CZ20004922A3 - Způsob časné diagnózy karcinomů - Google Patents

Description

1 • *t ······ «« · ···· · » * ·**· • I · ··· · · · • ····· · · i · · · • ·«······ ··· · · · · ·· · 4 ·· 4 ^ ^oo o - V 9 \ru

Způsob časné diagnózy karcinomu 0¾ i ast tec hni ky Předk i ádaný vynái ez se vztahuje ke způsobu časné diagnóz y kar c i no rn Q, s t e j n ě j a k o jejich předběžných s t u pftů . z v1áš t ě karci nomů horní ho d ýcha cí ho traktu ne b o anogenitálního traktu.

Dosavadní stav techniky

Od Doloviny 50.let byl v nabízeny preventivní programy pro většinu ro z d í 1 n ýc h k are i nomů. Pokud s e týká červ i kál ního k a r c i n o m u j s o u tyto Z 8 1 o ž en y přede vším na mo r í o 1 o g i c k é a cytologieké zkoušeš c y t o i o g i c k έ ho s t ě r u z d ě 1 o ž n í ho hr d 1 a což se nazývá Papův t e s t . který se prová d í n a z á k 1 a d ě r uti nn i c h gyne k o 1 o g i c k ý c; h p r o h 1 i d e k v p r a v i d e 1 n ý c h intervalech u žen o d 2 0 1et výšs. Pomoc í mo r f o 1 o g i e b u n é k _j S 0 U íiltói y Γ 0 z <5 ě í e n v do různých stupňů i nt e n z i t y dysplastických . buněčných změn. Podle Pap o va t e s t u I 8 ‘V tyto stupně i n z a xx z ; ί y u '.z a dej i jako norma i n í rn í r n á d yspí az i e v e z η θ . ] 5 i cl y spi a z i e . v á ž n á d y s p 1 a z i e a i n V <3 Z ivní kare i n o m. Jestliže P a p ů v test vede k j as né mu výs1edku . odejme s s k o u s e tkáně a podrobí se hi S t 0 logickému vyš e t ř e n í , kterým s e u r č í druh a intenzi ta d y s p 1 a z ie a klasifikuje se ja k o červi k á1n i intraepítelní n eo plaz i e f Cl Ní "·· I II). P ř e s v š © c h n y P r © v e n t i v n í progr a m y j e c e r v i kál r« í karcinom, který vede ke 400 000 nových případů za rok. druhým nejčasté .i i se vyskytujícím karcinomem u žen. To je mimo jiného způsobeno skutečností, že až 30 % výsledků Papova • · · ·

testu je falešně negat i vn í c h Předmětem přítomného vynálezu je tedy poskytnout způsob pomocí kterého mohou být červi kál ní karcinomy včas a spolehlivě diagnostikovány. Navíc může být tímto způsobem umožněna diferenciace vzhledem k benigním zánět 1í vým nebo metapi ast i ckým změnám dysp1 ast i cké preneoplaz i e.

Podstata vynálezu

Podle předloženého vynálezu je toho dosaženo předmětem přihlas k y patent u , k i e r ý j e def i n ován v p a t e n t o v ý c h n é r o c í c h Přítomný vynález je založen na pohledu př i hlašovate1e, že regu 1 ačn í protě i ny bunečného c yk 1 u i sou v rnnoha k a rcino rn ech expr i mo vány n a d měr n ě , např í k 1 a d v k arci n o m e c h hornino dýchacího traktu nebo anogen i tá 1 ní ch karcinomech,, zvláště v červi kál ním karcinomu a v předběžných stupních těchto karcinomů. Příkladem regulačních proteinů buněčného cyklu i sou cykiiny. Zvláště je nutno zmínit se o ki názách závislých na cyk linu, které cykiiny regulují,. Ještě důležitější je zmínit se o inhibitorech kináz závislých na cyklinu,. které naopak reguluji fcináxy závislé na cyk 1 inu. P ř í k i a d y i n h i b i torů kináz závislých na cykl i nu jsou proteiny Pí 4. p15, pi 6, pí 3, p21 a p27. Přihlašovatel zjistil, že intenzita nadměrné exprese regulačního proteinu buněčného cyklu koreluje se stupněm buněčné dysplaxie.

