CZ294329B6 - Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae - Google Patents
Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae Download PDFInfo
- Publication number
- CZ294329B6 CZ294329B6 CZ19963782A CZ378296A CZ294329B6 CZ 294329 B6 CZ294329 B6 CZ 294329B6 CZ 19963782 A CZ19963782 A CZ 19963782A CZ 378296 A CZ378296 A CZ 378296A CZ 294329 B6 CZ294329 B6 CZ 294329B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plant
- trehalose
- plants
- gene
- synthase
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 58
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims abstract description 56
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 174
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 174
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 173
- 108010020589 trehalose-6-phosphate synthase Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 239
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 49
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 101150077059 TPS1 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims description 6
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 claims description 6
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 claims description 6
- 101100194010 Arabidopsis thaliana RD29A gene Proteins 0.000 claims description 5
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 5
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 4
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 claims description 4
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 claims description 3
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 3
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims description 3
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 claims description 3
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 3
- 101150014929 TPS2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 claims description 2
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 claims description 2
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 claims description 2
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 claims description 2
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 claims description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 2
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims description 2
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 claims description 2
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 claims description 2
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 claims description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 claims description 2
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 claims description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 2
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 claims description 2
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000128884 Zier Kohl Species 0.000 claims description 2
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 claims description 2
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 claims description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 claims description 2
- 101150057187 rab-18 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 claims 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 claims 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 claims 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000009024 Ceanothus sanguineus Nutrition 0.000 claims 1
- 235000007460 Coffea arabica Nutrition 0.000 claims 1
- 235000005206 Hibiscus Nutrition 0.000 claims 1
- 235000007185 Hibiscus lunariifolius Nutrition 0.000 claims 1
- 244000284380 Hibiscus rosa sinensis Species 0.000 claims 1
- 240000003553 Leptospermum scoparium Species 0.000 claims 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims 1
- 235000015459 Lycium barbarum Nutrition 0.000 claims 1
- 101150108155 TSL1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 16
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 8
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 abstract description 6
- 244000038559 crop plants Species 0.000 abstract 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 34
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 30
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 30
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 108010045348 trehalose synthase Proteins 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 15
- LABSPYBHMPDTEL-JGZVXCDNSA-N trehalose-6-phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](COP(O)(O)=O)O1 LABSPYBHMPDTEL-JGZVXCDNSA-N 0.000 description 15
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 101000795074 Homo sapiens Tryptase alpha/beta-1 Proteins 0.000 description 13
- 101000830822 Physarum polycephalum Terpene synthase 2 Proteins 0.000 description 13
- 102100029637 Tryptase beta-2 Human genes 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 11
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 11
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- HSCJRCZFDFQWRP-RDKQLNKOSA-N UDP-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-RDKQLNKOSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 101100371160 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TSL1 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101100260765 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) tls1 gene Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- 241000611223 Selaginella lepidophylla Species 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 5
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N ADP alpha-D-glucoside Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 101710096830 DNA-3-methyladenine glycosylase Proteins 0.000 description 4
- 102100039128 DNA-3-methyladenine glycosylase Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001079084 Homo sapiens Ras-related protein Rab-18 Proteins 0.000 description 3
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 3
- 102100028149 Ras-related protein Rab-18 Human genes 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000592342 Tracheophyta Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 2
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- YVRXAUDZWLBQFI-LFWCVFAXSA-N (2r,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)-2-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1[C@@]1(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YVRXAUDZWLBQFI-LFWCVFAXSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004507 Abelmoschus esculentus Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 240000000662 Anethum graveolens Species 0.000 description 1
- FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N Anthron Natural products COc1cc2Cc3cc(C)cc(O)c3C(=O)c2c(O)c1C=CC(C)C FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241001513358 Billardiera scandens Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241001214984 Crinum thaianum Species 0.000 description 1
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N Gly-Glu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N Gly-Val-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 101000918926 Homo sapiens Sphingolipid delta(4)-desaturase/C4-monooxygenase DES2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N Leu-Ala-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 240000006828 Macroptilium lathyroides Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 1
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 241001646133 Myrothamnus flabellifolia Species 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 244000230712 Narcissus tazetta Species 0.000 description 1
- -1 Nematoda Chemical compound 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000208134 Nicotiana rustica Species 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 244000062780 Petroselinum sativum Species 0.000 description 1
- CWFGECHCRMGPPT-MXAVVETBSA-N Phe-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CWFGECHCRMGPPT-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 101100314406 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TPS1 gene Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100029473 Sphingolipid delta(4)-desaturase/C4-monooxygenase DES2 Human genes 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HDYANYHVCAPMJV-LXQIFKJMSA-N UDP-alpha-D-glucuronic acid Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HDYANYHVCAPMJV-LXQIFKJMSA-N 0.000 description 1
- DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 101150047356 dec-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 235000013572 fruit purees Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-HSUXUTPPSA-N keto-D-fructose 6-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000011197 perejil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 101150076896 pts1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000006491 synthase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150074622 treP gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003625 trehaloses Chemical class 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae pro trehalóza-6-fosfátsyntázu, který je pod kontrolou nekonstitutivního rostlinného promotoru, přičemž transformovaná rostlina má kapacitu pro syntézu trehalózy větší než je kapacita netransformované rostliny. Řešení lze použít pro ochranu běžných kulturních rostlin proti suchu, vysokému obsahu solí a teplotním extrémům, a pro zlepšení skladovacích vlastností sklizených rostlin, zahrnujících "zelené" potraviny, trhané ovoce a okrasné rostliny.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká genetického inženýrství rostlin s cílem zavést schopnost syntetizovat trehalózu. Konkrétně se vynález týká rostlin, které mají zvýšený obsah trehalózy, a způsobu, jak je připravit. Vynález se rovněž týká způsobů jak navodit zvýšení tolerance rostlin ke stresům, jako například chladu a suchu, i způsobu jak navodit produkci trehalózy.
Dosavadní stav techniky
Trehalóza (cc-glukopyranosyl-a-D-glukopyranóza) je dimer glukózových molekul, spojených přes jejich redukující skupiny. Vzhledem k neobvyklé kombinaci svých chemických vlastností ve srovnání sjinými cukry, včetně nedostatku redukujících skupin, pomalé hydrolýzy a schopnosti vytvářet nerozpustné „sklo“, se jedná o jednu z nejúčinnějších látek používaných pro ochranu bílkovin, buněčných membrán a jiných biologických látek in vitro. Podobně pro žijící organizmy, které obsahují velká množství trehalózy je charakteristické, že jsou často vystaveny osmotickému, dehydratačnímu a tepelnému stresu. Jedná se o hmyz, některé litorální živočichy a řadu mikroorganizmů, včetně kvasinek a bakterií. Existuje podrobný důkaz, který shrnul Wiemken v roce 1990 v časopise Antomie van Leeuwenhoek 58, 209-217, že primární rolí trehalózy v pekařských kvasinkách je navozovat odolnost k těmto stresům. Předpokládá se však rovněž (Nwaka et al. (1994) FEBS Letters 344, 225-228; Van Dijk et al. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61, 109-115), že akumulace trehalózy v pekařských kvasinkách sama o sobě není dostatečná k navození tolerance ke stresu.
Vysoké hladiny trehalózy se vyskytují v takzvaných „resurrection plants“, jako například u kapradiny Selaginella lepidophylla, která jsou schopné přežít dlouhodobé vysušení a vystavení vysokým teplotám (viz shrnující článek Avigadův (1982) v Encyclopedia of Plant Research (New Series) 13 A, str. 217-347). Velká většina cévnatých rostlin však není schopna syntetizovat trehalózu. Tyto rostliny často akumulují jiné „kompatibilní“ rozpuštěné látky, jako je glycin betain, prolin a různé polyoly, v odpovědi na stres způsobený například suchem, které snižují dostupnost intracelulámí vody (viz shrnující článek McCue a Hansona (1990) Trends in Biotechnology 8, 358-362).
Existuje velmi málo údajů o přítomnosti trehalózy u krytosemenných rostlin, a většinou se jedná o malá množství, která pravděpodobně odrážejí mikrobiální kontaminaci (např. Kandler a Senser (1965) Z. Pflanzenphysiol. 53, 157-161; Oesch a Meier (1967) Phytochemistry 6, 1147-1148). Opravdu byl vysloven názor, že trehalóza je toxická pro mnoho rostlinných tkání (Veluthambi et al. (1981) Plant Physiol. 68, 1369-1374), zejména pro ty, které mají nízkou nebo nulovou aktivitu trehalózy (trehalóza je enzym, který převádí trehalózu na glukózu). Avšak alespoň jedna krytosemenná rostlina, Myrothamnus flabellifolia (další z takzvaných „resurrection plants“), akumuluje značná množství trehalózy (Bianchi et al. (1993) Physiologia Plantarum 87,223-226), což ukazuje na to, že neexistuje absolutní kompatibilní bariéra mezi trehalózou akrytosemennými rostlinami.
Nepřítomnost trehalózy u většiny krytosemenných rostlin a zmíněná toxicita zjištěná u některých z nich ukazuje, že po zavedení syntetické dráhy pro trehalózu do těchto rostlin lze v některých případech očekávat negativní účinky. Na druhé straně, úspěšná produkce trehalózy v rostlinách by představovala podstatnou výhodu. Trehalózou akumulovanou například v zásobních orgánech cukrovky, bramboru, cibule a podobně, by bylo možné extrahovat na komerční bázi a tak získat trehalózu při nákladech, které by byly kompetitivní ve srovnání se sacharózou v určitých aplikacích. Takové aplikace zahrnují výrobu sušených potravin (práškové mléko a vejce, polévky, ovocné pyré, atd.), protože trehalóza chrání vůni a strukturu mnoha potravinových produktů
- 1 CZ 294329 B6 v průběhu ekonomicky výhodných sušicích postupů, a v tomto ohledu vysoce překonává obdobný efekt sacharózy (viz např. Roser (1991) Trends in Food Science and Technology, July, str. 166-169; Roser a Colaco (1993) New Scientist, May, str. 25-28). V porovnání se sacharózou je další výhodou trehalózy v mnoha případech (polévky, prášková vejce) skutečnost, že není sladká, a dále i to, že z ní nevzniká fruktóza, která je považována za riskantní pro lidské zdraví. Vysoká cena trehalózy však činí její využití v průmyslové výrobě sušených potravin příliš nákladným. Za druhé, produkce trehalózy v jedlých částech určitých rostlin by vedla k prodloužení skladovatelnosti produktů, jako jsou například rajčata. Za třetí, hromadění trehalózy v citlivých tkáních zvyšuje toleranci rostlin k mrazu, suchu, vysokému obsahu soli a podobným stresům.
Podstata vynálezu
Na základě toho, co je uvedeno výše, je předmětem vynálezu poskytnutí nové schopnosti rostlinám syntetizovat trehalózu. Konkrétně je předmětem vynálezu poskytnutí schopnosti řízené akumulovat trehalózu v rostlinných tkáních, jako komerčním zdroji trehalózy, nebo pro navození tolerance ke stresu, nebo za obojím účelem, a přitom minimalizovat potenciálně nepříznivé vlivy trehalózy na růst rostlin.
Vynález je založen na způsobu transformace rostlin strukturálními geny pro syntézu trehalózy, které jsou pod kontrolou vhodných rostlinných promotorů, s cílem produkce transgenních rostlin se zvýšeným obsahem trehalózy. Konkrétně se jedná o to, že kódující sekvence jednoho nebo několika genů kódujících polypeptidy enzymů produkujících trehalóza-6-fosfát nebo samotnou trehalózu, jsou podle vynálezu exprimovány v rostlinách pod kontrolou specifických rostlinných promotorů.
Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae pro trehalóza-6fosfátsyntázu, který je pod kontrolou nekonstitutivního rostlinného promotoru, má kapacitu pro syntézu trehalózy větší než je kapacita netransformované rostliny.
Tedy daná rostlina je transformována alespoň kódující sekvencí genu pro trehalóza-6-fosfátsyntázu (TreóPsyntáza) vhodně fúzovanou s rostlinným promotorem takovým způsobem, že kplné expresi genu dochází pouze když rostlina dozrává, nebo když se setká se specifickými podmínkami prostředí. Promotory jsou proto s výhodou nekonstitutivní a vybrané tak, aby dovolily dočasnou (např. diumální), topologickou (např. tkáňově specifickou), nebo stresem aktivovanou (nebo „stresem indukovanou“) kontrolu exprese genů. Rostlinu lze rovněž transformovat jedním nebo několika geny kódujícími trehalóza-6-fosfatázu (Tre6Pázu) nebo regulačním polypeptidem, který interaguje s Tre6Psyntázou nebo Tre6Pázou nebo oběma.
