CZ292076B6 - Způsob časné diagnózy karcinomů - Google Patents

Abstract

P°edkl dan °eÜen se vztahuje ke zp sobu asn diagn zy karcinom a jejich p°edb n²ch stup (prekarcerogenn ch stav ), kter² zahrnuje stanoven nadm rn exprese regula n ho proteinu bun n ho cyklu v organick m vzorku a k souprav pou iteln pro tento zp sob.\

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje ke způsobu časné diagnózy karcinomů, stejně jako jejich předběžných stupňů, zvláště karcinomů horního dýchacího traktu nebo anogenitálního traktu.

Dosavadní stav techniky

Od poloviny 50. let byly nabízeny preventivní programy pro většinu rozdílných karcinomů. Pokud se tká cervikálního karcinomu, jsou tyto založeny především na morfologické a cytologické zkoušce cytologického stěru z děložního hrdla, což se nazývá Papův test, který se provádí na základě rutinních gynekologických prohlídek v pravidelných intervalech u žen od 20 let výše. Pomocí morfologie buněk jsou stery rozděleny do různých stupňů intenzity dysplastických buněčných změn, Podle Papova testu I až V, se tyto stupně intenzity uvádějí jako normální, mírná dysplazie, vážnější dysplazie, vážná dysplazie a invazivní karcinom. Jestliže Papův test vede k jasnému výsledku, odejme se kousek tkáně a podrobí se histologickému vyšetření, kterým se určí druh a intenzita dysplazie a klasifikuje se jako cervikální intraepitelní neoplazie (CINI-III).

Přes všechny preventivní programy je cervikální karcinom, který vede ke 400 000 nových případů za rok, druhým nejčastěji se vyskytujícím karcinomem u žen. To je mimo jiného způsobeno skutečností, že až 30 % výsledků Papovatestuje falešně negativních.

Předmětem přítomného vynálezu je tedy poskytnout způsob, pomocí kterého mohou být cervikální karcinomy včas a spolehlivě diagnostikovány. Navíc může být tímto způsobem umožněna diferenciace vzhledem k benigním zánětlivým nebo metaplastickým změnám dysplastické preneoplazie.

Podstata vynálezu

Podle předloženého vynálezu je toho dosaženo předmětem přihlášky patentu, který je definován v patentových nárocích.

Přítomný vynález je založen na zajištění přihlašovatele, že regulační proteiny buněčného cyklu jsou v mnoha karcinomech exprimovány nadměrně, například v karcinomech horního dýchacího traktu nebo anogenitálních karcinomech, zvláště v cervikálním karcinomu a v předběžných stupních těchto karcinomů. Příkladem regulačních proteinů buněčného cyklu jsou cykliny. Zvláště je nutno zmínit se o kinázách závislých na cyklinu, které cykliny regulují. Ještě důležitější je zmínit se o inhibitorech kináz závislých na cyklinu, které naopak regulují kinázy závislé na cyklinu. Příklady inhibitorů kináz závislých na cyklinu jsou proteiny pl4, pl5, pl6, pl9, p21 a p27. Přihlašovatel zjistil, že intenzita nadměrné exprese regulačního proteinu buněčného cyklu koreluje se stupněm buněčné dysplazie.

Podle vynálezu jsou zjištění přihlašovatele použity pro způsob časné diagnózy karcinomů a jejich předběžných stupňů (prekarcerogenních stavů), které zahrnují stanovení nadměrné exprese proteinů buněčného cyklu ve vzorku odebraném z těla.

Výraz „karcinomy a jejich předběžné stupně“ zahrnuje karcinomy jakéhokoliv druhu a původu ajejich předběžné stupně. Mohou to být například karcinomy horního dýchacího traktu nebo anogenitální karcinomy, zvláště cervikální karcinom. Ve spojení s posledně uvedeným karcinomem, je zvláště nutné zmínit se o jejich předběžných stupních, to jest o cervikální intraepitelní neoplazii (CINI-III), karcinomech in sítu (CIS) atd.

