CZ294909B6

CZ294909B6 - Buňka imunitního systému s tyrosin-proteinkinázovými chimérickými receptory a léčivo

Info

Publication number: CZ294909B6
Application number: CZ19972601A
Authority: CZ
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: The General Hospital Corporation
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-01-24
Publication date: 2005-04-13
Also published as: DE69636053D1; FI973466L; RU2225870C2; FI973466A0; HU225689B1; KR19980702451A; EP0812352A4; AU703125C; EP0812352B1; US20020176851A1; ZA961476B; CA2209301C; CZ260197A3; HUP9800459A3; US6410014B1; KR100454396B1; NZ501340A; WO1996026265A1; JPH11500621A; NZ302090A

Abstract

Buňka imunitního systému, která obsahuje dva chimérické receptory, které způsobí, že buňky specificky rozpoznávají a likvidují infekční agens, buňku infikovanou infekčním agens, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo buňku vzniklou autoimunitním procesem. Chimérický receptor obsahuje extracelulární část, která je schopná specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens a intracelulární část tyrosin-proteinkinázy, která je schopná předat signál terapeutické buňce, aby zlikvidoval cílovou buňku navázanou na receptor nebo cílové infekční agens vázané na receptor. Použití těchto buněk pro výrobu léčiva.ŕ

Description

Buňka imunitního systému s tyrosin-proteinkinázovými chimérickými receptory a léčivo

Oblast techniky

Vynález se týká funkčních tyrosin-proteinkinázových chimér, které jsou schopny přesměrovat funkci imunitního systému. Konkrétněji se vynález týká regulace lymfocytů, makrofágů, zabíječských buněk (natural killer cells) nebo granulocytů tak, že buňky exprimují tyto chiméry, a to jim dává schopnost odpovídat na cíle chimérami rozpoznávané. Vynález se týká také takových funkčních proteinkinázových chimér, které jsou schopny nasměrovat terapeutické buňky tak, aby specificky rozpoznaly a likvidovaly buďto buňky infikované specifickými infekčními agens, infekční agens samotné, nádorovou buňku nebo také buňku vzniklou autoimunitním procesem (autoimunní buňku). Vynález se konkrétně týká tvorby tyrosin-proteinkinázových chimér, schopných nasměrovat cytotoxické T lymfocyty tak, aby specificky rozpoznávaly a lyžovaly buňky, exprimující obalové proteiny HIV. Vynález proto poskytuje novou protinádorovou léčbu, a také léčbu nemocí, jako je AIDS (syndrom získaného deficitu imunity), způsobovaných virem HIV.

Dosavadní stav techniky

Rozpoznání antigenu T buňkou zprostředkované T buněčným receptorem je základem celé řady imunologických jevů. T buňky řídí to, co se nazývá buněčná imunita (buňkami zprostředkovaná imunita). Ta zahrnuje likvidaci cizorodé tkáně nebo infikované buňky buňkami imunitního systému. Existují různé typy T buněk, včetně pomahačských („helper“), a tlumivých („supresor“), které modulují imunitní odpověď, a cytotoxických („Killer“) buněk, které mohou likvidovat abnormální buňky přímo.

T buňka, která rozpoznává antigen, prezentovaný na povrchu jiné buňky a váže se na něj, se tímto aktivuje a začne se množit, a jestliže se jedná o cytotoxickou buňku, navázanou buňku zlikviduje.

Autoimunitní nemoc je charakterizována tím, že se při ní tvoří buď protilátky, které reagují s hostitelskou tkání, nebo efektorové T buňky, které jsou autoreaktivní. V některých případech mohou autoprotilátky vznikat při normální T a B buněčné odpovědi, aktivované cizorodými látkami nebo organismy, které obsahují antigeny zkříženě reagující s podobnými látkami v tělesných tkáních. Příklady klinicky závažných autoprotilátek jsou protilátky proti acetylcholinovým receptorům při myasthenia gravis nebo protilátky, namířené proti DNA, erythrocytům a trombocytům v systémovém lupus erythematodes.

HIV a imunopatogeneze

V roce 1984 bylo prokázáno, že HIV je etiologickou příčinou AIDS. Od té doby prošla definice AIDS mnoha změnami v závislosti na tom, jaká kritéria diagnóza zahrnovala. Avšak přes proměny diagnostických parametrů, jednoduchým společným jmenovatelem AIDS je infekce virem HIV a následný vývoj perzistujících tělesných symptomů a pro AIDS charakteristických onemocnění, jako jsou druhotné infekce, novotvary a neurologická onemocnění (Harrison s Principles of Internal Medicine, 12. vyd., McGraw Hill, 1991).

HIV je lidský retrovirus ze skupiny lentivirů. Čtyři dosud známé lidské retroviry tvoří dvě odlišné skupiny: lidské T lymfotropní (nebo leukemické) retroviry, HTLV-1 a LTLV-2, a lidské viry deficitu imunity, HIV-1 a HIV-2. První skupina jsou transformující viry, zatímco viry druhé skupiny jsou cytopatické.

- 1 CZ 294909 B6

HIV-1 byl identifikován jako nejčastější příčina AIDS na celé světě. Sekvenční homologie mezi HIV-2 a HIV-1 je asi 40 %, přičemž HIV-2 je příbuznější některým členům skupiny virů deficitu imunity opic SIV (Curran et al., Science 329: 1357 - 1359, 1985, Wetss et al., Nátuře 324: 572-575, 1986).

HIV obsahuje kromě genů typických pro retroviry (env, gag a pol) ještě šest dalších genů, které se účastní replikace a dalších biologických aktivit viru. Společným jmenovatelem AIDS je výrazné potlačení imunity, zejména buněčné. Toto potlačení imunity vede k řadě oportunních onemocnění, zejména určitých infekcí a novotvarů.

Za hlavní příčinu nedostatečné imunity při AIDS byl značen kvantitativní a kvalitativní nedostatek subpopulace T-lymfocytů (na thymu závislých), populace lymfocytů T4. Tato populace buněk je fenotypicky definována přítomností povrchové molekuly CD4, o níž je známo, že je buněčný receptorem pro HIV (Dallgleish et al., Nátuře 312: 763, 1984), I když T4 je hlavní typ buněk, které jsou HIV infikovány, v podstatě každá lidská buňka, exprimující molekulu CD4 na svém povrchu, je schopná vázat a být infikována HIV.

Tradičně je T buňkám CD4+ přisouzena role pomahačských/indukujících („helper/inducer“) buněk, neboť poskytují aktivitu signálu pro B buňky, či indukují T lymfocyty nesoucí reciproký markér CD8, ze kterých se také stávají cytotoxické/supresorové buňky (Reinherz and Schlossman, Cell 19: 821-827, 1980, Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42, 1982).

HIV se váže specificky a s vysokou afinitou prostřednictvím vyčnívající skupiny aminokyselin z obalového proteinu (gp 120) na část oblasti VI molekuly CD4, lokalizovanou v blízkosti její N-koncové části. Po navázání viru fúzuje s buněčnou membránou a je intemalizován buňkou. Jakmile je uvnitř buňky, začne pomocí reverzní transkriptázy přepisovat svou genomovou RNA do DNA, která se integruje do buněčné DNA, kde dále existuje po celou dobu života buňky jako „provirus“.

Provirus může zůstat latentní nebo být aktivován k tomu, aby přepisoval mRNA a genomovou RNA, což vede k proteosyntéze, tvorbě nových virionů a k pučení viru buněčnou membránou. Ačkoliv přesný mechanismus, kterým virus způsobuje buněčnou smrt, není znám, má se zato, že je to především masivní pučení viru, vedoucí k rozrušení buněčné membrány a následně k vychýlení osmotické rovnováhy.

V průběhu infekce si hostitelský organismus vyvíjí protilátky proti virovým proteinům včetně hlavních obalových glykoproteinů gpl20 a gp41. Přes tuto látkovou imunitu nemoc pokračuje a vede k letálnímu potlačení imunity, charakterizované četnými oportunními infekcemi, přítomností parazitů, demencí a nakonec smrtí. Selhání schopnosti hostitelových protivirových protilátek zpomalit či zastavit progresi nemoci představuje jeden z nej obtížnějších a alarmujících aspektů infekce a dává také špatné vyhlídky snahám o očkování, založeném na konvenčním přístupu.

Dva důležité faktory hrají roli v účinnosti látkové imunitní odpovědi na viry deficitu imunity. Prvním je to, že stejná jako ostatní RNA viry (a zejména retroviry), viry deficitu imunity odpovídají na hostitelských imunologický doraz vysokou rychlostí mutace. Druhým faktorem je to, že obalový glykoprotein sám je silně glykosylovaná molekula, prezentující pouze několik málo epitopů, schopných vysoce afinitní vazby s protilátkami. Málo antigenní cíl, jakým je virový obal, poskytuje hostiteli jen malou příležitost omezit virovou infekci produkcí specifických protilátek.

Buňky infikované HIV exprimují na svém povrchu glukoprotein gp 120. Tento glykoprotein zprostředkovává fúzi buněk CD4+ podobnou reakcí, kterou virus vstupuje do neinfikované buňky, což vede ke vzniku obřích mnohojademých buněk s krátkou životností. Tvorba takových syncycií je závislá na přímé interakci mezi obalovým glykoproteinem gpl20 a proteinem CD4

-2CZ 294909 B6 (Dalgleish et al., výše. Klatzman et al., Nátuře 312: 763, 1984, Mc Douglal et al., Science 231: 382, 1986, Sodroski et al., Nátuře 322: 470, 1986, Lifson et al., Nátuře 323: 725, 1986, Sodroski et al, Nátuře 321: 412, 1986).

Důkaz, že vazba CD4-gpl20 je zodpovědná za virovou infekcí buněk, nesoucích antigen CD4, zahrnuje zjištění, že mezi gpl20 a CD4 dochází ke vzniku specifického komplexu (McDougal et al. výše). Další badatelé ukázali, že buněčné linie, které byly vůči HIV imunní, se změnily a infikovatelné linie poté, co byly transfekovány cDNA pro lidský antigen CD4 a začaly ho exprimovat. (Maddon et al., Cell 46: 333-348, 1986).

Několika skupinami vědců byly navrženy, a také úspěšně in vitro demonstrovány, terapeutické programy, založené na rozpustném CD4 jako pasivním agens, interferujícím s adsorpcí viru atransmisí přes syncycia (Deen et al., Nátuře 3321: 82-84, 1988, Fisher et al., Nátuře 331: 76-78, 1988, Hussey et al., Nátuře 331: 78-81, 1988, Smith et al., Science 238: 1704-1707, 1987, Traunecker et al., Nátuře 331: 84-86, 1988) a následně byly vyvinuty fúzované proteiny imunoglobuliny s CD4 s prodlouženým biologickým poločasem a mírnou biologickou aktivitou (Capon et al. Nátuře 337: 525-531, 1989, Traunecker et al., Nátuře 339: 68-70, 1989, Bym et al., Nátuře 344: 667-670, 1990, Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol, 9: 347-353, 1990). Ačkoliv konjugáty CD4 imunotoxinu s CD4 nebo fúzované proteiny vykazují potenciální cytotoxicitu pro infikované buňky in vitro (Chaudhary et al., Nátuře 335: 369-372, 1988, Till et al., Science 242: 116-1168, 1988), vzhledem k latenci syndromu deficitu imunity je účinnost jakékoliv jednozásahové terapie při eliminaci viru nepravděpodobná a antigenní schopnost cizorodých fúzovaných proteinů je činí nepoužitelnými pro opakované podávání. Pokusy na opicích infikovaných SIV ukázaly, že rozpustný CD4, pokud se podá zvířeti bez znatelné cytopenie, redukuje titr viru a zlepší myeloidní potenciál měřený in vitro (Watanabe et al., Nátuře 337: 267-270, 1989). Avšak ihned, jakmile bylo léčení přerušeno, virus se znovu objevil, což naznačuje, že ktomu, aby se zabránilo progresivnímu roztoku imunitního systému, by bylo nutné celoživotní podávání přípravku.

Tyrosin-proteinkinázy asociované s receptory na buněčném povrchu

Počátečním požadavkem pro zapojení buněčných efektorových programů v imunitní systému je často rozpoznání shluklých ligandů buňkou. Mezi receptory, přenášející aktivační signál při agregaci, patří také antigenní receptory B a T buněk (DeFranco, Eur, J, Biochem. 210: 381-388, 1992, Weiss, Annu Rev. Genet. 25: 487-510, 1991), členové rodin Fc receptorů IgG a IgE (Fanger et al., Immunol. Today 10: 92-99, 1989, Revetch and Kinet, Annu Rev. Immunol. 9: 457-492, 1991) a řada přídavných receptorů, včetně CD2, CD4, CD8 a CD28 a T buněk (Yokoyama and Shevach, Year Immunol. 4: 110-146, 1989), CD19, CD20, CD21 a CD40 u B buněk (Clark and Ledbetter, Adv. Canc. Res, 52: 81-149, 1989) CD44, CD45 a CD58 u monocytů (Webb et al., Science 249: 1295-1297, 1990). Kromě toho velký počet proteinů spojených s fosfolipidy podporuje buněčnou aktivaci způsobem závislým na antigenním receptoru, když se navázaly na povrch T buněk (Balk and Terhorst, Immunol. Ser. 45: 411-416, 1989, Krocser et al., Nátuře 322: 181-184, 1986, Yeh et al., J, Immunol. 138: 91-97, 1987, Yokoyama and Shevach, Year Immunol. 4: 110-146, 1989).

V současnosti není jasné, jak jednoduchá fyzická událost, jako je agregace, může vést k jasně rozpoznatelnému fyziologickému signálu. Zapojení buněčných efektorových programů, zprostředkované antigenními receptory B a T buněk, a také různými formami receptoru Fc, může být napodobeno navázáním proteinových chimér, nesoucích intracelulámí domény jednotlivých řetězců receptorových komplexů (Irving and Weiss, Cell 64: 891-901, 1991, Kolanus et al., EMBO J. 11: 4861-4868, 1992, Letoumeus and Klausner, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8905-8909, 1991, Letourneur and Klausner, Science 255: 79-82, 1992, Romeo and Seed, Cell 64: 1037-1046, 191, Wegener et al., Cell 68: 83-95, 1992). Minimální efektivní spouštění prvek se zdá vyžadovat fyologeneticky konzervovanou (Reth, Nátuře 338: 383-384, 1989) peptidovou sekvenci, obsahující dva tyrosinové zbytky, oddělené 10 či 11 aminokyselinami a obklopené

-3 CZ 294909 B6 aminokyselinami, vytvářejícími hydrofílní, typicky kyselé prostředí (Romeo et al., Cell 68: 889-897, 1992, Irving et al., J. Exp, Med. 177: 1093-1103, 1993). Shlukování receptorů nesoucích tento prvek spouští aktivační kaskádu, pro kterou je nezbytná tyrosin proteinkinázová (PTK) aktivita, neboť inhibitory PTK blokují jak časné události v aktivaci B a T buněk, jako je např. mobilizace kalcia, tak i pozdější následky uvolnění cytokinů a buněčnou proliferaci (June et al., J. Immunol. 144: 1591-1599, 1990, Lané et al., J. Immunol. 146: 715-722, 1991, Mustelin et al., Science 247: 1548-84-1587, 1990, Stenley et al., J. Immunol. 145: 2189-2198, 1990). Ačkoliv se vzdálenější důsledky aktivace receptorů liší v závislosti na typu buňky, časné události jsou nápadně podobné i buněk odlišných hematopoetických řad. Tak např. rychlé zvýšení aktivity PTK, které lze pozorovat po obsazení antigenních receptorů B buněk (Gold et al., Nátuře 345: 810-813, 1990, Cempbell and Sefton, EMBO J. 9: 2125-2131, 1990), antigenních receptorů T buněk (June et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 87: 7722-7726, 1990, June et al., J. Immunol. 144: 1591-1599, 1990), a vysoce afínitních receptorů IgE (Eiseman and Bolen, Nátuře 355: 78-80, 1992, Li et al., Mol. Cell Biol. 12: 3176-3182, 1992), má u všech zmíněných typů mezi časnými cíli fosforylace gama izoformu fostalidylinositol specifické fosfolipázy C (Carter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2745-2749, 1991, Li et al., Mol. Cell. Biol, 12: 3176-3182, 1992, Park et al., J. Biol. Chem 266: 24237-24240, 1991, Park et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5453-5456, 1991, Secrist et al., J. Biol. Chem. 266: 12135-12139, 1991, Weiss et al., Annu. Rev. Genet. 25: 487-510, 1991), která je přímo aktivovaná fosforylací tyrosinu (Nishibe et al., Science 250: 1253-1256, 1990).