Transformaci rostliny lze provést kterýmkoli ze způsobů dostupných v oboru, včetně infekce transformovaným Agrobacter tumefaciens a přímou introdukcí cizorodé DNA mikroinjekcí, elektroporací, bombardováním částicemi a přímým transportem DNA. Strukturální geny jsou výhodně zvoleny ze skupiny zahrnující kvasinkové geny TPS1, TPS2, a TSL1, které kódují Tre6Psyntázu o molekulové hmotnosti 56 kDa, Tre6Pázu o hmotnosti 102 kDa a regulační subjednotky kvasinkové trehalosyntázy o molekulové hmotnosti 123 kDa.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsob produkce transgenních rostlin se zvýšeným obsahem trehalózy. Tento způsob zahrnuje kroky transformace dané rostliny strukturálními geny pro syntézu trehalózy, zejména genem pro Tre6Psyntázu, jak je uvedeno výše, a exprese těchto genů pod kontrolou vhodného promotoru, který umožní dočasnou, topologickou nebo stresem indukovanou kontrolu exprese uvedených genů.
-2CZ 294329 B6
Třetím předmětem vynálezu je produkce trehalózy, která zahrnuje kroky:
- transformaci rostliny alespoň jedním strukturálním genem pro TreóPsyntázu s cílem vzniku transgenní rostliny,
- kultivaci transgenní rostliny za podmínek, které budou indukovat expresi syntézy trehalózy v rostlině, a
- extrakci trehalózy z rostlinných tkání.
Čtvrtým předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu ochrany rostlin proti nepříznivým podmínkám jako jsou sucho, vysoký obsah soli, teplotní extrémy a jiné stresy. Tento způsob zahrnuje transformaci rostliny alespoň kódovací sekvencí genu pro trehalóza-6-fosfátsyntázu, která je vhodně fúzovaná s rostlinným promotorem, takže plná exprese genu se neuskuteční, dokud se rostlina nesetká s nepříznivými podmínkami. Rostlinu lze výhodně současně transformovat jedním nebo několika geny kódujícími trehalóza-6-fosfatázu a regulační proteiny, které stabilizují aktivitu trehalóza-6-fosfát-syntázy nebo trehalóza-6-fosfatázy nebo obou. Například, vynález poskytuje způsob ochrany rostlin majících bobule nebo jiné plody proti poškození květů mrazem, což je umožněno transformací rostliny genem pro trehalóza-6-fosfatázu, který je vhodně fúzovaný s rostlinným promotorem, takže k plné expresi genu nedojde, pokud se rostlina nedostane do nízké teploty.
Pátým předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu produkce transformovaných okrasných rostlin, které nevyžadují tak intenzivní a odbornou péči jako netransformované rostliny. Tento způsob zahrnuje transformaci rostliny genem pro trehalóza-6-fosfátsyntázu, který je vhodně fúzován s rostlinným promotorem, takže rostlina obsahuje trehalózu v některých svých tkáních.
Krátký popis obrázků
Obr. 1. ukazuje schematicky strukturu chimérického genového produktu, obsahujícího malý subjednotkový promotor Rubisco A. thaliana (pastsl A), zfúzovaný s kvasinkovým genem TPS1, který kóduje subjednotku Treó-Psyntázy a stop signál transkripce z genu pro nopalinsyntázu Agrobacterium tumefaciens (nos). Je ukázána pouze část plazmidu pKOH51 s genovou chimérou. Jsou ukázána unikátní místa pro štěpení restrikčními enzymy významná pro konstrukci genové chiméry.
Obr. 2. uvádí výsledky Western blot analýzy transgenních rostlin tabáku, které ukazují TPS1 produkt o molekulové hmotnosti 56 kDa. Produkt je označen šipkou. Proteiny byly extrahovány z transformovaných rostlin tabáku, obsahujících (dráhy 1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 16 a 19) konstrukt popsaný na obr. 1 nebo (GUS) další genovou chiméru, obsahující promotor mozaikového viru květáku o molekulové hmotnosti 35S, zfúzovaný s genem pro β-glukuronidázu (UIDA) ve stejném vektoru nebo (SRÍ) z netransformovaných rostlin tabáku. Stejná množství proteinu byla nanesena do každé z drah. Použité antisérum (anti-57) bylo připraveno proti subjednotce kvasinkové TreóPsyntázy o molekulové hmotnosti 56 kDa.
Obr. 3. ukazuje chromatografickou identifikaci trehalózy. Vzorky (20 1) vodných extraktů tabákových listů byly analyzovány pomocí HPLC tak, jak je popsáno v Obecném materiálu a metodách. Extrakty A a B obsahovaly 192 mg čerstvé hmotnosti transformantu rostoucího ve skleníku v 19 ml (A) před a (B) po působení trehalózy. Extrakty C a D obsahovaly 149 mg listové hmoty na ml z (C) transformanta 4 nebo (D) kontrolní rostliny transformované plazmidem pDElOOl, který neobsahoval gen TPS1. Obě rostliny byly kultivovány za sterilních podmínek. Maxima trehalózy jsou označena T. Dvě velká maxima s retenčním časem okolo 25 minut (maxima 7 a 8 v A) jsou glukóza a sacharóza.
Obr. 4. Záznam proteinové imunoblotovací techniky ukazující tkáňovou lokalizaci TPSl-subjednotky analyzované u atsl-TPSl transformované linie 4. Listy divokého tabáku (SRÍ) byly použity jako negativní kontrola a 0,1 g TreóPsyntázové subjednotky purifikované z kvasinky (TPS1) jako pozitivní kontrola. Trehalózový obsah stejných tkání je uveden v mg/g suché hmotnosti nad imunoblotovým záznamem. Zkratka nt znamená netestováno. Dále jsou použity následující zkratky: FB, květní pupeny; UL, horní listy; ML, střední listy; LL, spodní listy; US, horní stonek; R, kořeny; EC, enzymová kontrola.
Obr. 5. Zvýšená tolerance k suchu v rostlinách produkujících trehalózu. Oddělené listy ze stejného vývojového stadia rostlin starých 6 až 8 týdnů, které byly kultivovány in vitro, byly sušeny na vzduchu (25 % RH). (A) V časech, které jsou uvedeny, byly listy váženy a výsledky uvedeny jako relativní čerstvá hmotnost listů v každém čase. Suchá hmotnost každého listu byla získána po sušení listů při +60 °C po dobu 48 hodin. Kontrola s divokým typem tabáku je označena SRÍ a trehalózu produkující transgenní linie 1, 4 a 8 jsou označeny jejich odpovídajícími čísly. (B) Vzhled oddělených listů transgenní linie 4 a kontrolních rostlin ve vybraných časech během působení stresu.
Obr. 6. Přežívání kontrolních a trehalózu produkujících tabákových rostlin za podmínek sucha. (A) 6 až 8 týdnů staré intaktní rostliny pěstované in vitro byly vystaveny sušení vzduchem (D) po doby, vyznačené v grafu. Po 17 hodinách působení stresu byly netransformované kontrolní rostliny (SRÍ) a trehalózu produkující transgenní rostliny linií 4 a 8 rehydratovány (R) tím, že rostliny byly umístěny do vody. (B) 3 týdny staré rostliny transgenní linie 8 a jak netransformované (SE1) tak vektorem transformované (C) kontrolní rostliny byly vystaveny sušení vzduchem (D) po indikovaný čas. Rostlinky byly následně rehydratovány (R) po 7 hodinách působení stresu tím, že byly umístěny do vody.
Obr. 7. SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti sodium dodecylsulfátu), analýza frakcí obsahujících TreóPsyntázu M. smegmatis eluovanou z prvního HeparinSepharózového sloupce. Dráhy 1 až 4 obsahují popořadě vzorky H33 (7,0 mU), H35 (20 mU), H36 (21 mU) a 37 H37 (12 mU) (Tab. 3). Po provedení SDS-PAGE v 8% akrylamidu byly geny obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue. Velikosti standardů molekulové hmotnosti v dráze 5 jsou uvedeny v kDa. Poloha polypeptidu TreóPsyntázy o molekulové hmotnosti 55 kDa je označena šipkou.
Obr. 8. SDS-PAGE analýza frakce z oblasti maxima TreóPsyntázy M. smegmatis eluované z druhého Heparin-Sepharózového sloupce. Frakce T21 (Tab. 3) byla koncentrována ve zkumavce Centricon 10 a následně smísena s polovinou objemu třikrát koncentrovaného pufru, používaného pro vzorky při SDS-PAGE. Celková koncentrace byla šestinásobná. Vzorky obsahující (dráha 1) 2,9 mU a (dráha 3) 8,7 mU TreóPsyntázy byly analyzovány SDS-PAGE v 8% akrylamidu a obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue. Standardy molekulárních hmotností v dráze 2, seřazené podle velikosti, byly 109, 84, 47, 33, 24 a 16 kDa.
Obr. 9. Western analýza TreóPsyntázy purifikované zM. smegmatis. Na 8% akrylamidový gel byly naneseny předem obarvené markéry molekulové hmotnosti (dráha 1: 200, 117, 80 a 47 kDa; dráha 10: jediný viditelný markér má 84 kDa), čistá TreóPsyntáza z frakce T21 (Tab. 3) (dráhy 7 a 8: 2,9 mU; dráhy 3, 4 a 9: 8,7 mU) a spojené aktivní frakce ze Sephadexu G100 (Tab. 3) (dráha 6: 7,8 g celkového proteinu; dráhy 2 a 5: 23 g celkového proteinu). Po provedení elektroforézy a přenosu na nitrocelulózu byla nitrocelulózová membrána rozstřižena mezi dráhami 3 a 4 a mezi dráhami 7 a 8. Dráhy 1 až 3 byly obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue, detekce na dráhách 4 až 7 byla provedena anti-57 sérem, které bylo získáno imunizací proti purifikované subjednotce kvasinkové TreóPsyntázy, mající molekulovou hmotnost 56 kDa, a detekce na dráhách 8 až 10 byla provedena pomocí preimunního séra. Imunoreaktivní pásy byly zviditelněny použitím kozího, antikráličího IgG-alkalická fosfatáza konjugátu (Promega) podle instrukcí výrobce. V obou případech byly časy vybarvení 2,8 minut. Diagonální čáry napříč dráhám 4 až 7 byly způsobeny náhodným zvarhaněním membrány během přenosu na nitrocelulózu.
-4CZ 294329 B6
Obr. 10. Western analýza 8 transgenních linií Arabidopsis thaliana. Rostliny vypěstované ze semen primárních transformantů byly extrahovány a analyzovány pomocí antiséra, připraveného proti subjednotce kvasinkové TreóPsyntázy, mající molekulovou hmotnost 56 kDa, tak jak je popsáno na obr. 2. Subjednotka TreóPsyntázy purifikovaná z kvasinky (0,1 g) byla použita jako pozitivní kontrola. Netransformovaná A. thaliana nedává žádný signál.
Podrobný popis vynálezu
V následujícím popisu výraz „konstitutivní rostlinný promotor“ označuje rostlinné promotory, které vyvolávají kontinuální a obecnou expresi s nimi asociovaných kódujících sekvencí, takže produkty těchto sekvencí jsou nalézány ve všech buňkách rostliny a ve všech fázích růstu. Nekonstitutivní promotory naproti tomu jsou aktivovány specifickými vnitřními nebo vnějšími událostmi, jako například diferenciací buněk, které vyúsťují v tvorbu zvláštních tkání v průběhu vývoje a zrání rostliny, nebo změnami v prostředí rostliny. Je známo mnoho typů změn prostředí, které aktivují zvláštní promotory. Příklady zahrnují světlem indukovanou aktivaci promotorů pro malou subjednotku ribulóza-l,5-bisfosfátkarboxylázy (Krebbers et al. (1988) Plant. Mol. Biol. 11, 745-759), jako například promotor astlA, použitý v příkladech 1 až 3, a aktivaci promotorů různými stresy, jako například LTI78 (Nordin et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 21, 641—653) a RAB18 (Lang a Palva (1992) Plant. Mol. Biol. 20, 951-962). Avšak náš vynález není omezen těmito příklady nekonstitutivních promotorů. Důležitou a novou částí vynálezu je koncept, že konstitutivní syntéza trehalózy rostlinou bude vždy neekonomická a někdy působící negativně, takže výhody produkce trehalózy popisované v této patentové přihlášce lze nejlépe uskutečnit pomocí nekonstitutivních promotorů. Díky těmto nekonstitutivním promotorům je biosyntéza trehalózy v transgenních rostlinách podřízena dočasné kontrole (tj. probíhá pouze v určitou dobu), topologické kontrole (tj. je omezena pouze na určité části rostliny), nebo oběma typům kontrol zároveň.
Názvy rostlinných orgánů použité v tomto popisu jsou obecně používány v zelinářských a ovocnářských kruzích jak pěstiteli, tak i zákazníky. Takto například slovo „plod“ představuje ty části jabloně nebo jahodníku, které jsou prodávány za účelem jídla, ačkoli tyto skladované tkáně obsahující semena samy o sobě nejsou plody v přísném botanickém smyslu slova. Zmínili jsme již, že téměř všechny druhy cévnatých rostlin nejsou schopny syntetizovat trehalózu, takže termín „trehalózu produkující“ rostliny nevyžaduje kvantitativní definici. Avšak možnost, že některé běžné rostliny (jiné než takzvané „resurrection plants“) produkují trehalózu během stresu, dosud nebyla prozkoumána. Tento vynález se týká genetického inženýrství rostlin s cílem vnést heterologní schopnost syntézy trehalózy (v tomto kontextu ji lze rovněž nazývat „nová“ schopnost syntézy trehalózy). Požadovaný vzrůst obsahu trehalózy, ve srovnání s netransformovanou rostlinou, která roste za identických podmínek, buď představuje užitečné zlepšení tolerance ke stresu nebo jej lze využít pro extrakci trehalózy z rostliny za komerčním účelem.