-1 CZ 292076 B6

Výraz „regulační proteiny buněčného cyklu“ zahrnuje regulační proteiny buněčného cyklu jakéhokoliv druhu a původu. Proteiny mohou být například cykliny. Zvláště to mohou být kinázy závislé na cyklinu, které cykliny regulují. Příkladem kináz, závislých na cyklinu, jsou proteiny 5 cdk4 a cdk6. Ve specielnějším případě to mohou být inhibitory kináz závislých na cyklinu, které naopak regulují kinázy závislé na cyklinu. Příkladem inhibitorů kináz závislých na cyklinu jsou proteiny pl4, pl5, pl6, pl8, p21 a p27 přičemž se upřednostňuje pl6.

Výraz „vzorek odebraný z těla“ zahrnuje jakékoliv vzorky z tělních orgánů, ve kterých mohou být zjištěny regulační proteiny buněčného cyklu. Příkladem takových vzorků odebraných z těla mohou být krev, stěr, sputum, moč, stolice, mok, žluč, gastrointestinální sekrety, lymfa, kostní dřeň, punkce orgánů nebo aspiráty a biopsie. Stěry a biopsie se doporučují zvláště při detekci anogenitálních karcinomů, například cervikálních karcinomů.

Výraz „určený nadměrné exprese regulačních proteinů buněčného cyklu“ zahrnuje jakékoli způsoby, které jsou vhodné pro detekci exprese regulačních proteinů buněčného cyklu nebo u jejich kódující mRNAs a amplifíkaci odpovídajících genů. Za účelem stanovení nadměrné exprese je zřejmé porovnat vzorek organu, který má být vyšetřen, s odpovídajícím vzorkem odebraným z těla, který pochází od zdravé osoby. Takový vzorek může být přítomen ve standardní formě. (Nadměrná) exprese regulačních proteinů buněčného cyklu může být zjištěna na úrovni nukleové kyseliny nebo na úrovni proteinu. Při sledování detekce na úrovni proteinu je možné použít například protilátky, které jsou namířeny proti regulačním proteinům buněčného cyklu. Tyto protilátky mohou být použity nejrozličnějšími způsoby, jako jsou „WESTERN blot“, ELISA, nebo immunoprecipitace. Může být výhodné fixovat protilátky na pevných nosičích, jako 25 jsou testovací pásky nebo latexové částice.

Pomocí předkládaného vynálezu je možné diagnostikovat karcinomy včas, to jest v jejich předběžných stupních.

Další předmět přihlášky se vztahuje k soupravě pro provedení způsobu podle tohoto vynálezu. Taková souprava zahrnuje:

a) reagenční činidlo pro zjištění exprese regulačního proteinu buněčného cyklu, například protilátku namířenou proti takovému proteinu nebo nukleové kyselině, která kóduje takový protein a jeho části,

b) obvyklá pomocná činidla, jako jsou pufry, nosiče,m značkovací látky atd. a případně

c) činidla pro řízení reakcí, například regulační protein buněčného cyklu, nukleovou kyselinu kódující takový protein a jeho části nebo pro přípravu buněk, například výřez buněčné tkáně fixované na podložním sklíčku.

Výše uvedené údaje se používají odpovídajícím způsobem na komponenty soupravy. Navíc mohou být přítomny jeden nebo více zástupců jednotlivých komponent.

Podle předkládaného vynálezu je možno karcinomy včas diagnostikovat. Včas mohou být >' stanoveny zvláště předběžné stupně karcinomů. Rovněž je nutno zdůraznit, že je možné vytvořit diferenciaci vzhledem k benigním zánětlivým nebo metaplastickým změnám dysplastické preneoplazie. Dalším charakteristickým rysem je, že výsledky získané způsobem podle 50 předkládaného vynálezu nejsou předmětem subjektivního vyhodnocení, takže je možno se vyhnout například falešně-negativním a falešně-pozitivním výsledkům Papova testu nebo histologických přípravků. Předkládaný vynález se navíc odlišuje rychlým a jednoduchým ovládáním, takže může být použit pro extenzivní skreening, zvláště rovněž v zemích třetího světa. Předkládaný vynález proto představuje důležitý příspěvek pro dnešní diagnostiky 55 rakovinných onemocnění.

