CZ295115B6 - Konstrukt DNA měnící expresi zacíleného genu v buňce, způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce a izolovaná kultivovaná buňka obratlovce - Google Patents

Konstrukt DNA měnící expresi zacíleného genu v buňce, způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce a izolovaná kultivovaná buňka obratlovce Download PDF

Info

Publication number
CZ295115B6
CZ295115B6 CZ19963258A CZ325896A CZ295115B6 CZ 295115 B6 CZ295115 B6 CZ 295115B6 CZ 19963258 A CZ19963258 A CZ 19963258A CZ 325896 A CZ325896 A CZ 325896A CZ 295115 B6 CZ295115 B6 CZ 295115B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
cells
cell
exon
construct
Prior art date
Application number
CZ19963258A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ325896A3 (en
Inventor
Douglas A. Treco
Michael W. Heartlein
Richard F. Selden
Original Assignee
Transkaryotic Therapies, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22918596&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ295115(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Transkaryotic Therapies, Inc. filed Critical Transkaryotic Therapies, Inc.
Publication of CZ325896A3 publication Critical patent/CZ325896A3/cs
Publication of CZ295115B6 publication Critical patent/CZ295115B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
    • C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Konstrukt DNA měnící expresi zacíleného genu v buňce, když je tento konstrukt DNA homologně rekombinován s cílovým místem v chromosomální DNA buňky, který obsahuje a) zacílující sekvenci homologní vůči cílovému místu; b) exogenní regulační sekvenci; c) exon; a d) nepárové donorové místo sestřihu u 3' konce exonu; přičemž po homologní rekombinaci zacílující sekvence s cílovým místem obsahuje chromosomální DNA buňky, kromě všech endogenních exonů zacíleného genu, exon pocházející z konstruktu, a přičemž zacílený gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, interleukinu 1, 2, 3, 6, 11, 12, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, FSH-.beta., TGF-.beta., TNF, glukagonu, faktoru-2 a -7 růstu kostí, TSH-.beta., protein kinázy C, urokinázy, antitrombinu III, DNAsy, .alfa.-galktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, VII, X a XIII antagonisty IL-2 a rozpustného CD4. Způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce a izolovaná kultivovaná buňka obratlovce, v jejímž genomu je zabudována transkripční jednotka pocházející z konstruktu uvedeného výše.ŕ

Description

Vynález se týká konstruktu DNA schopného měnit expresi zacíleného genu po vložení do chromozomální DNA buňky, způsobu in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce a izolované kultivované homologně rekombinantní buňky obratlovce. Vynález se zejména uplatňuje při zacílení genu erythropoietinu v savčích, například lidských, buňkách transfekcí těchto buněk za použití výše uvedeného konstruktu.
Dosavadní stav techniky
Současné přístupy k léčení chorob podávání terapeutických proteinů zahrnují in vitro produkci terapeutických proteinů pro konvenční farmaceutickou dodávku (například formu intravenosních, subkutánních nebo intramuskulárních injekcí) a nedávno také genovou terapii.
Proteiny, na něž je zaměřen terapeutický zájem, jsou obecně produkovány zavedením exogenní DNA kódující daný protein, který je předmětem terapeutického zájmu, do příslušných buněk. Tak například se exogenní DNA kódující požadovaný terapeutický protein zavede do buněk, jako jsou imortalizované buňky, ve vektoru, jako plazmidu, z něhož je kódovaný protein exprimován. Dále bylo navrženo modifikovat endogenní buněčné geny a jejich expresi genových zacílením (viz například patent US 5 272 071, WO 91/06666, WO 91/06667 a WO 90/11354.
V současné době dostupné přístupy ke genové terapii používají infekčních vektorů, jako retrovirových vektorů, které zahrnují genetický materiál, který má být exprimován. Také přístupy mají svá omezení, jak je potenciál vytvoření replikačně kompetentního viru během produkce viru; rekombinací mezi terapeutickým virem a endogenními retrovirovými genomy, potenciální tvorbu infekčních činidel s novými buněčnými specificitami, hostitelská rozmezí nebo zvýšenou virulenci a ctotoxicitu; nezávislou integraci do velkého počtu buněk, zvýšení rizika tumorigenní inserční příhody; omezenou klonovací kapacitu v retroviru (která omezuje terapeutickou aplikovatelnost) a krátkou životnost in vivo exprese produktu, který je předmětem zájmu. Lepší přístup k zajištění genových produktů, zejména takový přístup, který by se vyhýbal omezením a rizikům spojeným s metodami, které jsou v současné době k dispozici, by byl velmi cenný.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je v základním provedení 1) konstrukt DNA měnící expresi zacíleného genu v buňce, když je tento konstrukt DNA homologně rekombinován s cílovým místem v chromozomální DNA buňky, který obsahuje
a) zacílující sekvenci homologní vůči cílovému místu;
b) exogenní regulační sekvenci;
e) exon;a
d) nepárové donorové mésti sestřihu u 3' konce exonu;
přičemž po homologní rekombinací zacílující sekvence s cílovým místem obsahuje chromozomální DNA buňky, kromě všech endogenních exonů zacíleného genu, exon pocházející z konstruktu, a přičemž zacílený gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z inter feronu gamma interleukinu 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, protein kinázy C, urikinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
Výhodná provedení konstruktu definovaného výše zahrnují
2) Konstrukt DNA podle provedení 1), kde exon pocházející z konstruktu se skládá z odlišné sekvence DNA, než je sekvence DNA prvního endogenního exonu zacíleného genu.
3) Konstrukt DNA podle provedení 1), v němž jsou po homologní rekombinací zacílující sekvence s cílovým místem prvky b) až d) umístěny před místem iniciace transkripce zacíleného genu.
4) Konstrukt DNA podle provedení 3), kde se exon skládá z odlišné sekvence DNA, než je sekvence DNA prvního exonu zacíleného genu.
5) Konstrukt DNA podle provedení 3), kde zacílený gen kóduje alfa-galaktosidázu.
6) Konstrukt DNA podle provedení 3), kde exon pocházející z konstruktu je stejný jako první exon genu FSH-β.
7) Konstrukt DNA podle provedení 6), kde získaná buňka exprimuje α-podjednotku lidského glykoproteinu.
8) Konstrukt DNA podle provedení 6), kde buňka exprimuje gen α-podjednotky lidského glykoproteinu pod kontrolou exogenního promotoru.
9) Konstrukt DNA podle provedení 3), kde zacílený gen kóduje faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF).
10) Konstrukt DNA podle provedení 9), kde exon pocházející z konstruktu kóduje prvních 50 aminokyselin prekurzorového proteinu faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF).
11) Konstrukt DNA podle provedení 9), kde exon pocházející z konstruktu kóduje sekvenci obsahující funkční signální peptid.
12) Konstrukt DNA podle provedení 3), kde zacílený gen kóduje faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF).
13) Konstrukt DNA podle provedení 12), kde exon pocházející z konstruktu kóduje prvních 13 aminokyselin signálního peptidu faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF).
14) Konstrukt DNA podle provedení 1), v němž jsou po homologní rekombinací zacílující sekvence s cílovým místem prvky b) až d) umístěny před místem iniciace transkripce zacíleného genu, a v němž exogenní regulační sekvence je regulační sekvencí genu adenoviru, regulační sekvencí genu kolagenu, regulační sekvencí genu aktinu, regulační sekvencí genu HMG-CoA reduktázy nebo regulační sekvencí genu EF-la.
-2CZ 295115 B6
Předmětem vynálezu (provedení 15)) je dále způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupně
a) získání buňky, jejíž genom zahrnuje
i) zacílený gen obsahující endogenní regulační oblast, a ii) cílové místo;
b) získání konstruktu DNA podle provedení 1;
c) transfekce buňky konstruktem DNA podle b) za vzniku transfekované buňky;
d) udržování transfekované buňky za podmínek vhodných pro homologní rekombinaci za vzniku homologně rekombinantní buňky, jejíž genom obsahuje exogenní regulační sekvenci, exon pocházející z konstruktu a donorové místo sestřihu pocházející z konstruktu, kromě všech endogenních exonů zacíleného genu; a
e) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro transkripci pod kontrolou exogenní regulační sekvence za vzniku transkriptu exonu pocházejícího z konstruktu, zacíleného genu a jakékoliv sekvence ležící mezi exonem pocházejícím z konstruktu a zacíleným genem přičemž RNA transkriptu odpovídajícího donorovému místu sestřihu pocházejícímu z konstruktu orientuje sestřih do akceptorového místa sestřihu v transkriptu, která odpovídá místo v zacílujícím genu, a přičemž zacílený gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urokinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
Ve výhodném provedení 16) je předmětem vynálezu způsob podle provedení 15), jehož podstata spočívá v tom, že dále zahrnuje
f) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro sestřih a translace transkriptu; a
g) potvrzení, že byl vyroben translační produkt tohoto transkriptu.
Předmětem vynálezu je dále (provedení 17)) způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupně.
a) získání buňky, jej íž genom zahrnuj e
i) zacílený gen obsahující endogenní regulační oblast, a ii) cílové místo;
b) získání konstruktu DNA podle provedení 3;
c) transfekce buňky konstruktem DNA za vzniku transfekované buňky;
d) udržování transfekované buňky za podmínek vhodných pro homologní rekombinaci za vzniku homologně rekombinantní buňky, jejíž genom obsahuje exogenní regulační sekvenci, exon pocházející z konstruktu a donorové místo sestřihu pocházející z konstruktu, která jsou
-3 CZ 295115 B6 všechny umístěny podle směru exprese před endogenním místem iniciace transkripce zacíleného
e) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro transkripci pod kontrolou exogenní regulační sekvence za vzniku transkriptu exonu pocházejícího z konstruktu, zacíleného genu a jakékoliv sekvence ležící mezi exonem pocházejícím z konstruktu a zacíleným genem, přičemž RNA transkriptu odpovídajícího donorovému místu sestřihu pocházejícímu z konstruktu orientuje sestřih do akceptorového místa sestřihu v transkriptu, které odpovídá místu vzacílujícím genu, a přičemž zacílený gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urikinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
Ve výhodném provedení 18) je předmětem vynálezu způsob podle provedení 17), jehož podstata spočívá v tom, že dále zahrnuje
f) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro sestřih a translaci transkriptu; a
g) potvrzení, že byl vyroben translační produkt tohoto transkriptu.
Předmětem vynálezu je dále také (provedení 19)) způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupně
a) získání buňky, jejíž genom zahrnuje
i) zacílený gen obsahující endogenní regulační oblast, a ii) cílové místo;
b) získání konstruktu DNA podle provedení 1;
c) transfekce buňky konstruktem DNA za vzniku transfekované buňky;
d) udržování transfekované buňky za podmínek vhodných pro homologní rekombinací za vzniku homologně rekombinantní buňky, jejíž genom obsahuje exogenní regulační sekvenci, exon pocházející z konstruktu a donorové místo sestřihu pocházející z konstruktu, které jsou všechny umístěny podle směru exprese před endogenním místem iniciace transkripce zacíleného genu;a
e) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro transkripci pod kontrolou exogenní regulační sekvence za vzniku transkriptu exonu pocházejícího z konstruktu, zacíleného genu a jakékoliv sekvence ležící mezi exonem pocházejícím z konstruktu a zacíleným genem, přičemž RNA transkriptu odpovídajícího donorovému místu sestřihu pocházejícímu
f) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro sestřih a translaci transkriptu; a
g) potvrzení, že byl vyroben translační produkt tohoto transkriptu.
Předmětem vynálezu je dále také (provedení 21)) kultivovaná buňka obratlovce, a jejímž genomu je zabudována transkripční jednotka pocházející z konstruktu podle provedení 1, přičemž tato transkripční jednotka obsahuje exogenní regulační sekvenci, exogenní exon a donorové místo sestřihu u 3' konce exogenního exonu, přičemž všechny tyto prvky jsou umístěny podle směru exprese před endogenním místem iniciace transkripce endogenního genu a donorové místo sestřihu je operativně připojené k endogennímu akceptorovému místu sestřihu druhého endogenního exonu endogenního genu, a přičemž endogenní gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 1, interleukinu 2, Interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urokinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
Předmětem vynálezu je dále také (provedení 22)) izolovaná kultivovaná buňka obratlovce, v jejímž genomu je zabudována transkripční jednotka pocházející z konstruktu podle provedení 3, přičemž tato transkripční jednotka obsahuje exogenní regulační sekvenci, exogenní exon a donorové místo sestřihu u 3' konce exogenního exonu, donorové místo sestřihu je operativně připojeno k endogennímu akceptorovému místu sestřihu druhého endogenního exonu endogenního genu, buňka obsahuje, kromě všech endogenních exonů přítomných v endogenním genu, exogenní exon a přičemž endogenní gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urokinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
Ve výhodném provedení 23) je předmětem vynálezu kultivovaná buňka obratlovce podle provedení 22), zvolená ze souboru sestávajícího z buňky TH1080, buňky HeLa a derivátu buněk HeLa, buňky rakoviny prsu MCF-7, leukemické buňky K-562, buňky karcinomu KB, buňky karcinomu vaječníků 2780AD, Rajiho buňky, Jurkatovy buňky, Namalwovy buňky, buňky HL-60, Daudiho buňky, buňky RPMI 8226, buňky U-937, buňky Bowesova melanomu, buňky sublinie WI-38VA13 2R4 a buňky MOLT-4.
Ve výhodném provedení 24) je předmětem vynálezu kultivovaná buňka obratlovce podle provedení 22), kde exogenní regulační sekvence je regulační sekvencí genu adenoviru, regulační sekvencí genu kolagenu, regulační sekvencí genu aktinu, regulační sekvencí genu imunoglobulinu, regulační sekvencí genu HMG-CoA reduktázy nebo regulační sekvencí genu EF-la.
V dalším výhodném provedení 25) je předmětem vynálezu kultivovaná buňka obratlovce podle provedení 21), která je potomkem buňky původně transfekované konstruktem podle provedení 1).
-5 CZ 295115 B6
V dalším výhodném provedení 26) je předmětem vynálezu kultivovaná buňka obratlovce podle provedení 22), která je potomkem buňky původně transfekované konstruktem podle provedení 3).
Vynález se týká zlepšených metod in vitro produkce terapeutických proteinů a produkce a dodávky terapeutických proteinů genovou terapií. Při způsobu podle vynálezu se exprese požadovaného zacíleného genu v buňce (tj. požadovaného endogenního buněčného genu) modifikuje zavedením DNA, která zahrnuje alespoň regulační sekvenci, exon a donorové místo sestřihu, prostřednictvím homologní rekombinace do buněčného genomu na předem zvoleném místě. Výše uvedené složky se zavádějí do chromozomální (genomové) DNA takovým způsobem, že to má za následek produkci nové transkripční jednotky (v níž jsou regulační sekvence, exon a donorové místo sestřihu přítomné v konstruktu DNA operativně připojeny k endogennímu genu).
V důsledku zavedení těchto složek do chromozomální DNA dojde k pozměnění exprese požadovaného endogenního genu.
Pozměněná exprese genu, které se podle vynálezu používá, zahrnuje aktivaci (vyvolání exprese) genu, který je normálně tichý (není exprimován) v buňce, jak se získá, zvýšení exprese genu, který není exprimován na fyziologicky významné úrovni v buňce, jak se získá, změnu charakteristiky regulace nebo indukce tak, aby se lišila od buňky, jak se získá a redukci (včetně eliminace) exprese genu, který je exprimován v buňce, jak se získá.
Tento vynález se dále také týká konstruktů DNA, které jsou užitečné při způsobu pozměňování exprese cílového genu. Tyto konstrukty DNA zahrnují: a) zacílující sekvenci; b) regulační sekvenci; c) exon; a d) nepárové donorové místo sestřihu. Zacílující sekvence v konstruktu DNA řídí integraci prvků a) až d) do cílového genu v buňce tak, že prvky b) až d) jsou operativně připojeny k sekvencím endogenního cílového genu. V jiném provedení konstrukty DNA zahrnují: a) zacílující sekvenci; b) regulační sekvenci; c) exon; d) donorové místo sestřihu; intron a f) akceptorové místo sestřihu, přičemž zacílující sekvence řídí integraci prvků a) až f) tak, aby byly prvky b) až f) operativně připojeny endogennímu genu. Zacílující sekvence je homologní k předem zvolenému místu v buněčné chromozomální DNA, s níž má dojít k homologní rekombinaci. V konstruktu je exon obvykle přítomen ve směru k 3' od regulační sekvence a donorové místo sestřihu je umístěno ve směru 3' od exonu.