Mnoho mikrobních organizmů obsahuje enzymové systémy, které produkují trehalóza-6-fosfát (Tre6P) a hydrolyzují tuto látku na trehalózu. Například Saccharomyces cerevisiae obsahuje trehalózosyntázový komplex zahrnující subjednotky o molekulové hmotnosti 56, 102 a 123 kDa (Londesborough a Vucrio (1993) Eur. J. Biochem. 216, 841-848), který kondenzuje uridindifosfoglukózu (UDPG) a glukóza-6-fosfát (Glc6P) nejprve na TreóP (TreóPsyntázová reakce) a potom na volnou trehalózu (TreóPázová reakce). Za TreóPsyntázovou a TreóPázovou aktivitu jsou zodpovědné subjednotky o 56 a 102 kDa a subjednotka mající molekulovou hmotnost 123 kDa má regulační vlastnosti a stabilizuje celý komplex. Jiné mikrobní systémy zahrnuji systém Candida utilis (Soler et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters 61, 273-278), Escherichia coli (Glaever et al. (1988) J. Bacteriol. 170, 2841-2849), Dictyostelium discoideum (Killick (1979) Arch. Biochem. Biophys. 196, 121-123) a Mycobacterium smegmatis (Lapp et al. (1971) J. Biol. Chem. 246, 4567-4579), z nichž poslední dva systémy jsou schopny využívat adenindifosfoglukózu (ADPG) jako alternativu k UDPG. Málo je známo o subjednotkové struktuře těchto
-5CZ 294329 B6 dalších mikrobních systémů. Mnohobuněčné organizmy, které syntetizují trehalózu, jako jsou Nematoda, hmyz a tzv. „resurrection plants“, pravděpodobně též obsahují enzymy mající TreóPsyntázovou a TreóPázovou aktivitu.
V principu přenos kterékoli z těchto TreóPsyntáz do rostlin udělí rostlinám novou schopnost syntetizovat Tre6P. Bylo zjištěno, že některé rostliny, jako například tabák, mají vrozenou schopnost převádět Tre6P na trehalózu, takže, překvapivě například, transformace tabáku samotným genem pro TreóPsyntázu, vede k účinné produkci trehalózy. Avšak, jestliže je endogenní konverze Tre6P na trehalózu pomalá nebo vůbec neprobíhá, lze rovněž přenést TreóPázu z některého z vhodných zdrojů. Systémy jako je kvasinkový enzym, kde TreóPsyntáza a TreóPáza jsou subjednotky trehalózasyntázy, je výhodné kotransformovat rostliny geny pro TreóPsyntázu a TreóPázu ze stejného zdroje, takže se vytvoří přirozený komplex enzymů. Ať je zdroj enzymů jakýkoli, lze trehalózu vytvářenou v transgenních rostlinách extrahovat anebo tento cukr nám navodí zvýšenou toleranci k určitým typům stresu. Produkce trehalózy v rostlinách transformovaných tímto způsobem určitými kvasinkovými geny již byla popsána (PCT/FI93/00049).
Avšak ačkoli akumulace trehalózy v určitém čase (např. během vystavení stresu nebo ve zralé rostlině) a v určitých tkáních (např. zásobních orgánech nebo, ve vhodném čase, ve tkáních citlivých k mrazu) bude mít pravděpodobně pozitivní účinek, nebo alespoň nebude pro rostlinu škodlivá, existuje reálná možnost, že v jiném čase a v jiných tkáních bude akumulace trehalózy pro rostlinu škodlivá (Veluthambi et al. (1971) loc. cit.). Je proto výhodné používat rostlinný promotor (promotor je část genu, která stimuluje transkripci kódující sekvence), který nedovoluje plnou expresi genu nebo genů, a vyvolá syntézu trehalózy až když rostlina je zralá, nebo se dostane do podmínek prostředí (jako je sucho nebo nízká teplota), kdy výhody přítomnosti trehalózy převýší její možné nevýhody pro rostlinu. V oboru je známo několik příkladů takových nekonstitutivních rostlinných promotorů, včetně promotoru malé subjednotky ribulóza-l,5-bisfosfátkarboxylázy (Rubisco), který umožňuje světlem indukovanou expresi malé subjednotky RUBISCA (Krebbers et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11, 745-759).
Tabák a rostliny Arabidopsis transformované kódující sekvencí (otevřený čtecí rámec, ORF) kvasinkového genu TPS1, správně fúzovanou s promotorem atslA genu pro malou subjednotku Rubisco, jsou známy. TPS1 kóduje subjednotku kvasinkové trehalózasyntázy mající molekulovou hmotnost 56 kDa. Transformované rostliny jsou zdravé a fertilní, a obsahují ve svých listech trehalózu. Netransformovaný tabák nebo tabák transformovaný podobným vektorem bez genu TPS1 neobsahují trehalózu. Tyto zveřejněné transgenní rostliny byly získány s použitím A. tumefaciens, který zprostředkoval transformaci, ale lze použít kterýkoli způsob dostupný v oboru, včetně přímé introdukce DNA mikroinjekci, elektroporaci nebo bombardování částicemi (Gasser a Fraley (1989) Science 244, 1293).
Jedna z těchto transformovaných tabákových rostlin (transformant 4) obsahuje aktivitu TreóPsyntázy. Volná, 56 kDa těžká subjednotka je nestabilní, jestliže ji izolujeme z intaktního kvasinkového komplexu trehalózysyntázy (Londesborough a Vuorio (1993) loc. cit.). Jsou popsány způsoby, jimiž odborník dokáže kontransformovat rostliny TPS1 genem a jedním nebo oběma ostatními geny kvasinkové trehalózasyntázy (TPS2 a TLS1), a umístit je pod kontrolu rostlinných promotorů, např. promotoru atslA nebo některého vhodného promotoru, který je konstitutivní. Taková kotransformace často zvýší obsah trehalózy v rostlině ve srovnání s obsahem trehalózy rostlin obsahujících pouze TPS1, protože subjednotky kódované TPS2 aTSLl stabilizují subjednotku mající molekulovou hmotnost 56 kDa.
V rostlinách kontransformovaných genem pro TreóPsyntázu (kontrolovaným indukovatelným promotorem) spolu s jedním nebo několika geny pro TreóPázu nebo regulačními proteiny (jako například produkt TSL1), regulovanými konstitutivními promotory, bude produkce trehalózy kontrolována indukovatelným promotorem, protože TreóPsyntáza katalyzuje první jedinečný krok biosyntézy trehalózy.
-6CZ 294329 B6
Bylo prokázáno, že transformované rostliny tabáku produkující trehalózu vykazují zvýšenou toleranci k suchu. Bylo to dokázáno v experimentech, prováděných jak s oddělenými listy, tak i s celými rostlinami. Zlepšená tolerance k suchu je vykazována zralými rostlinami i mladými rostlinkami potomstva transformantů získaného samosprášením. V tomto potomstvu tolerance suchu kosegregovala se znakem TPS1, jak ukázala přítomnost subjednotky TreóPsyntázy, mající molekulovou hmotnost 52 kDa, v zelených tkáních potomstva.
Tolerance k vodou vyvolanému stresu u uvedených transgenních rostlin je překvapující, protože množství trehalózy zjištěné vjejich tkáních se zdá být příliš malé, aby zajistilo osmotické pufrování vnitrobuněčného obsahu. Je možné, že trehalóza funguje tak, že chrání specifická místa, jako jsou membrány, nebo trehalóza či její prekurzor (TreóP) mění rostlinný metabolizmus tak, že vyvolávají sekundární změny, které chrání buňky proti stresu.
Bylo zjištěno, že malé morfologické změny pozorované u primárních transformantů obsahujících genovou chiméru TPS1 genu, jako jsou například listy ve tvaru skalpelu, snížená apikální dominance nebo menší výška, většinou zmizely u potomstva, které ještě produkovalo trehalózu. Tyto alterace se zdají být většinou artefakty vyvolané kultivaci ve formě tkáňových kultur. Avšak bylo zjištěno, že trehalózu produkující tabákové rostliny, včetně potomstva získaného samosprášením, rostou poněkud pomaleji, neboť se opožďují za kontrolními rostlinami o 1 až 2 týdny po 8týdenním růstu za optimálních podmínek. Tato skutečnost ukazuje na to, že syntéza trehalózy v rostlinách, i když je pod kontrolou atslA promotoru, někdy zpomaluje růst. Tedy stresem indukované promotory, jako je LT178 (Nordin et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 21, 641-653), lze použít v pozitivním smyslu k udržení normálních růstových rychlostí a výtěžků za podmínek nepřítomnosti stresu, a tyto promotory současně poskytují trehalózou indukovanou ochranu v přítomnosti stresu, tak jak je vysvětleno v příkladu 5.
Tyto transgenní rostliny syntetizovaly trehalózu, ačkoli byly transformovány pouze kvasinkovým genem TPS1, kódujícím TreóPsyntázu a nikoli genem TPS2, který kóduje TreóPázu. Tedy některé rostliny mají endogenní aktivitu převádějící TreóP na trehalózu. V některých případech je výhodné kotransformovat rovněž rostlinu genem kódujícím TreóPázu, jako je například TPS2, aby se zvýšila rychlost konverze TreóP na trehalózu. Dále je zřejmé, že podobné výsledky lze dosáhnout s geny pro TreóPsyntázu (a TreóPázu), získanými z jiných organizmů než z kvasinek. Řada těchto genů je homologních sTPSl (a TPS2), a lze je snadno klonovat s použitím imunologických nebo oligonukleotidových prób, odvozených od enzymů a genů kvasinkového systému. Například TreóPsyntáza Mycobacterium smegmatis obsahuje 56 kDa těžký polypeptid, který křížově reaguje s antisérem připraveným proti purifikované subjednotce kvasinkové TreóPsyntázy o molekulové hmotnosti 56 kDa. Aminokyselinové sekvence tryptických peptidů z enzymu M. smegmatis jsou známy a mají blízkou sekvenční homologii s kvasinkovým enzymem. Odborník dokáže snadno klonovat geny pro TreóPsyntázu a TreóPázu z mnoha organizmů, jestliže použije uvedené přístupy. Náš vynález se týká transformace rostlin geny pro TreóPsyntázu a TreóPázu, získanými z jakéhokoli vhodného organizmu a fúzovanými s vhodnými rostlinnými promotory.
Rostliny obsahující trehalózu jako výsledek transformace jedním nebo několika geny pro trehalózasyntázu, lze použít několika způsoby. Například trehalózu lze extrahovat z rostlin na komerční bázi. Tato trehalóza je dostatečně levná pro použití ve velkém množství pro zachování chuti, vůně a struktury látek v potravinách během sušení. Pro tento způsob použití je lépe, jestliže je trehalóza akumulována v zásobním orgánu, jako je například hlíza bramboru, kořen cukrové a jiné řepy, nebo cibule cibulovitých rostlin. Byly popsány způsoby pro transformaci těchto uvedených a mnoha jiných plodin (Lindsey (1992) J. Biotechnol. 26, 1-28), avšak náš vynález není omezen těmito rostlinami, které jsou často používány jako modely molekulární biology. Způsoby vyvinuté pro modelové rostliny lze upravit pro použití s jinými rostlinami. V důsledku toho lze tuto patentovou přihlášku použít například pro stonek a listy transformované cukrové řepy, nebo plod banánu. V oboru jsou známy rostlinné promotory (např. patatinový promotor),
-7CZ 294329 B6 které vyvolávají specificky expresi v zásobním orgánu. V jednom provedení tohoto vynálezu je kódující sekvence genu pro TreóPsyntázu (např. TPS1) zfázována s takovým promotorem stejným způsobem, jako byla kódující sekvence TPS1 zfázovaná s promotorem atsl, a vhodné rostliny jsou transformovány těmito konstrukty DNA. Trehalózu, která se akumuluje v zásobních orgánech lze potom extrahovat.
V dalším provedení tohoto vynálezu, kdy se trehalóza akumuluje v tkáních rostliny, dochází ke zlepšení skladovacích vlastností po sklizni. V důsledku toho ztrácejí oddělené listy transformovaného tabáku vodu pomaleji než listy tabáku netransformovaného, a i po ztrátě vody neztrácejí barvu (obr. 5). Tento aspekt lze využít i u jedlých a okrasných rostlin. U rostlin používaných jako potrava například zkroucení a odbarvení různých druhů komerčně prodávaných salátů které nastává po sklizení rostlin, představuje závažný ekonomický problém, zejména v prodejnách maloobchodu. Konečné náklady však vždy platí zákazník.