Dosud známé aktivity PTK, asociované s receptory na buněčném povrchu, spadají do dvou tříd: jedna patří k rodině proto-onkogenu Src příbuzných kináz a druhou tvoří kinázy, příbuzné nově charakterizované kináze Syk. Z první třídy je to kináza Fyn, která je asociována s receptory T buněk (Gassmann et al., Eur, J, Immunol. 22: 283-286, 1992, Samelson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 4358-4362, 1990), kinázy Lyn, Fyn, Blk a Lek, které jsou asociovány s receptorem IgM B buněk (Burkhardt et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7410-7414, 1991, Campbell and Sefton, Mol. Cell. Biol. 12: 2315-2321, 1992, Yamashi et al., Science 251: 192-194, 1991), a kinázy Lyn a Yes, asociované s vysokoafínitními receptory IgE (Eiseman and Bolen, Nátuře 355: 78-80, 1992, Hutchcroft et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111, 1992, Hutchcroft et al., J. Biol, Chem. 267: 8613-8619, 1992). Mechanizmus pozorované asociace nebyl dosud detailně objasněn, ale předběžná data ukazují na to, že intracelulární domény řetězců receptorových komplexů mohou fyzicky asociovat s kinázami rodiny Ser (Clark et al., Science 258: 123-126, 1992, Timson Gauen et al., Mol. Cell. Biol. 12: 5438-5446, 1992).

V současnosti však není známo, zda se jedná o asociace přímé nebo nepřímé.

V současné době byly studiem kináz Fyn a Lek v T buňkách získány přesvědčivé důkazy o důležitosti kináz z rodiny Src pro buněčnou aktivaci. Nadměrná exprese („overexpression“) Fyn u transgenní myši vede k fenotypu se zvýšenou odpovědí (hyper-responzivní) na antigen v T buňkách, zatímco nadměrná exprese katalyticky neaktivní formy blokuje proliferaci T buněk, zprostředkovanou receptory (Cooke et al., Cell 65: 281-291, 1991). T buňky izolované zthymu mutované myši bez Fyn kinázové aktivity vykazují zřetelně nedostatečnou proliferační odpověď při ošetření kombinací forboesteru s protilátkou anti-CD3 nebo konkavalinem A (Appleby et al., Cell 70: 751-763, 1992, Stein et al., Cell 70: 741-750, 1992). Buňky izolované ze sleziny takové myši vykazují sice mírnější, ale podstatné oslabení v aktivační odpovědi (Appleby et al., Cell 70: 751-763, 1992, Stein et al., Cell 70: 741-750, 1992).

V T buňkách kináza Lek asociuje nepřímo s TCR prostřednictvím receptorů CD4 a CD8 (Rudd et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5190-5194, 1988, Shaw et al., Cell 59: 627-636, 1989, Turner et al., Cell 60: 755-765, 1990, Veillette et al., Cell 55: 301-308, 1988). Nadměrná exprese Lek v buňkách, normálně odpovídajících na antigen, zvyšuje citlivost receptorů podobným způsobem, jako lze pozorovat sFyn (Abraham and Veillette, Mol. Cell Biol, 10: 5197— 5206, 1990, Davidson et al., J. Exp, Med. 175: 1483-1492, 1982, Luo and Sefton, Mol. Cell. Biol. 12: 4724-4732, 1992). U hybridomu myších buněk závislých na CD4 bylo možné obnovit

-4CZ 294909 B6 antigen-specifíckou pomahačskou funkci pouze pomocí molekul CD4, které byly schopny reagovat s Lek (Glaichenhaus et al., Cell 64: 511-520, 1991).

Avšak nejsilnější důkaz pro přímou účast kinázy Lek v signální cestě, zprostředkované antigenním receptorem, pochází ze studia mutantních buněčných linií, které plně postrádají Lek. Byly zkoumány dvě takové linie, jedna pocházející z linie lidských leukemických T buněk Jurkat (Goldsmith and Weiss, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 6879-6883, 1987, Strauss and Weiss, Cell 70: 585-593, 1992) a druhá z klonu CTLL-2 myších cytotoxických T buněk (Kamitz et al., Mol, Cell. Biol, 12: 4521—4530, 1992). Obě buněčné linie, postrádající Lek, jsou defektní v signální cestě, zprostředkované TCR, přičemž kompementace obou linií transfekci plazmidem, který exprimuje Lek, obnovuje schopnost odpovídat na podněty, které vedou k obsazení TCR (Karnitz et al., Mol. Cell. Biol. 12: 4521-4530, 1992, Strauss and Weiss, Cell. 70: 585-593, 1992).

V nedávné době se prokázalo, že členové nové rodiny tyrosinových kináz, původně reprezentované blízce příbuznými nebo dokonce totožnými s kinázou Syk (Taniguchi et alk. J. Biol. Chem, 266: 15790-15796, 1991) a PTK 72 (Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 261: 15637-15643, 1986, Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 263: 19195-19202, 1988), jsou asociovány s receptory na buněčném povrchu. Ačkoliv nebylo dosud s konečnou platností prokázáno, zda PTK 72 a Syk jsou totožné, sdílejí shodnou tkáňovou distribuci (thymus a slezina), molekulovou hmotnost a proteolytickou labilitu. PTK 72 je asociována s receptorem IgM u B buněk (Hutchcroft et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111, 1992, Hutchcroft et al., J. Biol. Chem. 267: 8613— 8619, 1992) a je fosforylována po navázání anti-IgM na receptor (Hutchcroft et al., J, Biol. Chem. 266: 14846-14849, 1991). Původní aktivace enzymu, měřená buď jako autofosforylace nebo fosforylace exogenního proteinového fragmentu, byla prokázána jako důsledek obsazení vazby povrchového IgM (Hutchcroft et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111, 1992, Hutchcroft et al., J. Biol. Chem, 267: 8613-8619, 1991). PTK 72 je asociována s vysokoafinitním receptorem IgE u buněčné linie buněk krysí basofílní leukémie (Hutchrofit et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111, 1992, Hutchrofit et al., J, Biol. Chem. 267: 8613-8619, 1992).

Druhý člen rodiny Syk, ZAP-70, je PTK, která asociuje s řetězcem zeta T buněčného receptoru (TCR) po obsazení receptoru (Chán et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 9166-9170, 1991). I přes expresi ZAP-70 v buňkách COS vede Fyn nebo Lek k mírnému zvýšení celkového buněčného tyrosinfosfátu, společná exprese ZAP-70 s buď Lek nebo Fyn vede k dramatickému zvýšení čisté fosforylace tyrosinu (Chán et al., Cell. 71: 649-662, 1992). Pokud je také přítomen chimérický řetězec CD8, je chiméra fosforylována a ZAP-70 s ní asociuje (Chán et al., Cell 71: 649-662, 1992). Zatím není jasné, zda ZAP-70 aktivuje kinázy rodiny Ser a/nebo je to naopak, ani proč by měla společná exprese kináz vést ke zjevné konstituční aktivaci. Avšak aktivní asociace ZAP-70 s obsazeným TCR vede k domněnce, že PTK hraje roli v předávání odpovědi receptoru.

Na rozdíl od kináz z rodiny Src, nesou Syk a ZAP-70 dvě SH2 domény a žádné myristylované místo na N-koncové části (Taniguchi et al., J. Biol. Chem. 266: 15790-15796, 1991, Chán et al., Cell 71: 649-662, 1992). Přirozeně by se očekávalo, že mechanizmus asociace kinázy a receptoru je takový, že dvě SH2 domény, jakmile jsou fosforylovány, vážou dvě molekuly tyrosinu ze spouštěcího motivu antigenního receptoru. Avšak to je zatím spíše hypotéza.

Standardní referenční práce, představující obecné principy molekulární biologie, zahrnují práce: Watson et al., Molecular Biology of the Gene, díly I a II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, lne., vydavatel, Menlo Park; CA, 1987, Damell et al., Molecular Cell Biology, Scientific Američan Books, lne., vydavatel, New York, N.Y., 1986, Lewin, Genes II, John Wiley and Sons, vydavatelé, New York, N.Y., 1985, Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engeneering, 2. vydání, Univerzity of California Press, vydavatel, Berkeley, CA, 1981, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold

-5 CZ 294909 B6

Spring Harbor Laboratory, vydavatel, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N.Y., 1989.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je buňka imunitního systému, která obsahuje první proteinový chimérický receptor navázaný na membránu, obsahující a) intracelulární část tyrosin-proteinkinázy z rodiny kináz Syk, která je schopna předat buňce imunitního systému signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo cílového infekčního agens vázaného na receptor, a b) extracelulární část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, a druhý proteinový chimérický receptor navázaný na membránu, obsahující a) extracelulární část, která je schopna specifické vazby na cílovou buňku nebo cílové infekční agens, a b) intracelulární část, odvozenou od CD28, čímž je každá z těchto buněk imunitního systému schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens a kde první a druhý chimérický receptor jsou exprimovány těmito buňkami imunitního systému, a použití této buňky pro výrobu léčiva proti HIV.

Předkládaný vynález ukazuje, že je možné vytvořit chiméry, spojující intracelulární doménu molekuly tyrosin-proteinkinázy a extracelulární doménu, která je schopna plnit úkol rozpoznávání cíle. Konkrétně shlukování chimér, nesoucích kinázové sekvence ze Syk nebo ZAP-70, spouští mobilizaci kalcia. Agregace samotné chiméry Syk, nebo společná agregace chimér nesoucích kinázy Fyn nebo Lek a ZAP-70, je dostatečná pro spuštění cytolytické efektorové funkce. Taková efektorová funkce umožňuje specifické rozpoznání a likvidaci nežádoucích cílových buněk, např. patogenů, patogenem infikovaných buněk, nádorových buněk nebo autoimunních buněk.

Na základě tohoto vynálezu může být zkonstruován jakýkoliv počet užitečných chimérických molekul. Např. chiméry, vytvořené složením intracelulární části tyrosin-proteinkinázy s extracelulární částí vhodně upravené molekuly protilátky, umožňují specificky přesměrovat rozpoznávací potenciál buněk imunitního systému k antigenů, rozpoznávanému extracelulární částí protilátky. Takže s částí protilátky, schopnou rozpoznat některé determinanty na povrchu patogenu, by buňky imunitního systému, vybavené chimérou, odpověděly na přítomnost patogenu efektorovým programem vlastním dané linii, tzn. pomahačské T lymfocyty by odpověděly cytotoxickou aktivitou proti cíli a B lymfocyty by aktivovaly syntézu protilátek. Makrofágy a granulocyty by spustily své efektorové programy, zahrnující uvolnění cytokinů, fagocytózu a reaktivní produkty kyslíku. Podobně by tomu bylo s částí protilátky, rozpoznávající nádorové buňky, byla by příznivě stimulována odpověď imunitního systému na nádor. S protilátkou schopnou rozpoznat buňky imunitního systému, které nevhodně reagují s vlastními determinantami, by bylo možné selektivně cíleně zlikvidovat autoreaktivní buňky.

Ačkoliv tyto příklady upozorňují na užití protilátkových chimér jako vhodného expozičního nástroje, vynález se neomezuje pouze na protilátkové chiméry a skutečně, využití specifických neproti látkových extracelulárních domén má důležité výhody. Tak např. s extracelulární částí, která je receptorem pro virus, bakterii nebo parazita, bude buňka vybavená chimérou specificky zacílena proti buňkám, které exprimují determinant viru, bakterie nebo parazita. Výhoda tohoto přístupu ve srovnání s použitím protilátek je ta, že nativní receptor pro patogen má výjimečně vysokou selektivitu a afinitu pro patogen, a tím umožňuje vyšší stupeň přesnosti výsledné imunitní odpovědi. Podobně, je-li třeba zlikvidovat buňky imunitního systému, které nevhodně reagují s vlastními antigeny, stačí připojit antigen (buď jako intaktní protein v případě depleční léčby B buněk, nebo v podobě komplexu MHC v případě depleční léčby T buněk) (MHC - major histocompatibility complex - hlavní histokompatibilní systém) k intracelulámímu řetězci tyrosin-proteinkinázy, a tím ovlivnit specifické cílení buněk nepatřičně odpovídajících na vlastní determinanty.

-6CZ 294909 B6

Dalším využitím chimér je řízení buněčných populací in vivo, následující po nějakém jiném genově manipulujícím zásahu. Tak např. bylo navrženo užití lymfocytů infiltrujících nádory nebo zabíječských (natural killer) buněk k tomu, aby zprostředkovaly cytotoxický účinek až v místě nádorů. Předkládaný vynález poskytuje pohodlný prostředek k regulaci počtu a aktivity takových lymfocytů a buněk, aniž by musely být odstraněny z těla pacienta a pomnoženy in vitro. Jelikož intracelulární domény chimérických receptorů zprostředkovávají proliferační odpověď buněk, koordinace extracelulárních domén řadou různých agregujících stimulů, specifických pro extracelulární domény (např. protilátka specifická pro extracelulámí doménu), povede k proliferaci buněk, nesoucích chimérické molekuly.

Ačkoliv specifické ztělesnění předkládaného vynálezu zahrnuje chiméry, obsahující Syk nebo tyrosin-proteinkinázy rodiny Syk a Src, pro účel zde popsaný se může použít jakákoliv tyrosinkináza s podobnou funkcí jako tyto molekuly. K význačným rysům žádoucích spouštěcích molekul buněk imunitního systému patří autonomní exprese, schopnost fúze s extracelulámí doménou (přímo nebo nepřímo prostřednictvím transmembránové domény), takže výsledná chiméra je přítomna na povrchu terapeutické buňky, a schopnost spouštět buněčné efektorové programy při agregaci po setkání s cílovým ligandem.

V současnosti je nej pohodlnější metodou, jak dopravit chimérické molekuly do buněk imunitního systému, nějaká forma genové terapie. Avšak reorganizace buněk imunitního systému s chimérickými receptory smícháním buněk s vhodně solubilizovaným a přečištěným chimérickým proteinem by také vedla ke vzniku populace zmanipulovaných buněk schopných odpovědi na cíle, rozpoznávané extracelulámí doménou chimér. Podobné přístupy byly využity např. pro zavedení intaktních receptorů CD4 pro HIV do erytrocytů pro terapeutické účely. V tomto případě by populace zmanipulovaných buněk nebyla schopna se sama obnovovat.

Předkládaný vynález se týká funkčních zjednodušených tyrosin-proteinkinázových chimér, které jsou schopny přesměrovat funkci imunitního systému. Zvláště se pak týká regulace lymfocytů, makrofágů, zabíječských (natural killer) buněk nebo granulocytů expresí chiméry, která způsobí, že buňka reaguje na cíl chimérami rozpoznávaný. Vynález se také týká způsobu, jak nasměrovat buněčnou odpověď na infekční agens, nádorovou nebo rakovinnou buňku a nebo autoimunní buňku. Způsob nasměrování imunitní odpovědi u savců spočívá v tom, že se příslušnému savci podá účinné množství terapeutických buněk, přičemž terapeutické buňky jsou schopny rozpoznat a likvidovat infekční agens, nádorovou, rakovinnou nebo autoimunní buňku. Buněčná odpověď je zprostředkována jedinou chimérou neboje výsledkem spolupráce více chimér (např. sada dvou nebo více chimér, z nichž jedna obsahuje intracelulární doménu z CD28).

V jiném ztělesnění je způsob směrování buněčné odpovědi na infekční agens založen na podání terapeutických buněk, schopných rozpoznat a likvidovat infekční agens, přičemž infekčním agens je určitý virus, bakterie, prvok nebo houba. Specifičtěji je způsob zaměřen proti takovým agens, jako je HIV a Pneumocystis carinii.

Zasáhnout proti infekci HIV znamená podat pacientovi účinné množství cytotoxických T lymfocytů, exprimujících chimérický receptor, lymfocyty jsou pak schopny specificky rozpoznávat a lyžovat buňky infikované HIV stejně tak, jako volně cirkulující virus.

Takže jedním ztělesněním vynálezu je způsob nasměrování buněčné odpovědi proti buňkám infikovaným HIV, což znamená podat pacientovi účinné množství cytotoxických T lymfocytů, schopných specificky rozpoznat a lyžovat buňky infikované HIV.

Další ztělesnění vynálezu poskytuje chimérické receptorové proteiny, které nasměrují cytotoxické T lymfocyty tak, že rozpoznají a lyžují buňky infikované HIV. Dalším ztělesněním vynálezu jsou tedy hostitelské buňky transformované vektorem, který obsahuje chimérické receptory.

-7CZ 294909 B6

Mnoho různých způsobů konstrukce a exprese chimérických imunitních receptorů, stejně jako řada možností jejich terapeutického využití, je detailně vysvětleno ve WO 92/15322, který je zde zahrnutý v odkazu.

