JPH10501978A

JPH10501978A - トレハロース産生トランスジェニック植物

Info

Publication number: JPH10501978A
Application number: JP8502849A
Authority: JP
Inventors: ロンデスボロウフ，ヨン; トゥンネラ，オウティ; ホルムストローム，シェル−オーベ; メンテュレー，エイナル; ウェリン，ビヨルン; マンダル，アブール; パルバ，エー・タピオ
Original assignee: アルコ・グループ・リミテッド
Priority date: 1994-06-29
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 1998-02-24
Also published as: GB2303856B; GB9627137D0; CZ378296A3; FI943133A0; CZ294329B6; AU2794495A; WO1996000789A1; CN1159833A; AU699391B2; GB2303856A; HUT75659A; CA2193861A1; HU221613B; NZ288635A; EP0763118A1; HUP9603608D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、トレハロースを産生するトランスジェニック植物および植物のトレハロース含量を増加する方法に関する。本発明によれば、興味のある植物を非構造的植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼをコードする配列で形質転換して、遺伝子の発現に対して時間的、局所的またはストレスの誘発の制御を可能にする。本発明は、渇水、高塩分または極端な温度から特産の農作植物を保護するため、および緑色食材、摘んだ果物および鑑賞植物を含む収穫した植物の貯蔵性を改善するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】トレハロース産生トランスジェニック植物発明の分野本発明は、トレハロース合成能力を挿入するための植物の遺伝子工学に関する。特に、本発明は増加したトレハロース含量を有する植物およびそれを産生する方法に関する。本発明はまた寒さおよび渇水のようなストレスに対して植物の耐性を増加する方法およびトレハロースを産生する方法に関する。発明の背景トレハロース(α−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノース)は、その還元基を経由して結合しているグルコース分子の二量体である。還元基の欠損、遅い加水分解および非潮溶性ガラスを形成する能力を含む、その他の糖と比べて独特な化学特性の組み合わせのため、タンパク質、細胞膜および他のin vitro生物学的化合物の最も有効な既知の保存剤の一つである。また、大量のトレハロースを含む生存生物は、特徴的に、昆虫、ある沿岸地域の動物ならびに酵母および真菌を含む多くの微生物のような浸透、脱水および熱ストレスにしばしばさらされるものである。パン酵母中のトレハロースの主要な役割は、これらのストレスに対する耐性を付与することであるという状況証拠がある(Ｗiemken[1990]Ａntoni e van Ｌeeuwenhoek 58，209-217要約)。しかしながら、パン酵母中のトレハロースの蓄積が、それ自体、ストレス耐性を付与しないこともまた示唆されている (Ｎwaka et al.[1994]FEBS Letters 344，225-228；Ｖan Ｄijk et al[1995]Ａp plied Ｅnviron．Ｍicrobiol．61，109-115)。高濃度のトレハロースは、長期の渇水および熱暴露でも生存できるシダ植物のようないわゆる復活植物に発生する(Ａvigad[1982]Ｅncyclopedia of Ｐlant Ｒ esearch(New Series)13A，pp217-347でレビュー)。しかしながら、維管束植物の大半がトレハロースを合成できない。このような植物は、しばしばグルシンベタイン、プロリンおよび種々のポリオールを含む他の“適合性”溶解物を、利用可能な細胞内水の減少によりもたらされるようなストレスに反応して合成できる( ＭcＣue＆Ｈanson[1990]Ｔrends in Ｂiotechnology 8，358-362)。被子植物におけるトレハロースについてはほとんど報告がなく、通常、微生物汚染を反映しているかもしれない少量と記載されている(例えば、Ｋandler＆Ｓe nse[1965]Ｚ．Ｐflanzenphysiol．53，157-161；Ｏesch＆Ｍeier[1967]Ｐhytoch emistry 6，1147-1148)。実際、トレハロースは、多くの植物組織に対して(Ｖel uthambi et al.[1981]Ｐlant Ｐhysiol．68，1369-1374)、特にトレハラーゼ活性がないかほんの僅かであるものに対して(トレハラーゼはトレハロースをグルコースに変える酵素である)毒性であると示唆されている。しかしながら、少なくとも一つの被子植物、ミロサムナス・フラベリフォリア(Ｍyrothamnus flabel lifolia)(他の“復活”植物)において、明白な量のトレハロースが蓄積され(Ｂi anchi et al.[1993]Ｐhysiologia Ｐlantarum 87，223-226)、トレハロースと被子植物の間に適合性の障害が完全にないことを示す。ほとんどの被子植物におけるトレハロースの非存在および報告された毒性は、トレハロース合成経路のこれらの植物への挿入は、ある場合、有毒な作用をもたらすかも知れないことをある程度示唆している。一方、植物における充分なトレハロースの産生は、実質的な利点になり得る。例えば、サトウダイコン、ジャガ芋、玉ねぎ等の貯蔵器官に蓄積されたトレハロースは、商業的に抽出されて、ある使用においてスクロースと同等の費用でトレハロースを提供する。これらの使用は、経済的に魅力的な乾燥処理において、トレハロースが多くの食品の香りおよび具合を保存するため、およびこの点でスクロースより優れているため、乾燥食品(牛乳および卵粉末、スープ、果実ピューレ等)の産生を含む(例えば、Ｒose r[1991]Ｔrends in Ｆood Ｓcience＆Ｔechnology，７月発行、pp.166-169：Ｒo して、トレハロースの非甘味は多くの場合(スープ、卵粉末)、更なる利点であり、実際健康に有害と理解されているフルクトースを産生しない。しかしながら、トレハロースが高価なため、乾燥食品産業での使用は法外に高くつく。第２に、ある植物の可食部分におけるトレハロースの産生は、トマトのような生産物の貯蔵寿命を延長し得る。第３に、感受性組織でのトレハロースの蓄積は、霜、渇水、高塩分および類似のストレスに対する植物の耐性を増加し得る。発明の要約上記の記載を基にして、新規なトレハロース産生能力を有する植物の提供が本発明の目的である。特に、植物生育におけるトレハロースの有害な可能性を減少しながら、トレハロースの商業的原料としての植物組織におけるトレハロースの制御された蓄積またはストレス耐性もしくは両方を提供するのが本発明の目的である。本発明は、増加したトレハロース含量のトランスジェニック植物を産生するための好適な植物プロモーターでの制御下のトレハロース合成のための構造遺伝子で、興味の対象の植物を形質転換するという考えに基づいている。特に、本発明の、トレハロース６−ホスフェートまたはトレハロース自体を産生する酵素のポリペプチドをコードする１個またはそれ以上の遺伝子のコード配列は、特定の種類の植物プロモーターの制御下に植物内で発現される。従って、興味の対象の植物を、遺伝子の完全な発現が、成熟植物のみに、または特異な環境条件に遭遇した場合になされるように、少なくともトレハロース− ６−ホスフェート合成酵素(Ｔre６Ｐシンターゼ)の遺伝子のコード配列で形質転換する。従って、プロモーターは、好ましくは非構造的であり、遺伝子の発現の、時間的(例えば、昼間)、局所的(例えば、組織特異的)またはストレス−活性化 (または“ストレス−誘発”)制御が可能であるように選択する。植物はまた、トレハロース−６−ホスファターゼ(Ｔre６Ｐase)コード遺伝子またはＴre６ＰシンターゼまたはＴre６Ｐaseもしくは両方と相互作用する調節ポリペプチド１個またはそれ以上で形質転換し得る。植物の形質転換は、形質転換アグロバクター・ツメファシエンス(Agrobacter tumefaciens)での感染、およびマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃および直接ＤＮＡ取り込みによるによる外来ＤＮＡの直接挿入を含む、当分野で利用可能な方法で行い得る。構造遺伝子は、好ましくは、それぞれ５６kＤa Ｔre６Ｐシンターゼ、１０２kＤa Ｔre６Ｐaseおよび１２３kＤa 酵母トレハロースシンターゼ制御サブユニットをコードする酵母遺伝子ＴＰＳ１、ＴＰＳ２およびＴＳＬ１を含む群から選択する。興味の対象の植物をトレハロース合成のための構造遺伝子、特にＴre６Ｐシンターゼで上記のように形質転換し、遺伝子の発現において時間的、局所的またはストレス誘発的な制御が可能なように好適なプロモーターの制御下でこれらの遺伝子を発現させる工程を含む、増加したトレハロース含量のトランスジェニック植物を産生する方法を提供するのが本発明の別の目的である。 −トランスジェニック植物を産生するために、Ｔre６Ｐシンターゼの少なくとも一つの構造遺伝子で植物を形質転換する、 −植物中のトレハロース合成発現を誘発する条件下でトランスジェニック植物を栽培する、および −植物の組織からトレハロースを抽出する工程を含む、トレハロースの産生が本発明の第３の目的である。本発明の第４の目的は、渇水、高塩分、極端な温度および他のストレスのような逆境に対して植物を保護する方法の提供であり、該方法は、少なくとも、遺伝子の完全な発現が植物が逆境になるまでおきないような植物プロモーターと好適に融合したトレハロース−６−ホスフェートシンターゼの遺伝子のコード配列で植物を形質転換することを含む。植物は、所望により、トレハロース−６−ホスフファターゼおよびトレハロース−６−ホスフェートシンターゼまたはトレハロース−６−ホスファターゼもしくは両方と相互作用する制御タンパク質をコードする１個またはそれ以上の遺伝子と共形質転換し得る。例えば、本発明は、遺伝子の完全な発現が、植物が低温に遭遇するまでおきないように植物プロモーターと好適に融合したトレハロース−６−ホスフェート遺伝子で形質転換することを含む、開花に対する霜害からベリー類または他の果実がなっている植物を守る方法を提供する。