V dalším textu jsou ilustrována dvě provedení tohoto vynálezu, v nichž jsou sekvence před (proti směru exprese) genem humánního erythropoietinu h(EPO) pozměněny, aby umožňovaly expresi hEPO v primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buňkách, které neexprimují EPO v detegovatelných množstvích v netransfekovaném stavu, v jakém se získají. V prvním provedení obsahuje zacílující konstrukt dvě zacílující sekvence. První zacílující sekvence je homologní k sekvencím umístěným ve směru k 5' od druhé zacílující sekvenci a obě sekvence jsou umístěny před (proti směru exprese) kódující oblastí hEPO. Zacílující konstrukt také obsahuje regulační oblast (promotor mMT-1), exon (lidský růstový hormon (hGH)) exon 1) a nepárové donorové místo sestřihu. Produkt homologní rekombinace s tímto zacílujícím konstruktem je znázorněn na obr. 1.
Ve druhém provedení obsahuje zacílující konstrukt také dvě zacílující sekvence. První zacílující sekvence je homologní k sekvencím v endogenní regulační oblasti hEPO a druhá zacílující sekvence je homologní khEPO intronů 1. Zacílující konstrukt také obsahuje regulační oblast (promotor mMT-1), exon (hGH exon 1) a nepárové donorové místo sestřihu. Produkt homologní rekombinace se tímto zacílujícím konstruktem je znázorněn na obr. 2.
V těchto dvou provedeních jsou produkty zachování chimérické transkripční jednotky vytvářející maturovanou mRNA, v níž je první exon genu hGH umístěn před (proti směru exprese)hEPO exony 2-5. Produktem transkripce, sestřihu a translace je protein, v němž jsou aminokyseliny 1-4 hEPO signálního peptidu nahrazeny aminokyselinovými zbytky 1-3 z hGH. Tato dvě provedení se liší jak relativními polohami regulačních sekvencí zacílujícího konstruktu, které jsou vkládány,
-6CZ 295115 B6 tak specifickou charakteristikou sestřihu, ke které musí dojít, aby vznikl konečný upravený transkript.
Vynález se také týká způsobu produkce proteinu in vitro nebo in vivo zavedením výše popsaného konstruktu do chromozomální DNA hostitelské buňky homologní rekombinací za účelem produkce homologně rekombinantní buňky. Homologně rekombinantní buňka se potom udržuje za podmínek umožňujících transkripci, translaci a sekreci, přičemž dochází k produkci proteinu, který je předmětem zájmu.
Vynález se dále týká transfekovaných buněk, jako jsou transfekované primární nebo sekundární buňky (tj. neimortalizované buňky) a transfekovaných imortalizovaných buněk, které jsou užitečné pro produkci proteinů, zejména terapeutických proteinů, způsobů produkce takových buněk, způsobu používání takových buněk pro in vitro produkci proteinu a způsobů genové terapie. Buňky podle tohoto vynálezu pocházejí z obratlovců, zejména savců a zvláště pak jsou lidského původu. Buňky vytvořené způsobem podle tohoto vynálezu obsahují DNA, která kóduje terapeutický produkt, DNA, která je sama terapeutickým produktem a/nebo DNA, která vyvolává u transfekovaných buněk expresi genu na vyšší úrovni nebo s jinou charakteristikou regulace nebo indukce, než je charakteristika, k níž dochází u odpovídající netransfekované buňky.
Vynález se také týká způsobů, kterými jsou buňky, jako primární, sekundární a imortalizované buňky transfekovány, aby obsahovaly exogenní genetický materiál, způsobů produkce klonálních buněčných kmenů nebo heterogenních buněčných kmenů a způsobů očkování zvířat nebo produkce protilátek v očkovaných zvířatech za použití transfekovaných primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk.
Vynález se týká zejména způsobů genového zachování nebo homologní rekombinace v eukaryotních buňkách, jako jsou buňky houbového, rostlinného nebo živočišného původu, například buňky obratlovců, zejména savců a zvláště pak lidské buňky. Vynález se tedy týká způsobu zavádění DNA do primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk pocházejících z obratlovců homologní rekombinací, při níž dochází k zavedení DNA do genomové DNA primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk v předem zvoleném místě. Zacílující sekvence se volí s ohledem na místo, do něhož má být DNA zacílujícího DNA konstruktu vložena. Vynález se dále týká homologně rekombinantních primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk označovaných jako homologně rekombinantní HR primární, sekundární nebo imortalizované buňky, produkovaných způsobem podle vynálezu a dále též použití HR primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk.
V jednom provedení tohoto vynálezu, při němž je pozměněna exprese genu, je gen aktivován. Gen přítomný v primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buňkách pocházejících z obratlovců, který normálně není exprimován v buňkách, jak se získávají, je tedy aktivován a v důsledku toho se exprimuje kódovaný protein. Při tomto provedení se homologní rekombinace používá pro nahrazení, zneschopnění nebo rozbití regulační oblasti, která je normálně asociována s genem v buňkách, tak jak se získají, prostřednictvím inserce regulační sekvence, která způsobuje, že je gen exprimován na vyšší úrovni, než je úroveň zajištěná u odpovídajících netransferovaných buněk.
Podle jednoho provedení se aktivovaný gen může dále aplifíkovat včleněním amplifíkovatelného selektovatelného markerového genu, který má takovou vlastnost, že buňky obsahující amplifikované kopie selektovatelného markerového genu mohou být selektoványprostřednictvím kultivace buněk za přítomnosti vhodného selektivního činidla. Aktivovaný endogenní gen se amplifíkuje v tandemu s amplifíkovaným selektovatelným markerovým genem. Buňky obsahující mnoho kopií aktivovaného endogenního genu jsou užitečné pro produkci proteinu in vitro a pro genomovou terapii. Zacílení genu a amplifíkace, které jsou popsány v tomto popisu, jsou obzvláště užitečné pro aktivaci exprese genů vytvářejících transkripční jednotky o dostatečné velikosti, že
-7CZ 295115 B6 je obtížné je izolovat a exprimovat, nebo pro aktivaci genů, u nichž není celá oblast kódující protein k dispozici nebo nebyla klonována.
V dalším provedení se exprese genu, který je exprimován v buňce, jak se získá, zvyšuje nebo modifikuje tak, aby byla její charakteristika regulace nebo indukce odlišná od charakteristiky pozorované u odpovídajících netransfekovaných buněk. V jiném provedení se exprese genu, který má být exprimován v buňce jak se získá, redukuje (tj. snižuje nebo odstraňuje). Předmětem vynálezu je také způsob, při němž se homologní rekombinace používá pro konverzi genu na kopii cDNA neobsahující introny, pro přenos do kvasinek nebo bakterií za účelem in vitro produkce proteinu.
Transfekované buňky podle vynálezu jsou užitečné při četných aplikacích u člověka a zvířat.
V jednom provedení se mohou buňky implantovat člověku nebo zvířeti za účelem dodávky proteinu organismu člověka nebo zvířete. Tak například lze člověku pro dosažení terapeutického užitku systemicky nebo lokálně dodávat hGH, hEPO, humánní inzulinotropin a jiné proteiny. Kromě toho se mohou produkovat transfekované nehumánní buňky produkující růstový hormon, erythropoietin, inzulinotropin nebo jiné proteiny nehumánního původu.
Pro zadržení buněk ve fixované poloze in vivo nebo pro ochranu a pro izolaci buněk před imunitním systémem hostitele se může používat bariérových zařízeních obsahujících transfekované buňky, které exprimují terapeutický produkt. Taková bariérová zařízení jsou sice nepropustná pro buňky, ale terapeutický produkt jimi může volně procházet. Bariérová zařízení jsou obzvláště užitečná z toho důvodu, že umožňují implantovat transfekované imortalizované buňky, transfekované xenogenní buňky nebo transfekované allogenní buňky za účelem léčení chorob člověk anebo zvířat nebo pro zemědělské aplikace (například při potřebě dodávky hovězího růstového hormonu za účelem intenzifikace produkce mléka). Bariérová zařízení také umožňují účelnou krátkodobou (tj. transientní) terapii tím, že jsou buňky snadno dostupné a mohou se odstranit, když je třeba léčebný režim z nějakého důvodu zastavit. Transfekovaných xenogenních a allogenních buněk je také možno používat za nepřítomnosti bariérového zařízení pro krátkodobou genovou terapii. V posledně uvedeném případě bude genový produkt produkovaný buňkami dodáván in vivo tak dlouho, dokud nebudou buňky imunitním systéme hostitele odmítnuty.
Transfekované buňky podle vynálezu jsou také užitečné pro vyvolání produkce protilátek nebo pro imunizaci člověka a zvířat proti patogenním činidlům. Pro dodávku imunizačních antigenů stimulujících buněčné a humorální imunitní odpovědi hostitele se může používat implantovaných transfekovaných buněk. Cílové imunitní odpovědi mohou sloužit pro ochranu hostitele před infekčními činidly, kterým bude hostitel pravděpodobně vystaven (například v případě očkování), pro stimulaci a zvýšení schopnosti bojovat s chorobou v případě infekce, která je již v průběhu nebo pro produkci protilátek zaměřených proti antigenu exprimovanému in vivotransfekovanými buňkami, což může být užitečné pro terapeutické nebo diagnostické účely. Odstranitelných bariérových zařízení obsahujících buňky se může používat jako prostředku umožňujícího jednoduché ukončení expozice antigenu. Alternativně lze pro omezení expozice antigenu používat buněk, které jsou nakonec odmítnuty (xenogenních nebo allogenních transfekovaných buněk), poněvadž produkce antigenu je při odmítnutí buněk přerušena.
Způsobů podle vynálezu se může používat při produkci primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk exprimujících širokou paletu terapeuticky užitečných produktů. Jako neomezující příklady takových produktů je možnou vést hormony, cytokiny, antigeny, protilátky, enzymy, srážecí faktory, transportní proteiny, receptory, regulační proteiny, strukturní proteiny, transkripční faktory, ribozymy a antimediátorové RAN. Způsobů podle vynálezu je také možno použít pro produkci buněk exprimujících ribozymy, proteiny nebo nukleové kyseliny, které se nevyskytují v přírodě. Takové buňky jsou užitečné pro in vitro produkci terapeutického produktu nebo pro generovou terapii.
-8CZ 295115 B6
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněn schematický diagram strategie použití pro transkripční aktivaci genu hEPO; tlusté čáry, myší promotor metallothionein I; tečkovaný obdélník, 5' nepřeložená oblast hGH; vyčerněný obdélník, hGH exon 1; proužkovaný obdélník, lObp donorová sekvence sestřihu z hEPO intronu 1; mřížkovaný obdélník, 5' nepřeložená oblast hEPO; prázdné očíslované obdélníky, kódující sekvence hEPO; diagonálně šrafovaný obdélník, 3' nepřeložené sekvence hEPO; HIII, místo HindlII.
Na obr. 2 je znázorněn schematický diagram strategie použité pro transkripční aktivaci genu hEPO; tlusté čáry myší promotor metallothionein I; tečkovaný obdélník, 5' nepřeložená oblast hGH; vyčerněný obdélník, hGH exon 1; prázdné očíslované obdélníky, kódující sekvence hEPO; diagonálně šrafovaný obdélník, 3' nepřeložené sekvence hEPO; HIII, místo HindlII.
Na obr. 3 je schematicky znázorněn plazmid pXGH5, který zahrnuje gen hGH pod kontrolou myšího metallothioneionového promotoru.
Na obr. 4 je schematicky znázorněn plazmid pE3neoEPO. Jsou zde označeny polohy humánního erythropoietinového genu a genu neomycin fosfotransferázy (neo) a genů rezistence vůči ampicilinu (amp). Šipky ukazují směry transkripce různých genů. Šifrou pmMT-I je označen myší metallothioneionový promotor (pohánějící expresi hEPO) a šifrou pTK je označen thymidin kinázový promotor z viru Herpes simplex (pohánějící expresi neo). Tečkované oblasti mapy označující polohy sekvencí odvozených z loku humánní hypoxanthin-guanin-fosforibosyl transferázy (HPRT). Jsou zde označeny relativní polohy míst rozpoznávaných restrikční endonukleázou.
Na obr. 5 je schematicky znázorněn plazmid pcDNEO, který zahrnuje kódující oblast neo (fragment BamHI-BglII) z plazmidů pSV2 nebo vloženou do místa BamHi z plazmidů pcD; sekvence Amp-R a pBR3220ri zpBR322; a polyA, 16S spoj sestřihu a časné promotorové oblasti z SV40.
Na obr. 6 je schematicky znázorněn plazmid pREPO4.
Na obr. 7 je uvedena grafická reprezentace exprese erythropoietinu v cílové humánní buněčné linii podrobené stupňovité selekci v 0,02, 0,05, 0,1, 0,2 a 0,4μΜ methotrexátu.
Na obr. 8 je schematicky znázorněn plazmid pREPO15. Fragmenty pocházející z genomových sekvencí hEPO jsou označeny vyčerněnými obdélníky. Oblast mezi BamHi (3537) a BglIT/HindlIT odpovídá sekvencím v polohách 1-4008 v sekvenci HUMERPALu (podle Genbank). Oblast mezi BglH7HindIIT (11463) odpovídá sekvencím DNA v polohách 4009-5169 v sekvenci HUMERPALU (podle Genbank). Oblast mezi HindlII (11463) a Xhol (624) obsahuje sekvenci odpovídající polohám 7 až 624 sekvence HUMERPA (podle Genbank). Sekvence promotoru CMV jsou znázorněny jako prázdný obdélník; tyto sekvence obsahují sekvenci nukletidů 546 až 2105 sekvence HS5MIEP (podle Genbank). Gen neo je znázorněn jako prázdný obdélník se šipkou. Thymidin kinázový (tk) promotor pohánějící gen neo je znázorněn jako šrafovaný obdélník. Sekvence pBSIISK+ zahrnující gen amp jsou označeny tenkou čarou.
Na obr. 9A jsou znázorněny restrikční enzymové mapy a schematická zobrazení produktů pozorovaných po štěpení endogenního genu hEPO (nahoře) a aktivovaného genu hEPO po homologní rekombinaci s zacílujícím fragmentem z pREPO15 (dole).
Na obr. 9B jsou uvedeny výsledky štěpení restrikčním enzymem a analýzy hybridizací Southern neupraveného (HF) a cílového (TI) klonu humánních fibroblastů HF342-15 (viz příklad 7).
-9CZ 295115 B6
Na obr. 10 je schematicky znázorněn plazmid pREP018. Fragmenty pocházející z genomových sekvencí hEPO jsou označeny vyčeměnými obdélníky. Oblast mezi BamHl (3537) a Clal (7554) odpovídá sekvencím v polohách 1-4008 v sekvenci HUMERPALU (podle Genbank). Oblast mezi ATG (12246 a Hindlll' (13426) odpovídá sekvencím DNA v polohách 4009-5169 v sekvenci HUMERPLAU (podle Genbank). Oblast mezi Hindlll (13426) a Xhol (624) obsahuje sekvenci odpovídající polohám 7 až 624 sekvence HUMERPA (podle Genbank). Sekvence promotoru CMV jsou znázorněny jako prázdný obdélník; tyto sekvence obsahují sekvenci nukleotidů 546 až 2015 sekvence HS5MIEP (Genbank). Dihydrofolát reduktázová (dHFR) transkripční jednotka je znázorněna jako tečkovaný obdélník se šipkou. Gen neo je znázorněn jako prázdný obdélník se šipkou. Thymidin kinázový (tk) promotor pohánějící gen neo je znázorněn jako šrafovaný obdélník. Sekvence pBSIISK+ zahrnující gen amp jsou označeny tenkou čarou.
Na obr. 11 je schematicky ilustrován konstrukt podle vynálezu pro aktivaci a amplifikaci bezintronového genu, α-interferonového genu. Tento konstrukt zahrnuje první zacílující sekvenci (1), amplifikovatelný markerový gen (AM), selektovatelný markerový gen (SM), regulační sekvenci, místo CAP, donorové místo sestřihu (SD), intron (tenké čáry), akceptorové místo sestřihu (SA) a druhou zacílující sekvenci (2). Černý obdélník znázorňuje kódující DNA a tečkované obdélníky znázorňují nepřeložené sekvence.