Tato a neomezený počet dalších ztělesnění vynálezu budou odborníkovi zřejmá na základě následujícího podrobného popisu vynálezu.

V následujícím podrobném popisu vynálezu budeme často odkazovat na základní metody, obecně známé odborníkům v oborech molekulární biologie a imunologie. Publikace a další materiál, představující takový známý materiál, na který odkazujeme, jsou plně citovány v následujícím odstavci.

Pod pojmem „klonování“ se v následujícím textu rozumí užití technik rekombinace DNA in vitro ke vložení genu nebo určité sekvence DNA do molekuly vektoru. Aby bylo možné úspěšně klonovat požadovaný gen, je třeba využít metod, které umožní vytvořit fragmenty DNA, spojovat fragmenty DNA do vektorové molekuly, zavést složenou molekulu DNA do hostitelské buňky, ve které se může replikovat a selekci klonu hostitelských buněk, který obsahuje cílový gen.

„cDNA“ znamená komplementární DNA neboli DNA zkopírovanou podle RNA předlohy RNA-dependentní DNA polymerázovou (reverzní transkriptázou). Takže „cDNA klon“ znamená dvoj řetězcovou sekvenci DNA, komplementární k molekule RNA, která je vnesena do klonovacího vektoru.

„Knihovna cDNA“ označuje soubor rekombinantních molekul DNA, obsahujících vložené úseky cDNA, které jsou kopiemi mRNA, exprimované buňkou v okamžiku přípravy knihovny. Taková knihovna se dá připravit způsoby, které jsou odborníkům známy a jsou popsány např. v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, výše. Obecně řečeno, RNA je nejdříve izolována z buněk organizmu, z jehož genomu chceme požadovaný gen získat. V tomto vynálezu jsou výhodným zdrojem genů buněčné linie savčích, nejvýhodněji pak lidských lymfocytů. Preferovaným vektorem je pak virus vakcínie kmen WR.

„Vektor“ znamená molekulu DNA, odvozenou např. z plazmidů, bakteriofága nebo savčího či hmyzího viru, do kterého může být vložen neboli klonován fragment DNA. Vektor obsahuje jedno nebo více jedinečných restrikčních míst a je schopen autonomní replikace v určitém hostitelském organizmu, takže klonovaná sekvence je reprodukovatelná. Čili „DNA expresní vektor“ znamená jakýkoliv autonomní element, který je schopen řídit syntézu rekombinantního peptidu. Takové expresní vektory zahrnují bakteriální plazmidy, fágy a také savčí a hmyzí plazmidy a viry.

Látkou „v podstatě čistou“ rozumíme sloučeninu, např. protein, polypeptid nebo protilátku, která jev podstatě bez přítomnosti všech látek, které ji přirozeně doprovázejí. Obecně látka jev podstatě čistá, pokud alespoň 60 %, výhodněji nejméně 75 % a nejvýhodněji nejméně 90 % z celkové hmotnosti vzorku tvoří požadovaná sloučenina. Čistotu lze měřit příslušnou vhodnou metodou, např. užitím sloupcové chromatografie, elektroforézou v polyakrylamidovém gelu nebo analýzou na HPLC. V souvislosti se sekvencemi nukleových kyselin znamená „v podstatě čistý“ sekvenci, fragment nebo segment nukleové kyseliny, který bezprostředně nesousedí (tj. není kovalentně vázán) škodujícími sekvencemi, které mu bezprostředně předcházejí nebo následují (tj. jedna na 5' konci a druhá na 3' konci) v přirozené podobě genomu toho organizmu, z něhož je DNA, použitá ve vynálezu, odvozena.

Pojem „funkční derivát“ označuje „fragmenty“, „varianty“, „analogy“ a „chemické deriváty“ molekul. „Fragment“ molekuly, jako např. kterékoliv sekvence cDNA v předkládaném vynálezu, označuje jakýkoliv oligonukleotid nebo polynukleotid obsažený v původní molekule. „Variantou“ takové molekuly se rozumí přirozeně existující molekula, která se v zásadě podobá buďto celé nebo části původní molekuly. O molekule se říká, že je „v podstatě podobná“ jiné molekule,

-8CZ 294909 B6 pokud sekvence aminokyselin obou molekul je v podstatě podobná. „V podstatě podobná“ sekvence aminokyselin je taková, která vykazuje alespoň 50%, výhodně 85% a nejvýhodněji 95% identitu se sekvencí přirozené nebo referenční molekuly a/nebo se od této přirozené nebo referenční sekvence liší pouze konzervativními substitucemi aminokyselin. V podstatě podobné aminokyselinové molekuly vykazují také podobné biologické aktivity. Tak za předpokladu, že dvě molekuly mají podobné aktivity, jsou pak považovány za varianty ve smyslu zde užívaném i tehdy, jestliže jedna z molekul obsahuje méně nebo naopak více aminokyselinových zbytků, které v druhé molekule neexistují, nebo když sekvence aminokyselinových zbytků nejsou identické. Ve smyslu zde užívaném je molekula „chemickým derivátem“ jiné molekuly, pokud obsahuje další chemické skupiny, které normálně nejsou součástí původní molekuly. Takové skupiny mohou zlepšit rozpustnost, absorpci, biologický poločas atd. původní molekuly. Případně tyto skupiny mohou snížit toxicitu molekuly, eliminovat či případně změnit nějaký nežádoucí vliv molekuly a pod. Skupiny s takovýmto vlivem jsou uvedeny např. v publikaci Remingtoďs Pharmaceutical Sciences, 16. vyd., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).

Podobně tedy „funkčním derivátem“ genu receptorové chiméry v předkládaném vynálezu jsou myšleny „fragmenty“, „varianty“ nebo „analogy“ genu, které mají „podstatně podobnou“ nukleotidovou sekvenci a které kódují molekulu s podobnou aktivitou jako chiméra tyrosin-proteinkinázy. „V podstatě podobné“ nukleové kyseliny kódují podstatně podobné sekvence aminokyselin (jak je definováno výše), a také zahrnují jakékoliv sekvence nukleových kyselin, schopné za vhodných podmínek hybridizace s přirozenou nebo referenční sekvencí (vhodné hybridizační podmínky jsou uvedeny např. v Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N.Y., 1989).

Takže ve smyslu zde užívaném tyrosin-proteinkinázovou chimérou jsou myšleny jakékoliv funkční deriváty, fragmenty, varianty, analogy nebo chemické deriváty, které jsou „v podstatě podobné chiméře „divokého typu“ a které vykazují podobnou aktivitu (tj. nej výhodněji 90 %, výhodněji 70 %, výhodně 40 % nebo alespoň 10 % aktivity receptorové chiméry divokého typu). Aktivita funkčních derivátů chimérických receptorů zahrnuje specifické navázání cílového agens (na extracelulární část receptorů) nebo buňky a následnou destrukci (řízenou intracelulární částí receptorů) tohoto agens nebo buňky a může být ověřena, např. některým testem zde popsaným.

Sekvence DNA kódující chiméru v předkládaném vynálezu, nebo její funkční deriváty, může být rekombinována s vektorovou DNA pomocí běžných technik, pomocí slepých nebo ostrých konců pro ligaci, digescí restrikčními enzymy, aby vznikly vhodné konce, vhodným doplněním kohezivních konců ošetřením alkalickou fosfatázou, aby nedocházelo k nežádoucím spojením, a nakonec ligací vhodnou ligázou. Techniky pro takové manipulace jsou popsány v Maniatis et alk. výše, a odborníkům jsou dobře známy.

Molekula nukleové kyseliny, jako DNA, je označována za „schopnou exprese“ polypeptidu, jestliže obsahuje nukleotidová sekvence, obsahující informace, nutné pro transkripci a regulaci translace, přičemž takové sekvence jsou „operativně“ spojeny s nukleotidovými sekvencemi, které kódují polypeptid. Operativní spojení je takové spojení, při kterém regulační sekvence DNA a sekvence, které se mají exprimovat, jsou spojeny tak, že to dovoluje expresi genu. Přesná povaha regulačních oblastí nutných k expresi genu se mění od organizmu k organizmu, ale zcela obecně vždy bude obsahovat promotorovou oblast, která se u prokaryot skládá jak z vlastního promotoru (který řídí iniciaci transkripce RNA), tak z dalších sekvencí DNA, která po přepsání do RNA iniciují syntézu proteinu. Za normálních okolností takové sekvence budou zahrnovat ty nekódující sekvence 5' konce, zapojené v transkripci a translaci, jako je např. TATA box, sekvence, která zajišťuje opatření čepičkou, sekvence CAAT a podobně.

Pokud je třeba, je možné získat nekódující oblast sousedící se 3' koncem sekvence genu pro protein výše popsanými metodami. Tato oblast může být ponechána pro své sekvence, regulující terminaci transkripce, jako je např. terminace a polyadenylace. Tak ponechání oblasti 3' konce přirozeně sousedícího se sekvencí DNA kódující protein poskytne terminační signály. Jestliže

-9CZ 294909 B6 signály pro terminaci transkripce nejsou uspokojivě funkční v exprimující hostitelské buňce, může být 3' oblast nahrazena takovou, která je v hostitelské buňce funkční.

Dvě sekvence DNA (jako např. sekvence promotoru a sekvence kódující chiméru tyrosinproteinkinázy) jsou operativně spojeny, jestliže spojení dvou sekvencí 1) nevede k mutaci posunem čtecího rámce, 2) nenarušuje funkci promotoru v řízení transkripce genu pro receptorovou chiméru, 3) nenarušuje transkripci sekvence pro receptorovou chiméru z promotoru. Promotorova sekvence byla operativně spojena se sekvencí DNA, jestliže promotor je schopen ovlivnit transkripci připojené DNA. Pro expresi proteinu jsou tedy nezbytné transkripční a translační signály, které vhodné hostitelská buňka rozpoznává.

Předkládaný vynález zahrnuje expresi chimérického proteinu s vlastnostmi tyrosin-proteinkinázy (nebo jejího funkčního derivátu) buď v prokaryotické nebo eukaryotické buňce, ačkoliv eukaryotická (a zvláště lidský lymfocyt) je nejvýhodnější.

Protilátky dle předkládaného vynálezu je možno připravit některou z mnoha různých metod. Například buňky, exprimující chimérický receptorový protein nebo jeho funkční derivát, mohou být podány zvířeti, aby vyvolaly produkci séra, obsahujícího polyklonální protilátky, které jsou schopny vázat chiméry. Výhodně jsou protilátky podle předkládaného vynálezu monoklonální protilátky. Takové monoklonální protilátky mohou být připraveny užitím hybridomové technologie (Kohler et al., Nátuře 256:495. 1975, Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511. 1976, Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292, 1976, Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., ss. 563-684, 1981). Obecně takové postupy zahrnují imunizaci zvířete chimérickým antigenem. Splenocyty takového zvířete jsou extrahovány a fúzovány s vhodnou myelomovou buněčnou linií. Může být použita jakákoliv vhodná myelomová buněčná linie v souladu s předkládaným vynálezem. Po fúzi jsou vzniklé hybridomové buňky selektivně udržovány v médiu HAT a pak klonovány konečným ředěním, jak je popsáno ve Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981). Hybridomové buňky, získané touto selekcí, jsou poté testovány, aby se našly klony, secernující protilátky, schopné vazby s chimérou.

Protilátky předkládaného vynálezu mohou být také polyklonální nebo výhodně polyklonální protilátky, namířené proti specifické oblasti.

Protilátky proti chiméře podle předkládaného vynálezu se mohou užít k monitorování množství chimérického receptoru (nebo buněk nesoucích chimérický receptor) u pacienta. Takové protilátky jsou dobře uzpůsobeny k tomu, aby se daly využít ve standardních imunologických testech v oboru známých, včetně imunometrických nebo sendvičových testů, jako například „forward sandwich“, „reverse sandwich“ a „simultaneous sandwich“. Protilátky se mohou použít v libovolném počtu kombinací, jak mohou odborníci určit, aniž by zbytečně experimentovali a ovlivňovali specifičnost, citlivost a přesnost imunotestů.

Standardní referenční práce, vysvětlující obecné principy imunologie, zahrnují: Roitt, Essential Immunology, 6. vydání, Blackwell Scientifíc publications, vydavatel, Oxford, 1988, Kimball, Introduction to Immunology, 2. vyd., Macmillan Publishing Co., vydavatel, New York, 1986, Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., vydavatel, London, 1985, Campbell, „Monoclonal Antibody Technology“, v Burdon et al., editor, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, díl 13, Elsevier, vydavatel, Amsterdam, 1984, Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, vydavatel, New York, 1982 a Kennett et al., editor, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenům Press, vydavatel, New York, 1980.

„Detekcí“ se rozumí stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti určité látky nebo kvantifikace množství látky. Termín se tak vztahuje k použití látek, sloučenin a způsobů kvalitativního a kvantitativního stanovení v předkládaném vynálezu.

-10CZ 294909 B6

Izolace dalších hybridomů, secernujících monoklonální protilátky se stejnou specifičností jako protilátky popsané zde, může být provedena technikou antiidiotypového typování (Potocmjak etal., Science 215: 1637, 1982). Stručně, antiidiotypová protilátka je protilátka, rozpoznávající jedinečné determinanty protilátky, produkované zkoumaným klonem. Anti-idiotypová protilátka 5 se připraví imunizací zkoumanou monoklonální protilátkou zvířete stejného kmene, který byl užit jako zdroj monoklonálních protilátek. Imunizované zvíře rozpozná, a tedy odpoví, na idiotypové determinanty imunizující protilátky tím, že bude produkovat protilátky k těmto idiotypovým determinantám (anti-idiotypové protilátky).

Hybridní buňky mohou být pro replikaci kultivovány jak in vitro, tak in vivo. Kultivace in vivo je preferovaným způsobem, neboť dosahuje vysoké produkce. Stručně, buňky jednotlivého hybridního kmene se injikují intraperitoneálně do myší kmene Balb/c, stimulovaných Přistáném, což vede ke vzniku ascitu, obsahujícího vysokou koncentraci požadovaných monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky izotypu IgM nebo IgG se mohou čistit ze supematantu užitím 15 sloupcové chromatografíe, odborníkům dobře známé.

Protilátky předkládaného vynálezu jsou zvláště vhodné k užití v imunotestech, kde mohou být užity v kapalné fázi, nebo navázány na pevný nosič. Navíc mohou být protilátky v těchto imunotestech označeny různými způsoby pro detekci.

V oboru je známo mnoho různých značek a způsobů značení. Příklady druhů značek, které mohou být užity v předkládaném vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny pouze na ně, enzymy, radioizotopy, fluorescenční sloučeniny, chemiluminiscenční sloučeniny, bioluminiscenční sloučeniny a cheláty kovů. Odborníci budou běžně znát další značky vhodné k navázání na protilátky 25 nebo budou schopni dosáhnout téhož užitím rutinních experimentů. Kromě toho navázání takových značek k protilátkám může být dosaženo standardními technikami, jež jsou odborníkům všeobecně známé.

Jedna z cest, jak mohou být protilátky předkládaného vynálezu označeny pro detekci, je navázání 30 protilátky k enzymu. Tento enzym, je-li později zásoben substrátem, bude s ním reagovat takovým způsobem, že se tvoří chemická látka, detekovatelná například spektrofotometricky nebo fluorometricky. Příklady enzymů, které mohou být použity k označení protilátek pro detekci, zahrnují enzymy jako malátdehydrogenáza, stafylokoková nukleáza, delta-V-steroidní izomeráza, kvasničná alkoholdehydrogenáza, alfa-glycerol-fosfát dehydrogenáza, triozofosfát35 izomeráza, biotinavidinperoxidáza, křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, asparagináza, glukózooxidáza, beta-galaktosidáza, ribonukleáza, ureáza, kataláza, glukózo-6-fosfátdehydrogenáza, glukoamyláza a acetylcholinesteráza.

Přítomnost protilátek může být také detekována označením protilátek radioaktivním izotopem, který pak může být stanoven užitím gama počítače nebo scintilačního počítače. Izotopy zvláště vhodné pro účely předkládaného vynálezu jsou: ³H, ¹²⁵1, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ^{50 5l * *}Cr, ³⁶C1,⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se.

Je také možné detekovat protilátky značením fluorescenčními sloučeninami. Když je fluor45 escenčně značená protilátka exponovaná světlu vhodné vlnové délky, její přítomnost je detekována díky fluorescenci barevné látky. Mezi všeobecně užívané fluorescenční značící sloučeniny patří fluorescein, izothiokyanát, rhodamin, fykoerytrin, fykocyanin, allofykocyanin, o-ftaldehyd a fluorescamin.