本発明の第５の目的は、非形質転換植物でなされるような徹底的および高度な世話を必要としない形質転換観賞用植物の提供であり、本方法は、植物がそのある組織内にトレハロースを含むように植物プロモーターと好適に融合したトレハロース−６−ホスフェートシンターゼの遺伝子で形質転換することを含む。図面の簡単な説明図１は、Ｔre６ＰシンターゼサブユニットをコードするＴＰＳ１酵母遺伝子に融合したアラビドプシス・サリアナ・ルビスコ(Ａ．thaliana Ｒubico)小サブユニットプロモーター(pats1A)およびアグロバクテリウム・ツメファシエンのノパリンシンターゼ遺伝子(nos)由来の転写停止シグナルを含むキメラ遺伝子構築物の模式図を記載する。キメラ遺伝子とプラスミドpKOH51の部分のみ示す。キメラ遺伝子構築物の独特な制限酵素開裂部位を示す。図２は、矢印で記した５６kＤa TPS1生産物を示すトランスジェニックタバコ植物のウェスタン・ブロット分析の結果を示す。タンパク質は、図１に示す構築物(ライン１、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、１６および１９)または同じベクター内のβ−グルコニダーゼ遺伝子(ＵＩＤＡ)と融合したカリフラワー・モザイウクウィルス３５Ｓプロモーターでのキメラ遺伝子(ＧＵＳ)または非形質転換タバコ植物(ＳＲ１)から抽出した。図３は、トレハロースのクロマトグラフィー同定を示す。タバコ葉の水抽出物のサンプル(２０μl)を一般的材料および方法に記載のようにＨＰＬＣで分析した。抽出物ＡおよびＢは、トレハロース処理(Ａ)前および(Ｂ)後の温室栽培形質転換体１９生重量１９２mg ml^-1を含んだ。抽出物ＣおよびＤは、両方とも滅菌条件下で成育させた(Ｃ)形質転換体４または(Ｄ)ＴＰＳ１遺伝子を欠くプラスミドpDE1001で形質転換した対照植物からの葉１４９mg ml^-1を含んだ。トレハロースピークをＴで示す。約２５分の二つの大きなピーク(ピーク７および８)はグルコースおよびスクロースである。図４ ats1-TPS1形質転換ライン４を分析したＴＰＳ１−サブユニットの組織局在を示すタンパク質免疫ブロットである。野生型タバコ(ＳＲ１)の葉を陰性対照としておよび酵母(ＴＰＳ１)から精製したＴre６Ｐシンターゼサブユニット０．１μgを陽性対照として使用した。同じ組織のトレハロース含量を免疫ブロットの上にmg／ｇ乾燥重量で示す。ｎｔ、試験せず。以下の略語を使用する：ＦＴはつぼみ、ＵＬは上部の葉、ＭＬは真ん中の葉、ＬＬは下の葉、ＵＳは上部幹、Ｒは根およびＥＣは酵素対照。図５トレハロース産生植物における促進された渇水耐性。in vitro繁殖植物の６から８週令の同じ発育段階の別の葉を空気乾燥にさらした(２５％ＲＨ)。( Ａ)示唆した時間に葉を秤量し、結果を各時点の葉の相対的生重量として表す。各葉の乾燥重量は葉を＋６０℃で４８時間乾燥した後に得た。野生型対照タバコをＳＲ１で示し、トレハロース産生トランスジェニックライン１、４および８をその各ライン番号で示す。(Ｂ)ストレス処置の間の選択した時にトランスジェニックライン４および対照植物から得た別の葉の見かけ。図６対照およびトレハロース産生タバコ植物の渇水生存。(Ａ)６から８週令in vitro繁殖全植物を空気乾燥(Ｄ)に示唆した時間暴露した。ストレス処理１７時間後、非形質転換対照植物(ＳＲ１)およびトレハロース産生トランスジェニック植物ライン４および８をそれぞれ水中に入れることにより再給水(Ｒ)した。(Ｂ) トランスジェニックライン８および、非形質転換(ＳＲ１)およびベクター形質転換(Ｃ)対照植物の両方の３週令の苗木を空気乾燥(Ｄ)に示唆した時間暴露した。続いて苗木を７時間後水中に入れることにより再給水(Ｒ)した。図７第１ヘパリン−セパロースカラムから溶出したミコバクテリウム・スメグマティス(Ｍ．smegmatis)Ｔre６Ｐシンターゼ含有フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１から４はそれぞれＨ３３(７.０mＵ)、Ｈ３５(２０mＵ)、Ｈ３６(２１mＵ)およびＨ３７(１２mＵ)のサンプルを含む(表３)。８％アクリルアミドでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルをクマーシー・ブリリアント・ブルーで染色した。レーン５の分子量標準のサイズはkＤaで示す。５５kＤa Ｔre６Ｐシンターゼポリペプチドの位置を矢印で示す。図８第２ヘパリン−セパロースカラムから溶出したミコバクテリウム・スメグマティスＴre６ＰシンターゼのピークフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。フラクションＴ２１(表３)をＣentricon１０管で濃縮し、次いでその半量の３倍濃縮ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合した。全濃度は６倍であった。Ｔre６Ｐシンターゼの(レーン１)２.９mＵおよび(レーン３)８.７mＵを含むサンプルを８％アクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、クマーシー・ブリリアント・ブルーで染色した。レーン２の分子量標準は、上から下に１０９、８４、４７、３３、２４および１６kＤaである。図９ミコバクテリウム・スメグマティスから精製したＴre６Ｐシンターゼのウェスタン分析である。８％アクリルアミドゲルを染色前分子量マーカー(レーン１：２００、１１７、８０および４７kＤa；レーン１０：唯一の可視マーカーは８４kＤa)、フラクションＴ２１(表３)由来の純粋Ｔre６Ｐシンターゼ(レーン７および８：２.９mＵ；レーン３、４および９：８.７mＵ)およびＧ１００セフェアデックス由来の貯蔵活性フラクション(表３)(レーン６：全タンパク質７.８μ ｇ；レーン２および５：全タンパク質２３μg)と流した。電気泳動およびニトロセルロースへのブロッティング後、ニトロセルロース膜をレーン３と４および７と８の間で切断した。レーン１から３をクマーシー・ブリリアント・ブルーで染色し、レーン４から７を酵母由来の精製５６kＤaＴre６Ｐシンターゼサブユニットに対して発生した抗−５７血清とプローブし、レーン８から１０を前免疫血清とプローブした。免疫反応性バンドを、Ｐromega由来のヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ接合体を使用して、産生者の指示に従って、両方とも発色時間は２.８分で可視化した。レーン４から７を横切る斜線は、ニトロセルロースへの転移中の突発的な膜の折り目である。図１０アラビドプシス・サリナ(Ａrabidopsis thalina)の８種のトランスジェニックラインのウェスタン分析。一次形質転換体の種子から成育した植物を抽出し、本質的に図２で述べたように酵母由来の精製５６kＤaＴre６Ｐシンターゼサブユニットに対して発生した抗血清で分析した。酵母(０.１μg)から精製したＴ re６Ｐシンターゼサブユニットを陽性対照として使用した。非形質転換アラビドプシス・サリナはシグナルがなかった。発明の詳細な説明以下の記載において、“構造的植物プロモーター”は、その関連するコード配列の連続的および一般的発現の原因となり、その配列の生産物が植物の全ての細胞および成育の全ての段階で見られる、植物プロモーターを意味する。対照的に、非構造的プロモーターは、植物が生育および成熟するにつれて明確な組織を形成するために細胞が分化することまたは植物環境の変化することのような特異的な内部および外界の事象により活性化される。多くの種類の環境変化が、あるプロモーターを活性化することが知られている。例は、実施例１−３に使用のats１Ａプロモーターのようなリブロース−１,５−ビホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットの光誘発活性化(Ｋrebbers et al.[1988]Ｐlant Ｍol．Ｂiol ．11，745-759)並びにＬＴＩ７８(Ｎordin et al.[1933]Ｐlant Ｍol．Ｂiol．2 1，641-653)およびＲＡＢ１８(Ｌang＆Ｐlava[1992]Ｐlant Ｍol．Ｂiol．20，9 51-962)のようなプロモーターの種々のストレスによる活性化を含む。しかしながら、我々の発明は非構造的プロモーターのこれらの例に限定されない。むしろ、本発明の重要で新規な部分は、植物によるトレハロースの構造的合成が常に不経済であり、ある場合有害であるという概念であり、そのため、本明細書に記載のトレハロース産生の利点が非構造的プロモーターの使用により最も良く理解できる。これらの非構造的プロモーターの手段により、トランスジェニック植物中のトレハロースの生合成が時間的制御(即ち、ある時期にしか起こらない)、局所的制御(即ち、植物のある部分に限定されている)または両方に付すことができる。本明細書で使用の植物器官の名前は、一般に通常の青果商および消費者が使用しているものである。従って、例えば、“果実”は、種子を含むこれらの貯蔵組織は厳密な植物学的意味からはそれ自体果実ではないが、食べるために売られているリンゴまたはイチゴ植物を含む。維管束植物の大半がトレハロース合成能を欠くようであることは既に述べられており、従って“トレハロース産生”植物は、量的定義を要しない。しかしながら、ある普通の植物(いわゆる復活植物以外)がストレス中にトレハロースを産生し得ることは、研究されていないように思える。本願発明は、トレハロース合成のための異種能力を挿入するための植物の遺伝子工学に関する(本明細書において、トレハロース合成を“新規”能力とまた呼ぶ)。同様の条件下で成育させた非形質転換植物と比較して、必要とされるトレハロースの増加は、ストレス耐性の有用な改善をもたらすか、または商業的使用のために植物から有利に抽出できるようになることのいずれかである。多くの微生物は、トレハロース−６−ホスフェート(Ｔre６Ｐ)を産生する酵素系を含有し、それをトレハロースに加水分解する。例えば、サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓaccharomyces cerevisiae)は、５６、１０２および１２３kＤa サブユニットを含むトレハロースシンターゼ複合体を含有し(Ｌondesborough＆Ｖuorio[1993]Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．216，841-848)、それらはウリジンジホスホグルコース(ＵＤＰＧ)およびグルコース−６−ホスフェート(Glc6P)を最初にＴr e６Ｐに(Ｔre６Ｐ合成反応)、次いで遊離トレハロースに縮合する(Ｔre６Ｐase 反応)。Ｔre６ＰシンターゼおよびＴre６Ｐase活性は、それぞれ５６および１０２kＤaサブユニットに帰し、１２３kＤaサブユニットは錯体上で制御的特性を付与し、それを安定するように思える。