Na obr. 12 je schematicky ilustrován konstrukt podle vynálezu pro aktivaci a amplifikaci endogenního genu, kde první exon přispívá k signálnímu peptidů, humánnímu genu GM-CSF. Tento konstrukt zahrnuje první zacílující sekvenci (1), amplifikovatelný markerový gen (AM), selektovatelný markerový gen (SM), regulační sekvenci, místo CAP, donorové místo sestřihu (SD), a druhou zacílující sekvenci (2). Černé obdélníky znázorňují kódující DNA a tečkované obdélníky znázorňují nepřeložené sekvence.
Na obr. 13 je schematicky ilustrován konstrukt podle vynálezu pro aktivaci a amplifikaci endogenního genu, kde první exon přispívá k ignálnímu peptidů, humánnímu genu G-CSF. Tento konstrukt zahrnuje první zacílující sekvenci (1), amplifikovatelný markerový gen (AM), selektivatelný markerový gen (SM), regulační sekvenci, místo CAP, donorové místo sestřihu (SD) a druhou zacílující sekvenci (2). Černé obdélníky znázorňují kódující DNA a tečkované obdélníky znázorňující nepřeložené sekvence.
Na obr. 14 je schematicky ilustrován konstrukt podle vynálezu pro aktivaci a amplifikaci endogenního genu, kde první exon je nekódující, humánního genu FSHp. Tento konstrukt zahrnuje první zacílující sekvenci (1), amplifikovatelný markerový gen (AM), selektovatelný markerový gen (SM), regulační sekvenci, místo CAP, donorové místo sestřihu (SD) a druhou zacílující sekvenci (2). Černé obdélníky znázorňují kódující DNA a tečkované obdélníky znázorňují nepřeložené sekvence.)
Následuje podrobný popis vynálezu.
Vynález je založen na objevu, že regulace aktivity endogenních genů, které jsou předmětem zájmu, v buňce může být pozměněna vložením do buněčného genomu v předem zvoleném místě prostřednictvím homologní rekombinace konstruktů DNA zahrnujících a) zacílující sekvenci, b) regulační sekvenci, c) exon a d) nepárové donorové místo sestřihu, přičemž zacílující sekvence řídí integraci prvků a) až d) tak že prvky b) až d) jsou operativně připojeny k endogennímu genu.
V jiném provedení zahrnují konstrukty DNA a) zacílující sekvenci, b) regulační sekvenci, c) exon a d) donorové místo sestřihu, e) intron a f) akceptorové místo sestřihu, přičemž zacílující sekvence řídí integraci prvků a) až f) tak, že prvky b) až f) jsou operativně připojeny k prvnímu exonu endogenního genu.
-10CZ 295115 B6
Použité zacílující sekvence se volí v ohledem na místo, do něhož má být vloženo DNA. Při obou provedeních zacílování používá pro vytvoření nové transkripční jednotky, která představuje produkt fúze sekvencí zavedených zacílujícími DNA konstrukty a endogenního buněčného genu. Jak je zde vysvětleno, vytvoření nové transkripční jednotky například umožňuje, aby byly transkripčně tiché geny (geny, které před transkripcí nejsou v buňce exprimovány) aktivovány v hostitelských buňkách tím, že se do genomu hostitelských buněk zavedou konstrukty DNA podle tohoto vynálezu. Jak je v tomto popisu také vysvětleno, exprese endogenního genu, který je exprimován buňce tak, jak se normálně získá, může být pozměněna, tj. zvýšena, snížena a také odstraněna, nebo může být změněn profil regulace nebo produkce za použití způsobu a konstruktů DNA podle tohoto vynálezu.
Jak je uvedeno výše, vynález se týká zacílování genu nebo DNA v buňkách eukaryotního původu, jako jsou houbové, rostlinné nebo živočišné buňky, jako například buňky pocházející z obratlovců, zejména savců a zvláště pak člověka. Týká se tedy způsobu zavádění DNA do buňky, jako primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk pocházejících z obratlovců, homologickou rekombinací, tj. zacílováním DNA, která se zavádí do genomové DNA těchto buněk v předem zvoleném místě. Konkrétně se týká homologní rekombinace, při níž se produkty transkripce a/nebo translace endogenních genů modifikují za použití konstruktů DNA obsahujících zacílující sekvenci, regulační sekvenci, exon a donorové místo sestřihu. Dále se vynález také týká homologně rekombinantních buněk vyrobených způsobem podle vynálezu a jejich použití.
Vynález se také týká způsobu aktivace genu, který je přítomen v primárních buňkách, sekundárních buňkách nebo imortalizovaných buňkách pocházejících z obratlovců, ale za normálních podmínek není v těchto buňkách exprimován. Homologní rekombinace, tj. zacílování, se používá pro zavádění sekvencí způsobujících expresi genu v recipientních buňkách do genomu těchto buněk. V dalším provedení se exprese genu v buňce zvyšuje nebo se pozměňuje profil regulace nebo indukce genu zaváděním konstruktu DNA. V důsledku toho je kódovaný produkt exprimován na vyšší úrovni, než je úroveň pozorovaná u odpovídajících netransfekovaných buněk. Způsob a konstrukty DNA podle vynálezu jsou také užitečné pro produkci buněk, v nichž je exprese požadovaného produktu nižší ve srovnání s odpovídajícími netransfekovanými buňkami. V transfekovaných buňkách je v takovém případě produkováno méně proteinu (nebo též žádný protein) ve srovnání s buňkami, jak se normálně získají.
V ještě dalším provedení se za normálních podmínek tichý gen kódující požadovaný produkt aktivuje v transfekovaných primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buňkách a amplifikuje. Toto provedení představuje způsob zavádění sekvencí DNA, které nejsou normálně funkčně připojeny k endogennímu genu a které 1) po vložení do genomu hostitele v místě nebo v blízkosti místa endogenního genu slouží pro pozměnění (například aktivaci) exprese tohoto endogenního genu a dále 2) umožňují selekci buněk, v nichž je tento aktivovaný endogenní gen amplifíkován, prostřednictvím homologní rekombinace s genomovou DNA. Alternativně se zvyšuje exprese genu, který je normálně exprimován v buňce, tak jak se získá, a gen se amplifikuje.
Následuje popis konstruktů DNA podle tohoto vynálezu, způsobů při nichž se těchto konstruktů používá pro produkci transfekovaných buněk, transfekovaných buněk samotných a jejich použití.
Konstrukt DNA
Konstrukt DNA podle vynálezu zahrnuje alespoň následující složky: zacílující sekvencí, regulační sekvencí, exon a nepárové donorové místo sestřihu. V konstruktu je exon umístěn směrem k 3' od regulační sekvence a nepárové donorové místo sestřihu je umístěno směrem k 3' od exonu. Kromě toho může konstrukt obsahovat několik exonů a/nebo intronů před (směrem k 5') exonem lemovaným nepárovým donorovým místem sestřihu. Jak je uvedeno v tomto
- 11 CZ 295115 B6 popisu, konstrukt často obsahuje ještě přídavné složky, jako jsou selektovatelné markéry nebo amplifíkovatelné markéry.
DNA v konstruktu je možno označovat za exogenní. Pod označením „exogenní“ se zde rozumí, že tato DNA je zavedena do buňky způsobem podle vynálezu, totiž za použití konstruktů DNA charakterizovaných v tomto popisu. Exogenní DNA může obsahovat sekvence, které jsou totožné s endogenní DNA přítomnou v buňce před transfekcí, nebo které se od ní liší.
Zacílující sekvence
Pod označením „zacílující sekvence“ se rozumějí sekvence DNA, které umožňují legitimní homologní rekombinaci do genomu zvolené buňky obsahující gen, který je předmětem zájmu. Zacílující sekvencemi jsou obecně sekvence DNA, které jsou homologní (tj. identické nebo dostatečně podobné buněčné DNA, aby mohlo dojít k homologní rekombinaci zacílující sekvence a buněčné DNA) vzhledem k sekvencím DNA normálně přítomných v genomu buněk, jak se získají (například kódující nebo nekódující DNA ležící před místem startu transkripce, v místě nebo za místem konce transkripce genu, který je předmětem zájmu, nebo sekvence přítomné v genomu v důsledku dřívější modifikace). Zacílující sekvence, kterých se používá, se volí s ohledem na místo, do něhož má být DNA v konstruktu DNA vložena.
Může se použít jedné nebo více zacílujících sekvencí. Tak například kružnicový plazmid nebo fragment DNA přednostně obsahuje pouze jednu zacílující sekvenci. V lineárním plazmidu nebo fragmentu DNA se přednostně používá dvou zacílujících sekvencí. Zacílující sekvence mohou být nezávisle umístěny v genu, který je předmětem zájmu (jako například v sekvenci exonu a/nebo intronu), bezprostředně vedle genu, který je předmětem zájmu (v tomto případě nejsou mezi zacílující sekvencí a kódující oblastí genu, který je předmětem zájmu přítomny žádné přídavné nukleotidy), před (proti směru exprese) genem, který je předmětem zájmu (tj. v sekvencích nekódující oblasti nebo endogenních promotorových sekvencích před genem), nebo ve značné vzdálenosti před (proti směru exprese) genem (jako například v sekvencích před endogenním promotorem). Zacílující sekvence mohou obsahovat oblasti zacíleného genu, které jsou v současné době známy nebo sekvencovány a/nebo oblasti dále k 5'-konci, které nejsou strukturně charakterizovány, aleje možno je mapovat za použití restrikčních enzymů a určit.
Zacílování genu je možno použít pro vložení regulační sekvence izolované z odlišného genu, sestavené ze složek izolovaných z odlišných buněčných a/nebo virových zdrojů nebo nově syntetizované metodami genového inženýrství buď v, bezprostředně vedle, před (proti směru exprese), nebo ve značné vzdálenosti před (proti směru exprese) endogenním buněčným genem. Alternativně nebo přídavně je při zacílování možno nahradit, odstranit, přidat nebo jinak modifikovat sekvence ovlivňující strukturu nebo stabilitu RNA nebo produkovaného proteinu. Tak například je možno modifikovat prvky stability RNA, místo sestřihu a/nebo vedoucí sekvence molekul RNA za účelem zlepšení nebo pozměnění funkce, stability a/nebo schopnosti translace molekuly RNA. Také je možno pozměnit sekvence proteinu, jako signální sekvence, propeptidové sekvence, aktivní místa a/nebo strukturní sekvence za účelem zvýšení nebo modifikace transportu, sekrece nebo funkčních vlastností proteinu. Při tomto způsobu má zavádění exogenní DNA za následek pozměnění normálních vlastností exprese genu a/nebo strukturních vlastností proteinu nebo RNA.
Regulační sekvence
Regulační sekvence konstruktu DNA může zahrnovat jeden nebo více promotorů (jako konstitutivní nebo indukovatelný promotor), enhancerů, oblastí připojených v podobě lešení (scafford-attachment) nebo míst připojení matrice, negativních regulačních prvků, míst vazby faktorů transkripce nebo kombinaci takových sekvencí.
- 12CZ 295115 B6
Regulační sekvenoe mine obsahovat indukovatelný promotor, který se projevuje tak, ic buňky, tak jak jsou produkovány nebo zavedeny do individua, neexprimují produkt, ale mohou být k této expresi indukovány (tj. exprese se indukuje po produkci transfekovaných buněk, ale před implantací nebo po ní). DNA kódující požadovaný produkt se samozřejmě může do buněk zavádět takovým způsobem, že je exprimována po zavedení (například pod kontrolou konstitutivního promotoru). Regulační sekvence se může izolovat z buněčného nebo virového genomu (takové regulační sekvence zahrnují sekvence, které regulují expresi SV40 časných nebo pozdních genů, hlavních pozdních genů adenovirů, myšího genu metallothioneinu-I, genu elongačního faktoru-ία, genů cytomegaloviru, genů kolagenu, genů aktinu, genů imunoglobulinu nebo genu HMG-CoA reduktázy). Regulační sekvence přednostně obsahují místa vazby transkripčního faktoru, jako jsou vazebná místa TATA Box, CCAAT Box, API, Spi nebo NF-ÁB.
Přídavné prvky konstruktu DNA
Konstrukt DNA dále obsahuje jeden nebo více exonů Exon je zde definován jako sekvence DNA, která je kopírována do RNA a je přítomna v maturované molekuly mRNA. Exony mohou popřípadě obsahovat DNA kódující jednu nebo více aminokyselin a/nebo částečně kódující aminokyselinu (tj. jednu nebo dvě báze kodonu). Alternativně obsahuje exon DNA, která odpovídá 5' nekódující oblasti. Pokud exogenní exon nebo exony kódují jednu nebo více aminokyselin a/nebo část aminokyseliny, sestavuje se konstrukt DNA tak, aby při transkripci a sestřihu byl čtecí rámec v rámci s druhým exonem nebo kódující oblastí zacíleného genu. Pod označením „v rámci“ se zde rozumí, že kódující sekvence prvního exonu a druhého exonu po fúzi sdílejí nukleotidy způsobem, který nemění vhodný čtecí rámec části mRNA pocházející z druhého exonu.
Pokud první exon zacíleného genu obsahuje sekvenci ATG pro iniciaci translace, obsahuje exogenní exon konstruktu přednostně ATG a, je-li to žádoucí, jeden nebo více nukleotidů tak, že výsledná kódující oblast mRNA zahrnující druhý exon a následující exony zacíleného genu jsou v rámci. Jako příklady takových zacílených genů, v nichž první exon obsahuje ATG je možno uvést geny kódující hEPO, hGH, humánní faktor stimulující kolonie - granulocyt/makrofát (hGM-CSF) a humánní faktor stimulující kolonie - granulocyt (hG-CSF).
Donorové místo sestřihu je sekvence, která řídí sestřih jednoho exonu k druhému. První exon obvyk leží ve směru k 5' od druhého exonu a donorové místo sestřihu, které překrývá první exon a lemuje ho na své 3' straně rozpoznává akceptorové místo sestřihu lemující druhý exon na jeho 5' straně. Donorová místa sestřihu vykazují charakteristickou konvenční sekvenci, kterou lze znázornit takto: (A/C)AG GURAGU (kde R představuje purinový nukleotid), kde GU musí být ve 4. a 5. poloze (Jackson I.J., Nucleic Acids Research 19: 3715 až 3798 (1991)). První tři báze konvenčních donorových míst sestřihu jsou funkčně definovány schopností provést vhodnou reakci v rámci sestřihové dráhy mRNA.
Nepárové donorové místo sestřihu je zde definováno jako donorové místo sestřihu, které je přítomno v zacílujícím konstruktu a které není v konstruktu doprovázeno akceptorovým místem sestřihu umístěným ve směru k 3' od nepárového donorového místa sestřihu. Nepárové donorové místo sestřihu se projevuje sestřihem k endogennímu akceptorovému místu sestřihu.
Akceptorové místo sestřihu je sekvence, která podobně jako donorové místo sestřihu řídí sestřih jednoho exonu k druhému. Tím, že aparát sestřihu působí v kombinaci s donorovým místem sestřihu, může tento aparát použít akceptorového místa sestřihu pro odstranění intronu. Akceptorová místa sestřihu vykazují charakteristické sekvence, které lze znázornit takto: YYYYYYYYYYNYAG, kde Y představuje jakýkoliv pyrimidin a N představuje jakýkoliv nukleotid (Jackson I. J., Nucleic Acids Research 19: 3715 až 3798 (1991)).
Intron je definován jako sekvence jednoho nebo více nukleotidů ležící mezi dvěma exony, která se při sestřihu odstraní v prekurzorové molekuly RNA za vzniku mRNA.
Regulační sekvence je například operativně připojena kATG start kodonu, který iniciuje translaci. K regulační sekvenci a ATG start kodonu je popřípadě operativně připojeno místo CAP itó je tmu bsíuhíin
využíváno. Alternativně není místo CAP, které je připojeno k regulační sekvenci a je touto sekvencí využíváno, součástí zacílujícího konstruktu a transkripční aparát potom definuje nové místo CAP. U většiny genů leží místo CAP obvykle přibližně ve vzdálenosti 25 nukleotidů od
TATA Box ke konci 3'. Podle jednoho provedení donorové místo sestřihu umístěno v těsném sousedství s ATG, například když přítomnost jednoho nebo více nukleotidů není nutná, aby byl exogenní exon v rámci s druhým exonem zacíleného genu. Přednostně se bezprostředně vedle ATG na jeho 3' straně umístí DNA kódující jednu nebo více aminokyselin nebo částí aminokyseliny v rámci s kódující sekvencí zacíleného genu. V takovém provedení je donorové místo sestřihu umístěno bezprostředně vedle kódující DNA na její 3' straně.