-2CZ 292076 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje detekci nadměrné exprese cdk4 v buněčné linii cervikálního karcinomu CaSki transformovaného HPV16. Označení 4 h, 8 h, 12 h, 24 h se vztahují na časy odstranění extraktu. Označení co označuje kontrolní stanovení, zatímco arr značí přídavek séra.

Obrázek 2 ukazuje detekci nadměrné exprese cdk6 a pl9 v HPV16-transformovaných buňkách NIH3T3. Označení co označuje kontrolní stanovení.

Vynález je vysvětlen následujícím příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Detekce nadměrné exprese p 16 v biopsiích děložního hrdla (A) Parafinové výřezy o tloušťce 3 až 5 pm se připraví ze 20 biopsií cervix uteri, které obsahují všechny stupně dysplastické progrese z normální tkáně (n = 2) přes léze CINI (n = 4), II (n 4'), III (n 5') do invazivního karcinomu (n 5'). Deparafinizují se v xylenu po dobu 2-krát 10 minut a rehydrogenují se použitím ethanolu. Antigeny se demaskují v lOmM citrátovém pufru (pH 6,0) v autoklávu při 110 °C po dobu 10 minut. Endogenní peroxidázy se potom inaktivují za použití 0,25 % peroxidu vodíku v PBS. Následuje blokování nespecifických vazebních míst koňským sérem (detekční souprava Vectastain ABC, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornie, USA) při teplotě místnosti po dobu 20 minut, sekce se inkubují s pl6-specifickou monoklonální protilátkou (Neomarkers, Fremont, Kalifornie, USA) v přítomnosti 3% fetálního telecího séra při teplotě místnosti po dobu 45 minut. Pro detekci vazby pl6-protilátky se poté přidává biotinylovaná sekundární protilátka (koňské proti-myší IgG, souprava Vectastain, viz výše) po dobu 30 minut. Potom se pomocí činidel a ve shodě s instrukcemi soupravy Vectastain zjišťuje navázaná sekundární protilátka a obarvení jádra kontrastní barvou se provede za použití Mayerova hemalového roztoku. To ukazuje, že v dysplaziálních buňkách existuje nadměrná exprese pl6. Rovněž ukazuje, že intenzita nadměrné exprese koreluje se stupněm buněčné dysplazie.

(B) Kromě toho se připraví parafinové výřezy ze 78 biopsií cervix uteri. Biopsie se vztahují na normální tkáň (n 12'), dysplastické léze stupňů CINI (n 15'), II (n= 14), a III (n 18'), stejně jako invazivní karcinomy (n 19'). Parafinové výřezy se zpracují postupem popsaným v (A). Získají se data uvedená v tabulce 1.

Tabulka 1

Intenzita exprese pl6

histologie	n=	-	+	++	+++
normální	12	9	3
CINI	15	10	3	2
CIN II	14	1	4	9
CIN III	18			9	9
CxCa	19			1	18
celkem	78	20	10	21	27

-3CZ 292076 B6

Z dat v tabulce 1 vyplývá, že pl6 je nadměrně exprimována v dysplaziálních buňkách a invazivních karcinomech, přičemž nadměrná exprese vzrůstá se stupněm dysplazie vzhledem k invazivnímu karcinomu.

(C) Parafinové výřezy ze 180 biopsií cervix uteri se kromě toho zpracují způsobem popsaným v (A). Navíc se stanoví procentuální počet buněk, které reagují svýše uvedenou pl6 specifickou monoklonální protilátkou. Provede se rovněž rozlišení mezi HPV-pozitivní a HPV-negativní dysplazií a invazivními karcinomy. Získají se údaje uvedené v tabulce 2.

Tabulka 2

Procento buněk nadměrně exprimujících pl6

	n	průměrné procento ± směrodatná odchylka
CINI	32	54,9 ± 24,0
HPV-negativní	17	54,0 ± 27,2
HPV-pozitivní	15	55,9 ±21,0
CINII	32	70,8 ± 18,9
HPV-negativní	14	76,0 ± 15,8
HPV-pozitivní	18	66,8 ± 20,5
CINIII	60	92,4 ± 10,2
HPV-negativní	9	94,4 ± 7,5
HPV-pozitivní	51	92,1 ± 10,7
Invazivní karcinom	58	97,8 ± 5,2
HPV-negativní	5	96,4 ± 8,1
HPV-pozitivní	53	97,9 ± 4,9

Údaje z tabulky 2 ukazují, že pl 6 je nadměrně exprimována jak v HPV-pozitivních buňkách tak v HPV-negativních buňkách dysplazie a invazivních karcinomů. Tento výsledek ke potvrzen kontrolními stanoveními s normální tkání. Data rovněž ukazují, že procento buněk reagujících s pl6 vzrůstá se stupněm dysplazie vzhledem k invazivnímu karcinomu.