カンジダ・ユティリス(Ｃandida utilis)( Ｓoler et al[1989]FEMS Ｍicobiol．Ｌetters 61，273-278)、エシェリキア・コリ(Ｅ．coli)(Ｇlaever et al[1988]Ｊ．Ｂacteriol．170，2841-2849),ディクチオステリウム・ジスコイデウム(Ｄictyostelium discoideum)(Ｋillick[197 9]Ａrch．Ｂiochem．Ｂiophys．196，121-133)およびミクオバクテリウム・スメグマティス(Ｌapp et al[1971]Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．246，4567-4579)を含む他の微生物系は、後の二つはＵＤＰＧの代わりにアデニンジホスホグルコース(ＡＤＰＧ)を使用できる。これらの微生物酵素系のサブユニット構造についてほとんど情報がない。線虫類、昆虫および復活植物を含むトレハロースを産生する多細胞生物は、Ｔre６ＰシンターゼおよびＴre６Ｐase活性の酵素を含むとまた考えられ得る。原則として、これらのＴre６Ｐシンターゼの植物への伝達は、植物にＴre６Ｐを合成する新規能力を与える。タバコのような植物がＴre６Ｐをトレハロースに変換する内在能力を有することが記載されており、驚くべきことに、例えば、タバコのＴre６Ｐシンターゼ単独での形質転換が、トレハロースそれ自体の有効な産生を導く。しかしながら、Ｔre６Ｐのトレハロースへの内因性転換は遅いかまたは欠けているときは、好適な源からのＴre６Ｐaseでまた形質転換し得る。Ｔr e６ＰシンターゼおよびＴre６Ｐaseがトレハロース合成のサブユニットである酵母酵素のような系で、天然酵素複合体が形成できるように、植物を同じ源由来のＴre６ＰシンターゼおよびＴre６Ｐaseの遺伝子で共形質転換するのが好ましい。酵素の源が何であれ、トランスジェニック植物中で形成されたトレハロースを、次いで、抽出でき、またはあるストレスに対して増加した耐性を付与し得る。ある酵母遺伝子でこの方法で形質転換した植物中でのトレハロースの産生は、既に記載されている(ＰＣＴ／ＦＩ９３／０００４９)。しかしながら、ある場合(例えば、ストレスにさらされた場合または成熟植物中)およびある組織(例えば、貯蔵器官、または、好適な時期の霜感受性組織)のトレハロースの蓄積は植物にとって有益であり、または少なくとも害がないと考えれるが、他の時期または他の組織におけるトレハロースの蓄積が植物に有害であり得る明白な可能性がある(Ｖeluthambi et al.[1971]前掲)。従って、植物が成熟するかまたは、渇水および低温を含む環境条件に遭遇するまで、植物へのトレハロースの利点がその不利益より勝るまでは、トレハロース合成の原因となる遺伝子の完全な発現を行わない、植物プロモーター(植物プロモーターは、コード配列の転写を促進する遺伝子の一部である)の使用が有利である。 RUBISCOの小サブユニットの光誘発発現を動かすリブロース−１,５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ(Ｒubiscoプロモーター)(Ｋrebbers et al.[1988]Ｐl ant Ｍol．Ｂiol．11，745-759)を含む、このような非構造的植物プロモーターの幾つかの例が、当業者に既知である。Ｒubisco小サブユニットのats1プロモーターに正確に融合した酵母ＴＰＳ１遺伝子のコード配列(解放読み取り枠、ＯＲＦ)で形質転換したタバコおよびアラビドプシス植物を開示する。ＴＰＳ１は酵母トレハロースシンターゼの５６kＤaをコードする。形質転換植物は健康であり、繁殖力があり、その葉にトレハロースを含む。非形質転換タバコまたはＴＰＳ１遺伝子を欠く同様のベクターで形質転換したタバコはトレハロースを含まない。開示のトランスジェニック植物は、形質転換の媒体にアグロバクター・ツメファシエンスを使用して得たが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは粒子衝撃を含むＤＮＡの直接挿入を含む当分野で実行可能な方法を利用し得る(Ｇasser＆Ｆraley[1989]Ｓcie nce 244，1293)。これらの形質転換タバコ植物の一つ(形質転換体４)はＴre６Ｐシンターゼ活性を含むことが示される。遊離５６kＤaサブユニットは、酵母の無傷トレハロースシンターゼ錯体から単離した場合、不安定であることが知られている(Ｌondesbo rough＆Ｖuorio[1993]前掲)。方法は、同業者が、植物プロモーター、例えばats １Ａプロモーターまたは構造的であり得る他の簡便なプロモーターの制御下に、ＴＰＳ１遺伝子および他の酵母トレハロースシンターゼ遺伝子(ＴＰＳ２およびＴＳＬ１)の一つまたは両方で植物を共形質転換できるように記載されている。このような共形質転換は、ＴＰＳ２およびＴＳＬ１がコードするサブユニットが 56kＤaサブユニットを安定化するため、ＴＰＳ１のみを含有する植物と比較して、植物のトレハロース含量を増加し得る。誘導可能プロモーターで制御されたＴre６Ｐシンターゼ遺伝子を、構造的プロモーターで制御されたＴre６Ｐaseまたは制御タンパク質の１個またはそれ以上の遺伝子と共に共形質転換した植物において、トレハロース産生は、Ｔre６Ｐシンターゼがトレハロース生合成の最初の独特な工程を触媒するため、誘導可能プロモーターで制御される。トレハロース産生形質転換タバコ植物は、促進された渇水耐性を示すことを明らかにする。これは、切り取った葉および全植物体の両方の実験で示される。改善された渇水耐性は、形質転換体の自己授粉子孫の成熟植物および若い苗木で示される。これらの子孫において、渇水耐性は、子孫の緑色組織中の５２kＤaシンターゼサブユニットの存在により明らかであるＴＰＳ１⁺特性と共遺伝する。開示のトランスジェニック植物の水ストレス耐性は、細胞内容物の浸透圧緩衝化を提供するには、組織内で見られるトレハロースの量が少なすぎるように思えるため、驚きである。恐らく、トレハロースは、膜のような特殊な部位を保護するように働くか、または恐らくトレハロースまたはその前駆体であるＰre６Ｐが植物代謝を乱し、細胞をストレスから防御する二次的な変化をもたらす。キメラＴＰＳ１遺伝子を含む一次形質転換体において、ほとんど、またトレハロースを産生する子孫では見られない、槍形葉、減少した頂点優勢および減少した高さのような僅かな形態的変化が見られることを記載する。これらの変化は、主に組織培養による人工品に現れる。しかしながら、自己授粉子孫を含むトレハロース産生タバコ植物は、生育が遅く、最適条件下で８週間成育させた後、対照植物より１から２週間の遅れがあることを明らかにする。これは、植物中でのトレハロースの合成が、ats1Aプロモーターの制御下でさえ、成育を遅らせ得ることを示唆する。従って、LT178(Nordin et al[1993]Plant Mol．Biol.21，641-65 3)のようなストレス誘発プロモーターが、正常成育速度を維持するために更に有利に使用し得、および実施例５に記載のように、ストレス下でトレハロース誘発防御を提供するが、非ストレス条件下で産生する。これらのトランスジェニック植物は、Ｔre６ＰaseをコードするＴＰＳ遺伝子ではなく、Ｔre６Ｐシンターゼをコードする酵母ＴＰＳ１遺伝子でのみ形質転換しているが、トレハロースを合成する。従って、ある植物は、Ｔre６Ｐをトレハロースに変換する内在性能力を有する。ある場合、Ｔre６ＰaseをコードするＴＰＳ２のような遺伝子と共にまた植物を共転換するのが有利であり得、Ｔre６Ｐのトレハロースへの変換速度を増加する。更に、同様の結果が、酵母以外の微生物由来のＴre６Ｐシンターゼ(およびＴre６Ｐase)の遺伝子で得られ得ることが明白である。これらの遺伝子の多くがＴＰＳ１(およびＴＰＳ２)に相同であり、酵母系の酵素および遺伝子由来の免疫学的またはオリゴヌクレオチドプローブを使用して容易にクローン化し得る。例えば、ミコバクテリウム・スメグマティス由来のＴre６Ｐシンターゼは、酵母トレハロースシンターゼの精製56kＤa Ｔre ６Ｐシンターゼサブユニットに対して発生した抗血清と交差反応する約５５kＤa ポリペプチドであることを開示する。ミコバクテリウム・スメグマティス酵素由来のトリプティック(tryptic)ペプチドが開示され、酵母酵素との緊密配列相同性が明らかである。当業者は、Ｔre６ＰシンターゼおよびＴre６Ｐase遺伝子を、これらの試みを使用して多くの生物から容易にクローンできる。我々の発明は、好適な生物から得、好適な植物プロモーターに融合したＴre６ＰシンターゼおよびＴre６Ｐaseの遺伝子での植物の形質転換を含む。トレハロースシンターゼの１個またはそれ以上の遺伝子での形質転換の結果トレハロースを含む植物は、幾つかの方法に使用できる。例えば、トレハロースが商業的規模で植物から抽出できる。このようなトレハロースは、乾燥中の植物の香りおよび具合の保持を含む大量使用なし得るほど安い。この使用において、トレハロースは、好ましくはジャガ芋の塊茎、サトウダイコンまたはカブの根あるいは玉ねぎの球根のような貯蔵器官に蓄積する。方法は、これらの例および多くの他の農作物(Ｌindsey[1992]Ｊ．Ｂiotechnol．26，1-28)の形質転換について記載されているが、我々の発明は分子生物学者に頻繁にモデルとして使用されている植物に限定されない。モデル植物について開発された方法は、当業者は他の植物に適用できる。従って、本発明は、例えば、形質転換サトウキビの幹または葉もしくはバナナの果実において、また実行される。特異的に貯蔵器官での発現をもたらす植物プロモーターは当業者に既知である(例えば、パタティンプロモーター)。本発明の一つの態様において、ＴＰＳ１のようなＴre６Ｐシンターゼの遺伝子のコード配列は、このようなプロモーターに、ＴＰＳ１コード配列がat s１Ａプロモーターに融合したのと同じ方法でこのようなプロモーターに融合し、好適な植物をこれらのＤＮＡ構築物で形質転換する。次いで、貯蔵器官に蓄積されたトレハロースを抽出し得る。本発明の他の態様において、植物組織に蓄積されたトレハロースは、収穫後の貯蔵特性を改善し得る。従って、形質転換タバコの切り取った葉は、非形質転換タバコと比較してゆっくり水分を失い、水分を失った後でさえ、変色しない(図５)。この態様は、可食植物および観賞植物の両方に適用可能である。可食植物に関して、収穫後に起こる種々の種類のレタス商品のしなびることおよび変色が、特に小売店において重大な経済的負担である。最終費用は消費者の負担となる。トレハロース産生レタスは、安くてより魅力的なレタスを提供する。