Pod pojmem „operativně připojený“ nebo „funkčně umístěný“ se rozumí konfigurace, v níž jsou exogenní regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu a popřípadě sekvence a akceptorové místo sestřihu vhodně zacíleny v takové poloze vzhledem k endogennímu genu, aby regulační prvek řídil produkci primárního RNA transkriptů, který iniciuje v místě CAP (popřípadě zahrnutém v zacílujícím konstruktu) a zahrnuje sekvence odpovídající exonu a donorovému místo sestřihu zacílujícího konstruktu, DNA ležící před regulační oblastí (je-li přítomna) endogenního genu, 5' nepřepsanou oblast (je-li přítomna) endogenního genu, exony a introny (jsou-li přítomny) endogenního genu. V operativně připojené konfiguraci řídí donorové místo sestřihu zacílujícího konstruktu sestřih k akceptorovému místu sestřihu lemujícímu jednu z exonů endogenního genu tak, že plně sestřižený maturovaný transkript může produkovat požadovaný protein.
V jednom provedení je akceptorové místo sestřihu endogenní, takže sestřih je řízen k endogennímu exonu, například endogennímu genu.V jiném provedení, v němž je akceptorové místo sestřihu včleněno do zacílujícího konstruktu, dochází při sestřihu k odstranění intronu zavedeného zacílujícím konstruktem.
Použitá kódující DNA (například exon 1 zacílujícího konstruktu) může popřípadě kódovat jednu nebo více aminokyselin a/nebo část aminokyseliny, které jsou stejné jako aminokyseliny endogenního proteinu. Použitá kódující sekvence DNA může například odpovídat prvnímu exonu genu, který je předmětem zájmu. Kódující DNA může alternativně kódovat jednu nebo více aminokyselin nebo část aminokyseliny, které se liší od prvního exonu proteinu, který je předmětem zájmu. Posledně uvedené provedení je zvláště zajímavé, pokud aminokyseliny prvního exonu proteinu, který je předmětem zájmu, rozhodujícím způsobem neovlivňují účinnost nebo účinnost tohoto proteinu. Když se například zkonstruují fúze k endogennímu genu hEPO, může se použít sekvencí kódujících první exon hGH. V tomto příkladě fúze exonu 1 hGH k exonu 2 hEPO má za následek vytvoření hybridního signálního peptidu, který je funkční.
V příbuzných konstruktech se může použít jakéhokoliv exonu humánního nebo nehumánního původu, v němž kódované aminokyseliny nezabraňují funkci hybridního signálního peptidu.
V podobném provedení se této technice také může použít pro opravu mutace zjištěné v cílovém genu.
Pokud je požadovaným produktem fúzovaný protein endogenního proteinu a kódujících sekvencí zacílujícího konstruktu, obsahuje exogenní kódují DNA zavedená do buněk způsobem podle vynálezu, DNA, která kóduje jeden nebo více exonů nebo sekvenci cDNA odpovídající translačnímu nebo transkripčnímu produktu, který má být fúzován k produktu endogenního zacíleného genu. V tomto provedení se zacílování používá pro přípravu chimérických nebo multifunkčních proteinů, v nichž jsou kombinován strukturní, enzymatické vlastnosti nebo vazebné vlastnosti pro ,ligand nebo receptor ze dvou nebo více proteinů do jednoho polypeptidu. Tak například exogenní DNA může kódovat kotvu (anchor) k membráně pro zacílený protein nebo signální peptid za účelem zajištění nebo zlepšení buněčné sekrece, vedoucí sekvence,
-14CZ 295115 B6 enzymatické oblasti, oblasti transmembránové domény, oblasti vázající ko-faktor nebo jiné funkční oblasti. Jako příklady proteinů, které normálně nejsou vylučovány, ale které by bylo možno fúzovat k signálnímu proteinu pro zajištění sekrece je možno uvést dopa-dekarboxylázu, transkripční regulační proteiny, α-galaktosidázu a tyrosin hydroxylázu.
Pokud první exon zacíleného genu odpovídá nekódující oblasti (například první exon genu hormonu stimulujícího folikuly β (ΡδΗβ)), exogenní ATG není nutná a přednostně se vypouští.
DNA konstruktu je možno získat ze zdrojů, v nichž se nachází v přírodě nebo ji lze produkovat technikami genového inženýrství nebo syntetickými postupy.
Zacílený gen a výsledný produkt
Konstrukt DNA po transkripci do buněk, jako jsou primární, sekundární nebo imortalizované buňky, může regulovat expresi požadovaného produktu, například aktivní či funkční části proteinu nebo RNA. Produktem může být například hormon, cytokin, antigen, protilátka, enzym, srážecí faktor, transportní protein, transkripční faktor, natimediátorová RNA nebo ribozym. Přídavně může být produktem protein nebo nukleová kyselina, která se nevyskytuje v přírodě, tj. fúzovaný protein nebo nukleová kyselina.
Způsobem popsaným v tomto textu je možno produkovat jeden nebo více terapeutických produktů, jako jsou erythropoietin, kalcitonin, růstový hormon, inzulín, inzulinotropin, růstové faktory podobné inzulinu, parathyroidní hormon, anterferon β a interferon β, faktory růstu nervů, ΡδΗβ, TGF-β, faktor nekrózy nádorů, glukagon, faktor-2 růstu kostí, faktor-7 růstu kostí, TSH-β, interleukin 1, interleukin 2, interleukin 3, interleukin 6, interleukin 11, interleukin 12, CSF-granulocyt, CSF-makrofág, CSF-granulocyt/makrofág, imunoglobuliny, katalytické protilátky, protein kináza C, glukocerebrosidáza, superoxid dismutasa, aktivátor tkáňového plazminogenu, urokináza, antitrombin III, DNAsa, α-galaktosidáza, tyrosin hydroxyláza, srážecí faktor krve V, srážecí faktor krve VII, srážecí faktor krve VIII, srážecí faktor krve, IX, srážecí faktor krve X, srážecí faktor krve XIII, apolipoproteinE nebo apolipoprotein A-i, globiny, receptor nízkohustotního lipoproteinu, receptor IL-2, antagonisty IL-2, antitrypsin a-1, modifíkátory imunitní odpovědi a rozpustný CD4.
Selektovatelné markéry a amplifíkace
Identifikace zachování může být usnadněna za použití jednoho nebo více selektovatelných markerových genů. Tyto markéry je možno včlenit do zacílujícího konstruktu nebo mohou být přítomny v různých konstruktech.
Selektovatelné markéry je možno rozdělit do dvou kategorií: pozitivně selektovatelné anegativně selektovatelné (jinými slovy, markéry buď po pozitivní selekci, nebo negativní selekci). Při pozitivní selekci jsou buňky exprimující pozitivně selektivatelný markér schopny přežít zpracování selekčním činidlem, jako je neo, xanthin-guanin fosforybosyl transferáza (gpt), dhfit, adenosin deamináza (ada), puromycin (pac), hygomycin (hyg), CAD kódující karbamyl fosfát synthasu, aspartát transkarbamylázu a dihydro-orotasa glutamin synthetasu (GS), „multidrug resistance 1“ (mdrl) a histidin D (hisD). To umožňuje selekci buněk, v nichž je zacílující konstrukt integrován do genomu hostitelské buňky. Při negativní selekci jsou buňky exprimující negativně selektovatelný markér za přítomnosti selektivního činidla zničeny.
Identifikaci zachování je možno usnadnit za použití jednoho nebo více markerových genů vykazujících vlastnost negativní selekce. Přitom je negativní selektovatelný markér připojen k exogenní DNA, ale v takové konfiguraci, že negativně selektovatelný markér lemuje zacílující sekvenci a tak, že správná homologní rekombinace se sekvencemi v genomu hostitelské buňky nemá za následek stabilní integraci negativně selektovatelného markéru (Mansour S. L. et al.,
- 15CZ 295115 B6
Nátuře 336: 348 až 352 (1988)). Markéry užitečné pro tento účel zahrnují gen thymidin kinázy (TK) z viru Herpes simplex nebo bakteriální gen gtp.
Do primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk je možno zavést různé selektovatelné markéry. Tak například je možno použít selektovatelného markéru udělujícího selektovatelný fenotyp, jako je rezistence vůči léčivu, nutriční auxotrofíe, rezistence vůči cytotoxickému činidlu nebo exprese povrchového proteinu. Selektovatelné markerové geny, kterých lze použít, zahrnují: neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg, CAD, GS, mdrl a hisD. Udělený selektovatelný fenotyp umožňuje identifikovat a izolovat recipientní buňky.
Amplifikovatelné geny kódující selektovatelné markéry (například ada, GS, dhfr a multifunkční gen CAD) mají přídavnou vlastnost spočívající v umožnění selekce buněk obsahujících amplifikované kopie selektovatelného markéru vloženého do genomu. Toto provedení zajišťuje mechanismus pro podstatné zvýšení počtu kopií sousedního nebo připojeného genu, jehož amplifíkace je žádoucí. Může se také použít mutovaných verzí těchto sekvencí vykazujících zlepšené selekční vlastnosti a jiných amplifíkovatelných sekvencí.
Pořadí složek v konstruktu DNA se může měnit. Je-li konstruktem kružnicový plazmid, může být pořadí prvků ve výsledné struktuře následující: zacílující sekvence - plazmidová DNA (skládající se ze sekvencí použitých pro selekci a/nebo replikaci zacílujícího plazmidu v mikrobiálním nebo jiném vhodném hostiteli) - selektovatelný markér (markéry) - regulační sekvence - exon
- donorové místo sestřihu. Plazmid obsahující zacílující sekvenci a exogenní prvky DNA se přednostně štěpí restrikčním enzymem, který jednou nebo vícekrát rozštěpí zacílující sekvenci za vzniku lineární nebo přerušované molekuly před zavedením do recipientní buňky, takže volné konce DNA zvyšují četnost požadované homologní rekombinace charakterizované v tomto popisu. Volné konce DNA je kromě toho možno zpracovat exonukleázou za vzniku vyčnívajících 5' nebo 3' převislých jednořetězcových konců DNA pro zvýšení četnosti požadované homologní rekombinace. V tomto provedení má homologní rekombinace mezi zacílující sekvencí a buněčným cílem za následek vzniku dvou kopií zacílujících sekvencí lemujících prvky obsažené v zavedeném plazmidu.
Pokud je konstrukt lineární, může být pořadí například následující: první zacílující sekvence
- selektovatelný markér - regulační sekvence - exon - donorové místo sestřihu - druhá zacílující sekvence, nebo alternativně první zacílující sekvence - regulační sekvence - exon - donorové místo sestřihu - DNA kódující selektovatelný markér - druhá zacílující sekvence. Buňky, které konstrukt stabilně integrují, přežijí zpracováním selekčním činidlem; podmnožinou stabilní transfektovaných buněk budou homologně rekombinantní buňky. Homologně rekombinantní buňky je možno identifikovat různými technikami, jako je PCR, hybridizace Southern a fenotypový screening.
V jiném provedení může být pořadí složek konstruktu toto: první zacílující sekvence
- selektovatelný markér - regulační sekvence - exon - donorové místo sestřihu - intron
- akceptorové místo sestřihu - druhá zacílující sekvence.
Alternativně může být pořadí složek v konstruktu DNA například následující: první zacílující sekvence - selektovatelný markér 1 - regulační sekvence - exon - donorové místo sestřihu
- druhá zacílující sekvence - selektovatelný markér 2 nebo alternativně také první zacílující sekvence regulační sekvence - exon - donorové místo sestřihu - selektovatelný markér 2.
V posledně uvedeném provedení vykazuje selektovatelný markér 2 vlastnosti vhodné pro negativní selekci. Genový produkt selektovatelného markéru 2 je tedy možno podrobit selekci růstem na vhodném upraveném médiu obsahujícím činidlo (obvykle léčivo nebo jeho metabolitový analog), které zabíjí buňky exprimující selektovatelný markér 2. Rekombinace mezi zacílujícími sekvencemi lemujícími selektovatelný markér 1 a homologickými sekvencemi v genomu hostitelské buňky má za následek cílenou integraci selektovatelného markéru 1, přičemž selektovatelný markér 2 integrován není. Takovými rekombinancemi vznikají buňky
-16CZ 295115 B6 které jsou stabilně transfekovány selektovatelným markérem 1, ale nejsou stabilně transfekovány selektovatelným markérem 2. Selekci buněk lze v tomto případě provést na základě růstu na médiu obsahujícím selekční činidlo, které umožňuje pozitivní selekci na selektovatelný markér, a selekční činidlo, které umožňuje negativní selekci na selektovatelný markér 2.
Konstrukt DNA může také obsahovat pozitivně selektovatelný markér umožňující selekci buněk obsahujících amplifíkované kopie tohoto markéru. Amplifikace takového markéru má za následek ko-amplifikaci lemujících sekvencí DNA. V tomto provedení obsahuje konstrukt jednotlivé složky například v tomto pořadí: první zacílující sekvence - amplifíkovatelný pozitivně selektovatelný markér - druhý selektovatelný markér (případný) - regulační sekvence - exon - donorové místo sestřihu - druhá zacílující sekvence DNA.
V tomto provedení může být aktivovaný gen dále amplifikován včleněním selektovatelného markéru genu, který má tu vlastnost, že buňky obsahující amplifíkované kopie tohoto selektovatelného markerového genu mohou být podrobeny selekci pomocí kultivace těchto buněk za přítomnosti vhodného selekčního činidla. Aktivovaný endogenní gen bude amplifikován zároveň s amplifikací selektovatelného markerového genu. Buňky obsahující mnoho kopií aktivovatelného endogenního genu mohou produkovat vysokou hladinu požadovaného proteinu a jsou užitečné pro produkci proteinu in vitro a genovou terapii.
V jakémkoliv provedení nemusí selektovatelné a amplifíkovatelné markerové geny ležet ve vzájemném těsném sousedství.
Konstrukt DNA může popřípadě obsahovat bakteriální počátek replikace a bakteriální markéry rezistence vůči antibiotiku nebo jiné selektovatelné markéry, které umožňují propagaci plazmidu v bakteriálních nebo jiném vhodném klonovacím/hostitelském systému ve velkém měřítku. Konstruktu DNA zahrnujícího DNA kódující selektovatelný markér spolu s přídavnými sekvencemi, jako je promotor a spoje sestřihu, se může použít pro udělení selektovatelného fenotypu transfekovaným buňkám (například plazmid pcDNEO, který je schematicky znázorněn na obr. 4. Takový konstrukt DNA může být kotransfekován do primárních nebo sekundárních buněk spolu s zacílující sekvencí DNA za použití způsobů uvedených v tomto popisu.
Transfekce a homologní rekombinace
Při způsobu podle vynálezu se konstrukt zavádí do buňky, jako primární, sekundární nebo imortalizované buňky ve formě jednoho konstruktu DNA nebo separátních sekvencí DNA, které se zabudují do chromozomální nebo jaderné DNA transfekované buňky.
Zacílený konstrukt DNA obsahující zacílující sekvence, regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu a selektovatelný markér gen nebo geny se může zavést do buněk v podobě jediného konstruktu DNA nebo v podobě separátních konstruktů. Celková délka konstruktu DNA se bude měnit v závislosti na počtu složek (například zacílujících sekvencí, regulačních sekvencí, exonů, selektovatelných markerových genů a jiných prvků) a jejich délce. Celková délka konstruktu bude obvykle činit alespoň asi 200 nukleotidů. DNA může být dále zaváděna v lineární, dvouřetězcové (s nebo bez jednořetězcových oblastí na jednom nebo obou koncích), jednořetězcová nebo kružnicové podobě.
Kterýkoliv z typů konstruktů podle vynálezu se potom zavádí do buňky za účelem dosažení transfekce. Transfekovaná buňka se uchovává za podmínek umožňujících homologní rekombinací, které jsou známy v tomto oboru (Capecchi M. R., Science 244: 1288 až 1292 (1989)). Když se homologně rekombinantní buňka uchovává za podmínek postačující pro transkripci DNA, regulační oblast zavedená zacílujícím konstruktem, jako je tomu v případě promotoru, aktivuje transkripci.
-17CZ 295115 B6
Konstrukty DNA je možno zavádět do buněk různými fyzikálními nebo chemickými metodami, jako je elektroporace, mikroinjekce, bombardování mikroprojektily, srážení fosforečnanem vápenatým a transfekce zprostředkovaná liposomy, polybrenem nebo DEAE-dextranem. Alternativně je možno pro zavedení DNA použít infekčních vektorů, jako jsou retrovirové vektory, a vektory na bázi Herpes, Adenovirus, Adenovirus-asociované vektory a vektory na bázi viru příušnic a polioviru.