Podle vynálezu jsou pohledy přihlašovatele použity pro způsob časné diagnózy karcinomů a jejich předběžných stupňů. Které zahrnují stanovení nadměrné exprese proteinů buněčného c y k 1 u v a vz o i- k u odebraném z těla. 3 3 • · • · · ·· ···· ···· « t * <|·· ··· ··· · · • ····· · · ♦ · · • · · · · · ·· ····· ·· · · ·· · Výraz "karcinomy a jejich předběžné stupně" zahrnuje karcinomy jakéhokoliv druhu a původu a jejích předběžné stupně.. Mohou to být například karcinomy horního dýchacího traktu nebo anogen itá1 ní karcinomy, zvláště červikái ní karcinom.. Ve spojení s posledně uvedenými karcinomem, je zvláště nutně zmínit se o jejich předběžných stupních, to i es t o c&rvi ká1 ní in traepitslní n e o p i a z i i (CINI-111), karc i nomech i n s i tu ( CI S) atd .. Výraz "regulační proteiny buněčného cyklu" zahrnuj e r e g uliční proteiny buněčného cyklu jakéhokoliv druhu a původu.. Proteiny mohou být například cykl i ny. Zvláště to mohou být kinázy závislé na cyklinu, které cykl í ny regulují. Příkladem fcináz, závislých na cyklinu, jsou proteiny cdk4 a cdk6. Ve specielnějším případě to mohou být inhibitory Rináz závislých na cyklinu, které naopak regulují kinázy závislé na cyklinu. Příkladem inhibitorů kináz závisiých na cyk i i nu j sou prote j ny p 1 4 , p 1 5, p 1 6 , p 1 8 , p 1 9, p2 1 a p27 p ř i č e m ž s e u p ř e d n o s t ň u j e p I 8 . Výraz ”vzorek odebraný z těla" zahrnuje jakékoliv vzorky z tě1ní c h or gánů, ve kterých mohou být zji štěny regu1 ačn í p r o t e i n y b u n ě č n é h o c y k 1 u . P ř í k i a d e rn t a kových vzorků odebraných z těl a mo ho u být krev, stěr , sputum, moč, stol i rn o k, ž 1 u č , g a s t r o i n t e s t i n. á i n í sekrety. íymfa, kostní d f e ň , punkce orgánů nebo aspí r á t y a b i o p s i e . Stery a biopsi & s e doporučují zvláště př i detekci a n o g e n i t á1n í c h karcinomů. n a pří klad cer v i ká 1 n í c h k arci n o rnů. Výraz "určení nadměrné exprese regulačních proteinů buněčného cyklu" zahrnuje jakékoli způsoby, které jsou vhodné pro detekci exprese regulačních proteinů buněčného cyklu nebo jejich kódující mRNAs a amplífíkaci odpovídajících genů. 2a r

A '7 O / i. C? -5 . účelem stanovení nadměrné exprese je zřejmé porovnat vzorek organu, který ,r,a byt vyšetřen, s odpovídajícím vzorkem odebraným z těla. který pochází od zdravé osoby. Takový vzorek může být přítomen ve standardní formě. (Nadměrná) exprese regulačních proteinů buněčného cyklu může být zjištěna na úrovni nukleové kyseliny nebo na úrovni proteinu. Při sledováni detekce na úrovni proteinu je možné použit například protilátky, které jsou namířeny proti regulačním proteinům buněčného cyklu. Tyto Drotilatkv mohou být použity ne j ro z i i čně j š í mi způsoby, jako jsou 'WESTERN biot". ELÍ3A, nebo immunoprecioitace. riůže být výhodné fixovat protilátky na pevných nosičích, jako jsou testovací pásky nebo latexové částice.

Pomocí předkládaného vynálezu je možné diagnostikovat karcinomy včas. to iest v jejích předběžných stupních.