Protilátky předkládaného vynálezu mohou být pro detekci také značeny užitím kovů emitujících fluorescenci, jako např. ¹⁵²Eu nebo dalších prvků lantanové skupiny. Tyto kovy mohou být připojeny k molekule protilátky užitím chelatačních činidel, jako je například dietylentriaminpentaoctová kyselina (DTPA) nebo etylendiamintetraoctová kyselina (EDTA).

- 11 CZ 294909 B6

Protilátky mohou být také označeny pro detekci spojením s chemiluminiscenční sloučeninou. Přítomnost chemiluminiscenčně značené protilátky je pak stanovena detekcí luminiscence, která je důsledkem chemické reakce. Příklady zvláště vhodných chemiluminiscenčních značících sloučenin jsou luminal, izoluminol, theromatický ester akridinu, imidazol, akridinové soli, ester oxalátu a dioxetan.

Podobně mohou být ke značení protilátek předkládaného vynálezu užity také bioluminiscenční sloučeniny. Bioluminiscence je druhem chemiluminiscence, existující u biologických systémů, ve kterých katalytický protein zvyšuje účinnost chemiluminiscenční reakce. Přítomnost bioluminiscenční protilátky je stanovena detekcí přítomné luminiscence. Důležité bioluminiscenční sloučeniny pro účely značení jsou luciferin a luciferaseequorin.

Protilátky a v podstatě čistý antigen předkládaného vynálezu jsou ideálně vhodné pro přípravu diagnostické soupravy (kitu). Kit se skládá z obalu (nosiče) rozděleného tak, aby se do něho umístilo jeden nebo více kontejnerů, jako např. lahviček, zkumavek apod., přičemž každý z těchto kontejnerů obsahuje samostatný prvek testu, který bude používán. Typy testů, které mohou být zahrnuty do podoby kitu, je mnoho a zahrnují například kompetitivní a nekompetitivní testy. Typickými příklady testů, které mohou využít protilátky dle předkládaného vynálezu, jsou radioimunotesty (RIA), enzymové imunotesty (EIA), imunosorbentní testy spojené s enzymem (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA) a imunometrické nebo sendvičové imunotesty.

Termínem „imunometrický test“ nebo „sendvičový imunotest“ se míní obsáhnout imunotesty typu „simultaneous sandwich“, „forward sandwich“ a „reverser sandwich“. Odborníci těmto termínům dobře rozumějí. Odborníci také ocení, že protilátky podle předkládaného vynálezu budou použitelné v dalších variacích a formách testů, které jsou známy v současnosti nebo které mohou být vyvinuty v budoucnosti. Oblast předkládaného vynálezu zamýšlí obsáhnout také tyto testy.

Je důležité, že při preferovaném způsobu provádění testů jsou v inkubačním médiu přítomny určité „blokátory“ (obvykle přidávané se značenou rozpustnou protilátkou). „Blokátory“ se přidávají proto, aby se zajistilo, že nespecifické proteiny, proteázy nebo lidské protilátky k myším imunoglobulinům, přítomné v pokusném vzorku, nereagují zkříženě nebo neničí protilátky na pevném nosiči či radioaktivně značenou indikátorovou protilátku, takže nevznikají falešně pozitivní nebo negativní výsledky. Výběr „blokátorů“ proto podstatně přispívá ke specifičnosti testů, popisovaných v předkládaném vynálezu.

Bylo nalezeno, že jako „blokátory“ se může použít mnoho nerelevantních (tj. nespecifických) protilátek stejné třídy nebo podtřídy (izotyp) jako protilátky, používané v testech (např. IgGi, IgG2a, IgM, apod.). Koncentrace „blokátorů“ (normálně 1-100 pg/μΐ) je důležitá pro udržení náležité citlivosti a současné zabránění jakékoliv nežádoucí interferenci společně se vyskytujících zkříženě reagujících proteinů lidského séra. Navíc potřebuje být optimalizován pufrovací systém, obsahující „blokátory“. Preferované pufry jsou ty, které jsou založené na slabých organických kyselinách, jako je imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS apod., ve fyziologickém rozmezí pH. Poněkud méně preferované pufry jsou anorganické pufry, jako je fosfát, borát nebo karbonát. Nakonec jsou k pufrům obsahujícím „blokátory“ výhodně přidávány známé inhibitory proteáz (normálně v rozmezí 0,01 až 10 μg/ml).

Je mnoho imunoadsorbentů pevné fáze, které jsou využívány a mohou být použity v předkládaném vynálezu. Dobře známé imunoadsorbenty zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, dextran, nylon a další látky, ve formě zkumavek, kuliček a mikrotitračních destiček, vytvořených z takových látek nebo jimi potažených, a podobně. Imobilizované protilátky mohou být k imunoadsorbentu v pevné fázi vázány buď kovalentní nebo fyzikální vazbou, užitím takových technik jako je vázání amidovou nebo esterovou vazbou nebo absorpcí. Odborníci budou znát mnoho dalších imunoadsorbentů pevné fáze a způsobů, jak na nich imobilizovat protilátky, nebo budou schopni toto zajistit rutinním experimentem.

- 12CZ 294909 B6

Pro diagnózu in vivo, in vitro nebo in šitu se mohou protilátky dle předkládaného vynálezu označit radionuklidy buď přímým navázáním nebo využitím intermediámí funkční skupiny. Intermediární skupina, která se často užívá k navázání radioizotopů v podobě kationtů kovů k protilátkám, je dietylentriaminpentaoctová kyselina (DTPA). Typickými příklady kationtů kovů, které jsou tímto způsobem vázány, jsou: ^99mTc, ¹²³I, ^H1In, ^l31I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga a ⁶⁸Ga. Protilátky se pro účely diagnostiky mohou také označit neradioaktivními izotopy. Prvky, které jsou pro toto obzvláště vhodné, jsou: ^I57Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr a ⁵⁶Fe.

Antigen podle vynálezu se může izolovat v podstatě čisté formě užitím protilátek podle předkládaného vynálezu. Tak jedno ztělesnění předkládaného vynálezu poskytuje v podstatě čistou tyrosino-proteinkinázovou chiméru a uvedený antigen je charakterizován tím, že je rozpoznáván a váže se na protilátky podle předkládaného vynálezu. Jiné ztělesnění předkládaného vynálezu poskytuje způsob izolace nebo vyčištění chimérického receptorového antigenu tím, že uvedený antigen tvoří komplex s jednou nebo více protilátkami, namířenými proti receptorové chiméře.

V podstatě čisté chimérické antigeny podle předkládaného vynálezu se mohou naopak užít pro detekci nebo měření protilátek k chiméře ve vzorku, jako je například sérum nebo moč. Tak jedno ztělesnění předkládaného vynálezu zahrnuje způsob detekce přítomnosti nebo množství protilátek proti tyrosin-proteinkinázovému antigenu ve vzorku, zahrnuje styk se vzorkem, obsahujícím protilátku proti chimérickému antigenu s receptorovou chimérou označenou pro detekci, a uvedenou detekční značku. Je jasné, že se mohou také použít imunoreaktivní frakce a imunoreaktivní analogy chiméry. Termínem „imunoreaktivní frakce“ se rozumí jakákoliv část chimérického antigenu, která způsobí ekvivalentní imunitní odpověď na protilátku, namířenou proti receptorové chiméře. Termínem „imunoreaktivní analog“ je míněn protein, který se liší od receptorového chimérického proteinu v jedné nebo více aminokyselinách, ale přitom projevuje shodnou imunitní odpověď na protilátku podle vynálezu.

Spojením „specificky rozpoznat a vázat“ se rozumí to, že protilátka rozpozná a váže chimérický receptorový polypeptid, ale v podstatě nerozpozná a neváže jiné nepříbuzné molekuly ve vzorku, případně biologickém vzorku.

Termínem „autoimunní buňky“ jsou označeny buňky produkující protilátky, které reagují s hostitelskými tkáněmi nebo T efektorovými buňkami, které jsou autoreaktivní, takové buňky zahrnují protilátky proti acetylcholinovým receptorům, (což vede například k myasthenii gravis), nebo protilátky proti DNA, erytrocytům a trombocytům (což způsobuje lupus erythematodes).

Pod pojmem „terapeutická buňka“ se rozumí buňka, která byla transformována chimérou podle vynálezu, takže je schopna rozpoznat a likvidovat specifické infekční agens, buňku infikovanou specifickým agens, nádorovou a rakovinnou buňku nebo autoimunní buňku, výhodně jsou takovými terapeutickými buňkami hematopoetické buňky.

Termínem „cílové infekční agens“ se označuje jakékoliv infekční agens (například virus, bakterie, prvok nebo houba), které může být rozpoznáno chimérickým receptorem neseným terapeutickou buňkou. „Cílovou buňkou“ se označuje jakákoliv hostitelská buňka, která může být rozpoznána terapeutickou buňkou nesoucí chimérický receptor, přičemž cílové buňky zahrnují bez omezení hostitelské buňky infikované virem, bakterií, prvokem nebo houbou, a také nádorové nebo rakovinné buňky a autoimunní buňky.

Termín „extracelulární“ znamená, že alespoň část molekuly je exponována na buněčném povrchu. „Intracelulární“ znamená, že alespoň část molekuly je exponována v cytoplazmě terapeutické buňky. „Transmembránový“ znamená, že alespoň část molekuly prochází plazmatickou membránou. Termíny „extracelulární část“, „intracelulární část“, „transmembránová část“ v tomto textu označují okolní sekvence aminokyselin, které zasahují do příslušných buněčných kompartmentů.

-13 CZ 294909 B6 „Oligomerizace“ znamená tvořit s jinými proteiny dimery, trimery, tetramery nebo oligomery vyššího řádu. Takové oligomery mohou být homo-oligomery nebo hetero-oligomery. „Oligomerizující část“ je taková část molekuly, která řídí tvorbu komplexu (tj. oligomeru).

Pojem „cytolytický“ znamená být schopen zlikvidovat buňku (například buňku infikovanou patogenem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo autoimunní buňku) nebo zlikvidovat přímo infekční agens (například virus).

Termín „virus deficitu imunity“ označuje retrovirus, který je ve své divoké formě schopen infikovat buňky T4 hostitele primáta. Vyznačuje se morfogenezí a morfologickými charakteristikami podčeledi lentivirů. Termín zahrnuje bez omezení všechny varianty HIV a SIV včetně HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand, SIVcpz.

Termínem „nezávislý na MHC“ se myslí buněčná cytolytická odpověď, která nevyžaduje přítomnost antigenu II. třídy MHC na povrchu cílové buňky.

Termín „funkční cytolytický derivát přenášející signál“ znamená funkční derivát (jak je definován výše), který je schopen nasměrovat přinejmenším 10 %, výhodně 40 %, výhodněji 70 % nebo nej výhodněji alespoň 90 % biologické aktivity molekuly divokého typu. Ve smyslu užívaném zde „funkční cytolytický derivát přenášející signál“ přímo informuje terapeutickou buňku, aby zlikvidovala na receptor vázané agens nebo buňku (v případě intracelulámí části chimérického receptoru), nebo působí nepřímo tak, že podporuje oligomerizaci s proteiny signální transdukce vedoucí k cytolýze terapeutickou buňkou (v případě transmembránové domény). Účinnost takových derivátů je možné testovat užitím in vitro testů popsaných zde.

„Funkční derivát vážící obal HIV“ označuje funkční derivát (ve smyslu definovaném výše), který je schopen se navázat na obalový protein HIV. Funkční deriváty lze definovat užitím in vitro testů popsaných zde.

Terapeutické podávání

Transformační buňky podle předkládaného vynálezu se mohou použít k léčbě mnoha nemocí. Současné způsoby podávání takových transformovaných buněk zahrnují adoptivní imunoterapii nebo léčbu buněčným přenosem. Tyto metody dovolují navrácení transformovaných buněk imunitního systému do krevního oběhu. Rosenberg, Sci. Am. 62, květen 1990, Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:570. 1990.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu se mohou podávat jakémukoliv zvířeti, které zakusí blahodárný vliv sloučenin podle vynálezu. Nejpřednější mezi takovými zvířaty jsou lidé, ačkoliv není úmyslem vynálezu omezit se pouze na člověka.

Popis obrázků

Obr. 1A je schematický diagram, ukazující organizaci fúzovaných proteinů receptorové kinázy vynálezu. Obr. 1B ukazuje výsledky průtokové cytometrie pro CD16/7/zeta, CD16/7Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk a CD16/7/ZAP-70 exprimované rekombinantami vakcínie v buňkách Jurkat. Obr. 1C ukazuje testy aktivity kinázy in vitro imunoprecipitovaných CD16/7/zeta (negativní kontrola), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk a CD16/7/ZAP-70, ještě musí být identifikován precipitát nižší molekulové hmotnosti, objevující se v imunoprecipitátu chiméry Fyn.

Obr. 2 ukazuje odpověď cytosolového kalcia, spouštěnou navázáním kinázových chimér v buňkách Jurkat bez TCR. Je ukázána relativní intracelulámí koncentrace kalcia populace, která

- 14CZ 294909 B6 má TCR (měřeno poměrem Indo-1 violetí k modré fluorescenci). Buňky Jurkat, infikované rekombinantami vakcínie, exprimujícími různé fúzované proteiny, byly vystaveny anti-CD16 mAb 3G8 G8, což bylo následováno kozími protilátkami F(ab)2 (konjugovánými s fykoerytrinem) proti myším IgG v čase 0. Chiméry založené na řetězci zeta TCR a FcRIIB2 slouží jako pozitivní a negativní kontroly.

Obr. 3 ukazuje předčasné zapojení kalciové odpovědi u buněk s TCR, exprimujících chiméru kinázy Syk. Infekce a analýza byly provedeny tak, jak je popsáno výše u obr. 2. Podstatná část buněk, exprimujících chiméru Syk, vykazovala před přidáním primární protilátky vysoký poměr fluorescence fialová/modrá.

Obr. 4A a 4B ukazují smrtící test anti-hybridomů.

Obr. 4A ukazuje procento ⁵¹Cr-chromanu, uvolněného z hybridomových cílových buněk, vyjádřené jako funkce poměru efektorových buněk (CTL exprimující kinázovou chiméru) k buňkám cílovým, buňky, exprimující receptorové chiméry, nesoucí intracelulámí domény řetězce zeta TCR a FcRIIB2, slouží jako pozitivní a negativní kontroly. Obr. 4B ukazuje specifičnost usmrcování (nepřítomnost náhodného usmrcování). Buňky BW5147 (postrádající povrchovou protilátku anti-CD16) byly zatíženy ⁵¹Cr-chromanem a vystaveny CTL, exprimujícím kinázové chiméry za stejných podmínek jako paralelní vzorek buněk 3G8, zatížených chromanem (exprimující protilátku anti-CD16). Z buněk BW5147 nebylo pozorováno detekovatelné uvolnění chromanu.

Obr. 5A, 5B a 5C ukazují, že společná exprese ZAP-70 a Fyn či Lek umožňuje indukci cytolýzy a snižuje latenci kalciové odpovědi. CTL byly infikovány společně rekombinantami vakcínie, exprimujícími vyznačené chiméry a analyzovány na cytolytický potenciál nebo mobilizaci kalcia. Účinnost chimér je touto analýzou podceňována, protože frakce buněk, exprimující obě chiméry, nebyla měřena nezávisle (k normalizaci aktivity byla použita frakce buněk, exprimující alespoň jednu chiméru). Obr. 5A ukazuje test cytolýzy za použití CTL exprimujících páry chimér CD16/7/kinázy. Obr. 5B ukazuje kalciovou odpověď buněk bez TCR, které exprimují páry chimér CD16/7/kinázy. Obr. 5C ukazuje test cytolýzy CTL společně exprimujících chiméry CD4/CD7/Fyn a CD16/7/ZAP-70. Chiméra CD16/7/zeta slouží jako pozitivní kontrola, zatímco chiméra CD16/7/FcRIIB2 slouží jako kontrola negativní.

Obr. 6A a 6B ukazují, že chiméry kinázy s delecí nebo bodovou mutací jsou v mobilizaci kalcia a přesměrování cytolýzy neúčinné. Negativní varianty fúzovaného proteinu kinázy byly konstruovány delecí (v případě Syk) nebo bodovou mutací (v případě ZAP-70) a testovány na kalciovou odpověď a cytolýzu. Obr. 6A ukazuje kalciovou odpověď u buněk bez TCR. Obr. 6B ukazuje test přesměrované cytolýzy.