Zacílující DNA je popřípadě možno zavádět do buňky v podobě dvou nebo více oddělených DNA fragmentů. V případě, že se použije dvou fragmentů, sdílejí tyto dva fragmenty sekvenční homologii DNA (dochází k překrývání u 3' konce jednoho fragmentu a 5' konce druhého fragmentu, přičemž jeden z těchto fragmentů nese první zacílující sekvenci a druhý nese druhou zacílující sekvenci. Při zavádění do buňky může u těchto dvou fragmentů proběhnout homologní rekombinace za vzniku jediného fragmentu, v němž první a druhá zacílující sekvence lemuje oblast překrývání mezi dvěma původními fragmenty. Vzniklý fragment má potom vhodnou podobu pro homologní rekombinací s cílovými sekvencemi buňky. Může se použít více než dvou fragmentů, které jsou sestrojeny tak, aby u nich proběhla vzájemná homologní rekombinace, jejímž konečným výsledkem je produkt vhodný pro homologní rekombinací s cílovými sekvencemi buňky, jak je to popsáno výše.
Homologně rekombinantní buňky
Zacílování má za následek vložení regulační sekvence zacílujícího konstruktu, umístění endogenního genu pod jejich kontrolou (například vložením buď promotoru nebo enhanceru, nebo obou těchto prvků před (proti směru exprese) endogenní gen nebo regulační oblast). Zacílování může mít popřípadě současně za následek deleci endogenního regulačního prvku, jako je delece tkáňově specifického negativního regulačního prvku. Při zacílování může dojít k nahrazení existujícího prvku. Tkáňově specifický enhancer může být například nahrazen enhancerem, který vykazuje širší nebo odlišnou specificitu vzhledem k typu buňky než prvky, které se vyskytují v přírodě nebo který vykazuje odlučný profil regulace nebo indukce ve srovnání s odpovídající netransferovanou buňkou. Při tomto provedení dochází k deleci přírodních sekvencí a přidání nových sekvencí. Alternativně se při zacílování endogenní regulační prvky neodstraňují ani nenahrazují, nýbrž se rozbíjí nebo zneschopní, jako je tomu při zacílování exogenních sekvencí do endogenních regulačních prvků.
Po zavedení DNA do buňky se buňka uchovává za podmínek, které jsou vhodné pro průběh homologní rekombinace mezi genovou DNA a částí zavedené DNA; tyto podmínky jsou v tomto oboru známé (Capecchi M.R., Science 244: 1288 až 1292 (1989)).
Homologní rekombinace mezi genomovou DNA a zavedenou DNA má za následek vznik homologně rekombinantní buňky, jako například houbové, rostlinné nebo živočišné buňky, zejména primární, sekundární nebo imortalizované lidské nebo jiné savčí buňky, v níž jsou sekvence modifikující expresi endogenního genu operativně připojeny k endogennímu genu kódujícímu produkt, za vzniku nové transkripční jednotky s expresním a/nebo kódujícím potenciálem, který se liší od potenciálu endogenního genu.
Vynález se zejména týká homologně rekombinantní buňky zahrnující regulační sekvence a exon lemovaný donorovým místem sestřihu, přičemž tyto prvky jsou zavedeny na předem určené místo zacílováním konstruktu DNA, a jsou operativně připojeny ke druhému exonu endogenního genu. K jakémukoliv exonu endogenního genu může být popřípadě operativně připojeno více exogenních exonů (kódujících nebo nekódujících) a intronů. Výsledné homologně rekombinantní buňky se kultivují za podmínek umožňujících případnou selekci na amplifikaci DNA kódující amplifikovatelný markér a novou transkripční jednotku. Ať již se amplifikace provádí nebo ne, buňky produkované touto metodou je možno kultivovat za podmínek, které jsou v tomto oboru známé a které se hodí pro expresi proteinu. Tak lze produkovat protein in vitro nebo lze buněk použít pro in vivo dodávku terapeutického proteinu (tj. pro genovou terapii).
-18CZ 295115 B6
Pod označením „primární buňky“ se v tomto popisu rozumějí buňky přítomné v suspenzi buněk izolovaných z tkáňového zdroje obratlovců (před tím, než se nanesou ne médium, tj. než se připojí k substrátu pro tkáňovou kulturu umístěnému v misce nebo v baňce), buňky přítomné v explantátu získaném z tkáně. Předpokladem je, že oba výše uvedené typy buněk se připojují k substrátu poprvé. Také se pod tímto značením rozumějí buněčné suspenze získané z buněk nanesených na médium.
Pod označením „sekundárních buňky“ nebo „buněčný kmen“ se rozumějí buňky na všech následujících stupních kultivace. Když se tedy poprvé primární buňka před tím nenanesená na
názvem „sekundární buňka“, přičemž tohoto názvu se používá i pro všechny buňky v následující pasážích. Sekundární buňky jsou buněčné kmeny skládající se ze sekundárních buněk, které byly jedno nebo vícekrát pasážovány. Buněčný kmen se skládá ze sekundárních buněk, které 1) byly jednou nebo vícekrát pasážovány, 2) vykazují konečný počet středních zdvojnásobení populace v kultuře; 3) vykazují vlastnosti kontaktně inhibovaného růstu závislého na zakotvení (závislost na zakotvení se nevztahuje na buňky, které jsou propagovány v suspenzní kultuře); a 4) nejsou imortalizovány.
„Imortalizované buňky“ jsou buněčné linie (na rozdíl od buněčných kmenů, poněvadž označení „kmen“ je rezervováno pro primární a sekundární buňky), jejichž kritickým znakem je, že vykazují zjevně neomezenou životnost v kultuře.
Buňky zvolené pro způsob podle vynálezu mohou spadat do následujících čtyř typů nebo kategorií: 1) buňky, které vtom stavu, v jakém se získají, neprodukují nebo neobsahují protein nebo produkt (jako protein, který není normálně exprimován buňkou nebo fúzovaný protein, který se normálně v přírodě nevyskytuje), 2) buňky, které produkují nebo obsahují protein nebo produkt, ale i jiném množství, než je požadováno (jako například pro množství nižším, než je fyziologicky normální nižší hladina v buňkách vtom stavu, v jakém se získají), 3) buňky, v tomto stavu, v jakém se získají, produkují protein nebo produkt na fyziologicky normální úrovni, ale v nichž má být obsah proteinu nebo produktu nebo jejich produkce zvýšena a 4) buňky, v nichž je žádoucí změnit profil regulace nebo indukce genu kódujícího protein.
Primární, sekundární a imortalizované buňky, které mají být transfekovány způsobem podle vynálezu, je možno získat z různých tkání a zahrnují všechny typy buněk, které lze uchovávat v kultuře. Z primárních a sekundárních buněk, které lze transfekovat způsobem podle vynálezu je možno například uvést fibroblasty, keratinocyty, epithelové buňky (například buňky epithelu mléčné žlázy a buňky střevního epithelu), gliální buňky, nervové buňky, tvarované krevní prvky (například lyfocyty a buňky kostní dřeně), svalové buňky prekurzory těchto typů somatických buněk. Pokud se má homologně rekombinantních buněk použít pro genovou terapii, přednostně se primární buňky získávají z individua, kterému se mají transfekované primární nebo sekundární buňky podat. Primární buňky však lze získat i od donoru (odlišné od recipienta) stejného diuhu.
Homologně rekombinantní imortalizované buňky je také možno produkovat způsobem podle vynálezu a používat pro produkci proteinu nebo genovou terapii. Jako neomezující příklady imortalizovaných lidských buněčných linií, které jsou užitečné pro produkci proteinu nebo genovou terapii způsobem podle vynálezu, je možno uvést buňky HT1080 (ATCC CCL 121). buňky HeLa a deriváty buněk HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), buňky rakoviny prsu MCF-7 (ATCC BTH 22), leukemické buňky K-562 (ATCC CCL 243), buňky karcinomu KB (ATCC CCL 17), buňky karcinomu vaječníků 2780AD (Van der Blick, A. M. et al., Cancer Res., 48: 5927-5923 (1988)), Rajiho buňky (ATCC CCL 86), Jurkatovy buňky (ATCC TIB 152), Namalwovy buňky (ATCC CRL 1432), buňky HL-60 (ATCC CCL 240), Daudiho buňky (ATCC CCL 213), buňky RPMI 8226 (ATCC CCL 155), buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), jakož i heterohybridomální buňky produkované při fúzi lidských buněk a buněk jiného druhu.
-19CZ 295115 B6
Rovněž je možno použít kmenů sekundárních lidských fíbroblastů, jako WI-38 (ATCC CCL 75) aMRC-5 (ATCC CCL 171).
Pro in vitro produkci proteinu nebo pro genovou terapii je možno dále použít primární, sekundární nebo imortalizované lidské buňky nebo primární, sekundární nebo imortalizované buňky jiných druhů, které vykazují vlastnosti genové amplifíkace in vitro.
Způsob konverze genu na kopii cDNA
Tento vynález se také týká způsobu, při němž se homologní rekombinace používá pro konverzi genu na kopii cDNA (genovou kopii, která postrádá introny). Kopie cDNA se může přenést do kvasinky nebo bakterie pro in vitro produkci proteinu nebo se může vložit do savčí buňky pro in vitro nebo in vivo produkci. Má-li se cDNA přenést do mikrobiálních buněk, zavádějí se dva konstrukty DNA obsahující zacílující sekvence homologní rekombinací, a to jeden konstrukt před (proti směru exprese) a druhý konstrukt za (ve směru exprese) lidským genem kódujícím terapeutický protein.
Tak například sekvence zaváděné před (proti směru exprese) gen zahrnují sekvence DNA, které jsou homologní k sekvencím DNA v nebo před DNA kódující první aminokyselinu maturovaného upraveného terapeutického proteinu; retrovirové dlouhodobé repetice (long term repeat LTR); sekvence kódující markér pro sekvenci v mikrobiálních buňkách; regulační prvek, který funguje v mikrobiálních buňkách a DNA kódující vedoucí peptid, který zajišťuje sekreci z mikrobiálních buněk s donorovým místem sestřihu. Sekvence zaváděné před (proti směru exprese) gen se zavádějí do blízkosti nebo před genomovou DNA kódující první aminokyselinu maturovaného upraveného terapeutického proteinu.
Sekvence zaváděné za (ve směru exprese) gen zahrnují sekvence DNA homologní k sekvencím genomové DNA v nebo za DNA kódující poslední aminokyselinu maturovaného upraveného proteinu; mikrobiální sekvence terminace transkripce; sekvence schopné řídit replikaci DNA v mikrobiálních buňkách a retrovirovou LTR. Sekvence zaváděné za gen se zavádějí do sousedství nebo za DNA kódující stop kodon maturovaného upraveného terapeutického proteinu.
Po zavedení těchto dvou konstruktů DNA do buněk se výsledné buňky uchovávají za podmínek vhodných pro homologní rekombinací mezi zaváděnou DNA a genovou DNA za vzniku homologně rekombinantních buněk. Jeden nebo oba konstrukty DNA mohou popřípadě kódovat jeden nebo více markérů pro pozitivní nebo negativní selekci buněk obsahujících daný konstrukt DNA. Selekční stupeň je možno připojit ke způsobu poté, co jsou jeden nebo oba konstrukty DNA zavedeny do buněk.
Alternativně mohou být jak sekvence kódující markér pro selekci v mikrobiálních buňkách, tak sekvence schopné řídit replikaci DNA v mikrobiálních buňkách, přítomný buď v konstruktu zaváděné zachováním před (proti směru exprese), nebo za (ve směru exprese) lidský gen kódující terapeutický protein, nebo může být markér pro selekci v mikrobiálních buňkách přítomen v konstruktu zaváděném zachováním za lidský gen kódující terapeutický protein a sekvence schopné řídit replikaci DNA v mikrobiálních buňkách mohou být přítomny v zacílujícím konstruktu zaváděném před tento gen.
Homologně rekombinantní buňky se potom kultivují za podmínek vhodných pro LTR řízenou transkripci, úpravu a reversní transkripci RNA produktu genu kódujícího terapeutický protein. Produkt reversní transkripce je konstrukt DNA obsahující benzintronovou kopií DNA kódující terapeutický protein, který je operativně připojen v sekvencích DNA obsahujícím dva exogenní konstrukty DNA popsané výše. Bezintronový konstrukt DNA produkovaný tímto způsobem se potom zavede do mikrobiální buňky. Potom se mikrobiální buňky kultivuje za podmínek vhodných pro expresi a sekreci terapeutického proteinu.
-20CZ 295115 B6
In vivo produktu proteinu
Homologně rekombinantní buňky podle vynálezu jsou užitečné jako populace homologně rekombinantních buněčných linií, populace homologně rekombinantních primárních nebo sekundárních buněk, homologně rekombinantní klonální buněčné kmeny nebo linie, homologně rekombinantní heterogenní buněčné kmeny nebo linie a směsi buněk, v nichž je přítomna alespoň jedna reprezentativní buňka z jedné ze čtyř výše uvedených kategorií homologně rekombinantních buněk.
Takových buněk je možno použít v dodávkovém systému pro léčení jednotlivce s abnormálním nebo nežádoucím stavem, který responduje na dodávku terapeutického produktu, jímž je buď 1) terapeutický protein (například protein, který chybí, nebo který je produkován v množství nižším než odpovídá fyziologickým potřebám jednotlivce, defektní nebo neúčinně nebo nevhodně utilizovaný v jednotlivci; protein snovými funkcemi, jako s enzymatickými nebo transportními funkcemi) nebo 2) terapeutická nukleová kyselina (například RNA inhibující expresi genu nebo vykazující vlastní enzymatickou aktivitu).
Při tomto způsobu, kterým se dodává terapeutický protein nebo nukleová kyselina, se mohou individuu, u něhož má být léčen abnormální nebo nežádoucí stav, nebo u něhož má být takovému stavu předcházeno, podávat homologně rekombinantní primární buňky, klonální buněčné kmeny nebo heterogenní buněčné kmeny v množství postačujícím a takovou cestou, aby došlo k expresi proteinu nebo exogenní DNA na fyziologicky relevantní úrovni nebo aby byl protein nebo exogenní DNA učiněn na fyziologicky relevantní úrovni dostupným. Pod označením „fyziologicky relevantní úroveň“ se rozumí úroveň, která se buď blíží úrovni, na níž je produkt v těle normálně produkován, nebo úroveň zajišťující zlepšení abnormálního nebo nežádoucího stavu.
Při jednom provedení tohoto vynálezu, které je vysvětleno v tomto popisu, se homologně rekombinantní imortalizované buněčné linie, které mají být podány, mohou uzavřít v jednom nebo více polopropustných bariérových zařízeních. Propustnost zařízení je taková, že se buňkám zabrání opustit zařízení po implantaci do živočicha, ale terapeutický produkt může volně odcházet z bariérového zařízení a vstupovat do prostoru obklopujícího implantát nebo do systemické cirkulace. Pro dosažení terapeutického užitku lze člověku například systematicky dodávat hGH, hEPO, lidský insulinotropin, hGM-CSF, hG-CSF, lidský α-interferon nebo lidský FSHp.
Bariérové zařízení je obzvláště užitečné a umožňuje za účelem léčení choroby člověka nebo zvířete nebo pro dosažení zemědělského užitku (tj. produkce masa a mléka) implantovat homologně rekombinantní z jiného druhu (homologně rekombinantní xenogenní buňky) nebo buňky pocházející z donoru, který se recipientem není histologicky kompatibilní (homogenně rekombinantní allogenní buňky). Bariérová zařízení také umožňují účelnou krátkodobou (tj. transientní) terapii tím, že jsou buňky snadno dostupné a mohou se odstranit, když je třeba léčebný režim z nějakého důvodu zastavit.
K tomuto účelu je možno použít řady syntetických, polosyntetických neb přírodních filtračních membrán. Jako neomezující příklady materiálů pro takové membrány je možno uvést celulosu, acetát celulosy, nitrocelulosu, polysulfon, polyvinylendifluorid, polyvinylchlorid a polymery derivátů vinylchloridu. Bariérová zařízení umožňují použít pro genovou terapii člověka primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk pocházejících zjiných druhů.