Další předmět přihlášky se vztahuje k soupravě pro provedení způsobu podle tohoto vynálezu.

Taková souprava zahrnuje: a ) protei nu proti kóduje re alfě ní činidlo pro zjištění exprese regulačního buněčného cyklu, například protilátku namířenou takovému proteinu nebo nukleové kyselině, která takový protein a jeho části. b) obvyklá pomocná činidla, jako jsou puf rv, nosiče, značkovací látky atd. a případně c) činidla oro řízení reakcí, například regulační protein buněčného cyklu, nukleovou kyselinu kódující pa*o takový protein a jeho části nebo pro přípravu buněk, například výřez buněčné tkané fixované na podložním sklíčku. « * ···· ··

• · · · · · • · · · · • · · · · · ·· ·· ·· · · · V ý š e u v e d e n é ú d a j e se po u ž í v a j í o d p o v í d a i í c í m z p ů s o b e m na komponenty soupravy. Navíc mohou být přítomny jeden nebo v i c s z á s t u p c ů j e d n o t 1 i v ý c h k o rri ponent.

Podle předkládaného vynálezu je možno karcinomy včas diagnostikovat. Včas mohou být stanoveny zvláště předběžné stupně karcinomů. Rovněž je nutno zdůraznit, že je možné vytvořit diferenciaci vzhledem fc benigním zánět 1 i vým nebo metan 1 ast i ckýrn zrněném dysplastické pr e ne o p 1 a z i e .. Dalším charakteristickým rysem je, že výsledky získané způsobem podle předkládaného vynálezu nejsou předmětem subjektivního vyhodnocení, takže j e možno se vyhnout například falešně--negativním a fa í ešně-poz i t i vní m výsledkům Rapova t e s t u n e bo h i s t o 1 o g i e k ých p ř í pr a vk ů. P ř e d k 1 á d a n ý vy n á 1 e z s e n a v í c o d 1 i š u j e r y c h 1 ý rn a j e d n o d u c h ý m o v 1 á d á n í rn, t a k ž e rn ů ž e být použit pro extenzivní sfcreening. zvláště rovněž v zemích tře t i ho s v ě ta. Pře d k1ádaný vynález proto představuje tíůležít ý příspěvek pro dnešní diagnostiky rakovinných onemocnění. Přehled obrázku na výkresech

Obr Ϊ,

ukazuje detekci nadměrné exprese cdk4 v buněčné linii červi kál ní ho karcinomu CaSk i transformovaného HPVI6. Označení 4 h. 8 h. 12 h, 2 4 h se vztahují na časy odstranění extraktu. Označení co platí pro řízení, zatímco arr značí přídavek séra. ukazuje detekci nadměrné exprese cdk6 a p19 v HP V1 6 --t r a n s f o r mo va n ýc h buňkách NIH3T3. Označení c o o z n a č u i e k o n t r o 1 n í s t a n o v e n i .

Vyná1ez je vysvětlen nás 1edu]íčími přík1 ady. Příklady provedení___vynálezu a d 1 : D e t e kce nadměrné e xprese p 1 6 v b i o p s i í c h dě 1 o žní ho hrdla D ?.N V· .< U .! Cl f i n o v é výřezy o tlou štce 3 a ž 5 μ m s e p ř i p r a v i 2 8 20 b i o p s i í c s r v i x ti t e r i , k t e r é o hsahu j í všechny stup ně dys p1 a s ti c ké p r o g r e s e z η o r má i n í t k á n ě ( n = Á ) přes léze CIN I (n = 4) , II í n - 4) , I II (n = 5) do i nva z i vn í ho k a r c i n o mu ( n b ) * Deparafí n i z ti j í se v xylenu po d obu 2-~ krát 10 minut a r e hydr o g e n ti j í se použitím e t ha n o 1 u . A n t i g β n y s e d e m a s k u i í v Í0mM citrát o vém p u f r o ( pH 6,0) v autoklávu při 110 0 C po tío b u 1 0 tri i nut , E n d o genn í ρ e r o x .i d á z y s e p o t o m i nakt i vu j í z a p o u ž i t í 0,25% pero x i d u vo d í k u v P BS . N á s i e d u i e b i o k o v ání nespec i f i c kýc h b n í c h mí st koňským s é r e m ( d e t © k č n í s oupra va