Trehalózu produkující hlávkový salát (locika) zajistí zákazníkům levnější a lepší saláty. Podobně lze uvažovat i o jiných druzích rostlin, které se používají v kuchyni, zejména se to týká zeleniny, kde se v kuchyni používají listy, jako například zelí, brokolice, špenát, kopr nebo petržel, anebo ostatní zelená zelenina jako hrášek a fazol šarlatový. Řada okrasných květin, například růže, tulipány a narcisy, jsou po uříznutí dopravovány dále. I v podmínkách nákladné dopravy v chladicích vozech nebo letadly dochází k velkým ztrátám na zboží. Opět náklady za tyto škody zaplatí zákazník, který v případě využití okrasných květin produkujících trehalózu získá levnější a krásnější produkty, které lépe zadržují svůj obsah vody a méně podléhají odbarvování. V tomto případě, týkajícím se našeho vynálezu, je gen pro TreóPsyntázu zfázován s rostlinným promotorem, který je zvolen tak, že se trehalóza akumuluje v rostlinných částech, které se mají sklízet. Například promotor atslA vyvolává expresi TreóPsyntázy v listech, horním stonku a květních pupenech tabáku a trehalóza se akumuluje v těchto částech. Avšak vynálezci uvádějí ve známost, že rostliny jako tabák přenášejí trehalózu z místa její syntézy do tkání, které tento cukr nesyntetizují. Takto byla malá množství trehalózy rovněž nalezena v kořenech těchto transgenních rostlin tabáku, ačkoli nekonstitutivní promotor astlA nevyvolal expresi TreóPsyntázy v kořenech.
V aspektu vynálezu, který má vztah k tomu, co je uvedeno výše, jsou jedlé části transformovaných rostlin, obsahujících trehalózu, jako například rajčata, bobule a jiné plody, zpracovávány na pyré, pasty, želé a zavařeniny, které mají čerstvější a bohatší vůni a chuť, díky tomu, že obsahují trehalózu. Bylo zjištěno (WO 89/00012), že přidání trehalózy do takových potravinových produktů zlepšuje zachování jejich chuti a vůně, zejména, jestliže zpracování zahrnuje sušení. Tento vynález obchází potřebu přidávat trehalózu tím, že dává k dispozici rostlinu, která již sama trehalózu obsahuje. Výhodou z hlediska tohoto aspektu našeho vynálezu je použití promotorů takových jako je například patatinový promotor, které směrují syntézu trehalózy primárně do zásobního orgánu cílové rostliny.
Bylo ukázáno, že transformovaný tabák, který produkuje trehalózu, má zvýšenou odolnost proti suchu. Obecně jsou transformované rostliny obsahující trehalózu odolnější vůči suchu, mrazu, vysokému obsahu soli a jiným stresům, v porovnání s netransformovanými rostlinami. Sucho, mráz a osmotický stres negativně ovlivňují rostliny zejména tím, že odnímají vodu z buněk a tím poškozují membrány a proteiny. Tento efekt je v podmínkách in vitro zmírněn trehalózou (Crowe et al. (1992) Annu. Rev. Physiol. 54, 579). V tomto aspektu vynálezu je použitý rostlinný promotor takový, který je indukován stresem. V oboru jsou takové promotory známy, například LTI78 (Nordin et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 21, 641-653) a RAB18 (Lang a Palva (1992) Plant. Mol. Biol. 20, 951-962). Takový promotor zabrání syntéze trehalózy pokud tato není potřeba. Pro rostliny, které rostou dobře jestliže obsahují trehalózu, tohoto aspektu vynálezu lze dosáhnout, aniž bychom se uchýlili k použití stresem indukovaného promotoru. Avšak použití stresem indukovaných promotorů k zabránění produkce trehalózy, pokud ji není třeba, má další výhody vtom, že se vyhneme sníženému výtěžku rostliny, vyplývajícímu z částečného využití kapacity fotosyntézy na syntézu trehalózy, a tím i možnému zpomalení růstu, tak jak bylo
-8CZ 294329 B6 ukázáno pro tabák obsahující chiméru patslA-TPSl. Tento aspekt má použití nejen v oblasti rostlin, používaných jako potrava, nýbrž i v případě okrasných rostlin, používaných v zahradě nebo v místnostech. Transformované, ke stresu tolerantní okrasné rostliny vyžadují méně intenzivní a méně odbornou péči ve srovnání s odpovídajícími netransformovanými rostlinami. Pomalejší růst některých okrasných rostlin produkujících trehalózu a malé morfologické změny pozorované alespoň u primárních transformantů, nejsou vždy nevýhodou: pomalejší růst a nový vzhled někdy představují atraktivní charakteristiky, zejména v případě okrasných rostlin používaných v místnostech.
V ještě dalším aspektu vynálezu je gen pro TreóPsyntázu vhodně zfuzován s rostlinným promotorem (např. LTI78 nebo RAB 18), který je aktivován specifickou událostí nebo souborem podmínek (např. chladno nebo sucho), takže lze spustit akumulaci komerčně extrahovatelných množství trehalózy ve zralé rostlině krátce před sklizní, a tím se vyhnout jakýmkoli negativním vlivům trehalózy na časný vývoj některých rostlin.
Podle výše uvedeného zveřejnění jsou transgenní rostliny podle tohoto vynálezu jednoděložné rostliny, jako například kukuřice, oves, proso, pšenice, rýže, ječmen, čirok, laskavec, cibule, chřest nebo cukrová třtina, nebo dvojděložné rostliny, například vojtěška, sója, petúnie, bavlna, cukrová řepa, slunečnice, mrkev, celer, zelí, okurka, paprika, rajče, brambor, čočka, len, brokolice, tabák, fazole, locika, řepka, květák, špenát, růžičková kapusta, artyčok, hrách, okra, dýně (Cucurbita), kapusta kadeřavá, Brassica oleracea, čajovník nebo kávovník.
Je ukázáno, že kvasinkový gen TPS1 a jeho produkt jsou kompatibilní s biochemickým uspořádáním tabáku: gen byl exprimován s vysokou účinností a subjednotka o molekulové hmotnosti 56 kDa vyvolala syntézu trehalózy. Avšak v oboru je známo, že rostlinné geny někdy mají nižší poměry A+T než například mikrobní geny, a že hladinu exprese heterologních genů v rostlinách lze zvýšit změnou použití kodonu, zejména blízko startu kódující sekvence, na hodnotu nalézanou v rostlinách (Perlak et al. (1991) 88, 3324-3328). Domníváme se, že tyto a podobné modifikace genů jsou výhodné v tomto vynálezu.
Je rovněž dobře známo, že se v genech vyskytují přirozené mutace. Tyto a arteficielní změny v DNA sekvenci někdy mění aminokyselinové sekvence kódovaných polypeptidů. Označení TPS1 (nebo TPS2 nebo TSL1), tak jak je použito zde, zahrnuje všechny DNA sekvence homologní s TPS1 (nebo TPS2 nebo TLS1), které kódují polypeptidy s požadovanými funkčními nebo strukturálními vlastnostmi subjednotky kvasinkové trehalózasyntázy, mající molekulovou hmotnost 56 kDa (nebo 102 kDa nebo 123 kDa). Podobně označení „geny pro TreóPsyntázu (nebo TreóPázu) nebo regulační polypeptidy“ zahrnuje nejen takové geny, které lze snadno izolovat z přírodních organizmů (např. použitím nukleotidových prób vytvořených ze známých sekvencí TPS1 nebo TPS2 nebo TSL1), ale rovněž přírodní a umělé varianty, které kódují polypeptidy s požadovanými funkčními a strukturálními vlastnostmi polypeptidů kódovaných původně izolovanými geny.
Příklady provedení vynálezu
Obecný materiál a metody
Materiál. Byly použity rostliny Nicotiana tabacum cv. SRÍ a Arabidopsis thaliana L. Heynh. ekotyp C-24.
Kvasinkové geny TPS1 (dříve nazývané TSS1) kódující Tre6Psyntázovou subjednotku trehalózasyntázy, mající molekulovou hmotnost 56 kDa, a TLS1 kódující regulační subjednotku trehalózysyntázy o molekulové hmotnosti 123 kDa byly získány zplazmidů pALK752 a pALK754 popsaných Vuoriem et al. (1993) Eur. J. Biochem. 216, 849-861. Kvasinkový gen TPS2 byl získán zplazmidů poskytnutého Dr. Claudio De Virgiliem a Dr. Andresem Wiemkenem
-9CZ 294329 B6 z Botanisches Institut der Universitat Basel ve Švýcarsku a klonován do místa Sací plazmidu YCplaclll. Tento gen (popsaný v práci De Virgillia et al. (1993) Eur. J. Biochem. 212, 315— 323) kóduje aminokyselinové sekvence odvozené ze subjednotky o molekulové hmotnosti 102 kDa, tak jak je ukázáno v tabulce 1 v práci Vuorio et al. (1993, loc. cit.). Antiséra připravená proti kvasinkové trehalózasyntáze (anti-TPS/P) a 56 kilodaltonové subjednotce (anti-57K) i obecně používané chemikálie byly získány ze zdrojů uvedených v práci Vuorio et al. (1993, loc. cit.). Vakuolámí trehalóza byla částečně purifikována tak, jak je popsáno Londesboroughem aVarimem ((1984) Biochem. J. 219, 511-518) ze suc” gaF mel- maP kvasinkového kmene (ALKO2967) a nehydrolyzovala sacharózu, maltózu ani melibiózu.
DNA manipulace. Všechny manipulace s DNA byly prováděny za použití zavedených laboratorních technik (Sambrook et al. (1989) v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York). Kmeny E. coli DH5 a MC1061 byly použity pro plazmidové preparáty. Promotor použitý k regulaci exprese TPS1 pocházel z genu atslA A. thaliana, který kóduje malou subjednotku Rubisco (Krebbers et al. (1988) loc. cit.).
Pro konstrukci chimérického genu atslA-TPSl promotorový fragment atslA, kterému chyběla sekvence pro tranzitní peptid, byl amplifikován pomocí PCR z plazmidu pGSFR401. Syntetické oligonukleotidové primery byly použity k vytvoření místa pro EcoRI na 5'konci a místa Xbal na 3'konci amplifikovaného fragmentu. Amplifikovaný produkt získaný pomocí PCR byl štěpen příslušnými restrikčními enzymy a po purifikaci na agarózovém gelu byl vložen do plazmidů pUC19, rozštěpeného pomocí enzymů EcoRI a Mlul. Kvasinkový gen TPS1 byl amplifikován z plazmidu pALK752 popsaného výše. Výsledný fragment obsahoval 5' Mlul a 3'XbaI místa. Po digesci a purifikaci byl fragment ligován za patslA vpUC19. Fragment obsahující konstrukt promotor-TPSl byl připraven pomocí restriktáz EcoRI a Xbal a potom vložen do pBluescriptlI SK+ (Stratagene)-odvozeného plazmidu nesoucího 3'konec T-DNA genu G7 zahrnujícího jeho polyadenylační signál a pravou hraniční sekvenci T-DNA. Nakonec byla celá genová chiméra vložena jako EcoRI-SacI fragment do rostlinného transformačního vektoru pDElOOl (Denecke et al. (1992) EMBO J. 11, 2345-2355), obsahujícího chimémí gen pro rezistenci ke kanamycinu pNOS-NEO-3'OCS jako selektivní markér. Výsledkem byl plazmid pKOH51, nesoucí genovou chiméru patslA-TPSl-3'G7. Konstrukty byly klonovány v kmeni E. coli DH5 pomocí trasformace a poté převedeny pomocí elektroporace (Dower, Miller a Ragsdale (1988) Nucl. Acids. Res. 16, 6127-6145) do Agrobacterium tumefaciens (C58C1 rif*1), obsahujícího neonkogenní Ti plazmid pGV2260 (Deblare et al. (1995) Nucl. Acids. Res. 13, 2777-2788).
Ostatní konstrukty byly připraveny obdobným způsobem.
Růst rostlinného materiálu. Pro zajištění růstu ve sterilních podmínkách byly sterilizované explantáty Nicotiana tabacum (SRÍ) umístěny do skleněných nádob, obsahujících pevné MS médium (Murashige a Skoog (1962) Physiol. Plant. 15, 473-497), do něhož byla přidána sacharóza v koncentraci 2 hmotn. % (MS-2). Tyto nádoby byly potom umístěny do kultivační komory, kde bylo možno kontrolovat podmínky růstu, kde rostliny rostly při 22 °C s fotoperiodou 16 hodin. Explantáty byly pravidelně převáděny do nových nádob, obsahujících MS-2 médium, aby byl zajištěn kontinuální růst za sterilních podmínek. Skleníkové rostliny rostly v půdě v květináčích a byly denně zalévány. Transformované rostliny A. thaliana byly nejprve kultivovány za sterilních podmínek v dětských lahvích v kontrolovaném prostředí tak, jak je popsáno výše pro tabák, a později byly převedeny do půdy v květináčích umístěných ve skleníku, aby bylo dosaženo produkce semen. Semena z primárních transformantů byla buď přímo vsazena do půdy, aby bylo dosaženo nového cyklu produkce semen, nebo byl jejich povrch sterilizován a semena byla kultivována ve sterilních podmínkách na kultivačních destičkách o 24 jamkách pro budoucí molekulární analýzu.
