PR, D, G, L, R5, R⁶, S, S2, X, X', X” i Y mają wyżej podane znaczenie, sposobem opisanym w punkcie f) zastrz. 6;

d₃) przedłuża się do żądanej długości łańcuch sposobami podanymi w punktach b₃) i c₃); e,) ewentualnie wprowadza się koniugat Q' drogą sprzęgania z użyciem znanych sposobów;

f₃) tak otrzymany związek odszczepia się znanymi sposobami ze stałego nośnika, a grupy zabezpieczające odszczepia się sposobami opisanymi w punkcie h, przy czym odszczepianie grup zabezpieczających można prowadzić przed odszczepianiem ze stałego nośnika, po czym ewentualnie wprowadza się koniugat Q drogą znanej reakcji sprzęgania, z tym, że kolejność sprzęgania koniugatów Q i Q' metodami według punktów ej) i f₃) można zmienić i ewentualnie powstały związek cyklizuje się.
9. Środek fomacfutycany zawierający substancję tzynną i nbstancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają znaczenie podane w zastrz. 1-5.
10. Nowe ćrnalogi bliconokl<cbyków y ogClcymwzoraej,w któiym n ozmanzo Hacha od 0 do 100; B niezależnie oznaczają atom wodoru, hydroksyl, Ci-C^-alkil, Ci^o-alkoksyl, grupę Cl-C2o-αlailotic, C₆-C20-αrel, C₆-C₂₀-ar/l(^-C_rC₍,-alkil, C₆-C20-asylo-Cl-C₆-alaokcyl, grupę C6-C20-arylo-C ^-alkilotio, przy czym alkil i/lub aryl mogą być w każdym przypadku podstawione jednym lub większą liczbą podstawników wabrubach z grupy obejmującej hydroksyl, Ci-C^alkoksyl, -NR9R⁰, -C(O)OH, grupę okso, -C(O)OR⁸, -C(O)NR⁹r1°, -CN, -F, Cl, -Br, -NO2, C2-C6-alaokcyαlkil, -S(O)mR⁸, -CrC₆-alkilo-S(O)t₁R⁸, -NHC(=NH)NHR⁸, -C(=NH)NHR⁸, -NRtC(=O)R8, =NOR8, -NR⁹C(=O)OR'0 -OC(=O)Nr9r^w i -NR⁹C(=O)NR⁹R^k1, względnie B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guaniny, hipoasubtany, cyozaby, uracylu lub tymmy; przy czym A-B mogą także oznaczać przyłączone poprzez karbonyl ugrupowanie D-glicyny, D-alanmy, D-waliny, D-leucaby, D-izoleucyna, D-fenyloalaniba, D-prolmy, D-cetany, D-treoniba, D-cysteine, D-metioniny, D-tsaptofabu, D-tasozyby, D-acpasagiba, D-glutaminy, kwasu D-asparaginowego, kwasu D-glutaminowego, D-lizyba, D-arglmy, D-hictadyby, L-glicyny, L-alaniny, L-waliny, L-leucyny, L-izoleucyny, L-fenyloαlabiby, L-proliny, L-ceryna, L-treoniny, L-cysteiny, L-metioniny, L-tryptofanu, L-tysozany, L-asparaginy, L-glutaminy, kwasu L-asparaginowego, kwasu L-glutaminowego, L-lizyny, L-argininy lub L-histydyny; L niezależnie oznaczają N lub R*N⁺; R¹ oznacza atom wodoru lub C,-C6-alkil ewentuUlbie podstawiony hydroksylem, Cl-C6-alkokcylem, grupą Cl-C6-alkilctic lub grupą aminową, korzystnie atom wodoru lub metyl; A niezależnie oznaczają wiązanie pojedyncze, metylen lub grupę o ogólnym wzorze 2 a lub 2b, w których to wzorach Y’ oznacza =O, =S, ^CHL, =C(CH3)2 lub =NRK gdzie R1 ma wyżej podane znaczenie; M oznacza wiązanie pojedyncze, -O-, -S- lub -NR, gdzie Ri ma wyżej podane znaczenie; R2 i Rj niezależnie oznaczają atom wodoru, hydroksyl, Cl-C6-alkokcal, grupę Ci-C6-alkilotio, grupę aminową, atom chlorowca, taki jak F, Cl lub Br, albo C,-C6-alkil, przy czym każdy alkil może być podstawiony hydroksylem, Ci-Cg-alkoksylem lub grupą C,-C6-alkilotio; p i q niezależnie oznaczają liczbę od 0 do 5; r i s niezależnie oznaczają liczbę od 0 do 5; D i G niezależnie oznaczają CR⁵R6; R⁵ i R? niezależnie oznaczają atom wodoru, Ci-C6-alkil, C6-C20-asyl, C6-C2o-asylo-Cl-C6-αlkil, hydroksyl, C,-C6-alkoksyl lub grupę C,-C6-alkilotio, przy czym każdy alkil i aryl mogą być podstawione SR? lub NRKrk, gdzie Ri ma wyżej podane znaczenie, a Ri ma takie znaczenie jak R, z tym, że R1 i Ri są w grupie NRKrk jednakowe lub różne; X oznacza -O-, -S- lub -NR,-, gdzie R¹ ma wyżej podane znaczenie; Y oznacza =O lub =S; Z oznacza -OR8, -NR9R‘o lub X'Q”, gdzie X' ma takie znaczenie jak X, a Q” ma takie znaczenie jak Q; R⁸ oznacza atom wodoru, CiC_I8-alkil, C2-C_l8-alkenyl, C3-Cl₈-alkinal, C6-Cl2-asyl lub C6-C20-a^lo-C,-C6-alkil, przy czym alkil może być podstawiony jednym lub większą