Vectastaín ABC, Vector Laboratories, Burlingsme, Kalifornie, USA) při teplotě místnosti po dobu 20 minut, sekce se i nk orbu ji s p16~speci f i ckou rno π o k 1 o n á 1 n í protilátkou ( Neomarkers, Frernont, Kalifornie, USA) v přítomnosti 3% fetálního telecího séra při teplotě rn i s t n o s t i po d o b u 4 5 min u t . Pro detekci v a z b y p 1 6 -prot i -1á t k y se poté p ? i d ává bio ti n y1 o va ná sekundárn í p rot i 1átka ( k o ň s k é p r o t i -myš í I g G , souprava Ve ctasta ín , v i z vyš s) po dobu 30 m i n u t . P o t o rn se pomocí č i n i d e i a ve shodě s i n s t r u k c e rn i s o u p r a vy V ectastain z j i š ť u j e n a V 3 Z 8 Π δ se k u n d á r n í pr o t i 1 á tka a obarvení j á d r a k o n t. r a s t n í b a r v o tr 'v> Θ provede z a použ i t i Mayerova ne Π18 lového r oztoku. To uka zu 'í e <. z β v dy S Ρ 1 3 Z i á 1 n í c h b u ň k á c h Θ x i s t u j e nadměrné a x prese p 1 8 • Ro vn ě ž uk azuje, že i nt e n z i t a n a d mé r n e ex prese kor e i uje se st u p n ě rn b u n ě č n e (jyapiiS J 3 «.

Krοmě t o h o s e p ř i p r a ví paraf i nové vý řezy ze 7 8 b i o p s i í červix uter i . Biopsie se vztahují na normální tkáň (n - 12), dysp. •3 Γ'"; I", i c k é leze s t u pň ů CIN I ín = í 5 ) , 11 ( n = 1 4 ) , a I 11 {n * 18), stejně j a k o i nvaz i vn í karcinomy (n - i 9) . Parafinové výřez y se z p r a c u jí post pern popsaným v ( A) . Zí sfca j i se data uveden á v t a b u 1 c e T a b u1ka 1

Intenzita exprese o i 6 h i s t o i o g i e n ~ + ++ +++ n o r má 1 n í j 2 9 3 CUM I 1 5 1 0 3 C I N II 1 4 1 4 q CI N I .! I 1 8 9 S CxCa 1 9 1 18 celkem 78 20 1 0 2 1 2? Z dat v tabulce 1 vyp1ývá, že p18 je nadměrně e x p r i rn o v á n a v d y s ρ 1 a z i á i n í ch buňkách a invazi vn í c sarcinomech, oř i č & ΓΠ Ž Π d d ΓΠ i: Γ Π 3 8 X Q Γ 8 S 5 vzrůstá se stupněm dysplazie vzhledem k invazivnímu karcinomu (C) Parafinové výřezy ze 180 biopsií červix uter i se kromě toho zpracují způsobem popsaným v (A). Navíc se stanoví procentuální počet buněk,- které reagují s výše uvedenou p16 specifickou monokloná1 ní protilátkou. Provede se rovněž rozlišení mezí HPV~poz i t i vní a HP V- ne g a t i vni dysplazíí a in va z ivnimi k are i nomy se údaje uvedené v tabulce 2. 11 a :í i