Transformace rostlin. Tabák a A. thaliana byly transformovány následujícím způsobem. Počátečním materiálem byly vyříznuté listy tabáku a kořeny A. thaliana. Transformace a tkáňové kultury
- 10CZ 294329 B6 byly prováděny tak, jak popsal Valvekens et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5536— 5540), s následujícími modifikacemi. Izolované kořeny nebo listy byly preinkubovány na pevném, kalusy-indukujícím médiu (CIM) po dobu 4 dnů, kořeny byly nařezány na malé segmenty (1-2 mm) a listy byly nařezány na větší kousky (10-20 mm) a přeneseny do 20 ml tekutého CIM. 3',5'-Dimethoxy-4'hydroxyacetofenon byl přidán (0,2 mg/1) před infekcí Agrobacteriem (C58C1 rif*^). Bakterie použité pro infekci byly kultivovány přes noc v YEB médiu (Vervliet et al. (1975) J. Gen. Virol. 26, 33-48), které obsahovalo vhodná antibiotika, při 28 °C, a byly odděleny centrifugací. Bakteriální peleta byla pak resuspendována v 10 mM MgSO4, bakterie byly přidány k rostlinné tkáni a systém byl jemně míchán po dobu 15 minut. Nadbytečná tekutina byla slita a kořeny přeneseny na sterilní filtrační papír. Po dvoudenní kokultivaci na pevném CIM byla rostlinná tkáň opláchnuta 3 až 4krát tekutým CIM, aby se tkáň zbavila bakterií, a přenesena na selektivním indukčním médium (SIM). Po 7 dnech růstu byly explantáty s diferenciovanými morfogenetickými sektory přeneseny na čerstvé SIM.
Extrakce proteinů pro Western analýzu. Rostlinné vzorky o hmotnosti 100 až 200 mg čerstvé váhy byly homogenizovány skleněnou tyčinkou v 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavkách se 100 ml pufru na extrakci proteinů (50 mM Tris/HCl pH 7,2, 250 mM sacharóza, 5 mM EDTA, lOmM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM β-merkaptoethanol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 30 M pepstatin, 50 M leupeptin a 15 M aprotinin). Nerozpustný materiál byl odstraněn dvěma centrifugacemi (13 000 g, 10 minut). Koncentrace proteinů v supernatantech byla měřena podle Bradfordové (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254) s použitím hovězího albuminu jako standardu. Stejná množství rozpustných proteinů byla nanesena na SDS-PAGE pro imunologické studie.
SDS-PAGE a imunologické techniky. Proteiny byly odděleny pomocí SDS-PAGE elektroforézy (Laemmli (1970) Nátuře 227, 680-685). Proteiny byly detekovány technikou imunoblottingu s antisérem anti-57 (ředění 1/1000) a králičí protilátkou proti antiséru 57, na níž byla navázána alkalická fosfatáza jako markér. Pro Western blotovací techniku byly bílkoviny elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózové filtry a obarveny pomocí 0,5 % Ponceau Red v 5% kyselině octové, aby byla potvrzena rovnoměrnost nanášení a úspěšnost přenosu. Filtry byly potom blokovány přes noc 5% suchým mlékem v prášku, které neobsahovalo tuk, a detekce a barvení byly provedeny standardním způsobem.
Stanovení TreóPsyntázy. Přibližně 500 mg zmrazeného rostlinného materiálu bylo zváženo a rozetřeno nájemný prášek v třecí misce s pevným CO2. Prášek byl převeden do 0,7 ml 50 mM roztoku HEPES/KOH pH 7,0, obsahujícího 1 mM benzamidin, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA a 1 mM dithiotreitol (HBMED), dále obsahujícího 1 mM PMSF a 10 M koncentrace pepstatinu A a leupeptinu, a směs byla ponechána aby roztála. Výsledný homogenát byl zcentrifugován 10 minut při 17 000 g a v supematantu byla stanovena aktivita TreóPsyntázy způsobem podle Lappa et al. (1971) J. Biol. Chem. 246, 4567-4579). Vzorek (10 ml) byl přidán k 90 ml reakční směsi obsahující 40 mM HEPES/KOH pH 7,0, 10 mM MgCl2, 10 mM glukózu 6-fosfát, 5 mM fruktóza 6-fosfát, 5 mM uridindifosfoglukózu (UDPG) a 1 mg/ml hovězího albuminu, a směs byla inkubována při 30 °C po požadovanou dobu. Reakce byla zastavena zahříváním na 100 °C po dobu 2 minut. Deriváty cukrů (včetně veškeré vytvořené sacharózy) kromě trehalózy a trehalóza 6-fosfátu byly hydrolyzovány přidáním 50 ml 0,6 M HC1 a zahříváním při 100 °C po dobu 5 minut a potom bylo přidáno 50 ml 8% NaOH a směs byla opět zahřívána 15 minut při 100 °C. Zbývající cukry (tj. trehalóza a trehalóza 6-fosfát) byly stanoveny pomocí anthronového stanovení (Trevelyan a Harrison (1956) Biochem. J. 63, 23-33).
Stanovení trehalózy. Přibližně 500 mg zmrazeného rostlinného materiálu bylo rychle odváženo do skleněné zkumavky. Byla přidána horká destilovaná voda (1 ml) a směs byla povařena po dobu 20 minut a listová hmota byl občas rozrušována tupou skleněnou tyčinkou. Kapalná fáze byla odebrána Pasteurovou pipetou a pevná fáze znovu extrahována 0,5 ml vody. Spojené kapalné fáze byly přečištěny centrifugací. Spojené pevné zbytky byly vysušeny do konstantní váhy při 107 °C (suché hmotnosti listů v průměru činily 5,1 % čerstvých hmotností). Supernatant
-11 CZ 294329 B6 byl analyzován s použitím kapalinového chromatografu s Dionexem DX-300, který byl vybaven Dionexovým pulzním elektrochemickým detektorem (PED-2). Vzorky (20 μΐ; ve třech paralelách) byly injikovány pomocí předkolony Carbopac PA-1 (4 x 50 mm) na kolonu Carbopac PA-1 (4 x 250 mm) a eluovány vodou rychlostí 1 ml/min. Elutát byl smísen s reagens 5 (0,6 ml/min 0,3 M NaOH). Trehalóza se objevila ve 3. minutě, daleko před glukózou a sacharózou, jejichž maxima se objevovala až okolo 20. minuty.
Příklad 1
Produkce trehalózy tabákovými rostlinami transformovanými kvasinkovým PTS1 genem regulovaným atslA promotorem.
Transformované a kontrolní rostliny tabáku byly kultivovány jak ve sterilních podmínkách 15 in vitro, tak i ve skleníku. Zralí transformanti neměli odlišný fenotyp od netransformovaných kontrol nebo od kontrol transformovaných vektorem pDElOOl (který neobsahoval TPS1). Listy byly sklizeny v 09,00 hodin, zmrazený a uskladněny při teplotě -70 °C nebo nižší, dokud nebyly analyzovány.
Z 26 testovaných transformantů rezistentních k účinku kanamycinu jich 20 produkovalo detekovatelná množství imunoreaktivních polypeptidů o očekávané velikosti, jestliže byly testovány s antisérem, připraveným proti purifikované subjednotce Tre6Psyntázy kvasinkové trehalózasyntázy, která má molekulovou hmotnost 56 kDa. Příklady jsou uvedeny na obr. 2. Tabulka 1 shrnuje obsah trehalózy v listech.
Výsledky ukazují, že kvasinkový gen TPS1 je v tabáku účinně exprimován, jestliže je jeho promotor nahrazen promotorem atslA. Specifický signál pozorovaný na Western blot stanoveních má správnou molekulovou hmotnost. Nejsilnější signály (např. signál z transformantů 4 kultivovaného in vitro) byly jen o málo slabší v přepočtu na jednotku vneseného proteinu než 30 signály získané z kvasinkového materiálu, sklizeného ve stacionární fázi růstu. Exprese TPS1 byla doprovázena objevením se trehalózy vtkáni listů, což bylo identifikováno jak chováním na HPLC, tak i skutečností, že cukr byl degradován vysoce specifickou trehalózou (viz rovněž obr. 3). Různí transformanti exprimovali produkt TPS1 v různých
- 12CZ 294329 B6
Tabulka 1. Obsah trehalózy v TPS1 transformantech tabáku.
| Tabáková rostlina Rostliny in vitro | Zvláštní působení | Trehalóza (mg/g čerstvých listů) |
| Netransformovaná SRÍ | - | 0,002 |
| pDElOOl kontrola | - | 0,002 |
| Transformant 1 | - | 0,02 |
| Transformant 3 | - | 0,009 |
| Transformant 4 | — | 0,067 |
| Transformant 8 | - | 0,075 |
Transformant 8 extrakce ethanolem místo vody 0,055
Skleníkové rostliny
| pDElOOl kontrola | - | 0,002 |
| Transformant 1 | - | 0,16 |
| Transformant 4 | - | 0,16 |
| Transformant 4 | alkalická fosfatáza3 | 0,13 |
| Transformant 5 | - | 0,052 |
| Transformant 6 | — | 0,044 |
| Transformant 8 | - | 0,039 |
| Transformant 8 | specifická trehalóza | 0,021 |
| Transformant 19 | - | 0,053 |
| Transformant 19 | alkalická fosfatáza3 | 0,060 |
| Transformant 19 | specifická trehalóza | 0,016 |
| Transformant 25 | - | 0,036 |
| Transformant 26 | - | 0,11 |
aExtrakt byl podroben působení alkalické fosfatázy za podmínek, kdy nosič [14C]trehalóza 6fosfát byl defosforylován.
hladinách z důvodů, které dosud nejsou známy. Se zjevnou výjimkou, kterou byl Transformant 8, množství trehalózy nalezené v listech zhruba korelovalo se silou signálu 56 kDa ve Western blot stanoveních (srovnej obr. 2 a tabulku 1). Ačkoliv tito transformanti nanesou gen kódující rekombinantní TreóPázu, nebyl podán důkaz, že rostliny akumulovaly více Tre6P než trehalózy. Zřejmě tabák má fosfatázy, které jsou schopny přeměnit Tre6P na trehalózu což ukazuje, že alespoň v případě této rostliny je klíčovým enzymem nutným k vnesení trehalózové syntetické dráhy Tre6Psyntáza, a že vnesení tohoto samotného enzymu je vhodné, i když ne nutně optimální.
Určení distribuce v tkáních subjednotky Tre6Psyntázy mající molekulovou hmotnost 56 kDa v transgenní linii 4 ukázalo, že značná množství tohoto polypeptidu lze nalézt ve všech zelených částech rostliny vyjma nižšího stonku, ale nikoli v kořenech (obr. 4). Distribuce je ve shodě s tkáňovou specificitou exprese atslA genu (De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 78). Obr. 4 rovněž ukazuje, že tkáně v nichž byla Tre6Psyntáza exprimována, rovněž obsahovaly trehalózu. Navíc byla malá množství trehalózy nalezena v kořenech, což ukazuje, že transgenní tabák transportuje trehalózu z místa syntézy do jiných tkání.
Výsledky rovněž ukázaly, že tabákové rostliny exprimující TPS1 regulovaný promotorem atslA a akumulující trehalózu v zelených tkáních během osvitu denním světlem jsou zdravé a mají normální vzhled. Ačkoliv primární transformanti, obsahující genovou chiméru TPS1 měli některé malé morfologické alterace, jako například listy ve tvaru skalpelu, sníženou apikální dominanci a nižší výšku (viz obr. 5 a 6), většina změn se neprojevila v samosprášeném, TPS pozitivním potomstvu, které stále produkovalo trehalózu (viz obr. 6). Proto se zdají být morfologické změny v primárních transformantech artefakty tkáňové kultury, spíše než výsledky produkce trehalózy.
- 13 CZ 294329 B6
Vysoká hladina produkce TreóPsyntázové subjednotky a přítomnost trehalózy však vedly k 20 až 50% snížení růstové rychlosti u transgenních rostlin za normálních podmínek ve srovnání s netransformovanými kontrolami. Zjevně normální fenotyp těchto transgenních rostlin je v kontrastu k publikované toxicitě exogenně přidané trehalózy k některým rostlinám (Veluthambi et al. (1981) loc. cit.). Tyto výsledky ukazují, že produkce in planta pod kontrolou promotoru atslA není pro tabák toxická, ačkoli může přispívat k určitému snížení růstové rychlosti. Indukovatelné promotory spouštěné specifickými událostmi, jako je sucho a zima, lze použít k minimalizaci efektu na snížení růstové rychlosti tím, že tyto promotory vyvolávají produkci trehalózy pouze když je tato zapotřebí.