184 920 liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej , hydroksyl, C,-C₄-alkoksyl, F, Cl i Br, a aryl może być podstawiony 1-3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej hydroksyl, C^-alkoksyl, C,-C4-alkil. F, Cl, Br, NO₂, -NR⁹R¹⁰, -C(O)OH, -C(O)O-C,-C6-alkil i C^OjNR^RO korzystnie atom wodoru, C,-C6-alkil, C6-Ci2-a_ryl lub Cń-C12-arylo- C^C6-alkil, gdzie aryl może być podstawiony C,-C4-alkoksylem, C,-C4-alkilem, F, Cl, Br lub NO,, a szczególnie korzystnie atom wodoru, CrC6-alkil, fenyl lub 2-(4-nitrofenylo)etyl; R⁹ i R‘^oniezależnie oznaczają atom wodoru, ^C1^-C1 —alkil, CrC,—-alkenyl, Cj-Cn—alkinyl, C6—Cj₂—aryl lub C₆-Ci2-arylo-Ci-C6-alkil, przy czym alkil może być podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, Cj-C^alkoksyl, F, Cl i Br, względnie R9 i R¹⁰ mogą tworzyć wraz z atomem azotu, do którego są przyłączone pierścień o 4-7 członach; a Q i Q’ nie:hleżm e oznac&ijążtom wodorUjR⁸ im oligonukleotydy, eweutualnie zmodyfikowane poprzez:

u) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3’- i/lub S^fosfodiestrowych, np. mostkami fosfotioestrowymi, fosfoditioestrowymi, NR⁴R⁴'-fosfodmidunowymi, fosfo-Ometyloestrowymi, fosfo-O-etyloestrowymi, fosfo-O-iropropyloestrowymi, m-tylofosfoniunowymi lub feo.ylofosfoniuoowymi;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3’- lub 5-fosfodiestrowych w pozycjach pirymidynowych i na 5’-końcu i/lub na 3’-końcu ugrupowaniem formacetalowym i/lub 3 ’-tioformacetalowym;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosfordaowyoh „PNA” lub hybryddmi PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek e-D-2'-dezoksyrybozy 2’-F-2’dezoksyrybozą, 2’-O-Ci-C6-ulkilorybozą, 2’-O-C₂-C6-alkenylorybozą lub 2’-NH2-2’dezoksyrybozą;

e) całkowite lub częściowe zustąpi-oi- ugrupowań ud-nioy, gu^^y, hipoksuotyoy, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-(Cl-C6-ulkilo)urucyl-m, 5-(C2-C₆-ulkeoylo)urucylem, 5-(C2-C6ulkioylo)urucylem, 5-(Cl-C₆-ulkilo)cytoryoą, 5-(C2-C₆-alkenylo)cytoryoą, 5-(C2-C₆-alkmylo) cytozyną, 5-fluorourucylem, 5-fluorcytozyną, 5-chlorouracylem, 5-ohlorooytozyoą, 5-bromouracylem, 5-bromocytozyaą, 7-deuzu-7-(C2-C₇-ulkiaylo)guuoiną, 7-d-ur:u-7-(C2-C₇-ulkinylo)ud-aioą, 7-deuru-7-(C2-C₇-ulkeoylo)euuoioą, 7-deur^-7-(C2-C₇-ulkenylo)udenioą, 7-deuru7-(Cl-C₇-ulkilo)euuo.ioą, 7-deuru-7-(Cl-C₇-ulkilo)ud-nioą, 7-deuza-7-bromoguunmą lub 7-deuzu-7-bromoudeoiaą, ' z wykluczeniem związków o ogólnym wzorze 1, w którym Z oznacza -ORe lub NR9Rio, Q i Q’ oiezuleżoie oznaczają atom wodoru lub oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3’- i/lub 5’-fosfodiestrowych, np. mostkami fosfotioestrowymi, fosfoditio-strowymi, NR4R4’-fosfoumidunowymi, fosfo-O-metylo-strowymi, fosfo-O-etyloestrowymi, fosfo-O-izopropyloestrowymi, metylofosfooiuoowymi lub fenylofosfonianowymi;