Příklad 2: Detekce nadměrné exprese regulačních proteinů buněčného cyklu v HPV-transformovaných buňkách (A) Buňky CaSki cervikálního karcinomu, které jsou transformovány sHPV16, se kultivují za nepřítomnosti séra po dobu 72 hodin. Po přidání séra se buněčné extrakty v různých časech seberou, podrobí SDS-PAGE a přemístí do PVDF membrán (Du Pont). Exprese cdk4 se stanoví použitím polyklonálního antiséra (1 : 1000) od Santa Cruz. Dále se stanoví exprese proteinu HPV16-E7 s monoklonální protilátkou proti HPV16-E7 (1:50) z Tritonu.

Individuální immuní odpovědi se zjistí pomocí sekundárních protilátek s navázanou peroxidázou a chemiluminiscenčního detekčního systému (NEN, Du Pont).

Ukazuje se, že cdk4 je nadměrně exprimován (viz obr. 1).

(B) Buňky NIH3T3 jsou transformovány s HPV16 tak, že se získá exprese proteinu HPV16-E7.

Získají se buněčné extrakty transformovaných buněk a zpracují se způsobem uvedeným v (A). Pro detekci exprese cdkló a pl9 se použijí polyklonální antiséra (1 : 1 000) od Santa Cruz. Pokud se týká detekce exprese proteinu HPV16-E17 a detekce individuálních imunních odpovědí, odkazuje se na konstatování uvedené výše pod bodem (A).

Ukazuje se, že cdk6 a pl9 jsou nadměrně exprimovány (viz obr. 2).

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob časné diagnózy karcinomů a jejich prekarcerogenních stavů, vyznačující se t í m , že zahrnuje stanovení nadměrné exprese regulačního proteinu buněčného cyklu ve vzorku odebraném z těla, kde regulačním proteinem buněčného cyklu je inhibitor kinázy závislé na cyklinu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že karcinomy jsou karcinomy horního respiračního traktu.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že karcinomy jsou anogenitální karcinomy.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že anogenitálním karcinomem je cervikální karcinom.
5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že inhibitorem kinázy závislé na cyklinu je protein pl4, pl5, pl6, pl8, pl9, p21 a p27.
6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že vzorkem odebraným z těla je krev, stěr, sputum, moč, stolice, mok, žluč, kostní dřeň, gastrointestinální sekrety, punkce orgánů, biopsie a/nebo lymfa.
7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že nadměrná exprese se stanoví na úrovni nukleové kyseliny.
8. 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že nadměrná exprese se stanoví na úrovni proteinu.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že pro stanovení se použije protilátky namířené proti regulačnímu proteinu buněčného cyklu.
10. 10. Souprava pro provedení způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se t í m, že zahrnuje:

    a) reagenční činidlo pro detekci exprese regulačního proteinu buněčného cyklu,

    b) obvyklá pomocná činidla, jako jsou pufry, nosiče, značkovací látky atd. a případně

    c) činidlo pro řízení reakcí.
11. 11. Souprava podle nároku 10, vyznačující se tím, že reagenčním činidlem je protilátka namířená proti regulačnímu proteinu buněčného cyklu.
12. 12. Souprava podle nároku 10, vyznačující se tím, že reagenčním činidlem je nukleová kyselina kódující regulační protein buněčného cyklu nebo jeho části.
13. 13. Souprava podle kteréhokoliv z nároků lOaž 12, vyznačující se tím, že činidlem je regulační protein buněčného cyklu nebo nukleová kyselina kódující tento protein nebo jeho části.
14. 14. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, vy zn ač u j í c í se tí m , že činidlem je buněčný preparát nebo buňky fixované na podložním sklíčku.