Obr. 7A, 7B a 7C ukazují, že chiméry založené na lidském Syk jsou v podstatě ekvipotentní s chimérami založenými na Syk prasečím. Obr. 7A je sekvence lidského Syk (sekvence identifikačního čísla 5) a srovnání s prasečím Syk (sekvence identifikačního čísla 6), prvních 11 a posledních 7 aminokyselinových zbytků je určeno sekvencí primerů. Obr. 7B ukazuje analýzu mobilizace kalcia buněk bez TCR exprimujících lidskou chiméru Syk. Obr. 7C ukazuje test přesměrované cytolýzy CTL exprimující chiméru lidského Syk.

Obr. 8 ukazuje změny ve vzorci fosforylace tyrosinu po navázání kinázových chimér. Buňky Jurkat bez antigenu T buněčného exprimující vyznačené chiméry nebo páry chimér byly vystaveny anti-CD16 a kozí sekundární protilátce proti myšímu IgG a poté lyžovány, rozděleny do frakcí na polyakrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulózu a inkubovány s anti-fosfotyrosinovou protilátkou. Dráhy označené „+“ představují extrakty z buněk s navázanou protilátkou, zatímco dráhy označené byly lyžovány přímo bez předchozí expozice sekundární protilátce. Kontrolní dráhy byly vytvořeny obdobným ošetřením buněk bez TCR exprimujících fúzovaný protein CD 16/7, který neobsahoval intracelulámí doménu. Pro srovnání, účinky

-15CZ 294909 B6 ošetření buněk Jurkat s TCR anti-CD3 (s nebo bez infekce virem divokého typu vakcínie), jsou ukázány vpravo. Výrazné pásy v blízkosti 100 kD v levé části tohoto panelu odpovídají očekávaným molekulovým hmotnostem kinázových chimér.

Obr. 9 ukazuje fosforylaci tyrosinu fosfolipázy C-gamal následující agregaci chimér. PLCgamal byla imunoprecipitována z buněk s navázanou protilátkou a imunoprecipitáty byly rozděleny na gelech, přeneseny na nitrocelulózu a inkubovány s protilátkou proti fosfotyrosinu. Podstatné zvýšení ve fosforylovaném PLC-gamal bylo pozorováno po agregaci chimér Syk, zatímco omezenější, ale snadno detekovatelné zvýšení je pozorováno po společné agregaci chimér Fyn a ZAP-70.

Obr. 10A a 10B ukazují kinázové testy in vitro. Buňky exprimující kinázové chiméry navázaly chimérické protilátky, poté byly kinázy imunoprecipitovány a imunoprecipitáty byly vyhodnoceny na fosforylaci endogenního substrátu. Obr. 10A ukazuje srovnání aktivity imunoprecipitovaných kinázových chimér po inkubační dobu deseti minut, za použití imunoprecípitátů izolovaných z buněk s navázanou protilátkou (+) nebo bez ní (-). Obr. 10B ukazuje časový průběh asimilace fosfátu do endogenních substrátů chimérou kinázy Syk, s (+) nebo bez (-) navázané protilátky.

Aktivace T buněk shluklými tyrosin-kinázami

Nyní následuje popis konkrétních ztělesnění vynálezu. V tomto popise se demonstruje, že nereceptorové kinázy jsou aktivovány jednoduchými shlukovými událostmi. Byly tvořeny artefíciální receptorové kinázy, jejichž intracelulární domény byly složeny z kompletních sekvencí kináz rodin Src nebo Syk a byly zkoumány důsledky agregace s externími vazebnými stimuly. Aktivity kináz z rodin Syk a Src se jasně lišily: vytváření vazeb kinázami Src nevedlo k významné buněčné aktivaci, zatímco tvoření vazeb kinázami Syk vedlo k výskytu volného intracelulárního kalciového iontu a, v případě Syk, cytolytického potenciálu. Selhání chimér ZAP-70 indukovat programy zprostředkované distálním receptorem může být překonáno současným shlukováním chiméry ZAP-70 skinázovými chimérami buď Fyn nebo Lek. Příklady nyní popsané jsou poskytnuty za účelem ilustrace vynálezu, ne jeho limitace.

Příklady provedení vynálezu

Konstrukce tyrosin-proteinkinázových chimér a demonstrace účinnosti

Fúzované geny, kódující proteiny podobné buněčným receptorovým kinázám, byly vytvořeny připojením DNA fragmentu, kódujícího extracelulámí doménu molekuly CD 16, ke krátkému oddělovacímu segmentu, kódujícímu juxtamembránovou a transmembránovou doménu CD7, spojenou postupně s kompletní kódující sekvencí tyrosinkináz lidského Lek (Koga et al., Eur. J. Immunol. 16:1643-1646. 1986), myšího Fyn(T) (Cooke and Perlmutter, New Biol, 1:66-74. 1989), prasečího Syk (Taniguchi et al., J. Biol, Chem. 266:15790-15796, 1991) a lidského ZAP-70 (Chán et al., Cell 71:649-662. 1992) (obr. 1A). Výsledné trojité genové fúze byly včleněny do rekombinantních virů vakcínie homologní rekombinací a selekci na společnou expresi genového produktu gpt E. coli. Infekce buněk rekombinantami měla za následek účinnou expresi všech čtyřech kinázových chimér na buněčném povrchu (obr. IB). Imunoprecipitace výsledných proteinových chimér protilátkami anti-CD16 odhalila přítomnost molekul očekávaných hmotností, které byly aktivní v testu fosforylace in vitro (obr. 1C).

Dále jsme vyšetřovali, zda obsazení vazebných míst fúzovaných proteinů může umožnit akumulaci volného intracelulárního kalcia, podobně jako fúzované proteiny založené na intracelulámích doménách antigenu T buněčného receptoru. Abychom toho dosáhli, infikovali jsme různé buňky rekombinantami vakcínie a měřily relativní koncentraci cytoplazmatického kalcia po obsazení extracelulárních domén protilátkami. Byla provedena obě měření, jak spektrofluorometrické

-16CZ 294909 B6 (kompaktní populace) tak průtokově cytometrické (jednotlivá buňka), s buňkami obarvenými Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440-3450, 1985, Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961. 1986). Analýzy průtokovou cytometrií se prováděly z dat získaných z buněk, které exprimovaly na buněčném povrchu CD 16, jak určováno intenzitou fluorescence fykoerytrinu, v relativně úzkém předem definovaném rozmezí. Ačkoliv v tomto rozmezí byly stále pozorovatelné menší odchylky od průměrné intenzity fluorescence (způsobené odlišností v distribuci chimér exprimovaných buňkami), tento přístup nám umožnil porovnat odpovědi buněk nesoucích přibližně stejný počet receptorů. Obrázek 2 ukazuje analýzu dat sebraných na buňkách mutantní varianty lidské T buněčné leukemické linie Jurkat, postrádající antigen T buněčného receptoru (Weiss a Stobo, J, Exp. Med. 160:1284-1299. 1984). V těchto buňkách neměla chiméra Lek ani Fyn schopnost mobilizovat kalcium po obsazení vazebných míst. V některých experimentech mělo shlukování fúzovaného proteinu Lek za následek slabé snížení klidové koncentrace kalcia, relativně k negativní kontrole, fúzovanému proteinu založenému na intracelulámí doméně nízkoafínitního IgG receptoru FcRIIB2 (Kolanus et al., EMBO J, 11: 4861-4868, 1992). Agregace fúzovaných proteinů založená na obou ZAP-70 a Syk velice účinně podporovala výskyt volného cytoplazmatického kalciového iontu, zhruba tak účinně jako agregace podobné chiméry, nesoucí intracelulámí doménu řetězce zeta T buněčného receptoru. U obou kinázových chimér ZAP-70 a Syk bylo pozorováno mírné zpoždění v nástupu kalciové odpovědi, odpovídající době nástupu mobilizace kalcia chimérou zeta. V buňkách, obsahujících T buněčný receptor (obr. 3), bylo vyhodnocení toku chimér Syk částečně vyvráceno vysokou klidovou koncentrací volného kalciového iontu, což by svědčilo pro konstitutivní zapojení kalciového regulačního aparátu.

Začlenění chimér do cytolytické T buněčné linie nám poté umožnilo stanovit potenciál fúzovaných proteinů pro vykonávání efektorové funkce. V tomto testu jsou jako cílové buňky použity hybridomové buňky anti-CD16, které exprimují protilátku buněčného povrchu IgG proti CD 16 (Fleit et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: 3275-3279, 1982, Shen et al., Mol, Immunol. 26: 959-969, 1989). Hybridomové buňky jsou značeny inkorporací ⁵¹Cr-chromanu a sedimentovány společně s efektorovými buňkami, připravenými infekcí lidské alospecifické cytotoxické T lymfocytární (CTL) linie rekombinantami vakcínie, exprimujícími fúzované proteinové kinázy CD16/CD7. Exprese kinázových receptorových chimér umožňuje infikovaným buňkám CTL vázat se na cílové buňky, a jsou-li kompetentní, lyžovat je, což je proces, který je měřen uvolněním inkorporovaného ⁵¹Cr-chromanu. Relativní účinnost vybavených CTL je určována srovnáním poměru efektorových buněk k cílovým buňkám, který je nutný k dosažení dané části uvolněného ^5lCr. Obr. 4A ukazuje, že CTL exprimující chimérické receptory obsahující kinážy Lek nebo Fyn(T) z rodiny Src nebo kinázu ZAP-70 z rodiny Syk, jsou neschopné zprostředkovat cytolýzu proti hybridomovým cílům anti-CD16. Avšak CTL exprimující kinázovou chiméru založenou na proteinovém produktu Syk byly v podstatě stejně účinné jako CTL exprimující chiméru složenou z CD 16 fúzované stejným způsobem s intracelulámí doménou řetězce zeta T buněčného receptoru. Cytolytická aktivita směrovaná kinázovými chimérami CD16/CD7 by nemohla být připisována nespecifickému uvolnění cytotoxických granul, protože společná sedimentace irelevantního cíle obsahujícího chrom s CTL vybavenými kinázou neměla za následek detekovatelné uvolnění značeného chrómu (obr. 4B).

Rozdílnost aktivity v testu cytolýzy pro Syk a ZAP-70 byla neočekávaná ve světle podobné aktivity těchto dvou chimér v testu kalciové odpovědi. Ve světle důkazu, že společná exprese nechimérických kináz rodin ZAP-70 a Src vedla k aktivaci v buňkách COS (Chán et al., Cell. 71:649-662, 1992), jsme se pustili do hodnocení relativního potenciálu párů chimér provádět cytolýzu. Efektory CTL byly infikovány současně rekombinantními viry vakcínie, kódujícími chiméry ZAP-70 a Lek, chiméry ZAP-70 a Fyn(T) nebo chiméry Lek a Fyn(T). Obr. 5A ukazuje, že společná exprese chimér ZAP-70 a Fyn(T) nebo chimér ZAP-70 a Lek obdařila CTL aktivitou v podstatě ekvipotentní s aktivitou CTL, exprimujících samotné kinázové chiméry CD16/CD7/Syk, aktivitou opět stejně silnou jako je ta projevovaná chimérami CD16/CD7/zeta. Společná exprese chimér Lek a Fyn(T) neumožnila, aby byl přesměrován významný cytolytický potenciál proti cílovým buňkám anti-CD16 (obr. 5A). Vyhodnocení potenciálu mobilizace kalcia buněk, infikovaných současně páry fúzovaných proteinkináz ukázalo, že společná exprese chimér

- 17CZ 294909 B6 kináz rodin ZAP-70 a Src zvýšila rychlost, se kterou se kalcium mobilizovalo jako odpověď na obsazení receptoru, a že společná exprese chimér Lek a Fyn(T) neměla za následek významnou akumulaci volného intracelulárního kalcia (obr. 5B). Aby se dále prozkoumala úloha chiméry Fyn v aktivační odpovědi, indukované společnou agregací, připravili jsme chiméru Fyn, skládající se z extracelulárních a transmembránových domén CD4 fúzovaných s Fyn způsobem podobným způsobu chimér CD 16. Obr. 5C ukazuje, že účinnost této chiméry v testu řízené cytolýzy je deset až dvacetkrát nižší než účinnost srovnatelné chiméry CD 16, což svědčí pro to, že fyzické spojení kinázových chimér je důležité pro aktivaci. Avšak cytolytická aktivita buněk exprimujících dvě chiméry je významně vyšší, než by byla pozorována pro buňky exprimující pouze chiméru ZAP-70. Kvůli relativně vysoké úrovni exprese kináz v tomto systému nemůže být vyloučeno, že reziduální aktivita odráží náhodnou spontánní asociaci chiméry CD4/Fyn s CD16/ZAP-70.

Aby se určilo, zda aktivace pozorovaná v testech kalciové odpovědi a cytolýzy byla přímo důsledkem aktivity relevantní kinázy, a ne pasivní asociací kináz s existujícími prvky signální transdukce, jejichž nepřímá agregace tedy spustila aktivační odpověď, vytvořili jsme varianty bez kinázové aktivity receptorových chimér prasečího Syk a lidského ZAP-70. Obr. 6 ukazuje, že receptorové chiméry, které buď postrádají v podstatě všechny kinázové domény (v případě Syk) nebo nesou bodovou mutaci rušící fosfotransferázovou aktivitu (v případě ZAP-70, neměly kinázovou aktivitu in vitro a byly neschopné zprostředkovat mobilizaci kalcia po obsazení receptorů nebo zprostředkovat receptorové přesměrovanou cytolýzu.

Protože interakce prasečího Syk s lidským buněčným aparátem nemusí být identická s interakcí lidského Syk, zkonstruovali jsme také podobné proteinové chiméry založené na lidském Syk, po izolaci sekvencí lidského Syk metodou PCR s primery odpovídajícími amino- a karboxylkoncům prasečí proteinové sekvence. Obr. 7A ukazuje, že prasečí a lidský Syk jsou nápadně podobné proteiny, jak pro to svědčí analýza produktů PCR, které odpovídají částem kinázové a druhé SH2 domény (Chán et al., Cell 71:649-662, 1992). Ve shodě s tímto nálezem se proteiny chimérického receptoru lidského Syk chovaly v podstatě identicky s prasečími konstrukty při testech uvolňování kalcia a cytolýzy (obr. 7B a 7C).

Aby se určilo, zda agregace tyrosin-kinázových chimér má za následek významnou změnu v nadbytku fosfotyrosinových proteinů, byly buňky bez T buněčného receptoru infikovány rekombinantami vakcínie, kódujícími kinázové chiméry. Extracelulámí domény chimér byly obsazeny protilátkami a celkové buněčné lyzáty aktivovaných buněk byly rozděleny elektroforézou, přeneseny na membrány a analyzovány s protilátkou rozpoznávající fosfotyrosin. Lyzáty byly připraveny rozrušením buněk v neionogenních detergentech za přítomnosti vanadátu s nebo bez EDTA, nebo lyžovány za přítomnosti dodecylsulfátu sodného, následovanou sonifíkací, aby se roztrhala uvolněná DNA. Vzorec fosfotyrosinových proteinů byl v každém případě odlišný a lyzáty připravené s vanadátem, ale bez EDTA, ukazovaly další druhy, nepřítomné v lyzátech, připravených pouze v SDS, což svědčí pro to, že EDTA může inhibovat činnost tyrosinových kináz po lýzi stejně jako fosfatáz. Shledalo se, že použití přímé lýze v SDS vede k reprodukovatelnějšímu vzorci proteintyrosinové fosforylace než lýze s neionogenními detergenty v přítomnosti EDTA a vanadátu. Obr. 8 ukazuje, že agregace chimér, nesoucích Syk, ZAP-70 nebo Fyn a ZAP-70, vede k výskytu nebo zvýšené fosforylaci několika proteinových druhů, migrujících společně s proteiny, které ukazují zvýšenou fosforylaci, následující po navázání receptorové antigenu. Konkrétně vzorec pásů, indukovaný shlukováním chiméry Syk, je velmi podobný vzorci indukovanému protilátkou anti-CD3 v buňkách s T buněčným receptorem (obr. 8). Mezi těmito pásy je protein o velikosti přibližně 150 kD indukovaný agregací chiméry Syk, ale také indukovaný společnou agregací chimér Fyn a ZAP-70. V předběžných pokusech bylo pozorováno, že tento fosfoprotein migroval společně s fosfolipázou C-gama (data neuvedena).