同様の考えが、食用植物、特にキャベッツ、ブロッコリー、ホウレンソウ、イノンドまたはパセリのような葉生産物およびエンドウ豆およびベニバナインゲンのような緑色野菜に適用される。バラ、チューリップ、ラッパズイセンのような多くの観賞植物は、切った後に輸送される。高価な輸送(冷蔵、空輸)でさえ、多くの浪費が起こる。再び、費用は消費者が負担するが、この消費者に、水分含量を良好に維持し、乾燥への感受性が低いトレハロース産生観賞植物により、安くてより快適な生産物が提供されることになる。本願発明のこの態様において、Ｔre６Ｐシンターゼ遺伝子を、トレハロースが植物の収穫すべき部位に蓄積するように選択した植物プロモーターと融合する。例えば、ats１Ａプロモーターは、タバコの葉、茎上部およびつぼみでのＴre６Ｐの発現をもたらし、トレハロースはこれらの部位に蓄積する。しかしながら、発明者は、タバコのような植物が、トレハロースをその合成部位からトレハロースを合成しない組織に輸送することを明らかにする。従って、非構造的ats１Ａプロモーターが根でのＴre６Ｐシンターゼの発現をもたらさないが、少量のトレハロースが、これらのトランスジェニックタバコ植物の根にも見られた。本発明の関連の態様において、トマト、ベリーおよび他の果実のような、形質転換植物のトレハロース含有可食部位は、またそのトレハロース含量のために新鮮で豊かな香りを有するピューレ、ペースト、ゼリーおよびジャムを産生するために処理される。このような植物へのトレハロースの添加は、特に処理が乾燥工程を含む場合、その香りの保持を改善することが示されている(WO89/00012)。本願発明は、トレハロースを既に含む植物を提供することにより、トレハロース添加の必要性を回避する。標的植物の貯蔵器官でのトレハロース合成を主に指示するパタティンプロモーターのようなプロモーターの使用が、本発明の本態様で有利であり得る。トレハロース産生形質転換タバコが増加した渇水耐性を有することが開示される。一般に、トレハロース含有形質転換植物は、渇水、霜、高塩分および他のストレスに、非形質転換植物よりもより耐性であり得る。従って、渇水、霜および浸透ストレスは、全て植物を主に細胞内水を取り除くことにより苦しめ、膜およびタンパク質の障害の原因となり、それをトレハロースがin vitroで軽減することが知られている(Crowe et al[1992]Annu.Rev.Physiol．54，579)。本発明のこの態様において、使用する植物プロモーターは、ストレスにより誘発されるものである。このようなプロモーターは、当分野で既知であり、例えばＬＴ１７８( Ｎordin et al.[1993]Ｐlant Ｍol．Ｂiol．21，641-653)およびＲＡＢ１８(Ｌa ng＆Ｐalva[1992]Ｐlant Ｍol．Ｂiol．20，951-962)である。これは、トレハロース合成を必要になるまで阻止する。トレハロースを含むが、よく成育する植物について、本発明のこの態様は、ストレス誘発プロモーターの手段なしに達成できる。しかしながら、必要になるまでトレハロース産生を阻止するストレス誘発プロモーターの使用は、そうでなければ光合成能力のトレハロース合成への転換をもたらす産生の不利益を避け、pats１Ａ−ＴＰＳ１キメラ含有タバコで明らかような成育の起こり得る遅延を避けるのに更に有利である。この態様は、食用植物だけでなく、庭または室内装飾を意図する観賞植物にも適用される。形質転換ストレス耐性観賞植物は、対応する非形質転換植物よりも集中および専門的扱いが必要でない。少なくとも一次形質転換体に見られるあるトレハロース産生植物における生育遅延および僅かな形態学的変化は、観賞植物で不利ではないことがある：成育遅延および新しい外観は、特に室内装飾について魅力的特性となることができる。本発明の更に別の態様において、Ｔre６Ｐシンターゼは、特異的事象または条件設定(例えば、寒冷または渇水ストレス)により活性化する植物プロモーター( 例えば、ＬＴＩ７８またはＲＡＢ１８)と好適に融合し、商業的に抽出可能な量のトレハロースの植物中への蓄積が、収穫直前に成熟植物で起こるように引金を引くことができ、ある植物の発育初期のトレハロースの有害作用を避ける。上記の記載を基に、本発明のトランスジェニック植物は、トウモロコシ、オート麦、キビ、小麦、米、大麦、モロコシ、アマランス、玉ねぎ、アスパラガスまたはサトウキビのような単子葉植物またはアルファルファ、大豆、ペチュニア、綿、サトウダイコン、ヒマワリ、ニンジン、セロリ、キャベツ、キュウリ、胡椒、トマト、ジャガ芋、レンズ豆、アマ、ブロッコリー、タバコ、豆、レタス、アブラナ、コラード、カリフラワー、ホウレンソウ、芽キャベツ、アーティチョーク、エンドウ豆、オクラ、カボチャ、ケール、紅茶またはコーヒーのような双子葉植物であることができる。酵母遺伝子ＴＰＳ１およびその生産物がタバコの生化学的組織と適合性があることが開示される：遺伝子は、高度に発現され、５６kＤaサブユニットがトレハロースの発現をもたらした。しかしながら、当分野で、植物遺伝子が、例えば、微生物遺伝子と比較して低いＡ＋Ｔ割合をしばしば有することが知られており、植物中の異種遺伝子の発現レベルがコドン使用を、特にコード配列の開始点付近を、植物で見られるもののように変えることにより増加できる(Perlak et al.[1 991]88，3324-3328)。我々は、遺伝子のこれらおよび同様の修飾が本願発明で有用であり得ることを予想する。自然変異が遺伝子で起きることもまたよく知られている。ＤＮＡ配列のこれらおよび人工変化が、コードポリペプチドのアミノ配列を変化し得る。本明細書での使用において、ＴＰＳ１(またはＴＰＳ２またはＴＳＬ１)は、酵母トレハロースシンターゼの５６kＤa(または１０２kＤaまたは１２３kＤa)サブユニットの所望の機能または構造特性のポリペプチドをコードするＴＰＳ１(またはＴＰＳ２またはＴＳＬ１)と相同の全てのＤＮＡ配列を含む。同様に、“Ｔre６Ｐシンターゼ(またはＴre６Ｐaseまたは制御ポリペプチド)の遺伝子”は、天然生物から容易に単離し得るこのような遺伝子(例えば、ＴＰＳ１またはＴＰＳ２またはＴＳＬ１の既知の遺伝子から設計されたヌクレオチドプローブを使用して)だけでなく、本来単離された遺伝子によりコードされるポリペプチドの所望の機能または構造特性のポリペプチドをコードする天然および人工変異も含む。実施例一般的材料および方法材料使用した植物はＮicotiana tabacum cv．SR1およびＡrabidopsis thalian a Ｌ．Ｈeyng．ecotype C-24であった。トレハロースシンターゼの５６kＤa Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットをコードする酵母遺伝子ＴＰＳ１(以前はＴＳＳ１と呼ばれていた)、トレハロースシンターゼの１２３kＤa制御サブユニットをコードする酵母遺伝子ＴＰＬ１は、Ｖuo rio et al.([1993]Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．216，849-861)記載のプラスミドｐＡＬＫ７５２およびｐＡＬＫ７５４から得た。酵母遺伝子ＴＰＳ２は、スイスのＢot よびＡndres Ｗiemken博士から得、プラスミドYCplac111のＳacＩ部位にクローン化したＴＰＳ２遺伝子を含有した。本遺伝子(Ｄe Ｖirgilio et al.[1993]Ｅu r．Ｊ．Ｂiochem．212，315-323記載)は、Ｖuorio et al.(1993、前掲)の表１に示すように、１０２kＤa由来のアミノ酸配列をコードする。酵母トレハロースシンターゼ(抗ＴＰＳ／Ｐ)および５６kＤaサブユニット(抗５７Ｋ)に対して産生した抗血清および一般的生化学物質は、Vuorio et al.(1993前掲)に記載の源由来であった。小空胞トレハラーゼは、suc^-gal^-mel^-mal^-酵母株(ALKO2967)からＬon desborough＆Ｖarimo([1984]Ｂiochem．Ｊ．219，511-518)に記載のように部分的に精製され、スクロース、マルトースまたはメリビオースを加水分解しなかった。ＤＮＡ操作全ＤＮＡ操作は、確立された研究室方法にしたがって行った(Ｓamb rook et al.[1989]Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpr ing Ｈarbor，Ｎew Ｙork)。エシェリキア・コリ株ＤＨ５αおよびＭＣ１０６１をプラスミド産生に使用した。ＴＰＳ１発現の制御に使用したプロモーターは、Ｒubiscoの小サブユニットをコードする、アラビドプシス・サリアナのats１Ａ遺伝子由来であった(Ｋrebbers et al[1988]前掲)。キメラats１Ａ−ＴＰＳ１遺伝子を構築するために、転移ペプチドの配列を欠く、ats１ＡプロモーターフラグメントをプラスミドpGSFR401からＰＣＲで増幅した。合成オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅フラグメントの５'にＥcoＲＩ部位および３'末端にＸbaＩ部位を産生するために使用した。ＰＣＲ増幅生産物を好適な制限酵素で消化し、続いてアガロースゲルで精製し、ＥcoＲＩおよびＭluＩ消化ｐＵＣ１９プラスミドにライゲートした。酵母ＴＰＳ１遺伝子を上記のようにプラスミドpALK752から増幅した。得られたフラグメントは５'ＭluＩおよび３'ＸbaＩ部位を含んだ。消化および精製後、フラグメントをｐＵＣ１９のp ats１Ａの後ろにライゲートした。プロモーター−ＴＰＳ１構築物のフラグメントをＥcoＲＩおよびＸbaＩで切断し、次いでそのポリアデニル化信号およびＴ− ＤＮＡ右端を含むＴ−ＤＮＡ遺伝子Ｇ７の３'末端を含むプラスミド由来のｐＢl uescriptII ＳＫ⁺(Ｓtratagene)に挿入した。最後に、完全キメラ遺伝子をＥco ＲＩ−ＳacＩフラグメントとして、キメラカナマイシン耐性遺伝子ｐＮＯＳ−ＮＥＯ−３'ＯＣＳを選択マーカーとして含む植物形質転換ベクターｐＤＥ１００１(Ｄenecke et al[1992]EMBO J．11，2345-2355)に挿入した。この得られたプラスミドｐＫＯＨ５１はキメラpats1A-TPS-1-3'G7遺伝子を含む。構築物は、形質転換によりエシェリキア・コリ株ＤＨ５αにクローン化し、次いでエレクトロポレーション(Ｄower，Ｍiller＆Ｒagsdale[1988]Ｎucl．Ａcids Ｒes．16，612 7-6145)により、非癌原性ＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０(Ｄeblare et al[1995] Ｎucl．Ａcids Ｒes．13，2777-2788)含有アグロバクテリウム・ツメファシエンス(C58C1 rif^R)に移入した。他の構築物は同様の方法で産生した。