Na základě proteinové analýzy představují obsahy trehalózy v nej lepších transformantech uvedené v tabulce 1 (např. 16 mg/g proteinu u transformanta 4) již alespoň 20 % hladiny, při níž nastává jasné zlepšení termotolerance u kvasinek (De Virgilio et al. (1990) FEBS Letters 273, 107-110).
Někteří TPS1 transformanti a kontroly byly analyzovány z hlediska přítomné TreóPsyntázové aktivity. Výsledky ukázané v tabulce 2 jsou průměry jejich limity ze stanovení v čase 0,15 a 30 minut, provedeném ve dvou paralelních vzorcích. U kontrol byla TreóPsyntázová aktivita nulová. U transformanta 4 se cukr, stabilní v kyselém i alkalickém prostředí, akumuloval v přítomnosti UDPG a GlcóP. Tato akumulace vyžadovala GlcP, ale nikoli fruktóza 6-fosfát (Fru6P; tento hexosafosfát aktivuje nativní trehalózasyntázový komplex kvasinek) a neprobíhala, jestliže byl UPDG nahrazen ADPG (enzym purifikovaný z kvasinky rovněž nepoužívá ADPG). Akumulovaný cukr je pravděpodobně trehalóza nebo Tre6P, protože jiné produkty jsou zničeny hydrolýzou. Analýza HPLC ukázala, že nešlo o trehalózu. Tedy za podmínek in vitro stanovení je Tre6P syntetizován extrakty transformanta 4 rychleji než je konvertován na trehalózu. To ukazuje, že celkovou rychlost syntézy trehalózy v listech lze zvýšit kotransformací s TPS2, který kóduje subjednotku TreóPázy.
TreóPsyntázová aktivita kvasinkových extraktů, zjištěná způsobem použitým v tabulce 2, souhlasila s aktivitou zjištěnou měřením objevujícího se UDP tak, jak popsali Londesborough a Vuorio ((1991) J. Gen. Microbiol. 137, 323-330). Dále, kvasinkové extrakty měřené v přítomnosti extraktů tabákových rostlin nebyly inhibovány. Tedy nepřítomnost aktivity v kontrolních rostlinách v tabulce 2 není dána interferencí s některým faktorem přítomným v tabákových extraktech.
Tabulka 2. TreóPsyntázová aktivita TPS1 transformovaných a kontrolních tabákových listů (všechny výsledky byly získány s rostlinami za sterilních podmínek in vitro).
Transformant Směs stanovení Aktivita TreóPsyntázy (mU/g čerstvých listů)
| 15 min | 30 min | ||||
| Netransformovaná | |||||
| kontrola | úplná | 3 | 47 | 3 | 21 |
| PDE1001 kontrola | úplná | 22 | 35 | 7 | 8 |
| Transformant 4 | |||||
| pokus 1 | úplná | 259 | 147 | 60 | 6 |
| Transformant 4 | |||||
| pokus 2 | úplná | 128 | 39 | 155 | 22 |
| bez GlcP | 12 | 19 | -1 | 12 | |
| bez FruóP | 153 | 10 | 144 | n 0 | |
| ADPG místo UDPG | 0 | 52 | 4 | 21 |
TreóPsyntázová aktivita zjištěná u transformanta 4 byla nestabilní. U některých extraktů aktivita zmizela během několika hodin, kdy byly skladovány na ledu. Avšak specifický pás pozorovaný u analýz typu Western byl stále přítomen prakticky v nezměněné intenzitě v extraktech, které
-14CZ 294329 B6 byly uskladněny 24 hodin při teplotě místnosti. Je tedy pravděpodobné, že konformace TreóPsyntázové subjednotky se mění v průběhu skladování tabákových extraktů. Tyto výsledky ukazují, že zvýšená aktivita TreóPsyntázy bude dosažena transformací tabáku současně TPS1 a jednou nebo několika jinými subjednotkami kvasinkové trehalózasyntázy, čímž se zvýší konformační stabilita subjednotky TreóPsyntázy.
Příklad 2
Transgenní Arabidopsis thaliana.
Rostliny A. thaliana obsahující TPS1 regulovaný promotorem atslA byly konstruovány stejným způsobem, jaký je popsán výše pro tabákové transformanty. Vzhled těchto transformovaných rostlin Arabidopsis je rovněž normální a rostliny jsou zdravé a produkují fertilní semena. Analýza Western typu rostlin kultivovaných ze semen primárních transformantů ukázala, že rostliny obsahovaly subjednotku kvasinkové trehalózasyntázy, mající molekulovou hmotnost 56 kDa (obr. 10). Je zřejmé očekávat, že tyto rostliny akumulují trehalózu v zelených tkáních.
Příklad 3
Odolnost trehalózu produkujících rostlin tabáku k sušení.
Aby bylo možné stanovit, zda množství trehalózy produkovaná transgenním tabákem jsou dostatečná, aby zvýšila odolnost k sušení, byly oddělené listy z kontrol a transgeních linií pěstovaných in vitro sušeny vzduchem (25% relativní vlhkost, RH) (obr. 5). Zatímco oddělené listy kontrolních rostlin rychle ztrácely vodu a ukazovaly známky hnědnutí po 3 hodinách stresu, listy trehalózu produkujících rostlin zůstaly zelené až do 24 hodin při jasně snížené ztrátě vody. Protektivní účinek trehalózy je tedy dvojí: za prvé, oddělené listy transgenních rostlin syntetizujících trehalózu nejprve projevovaly lepší retenci vody. Teprve po dlouhém sušení tento rozdíl mezi trehalózu produkujícími a kontrolními rostlinami zmizel. Za druhé, kontrolní listy vykazovaly jasné známky stárnutí a hnědnutí. Naopak listy z trehalózu produkujících rostlin zůstaly zelené alespoň 24 hodin a teprve prodloužené sušení (několik dní) vyvolalo určité zhnědnutí. Existoval jasný rozdíl mezi trehalózu produkujícími a kontrolními rostlinami i při stejném obsahu vody. Trehalóza tedy chrání rostlinnou tkáň před účinky dehydratace a snižuje rychlost jakou se voda ztrácí. Hnědnutí by alespoň částečně mohlo být způsobeno Maillardovou reakcí, kdy redukující cukry reagují svolnými aminoskupinami polypeptidů a aminokyselin, a vzniká hnědá barva. Jako neredukující cukr se trehalóza neúčastní této reakce, a dokonce inhibuje reakci mezi jinými cukry a proteiny (Roser a Colaco (1993) New Scientist 1873, 24).
Ochrana oddělených listů trehalózou před poškozením účinkem sušení ukázala, že trehalóza by měla mít podobný účinek i na úrovni celých rostlin. Abychom prokázali, že trehalóza zvyšuje toleranci intaktních rostlin k vysychání, byly rostliny kultivované in vitro vystaveny sušení vzduchem (30% RH, obr. 6A). Kontrolní rostliny ztratily turgor a zvadly během 3 až 4 hodin. Naopak trehalózu produkující transgenní rostliny naznačovaly ztrátu turgoru po prodlouženém sušení. Po 17 hodinách sušení byly rostliny rehydratovány a zkoumáno přežívání rostlin (obr. 6A). Netransformované kontrolní rostliny tento pokus nepřežily a ani po prodloužené rehydrataci nedošlo k jejich zotavení. Naopak, trehalózu produkující transgenní linie, ačkoli byly zřetelně zvadlé a ztratily většinu jejich tkáňové vody (pokles až na hodnotu 30 % reziduální čerstvé hmotnosti), přežily 17 hodin sušení.
Zvýšené přežívání podmínek sucha se ukázalo i u mladých rostlinek (obr. 6B). Když byly 3 týdny staré rostlinky transgenní linie 8 spolu s netrasformovanými a vektorem transformovanými kontrolními rostlinkami vystaveny sušení vzduchem (50% RH), byl zjištěn jasný rozdíl v toleranci k suchu mezi trehalózu produkujícími a kontrolními rostlinami. Transgenní trehalóza
-15 CZ 294329 B6 pozitivní linie 8 vykazovala jak zpomalenou ztrátu turgoru, tak zvýšené přežívání dehydratuj ícího stresu ve srovnání s kontrolními rostlinami (obr. 6B).
Příklad 4
Produkce trehalózy rostlinami kotransformovanými genem kódujícím TreóPsyntázu a jedním nebo několika geny kódujícími TreóPázu nebo regulační polypeptid.
Odborník dokáže připravit vektory, obsahující kódující sekvence kvasinkových genů TPS2 aTSLl pod kontrolou atslA promotoru a použít je k transformaci tabáku, Arabidopsis, a jiných rostlin způsoby, které jsou popsány v Obecném materiálu a metodách a v příkladu 1. Rostliny najednou transformované pomocí TPS1 a jedním nebo oběma dalšími geny TPS2 a TLS1 lze získat křížením jednotlivých transformantů, další transformací již transformované rostliny druhým genem nebo transformací vektory, obsahujícími dva nebo tři geny vázané s vhodnými promotory: například TPS1 vázaný s nekonstitutivním promotorem atslA, aby syntéza trehalózy a případně jiný gen nebo geny regulované konstitutivními promotory byly pod jeho kontrolou.
Předpokládá se, že řízená exprese genů pro dvě nebo více subjednotek kvasinkového trehalózasyntázového komplexu, z nichž alespoň jedna má molekulovou hmotnost 56 kDa, vyústí ve zvýšenou akumulaci trehalózy v zelených tkáních rostliny, protože 56 kilodaltonová subjednotka bude stabilizována přítomností druhé subjednotky nebo subjednotek. Rovněž zavedení TreóPázové subjednotky o molekulové hmotnosti 102 kDa bude výhodné, neboť tím bude snížen očekávaný potenciál akumulace Tre6P, jestliže bude stabilita TreóPsyntázové jednotky zvýšena. Je zřejmé, že pro tento typ konstrukce TPS1 kódující sekvenci lze nahradit kódující sekvencí nějakého dalšího strukturálního genu pro TreóPsyntázu, TPS2 sekvenci sekvencí některého jiného TreóPázového genu a TLS1 sekvenci sekvencí některého jiného genu kódujícího polypeptid, který udílí regulační vlastnosti nebo stabilitu TreóPsyntáze a TreóPáze stejným způsobem, jako TSL1 produkt udílí takové vlastnosti jiným subjednotkám přirozené kvasinkové trehalózasyntázy.
Příklad 5
Transformace rostlin geny pro TreóPsyntázu pod kontrolou stresem indukovaných promotorů.
Rostlinné promotory jako jsou LTI78 (Nordin et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21, 641-653) aRAB18 (Lang a Palva (1992) Plant Mol. Biol. 20, 951-962) jsou známy tím, že jsou indukovány suchem a chladovým stresem. Transformací tabáku, Arabidopsis a jiných rostlin kódující sekvencí genu pro TreóPsyntázu, jako je TPS1 pod kontrolou takového stresem indukovaného promotoru, samotného nebo dohromady s kódujícími sekvencemi genů pro TreóPázu nebo regulační polypeptid nebo obou, jako jsou TPS2 a TLS1 pod kontrolou jakéhokoli vhodného rostlinného promotoru, lze vyvolat akumulaci trehalózy v rostlinných tkáních pouze v odpovědi na tyto typy stresu. Výhodou je, že hladiny trehalózy, které mají negativní účinek na některé tkáně určitých rostlin, a které rovněž představují odchylku fotosyntetické funkce, která snižuje její výtěžek a někdy zpožďuje růst rostliny, se akumulují pouze (1) jestliže je rostlina náhodně vystavena stresu (výhody ochrany poskytované trehalózou převáží jakékoli negativní účinky) nebo (2) jestliže je rostlina záměrně vystavena stresu aby došlo k akumulaci trehalózy, která pak bude extrahována ze sklizené rostliny.
-16CZ 294329 B6
Příklad 6
Purifikace, analýza a klonování jiných TreóPsyntáz.
Ačkoli existují i jiné metabolické dráhy syntázy trehalózy, je zřejmé, že hlavní syntetická dráha jde přes Tre6P, jak to popsali Cabib a Leloir (1958, loc. cit.). Klíčový enzym v této dráze je TreóPsyntáza, jelikož, jak je ukázáno výše, jestliže je TreóP vytvořen, mnoho buněk bude schopno tuto látku defosforylovat za vzniku volné trehalózy. Tedy hlavní myšlenkou tohoto vynálezu je vnést TreóPsyntázovou aktivitu do cílové rostliny. Není primárně důležité, odkud tato aktivita pochází. Používáme kvasinkový enzym, který náhodou je subjednotkou kvasinkového komplexu trehalózasyntázy, který obsahuje ještě nejméně dvě další subjednotky. V obdobných případech je možné, že optimální aktivita TreóPsyntázové subjednotky bude vyžadovat přítomnost jedné nebo několika ostatních subjednotek, ačkoli zjevně subjednotka kvasinkové TreóPsyntázy o molekulové hmotnosti 56 kDa účinně funguje v tabáku bez subjednotek o 102 a 123 kDa.