In vitro produkce proteinu
Homologně rekombinantní buňky z člověka nebo jiného druhu je podle tohoto vynálezu možno použít také pro in vitro produkci proteinu. Buňky se uchovávají za podmínek známých v tomto oboru, za nichž dochází k expresi proteinu. Proteiny exprimované popsanými postupy je možno
-21 CZ 295115 B6 purifikovat z buněčného lyzátu nebo supematantu, a tak se získá čistý požadovaný protein. Proteiny vyráběné tímto postupem zahrnují terapeutické proteiny, které lze dodávat člověku nebo jinému zvířeti konvenčními farmaceutickými cestami, například orálním, intravenosním, intramuskulárním, intranasálním nebo subkutánním podáváním. Takové proteiny zahrnují hGH, hEPO, lidský insulinotropin, hGM-CSF, hG-CSF, lidský α-interferon a lidský FSHp.
Použitými buňkami mohou být imortalizované, primární nebo sekundární buňky. Použití buněk z jiných druhů může být žádoucí v případě, v nichž jsou buňky z jiného zdroje než člověka výhodné pro účely produkce proteinu, nebo terapeuticky nebo obchodně užitečné. Tak například se účelně používá buněk lososa pro produkci lososího kalcitoninu, buněk získaných z vepře pro produkci vepřového inzulínu a buněk hovězího skotu pro produkci hovězího růstového hormonu.
Výhody
Způsoby, konstrukty DNA, buňky a výsledné proteiny podle vynálezu jsou všestranně využitelné a mají mnoho výhod ve srovnání se způsoby, kterých se v současné době používá v tomto oboru pro genové zacílování. Schopnost aktivovat endogenní gen umístěním exogenní regulační sekvence v různé poloze v rozmezí od bezprostředního sousedství vzhledem k genu, který je předmětem zájmu (přímá fúze k normální oblasti transkripce genu) do 30 kbp nebo ještě dále před (proti směru exprese) přepsanou oblastí endogenního genu, nebo do intronu endogenního genu, je výhodná pro expresi genu v buňce. Tak například se způsobu podle vynálezu může použít pro umístění regulačního prvku před (proti směru exprese) nebo za (ve směru exprese) oblastí, která normálně umlčuje nebo negativně reguluje gen. Umístění regulačního prvku před nebo za takovou oblastí může zvrátit dominantní negativní účinky, které normálně inhibují transkripci. Kromě toho lze oblasti DNA, které normálně inhibují transkripci nebo některé mají jinak škodlivý účinek na expresi genu, vypustit za použití zacílujících konstruktů uvedených v tomto popisu.
Kromě toho, jelikož je známo, že funkce promotoru silně závisí na místním prostředí, může se podrobit zkoumání širokého rozmezí poloh za účelem nalezení takového lokálního prostředí, v němž je funkce optimální. Jelikož však se ATG start kodony často vyskytují v savčí DNA (přibližně jeden výskyt na 48 bp), transkripce nemůže jednoduše začít v jakékoliv poloze před genem a produkovat transkript obsahující dlouhou vedoucí sekvenci předcházející správnému ATG start kodonu, poněvadž častý výskyt ATG kodonu v takové vedoucí sekvenci zabraňuje translaci správného genového produktu a činí tak informaci bezcennou.
Zavedení exogenního exonu, donorového místa sestřihu a popřípadě intronu a akceptorového místa sestřihu do zacílujících konstruktů obsahujících regulační oblast umožňuje tedy optimalizovat expresi genu tím, že se identifikuje optimální místo pro funkci regulační oblasti, aniž by bylo nutno brát zřetel na omezení vnucená potřebou vyhnout se nevhodným ATG start kodonům v produkované mRNA. Tím se dosáhne podstatně zvýšené flexibility při umísťování konstruktu a je možno aktivovat širší rozsah genů. Konstrukty DNA podle vynálezu jsou také užitečné například při způsobech produkce fúzovaných proteinů kódovaných rekombinantními nebo exogenními sekvencemi a endogenními sekvencemi.
Zacílování a amplifikace genu, které jsou popsány výše, jsou obzvláště užitečné při pozměňování exprese genů vytvářejících transkripční jednotky, jež jsou dostatečně velké, že je obtížné je izolovat a exprimovat nebo pro orientaci na geny, u nichž není celá oblast kódující protein k dispozici nebo u nichž celá tato oblast nebyla klonována. Konstrukty DNA popsané výše jsou tedy užitečné pro operativní připojení exogenních regulačních prvků k endogenním genům způsobem, který přesně definuje transkripční jednotku. Tím se dosahuje pružnosti v relativním umístění exogenních regulačních prvků a endogenních genů, získá se vysoce řízený systém pro dosažení a regulaci exprese genů, které jsou předmětem terapeutického zájmu.
-22CZ 295115 B6
Vysvětlení příkladů jak je uvedeno v tomto popisu, přihlašovatel demonstroval, že DNA je možno zavádět do buněk, jak primárních, sekundárních nebo imortalizovaných buněk obratlovců, a zeje možno ji integrovat do genomu transfekovaných buněk homologní rekombinací. Přihlašovatel dále demonstroval, že exogenní DNA vykazuje požadovanou funkci v homologně rekombinantních (HR) buňkách a že správně zacílené buňky je možno identifikovat na bázi detegovatelného fenotypu, který je jim udělen vhodně zacílenou DNA.
Přihlašovatel popsal konstrukci plazmidu užitečného pro zachování do specifického místa (místa HPRT) v genomu člověka a selekci založenou na fenotypu rezistence vůči léčivu (viz příklad la). Tento plazmid je označen šifrou pE3Neo. Jeho integrací do genomu buňky v místě HPRT poskytne buňky vykazující hprt“, 6-TG rezistentní fenotyp, které jsou také rezistentní vůči G418. Jak je uvedeno v tomto popisu, přihlašovatel demonstroval, že pE3Neo žádné funguje při zachování genu v získané buněčné linii lidských fibroblastů (příklad lb) tím, že ukázal, že DNA zavedená do získaných buněk je umístěna v exonu 3 genu HPRT.
Kromě toho přihlašovatel demonstroval zacílení genu v primárních a sekundárních fíbroblastech lidské kůže za použití pE3Neo (příklad lc). Dále je v tomto popisu demonstrováno, že modifikace konců DNA zvyšuje zacílení DNA do genomové DNA (příklady lc a le). Přihlašovatel také popsal způsoby, jimiž je možno gen vložit na předem zvolené místo v genomu buňky, jako primární, sekundární nebo imortalizované buňky, metodou zachování genu (příklad ld).
Vynález se kromě také týká způsobu produkce proteinu za použití transfekovaných buněk. Tento způsob zahrnuje transfekci buněk, jako jsou primární buňky, sekundární buňky nebo imortalizované buňky, exogenní DNA, která kóduje terapeutický produkt, nebo DNA, která postačuje pro zacílení na endogenní gen kódující terapeutický produkt. Tak například v příkladech lg, lh, lj, lk, 2, 3, 4 a 6 až 9 je popsána produkce proteinu zacílením zvoleného endogenního genu prvky sekvence DNA, které modifikují expresi tohoto endogenního genu.
Přihlašovatel také popsal konstrukty DNA a způsoby amplifíkace endogenního buněčného genu, který byl aktivován genovým zachováním (příklad 3, 6, 8 a 9).
Příklady lf až lh, 2, 4 a 6 ilustrují provedení, v němž se normální regulační sekvence před (proti směru exprese) genem hEPO modifikují pro umožnění exprese hEPO v kmenech primárních nebo sekundárních fibroblastů, které neexprimují EPO v detegovatelném množství, pokud jsou v netransfekovaném stavu. Při jednom provedení ponechává produkt zacílení normální protein EPO nedotčen, ale pod kontrolou myšího metallothioneinového promotoru.
Příklady li a lj ukazují použití podobných zacílujících konstruktů pro aktivaci endogenního genu růstového hormonu v primárních nebo sekundárních fíbroblastech člověka. Při jiných provedeních, která jsou popsána pro aktivaci exprese EPO v humánních fíbroblastech, jsou produkty zacílování chimérické transkripční jednotky, v nichž je první exon genu humánního růstového hormonu umístěn před (proti směru exprese) EPO exony 2 až 5. Produktem transkripce, která je konstruována myším metallothioneionovým promotorem, sestřihu a translace je protein, v němž jsou aminokyseliny 1 až 4 signálního peptidu hEPO nahrazeny aminokyselinovými zbytky 1 až 3 z hGH. Chimérická část tohoto proteinu, signální peptid, se odstraňuje před sekrecí z buňky.
V příkladu 5 jsou popsány zacílující konstrukty a způsoby produkce buněk, při nichž je gen (s introny) převeden na exprimovatelnou kopií cDNA tohoto genu (bez intronů) a získání takových exprimovantelných molekul cDNA v mikrobiálních (například kvasinkových nebo bakteriálních) buňkách.
V příkladu 6 je popsána konstrukce zacílujícího vektoru označeného šifrou pREPO4 pro dvojí selekci a selekci buněk, v nichž je amplifíkován gen dhfr. Plazmidu pREPO4 bylo použito pro
-23 CZ 295115 B6 amplifikaci loku hEPO v buňkách HT1080 (imortalizovaná buněčná linie pocházející z člověka) po aktivaci endogenního genu hEPO homologní rekombinací. Jak je to popsáno, stupňovitá selekce v médiu obsahujícím methotrexate má za následek 70násobné zvýšení produkce hEPO v buňkách rezistentních vůči 0,4μΜ methotrexate.
Příklady 7 a 8 popisují způsoby vkládání regulační sekvence před normální promotor EPO a způsoby produkce EPO za použití takového konstruktu. Kromě toho, příklad 8 popisuje amplifikaci zacíleného genu EPO produkovaného způsobem opsaným v příkladu Ί. Příklad 8 popisuje způsob zachování genu humánního α-interferonu, GM-CSF, G-CSF a FSHp pro vytvoření buněk užitečných pro produkci proteinu.
Příklady uvádějí způsoby aktivace nebo aktivace a amplifíkace endogenních genů zachování genu, který nevyžaduje manipulaci nebo jiná použití oblastí kódujících protein cílových genů. Za použití způsobů, konstruktů DNA nebo plazmidů, které jsou zde popsány, nebo jejich modifikací, které jsou zřejmé odborníkům v tomto oboru, je možno modifikovat expresi genu v buňkách majících vlastnosti požadované pro in vitro produkci proteinu (například farmaceutického činidla) nebo způsoby in vivo dodávky proteinu (například genovou terapii). Dvě strategie transkripční aktivace genu hEPO jsou ilustrovány na obr. 5 a 6.
Za použití způsobů a konstruktů DNA nebo plazmidů charakterizovaných v tomto popisu nebo jejich modifikací, které jsou zřejmé odborníkům v tomto oboru, je možno exogenní DNA kódující terapeutický produkt (například protein, ribozym nebo antimediátorovou RNA) vložit na předem určené místo v genomu primárních nebo sekundárních buněk obratlovce (například savce, ať již člověka nebo jiného živočicha).
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Produkce kmenů transfekovaných buněk genovým zacílením
K zacílení genu dochází, když se transfekční DNA buď integruje do sekvence chromozomální DNA, nebo když část sekvence chromozomální DNA nahradí prostřednictvím homologní rekombinace. K takovému jevu může sice docházet v průběhu jakéhokoliv daného transkripčního experimentu, ale obvykle je maskován obrovský nadbytek jiných jevů či procesů, při nichž se plazmidová DNA integruje nehomologní nebo nelegitimní rekombinací.
a) Vytvoření konstruktu užitečného pro selekci na proběhlé zacílení genu v humánních buňkách
Jeden přístup k selekci uskutečněného zacílení spočívá v genetické selekci na ztrátu funkce genu v důsledku integrace transkripční DNA. Humánní loku HPRT kóduje enzym hypoxanthin-fosforibosyl transferázu. Buňky hprt“ je možno podrobit selekci prostřednictvím růstu v médiu obsahujícím nukleosidový analog 6-thioguanidin (6-TG): buňky s allelou divokého typu (HPRT+) jsou usmrceny působením 6-TG, zatímco buňky s mutantnímí allelami (hprt“) mohou přežít. Buňky s uskutečněným zacílením,který zničil funkci genu hprt jsou proto selektovatelné v 6-TG médiu.
Pro konstrukci plazmidu pro zacílení do loku HPRT se 6,9kb HindlII fragment umístěný v polohách 11 960 až 18 869 v HPRT sekvenci (označení v Genebank: HUMHPRTB; Edwards a. et al., Geomics 6: 593 až 608 (1990)) a zahrnující exony 2 a 3 genu HPRT subklonuje do místa
-24CZ 295115 B6
HindlII pUC12. Výsledný klon se rozštěpí v jedinečném místě Xhol v exonu 3 fragmentu genu HPRT a vloží se 1,1 kb fragment Sall-Xhol obsahující neo gen z pMCINeo (Stratagene), přičemž se rozruší kódující sekvence exonu 3. Zvolí se jedna orientace se směrem transkripce neo opačným vzhledem k transkripci HPRT a tato orientace se označí šifrou pE3Neo. Nahrazení normálního exonu 3 HPRT pomocí neo-rozrušené verze má za následek vznik hprt“, 6-TG rezistentního fenotypu. Takové buňky jsou rovněž rezistentní vůči G418.
b) Zacílení genu v ustálené buněčné linii humánních fíbroblastů
Pro demonstraci zacílení v liniích imortalizovaných buněk a pro zajištění, že pE3Neo řádně funguje při zacílení genu se provede transfekce buněčné linie lidského fíbrosarkomu HT1080 (ATCC CCL 121) elektroporací pE3Neo.
Buňky HT1080 se před elektroporací uchovávají vHAT (hypoxanthin/aminopterin/xanthin) doplněném DMEM s 15 % telecího séra (Hyclone). Dva dny před elektroporací se buňky převedou do stejného média bez aminopterinu. Exponenciálně rostoucí buňky se trypsinizují a zředí v DMEM/15% telecí sérum, odstředí a resuspendují v PBS (fosfátem pufrovaný roztok chloridu sodného) na výslednou koncentraci buněk 13,3 χ 106 buněk/ml. pE3Neo se štěpí HindlII, z hlavního řetězce pUC12 se oddělí 8kb fragment HPRT-neo, tento fragment se puriflkuje extrakcí fenolem a srážením ethanolem a resuspenduje na koncentraci 600 pg/ml 50 μΐ (30 pg) tohoto přípravku se přidá do elektroporační kyvety (mezera mezi elektrodami 4 mm; Bio-Rad Laboratories) spolu se 750 μΐ buněčné suspenze (10 000 000 buněk). Elektroporace se provádí při 450 V, 250 pF pomocí zařízení Bio-Rad Gene Pulser; Bio-Rad Laboratories. Obsah kyvety se ihned přidá k DMEM s 15 % telecího séra, a tak se získá buněčná suspenze obsahující 1 milion buněk na 25 ml média. 25 ml zpracované buněčné suspenze se nanese na plotny pro tkáňové kultury o průměru 150 ml. Inkubace se provádí při 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého a po 24 hodinách se přímo na plotny přidá roztok G418 do konečné koncentrace 800 pg/ml G418. Po 5 dnech se médium nahradí DMEM/15% telecího séra/ 800 pg/ml G418. 9 dnů po elektroporací se médium nahradí DMEM/15% telecího séra/800 pg/ml G418 a 10pM 6-thioguaninu. Kolonie rezistentní vůči G418 6-TG se seberou za použití klonovacích válců 14 až 16 dnů po začátku dvojí selekce.
Výsledky pěti reprezentativních experimentů se zachováním v buňkách HT1080 jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
Transfekce Počet ošetřených buněk Počet klonů G418r6-TGr
1 1 χ 107 32
2 1 χ 107 28
3 1 χ 107 24
4 1 χ 107 32
5 1 χ 107 66
V případě transfekce 5 ukázaly kontrolní plotny určené pro stanovení celkového výtěžku kolonií G418r, že z počátečního počtu 1 χ 107 ošetřených buněk bylo možno vytvořit 33 700 kolonií G418r. Poměr případů s zacílením a bez zacílení činí tedy 66/33 700, tj. 1 : 510. Když se všech pět experimentů zkombinuje, zjistí se, že k zacíleníovým příhodám dochází s frekvencí 3,6 χ 106, tj. u 0,00036 % ošetřených buněk.