Aby se stanovily přímo účinky shlukování kinázových chimér na PLC-gama, navázali jsme vazebně chiméry, precipitovali PLC-gama se směsí monoklonálních protilátek a analyzovali výsledné imunoprecipitáty na přítomnost fosfotyrosylových proteinů. Obr. 9 ukazuje, že

-18CZ 294909 B6 shlukování Syk vede k podstatnému zvýšení v obsahu tyrosinfosfátu PLC-gama, zatímco navázání chimér Fyn a ZAP-70 má za následek méně dramatické, ale snadno detekovatelné zvýšení tyrosinfosfátu. Buňky exprimující samotnou chiméru Fyn ukazovaly mírnou základní fosforylaci PLC-gama, která se nezvyšovala po agregaci receptorů (obr. 9). Zdali jsou tytéž tyrosinové zbytky fosforylovány Syk, Fyn nebo ZAP-70 a Fyn, je v současnosti neznámo. Protože buňky exprimující chiméru Fyn nevykazovaly ani klidovou ani indukovanou mobilizaci kalcia, může fosfotyrosinový signál pozorovaný v těchto buňkách představovat používání jiných míst na PLC-gama, než těch, které zprostředkovávají aktivaci fosfolipázy.

V předběžném pokuse vysvětlit změny fosfotyrosinového vzorce jsme vyhodnocovali aktivitu různých kináz po shlukování v in vitro autofosforylačním testu. Chiméry byly agregovány, imunoprecipitovány a vyhodnocovány na schopnost inkorporovat fosfátové značení do proteinu přítomného v imunoprecipitátu. Obr. 10A ukazuje, že za těchto podmínek nebylo detekováno žádné zvýšení v aktivitě kinázy po obsazení vazeb, když byl test kinázy prováděn po dobu deseti minut. Ačkoliv inkorporace značeného fosfátu se v tomto testu plynule zvyšuje až 30 minut, je nejasné, které faktory omezují aktivitu, konkrétně pozorovaná kinetika může být ovládnuta rychlostí disociace imunních komplexů, což umožní difúzi kinázy k nespotřebovanému substrátu. Při pokusu potlačit tento účinek, stejně jako maximalizovat senzitivitu testu, jsme také vyhodnocovali aktivitu kinázy Syk s nebo bez předběžného obsazení vazeb po velmi krátkou dobu od 5 do 30 sekund, avšak také zde nebylo žádné významné zvýšení kinázové aktivity (obr. 10B). Ačkoliv nemůžeme v současnosti vyloučit možnost, že zvýšení aktivity by bylo s příslušným substrátem prokazatelné, zvýšení aktivity chiméry Syk indukované agregací také nebylo pozorováno, když byl k měření kinázové aktivity použit exogenní peptidový substrát (Y 19 K substituce cdc 2 zbytky 6-20).

Možné mechanizmy

Mechanizmus, díky kterému má jednoduchý stimul fyzikální povahy, tedy agregace receptorů, za následek přenos zřetelného chemického signálu na buňky imunitního systému, zůstává neznámý. Předešlé studie prokázaly, že kinázy rodiny Src mohou být spojené s mnoha důležitými receptory imunitního systému, které jsou aktivovány agregací, a že obsazení takových receptorů často vede ke zvýšené aktivitě kinázy. Nedávno bylo zjištěno, že příbuzné kinázy Syk a ZAP-70 jsou spojeny buď stabilně (v případě Syk) nebo přechodně (v případě ZAP-70) s antigeny B a T buněčných receptorů a alespoň v případě Syk bylo publikováno, že obsazení receptorů vede ke zvýšené kinázové aktivitě.

V této práci jsme ukázali, že agregace rodiny kináz Syk, ale již ne agregace kináz Lek nebo Fyn z rodiny Src, vede ke kalciové odpovědi v buňkách postrádajících T buněčný receptor. Odpověď se nezdá být důsledkem nepřímého spojení s dalšími T buněčnými receptory nebo složkami signální transdukce, protože mutanty bez kináz nemohou indukovat kalciovou odpověď. Agregace chimér obsahujících kinázu Syk je dostatečná ktomu, aby umožnila indukci specifické cytolýzy, zatímco indukce podobné cytolýzy chimérou ZAP-70 vyžaduje účast další kinázy rodiny Src. V současnosti je nejasné, která z kináz rodiny Src pravděpodobně hraje důležitější roli v T buněčné aktivaci: obě ZAP-70 a Syk jsou exprimovány v T buňkách, včetně buněčných linií, používaných v této studii a přinejmenším jedna vnímavá lidská T buněčná linie obsahuje Syk, ale ne ZAP-70, jak se dá usuzovat ze specifických produktů PCR. Vzorec zvýšené tyrosinové fosforylace proteinu, pozorovaný po shlukování chiméry Syk, je velmi podobný vzorci, pozorovanému po navázání antigenu T buněčného receptorů.

Jeden jednoduchý model aktivace imunitního systému buňkami nereceptorových tyrosinkináz používá s receptorem spojenou tyrosinkinázu, jejíž agregace vede k aktivaci buď fyzickou asociací (např. tvořením aktivních kinázových dimerů) nebo vzájemnou enzymatickou akcí (např. fosforylaci), aktivovaný enzym působí na klíčové intracelulámí substráty, vyžadované pro mobilizaci kalcia a syntézu inositolfosfátu. Podklad pro tento sled událostí může být nalezen ve studiích, popisujících zvýšení v aktivitě kinázy spojené s receptorem, které následuje po obsazení

-19CZ 294909 B6 receptoru (např. Bolen et al., Adv. Cancer Res. 57:103-149. 1991, Burkhardt et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:7410-7414, 1991, Eiseman a Bolen, Nátuře 355:78-80. 1992, Hutchcroft et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:9107-9111. 1992, Hutchcroft et al., J. Biol. Chem. 267: 8613-8619, 1992, Tsygankov et al., J. Biol, Chem, 267:18259-18262. 1992, Wong et al., Oncogene 7:2407-241.5 1992). Avšak hlášené změny v kinázové aktivitě jsou ve většině případů mírné a kontrastují s dramatickými změnami ve fosfotyrosinovém proteinovém vzorci, pozorovaném in vivo. Protože je obtížné jednoznačně vyloučit aktivaci slabými alosterickými interakcemi za použití kinázových testů in vitro, nemůžeme nyní učinit definitivní prohlášení o relativní důležitosti kinázové aktivace v iniciaci signální transdukce. Ale data zde prezentovaná svědčí pro to, že agregací indukované opětovné rozdělení enzymu a substrátu může být důležitý faktor v nasměrování existující aktivity k příslušnému fyziologickému cíli.

Agregace chimér založených na kinázách rodiny Syk vedla ke kalciové odpovědi, která byla lehce opožděna, ale amplitudou podobná odpovědi, pozorované po agregaci chimér receptoru zeta v buňkách bez endogenního T buněčného receptoru. Vážnější opoždění ve výskytu volného kalciového iontu bylo pozorováno po navázání chiméry ZAP-70 a toto opoždění mohlo být v podstatě odstraněno společným navázáním chimér ZAP-70 a Fyn. V současnosti je vysvětlení této pozorované latence nejasné. Protože společné obsazení vazeb urychlilo mobilizaci kalcia, je lákavé připsat opoždění relativní neúčinnosti ZAP-70 autoaktivaci zprostředkované agregací. Ale stejnou mírou mohou být důležité další faktory a dosah působnosti kináz ZAP a Syk na buněčném povrchu může být ve skutečnosti současně překážka aktivace při srovnání s normálním procesem, například jestliže v normálním průběhu událostí jsou kinázy rodiny Syk přechodně vychytány shlukovanými receptory, aktivovány a pak uvolňovány, aby mohly difundovat ke svým substrátům, permanentní vazba kinázové domény k plazmatické membráně by mohla být restriktivní tím, že brání přístupu k substrátu a/nebo omezuje zesílení signálu v důsledku neschopnosti chimérických receptorů fungovat jako druh katalytického centra pro aktivaci kinázy.

Druhou zvláštností kalciové odpovědi bylo zjištění, že buňky s T buněčným receptorem, exprimující chiméry založené na lidském nebo prasečím Syk, vykazovaly vysokou bazální koncentraci volných kalciových iontů, což zřejmě znamená, že uvolňování kalcia bylo spuštěno spontánně. Nic podobného nebylo pozorováno u buněk, které receptor neměly. Tyto výsledky protiřečí obecnému trendu, který jsme pozorovali, kdy mutanty lidských T buněk, odvozené z nádorových linií bez T buněčných receptorů, zvýšeně odpovídají na exogenně dodané spouštěcí molekuly. K vysvětlení zjevné nezbytnosti T buněčného receptoru ve spontánním aktivačním procesu navrhujeme dvě možná vysvětlení. Jedno je to, že chimérická kináza Syk působí konstitutivně na intracelulámí doméně T buněčného receptoru a vytváří tak fosfotyrosinové cíle pro domény SH2 receptorové chiméry, což v důsledku vede k intracelulámí agregaci, zprostředkované multivalentními můstky T buněčných receptorů, a opět podporuje aktivitu kinázy. Jinou možností je to, že buňky bez T buněčných receptorů vyžadují nižší hladinu kinázy, asociované s membránou pro aktivaci Syk, a to bud’ proto, že celkový regulační okruh sníží syntézu de novo hypotetické kinázy, nebo proto že nepřítomnost antigenního receptoru vede k poruše regulace buněčných signálních cest.

Kináza Syk je u B buněk konstitutivně asociována s intracelulámími částmi antigenních receptorů IgM (Hutchcroft et al., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 89:9107-9111, 1992, Hutchcroft et al., J. Biol, Chem. 267:8613-8619, 1992). Přesný mechanizmus asociace je nejasný, ale jedna z možností je, že fosfotyrosin není nezbytný pro interakci domény SH2 ze Syk s tyrosinovým spouštěcím motivem, přítomným v cytoplazmatické doméně receptorových řetězců mb-1 a B29. Částečným předpokladem pro tuto hypotézu je zpráva o tom, že genový produkt ber ve zlomové oblasti filadelfského chromozomu se váže k různým doménám SH2 typu způsobem nezávislým na fosfotyrosinu (Pendergast et al., Cell 66:161-171, 1991, Muller et al., Mol. Cell. Biol. 12:5087-5093, 1992). V tomto případě se však zdá, že fosfoserinové a/nebo fosfothreoninové zbytky hrají v interakci klíčovou roli. Jinou možností je, že Syk je asociována s intracelulárním motivem receptoru IgM prostřednictvím jedinečné oblasti, umístěné mezi elementy SH2 a kataly

-20CZ 294909 B6 tickou doménou Syk. Třetí možností je, že pouze velmi malé množství peptidu s fosforylovaným tyrosinem je nezbytné ktomu, aby přitáhlo funkčně významné množství Syk k vnitřnímu povrchu plazmatické membrány, a že toto nízké množství tyrosinfosfátu dosud unikalo detekci.

Ačkoliv u B buněk dosud nebylo s konečnou platností rozhodnuto o účasti kináz z rodiny Src v aktivaci, u T buněk byly zjištěny dvě kinázy Lek a Fyn(T), které hrají důležitou roli, jak bylo prokázáno somatickou genetikou nebo genetikou organizmů (Appleby et al., Cell 70:751-763, 1992, Karnitz et al., Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530. 1992, Stein et al., Cell 70: 741-750, 1992, Strauss a Weiss, Cell 70:585-593. 1992). V současnosti nejsme schopni rozumně stanovit, zda činnost těchto kináz předchází anebo následuje činnost kináz z rodiny Syk. Jedna hypotéza, vysvětlující činnost ZAP-70 v aktivaci T buněk, se dovolává kinázy z rodiny Src asociované s receptorem, jejíž agregace dovoluje dočasnou fosforylaci receptorových řetězců, což opět vede k asociaci ZAP-70, a následně k buněčné aktivaci. Počáteční fosforylace receptorových řetězců navržená v tomto modelu musí být odlišena od stabilní fosforylace zety pozorované delší čas po obsazení receptoru.

U myších T buněk malý podíl T buněčných receptorových komplexů obsahuje molekulu zvanou eta, příbuznou se zeta (Baniysh et al., J. Biol. Chem. 263:9874-9878. 1988), což představuje alternativně sestřiženou formu (Clayton et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5202-5206, 1991). Eta se liší od zety karboxylovým koncem a postrádá nejvzdálenější ze šesti tyrosinů, nalezených u myší zety (Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3323. 1990). Ačkoliv fosforylace řetězce zeta myších TCR izoform zeta-zeta se dá snadno detekovat po protilátkou zprostředkovaném obsazení receptoru, za podobných podmínek TCR řetězec eta není fosforylován na detekovatelné úrovni (Bauer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:3842-3846. 1991). Stálá fosforylace řetězce zeta zřejmě vyžaduje dva přilehlé řetězce zeta, neboť izoformy TCR nesoucí zeta-eta heterodimery nejsou fosforylovány po obsazení receptoru (Bauer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:3842-3846. 1991). I přes rozdíly ve fosforylaci, buněčné linie obsahující izoformy TCR, které se skládají výhradně z homodimerů eta, jsou funkčně nerozlišitelné od buněčných linií, nesoucích pouze homodimery zeta (Bauer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:3842-3846, 1991). Takže fosforylace zety, jak je pozorována 30 minut po agregaci receptorů zprostředkované protilátkou, nekoreluje s aktivací. Samostatná studie, ověřující časový průběh akumulace fosfoproteinů s fosfotyrosinem po agregaci TCR, ukázala, že dříve pozorované dva proteiny o molekulové hmotnosti 135 a 100 kD, jejichž fosforylace je poprvé detekovatelná 5 a 15 sekund po obsazení vazeb a které dosahují 50% maximální fosforylace v obou případech přibližně v 30 sekundách, předchází čas, kdy je dosaženo poloviny maximální mobilizace vápníku a tvorby inositolfosfátu (June et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7722-7726, 1990, June et al., J. Immunol. 144:1591-1599, 1990). Naproti tomu rychlost fosforylace zety je podstatně pomalejší, poloviny maximální substituce je dosaženo přibližně 3 až 5 minut po stimulaci, tedy potom, co je pozorována akumulace kalcia a uvolnění inositolfosfátu (June et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7722-7726, 1990, June et al., J. Immunol. 144:1591-1599. 1990).

Takže jestliže dvoukrokový model je správný, fosforylace tyrosinů nezbytná ktomu, aby připoutala ZAP-70 k vnitřnímu povrchu plazmatické membrány, musí být pravděpodobně dočasnou událostí a podstatně rychlejší, než bylo pozorováno ve výše zmíněných studiích. Nedávno bylo zjištěno, že fosforylace tyrosinů spouštěná dostatečně rychle (přibližně během 15 sekund), může být detekována jak u zeta, tak u řetězců epsilon CD3 po obsazení receptoru (Wange et al., J. Biol, Chem. 267: 11685-11688, 1992), a že protein o velikosti 70 kD nesoucí tyrosinfosfát je asociován jak se zeta, tak epsilon řetězci. Dosud není jasné, zda stabilní asociace s fosforylovaným receptorovým řetězcem je nezbytným předpokladem pro úspěšnou aktivaci T buněk.

Obecně lze tvrdit, že výsledky zmíněné zde ukazují, že kinázy rodiny Syk účinkují příměji na efektorový aparát T buněk než kinázy rodiny Src. Rostoucí počet důkazů ukazuje, že kinázy rodiny Src se mohou asociovat s mnoha molekulami na buněčném povrchu, které přitom nejsou členy žádné rodiny receptorů antigen/Fc včetně CD2 (Bell et al., Mol, Cell. Biol, 12: 5548-5554, 1992), CD23 (Sugie et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 9132-9135, 1991), CD36 (Huang et al.,

-21 CZ 294909 B6

J. Biol. Chem. 267: 5467-5473, 1992), beta řetězec IL-2 (Hatakeyama et al., Science 252: 1523-1528, 1991) a různé proteiny ukotvené fosfatidylinositolem (Stefanova et al., Science 254: 1016-1019, 1991, Thomas a Samelson, J, Biol. Chem. 267: 12317-12322, 1992), z nichž některé jsou známy tím, že vyžadují dodatečnou přítomnost antigenního receptorů k podpoře aktivace T buněk. Tento požadavek je možno jednoduše vysvětlit tím, že spouštěcí motivy na antigenním receptorů působí jako substráty pro kinázy rodiny Src, čímž umožňují následné připojení kináz z rodiny Syk, následované zřejmě nějakými modifikujícími kroky, které podporují jejich aktivaci. Jelikož je těžké stanovit kauzální řetězec fosforylací a aktivací, je možné, že spouštěcí motivy hrají jenom přechodnou roli a účinkují jako určitý druh katalytického centra pro získání, aktivaci a uvolnění efektorových kináz.