Tabulka 2 P roce n t o h u n ě k n a d rně r η ě e xp r i rnu j í c í c h p 1 6 průměrné procento — ------------- ± směr od a t n á o d c CÍN í 3 2 5 4 S ± 2 4 , 0 HPV-negat í vn í i 7 5 4 , 0 ± ? 7 O HPV-poz i t i v n í 1 5 c: 0 ž 2 1 0 CI N I I 3 7 7 0 , 8 ± -i n 1 O , 9 HPV-negat í vn í 1 4 7 6 , G ± 1 5 , 'ó HPV-poz i t i v n í i 8 6 & , 8 ž 20, C" CIN III 8 0 92, 4 ± 1 0 2 HP V.....negat i vn í 9 9 4 , 4 4. *7 < HP V-po z i t i vn í 5 1 q ? 1 + 1 0 , 'f Invazivní k arci nom 5 8 9 7 , 8 "h 5 , n .i. Η P Vn e g a t i vn í CJ 36 , 4 ± 8 , 1 HPV-poz it i v n í 5 3 9 7 , 9 ± 4 , 3

U d a i e z t abulky 2 u k a z u jí , že p16 j e n a dměrně expri m ovéna jak v ΗPV-požiti vn í ch b u ňkách t a R v HPV-negativních buňkách dysplazie a i nvaz i vní ch karcinomů. 9 t*2<® «//* & 2- O O o / (ř tí? "> o > ! /

Tento výsledek je potvrzen kontrolními stanoveními s normální tkání. Data rovněž ukazují, že procento buněk reagujících s pí 6 vzrůstá se stupněm dyspiazie vzhledem k invazivnímu kare i nomu. Příklad 2 : Detekce nadměrné exprese regulačních proteinu buněčného cyklu v HPV-transformovaných buňkách (A) Buňky CaSki cervikálního karcinomu, ktere jsou transformovaný s HPV16. se kultivují za nepřítomnosti séra po dobu 7 2 hodin. Po oř i dani sěra se buněčné extrakty v různých časech seberou, podrobí SDS-PAGE a Dřemí stí do PVDF membrán (Du Pont). Exorese cdk4 se stanoví oo užitím polvklonálního anti sera (1 : 1000) od Santa Cruz. Dále se stanoví exprese oroteinu HPV1S - E7 s monoklonálni protilátkou proti HP V16 - Ξ7 H : 50) z Tritonu.

Individuální imunní odpovědi se zjisti pomocí sekundárních protilátek s na vázánou oeroxi dazou a chemiluminiscenčního detekčního systému (NEN, Du Pont).

Ukazuje se. že cdk4 je nadměrně exprimován (viz obr. 1). ( B) Buňkv NIH3T3 isou transformovány s HP V16 tak, že se získá exprese oroteinu HPV16 - E7. Získají se buněčné extrakty transformovaných buněk a zpracují se způsobem uvedeným v (A). Pro detekci exprese cdk6 a p19 se douží jí polyklonální antisera (I : 1000) od Santa

Cruz. Pokud se týká detekce exprese oroteinu HPV16 - E17 a detekce individuálních imunních odpovědí, odkazuje s« na konstatování uvedené výše pod bodem (A).

Ukazuje se. že cdk6 a p19 jsou nadměrně exprimovany (viz obr. 2).

Claims (15)