b) zastąpienie jedn-go, dwóch lub trzech mostków 3’- lub 5’-fosfodi-strowych w pozycjach pirymidynowych i na 5’-końcu i/lub na 3’-końou ugrupowaniem formacetalowym i/lub 3 ’-tioformuo-tulowym;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2’-d-zoksyrybozy 2’-F-2’-dezoksyrybozą, 2’-O-Ci-C6-alkilorybozą, 2 ’-O-C₂-C6-ulk-nylolyyχ;>zą.lub 2’-NH₂-2’dkzakssyybx)zą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań udeaioy, guuoioy, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-(Cl-C6-ulkilo)uraoylem, 5-(C2-C6-dkeoylo)urdoylem, 5-(C2-C6-ulkioylo)urucyl-m, 5-(Cl-C6-ulkilo)cytozyaą, 5-(C₂-C6-alk-^;yl^)cytozyną, 5-(C2-C6-alkinyloX'ytozyną, 5-fluorouracylem, 5-fluoroytoryną, 5-ohlorΌurucylem, 5-ohlorooytozyną, 5-bromouracylem, ó-bromocytozyną, 7-deuzu-7-{C2-C₇-ulkinylo)eudainą, 7-d-uzu-7-(C2-C₇-alkioylo)udeoioą, 7-dedru -7-(C2-C₇-ulk-oylo)gujoiaą, 7-deuzu-7-(C2-C₇-ulk-oylo)ud-nioą, 7-d-ura-7-(Cl-C₇-ulkilo)euunmą, 7-deuru-7-(Cl-C₇-ulkilo)ud-niną, 7-d-uzu-7-bromogudoioą lub 7-d-uru-7-bromoudenioą, u pozostałe podstawniki A, B, D, G, L, P, X, Y, R⁵, R6 i n mają wyżej podane zoucz-oie.

184 920
11. Związki według zastrz. 10 o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 50; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guaniny, hipoksóhtono, cztozzno, uracylu lub tymmy; L oznacza N; A oznacza grupę o ogólnym wzorze 2b, w którym r oznacza 1, s oznacza 0, R2 i R3 oznaczają atomy wodoru, Y’ oznacza O, a M oznacza wiązanie pojedyncze; D i G niezależnie oznaczają CHR⁵, gdzie R5 oznacza atom wodoru; X oznacza -O-; Y oznacza =O; Z oznacza hydroksyl, metoksyl, etoksyl, 2-(4-hitrufenolo)etoksol, propoksyl, inuprupuksyl, butoksoi, pentoksyl, fenoksyl lub alliloksol, a Q i Q’ niezależnie oznaczają atom wodoru, R⁸ lub uligunUkleotodo, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3’- i/lub 5’-fusfodiestrowyc0, np. mostkami fosfotiuestruwomi, fosfoditioestrowomi, NR⁴R⁴-fosfoamidónowomi, fosfo-Ometoloestrowomi, fosfo-O-etyloestrowomi, fosfo-O-izopropoloestrowomi, metolufosfuhianowymi lub feholufosfunióhowomi;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3’- lub 5’-fosfodiestrowoch w pozycjach pirymidynowoch i na 5’-końcu i/lub na 3’-końcu ugrupowaniem formacetalowom i/lub 3‘-tlufurmócetalowym;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cu^^d^ofosfo^^owych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2’-denoksoτybueo 2’-F-2’denuksyroboną, 2’-O-C,-C6-alkilorybozą, 2’-O-C2-C6-alkeholurybozą lub 2’-NH₂-2’-dezoksorobozą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adenino, guanino, Oipoksahtoho, cytozono, uracylu lub tymino 5-(C,-C6-ólkilu)uracylem, 5-(C2-C6-ólkehylu)urócylem, 5-(C₂-C6alkino^uracylem, 5-(C,-C₆-alkilu)cztozyhą, 5-(C₂-C6-alkeholu)cytozyhą, 5-(C₂-C6-alkiholu) cotozoną, 5-fluorourócolem, 5-fluorcytuzyhą, 5-c0loruuraczlem, 5-c0lurucotozohą, 5-bromouracylem, 5-bromucytozohą, 7-deózó-7-(C2-C₇-alkihylu)guahihą, 7-deaza-7-(C2-C₇-ólkinylo) adeniną, 7-deana-7-(C2-C₇-alkehylu)guamną, 7-deanó-7-(C₂-C₇-ólkenylo)adeniną, 7-deaza-7(C,-C₇-alkilo)guóhihą, 7-deóeó-7-(C,-C₇-alkllu)adehiną₎ 7-deazó-7-bromoguónnąlub 7-deóea7-bromoademną,
12. Związki według zastrz. 10 albo 11, o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 30; Q i Q’ niezależnie oznaczają atom wodoru lub R⁸, gdzie R⁸ oznacza atom wodoru, C,^alkil, fenyl lub 2-(4-nitrufenolo)etyl albo oligonukleutody, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3’- i/lub 5’-fosfodiestrowych mostkami fosfutiuestruwymi, fosfoditioestrowomi lub metolufbsforιiahuwomi;