植物の生育無菌成育のため、ニコチアナ・タバクム(ＳＲ１)由来滅菌外植体を２％シュークロース添加固体ＭＳ(Ｍurashige＆Ｓkoog[1962]Ｐhysiol．Ｐlant 15，473-497)培地(ＭＳ−２)を含むガラスジャーに植えた。これらのジャーを、次いで、植物が２２℃で１６時間光時間で成育できる培養室中の制御成育条件下に置いた。外植体を無菌物質の連続成育のために、新しいジャーおよびＭＳ−２培地に定常的に移した。温室植物を植木鉢中の土で成育させ、毎日水をやった。形質転換アラビドプシス・サリアナ植物を最初、タバコについて上記のような制御環境下でベビーフードシャーで無菌的に成育させたが、後に種産生のために音質中の植木鉢の土壌に移植した。一次形質転換体の種は、新しい種子産生のために土壌に直接蒔くか、分子分析のために表面滅菌し２４ウェル組織培養プレートで無菌的に成育させるかいずれかであった。植物形質転換タバコおよびアラビドプシス・サリアナの両方を、以下のプロトコールに従い、出発物質はタバコの切り取った葉およびアラビドプシス・サリアナの根で、形質転換した。形質転換および組織培養は、基本的にＶalvekens et al([1988]Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．U.S.A．85，5536-5540)の記載の通りであり、以下の修飾をなした。単離根または葉を固化カルス誘発培地(ＣＩＭ)で４日間予備インキュベーションし、根を小さいセグメント(１−２mm)に切断し、葉を大きな片(１０−２０mm)に切断し、液体ＣＩＭ２０mlに移した。３',５'−ジメトキシ−４'−ヒドロキシアセトフェノン(０.２mg／ｌ)をアグロバクテリウム (C56C1 rif^R)感染前に添加した。感染に使用した細菌は、一晩、好適な抗生物質を含むＹＥＢ培地(Ｖervliet et al[1975]Ｊ．Ｇen．Ｖirol．26，33-48)で２８ ℃で繁殖させ、遠心して回収した。細菌ペレットを１０mＭＭｇＳＯ₄に再懸濁し、植物組織に加え、穏やかに約１５分撹拌した。過剰な液体を流して捨て、根を滅菌濾紙にブロットした。２日間、固体ＣＩＭで共培養後、植物組織を３−４回液体ＣＩＭで濯いで細菌を洗い、選択的発芽誘発培地(ＳＩＭ)に移した。７日成育後、分化形態学的セクターの外植体を新鮮ＳＩＭに移した。ウェスタン分析のためのタンパク質抽出生重量１００−２００mgの植物サンプルを、タンパク質抽出緩衝液(５０mＭトリス／ＨＣｌｐＨ７.２、２５０mＭスクロース、５mＭＥＤＴＡ、１０mＭＭｇＣｌ₂、１mＭＣａＣｌ₂、１０mＭ β−メルカプトエタノール、１mＭフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)、３０μＭペプスタチン、５０μＭロイペプチンおよび１５μＭアプロチニン)１００μl含有１.５ml微小遠心管中のガラス棒で均質化した。不溶性物質を２回の遠心(１３,０００ｇ、１０分)で除去した。上清のタンパク質濃度をＢradford([1976]Ａnal．Ｂiochem．72，248-254)に従い、ウシアルブミンを標準として測定した。等量の可溶性タンパク質を免疫学的研究のためにＳＤＳ −ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫学的技術タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した(Ｌaemmli[1970]Ｎature 227，680-685)。タンパク質の検出のために、免疫ブロッティンを抗血清抗５７(１／１０００希釈)および抗ウサギアルカリホスファターゼ接合第２抗体で行った。ウェスタンブロッティングのために、タンパク質をニトロセルロースフィルターに電気泳動で移し、５％酢酸中の０.５％Ｐoncea u Ｒedで染色し、サンプルの等量充填および移動の成功を確認した。続いてフィルターを５％脱脂粉乳で一晩ブロックし、標準法でプローブおよび染色した。Ｔre６Ｐシンターゼ検定約５００mgの凍結植物材料を秤量し、次いで乳鉢および乳棒で微粉末まで、固体ＣＯ₂上で挽いた。粉末を１mＭＰＭＳＦならびにペプスタチンＡおよびロイペプチンのいずれか１０μg／ml含有１mＭベンズアミジン、２mＭＭｇＣｌ₂、１mＭＥＤＴＡおよび１mＭジチオスレイトール含有５０mＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７.０(ＨＢＭＥＤ)０.７mlに移し、溶かした。得られた均質物を１７,０００ｇで１０分遠心し、上清をＴre６Ｐシンターゼについて、本質的にＬapp et al.([1971]Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．246，4567-4579) に従って検定した。サンプル(１０μl)を、４０mＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７.０、１０mｇＭｇＣｌ₂、１０mＭグルコース６−ホスフェート、５mＭフルクトース６−ホスフェート、５mＭウリジンジホスホグルコース(ＵＤＰＧ )および１mg／mlウシアルブミン含有反応混合物９０μlに添加し、３０℃で必要な時間インキュベートした。トレハロースおよびトレハロース６−ホスフェート以外の糖誘導体(形成されたスクロースを含む)を０.６ＭＨＣｌ５０μlを添加し、１００℃で５分および次いで８％ＮａＯＨ５０μlおよび１００℃で１５分の加熱により破壊した。次いで、残った炭水化物(即ち、トレハロースおよびトレハロース６−ホスフェート)をアンスロン検定(anthrone)(Ｔrevelyan＆Ｈarri son[1956]Ｂiochem．Ｊ．63，23-33)で測定した。トレハロース検定約５００mgの凍結植物材料を素早くガラス管に量り入れる。熱い蒸留水(１ml)を添加し、混合物を２０分沸騰させ、葉材料を平ガラス棒で時折破壊する。液相をパスツールピペットで回収し、固体を水０.５mlで再抽出した。合わせた液相を遠心して透明にした。合わせた固体残渣を一定重量になるまで１０７℃で乾燥させた(葉の乾燥重量は、生重量の平均５.１％である)。上清を、Ｄionexパルス電気化学検出器付きＤionex DX-300液体クロマトグラフィー( ＰＥＤ−２)を使用して分析した。サンプル(２０μl：３つずつ)をＣarbopac PA -１(４×５０mm)プレカラムを経由してＣarbopac PA-1(４×２５０mm)カラムに注入し、水で１ml／分で溶出した。溶出物をポストカラム試薬(０.６ml／分の０ .３ＭＮａＯＨ)と混合した。トレハロースは、約２０分に溶出するグルコースおよびスクロースピークより十分前の約３分に溶出した。実施例１．ats１Ａプロモーター下、酵母ＴＰＳ１遺伝子で形質転換したタバコ植物によるトレハロース生産タバコ形質転換体および対照植物を滅菌インビトロ条件と温室の両方で生育させた。成熟形質転換体は、非形質転換対照またはベクターｐＤＥ１００１(ＴＰＳ１を欠く)で形質転換した対照と比較して、なんら明らかな表現型を持たなかった。葉を０９００時間で集め、分析に先立ち凍結し、−７０℃またはそれ以下で貯蔵した。試験した２６種のカナマイシン耐性形質転換体のうち２０種が、酵母トレハロースシンターゼの精製５６kＤa Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットに対して生じる抗血清でプローブした場合に予想サイズの、検出可能レベルの免疫反応性ポリペプチドを生産することが分かった。実施例は、図２に示している。表１は、葉のトレハロース含量をまとめたものである。これらの結果は、酵母ＴＰＳ１遺伝子が、そのプロモーターをats１Ａプロモーターで置き換えると、タバコ中で効果的に発現することを明らかにするものである。ウェスタンブロットで観察された特定のシグナルは、正確な分子量を有する。最強のシグナル(例えば、インビトロで生育させた形質転換体４由来のもの) は、静止期の酵母から得られたシグナルよりも、ゲルに載せたタンパク質単位当たりで、わずかに弱いだけであった。ＴＰＳ１の発現は、葉組織中にトレハロースが生じることに付随するものであり、そのＨＰＬＣ挙動およびそれが高度に特異的なトレハラーゼにより分解したという事実の両方によって同定した（図３も参照）。様々な形質転換体が、理由はまだ確立されていないが、様々なレベルでＴＰＳ１産物を発現し、(形質転換体８の明らかな例外は除いて)葉中に見いだされたトレハロース量は、ウェスタンにおける５６kＤaシグナルの強度とおおよそ相互関係にあった（図２と表１を比較）。これらの形質転換体は、組換Ｔre６Ｐアーゼをコードする遺伝子を持たなかったが、その植物がトレハロースよりもＴ re６Ｐをより多く蓄積するという証拠はなんら発見されなかった。明らかに、タバコは、Ｔre６Ｐをトレハロースに変換する能力のあるホスファターゼを有し、少なくともこの植物の場合、トレハロース合成経路を導入するのに必要な鍵となる酵素はＴre６Ｐシンターゼであること、および必ずしも最適ではないが、この酵素単独の導入が適切であることを示している。トランスジェニック系列４の５６kＤaＴre６Ｐシンターゼサブユニットの組織分布の測定は、このポリペプチドの実質的な総量は、植物の下部茎を除く全ての緑色部分にあり得るが、根にはないことを示した。この分布は、ats１Ａ遺伝子発現の組織特異性によるものである（De Almeida等［1989］Mol.Gen.Genet.218, 78）。図４も、Ｔre６Ｐシンターゼを発現した組織もトレハロースを含有したことを示す。更に、より少ない量のトレハロースが根にも見られ、トランスジェニックタバコがトレハロースをその合成部位から他の組織へ移送することを示している。この結果は、ats１Ａプロモーター下でＴＰＳ１を発現し、日中、それらの緑色組織にトレハロースを蓄積するタバコ植物は、外観上は自然で正常であることを明らかにしている。キメラＴＰＳ１遺伝子を含有する主要な形質転換体は、槍型葉のような若干の形態学上の変化を有し、頂部優性を低減し、および高さを下げた（図５および６参照）が、変化の殆どが、自家受粉ＴＰＳ１−陽性後代には示されず、これは依然トレハロースを生産した（図６参照）。従って、主たる形質転換体における形態学上の変化は、トレハロース生産の結果というよりもむしろ組織培養の人工産物であるようである。しかしながら、Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットの高レベル生産およびトレハロースの存在は、トランスジェニック植物の正常条件下での生育速度を非形質転換対照と比較して２０ないし５０％減少せしめた。これらの見かけ上正常な表現型のトランスジェニック植物は、ある植物に外来的にトレハロースを加えた場合に報告された毒性とは対照的である（Ve luthambi等［１９８１］上記引用）。