1. i o • · · · · "?V «2-oco- hpii. P A T E N T 0 V E N A R 0 K Y 1 .. 2 p ůsob č a s né diagnózy kare i n í c h s t u p ň ů, v y z n a č u j í j e sta no vβη í n admě rné e xprese r cyk1u v e v z o r k a odebrané m z t ě í
2. 2. Způsob podle nároku 1, v y že karcinomy jsou karcinomy hor
3. 3. Způsob podle nároku 1, v y že karcinomy jsou anogenitáini
4. 4. Způsob podle nároku 3, v y že anogenitáini m kare i n o me rn j e
5. 5. Způsob podle kteréhoko1 . i v č u jící s e t i m, ž £ i re je c yk1 i n,
6. 6, Způsob p o d 1 e k t e r é h o k o i : i v ču j i c í se t i ΓΠ , ž e regulační ’ rn p k i n a z a z á v i s 1 á n a cyk 1 inu.
7. 7.. Způsob podle n a r o k u 8 , V y že k i názou Z či v i s 1 ou na cyk) i i n u
8. 8- Způsob podle kteréhokoliv č u j í c í se t í m, že r buněčného cyklu je i nhi bi tui nornů a „jejich P Γ Θ 1 i m í n á r - c í s e t .1 ΓΠ r ž e za h r n u ~ egu1 ačního protě inu b u n ě č né ho z n a č u j í c í S Θ t i rn n í ho r e s p i r a č n í ř"i 0 t .r a κ t u «. z n a ě u j í c í s e t í m k a r cino my .. z n a č u j í c í S Θ "C i m červi kál ní ka r c i n o rn - nároků 1 až 4 .· v y χ: n a — rj 1 a č n í protei n buněčného c yk 1 n á r o k ů 1 a z 4 v z n a -· ote i nem buněč n é h o c y k 1 u i s znač u j í c í se t í rn j e c d k 4 n e b o c d k 6 . z nároků ) až 4 <. v vy 'y a ~ g u 1 a č n i m p r o t e i n e m n a c y z v i \ e n a c yk l i n u . • · • · · · • ·
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím že i nh i b i torem ki názy závislé na c yklinu je p rotei η ρl4, p15 p "l 8 , p i 8 , p 1 9 , p 2 1 nebo p 2 7
10. 1 0 . Z p Ů3 0 b p o d i e }<· f 0 γ· é h o k o 1 i v z nároků 1 až 3, v V z n a- č u j í c f s e t í m, ž e v z o r k e m o d e b r a n ý m z t e 1 a .j o k r S t- θ Γ ,. s p u t um, moč , st o 1 ice, mok, žluč, kostní dř e n , g a s t r o — i nt e stinál ní sekrety. ρ u n k c e o r g á nů nebo a s p i r át y a b i o p s i e a /ne bo i ym f a
11. 1 1 . Způsob p o tí I e k t e r é hok o 1 i v z narofcú 1 až 10, v y z n a- č u j í c í s e t i tri, ž e nadměrná exprese se stanoví na úr ov n i n u k 1 e o vé k ys e 1 i n y.
12. 12.. Způsob p o d 1 e k t e r éhoko1 i v z nároků 1 až 10, v y z n a - č u j i c i s e 4- ,i m, že nadměrná exprese se stanoví na u r o v ni pro te i nu.
13. 1 3 . Způsob p o d 1 e n á r o ku 12, v y z n a č u j í c í s e t i rn, ž e stanové n í s s provede pomocí protilátky n a rn í ř e n é r> r 0 t i regu í s ční mu p r o t e i n u buněčného cyklu.
14. 1 4 . Souprs v a pro provedení způsobu podle kterého k o í i v z ná r o k ů 1 3 z 13, y z n a č u i í c í se t j ín, ze zahr n u j e i a) r e a g e n č n í č i n i d 1 o p r o d e tekci exprese re gul ač n í ř:i o p r o t e i n u b u n ě č n é h o c y k 1 u, b) obvyklá pomocná činidla, jako jsou puf ry, nosič**, značkovací látky atd. a případně c ) činidlo p r o ř í ze n í rea k cí .
15. 15. Souprava podle nároku 14, v y z n a č u i í c i s e t í rrt, že reakční m činidlem j s prot i 1 átka narní řená proti 1 2 r e g u 1 a č n í mu pr o te i nu buněčného c y k 1 u . i '0 . S o u p r a v a p o cl i & n ároku 14 v y z n a č u j í ο í s e t í m.. že reagenčním č i n i d 1 e rn j e n u k 1 e o v á k y s e 1 ι na k ó d u j í c í p r o r e g υ; 1 a č n í p r o t e i n buněčného cyklu nebo jeho Č á s t i . ! / * 8 o up rs v a pod 1e k t eréhoko1 i v z nároků 14 až 1 6 f v y z na..... č u jící se t í m, že či n i dlem j e r egu 1 a č n í p r o t e i n fauně čného cyk1 o nebo nuk 1eová k ys e1 i n 3 kódující pr o t e n t o p r o t e i n nebo jeho č á Sti . 1 8 . Souprava podle k t e r é h o k o 1 i v z nároků 14 až 1 R v y z n a ~ č u lící se t i m, že čin i d í em je buněčný pr B Ώ o Γ á t