Je dobře známo, že enzymy katalyzující stejnou reakci v odlišných organizmech jsou často homologní, takže jestliže byl jednou člen této skupiny klonován, úkol klonovat ostatní členy této skupiny je snadnější. Jelikož kvasinková TreóPsyntáza byla klonována (Londesborough a Vuorio (1992) USPA 07/836021), je jasné, že existuje skupina homologních proteinů, včetně TreóPsyntázy zE. coli a proteinu z Methanobacterium thermoautotrophicum (McDougall et al., (1993) FEMS Microbiology Letters 107, 25-30). Rozhodli jsme se otestovat, zda jiné organizmy rovněž obsahují homologní TreóPsyntázy.
Mycobacterium smegmatis obsahuje heparinem aktivovanou TreóPsyntázu, která byla částečně purifikována a studována Elbeinovou skupinou (Liu et al., (1969) J. Biol. Chem. 244, 3728— 3791; Lapp et al., (1971) J. Biol. Chem. 246, 4567-4579; Elbein a Mitchell (1975) Arch. Biochem. Biophys. 168, 369-377; Pan et al. (1978) Arch. Biochem. Biophys. 186, 392-400). Enzym purifikovaný těmito pracovníky měl specifickou aktivitu 0,8 LJ/mg proteinu při 37 °C s GlcP a UDPG jako substráty (enzym je schopen používat řadu nukleosid-difosfoglukózových derivátů) v přítomnosti optimální koncentrace heparinu. Preparát obsahoval dva polypeptidy s molekulovými hmotnostmi, stanovenými pomocí SDS-PAGE, 45 a 90 kDa. My jsme modifikovali jejich purifikační postup tím, že jsme do něj zahrnuli inhibitory proteáz a jiná agens chránící proteiny v použitých pufrech a přidali konečný chromatografický krok v přítomnosti neiontového detergentu Tritonu X-100. Náš konečný postup byl následující:
1) Buňky M. smegmatis (28 g čerstvé hmotnosti rostoucí 3 dny v Luriově médiu a skladované v zmrazeném stavu) byly rozmraženy ve 40 ml 50 mM HEPES/KOH pH 7,5 obsahujícího 1 mM benzamidin, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM dithiotreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) a 10 g pepstatinu A/ml a potom rozbity ve French pressu. Homogenát byl centrifugován 20 minut při 28 000 g. (NH4)2SO4 (30 g na 100 ml) byl přidán k supematantů. Vysrážený protein byl shromážděn, rozpuštěn v 20 mM HEPES/KOH pH 7,5 obsahujícím 0,1 mM EDTA a 0,2 mM dithiotreitol (HED pufr), dále obsahujícím 1 mM PMSF a 10 g pepstatinu A/ml, a dialyzován přes noc proti HED pufru.
2) Dialyzovaný roztok byl nanesen na sloupec DEAE celulózy o rozměrech 3,4 x 25 cm a enzym byl eluován při průtoku 20 ml/hodinu lineárním gradientem maximálně obsahujícím 0,9 M NaCl v 1,2 1 HED pufru. Maxima enzymových frakcí (při 0,2 M NaCl) byla spojena (33 ml) a upravena na konečnou koncentraci 0,5 mM PMSF a 5 g pepstatinu A/ml. Protein byl vysrážen přidáním 9,9 g (NH4)2SO4 a rozpuštěn v 50 mM Tris/HCl pH 7,5 obsahujícím 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA a 0,2 mM dithiotreitol (TNED pufr).
3) Rozpuštěné proteiny (3,7 ml) byly chromatografovány na koloně Sephadexu G100 (2,8x34 cm), která byla ekvilibrována TNED pufrem při průtoku 36 ml/hodinu. Enzymové frakce v maximech byly ihned naneseny na sloupec Heparin Separózy (1,5 x 8,5 cm) v TNED
- 17CZ 294329 B6 pufru. Sloupec byl vyvíjen gradientem maximálně obsahujícím 1,0 M NaCl v objemu 100 ml při rychlosti průtoku 5 ml/hodinu. Enzym byl eluován přibližně při koncentraci 0,5 M NaCl.
4) Vzorek eluátu zHeparin Separózy (frakce H37 v tabulce 3) byl převeden do TND/0,1 % (V/V) Triton X-100 v zařízení Amicon (membrána PM10) a potom nanesen na sloupec Heparin Separózy (0,7 x 8 cm) ekvilibrované TNED obsahujícím 0,1 % (V/V) Triton X-100 a eluován gradientem maximálně obsahujícím 1,0 M NaCl v 50 ml stejného pufru.
Ačkoli specifické aktivity po prvním kroku využívajícím Heparin Separózu byly mnohem větší než bylo oznámeno Panem et al. (1978), SDS-PAGE (obr. 7) ukázala, že tyto frakce nebyly čisté. Překvapivě bylo maximum při hodnotě 55 kDa jediným hlavním pásem (band), pro nějž intenzita dobře korelovala s enzymovou aktivitou. Band o hodnotě 55 kDa byl oddělen a rozpuštěn v gelu s trypsinem a tryptické peptidy byly odděleny pomocí HPLC a sekvenovány tak, jak je popsáno (Londesborough a Vuorio, 1993 loc. cit.). Sekvence jsou uvedeny v tabulce 4 a v Seznamu sekvencí. Pro peptidová maxima
Tabulka 3. Purifikace TreóPsyntázy z M. smegmatis
TreóPsyntáza byla stanovena jak popisují Londesborough a Vuorio (1993, loc. cit.), avšak při teplotě 35 °C a v přítomnosti 0,25 g heparinu/ml.
| Frakce | Objem (ml) | Specifická aktivita (mU/mg) | Celková aktivita (U) |
| Supernatant (28 000 g) | 154 | 9 | 25,0 |
| Dialyzovaný precipitát vysrážený pomocí (NH4)2SO4 | 52 | 21 | 35,2 |
| DES2 eluát | 33 | 139 | 23,4 |
| G100 eluát | 21 | 385 | 14,6 |
| První eluát z Heparin Separózy frakce H33 | 2,7 | 1880 | 0,9 |
| frakce H34 | 2,7 | 4380 | 2,1 |
| frakce H35 | 2,7 | 6190 | 2,7 |
| frakce H36 | 2,7 | 7890 | 2,8 |
| frakce H37 | 2,7 | 6340 | 1,6 |
| Druhý eluát z Heparin Separózy (naneseno pouze H37) frakce T21 | 1,4 | ND | 0,08 |
| frakce T22 | 1,4 | ND | 0,14 |
| frakce T23 | 1,4 | ND | 0,06 |
a 31, která poskytovala dvojité sekvence, byly aminokyseliny libovolně přiřazeny podle SEQ ID NOs 3 a 4 (z maxima 29) a SEQ ID NOs 6 a 7 (z maxima 31) stejným způsobem, jak je ukázáno v tabulce 4. Prvních 9 zbytků Peptidu 13 je z 89 % identických se zbytky 250-258 (VGAFPIGID; viz Vuorio et al. 1993 loc. cit.·, EMBL katalog přírůstků č. X67499) kvasinkové TreóPsyntázy o molekulové hmotnosti 56 kDa.
- 18 CZ 294329 B6
Tabulka 4. Aminokyselinové sekvence vnitřních tryptických peptidů získaných z TreóPsyntázy purifikované z M. smegmatis.
| Pík peptidu | Sekvence | Seznam sekvencí |
| 13 | VGAFPISIDSAEL | SEQ ID NO:1 |
| 21 | AT/GFLDALAATGETGDSGVT | SEQ IDNO:2 |
| 29 (dvojitý) | RVVVNNTSR | SEQ IDNO:3 |
| YLEGAR | SEQ IDNO:4 | |
| 25 | QVLAHDVDR | SEQ ID NO:5 |
| 31 (dvojitý) | IGGAQPAD | SEQ IDNO:6 |
| VGALQVLL | SEQ IDNO:7 | |
| 43 | GEVQVGFR | SEQ ID NO:8 |
Abychom potvrdili, že tento band o molekulové hmotnosti přibližně 56 kDa představuje TreóPsyntázu, pokusili jsme se o další purifikaci. Enzym se vázal pevně k UDP-glukuronát agarózovému sloupci, ale nemohl být uvolněn zpět. Proto byla frakce H37 převedena do pufru, obsahujícího 0,1 % Triton X-100 (dvě třetiny aktivity byly během tohoto přenosu ztraceny) a znovu chromatografována na Heparin Separóze v přítomnosti Tritonu X-100. Obr. 8 ukazuje, že band mající molekulovou hmotnost přibližně 55 kDa byl jediný materiál reagující s Coomassie Blue, který byl přítomen v aktivních frakcích, kromě dvou slabých pásů menších než cytochromc. Zřejmě polypeptid mající molekulovou hmotnost 90 kDa popsaný Panem et al. (1978; loc. cit.) není podstatnou složkou této TreóPsyntázy zM. smegmatis a velikost důležitého polypeptidu, přibližně 55 kDa, je znatelně větší než velikost malého polypeptidu (45 kDa), což je složka, o níž referují uvedení autoři. Obr. 9 ukazuje, že tento polypeptid je rozeznáván antisérem, které je vytvořeno proti subjednotce TreóPsyntázy kvasinkové trehalózasyntázy, která má molekulovou hmotnost 56 kDa, ale nikoli preimunním sérem, což ukazuje, že Tre6P syntáza M. smegmatis sdílí antigenní determinanty s kvasinkovým enzymem. Povaha ostatních imunoreaktivních pásů přítomných v relativně surových preparátech enzymu (viz dráhy 5 a 6 na obr. 9) nebyla zkoumána: ne všechny z nich jsou artefakty vzniklé díky velké dávce naneseného proteinu, nýbrž představují příbuzné proteiny. Nicméně antisérem vytvořené proti kvasinkovému enzymu lze použít k detekci a izolaci pozitivních klonů z hostitelských buněk transformovaných genovou bankou M. smegmatis. Podobně data týkající se aminokyselinové sekvence v tabulce 4 lze použít ke zkoumání sekvence izolovaného genu. Podobnosti týkající se imunologických reakcí a aminokyselinových sekvencí mezi enzymy kvasinky a M. smegmatis ukazují, že nukleotidové proby odvozené z genu TPS1 lze rovněž úspěšně použít k výběru genu M. semagmatis.
Závěrem lze říci, že imunologické a sekvenační studie enzymu M. smegmatis potvrzují, že TreóPsyntázy různých organizmů jsou členy jedné rodiny. Geny těchto enzymů lze použít stejným způsobem jako TPS1 k přípravě transgenních rostlin, které syntetizují trehalózu a mají zlepšenou toleranci ke stresu.
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatelé: Alko Group Ltd.
and
Londesborough, John
Tunnela, Outi Holmstrom, Kjell-Ove
Mántylá, Einar Welin, Bjom Mandal, Abul Palva, E. Tapio
-19CZ 294329 B6 (ii) Název vynálezu: Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae (iii) Počet sekvencí: 8 (iv) Korespondenční adresa:
(A) Adresát: Alko Group Ltd (B) Ulice: Salmisaarenranta 7 (C) Město: Helsinki (D) Stát: - (E) Země: Finsko (F) PSČ: FIN-00180 (v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ média: disketa, 3,5 palc., 720 kb (B) Počítač: IBM PC/XT/AT (C) Operační systém: PC-DOS (D) Software: WP.l soubor exportovaný jako DOS-ový textový soubor (vi) Údaje o mezinárodní přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: PCT/FI95/00377 (B) Datum podání: 29. červen 1995 (C) Třída: C12N 15/82, 15/54, A01H 5/00, A01N 3/00 (vii) Údaje o prioritní přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: FI943133 (B) Datum podání: 29. červen 1994 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotetický: ne (iv) Typ fragmentu: N-koncový (v) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1
Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile Asp Ser Ala Glu Leu
10
-20CZ 294329 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO:2 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 19 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotetický: ne (iv) Typ fragmentu: N-koncový (v) Popis sekvence: SEQ ID NO:2
Ala Xaa Phe Leu Asp Ala Leu Ala Ala Thr Gly Glu Thr Gly Asp Ser Gly Val Thr 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO:3 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotetický: ano (iv) Typ fragmentu: N-koncový (v) Popis sekvence: SEQ ID NO:3
Arg Val Val Val Asn Asn Thr Ser Arg (2) Informace pro SEQ ID NO:4 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotetický: ano (iv) Typ fragmentu: N-koncový
-21 CZ 294329 B6 (v) Popis sekvence: SEQ ID NO:4
Tyr Leu Glu Gly Ala Arg (2) Informace pro SEQ ID NO:5 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotetický: ne (iv) Typ fragmentu: N-koncový (v) Popis sekvence: SEQ ID NO:5
Gin Val Leu Ala His Asp Val Asp Arg (2) Informace pro SEQ ID NO:6 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotetický: ano (iv) Typ fragmentu: N-koncový (v) Popis sekvence: SEQ ID NO:6
Ile Gly Gly Ala Gin Pro Ala Asp (2) Informace pro SEQ ID NO:7 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid
-22 CZ 294329 B6 (iii) Hypotetický: ano (iv) Typ fragmentu: N-koncový (v) Popis sekvence: SEQ ID NO:7
Val Gly Ala Leu Gin Val Leu Leu (2) Informace pro SEQ ID NO:8 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotetický: ne (iv) Typ fragmentu: N-koncový (v) Popis sekvence: SEQ ID NO:8
Gly Glu Val Gin Val Gly Phe Arg
Claims (15)
1. Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae pro trehalóza-6fosfátsyntázu, který je pod kontrolou nekonstitutivního rostlinného promotoru, přičemž transformovaná rostlina má kapacitu pro syntézu trehalózy větší než je kapacita netransformované rostliny.