これらの結果は、ats１Ａプロモーターの制御下のトレハロース植物内生産は、生育速度を若干減少させることもあるが、タバコにとって毒性がないことを明らかにしている。渇水または寒冷を含む特定の事象により誘発される誘導性プロモーターを用いて、必要なときにトレハロースのみの生産を引き起こすことにより、生育速度の低減を最小化することができる。タンパク質ベースで、表１における最良の形質転換体のトレハロース含量（例えば、形質転換体４の場合＞１６mg／gタンパク質）は、既に、酵母において熱耐性の明確な向上が観察されるレベルの少なくとも２０％である（De Virgili o等［1990］FEBS Letters 273，107-110）。あるＴＰＳ１−形質転換体および対照をＴre６Ｐシンターゼ活性について検定した。表２に示した結果は、２回のゼロおよび１５または３０分アッセイの平均 ±最大範囲である。対照では、Ｔre６Ｐシンターゼ活性は、ゼロ分の場合と違わなかった。形質転換体４では、酸およびアルカリ安定性炭水化物がＵＤＰＧおよびＧlc６Ｐの存在下で蓄積した。この蓄積は、Ｇlc６Ｐを必要とするが、フルクトース６−ホスフェート（Ｆru６Ｐ；このヘキソースホスフェートは、酵母の天然トレハロースシンターゼ複合体を活性化する）を必要とせず、ＵＤＰＧをＡＤＰＧで置き換えると妨げられた（酵母から精製した酵素もＡＤＰＧを使用できない）。蓄積した炭水化物は、おそらくトレハロースか、またはＴre６Ｐであると思われ、なぜなら他の考えられる生成物は加水分解により破壊されているからである。ＨＰＬＣ分析により、それがトレハロースでないことが示された。従って、これらのインビトロアッセイ条件下では、Ｔre６Ｐがトレハロースに変換されるよりも早く、形質転換体４の抽出物によりＴre６Ｐが合成される。このことは、葉におけるトレハロース合成の全体速度がＴre６ＰサブユニットをコードするＴＰＳ２での同時形質転換により増大し得ることを示している。表２で用いた方法により見いだされた酵母抽出物のＴre６Ｐシンターゼ活性は、Londesborough & Vuorio（[1991]J.Gen.Microbiol.137,323-330）に記載のようにＵＤＰの出現を測定することにより見いだされたものと一致した。更に、タバコ植物の抽出物の存在下で測定した酵母抽出物は、阻害されなかった。従って、表２の対照植物に活性がないのは、タバコ抽出物に存在する何等かの要因による干渉が原因ではない。形質転換体４で見られたＴre６Ｐシンターゼ活性は、不安定であった。幾つかの抽出物では、活性は氷で数時間貯蔵中に消失した。しかしながら、ウェスタン分析で見られた特定のバンドは、室温で２４時間貯蔵した抽出物においてその元の強度近くで依然存在した。従って、Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットのコンホーメーションは、タバコ抽出物の貯蔵中に変化するようである。これらの結果は、Ｔre６Ｐシンターゼ活性の増大がタバコをＴＰＳ１および酵母トレハロースシンターゼの１またはそれ以上の他のサブユニットで同時に形質転換し、それによってＴre６Ｐシンターゼサブユニットのコンホーメーション安定性を増大することによって達成されることを示している。実施例２．トランスジェニックArabidopsis thaliana ats１Ａプロモーター下、ＴＰＳ１を含有するA.thaliana植物を上記のタバコ形質転換体と同様の方法で構築した。これらの形質転換したArabidopsis植物もまた外観上は自然かつ正常であり、受精種子を産生した。主たる形質転換体の種子から生育した植物のウェスタン分析は、それらが酵母トレハロースシンターゼの５６kＤaサブユニットを含有することを示した（図１０）。これらの植物がその緑色組織中にトレハロースを蓄積するという予想は、明らかである。実施例３．トレハロース−生産タバコ植物の乾燥耐性トランスジェニックタバコ中で生産されるトレハロースの量がそれらの渇水耐性を高めるのに十分であるかどうかを測定するために、インビトロ増殖させた対照およびトランスジェニック系列由来の分離葉を空気乾燥にかけた(相対湿度ＲＨ２５％)(図５)。対照植物の分離葉が迅速に水分損失して、３時間のストレス後に明らかな褐変兆候を示したのに対し、トレハロース生産植物の葉は、最初に明らかな水分損失の低減を示したものの２４時間まで緑色のままであった。従って、トレハロースの保護効果は、二重のようである：まず、トレハロースを合成するトランスジェニック植物由来の分離葉は、初期に水分保持力を向上するようであった。渇水処理を延長した後のみ、トレハロース生産植物と対照植物との相異が無くなった。第２に、対照の葉は、老化および褐変の明らかな兆候を示した。反対に、トレハロース含有植物由来の葉は、少なくとも２４時間緑色のようであり、渇水状態処理を（数日間）延長した場合に若干の褐変が生じた。トレハロース生産植物と対照植物とは同じ水分含量でさえ明らかな相異があった。従って、トレハロースは、植物組織を脱水作用から保護するのと同様、水分損失速度を低減するようである。褐変は、少なくとも部分的に、還元糖がポリペプチドの遊離のアミノ基と反応して、アミノ酸が茶色を生じる、メイラード反応によるものであり得る。トレハロースは非還元糖としてこの反応に関与せず、他の糖とタンパク質との反応を阻害しさえするのである（Roser & Colaco[1993]New Scientist 1873,24）。摘出葉のトレハロースによる渇水損傷からの保護は、トレハロースが植物個体のレベルでさえ同様の作用を有することを示した。トレハロースが無傷植物の渇水耐性を高めるかどうかを評価するために、インビトロ増殖させた植物個体を空気乾燥（ＲＨ３０％、図６Ａ）にさらした。３ないし４時間以内に、対照植物は、膨圧を失い、しおれた。反対に、トレハロース生産トランスジェニック植物は、空気乾燥を延長した後に膨圧損失の兆候を示しただけであった。１７時間乾燥処理の後、植物を再水和させ、植物の生存を詳細に記録した（図６Ａ）。非形質転換対照植物は、再水和を延長してもなんら回復が認められず、この処理に耐えなかった。反対に、トレハロース生産トランスジェニック系列は、明らかにしぼんでおり、それらの組織水分の殆どを損失していた（残生鮮重量３０％まで低下）が、１７時間の乾燥処理に耐えた。高い渇水生存力は、若い苗においても示された（図６Ｂ）。トランスジェニック系列由来の３週齢の苗を、非形質転換およびベクター形質転換対照苗と共に、空気乾燥（ＲＨ５０％）にさらすと、トレハロース生産植物と対照植物とでは渇水耐性において明確な相異を示した。トランスジェニックトレハロース陽性系列８は、対照植物と比較して、膨圧の損失遅延および脱水ストレスに対する生存力の増大の両方を示した（図６Ｂ）。実施例４．Ｔre６Ｐシンターゼをコードする遺伝子およびＴre６Ｐアーゼまたは調節ポリペプチドをコードする１またはそれ以上の遺伝子での同時形質転換植物によるトレハロース生産当業者は、ats１Ａプロモーターの制御下で酵母遺伝子ＴＰＳ２およびＴＳＬ１のコード配列を含有するベクターを調製でき、General Materials and Method sおよび実施例１に記載の方法により、タバコ、Arabidopsis、および他の植物を形質転換するのにそれらを使用できる。ＴＰＳ１および他の遺伝子、ＴＰＳ２およびＴＳＬ１の１つまたは両方で同時に形質転換させた植物は、個々の形質転換体の交雑、第２の遺伝子での１の形質転換植物の更なる形質転換、または適切なプロモーターと連結した２または３の遺伝子；例えばＴＰＳ１を非構成性ats１Ａプロモーターに連結させて、トレハロース合成についての対照を提供できる、および構成性プロモーターにより作動される他の遺伝子を含有するベクターでの形質転換により、得ることができる。酵母トレハロースシンターゼ複合体の２またはそれ以上のサブユニット、ただし少なくとも１つは５６kＤaサブユニットである、に対する遺伝子の制御化発現の結果、５６kＤaサブユニットが他のサブユニットの存在により安定化されることから、植物の緑色組織におけるトレハロースの蓄積が増大されることが予想される。更に、１０２kＤaのＴre６Ｐアーゼサブユニットの導入は、Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットの安定性が増大する場合に予想されるＴre６Ｐの潜在的な蓄積を低減するので、有益である。この種の構築の場合、ＴＰＳ１コード配列をその他のＴre６Ｐシンターゼ構造遺伝子のコード配列に置き換え、ＴＰＳ２配列を他のＴre６Ｐアーゼ配列に置き換え、更にＴＳＬ１配列を、Ｔre６ＰシンターゼおよびＴre６Ｐアーゼに調節特性または安定性をＴＳＬ１産物が天然酵母トレハロースシンターゼの他のサブユニットにかかる特性を与えるのと同様の方法で与えるポリペプチドをコードする他の遺伝子の配列に置き換えることができるのは明らかである。実施例５．ストレス誘導プロモーターの制御下、Ｔre６Ｐシンターゼの遺伝子での植物の形質転換ＬＴＩ７８（Nordin等［1993］Plant Mol.Biol.21,641-653）およびＲＡＢ１８（Ｌang & Palva［1992］Plant Mol.Biol.20,951-962）などの植物プロモーターは、渇水および寒冷ストレスに応答して誘導されることが知られている。タバコ、Arabidopsisおよび他の植物を、かかるストレス誘導プロモーターの制御下、ＴＰＳ１などのＴre６Ｐシンターゼ遺伝子のコード配列単独で、または簡便な植物プロモーターの制御下、Ｔre６Ｐアーゼまたは調節ポリペプチドまたは両方の遺伝子のコード配列、例えばＴＰＳ２およびＴＳＬ１と共に形質転換することにより、植物組織におけるトレハロースの蓄積を、これらのストレスに応答してのみ生じさせることができる。利点は、トレハロースレベルがある植物のある組織に対して有害な場合もあり、光合成能力の収量低下になることもあり、恐らく植物生育を遅延させることにもなるが、（１）植物が偶然ストレスにさらされたとき（トレハロースによって与えられる、有害作用を克服する保護効果）または（２）後に収穫した植物から抽出されるトレハロースの蓄積をもたらすために植物に故意にストレスを与えたとき、のみにこのトレハロースが蓄積するということである。実施例６．他のＴre６Ｐシンターゼの精製、分析、およびクローニングトレハロースの他の代謝経路があり得る一方で、Cabib & Leloir（1958，上記）に記載のように、主要合成経路がＴre６Ｐを介することは明らかなようである。この経路の鍵となる酵素は、上記に明らかにしたように、一旦Ｔre６Ｐが作られると、多くの細胞がそれを遊離のトレハロースへと脱リン酸化する能力を持つこととなることから、Ｔre６Ｐシンターゼである。したがって、本発明の主要な概念は、Ｔre６Ｐシンターゼ活性を標的植物へ導入することである。