b) zastąpienie jednego, dwóch lub trzech mostków 3’- lub 5’-fosfodiestrowoch na 5’końcu i/lub na 3’-końcu;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowoc0 „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2’-denuksyrobony 2’-F-2’dezokszrobozą, 2’-O-C1-C4-alkilorybozą, 2’-O-C2-C4-alkenylorzbozą lub 2’-NH2-2’dezuksyroWuzą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adenino, guamno, hipoksóhtyno, cytozony, uracylu lub tymmy 5-(C3-C6-ólkilu)urócylem, 5-(C2-C6-alkenylu)uracylem, 5-(C2-C6alkrnyl^uracylem, 5-(Ci-C6-alkilo)cotozyną, 5-(C2-C6-alkehylo)cotozzhą, 5-(C₂-C6-alkinylo) cotozoną, 7-deaza-7-(C2-C₇-alklhzlo)guahihą, 7-deóeó-7-(C2-C₇-ólkmylo)ódenmą, 7-deana-7(C2-C₇-ólkeholo)guahihą, 7-deóeó-7-(C₂-C₇-alkenolo)adehlną, 7-deóZó-7-(C,-C₇-alkilo)guamhą, 7-deazó-7-(C,-C₇-alkilo)adeniną, 7-deóZó-7-bromoguóhnąlub 7-deóeó-7-Wromoadehihą.
13. Związki według zastrz. 10 albo 11, o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 25; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adenino, guamny, hίpuksóhtono, cotozono, uracylu lub tominy; Z oznacza hydroksyl, etoksyl, 2-(4-hitrufeholu)etuksol lub fenoksyl; a Q i Q’ niezależnie oznaczają atom wodoru, R8, gdzie R⁸ oznacza atom wodoru, C,-C6-alkil, fenyl lub

2-(4-hitrofenyłu)etyl,ólbu uligonukleutodo, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3’- i/lub 5’-fosfodiestΓUwycO mostkami fusfUtioestrowymi;

184 920

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowofosforanowych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek e-D-2’-dezoksyrybozy 2’-O-metylorybozą, 2’-O-alliloryboząlub 2’-O-butylorybozą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy 5-heksynylocytozyną, 5-heksynylouracylem, 7-deaza-7-propynyloguaniną, 7-deaza-7-propynyloadeniną, 7-deaza-7-metyloguaniną, 7-deaza-7-metyloadeniną, 7-deaza-7-bromogiuaiinąlub 7-deaza-7-bromoadeniną.
14. Związki według zastrz. 12, o wzorze 1, w którym n oznacza liczbę od 0 do 25; B niezależnie oznaczają ugrupowanie adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy; Z oznacza hydroksyl, etoksyl, 2-(4-nitrofenylo)etoksyl lub fenoksyl; a Q i Q’ niezależnie oznaczają atom wodoru, R⁸, gdzie R oznacza atom wodoru, C^^-alkil, fenyl lub 2-(4nitrofenylo)etyl albo oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane poprzez:

a) calkowiaelubczęściowę castąp ienie mostków 3’-i/lub 5 i/fosfodieisOdiych moschami fosfotioestrowymi;

c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletów cukrowufusfornsowych „PNA” lub hybrydami PNA-DNA;

d) całkowite lub częściowe zastąpienie jednostek β-D-2’-dezuksyrybozy 2’-Ometylorybozą, 2’iOinlliloryboząluS 2’-OiSueyluyrySuzą;

e) całkowite lub częściowe zastąpienie ugrupowań adeniny, guaniny, hipoksantyny, cytozyny, uracylu lub tyminy Oiheksynylucyeozyną, Oiheksynyluorncylem, 75dpnza5 7-propynyloguaniną, 7-denen-75prupynyloadeniną, 7-deaza-7-metyloguaniną, 7-deazn-7-mρtyluadpnmą, 7-deaea-7iSΓomoguaniną lub 7-denza-7ibromoadeniną
15. Sposób wytwarzania nowych analogów uligunukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają znaczenie podane w zastrz. 10-14, znamienny tym, że a, ) związek o ogólnym wzorze 3, w którym D, G, L i X mają znaczenie podane w zastrz. 10-14, a S1 oznacza odpowiednią grupę zabezpieczającą, korzystnie dimptuksyerieyl, monomeeuksytrityl, trityl lub piksyl, t-SutoksyknrSosyl lub fluurpnylowptuksykarbonyl poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 4, w którym R5 i R6 mają znaczenie podane w zastrz. 10-14, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze 0-100°C, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 5a lub 5b;

b, ) związek o wzorze 5a lub 5b poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6a lub 6b, w których to wzorach Y ma znaczenie podane w zastrz. 10-14, X’ i X” sąjednakowe lub różne i mają znaczenie zdefiniowane powyżej dla X, S2 i S³ niezależnie oznaczają grupy zabezpieczające, a L’ oznacza grupę odszczekującą się, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze 0-100°C, ewentualnie w obecności zasady, zasady kompleksowej lub nie mającej ładunku elektrycznego, pprałkiluwanpj zasady polinwinofosfneenowej, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 7, w którym D, G, L, R5, R6, β1, S2, S³, X, X’, X” i Y mająznaczenie podane w zastrz. 10-14;

c, ) związek o wzorze 7 poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 8, w którym A ma znaczenie podane w zastrz. 10-14, B^PR ma takie samo znaczenie jak B i ewentualnie występuje w, postaci zabezpieczonej, a L2 oznacza znaną grupę odszczepiającą się lub oznacza hydroksyl, gdy A oznacza grupę o wzorze 2b, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze od -20°C do 100°C, ewentualnie w obecności zasady, zasady kompleksowej lub nie mającej ładunku elektrycznego, ppralkilowanpj zasady poliawmofusfazenuwej lub bez dodatku zasady, w obecności znanego środka sprzęgającego ułatwiającego powstawanie wiązań peptydowych, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 9, w którym A, B^PR D, G, L, R5, R6, S¹,, S2, β3, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

dj) ze związku o wzorze 9 usuwa się grupę zabezpieczającą S3 z użyciem znanych sposobów, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 10, w którym A, B^PR D, G, L, R5, R6, S1

52, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

e,) ze związku o wzorze 9 usuwa się grupę zabezpieczającą S1 z użyciem znanych sposobów, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 11, w którym A, B^PR D, G, L, R5 R⁶, S2,

5³, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

-84 920 f,) związek o wzorze il i związek o wberzk i0 poddaje się reakcji według znanej w chemii eligenukleoipdów „metody fesfeirikstrowej”, w odpowiednim rozpuszczalniku orgacicbcpm, w temperaturze od -20°C do -00°C, w obecności środka sprzęgającego lub bwiebku o ogólnym wzorze -2, w którym Ri5 oznacza C6-Ci2-aryl, ewentualnie podstawiony --4 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej C_rC₆-alkil, C--C6-alkoksyl, grupę nitrową, atom chloru i atom bromu i w którym kb atomy węgla można ewentualnie zastąpić heteroatomami, a Ri6 obcαcza grupę edszcbepiajeoe się, ewentualnie w obecności katalizatora, przy czym środek sprzęgający można wytwarzać in situ lub można go wytworzyć oddzielnie i dodawać roztwór zaaktywewαnych związków w odpowiednim rozpuszczalniku, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze -b, w którym A, B^PR, D, G, L, R⁵, R6, S- S2, S³, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie;