Kinázy z rodiny Src jsou široce rozšířeny mezi různými typy buněk, které nejsou hematopoetického původu a současné studie na myších bez Fyn ukázaly na význam Fyn v udržení dlouhodobé potenciace, fenoménu usnadněného synaptického přenosu, který je považován za podklad počáteční konsolidace asociativní paměti (Grant et al., Science 258: 1903-1910, 1992). Kdyby podobné aktivační cesty zprostředkovávaly kinázy z rodiny Src v ostatních typech buněk, mohlo by se ukázat, že kinázy rodiny Syk jsou mnohem více rozšířeny v tělesných kompartmentech mimo hematopoetický systém.

Experimentální metody

Konstrukce chimér

Celá kódující oblast lidského genu pro kinázu Lek (Koga et al., Eur. J, Immunol, 16: 1643-1646, 1986), myšího Fyn(T), (Cook and Perlmutter, New Biol, 1: 66-74, 1989, prasečího Syk (Taniguchi et al., J, Biol. Chem. 266: 15790-15796, 1991) a lidského ZAP-70 (Chán et al., Cell 71: 649-662, 1992) byla spojena s intracelulární doménou chimérického transmembránového proteinu, který se skládal z extracelulární domény CD 16, spojené s krátkým stopkovým („stalk“) segmentem a transmembránovou doménou CD7. Intracelulární doména CD7 byla zkrácena ve transferové stopovací sekvenci přidáním místa pro restriktázu Mlu. Různé kinázy byly upraveny pomocí místa Mlu s vhodným čtecím rámcem tak, aby byla možná exprese trojitého fúzovaného proteinu. Prasečí sekvence Syk se získala reverzní transkripcí a provedením PCR celkové RNA z prasečích lymfocytů užitím primerů, nesoucích vhodná restrikční místa. Podobně byly získány sekvence ZAP-70 z cDNA knihovny lidských T buněk pomocí PCR. Několik izolátů bylo paralelně sekvencováno a kódující sekvence bez mutací pro každou kinázu byly odvozeny výměnou restrikčních fragmentů. Výsledné kódující sekvence byly vloženy do expresního vektoru z viru vakcínie po směru od CD16/CĎ7 sekvencí. Lidský Syk byl izolován z cDNA knihovny zabíječských (natural killer) buněk a z buněčné knihovny Daudi užitím primerů, které odpovídaly koncovým sekvencím prasečího Syk. Sekvence „forward“ primeru je atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t (sekvence identifikačního čísla 7) a sekvence „reverze“ primeru je ege ggg gcg gcc get tta att cac cac gtc gta gta gta (sekvence identifikačního čísla 8). Po počáteční amplifíkaci, která vedla ke vzniku pásu očekávané délky, byla provedena reamplifíkace (10 cyklů) s extenzním primerem na 5' konci o složení ege ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac (sekvence identifikačního čísla 9), což umožnilo, aby byl fragment vložen do vektoru naštěpeného Mlu.

Analýza mobilizace kalcia

Buňky exprimující rekombinantní kinázy byly analyzovány průtokovou cytometrií a spektrofotometrickou analýzou užitím fluoroforu Indo-1, citlivého ke kalciu, jak popsali (Romeo a Seed, Cell 64:1037-1046. 1991, Romeo et al., Cell 68: 889-897, 1992). Krátce, buňky mutantní sublinie JRT 3.T 3.5 linie Jurkat (Weiss a Stobo, J. Exp. Med. 160: 1284-1299, 1984) byly infikovány rekombinantními viry vakcínie po dobu jedné hodiny v médiu IMDM bez séra desetinásobkem infekčního viru (moi = 10) a inkubovány po tři až devět hodin v IMDM, 10% FBS. Buňky byly sebrány centrifugám' a resuspendovány v množství 3 x 10⁶/ml v komplet-22 CZ 294909 B6 ním médiu, obsahujícím 1 mM Indo-1 acetometoxyester (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3440-3450, 1985) (Molecular Probes, Eugene, OR) a inkubovány ve 37 °C po dobu 45 minut. Z buněk obsahujících Indo-1 se vytvořila peleta a resuspendovala se v 1 x 10⁶/ml v séru bez IMDM a uložila se při teplotě místnosti v temnu. V buňkách se analyzoval volný kalciový ion simultánním měřením fialové a modré fluorescenční emise průtokovou cytometrií (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952-961, 1986). Aby se inicioval tok kalcia, byla k buněčné suspenzi přidána buď nekonjugovaná 3G8 (anti-CD16) monoklonální protilátka (v koncentraci 1 pg/ml) následovaná fragmentem F(ab')₂ kozího protimyšího IgG konjugovaného s fykoerytrinem (PE) o koncentraci 10 pg/ml v čase 0 nebo protilátka anti-CD4 konjugovaná sPE (Leu-3a, Becton Dickinson) a následovalo přidání druhé nekonjugované protilátky. Z populace buněk obsahujících PE (infikovaných), které představují 40 až 80 % všech buněk, byly sbírány histogramy poměru fialové/modré emise. Poměr fíalové/modré emise před přidáním protilátky byl použit k normalizaci počátečního poměru a stanoven roven 1.

Test cytolýzy lymfocytů

Restriktivní cytolytická linie (VH3) buněk CD8⁺ CD4 HLA B44 byla udržována v médiu IMDM s 10 % lidského séra a 100 j./ml IL-2 a byla periodicky stimulována ozářenými (3000 rad) mononukleárními buňkami haplocytu HLA B44. Buňky byly pěstovány nejméně 10 dní po stimulaci předtím, než se použily pro test cytotoxicity. Buňky byly infikovány rekombinantní vakcínii nejméně desetinásobkem infekčního množství po jednu hodinu v médiu bez séra a následně byly buňky inkubovány v úplném médiu po tři hodiny. Buňky byly sbírány centrifugací a resuspendovány na hustotu 1 x 10⁷/ml. 100 μΐ pak bylo přidáno do každé jamky mikrodestičky s dnem jamek tvaru U, přičemž jamky předem obsahovaly 100 μΐ úplného média. Buňky byly ředěny ve dvojnásobných sériových krocích. Dvě jamky pro každý vzorek neobsahovaly žádné lymfocyty, což umožnilo spontánní uvolnění chrómu a mohl být tak měřen celkový příjem chrómu. Poměrná část 10⁶ cílových buněk 3G8 10-2 (Shen et al., Mol. Immunol, 26: 959-969, 1989) byla centrifugována a pak resuspendována v 50 μΐ roztoku chromanu sodného s ⁵¹Cr (jeden mCi/ml, DuPont) a občasně míchána během hodinové inkubace ve 37 °C a pak byla třikrát opláchnuta v PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ označených buněk, resuspendovaných v médiu na hustotu 10⁵/ml. Mikrotitrační destička byla stočena při 750 x g po jednu minutu ainkubována 4 hodiny při 37 °C. Na konci inkubačního období byly buňky v každé jamce jemným pipetováním resuspendovány, byl odebrán vzorek ke stanovení celkové inkorporované radioaktivity a destička byla znovu stočena při 750 x g jednu minutu. Odebraná poměrná část 100 μΐ supernatantu se měřila na přítomnost gama záření ve scintilačním počítači. Poměr efektorových a cílových buněk byl korigován podle procenta infikovaných efektorových buněk (obvykle > 70 %).

Vytvoření mutantních kinázových chimér

Fúzovaný protein neobsahující prasečí kinázu Syk se vytvořil štěpením chiméry pomocí Stul a Notl (místo Notl leží hned vedle 3' karboxylového konce), doplněním místa Notl a vzájemným spojením konců. Výsledná sekvence spojuje prvních 298 zbytků prasečího Syk se 4 vnějšími zbytky (GPRL před terminací). Bodová mutace (K369G) ve vazebném místě pro ATP genu ZAP-70 byla vytvořena vložením dvojitého oligonukleotidového fragmentu mezi místa Balí a Earl, která leží mezi nukleotidy 1319 a 1345 vrchního řetězce sekvence popsané v Chán et al., Cell. 71: 649-662, 1992. Výsledná sekvence kóduje glycin v 369. poloze místo lysinu.

Imunoprecipitace a kinázový test

Přibližně 2 x 10⁶ buněk HeLa S3 bylo infikováno jednu hodinu v médiu DME bez séra desetinásobným nadbytkem infekčního množství rekombinantní vakcínie. Buňky byly sebrány 5 hodin po infekci, opláchnuty 2 x v PBS a lyžovány v roztoku: 1% Triton X-100, 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES pH 7,3, 5 mM EDTA, 5 mM NaF, 0,2 mM Na₃VO₄, 10 pg/ml leupeptin, 10 pg/ml

-23 CZ 294909 B6 aprotinin a 1 mM PMSF. Po desetiminutové inkubaci na ledu byla centrifugací odstraněna jádra a fúzované proteiny CD 16 byly imunoprecipitovány protilátkou BMA 209/2 a sefarózou s proteinem A. Sefaróza s nachytaným fúzovaným proteinem byly třikrát propláchnuta lyzovacím pufrem a nakonec promyta 20 mM Hepes pH 7,3. Ke každému vzorku bylo přidáno 10 μΐ kinázového pufru (20 mM Hepes pH 7,3, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂) s deseti pCi [gama-³²P] ATP (> 3000 Ci/mmol). Reakce se inkubovaly 10 minut při teplotě místnosti a ukončily se přidáním 20 μΐ 2 x nanášecího pufru (4% SDS, 100 mM Tris, pH 6,8, 20% glycerol, 10% betamerkaptoethanol). Vzorky byly 3 minuty povařeny a pak byla poměrná množství nanesena na 4 až 15% gradientový gel. Kinázové testy s rozpustným peptidem jako substrátem odpovídajícím polohám 6 až 20 z cdc2, ve kterém byl tyr 20 nahražen lysinem, byly provedeny podle doporučení výrobce (UBI).

Analýza fosforylace tyrosinu v proteinu pomocí imunoblotu

Buňky typu 3.5 bez TCR byly infikovány zásobním roztokem rekombinantního viru (desetinásobkem infekčního množství) po jednu hodinu. Pak byly buňky inkubovány v 37 °C po dobu 8 až 12 hodin, centrifugovány, promyty a resuspendovány v Iscoveho médiu bez séra na hustotu 10⁷ buněk/ml. Poměrná množství buněk byla inkubována s mAb anti-CD16 (3G8, Medarex nebo BMA209/2, Behringwerke) v množství 1 pg protilátky na 2 až 3 x 10⁶ buněk. Stimulované vzorky byly dále inkubovány s 3 až 5násobným nadbytkem afinitně přečištěné protilátky protimyší IgGl (Southern Biotechnology) po dobu 5 minut. Dále byly buňky ošetřeny podle Secrist et al., J. Biol, Chem. 268: 5886-5893, 1993, s drobnými modifikacemi. Inkubace byly ukončeny přidáním SDS na konečnou koncentraci 1 % a vzorky byly 3 minuty povařeny. DNA byla roztrhána sonikací po dobu jedné minuty užitím Heat Systems Ultrasonics lne., byl přidán 2x nanášecí pufr a poměrná množství odpovídající 10⁵ až 2,5 x 10⁵ buněk byla rozdělena na polyakrylamidovém gelu a proteiny byly přeneseny na nitrocelulózu (Schleicher a Schuell BA45) polosuchým elektrob loto váním (Hoefer). Nitrocelulózové filtry byly blokovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris s 0,05% Tween-20 (TBST) a 1,5% kuřecí vaječný albumin (Sigma), opláchnuta v TBST a přeneseny do roztoku obsahujícího protilátku 4G10 (UBI) proti fosfotyrosinu v ředění 1:10 000 a inkubovány 1 až 2 hodiny ve 20 °C. Po několika promytích v TBST byly filtry inkubovány jednu hodinu v TBST a roztoku protimyší protilátka konjugované s křenovou peroxidázou v ředění 1:5000. Pásy fosforylovaných proteinů byly detekovány chemiluminiscencí (ECL, Amersham). Expoziční čas byl mezi 2 sekundami a 5 minutami.

Konstrukce chimér spojujících proteintyrosinovou kinázu a lidský IgGl

Mohou být vytvořeny chimérické molekuly, které obsahují extracelulární doménu protilátky molekulově specifickou pro cílovou buňku a intracelulární doménu tyrosin-proteinkinázy (např. kinázy popisované zde). Aby se vytvořila taková molekula, jsou připraveny sekvence těžkého řetězce lidského IgGl spojením sekvencí v doméně C_H3 s fragmentem cDNA odvozeným ze 3' konce transmembránové formy protilátkové mRNA. 3' koncový fragment se získá polymerázovou řetězovou reakcí za použití tonzilámí knihovny cDNA jako substrátu, a oligonukleotidů majících sekvence:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sekvence identifikačního čísla 1) a

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (sekvence identifikačního čísla 2), odpovídající koncům 5' a 3' požadovaných fragmentů DNA. 5' oligonukleotid je komplementární k místu v doméně C_H1 lidského IgGl a 3' oligonukleotid je komplementární místu hned vedle 5' sekvencí kódujících transmembránovou doménu. Produkt PCR je štěpen BstXI a BamHI a vložen mezi BstXI a BamHI místa semisyntetického genu pro protilátku IgGl nesoucího

-24CZ 294909 B6 variabilní a konstantní oblasti. Po vložení BstXI do fragmentu BamHI jsou amplifíkované části konstrukci výměnou restrikčního fragmentu umístěny po směru k místu Smál v C_H3, takže z reakce PCR se získává pouze část mezi místem Smál a 3' oligonukleotidem.

Aby se vytvořil lidský chimérický receptor IgGl, je gen těžkého řetězce, končící v místě BamHI, spojen standardními technikami s intracelulární doménou požadované kinázy. Hladina exprese chimérického receptoru může být určována průtokovou cytometrií. Zvýšení v expresi může být dosaženo současnou expresí plazmidu, kódujícího cDNA lehkého řetězce protilátky.

Aby se vytvořila jednoduchá transkripční jednotka, která by umožnila oběma řetězcům, těžkému i lehkému, aby byly exprimovány zjednoho promotoru, vytvoří se plazmid kódující bicistronickou mRNA ze sekvencí, kódujících těžký a lehký řetězec a z 5' nepřekládané části mRNA kódující protein o velikosti 78 kD regulovaný glukózou, jinak známý jako grp78 nebo BiP. Sekvence grp78 se získají metodou PCR z lidské genomové DNA za použití primerů o sekvencích:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (sekvence identifikačního čísla 3) a

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (sekvence identifikačního čísla 4) na koncích 5' a 3'. Polymerázové řetězové reakce s těmito oligonukleotidy se provádějí v přítomnosti 10% dimethylsulfoxidu. Fragment získaný PCR je štěpen Notl a HincII a vložen mezi místa Notl a Hpal po směru od sekvence kódující lidský IgGl. Sekvence kódující cDNA lehkého řetězce kappa lidského IgG jsou poté vloženy po směru od zaváděcí sekvence (leader) grp78 za použití místa HincII a dalšího místa ve vektoru. Expresní plazmid, který je výsledkem těchto manipulací se skládá z genu semisyntetického těžkého řetězce, následovaného zaváděcími sekvencemi grp78, následováno sekvencemi cDNA lehkého řetězce kappa, následováno polyadenylačními signály získanými z fragmentu DNA SV40. Již dříve jsme ukázali, že transfekce buněk COS tímto expresním plazmidem vedla k výrazně zvýšené expresi determinant těžkých řetězců ve srovnání s transfekcí plazmidem kódujícím samotné determinanty těžkých řetězců.

Aby se vytvořil bicistronický gen obsahující chiméru těžký řetězec/receptor a lehký řetězec, protisměrné sekvence těžkého řetězce se mohou nahradit jakýmkoliv genem chiméry těžký řetězec/receptor popsaným zde.

Jakmile jsou jednou zkonstruovány, chiméry IgG-tyrosinkinázy se mohou klonovat do expresního vektoru, zavést do hostitelské buňky a testovat kterýmkoliv z testů popsaným zde (např. imobilizaci kalcia nebo cytolytickým testem).

Konstrukce chimér CD4-tyrosinkináza

Lze vytvořit chimérické molekuly, které obsahují extracelulámí doménu molekuly CD4 a intracelulární doménu tyrosin-proteinkinázy (např. těch kináz popsaných zde). Pro vytvoření takové molekuly je sekvence kódující tyrosinkinázu (např. cDNA) izolována (např. jak je popsáno výše). Tato sekvence je pak spojena s extracelulámí doménou upravené formy CD4, která má místo BamHI právě proti směru od domény procházející membránou, standardními technikami (Aruffo et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577, 1987, Zettlmeissl et al. DNA Cell. Biol, 9: 347-353, 1990). Aby se vytvořil fúzovaný protein, místo BamHI se může vložit do sekvence ve vhodné pozici (opět standardními technikami). Fúzované geny jsou zavedeny do expresního plazmidu viru vakcínie (jak je popsáno zde), a vloženy do genomu kmene WR vakcínie homologní rekombinací a selekcí na růst v mykofenolové kyselině (Falkner et al., J. Virol. 62: 18491854, 1988, Boyle et al., Gene 65: 123-128, 1988). K ověření exprese fúzovaných proteinů CD4/tyrosinkináza rekombinantní vakcínie na buněčném povrchu je potom užita průtoková

-25 CZ 294909 B6 cytometrie. Imunoprecipitace buněk infikovaných rekombinantami vakcínie se užívá k potvrzení výsledků (jak je popsáno výše).