この活性が何に由来するかはそれほど重要ではない。我々は、たまたま酵母トレハロースシンターゼ複合体のサブユニットであり、少なくとも２つの他のサブユニットを含有する酵母の酵素を用いた。このような場合では、Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットの最適活性のために、酵母由来の５６kＤa Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットは、一見すればタバコ中で１０２および１２３kＤaサブユニットなしでも効果的に機能しているが、１またはそれ以上の他のサブユニットの存在を必要とし得る場合もありうる。広範囲の様々な有機体において同じ反応を触媒する酵素は、しばしば同族であることがよく知られており、そのため、一旦ファミリーの一員をクローンすれば、他の構成員をクローニングするのは容易である。酵母Ｔre６Ｐシンターゼはクローンされた（Londesborough & Vuorio,[1992]USPA 07/836,021）ので、E.coli由来のＴre６Ｐシンターゼ、およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）由来のタンパク質を含む同族タンパク質のファミリーがあることが明らかになった（McDougall等、[1993]FEMS Mi crobiology Letters 107,25-30）。我々は、その他の有機体も同族Ｔre６Ｐシンターゼを含有するかどうかを試験することに決めた。 Mycobacterium smegmatisは、ヘパリン活性化Ｔre６Ｐシンターゼを含有し、これが部分的に精製されて、Elbeinのグループにより研究された（Liu等[1969]J .Biol.Chem.44,3728-3791；Lapp等［1971］J.Biol.Chem.246,4567-4579；Elbein & Mitchell［1975］Arch.Biochem.Biophys.168,369-377；Pan等［1978］Arch.B iochem.Biophys.186,392-400）。これらの研究者により精製された酵素は、Ｇlc ６ＰおよびＵＤＰＧを基質として、最適ヘパリンの存在下、３７℃で０.８Ｕ／m gタンパク質の比活性を有した（この酵素は、ヌクレオシドジホスホグルコース誘導体のスペクトルを使用できる）。調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約４５および９０kＤaの２つのポリペプチドを含有した。我々は、プロテアーゼ阻害因子および他のタンパク質保護試薬を、使用した緩衝液中に含ませ、非イオン性洗剤、トリトンＸ−１００の存在下での最終クロマトグラフィー工程を加えることにより、先の研究者らの精製法を改良した。我々の最終処理は以下の通りであった：１）M.smegmatis細胞（ルリア（Luria）ブロス中３日間生育させ、凍結貯蔵した、生鮮重量２８g）を１mＭベンズアミジン、２mＭＭgＣl₂、１mＭＥＤＴＡ、１mＭジチオトレイトール、１mＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１０μgペプスタチンＡ／mlを含有する５０mＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７.５、４０mlに溶かし、次いでフレンチ・プレス中で破壊した。ホモジェネートを２８０００gで２０分間遠心分離した。(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄（１００ml毎に３０g）を上清に加えた。沈殿したタンパク質を集め、０.１mＭＥＤＴＡを含有する２０mＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７.５および１mＭＰＭＳＦおよび１０μgペプスタチンＡ／mlを含有する０.２mＭジチオトレイトール（ＨＥＤ緩衝液）に溶解させ、ＨＥＤ緩衝液で一晩透析した。２）透析物をＤＥＡＥ−セルロースの３.４×２５cmカラムにかけると、酵素がＨＥＤ緩衝液１.２Ｌ中０.９ＭＮaＣlまでの直線勾配で２０ml／hで溶出した。ピーク酵素画分（０.２ＭＮaＣl）を集め（３３ml）、０.５mＭＰＭＳＦおよび５μgペプスタチンＡ／mlに適合させた。(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄９.９gの添加によりタンパク質を沈殿させ、５０mＭＮaＣl、０.１mＭＥＤＴＡおよび０.２mＭジチオトレイトールを含有する５０mＭトリス／ＨＣl、ｐＨ７.５（ＴＮＥＤ緩衝液）に溶解した。３）溶解させたタンパク質（３.７ml）を、ＴＮＥＤ緩衝液で平衡化したセファデックスＧ１００の２.８×３４cmに３６ml／hで通した。ピーク酵素画分を素早くＴＮＥＤ緩衝液中ヘパリンセファロースの１.５×８.５cmカラムにかけた。カラムを１００ml中１.０ＭＮaＣlまでの勾配で５ml／hで展開した。酵素が約０. ５ＭＮaＣlで溶出した。４）ヘパリンセファロース溶出物の試料（表３の画分Ｈ３７）をアミンコン・セル中ＰＭ１０膜上のＴＮＥＤ／０.１％（v／v）トリトンＸ１００に移し、次いで、０.１％（v／v）トリトンＸ１００を含有するＴＮＥＤで平衡化したヘパリンセファロースの０.７×８cmのカラムにかけ、同じ緩衝液５０ml中１.０ＭＮa Ｃlまでの勾配で溶出した。１回目のヘパリンセファロース工程後の比活性は、Pan等（1978）により報告されたものよりもずっと高かったが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７）は、これらの画分が純粋ではないことを示した。驚いたことに、約５５kＤaのバンドは、強度が酵素活性と十分に相関した唯一の主たるバンドであった。５５kＤaバンドを削り取り、ゲル中、トリプシンで消化し、トリプシン作用ペプチドをＨＰＬＣにより分離して、（LondesboroughおよびVuorio，1993、上記）記載のように配列決定した。配列は、表４および配列表に示す。二重配列を与えるペプチドピーク２９と３１については、アミノ酸を、表４に示したのと同じ方法で、任意に、配列番号３および４（ピーク２９由来）および配列番号６および７（ピーク３１由来）に与えている。ペプチド１３の最初の９残基は、酵母由来の５６kＤa Ｔre６Ｐシンターゼの残基２５０−２５８（ＶＧＡＦＰＩＧＩＤ；Vuorio等，1993，上記；ＥＭＢＬ受託番号Ｘ６７４９９、参照）と８９％同一である。この約５５kＤaバンドがＴre６Ｐシンターゼを表していることを確認するために、更に精製を試みた。酵素は、ＵＤＰ−グルクロネートアガロースカラムに強く結合していたが、回収できなかった。それ故に、画分Ｈ３７を、０.１％トリトンＸ１００を含有する緩衝液に移し（活性の３分の２はこの移送中に損失した）、トリトンＸ１００の存在下、ヘパリン・セファロースで再クロマトグラフィーにかけた。図８は、シトクロームｃよりも小さい２つのかすかなバンドを除けば、約５５kＤaバンドが活性画分に存在する唯一のクマシーブルー反応性物質であることを示す。明らかに、Pan等（1978;上記）により報告された９０kＤaポリペプチドは、このM.smegmatis由来のＴre６Ｐシンターゼの必須成分ではなく、また必須ポリペプチドのサイズ、約５５kＤaは、これらの研究者らにより報告されたより小さい４５kＤaの成分のサイズよりも顕著に大きい。図９は、このポリペプチドが、酵母トレハロースシンターゼの５６kＤa Ｔre６Ｐシンターゼサブユニットに対して生じた抗血清により認識されるが、免疫前血清によっては認識されないことを示し、M.smegmatisのＴre６Ｐシンターゼが抗原性決定因子を酵母酵素と共有することを示している。比較的粗雑な酵素調製物に存在する他の免疫反応性バンド(図９のレーン５および６参照)の性質は、調査されていない：それらの全てがラージタンパク質荷重による人工産物とは限らないが、関連タンパク質を表している。それにもかかわらず、酵母酵素に対して生じる抗血清を用いて、M. smegmatis遺伝子バンクで形質転換させた宿主細胞から陽性クローンを検出および単離できる。同様に、表４のアミノ酸配列データを用いて、単離した遺伝子の配列をチェックできる。酵母由来の酵素とM.smegmatisとの免疫学的およびアミノ酸配列類似性は、ＴＰＳ１遺伝子から設計したヌクレオチドプローブをうまく用いて、M.smegmatis遺伝子についてスクリーンすることもできることを示す。結論として、M.smegmatis酵素の免疫学的および配列決定研究は、様々な有機体由来のＴre６Ｐシンターゼが一ファミリーの構成員であることを確認するものである。これらの酵素の遺伝子をＴＰＳ１と同様に用いて、トレハロースを合成し、増進したストレス耐性を有するトランスジェニック植物を作ることもできる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年９月９日【補正内容】請求の範囲１．形質転換植物がトレハロース合成の新規能力を有するような、非構造的植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの遺伝子をコードする配列で形質転換した植物。２．植物プロモーターが特異組織である、請求項１の植物。３．植物プロモーターが光活性である、請求項１の植物。４．植物プロモーターが乾燥、高塩分または極端な温度などのストレスにより活性化され得る、請求項１の植物。５．トレハロースー６−ホスフェートシンターゼ遺伝子が微生物からである、請求項１から４のいずれかの植物。６．トレハロースー６−ホスフェートシンターゼ遺伝子が酵母トレハロースの５６ｋＤａをコードする酵母ＴＰＳ１である、請求項５の植物。７．トレハロースー６−ホスファターゼ、または導入されたトレハロースー６− ホスフェートシンターゼまたはトレハロースー６−ホスファターゼと相互作用する調節ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの遺伝子で形質転換した請求項１から６のいずれかの植物。８．トレハロースー６−ホスファターゼをコードする遺伝子が酵母ＴＰＳ２遺伝子であり、調節ポリペプチドをコードする遺伝子が酵母ＴＳＬ１遺伝子である、請求項７の植物。９．植物プロモーターがpats１Ａである、請求項６の植物。１０．用いられた植物プロモーターがＬＴＩ７８またはＲＡＢ１８などのストレス活性である、請求項１から８のいずれかの植物。１１．植物が非形質転換植物よりも一層ストレス耐性である、請求項１から１０のいずれかの植物。１２．トウモロコシ、オート麦、キビ、小麦、米、大麦、モロコシ、アマランス、玉ねぎ、アスパラガスまたはサトウキビなどの単子葉植物である、請求項１から１１のいずれかの植物。１３．