g_t) związek o wzorze 1b poddaje się reakcji wydłużania łańcucha sposobem podanym w punktach e,) i f,) do uzyskania żądanej długości tego łańcucha, z wptworbknlkm związku’ o ogólnym wzorze -4, w którym A, B”R D, G, L, R5, R⁶, S- S2, Sb, X, X’, X” i Y mają wyżej podane bcaczknik, a n ma znaczenie podane w zastiz. 10-14;

h- odsbczkpia się grupy zabezpieczające S- S² i S³ oraz grupy zαbebpleozajece w podstawniku B^pR z użyciem znanych sposobów;

po czym ewentualnie wprowadza się grupy Q i Q’ z użyciem znanych sposobów i ewentualnie otrzymany zwiebkk poddaje się opklibaoji, z wytworzeniem związku o wzorze i.

-6. Sposób wytwarzania nowych a^idogów ohgenuklkeiydów o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają znaczenie podane w zastrz. 10-14, a n oznacza liczbę

1-100, bnamiknnp tym, że zwiąbkk o ogólnym wzorze -5 lub
16, w których to wzorach A, BPR, D, G, L, R5, R⁶, S-, S2, Sb, X, X’, X” i Y mają znaczknik podane w zastrz. 10-14, a o i p niezależnie ebcacbają liczbę od 0 do 50, przy czym o + p + 1 = n, poddaje się następującym reakcjom:

aj) w związku o wzorze -5 odszczepia się grupę zabezpieczającą S¹ sposobem opisanym w punkcie e,) zastrz. -5;

b2) w związku o wzorze -6 odszczepia się grupę zabebpiecbajecą S3 sposobem opisanym w punkcie dj) zastrz. -5; i c₂) sprzęga się ze sobą tak otrzymane związki sposobem opisanym w punkcie fi) zastrz. -5, z wyiwpfbemzm ewićwku o ogóegmt wzorce H, w ktńzytn A, B, Di G, L, R⁵, r5, R^l, S², Sb, X, X’, X”, Yi n matąwyenpod&re anezznniz;

dz) powstały związek przeprowadza się w związek o wzorze i sposobem opisanym w punkcie h,) zastrz. -5.

-7. Sposób wytwarzania nowych analogów oligonukleotydów o ogólnym wzorze -, w którym wszystkie podstawniki mają znaczenie podane w zastrz. 10-14, znamienny tym, że zwiezey o ogólnym wzorze -0, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R6, S- S2, X, X’, X”i Y mają znaczenie podane w zastrz. Ó^0-14, sprzęga się z użyciem znanych sposobów z mostkiem SPACER na stałym nośniku, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze
17, w którym A, BPR, D, G, L, R5, R⁶, S- S², X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, SS oznacza stały nośnik odpowiedni do użycia w syntezie w fazie stałej, a SPACER oznacza grupę dającą się odsbczkpiαć od nośnika po syntezie, względnie SPACER oznacza dwutUnkcyjne cząsteczkę keclugatone. Q, którą można poprzez znaną grupę odszczkpiająee się związać ze stałym nośnikiem;

bb) ze zwiebyu o wzorze -7, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R⁶, S- S², SS, SPACER, X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, edszobepia się grupę zabkbpikczające Si sposobem opisanym w punkcie e- zastrz. 15;

C3) powstały związek poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wberzk i0, w którym A, B^pR, D, G, L, R5, R6, S- S², X, X’, X” i Y mają wyżej podane znaczenie, sposobem opisanym w punkcie f) zastrz. 15;

d₃) przedłuża się do żądanej długości łańcuch sposobami podanymi w punktach bb) i c₃); e,) ewentualnie wprowadza się koniugat Q’ sprzęgania z użyciem znanych sposobów;

184 920 f₃) tak otrzymany związek odszczepia się znanymi sposobami ze stałego nośnika, a grupy zabezpieczające odszczepia się sposobem opisanym w punkcie h,), przy czym odszczepianie grup zabezpieczających można prowadzić przed odszczepianiem ze stałego nośnika, po czym ewentualnie wprowadza się koniugat Q drogą znanej reakcji sprzęgania, z tym, że kolejność sprzęgania koniugatów Q i Q’ metodami według punktów e₃) i f₃) można zmienić i ewentuaLne powstały związek cyklizuje się.
18. Środek farmafautyczny zawierajmy substancję czynną i sub siancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czyoną zawiera co najmniej jeden związek o ogólnym wzorze 1, w którym wszystkie podstawniki mają znccznoin pedcon w zastrz. 10-14.