Účinnost chimér CD4 se může testovat kterýmkoliv testem mobilizace kalcia nebo cytolýzy popsanými zde. V jednom zvláštním příkladu je vytvořen modelový systém cíkefektor založený na rozpoznání obalového komplexu gpl20/gp41 HIV receptorem CD4. HeLa buňky jsou infikovány rekombinantním virem vakcínie exprimujícím gpl20/gp41 (Chakrabarti et al., Nátuře 320: 535-537, 1986, Earl et al., J. Virol. 64: 2448-2451, 1990) a značeny ⁵¹Cr. Označené buňky jsou inkubovány s buňkami z linií lidských alospecifických (CD8⁺CD4“) cytotoxických T lymfocytů, které byly infikovány rekombinantami vakcínie exprimujícími chiméru CD4-tyrosinkináza, a pak testovány na specifickou lýzi.

Aby se ověřila možnost, že infekce vakcínií může podporovat rozpoznávací CTL, podobné cytolytické pokusy se provádějí s cílovými buňkami, infikovanými rekombinantami vakcínie exprimujícími formu CD 16 spojenou s fosfatidylinositolem (CD16_Pi) a značenými ⁵¹Cr, a s CTL infikovanými kontrolními rekombinantami, které exprimují chiméry CD16.

V jiném příkladu jsou neutrofilní granulocyty, které mají v oběhu velmi krátkou dobu života (asi 4 hodiny) a jsou silně cytolytické, atraktivními buňkami pro expresi chimér CD4-tyrosinkináza. Infekce neutrofilů HIV pravděpodobně nepovede k uvolnění viru a nadbytek těchto buněk (nejpočetnější skupina leukocytů) by měl umožnit obranu hostitele. Jinou atraktivní možností pro hostitelské buňky jsou zralé T buňky, což je populace v současnosti přístupná genové manipulaci retrovirem (Rosenberg, Sci. Am. 262: 62-69, 1990). Pomocí rekombinantního IL-2 může být populace T buněk rozmnožena v kultuře relativně snadno a taková pomnožená populace má typicky omezenou dobu života po opětné infuzi (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 570-578, 1990).

Za odpovídajících podmínek rozpoznávání HIV buňkami exprimujícími chiméry CD4 by mělo také poskytovat mitogenní stimul dovolující možnost, aby vybavená buněčná populace dynamicky odpovídala virové zátěži. Ačkoliv jsme se zde zaměřili na chování fúzovaných proteinů v cytolytických T lymfocytech, exprese chimér v pomahačských lymfocytech by mohla poskytnout HlVem mobilizovaný zdroj cytokinů, který by působil proti kolapsu subpopulace pomahačských buněk při AIDS. Současný popis několika schémat pro genetické manipulování rezistence k infekci v krocích jiných než je penetrace viru (Friedman et al., Nátuře 335:452-454. 1988, Green et al., Cell 58: 215-223, 1989, Malim et al., Cell 58: 205-214, 1989, Trono et al., Cell 59: 113-120, 1989, Buonocore et al., Nátuře 345: 625-628, 1990) předpokládá, že buňky nesoucí chiméry CD4 by byly upraveny tak, aby zastavily produkci viru tím, že by exprimovaly vhodné agens s intracelulárním místem účinku.

Schopnost přenášet signály T lymfocytům prostřednictvím autonomních chimér také poskytuje možnost regulovat lymfocyty genově manipulované retrovirem in vivo. Vazebné stimuly zprostředkované např. specifickými protilátkami IgM upravenými tak, že odstraní domény vážící komplement, umožní takovým lymfocytům zvýšit jejich počet in šitu, zatímco ošetření podobnými specifickými protilátkami IgG (např. rozpoznávající variaci aminokyselin vloženou genovými manipulacemi do chimérického řetězce) by mohl selektivně likvidovat manipulovanou populaci. Už dříve jsme stanovili, že protilátky IgM anti-CD4 nevyžadují dodatečné obsazení vazeb ktomu, aby mobilizovaly kalcium v buňkách. Jurkat exprimujících chiméry CD4:zeta. Možnost regulovat buněčné populace, aniž by se musely opakovaně množit mimo tělo, podstatně rozšíří rozsah a účinnost současného využití geneticky upravených T buněk.

Kombinační kontrola kinázových chimér a chimérických receptorů CD28

Průkaz toho, že některé kinázové chiméry (jako např. ZAP-70 a kinázové chiméry rodiny Src) mohou fungovat jenom ve vzájemném souladu, aby řídily cytolytickou likvidaci, poskytuje příležitost řídit cytolytickou odpověď tím, že se použijí vhodné páry kinázových chimér. Tento

-26CZ 294909 B6 přístup je zvláště výhodný v oblasti protinádorových terapií, protože extracelulární domény chimérických párů mohou být upraveny tak, aby rozpoznaly a vázaly mnohonásobné determinanty na povrchu nádorových buněk. Jedině po navázání každé z mnohonásobných determinant (tedy poté, co jsou zahrnuty např. ZAP-70 a kinázy z rodiny Src) je ovlivněna silná cytolytická odpověď. Tento přístup zvyšuje terapeutickou specifičnost tím, že snižuje pravděpodobnost a frekvenci destrukce buněk jiných než nádorových.

V jednom zvláštním případu dvojice chimér obsahuje dvě různé extracelulární domény, z nichž každá rozpoznává určitou antigenní charakteristiku cílového nádoru. Taková dvojice chimér rozpoznává dvě nepříbuzné molekuly na povrchu nádoru (např. dva odlišné proteinové markéry na buněčném povrchu), nebo dvojice rozpoznává dvě odlišné vlastnosti téže molekuly (např. antigenní protein a antigenní sacharid asociovaný stýmž proteinem na buněčném povrchu). Příklady nádorových antigenů zahrnují bez omezení kterýkoliv z mnohých sacharidů (např. Le^y, sialyl-Le^y, Le^x a sialyl-Le^x), karcinomembryonický antigen, CD40, modifikovaný CD44, alfafetoprotein, antigeny T a Tn, tenascin, a receptory růstového faktoru (např. HER2/neu).

Navíc, protože bylo ukázáno, že aktivace T buněk je zvýšena při zapojení CD28, vynález také zahrnuje terapeutické buňky exprimující sady chimérických receptorů, z nichž jeden zahrnuje intracelulární doménu CD28 a další (nebo více) obsahuje kteroukoliv intracelulámí doménu tyrosin-proteinkináz popsaných zde. V daném souboru chimérických receptorů mohou být extracelulární domény shodné (např. všechny jsou odvozeny z proteinu CD4 a tudíž všechny rozpoznávají HIV nebo buňky infikované HIV) nebo, jak bylo diskutováno výše, každá je navržena tak, aby rozpoznala odlišnou cílovou molekulu na povrchu buňky nebo patogenu.

Tato metoda kombinované kontroly může být rozšířena na jakýkoliv počet spolupracujících chimérických receptorů (např. může být užita v kombinaci se ZAP-70 a chimérami rodiny Src nebo může být užita kombinace CD28, chiméry ZAP-70 a chiméry z rodiny kináz Src, což umožní další kombinovanou kontrolu). Navíc se tato dá využít k regulaci kteréhokoliv léčebného způsobu předkládaného vynálezu.

Chiméry CD28 jsou konstruovány a exprimovány způsobem popsaným zde. Sekvence CD28 je z Aruffo a Seed (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577, 1987). V tomto odkazuje také popis intracelulárních a transmembránových domén CD28. Příklad chiméry nesoucí intracelulámí doménu CD28 je vyjeven v Romeo et al., (Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol. LVU: 117-125, 1992).

Další ztělesnění

Aby se vytvořily další chiméry obsahující intracelulámí sekvence proteinkináz, mohou se opatřit restrikčním místem v pozici právě před vybranou extracelulární doménou sekvence cDNA nebo genomové sekvence kódující extracelulární doménu receptorů. Fragment extracelulární domény zakončený v restrikčním místě pak může být připojen k sekvencím proteinkinázy. Typické extracelulární domény se mohou odvodit z receptorů, které rozpoznávají komplement, sacharidy, virové proteiny, bakterie, prvoky a vícebuněčné parazity nebo jimi indukované proteiny. Podobně se mohou připojit k sekvencím proteinkináz ligandy nebo receptory exprimované patogeny nebo nádorovými buňkami, což nasměruje imunitní odpovědi proti buňkám nesoucím receptory rozpoznávající tyto ligandy. Aby se identifikovaly nejmenší sekvence proteinkinázy nezbytné pro cytolýzu, připraví se série delečních mutant standardními technikami, ve kterých je postupně větší část intracelulámí kinázové domény odstraněna. Účinnost takových delečních mutant je pak testována v jakémkoliv z testů popsaných zde. Užitečné intracelulámí domény proteinkinázy Syk zahrnují například aminokyseliny 336 až 628 ze sekvence prasečího Syk a aminokyseliny 338 až 630 z lidské sekvence Syk. Užitečné intracelulární domény kináz z rodiny Src jsou například domény SH2 a SH3.

-27CZ 294909 B6

Ačkoliv byl vynález popsán ve spojení se specifickými ztělesněními, rozumí se samosebou, že může být dále modifikován a tato přihláška zamýšlí pokrýt také odlišnosti, různá využití nebo adaptace vynálezu a zahrnuje také takové odchylky od současného objevu, jak přicházejí v oboru, kterého se vynález týká a jak mohou být aplikovány na podstatné charakteristické rysy výše uvedené, jak následuje v rámci připojených patentových nároků.

Průmyslová využitelnost

Tyrosin-proteinkinázové chiméry podle předkládaného vynálezu jsou schopny modulovat funkci imunitního systému, takže je možné specificky rozpoznávat a likvidovat buňky infikované infekčním agens, infekční agens samotné, nádorovou buňku nebo také buňku vzniklou autoimunitním procesem (autoimunní buňku). Dále jsou tyto chiméry schopny nasměrovat cytotoxické T lymfocyty tak, aby specificky rozpoznávaly a lyžovaly buňky exprimující obalové proteiny HIV. Vynález proto poskytuje novou protinádorovou léčbu, a také léčbu nemocí, jako je AIDS (syndrom získaného deficitu imunity), způsobovaný virem HIV.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Buňka imunitního systému, která obsahuje první proteinový chimérický receptor navázaný na membránu, obsahující a) intracelulámí část tyrosin-proteinkinázy z rodiny kináz Syk, která je schopna předat buňce imunitního systému signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo cílového infekčního agens vázaného na receptor a b) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, a druhý proteinový chimérický receptor navázaný na membránu, obsahující a) extracelulámí část, která je schopna specifické vazby na cílovou buňku nebo cílové infekční agens, a b) intracelulámí část, odvozenou od CD28, čímž je každá z těchto buněk imunitního systému schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens a kde první a druhý chimérický receptor jsou exprimovány těmito buňkami imunitního systému.
2. Buňka podle nároku 1, kde tyrosin-proteinkináza je Syk.
3. Buňka podle nároku 2, kde intracelulámí část obsahuje aminokyseliny 336 až 628 prasečí Syk nebo aminokyseliny 338 až 630 lidské Syk.
4. Buňka podle nároku 1, kde každá buňka imunitního systému exprimuje třetí proteinový chimérický receptor vázaný na membránu, přičemž třetí chimérický receptor obsahuje a) intracelulární část druhé tyrosin-proteinkinázy, která je schopna předat buňce imunitního systému signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo infekčního agens vázaného na receptor a b) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, čímž je každá z buněk imunitního systému schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens.
5. Buňka podle nároku 4, kde jedna z tyrosin-proteinkináz je členem rodiny kináz Syk a druhá tyrosin-proteinkináza je členem rodiny kináz Src.
6. Buňka podle nároku 4, kde jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá tyrosin-proteinkináza je Fyn.
7. Buňka podle nároku 4, kde jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá tyrosin-proteinkináza je Lek.

-28CZ 294909 B6
8. Buňka podle nároku 6 nebo 7, kde část ZAP-70 obsahuje Tyr v poloze 369 lidského ZAP-70.
9. Buňka podle nároku 1 nebo 4, kde buňky imunitního systému jsou vybrány ze skupiny obsahující: a) T lymfocyty, b) cytotoxické T lymfocyty, c) zabíječské buňky, d) neutrofily, e) granulocyty, f) makrofágy a g) žírné buňky.
10. Buňka podle nároku 1, kde cílové infekční agens je virus deficitu imunity.
11. Buňka podle nároku 10, kde extracelulámí část každého z chimérických receptorů obsahuje část CD4, která váže obal HIV.
12. Buňka podle nároku 1, kde buňky imunitního systému likvidují cílovou buňku nebo cílové infekční agens vázané na receptor cytolýzou.
13. Buňka podle nároku 1 nebo 4, kde vazba na receptor je nezávislá na hlavním histokompatibilním systému.
14. Buňka podle nároku 1 nebo 4, kde extracelulámí část obsahuje část receptoru vážící ligand, část ligandu vážící receptor, část protilátky vážící antigen nebo jejich funkční deriváty.
15. Použití buněk imunitního systému pro výrobu léčiva pro vyvolání buněčné imunitní odpovědi savce, kde buňky imunitního systému obsahují první proteinový chimérický receptor navázaný na membránu, obsahující a) intracelulární část tyrosin-proteinkinázy z rodiny kináz Syk, která je schopna předat buňce imunitního systému signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo cílového infekčního agens vázaného na receptor, b) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, a druhý proteinový chimérický receptor navázaný na membránu, obsahující a) extracelulámí část, která je schopna specifické vazby na uvedenou cílovou buňku nebo cílové infekční agens, b) intracelulární část odvozenou z CD28, čímž je každá z buněk imunitního systému schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens a kde první a druhý chimérický receptor jsou exprimovány těmito buňkami imunitního systému.
16. Použití buněk podle nároku 15, kde cílová buňka je hostitelská buňka infikovaná infekčním agens, nádorová nebo rakovinná buňka nebo buňka vzniklá autoimunitním mechanizmem.
17. Použití buněk podle nároku 15, kde tyrosin-proteinkináza je Syk.
18. Použití buněk podle nároku 17, kde intracelulární část obsahuje aminokyseliny 336 až 628 prasečí Syk nebo aminokyseliny 338 až 630 lidské Syk.
19. Použití buněk podle nároku 15, kde každá buňka imunitního systému exprimuje třetí proteinový chimérický receptor vázaný na membránu, přičemž třetí chimérický receptor obsahuje

a) intracelulární část druhé tyrosin-proteinkinázy, která je schopna předat buňce imunitního systému signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo cílového infekčního agens vázaného na receptor a

b) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, čímž je každá z buněk imunitního systému schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens.
20. Použití buněk podle nároku 19, kde jedna z tyrosin-proteinkináz je členem rodiny kináz Syk a druhá tyrosin-proteinkináza je členem rodiny kináz Src.

-29CZ 294909 B6
21. Použití buněk podle nároku 19, kde jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá tyrosin-proteinkináza je Fyn.
22. Použití buněk podle nároku 19, kde jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá tyrosin-proteinkináza je Lek.
23. Použití buněk podle nároku 21 nebo 22, kde část ZAP-70 obsahuje Tyr v poloze 369 lidského ZAP-70.
24. Použití buněk podle nároku 15 nebo 19, kde buněčná odpověď je nezávislá na hlavním histokompatibilním systému.
25. Použití buněk podle nároku 15 nebo 19, kde buňky imunitního systému jsou vybrány ze skupiny obsahující: a) T lymfocyty, b) cytotoxické T lymfocyty, c) zabíječské buňky, d) neutrofily, e) granulocyty, f) makrofágy a g) živné buňky.
26. Použití buněk podle nároku 15, kde cílové infekční agens je virus deficitu imunity.
27. Použití buněk podle nároku 24, kde extracelulámí část každého z chimérických receptorů obsahuje část CD4, která váže obal HIV.
28. Použití buněk podle nároku 15, kde buňky imunitního systému likvidují cílovou buňku nebo cílové infekční agens vázané na receptor cytolýzou.