アルファルファ、大豆、ペチュニア、綿、サトウダイコン、ヒマワリ、ニンジン、セロリ、キャベツ、キュウリ、胡椒、トマト、ジャガ芋、レンズ豆、アマ、ブロッコリー、タバコ、豆、レタス、アブラナ、コラード、カリフラワー、ホウレンソウ、芽キャベツ、アーティチョーク、エンドウ豆、オクラ、カボチャ、ケール、紅茶またはコーヒーなどの双子葉植物である、請求項１から１１のいずれかの植物。１４．請求項１から１３のいずれかの植物からのトレハロースの産生。１５．請求項１から１３のいずれかの植物から産生された種子。１６．−興味のある植物を少なくとも１つのトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの構造遺伝子で形質転換し、そしてーその遺伝子を、遺伝子の発現に対して時間的、局所的またはストレス誘発の制御を可能にするのに好適なプロモーターの制御下に発現する、工程を含む、植物のトレハロース含量を増加せしめる方法。１７．遺伝子が酵母トレハロースシンターゼの５６ kＤa をコードする酵母遺伝子ＴＰＳ１である請求項１６の方法。１８．トレハロースの合成がトレハロースー６−ホスフェートシンターゼ遺伝子を制御するプロモーターで調節されるように、pats１Ａなどの非構造的プロモーターの制御下にトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの遺伝子で、および適当なプロモーターの制御下にトレハロースー６−ホスファターゼまたはトレハロースシンターゼの調節サブユニットの少なくとも１つの遺伝子で植物を形質転換する、請求項１６または１７の方法。１９．トレハロースー６−ホスファターゼまたは調節サブユニットの遺伝子がそれぞれ、酵母遺伝子ＴＰＳ２またはＴＰＳ１である、請求項１８の方法。２０．トレハロースシンターゼの遺伝子をコードする配列が貯蔵器官で特異的に発現をおこす植物プロモーターと融合している、請求項１６から１９のいずれかの方法。２１．−トランスジェニック植物を産生するために、トレハロースー６−ホスフェートシンターゼの構造的遺伝子で植物を形質転換し（該遺伝子は、遺伝子の発現に対して時間的、局所的またはストレス誘発の制御を可能にするプロモーターの制御下に発現される）、ー植物内でトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの発現を起こす条件下にトランスジェニック植物を栽培し、ー植物組織からトレハロースを抽出する、工程を含むトレハロースを産生する方法。２２．トランスジェニック植物が貯蔵器官内にトレハロースを蓄える、請求項２１の方法。２３．植物がジャガイモ、砂糖ダイコンまたはカブなどの根農作物である、請求項２３の方法。２４．植物が渇水、高塩分または極端な温度に遭遇するまでは、遺伝子の完全な発現が起きないように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、渇水、高塩分または極端な温度から特産の農作植物を保護する方法。２５．植物が低温に遭遇するまでは、遺伝子の完全な発現が起きないように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、開花に対する霜害から食用果実植物を保護する方法。２６．収穫部分が改善水分保持、改善脱水耐容またはその両者を有する植物を提供するように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、緑色食材、摘んだ果物および鑑賞植物を含む収穫した植物の貯蔵性を改善する方法。２７．非形質転換植物に比して改善されたストレス耐容性を有する植物を提供するように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、鑑賞植物の栽培および維持を容易にする方法。２８．植物の食用部分にトレハロースの蓄積がなされるように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、植物の食用部分からつくられたピューレ、ペースト、ゼリーおよびジャムの香りおよび具合を改善する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者メンテュレー，エイナルスウェーデン、エス−750 07ウプサラ、ボックス7010（番地の表示なし）スウェーディッシュ・ユニバーシティ・オブ・アグリカルチュラル・サイエンシーズ、ウプサラ・ジェネティック・センター (72)発明者ウェリン，ビヨルンスウェーデン、エス−756 54ウプサラ、セロベーゲン５コー番 (72)発明者マンダル，アブールスウェーデン、エス−756 54ウプサラ、ディリゲントベーゲン179番 (72)発明者パルバ，エー・タピオスウェーデン、エス−753 10ウプサラ、ドロットニングガータン５番

Claims

【特許請求の範囲】１．形質転換植物がトレハロース合成の新規能力を有するような、非構造的植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの遺伝子をコードする配列で形質転換した植物。２．植物プロモーターが特異組織である、請求項１の植物。３．植物プロモーターが光活性である、請求項１の植物。４．植物プロモーターが乾燥、高塩分または極端な温度などのストレスにより活性化され得る、請求項１の植物。５．トレハロースー６−ホスフェートシンターゼ遺伝子が微生物からである、請求項１から４のいずれかの植物。６．トレハロースー６−ホスフェートシンターゼ遺伝子が酵母トレハロースの５６ｋＤａをコードする酵母ＴＰＳ１である、請求項５の植物。７．トレハロースー６−ホスファターゼ、または導入されたトレハロースー６− ホスフェートシンターゼまたはトレハロースー６−ホスファターゼと相互作用する調節ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの遺伝子で形質転換した請求項１から６のいずれかの植物。８．トレハロースー６−ホスファターゼをコードする遺伝子が酵母ＴＰＳ２遺伝子であり、調節ポリペプチドをコードする遺伝子が酵母ＴＳＬ１遺伝子である、請求項７の植物。９．植物プロモーターがpats１Ａである、請求項６の植物。１０．用いられた植物プロモーターがＬＴＩ７８またはＲＡＢ１８などのストレス活性である、請求項１から８のいずれかの植物。１１．植物が非形質転換植物よりも一層ストレス耐性である、請求項１から１０のいずれかの植物。１２．トウモロコシ、オート麦、キビ、小麦、米、大麦、モロコシ、アマランス、玉ねぎ、アスパラガスまたはサトウキビなどの単子葉植物である、請求項１から１１のいずれかの植物。１３．アルファルファ、大豆、ペチュニア、綿、サトウダイコン、ヒマワリ、ニンジン、セロリ、キャベツ、キュウリ、胡椒、トマト、ジャガ芋、レンズ豆、アマ、ブロッコリー、タバコ、豆、レタス、アブラナ、コラード、カリフラワー、ホウレンソウ、芽キャベツ、アーティチョーク、エンドウ豆、オクラ、カボチャ、ケール、紅茶またはコーヒーなどの双子葉植物である、請求項１から１１のいずれかの植物。１４．請求項１から１３のいずれかの植物からのトレハロースの産生。１５．請求項１から１３のいずれかの植物から産生された種子。１６．−興味のある植物を少なくとも１つのトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの構造遺伝子で形質転換し、そしてーその遺伝子を、遺伝子の発現に対して時間的、局所的またはストレス誘発の制御を可能にするのに好適なプロモーターの制御下に発現する、工程を含む、植物のトレハロース含量を増加せしめる方法。１７．遺伝子が酵母トレハロースシンターゼの５６ kＤa をコードする酵母遺伝子ＴＰＳ１である請求項１６の方法。１８．トレハロースの合成がトレハロースー６−ホスフェートシンターゼ遺伝子を制御するプロモーターで調節されるように、pats１Ａなどの非構造的プロモーターの制御下にトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの遺伝子で、および適当なプロモーターの制御下にトレハロースー６−ホスファターゼまたはトレハロースシンターゼの調節サブユニットの少なくとも１つの遺伝子で植物を形質転換する、請求項１６または１７の方法。１９．トレハロースー６−ホスファターゼまたは調節サブユニットの遺伝子がそれぞれ、酵母遺伝子ＴＰＳ２またはＴＰＳ１である、請求項１８の方法。２０．トレハロースシンターゼの遺伝子をコードする配列が貯蔵器官で特異的に発現をおこす植物プロモーターと融合している、請求項１６から１９のいずれかの方法。２１．−トランスジェニック植物を産生するために、トレハロースー６−ホスフェートシンターゼの構造的遺伝子で植物を形質転換し、ー植物内でトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの発現を起こす条件下にトランスジェニック植物を栽培し、ー植物組織からトレハロースを抽出する、工程を含むトレハロースを産生する方法。２２．遺伝子を、遺伝子の発現に対して時間的、局所的またはストレス誘発の制御を可能にするプロモーターの制御下に発現する、請求項２１の方法。２３．トランスジェニック植物が貯蔵器官内にトレハロースを蓄える、請求項２１の方法。２４．植物がジャガイモ、砂糖ダイコンまたはカブなどの根農作物である、請求項２３の方法。２５．植物が渇水、高塩分または極端な温度に遭遇するまでは、遺伝子の完全な発現が起きないように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、渇水、高塩分または極端な温度から特産の農作植物を保護する方法。２６．植物が低温に遭遇するまでは、遺伝子の完全な発現が起きないように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、開花に対する霜害から食用果実植物を保護する方法。２７．収穫部分が改善水分保持、改善脱水耐容またはその両者を有する植物を提供するように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、緑色食材、摘んだ果物および装飾植物を含む収穫した植物の貯蔵性を改善する方法。２８．非形質転換植物に比して改善されたストレス耐容性を有する植物を提供するように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、鑑賞植物の栽培および維持を容易にする方法。２９．植物の食用部分にトレハロースの蓄積がなされるように、植物プロモーターと融合したトレハロースー６−ホスフェートシンターゼの少なくとも１つの遺伝子をコードする配列で植物を形質転換することを含む、植物の食用部分からつくられたピューレ、ペースト、ゼリーおよびジャムの香りおよび具合を改善する方法。