-25 CZ 295115 B6
Experimenty za použití restrikčního enzymu a hybridizace Southern s próbami pocházejícími z genů neo a HPRT ukazují, že gen neo je umístěn v loku HPRT v předem určeném místě, tj. v exonu 3 HPRT.
c) Zacílení genu v primárních a sekundárních fibroblastech lidské kůže pE3Neo se štěpí HindlII, z hlavního řetězce pUD12 se oddělí 8kb fragment HPRT-neo a ten se purifikuje extrakcí fenolem a srážením ethanolem. DNA se resuspenduje na koncentraci 2 mg/ml. 3 Miliony sekundárních fibroblastů lidské předkožky v objemu 0,5 ml se elektroporují při 250 V a 960 pF za použití 100 pg HindlII pENEO (50 pl). Provedou se 3 separátní transfekce, celkem u 9 milionů ošetřených buněk. Buňky se zpracují a podrobí selekci na rezistenci vůči G418. Pro selekci pomocí G418 se 500 000 buněk nanese na 150mm kultivační misku. Po 10 dnech od selekce se kultivační médium nahradí živným médiem pro lidské fíbroblasty obsahujícím 400 pg/ml G418 a 10pM 6-TG. V selekci za použití kombinace těchto dvou léčiv se pokračuje dalších 10 dnů. Misky se prohlédnou pod mikroskopem, aby se lokalizovaly kolonie humánních fibroblastů, které jsou rezistentní vůči oběma léčivům. Frakce kolonií 04181^ 6-TGr je přítomna v počtu 4 na 9 milionů ošetřených buněk. Tyto kolonie tvoří 0,0001 % (tj. 1 na jedem milion) všech buněk schopných tvořit kolonie. Kontrolní misky určené pro stanovení celkového výtěžku kolonií G418r ukazují, že z počátečního počtu 9 x 106 ošetřených buněk bylo možno získat 2 850 kolonií G418r. Poměr případů s zacílením a bez zacílení činí tedy 4/2 850, tj. 1 : 712.
Experimenty za použití restrikčního enzymu a hybridizace Southern s próbami pocházejícími z genů neo a HPRT ukazují, že gen neo je umístěn v loku HPRT v předem určeném místě, tj. v exonu 3 HPRT. Tyto experimenty také ukazují, že zacílení proběhlo v těchto čtyřech klonálních buněčných kmenech. Kolonie rezistentní vůči oběma léčivům se také izolují transfekcí primárních buněk (1/3 x 107).
Výsledky několika experimentů s zacílením za použití pE3Neo jsou sumerizovány v tabulce 2. pE3Neo rozštěpený HindlII se buď přímo transfekuje nebo předem zpracuje exonukleázou III pro vytvoření 5' jednořetězcových převisů před transfekcí (viz příklad lc). Zkoušejí se DNA přípravky s jednořetězcovými oblastmi o délce 175 až 930 bp. Za použití samotného pE3Neo štěpeného HindlII se analýzou pomocí restrikčního enzymu a hybridizace Southern identifikuje 1/799 G418-rezistentních kolonií majících zamýšlenou insercí genu neo v místě HPRT (celkem se izoluje 24 zacílených klonů). Zacílení je maximálně stimulován (přibližně lOnásobná stimulace), pokud mají převisy délky 175 bp. V tomto případě se získá 1/80 G418r kolonií vykazujících restrikční fragmenty, které slouží pro diagnostikaci zacílení v HPRT (celkem se izoluje 9 zacílených klonů).
Za použití podmínek a rekombinantních konstruktů DNA popsaných výše, je tedy v normálních humánních fibroblastech zacílení dobře pozorovatelné, přičemž celkovou četnost zacílení (počet zacílených klonů dělený celkovým počtem klonů stabilně transfekovaných na G418-rezistenci) je možno stimulovat transfekcí zacílujícími konstrukty obsahujícími jednořetězcové převislé ocasy za použití způsobu popsaného v příkladu le.
-26CZ 295115 B6
Tabulka 2
Zacílení do loku HPRT v humánních fíbroblastech
Zpracování pE3Neo Počet experimentů Počet zacil, kolonií na počet kolonií G418r Celkový počet zacil, klonů
štěpení HindlII 6 1/799 24
175bp převis 1 1/80 9
350bp převis 3 1/117 20
930bp převis 1 1/144 1
d) Vytvoření konstruktu pro cílenou inserci genu, který je předmětem terapeutického zájmu do humánního genomu a jeho použití při zacílení genu
Pro zacílení genu, který je předmětem terapeutického zájmu, do specifické polohy genomu recipientních primárních nebo sekundárních buněk se může použít varianty pE3Neo, v níž je gen, který je předmětem terapeutického zájmu, vložen do kódující oblastiHPRT vedle nebo v blízkosti genu neo. Takovou variantu pE3Neo je možno zkonstruovat pro zacílení genu hGH do loku HPRT.
pXGH5 (schematicky znázorněný na obr. 3) se štěpí ExoRI a 4,lkb fragment obsahující gen hGH a připojený myší metallothioneionový (mMT) promotor se izoluje. EcoRI převisy se vyplní klenowovým fragmentem z E. coli DNA polymerázy. Odděleně se pE3Neo rozštěpí Xhol, přičemž ke štěpení dojde ve spoji fragmentu neo a exonu 3 HPRT (3' spoj inserce do exonu 3). Xho převislé konce linearizovaného plazmidu se vyplní Klenowovým fragmentem z E. coli DNA polymerázy a výsledný fragment se liguje k 4,1 kg tupým koncem zakončenému fragmentu hGH-mMT. Bakteriální kolonie získané za použití této ligační směsi se podrobí screeningu pomocí analýzy restríkčním enzymem na ínserci jediné kopie fragmentu hGH-mMT a vybere se jedna orientace genu hGH přepsaného ve stejném směru jako gen neo. Tato orientace se označí šifrou pE3Neo/hGH. pE3Neo/hGH se štěpí HindlII, přičemž dojde k uvolnění 12,1 kb fragmentu obsahujícího sekvence HPRT, neo a mMT-hGH. Rozštěpená DNA se zpracuje a transfekuje do primárních nebo sekundárních humánních fibroblastů způsobem popsaným v příkladu lc. Selekcí se oddělí kolonie G418r TGr a provede se analýza na cílenou inserci sekvencí mMT-hGH a neo do genu HPRT, jak je to popsáno v příkladu lc. Jednotlivé kolonie se zkoušejí na expresi hGH za použití obchodně dostupného imunoeseje (Nichols Institute).
Sekundární lidské fibroblasty se transfekují pomocí pE3Neo/hGH a thioguanin-rezistentní kolonie se analyzují na stabilní expresi hGH a dále se provedou analýzy restríkčním enzymem ahydridizací Southem. Z 13 TGr analyzovaných kolonií se identifikuje 8 kolonií, v nichž došlo k vožení genu hGH do endogenního loku HPRT. Všech 8 kmenů stabilně exprimuje významná množství hGH s průměrnou úrovní exprese 22,7 pg/106 buněk/24 hodin. Alternativně se může pro zacílení EPO do humánního loku HPRT použít plazmidu pE3NeoEPO (viz obr. 4).
Použití homologní rekombinance pro zacílení genu, který je předmětem terapeutického zájmu do specifické polohy genomové DNA buňky je možno rozšířit a učinit užitečnějším pro produkci produktů určených pro terapeutické účely (například farmaceutických činidel) nebo pro genorovou terapii vložením genu, prostřednictvím kterého mohou být buňky obsahující amplifikované kopie tohoto genu podrobeny selekci expozicí vhodného selekčnímu režimu za použití léčiva. Tak například pE3Neo/hGH (příklad ld) je možno modifikovat vložením genu dhfr, ada nebo CAD do polohy bezprostředně vedle genu hGH nebo neo v pE3Neo/hGH. Takovým plazmidem se transfekují primární, sekundární nebo imortalizované buňky a identifikují se správné případy zacílení. Tyto buňky se dále zpracují zvyšujícími se koncentracemi léčiv vhodných pro příslušnou selekci buněk obsahujících amplifikované geny pro dhfr je selekčním činidlem methotrexate, pro CAD je selekčním činidlem N-(fosfonoacetyl)-L-aspartát (PALA) a pro ada je selekčním činidlem adeninnukleosid (například alanosin)). Tímto způsobem dojde
-27CZ 295115 B6 k integraci genu, který je předmětem terapeutického zájmu spolu s genem, na který se selektují amplifíkované kopie.
Genové inženýrství buněk pro produkci genů pro terapeutická použití lze tedy snadno regulovat předběžnou volbou místa, v němž se zacílující konstrukt integruje a v němž jsou amplifíkované kopie usídleny v amplifikovaných buňkách.
e) Modifikace konců DNA pro zvýšení zacílení
Okolnost, že 3' převislé konce se podílejí na určitých homologních rekombinančních drahách E. coli, bakteriofágu, S. cerevisiae a Xenopus laevis je podporována několika typu důkazů. V oocytech Xenopus laevis podlehly po mikroinjekci molekuly s 3' převislými konci o délce několika set bp rekombinaci s podobně upravenými molekulami mnohem rychleji, než molekuly s velmi krátkými převisy (4 bp) získanými štěpením restrikčním enzymem. Zdá se, že v kvasinkách je tvorba 3' převislých konců o délce několika set bp stupněm omezujícím rychlost při meiotické rekombinaci. Nebyl oznámen žádný důkaz, že se 3' převislé konce podílejí na rekombinaci v humánních buňkách a v žádném případě se nezjistilo, že by modifikované DNA substráty jakéhokoliv druhu podporovaly zacílení (jednu formu homologní rekombinace) u jakéhokoliv druhu. Experiment popsaný v následujícím příkladu a v příkladu lc ukazuje, že 5' převislé konce jsou účinné pro stimulaci zacílení v primárních, sekundárních a imortalizovaných lidských fíbroblastech.
Nejsou k dispozici žádné zprávy týkající se zvýšení zacílení modifikací konců transfekčních molekul DNA. Tento příklad slouží pro ilustraci, že modifikace konců lineárních molekul DNA konverzí konců těchto molekul s dvouřetězcové formy na jednořetězcovou formu může stimulovat zacílení do genomu primárních a sekundárních lidských fíbroblastů.
1100 mg plazmidu pE3Neo (příklad la) se štěpí HindlII. Této DNA se může použít přímo po extrakci fenolem a srážení ethanolem nebo se může 8kb HindlII fragment, který obsahuje pouze HPRT a neogen oddělit od sekvencí vektoru pUC12 elektroforézou na gelu.
Štěpení ExoIII DNA rozštěpené HindlII má za následek rozsáhlé exonukleolytické štěpení na obou koncích počínající vždy na volné 3' konci a ponechávající 5' převislé konce. Rozsah exonukleolytické akce, a tedy délku výsledných 5' převisů, je možno regulovat měněním doby štěpení pomocí ExoIII. Štěpení exoIII za použití 100 pg pE3Neo štěpeného HindlII se provádí za podmínek doporučených dodavatelem po dobu 30 sekund, 1 minuta, 1,5 minuty, 2 minuty, 2,5 minuty, 3 minuty, 3,5 minuty, 4 minuty, 4,5 minuty a 5 minut. Pro monitorování rozsahu štěpení se v každém časovém okamžiku na alikvotní díl štěpené směsi obsahující 5 pg DNA zpracovávané ExoIII působí nukleázou z fazole mungo (Promega) za podmínek doporučených dodavatelem a získané vzorky se frakcionují elektroforézou na gelu. Měří se rozdíl velikosti molekul pE3Neo štěpeného HindlII, který nebyl podroben žádnému zpracování a stejných molekul po zpracování ExoIII a nukleázou z fazolu mungo. Rozdíl velikosti dělený dvěma představuje průměrnou délku 5' převisu na každém konci molekuly. Za použití časových intervalů uvedených výše a teploty štěpení 30 °C by měly mít získané 5' převisy délky v rozmezí od 100 do 1000 bází.
pg DNA (celý štěpný produkt pE3Neo získaný pomocí HindlII) zpracované ExoIII z každého časového intervalu se purifikují a elektroporací zavede do primárních, sekundárních nebo imortalizovaných fíbroblastů člověka za podmínek uvedených v příkladu lc. Stupeň zvýšení zacílení za použití každého přípravku ošetřeného ExoIII se kvantifikuje zjištěním počtu kolonií
G418r 6-TGr a porovnáním tohoto počtu s zacílením za použití pE3Neo štěpeného HindlII bez zpracování ExoIII.
Účinek 3' převislých konců lze také kvantifikovat za použití analogického systému. V tomto případě se na pE3Neo štěpený HindlII působí T7 gen 6 exonukleázou (United States Biochemicals) po různý časový interval za podmínek doporučených dodavatelem. Stanovení rozsahu štěpení (průměrné délky 3' převisu vztaženo na jeden konec) a podmínky elektroporace jsou popsány v souvislosti s DNA ošetřenou ExoIII.
Stupeň zvýšení zacílení za použití každého přípravku zpracovaného T7 gen exonukleázou se kvantifikuje zjištěním počtu kolonií G418r 6-TGr a porovnáním tohoto počtu s zacílením za použití pE3Neo štěpeného HindlII bez zpracování T7 gen 6 exonukleázou.
Jsou možné i jiné způsoby vytvoření 5' a 3' převislého konce, například denaturace a teplotní hybridizace dvou lineárních molekul, které se vzájemně zčásti překrývají. Při tom vznikne směs molekul, z nichž každá obsahuje 3' převisy na obou koncích a 5' převisy na obou koncích, jakož i znovu teplotně hybridizované fragmenty, které jsou nerozlišitelné od výchozích lineárních molekuly. Délka převisů se stanoví jako délka DNA, která není společná pro oba dva fragmenty DNA.
f) Konstrukce zacílujících plazmidů pro umístění genu lidského erythropoietinu pod kontrolu myšího metallothioneionového promotoru v primárních, sekundárních a imortalizovaných fibroblastech člověka
Následující příklad slouží pro ilustraci jednoho provedení tohoto vynálezu, při němž se normální pozitivní a negativní regulační sekvence před (proti směru exprese) genem humánního erythropoietinu (hEPO) modifikují tak, aby umožnily expresí humánního erythropoietinu v primárních, sekundárních nebo imortalizovaných fibroblastech člověka, které v tom stavu, v jakém se získají, neexprimují významná množství hEPO.
Oblast ležící výlučně před (proti směru exprese) kódující oblastí humánního EPO je možno amplifikovat pomocí PCR. K tomuto účelu se po analýze publikované sekvence humánního EPO (označení podle Genbank: HUMERPA; Lin, F-K. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7580 až 7594 (1985) sestrojí tři sady primerů. Tyto dvojice primerů mohou amplifikovat fragmenty o délce 609, nebo 590 bp.
-29CZ 295115 B6
Tabulka 3
Primer Souřadnice Sekvence Velikost
HUMERPA fragmentu
Fl 2 -> 20 5' agcttctgggcttccagac. (SEQ ÍD NO 1)
R2 610 -* 595 5' GGGGTCCCTCAGCGAC (SEQ ID NO 2) 609 bp
F2 8 24 5' TGGGCTTCCAGACCCAG (SEQ ID NO 3)
R2 610 -* 595 5' GGGGTCCCTCAGCGAC 603
F3 21 -* 40 5' CCAGCTACTTTGCGGAACTC (SEQ ID NO 4)
R2 610 -* 595 5' GGGGTCCCTCAGCGAC 590 bp
Výše uvedené tři fragmenty se ve značném rozsahu překrývají a jsou pro účely opsané výše zaměnitelné. 609bp fragment ležící v rozmezí od -623 do -14 vzhledem k místu počátku translace (polohy nukleotidů 2 až 610 v HUMERPA) se liguje na obou koncích za použití linkerů Clal. Výsledný Clal spojený fragment se štěpí Clal a vloží do místa Clal plazmidů pBluescriptIIISK/+ (Stratagene) s takovou orientací, že nukleotidová poloha 610 HUMERPA sousedí s místem Sall v plazmidovém polylinkeru. Tento plazmid, p5'EPO, se může štěpit odděleně v jedinečných místech FspI nebo Sfíl ve fragmentu hEPO proti směru exprese (nukleotidové polohy HUMERPA 150 až 405) a ligovat k myšímu metallothioneionovému promotoru. Obvykle se také mohou u l,8kb fragmentu EcoRI-BglII genu mMT-I (neobsahující žádné kódující sekvence mMT; Hamer D. H. a Walling M., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273 až 388 (1982); tento fragment je také možno izolovat známými způsoby z myší genomové DNA za použití PCR primerů zkonstruovaných na základě analýzy sekvencí mTM dostupných od Genbank; tj. MUSMTI, MUSMTIP, MUSMTIPRM) otupit konce známými způsoby a může se provést ligance s p5'EPO štěpeným Sfíl (který má také tupé konce) nebo FspI. Zjistí se orientace výsledných klonů a pro zacílení primárních a sekundárních fibroblastů člověka se použije klonů, v nichž je místo BglIII z bývalého mMT v proximální poloze vzhledem k místo Sall plazmidového polylinkeru. Tato orientace řídí transkripci mMT směrem k nukleotidové poloze 610 (HUMERPA) výsledného konstruktu. Výsledné plazmidy se označí šiframi p5'EPO-mTF a p5'EPO-mMTS pro inserce mMT v místech FspI a Sfíl.