2. Rostlina podle nároku 1, přičemž rostlinný promotor je tkáňově specifický.
3. Rostlina podle nároku 1, přičemž rostlinný promotor je aktivován světlem.
4. Rostlina podle nároku 1, přičemž rostlinný promotor je aktivovatelný stresem, jako je vystavení suchu, vysoké salinitě nebo extrémním teplotám.
5. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, přičemž gen pro trehalóza-6-fosfátsyntázu je mikrobiálního původu.
6. Rostlina podle nároku 5, přičemž gen pro trehalóza-6-fosfátsyntázu je kvasinkový gen TPS1.
-23 CZ 294329 B6
7. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, přičemž tato rostlina je kotransformovaná alespoň jedním genem kódujícím trehalóza-6-fosfatázu nebo regulační subjednotku polypeptidu, který stabilizuje aktivitu vnesené trehalóza-6-fosfátsyntázy nebo trehalóza-6-fosfatázy.
8. Rostlina podle nároku 7, přičemž gen kódující trehalóza-6-fosfatáza je kvasinkový gen TPS2 a gen kódující regulační subjednotka polypeptidu je kvasinkový gen TSL1.
9. Rostlina podle nároku 6, přičemž rostlinný promotor je patsl A.
10. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, přičemž použitý rostlinný promotor aktivovaný stresem je vybíraný z LTI78 nebo RAB 18.
11. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, přičemž tato rostlina je tolerantnější k účinku stresu než netransformovaná rostlina.
12. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, přičemž tato rostlina je jednoděložná, vybíraná z kukuřice, ovsa, prosa, pšenice, rýže, ječmene, čiroku, laskavce, cibule, chřestu nebo cukrové třtiny.
13. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, přičemž tato rostlina je dvouděložná, vybíraná z vojtěšky, sóji, petúnie, bavlníku, cukrové řepy, slunečnice, mrkve, celeru, zelí, okurky, papriky, rajčete, bramboru, čočky, lnu, brokolice, tabáku, fazole, lociky, hlávkového salátu, řepky, květáku, špenátu, růžičkové kapusty, artyčoku, hrachu, oky, ibišku jedlého, dýně-Cucurbita, kapusty kadeřavé, Brassica oleracea, čajovníku nebo kávovníku.
14. Použití rostliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 13 pro produkci trehalózy.
15. Semeno produkované rostlinou podle kteréhokoli z nároků 1 až 13.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI943133A FI943133A0 (fi) | 1994-06-29 | 1994-06-29 | Transgena vaexter |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ378296A3 CZ378296A3 (cs) | 1998-03-18 |
| CZ294329B6 true CZ294329B6 (cs) | 2004-12-15 |
Family
ID=8541026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19963782A CZ294329B6 (cs) | 1994-06-29 | 1995-06-29 | Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0763118A1 (cs) |
| JP (1) | JPH10501978A (cs) |
| CN (1) | CN1159833A (cs) |
| AU (1) | AU699391B2 (cs) |
| CA (1) | CA2193861A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ294329B6 (cs) |
| FI (1) | FI943133A0 (cs) |
| GB (1) | GB2303856B (cs) |
| HU (1) | HU221613B (cs) |
| NZ (1) | NZ288635A (cs) |
| WO (1) | WO1996000789A1 (cs) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6329574B1 (en) | 1990-01-22 | 2001-12-11 | Dekalb Genetics Corporation | High lysine fertile transgenic corn plants |
| WO1991010725A1 (en) | 1990-01-22 | 1991-07-25 | Dekalb Plant Genetics | Fertile transgenic corn plants |
| US6326527B1 (en) | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
| US5780709A (en) * | 1993-08-25 | 1998-07-14 | Dekalb Genetics Corporation | Transgenic maize with increased mannitol content |
| US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
| IL116564A0 (en) * | 1995-01-04 | 1996-03-31 | Mogen Int | Process for producing trehalose in plants |
| EP0784095A3 (en) * | 1996-01-12 | 1997-12-29 | Mogen International N.V. | Enhanced accummulation of trehalose in plants |
| IN1997CH00924A (en) | 1996-05-03 | 2005-03-04 | Syngenta Mogen Bv | Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate |
| MX205414B (es) * | 1996-05-08 | 2001-12-07 | Univ Mexico Nacional Autonoma | Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla. |
| ES2110918B1 (es) * | 1996-07-04 | 1998-08-01 | Univ Poltecnica De Valencia | Obtencion de plantas tolerantes al estres osmotico mediante manipulacion genetica del metabolismo de carbohidratos. |
| AU4722797A (en) * | 1996-10-24 | 1998-05-15 | Japan Tobacco Inc. | Method for controlling water content of plant |
| GB9703681D0 (en) * | 1997-02-21 | 1997-04-09 | Gene Shears Pty Ltd | Protein complemention |
| EP0868916A3 (en) * | 1997-03-04 | 2004-09-15 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| HUP0002948A3 (en) * | 1997-05-02 | 2002-09-30 | Syngenta Mogen Bv | Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate by inhibiting endogenous trehalase levels |
| WO1999023225A1 (en) * | 1997-10-30 | 1999-05-14 | Mogen International N.V. | Novel high-fermenting microorganisms |
| ZA989782B (en) * | 1997-10-30 | 1999-05-04 | Mogen Int | Pre-and postharvest inhibition of remobilisation of storage compounds |
| ZA989886B (en) * | 1997-10-30 | 1999-04-30 | Mogen Int | Nuclear male sterile plants method of producing same and methods to restore fertility |
| AU2412499A (en) * | 1997-10-30 | 1999-05-31 | Mogen International N.V. | Novel high-fermenting microorganisms |
| BR9907223A (pt) * | 1998-01-22 | 2000-10-24 | Ca Nat Research Council | Métodos e composições para modificação dos nìveis de compostos metabólicos secundários em plantas |
| KR20010082520A (ko) | 1998-03-11 | 2001-08-30 | 한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터 | 식물에서 트레할로즈 생합성 유전자의 발현 |
| DE19832334A1 (de) * | 1998-07-17 | 2000-01-20 | Norika Nordring Kartoffelzucht | Glucosylglycerolphosphatsynthasegene zur Erzeugung der niedermolekularen Schutzsubstanz Glucosylglycerol und ihre Verwendung |
| EP1002867A1 (en) * | 1998-10-15 | 2000-05-24 | K.U. Leuven Research & Development | Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment |
| GB0100105D0 (en) * | 2001-01-04 | 2001-02-14 | Leuven K U Res & Dev | The use of plant TPS (Trehalose-6-phosphate syntase) as a selectable marker for plant transformation |
| US20040187175A1 (en) * | 2002-11-06 | 2004-09-23 | Wu Ray J. | TPS plant gene constructs and transformants |
| KR100440725B1 (ko) | 2002-06-20 | 2004-07-15 | 주식회사 그린진 바이오텍 | 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을증가시키는 방법 |
| CN101023175B (zh) * | 2004-04-20 | 2012-02-29 | 辛根塔参与股份公司 | 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列 |
| CN101586107A (zh) * | 2009-07-08 | 2009-11-25 | 四川农业大学 | 一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法 |
| CN103517981B (zh) * | 2011-04-22 | 2017-02-15 | 丹尼斯科美国公司 | 具有粘度改变表型的丝状真菌 |
| CN113016524A (zh) * | 2019-12-24 | 2021-06-25 | 东北农业大学 | 一种提高水稻耐碱性的方法 |
| CN112980849B (zh) * | 2021-05-10 | 2022-10-18 | 长江师范学院 | 一种靶向根肿菌PbTPS1基因防治根肿病的活性siRNA及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE133198T1 (de) * | 1990-03-28 | 1996-02-15 | Gist Brocades Nv | Neue hefestämme mit erhöhtem trehalosegehalt, verfahren zur gewinnung solcher hefen und verwendung dieser hefen |
| US5422254A (en) * | 1992-02-14 | 1995-06-06 | Oy Alko Ab | Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase |
| CZ290830B6 (cs) * | 1993-06-30 | 2002-10-16 | Syngenta Mogen B.V. | Nukleová kyselina, vektor, mikroorganismus, rostlinný DNA genom, buňka a rostlina, způsob jejího získávání a způsob výroby trehalózy z ní |
| AU4953393A (en) * | 1993-08-24 | 1995-03-21 | Mogen International N.V. | Production of trehalose in plants |
-
1994
- 1994-06-29 FI FI943133A patent/FI943133A0/fi not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-06-29 JP JP8502849A patent/JPH10501978A/ja not_active Ceased
- 1995-06-29 HU HU9603608V patent/HU221613B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-29 CZ CZ19963782A patent/CZ294329B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-06-29 NZ NZ288635A patent/NZ288635A/xx unknown
- 1995-06-29 CA CA002193861A patent/CA2193861A1/en not_active Abandoned
- 1995-06-29 AU AU27944/95A patent/AU699391B2/en not_active Ceased
- 1995-06-29 CN CN95194807A patent/CN1159833A/zh active Pending
- 1995-06-29 EP EP95923355A patent/EP0763118A1/en not_active Ceased
- 1995-06-29 WO PCT/FI1995/000377 patent/WO1996000789A1/en not_active Ceased
- 1995-06-29 GB GB9627137A patent/GB2303856B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2303856B (en) | 1998-12-30 |
| GB9627137D0 (en) | 1997-02-19 |
| CZ378296A3 (cs) | 1998-03-18 |
| FI943133A0 (fi) | 1994-06-29 |
| JPH10501978A (ja) | 1998-02-24 |
| AU2794495A (en) | 1996-01-25 |
| WO1996000789A1 (en) | 1996-01-11 |
| CN1159833A (zh) | 1997-09-17 |
| AU699391B2 (en) | 1998-12-03 |
| GB2303856A (en) | 1997-03-05 |
| HUT75659A (en) | 1997-05-28 |
| CA2193861A1 (en) | 1996-01-11 |
| HU221613B (hu) | 2002-11-28 |
| NZ288635A (en) | 1998-12-23 |
| EP0763118A1 (en) | 1997-03-19 |
| HUP9603608D0 (en) | 1997-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ294329B6 (cs) | Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu Saccharomyces cerevisiae | |
| EP0901527B1 (en) | Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate | |
| Kenward et al. | Type II fish antifreeze protein accumulation in transgenic tobacco does not confer frost resistance | |
| US8796505B2 (en) | Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment | |
| JP3107820B2 (ja) | 低温耐性植物およびその作製法 | |
| KR100379143B1 (ko) | 자스몬산 메칠화 효소 유전자 및 이를 이용하여 병충해 및스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법 | |
| JP2001523110A (ja) | 内在性トレハラーゼレベルの阻害によるトレハロース−６−リン酸のレベルの改変による代謝の調節 | |
| US5648249A (en) | Method of improving the quality of stored potatoes | |
| US6130368A (en) | Transgenic plants producing trehalose | |
| AU727509B2 (en) | Method for increasing the trehalose content in organisms by means of their transformation with the cDNA of trehalose- 6-phosphate synthase/phosphatase from selaginella lepidophylla | |
| MXPA96001719A (en) | Method for increasing the trehalose content of the organisms through its transformation with the adnre of trehalosa-6-phosphate synthase / phosphatase of selaginella lepidophy | |
| US20110191902A1 (en) | Methods and Compositions for Increasing Storage-Life of Fruit | |
| US8889949B2 (en) | Method for increasing resistance of monocot plants against abiotic stresses, TPSP fusion enzyme gene constructs, and transformants | |
| KR100468307B1 (ko) | 트레할로스를생성하는유전자도입식물 | |
| RU2143496C1 (ru) | Продуцирование трегалозы в растениях | |
| AU2008202390B2 (en) | Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment | |
| HK1002769A (en) | Transgenic plants producing trehalose | |
| KR20150003099A (ko) | 식물의 생산성 증대 기능, 스트레스 내성 기능 및 노화 지연 기능을 갖는 atpg6 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 | |
| MXPA01003704A (en) | Specificgenetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment | |
| AU2005202773A1 (en) | Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a Homologous or heterologous environment | |
| Arvanitoyannis et al. | Plant Genetic Engineering: Horticultural Applications | |
| CZ2000451A3 (cs) | Způsob zvýšení výnosů rostlin | |
| HUP9903888A2 (hu) | Szabályozó mechanizmus trehalóz-6-foszfatáz szintjének a módosításával |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20060629 |