Přídavné sekvence umístěné proti směru exprese jsou užitečné v případech, v nichž je žádoucí modifikovat, vypustit a/nebo nahradit negativní regulační prvky nebo enhancery, ležící proti směru exprese („před“) počáteční cílovou sekvencí. V případě EPO se může vypustit negativní regulační prvek inhibující expresi EPO v extrahepatické a extrarenální tkáni (Semenze G. L. et al., M. Cell Biol. 10: 930 až 938 (1990)). Připraví se série delecí v 6kb fragmentu. Vypuštěné oblasti se mohou nahradit enhancerem se širokou aktivitou vůči hostitelské buňce (například enhanderem z Cytomegaloviru (CM V)).
-30CZ 295115 B6
Byla zvolena orientace 609bp fragmentu 5ΈΡΟ ve vektoru pBluescrioptIISK/+, poněvadž sekvence HUMERPA u 5' konce předchází místo BamHl (distální) a Hindlll (proximální). 6kb fragment BamHI-HindlII, který normálně leží před (proti směru exprese) 609bp fragmentem (Semenza G. L. et al., Mol. Cell. Biol. 10: 930 až 938 (1990)) se může izolovat zgenomové DNA známými způsoby. Tak například se může provést screening umělé chromozomální knihov bakteriofágu, kosmidu nebo kvasinky za použití 609bp PCR amplifíkovaného fragmentu, jako próby. Požadovaný klon bude obsahovat 6kb fragmentu BamHI-HindlII a jeho totožnost je možno potvrdit známým způsobem, porovnání jeho restrikční mapy s restrikční malou oblasti okolo genu hEPO. Alternativně se může zkonstruovat restrikční mapa genomu člověka před (proti směru exprese) genem EPO a za použití 609bp fragmentu, jako próby, se mohou identifikovat enzymy vytvářející fragment pocházející z místa mezi souřadnicemi 2 a 609 HUMERPA, který zasahuje za místo BamHl umístěné dále vepředu směru exprese.
Tento fragment se může izolovat elektroforézou na gelu z příslušného štěpného produktu humánní genomové DNA a ligovat do bakteriálního nebo kvasinkového klonovacího vektoru. Správný klon bude hybridizovat k 609bp próbě 5ΈΡΟ a bude obsahovat 6kb fragment BamHI-HindlII. Izolovaný 6kb fragment se vloží ve správné orientaci do p5'EPO, p5'EPO-mMTF nebo p5'EPOmMTS (tak, aby místo Hindlll sousedilo s nukleotidovou polohou 2 HUMPERPA). Přídavné sekvence umístěné v předu (proti směru exprese) je možno izolovat známými metodami za použití chromozomálních krokových technik nebo izolací kvasinkových umělých chromozomů hybridizujících k 609bp 5ΈΡΟ próbě.
Klonovací strategie popsané výše umožňují modifikovat sekvence umístěné před EPO in vitro pro další cílenou transfekci primárních, sekundárních nebo imortalizovaných humánních fibroblastů. Tyto strategie popisují jednoduché inserce promotoru mMT, jakož i deleci negativní regulační oblasti a deleci negativní regulační oblasti s nahrazením enhancerem se širokou aktivitou vůči hostitelské buňce.
g) Aktivita genu humánního EPO a izolace zacílených, primárních, sekundárních a imortalizovaných humánních fibroblastů screningem
Pro zachování se plazmidy rozštěpí restrikčními enzymy, které uvolní insert z hlavního řetězce plazmidu. V případě p5'EPO-mMTS se pomocí Hindlll a Sáli štěpením uvolní 2,4kb zacílujícího fragment, který se skládá z l,8kb mMT promotoru lemovaného na 5' straně 405 bp 3' straně 204 bp DNA pro zacílení tohoto konstruktu do regulační oblasti genu humánního EPO. Tato DNA nebo samotný 2,4kb zacílující fragment se purifikuje extrakcí fenolem a srážením ethanolem a transfekuje do primárních nebo sekundárních fibroblastů člověka za podmínek uvedených v příkladu lc.
Transfekované buňky se nanesou na 150mm plotny s živným médiem pro humánní fibroblasty. Po 48 hodinách se buňky přenesou na 24jamkové plotny při hustotě 10 000 buněk/cm2 (přibližně 20 000/jamka; pokud zacílení probíhá s poměrem 1 případ na 106 klonovatelných buněk (srovnej příklad lc), potom je zapotřebí pro izolaci jediné exprimující kolonie prozkoušet asi 50 jamek). Buňky, v nichž byla transfekční DNA zachováním zavedena do homologní oblasti před genem humánního EPO, exprimující hEPO pod kontrolou mMT promotoru. Po 10 dnech se úplné supernatant z jamek zkoušejí na expresi EPO za použití obchodně dostupného kitu pro imunoeseje (Amgen). Klony z jamek vykazujících syntézu hEPO se izolují za použití známých metod. Obvykle se postupuje tak, e se analyzují frakce heterogenních populací buněk oddělených do jednotlivých jamek nebo misek zkoušejí se frakce těchto pozitivních jamek, přičemž postup se opakuje podle potřeby, až se nakonec izoluje zacílená kolonie screeningem 96-jamkovým mikrotitrových ploten zaočkovaných při koncentraci 1 buňka/jamka.
Také se může analyzovat DNA z úplných lyzátů z ploten za použití PCR pro amplifikaci fragmentu. Při tom se používá mMT specifického primeru ve spojení s primerem ležícím před (proti
-31 CZ 295115 B6 směru exprese) nukleotidovou polohou 1 (podle HUMERPA). Tato dvojice primerů by měla amplifíkovat fragment DNA o přesně předpovězené velikosti na základě sekvence DNA. Pozitivní misky se trypsinizují a provede se nové vzorkování za použití postupně nižších koncentrací a příprava DNA, jakož i stupně pCR se opakují podle potřeby pro izolaci zacílených buněk.
Výše popsaných režimů zacílení se také může použít pro aktivaci exprese hGH v imortalizovaných humánních buňkách (například buňky HT1080 (ATCC CCL 121), buňky HeLa a deriváty buněk HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), buňky rakoviny prsu MCF-7 (ATCC BTH 22), leukiemické buňky K-562 (ATCC CC1 243), buňky karcinomu BK (ATCC CCL 17), buňky karcinomu vaječníků 2780AD (Van der Blick, A.M. et al., Cancer Res., 48: 5927-5932 (1988)), Rajiho buňky (ATCC CCL 86), Jurkatovy buňky (ATCC TIB 152), Namalwovy buňky (ATCC CRL 1432), buňky HL-60 (ATCC CCL 240), Daudiho buňky (ATCC CCL 213), buňky RPMI 8226 (ATCC CCL 155), buňky U-937 (ATCC CRL 1593), Bowesovy buňky melanomu (ATCC CRL 9607), buňky sublinie WI-378VA13 2R4 (ATCC CLL 75.1) a buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), jakož i různé heterohybridomální buňky) pro účely produkce hGH prokonvenční farmaceutickou dodávku.
h) Aktivace genu humánního EPO a izolace zacílených primárních, sekundárních a imortalizovaných fibroblastů člověka za použití pozitivního nebo kombinovaného, pozitivního a negativního, selekčního systému.
Strategie pro konstrukci p5'-EPO-mMTF a p5'EPO-mMTS a jejich derivátů s přídavným 6kb BamHI-HindlII fragmentem umístěným vpředu (proti směru exprese) může být následována přídavkem stupněm vložení genu neo do sousedství promotoru mMT. Kromě toho lze do sousedství se sekvencemi HUMERPA v polylinkeru pBluescriptIIISK/+ zavést negativní selekční markér, například gpt (z pMSG (Pharmacia) nebo jiného vhodného zdroje). V prvním případě se izoluje kolonie G418r a podrobí screeningu pomocí PCR amplifikace nebo analýzy DNA připravené ze směsi kolonií restrikčním enzymem a hybridizací Southern za účelem identifikace zacílených kolonií. V posledně uvedeném případě se kolonie G418R umístí do média obsahujícího 6-thioxanthin za účelem selekce na integraci genu gpt (Besnard C. et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139 až 4141 (1987)).
Kromě toho se může gen HSV-Tk umístit na opačnou stranu insertu jako gpt, což umožňuje selekci na neo a proti jak gpt, tak TK růstem buněk v živném médiu pro humánní fíbroblasty s obsahem 400 pg/ml G418, 100μΜ 6-thioxanthinu a 25 pg/ml gancykloviru. Dvojitá negativní selekce by měla poskytnout téměř absolutní jistotu při výběru případů, kde zacílení skutečně proběhlo a konečné potvrzení poskytuje analýza Southern blot.
Výše popsaných režimů zacílení se také může použít pro aktivaci exprese hEPO v imortalizovaných humánních buňkách (například buňky HT1080 (ATCC CCL 121), buňky HeLa a deriváty buněk HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), buňky rakoviny prsu MCF-7 (ATCC BTH 22), leukemické buňky K-562 (ATCC CCL 243), buňky karcinomu KB (ATCC CCL 17), buňky karcinomu vaječníků 2780AD (Van der Blick, A. M. et al., Cander Res., 48: 5927-5932 (1988)), Rajiho buňky (ATCC CCL 86), Jurkatovy buňky (ATCC TIB 152), Namalwovy buňky (ATCC CRL 1432), buňky HL-60 (ATCC CL 240), Daudiho buňky (ATCC CCL 213), buňky RPMI 8226 (ATCC CC1 155), buňky U-937 (ATCC CRL 1593), Bowesovy buňky melanomu (ATCC CRL 9607), buňky sublinie WI-38VA13 2R4 (ATCC CLL 75.1) a buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), jakož i různé heterohybridomální buňky) pro účely produkce hEPO pro konvenční farmaceutickou dodávku.
-32CZ 295115 B6
i) Konstrukce zacílujících plazmidů pro umístění genu růstového hormonu člověka pod kontrolu myšího metallothioneinového promotoru v primárních, sekundárních nebo imortalizovaných fíbroblastech člověka
Tento příklad slouží pro ilustraci jednoho provedení vynálezu, v němž se normální regulační sekvence umístěné proti směru exprese (před) genem humánního růstového faktoru modifikují za účelem umožnění exprese růstového faktoru člověka v primárních, sekundárních nebo imortalizovaných fíbroblastech člověka.
Za použití klonovaných fragmentů DNA pocházejících z 5' konce N genu humánního růstového hormonu se sestrojí podobné zacílující molekuly, jaké byly popsány v příkladu lf pro zacílení do regulační oblasti genu EPO. Přibližně l,8kb fragment ležící v rozmezí nukleotidových poloh 3787 až 5432 (polohy dvou míst EcoNI, která vytvářejí fragment o vhodné velikosti pro klonování nebo pro diagnostické štěpení subklonů obsahujících tento fragment) HUMGHCSA (podle označení Genbank) se amplifikuje za použití PCR primerů zkonstruovaných na základě analýzy sekvence HUMGHCSA v této oblasti. Tato oblast je umístěna od středu intronu 1 genu N hGH do polohy vepředu (proti směru exprese) přibližně 1,4 kb ve směru k 5' od místa startu translace. pUC12 se rozštěpí EcoRI a BamHI, zpracuje Klenowovým fragmentem pro vytvoření tupých konců a znovu se provede cyklizace na kružnicovou formu ve zředěném stavu, což má za následek vznik plazmidů, které ztratily místa EcoRI a BamHI. Výsledný plazmid se označí šifrou pUC12XEB. Linkery HindlII se ligují k amplifíkované fragmentu hGH a výsledný fragment se štěpí HindlII a liguje k pUC12XEB štěpenému HindlII. Výsledný plazmid, pUC12XEB-5'hGH se štěpí EcoRI a BamHI pro odstranění 0,5 kb fragmentu ležícího bezprostředně před místem iniciace transkripce gGH. Štěpená DNA se liguje k l,8kb fragmentu EcoRI-BglII genu mMT-I (bez kódujících sekvencí mMT; Hamer D.H. a Walling M., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273 až 388 (1982); tento fragment je také možno izolovat známými způsoby z myší genomové DNA za použití PCR primerů zkonstruovaných na základě analýzy sekvencí mMT dostupných od Genbank; tj. MUSMTI, MUSMTIP, MUSMTIPRM). Tento plazmid p5'-hGH-mMT obsahuje promotor mMT lemovaný na obou stranách sekvencemi hGH.
Klonovací strategie popsané výše umožňují modifikovat in vitro sekvence umístěné před hGH (proti směru exprese) pro následující zacílenou transfekci primárních, sekundárních nebo imortalizovaných humánních fibroblastů. Při popsané strategii se používá jednoduché inserce mMT promotoru. Použít je však možno i jiných strategií, při nichž lze například vložit před vloženou sekvencí mMT enhancer se širokou specifícitou vůči hostitelským buňkám.
j) Aktivace genu hGH a izolace zacílených primárních, sekundárních a imortalizovaných humánních fibroblastů screeningem
Pro zachování se plazmidy rozštěpí restrikčními enzymy, které uvolní insert z hlavního řetězce plazmidu. V případě p5'hTH-mMT se pomocí HindlII štěpením uvolní 2,9kb zacílující fragment, který se skládá z l,8kb mMT promotoru lemového na 5' straně a 3' straně DNA pro zacílení tohoto konstruktu do regulační oblasti genu hGH. Tato DNA nebo samotný 2,9kb zacílující fragment se purifikuje extrakcí fenolem a srážením ethanolem a transfekuje do primárních nebo sekundárních fibroblastů člověka za podmínek uvedených v příklad 11.
Transfekované buňky se nanesou na 150mm plotny s živným médiem pro humánní fibroblasty. Po 48 hodinách se buňky přenesou na 24jamkové plotny při hustotě 10 000 buněk/cm2 (přibližně 20 000/jamka; pokud zacílení probíhá s poměrem 1 případ na 106 klonovatelných buněk (srovnej příklad lc), potom je zapotřebí pro izolaci jediné exprimující kolonie prozkoušet asi 50 jamek). Buňky, v nichž byla transfekční DNA zachováním zavedena do homologní oblasti před genem hGH, exprimující hGH pod kontrolou mTM promotoru. Po 10 dnech se úplné supematanty z jamek zkoušení na expresi hGH za použití obchodně dostupného kitu pro imunoeseje (Nichols). Klony z jamek vykazujících syntézu hGH se izolují za použití známých metod. Obvykle se
-33 CZ 295115 B6 postupuje tak, že se analyzují frakce heterogenních populací buněk oddělených do jednotlivých jamek nebo misek zkoušejí se frakce těchto pozitivních jamek, přičemž postup se opakuje podle potřeby, až se nakonec izoluje zacílená kolonie screeningem 96-jamkových mikrotitrových ploten zaočkovaných při koncentraci 1 buňka/jamka.
Také se může analyzovat DNA z úplných lyzátů z ploten za použití PCR pro amplifíkaci fragmentu. Při tom se používá mMT specifického primerů ve spojení s primerem ležícím za (po směru exprese) nukleotidovou polohou 5432 (podle HUMGHCSA). Tato dvojice primerů by měla amplifíkovat fragment DNA o přesně předpovězené velikosti na základě této sekvence DNA. Pozitivní misky se trypsinizují a provede se nové vzorkování za použití postupně nižších koncentrací a příprava DNA, jakož i stupně PCR se opakují podle potřeby pro izolaci zacílených buněk.
Výše popsaných režimů zacílení se také může použít pro aktivaci exprese hGH v imortalizovaných humánních buňkách (například buňky HT1080 (ATCC CC1 121), buňky HeLa a deriváty buněk HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), buňky rakoviny prsu MCF-7 (ATCC BTH 22), leukemické buňky K-562 (ATCC CCL 243), buňky karcinomu KB (ATCC CCL 17), buňky karcinomu vaječníků 2780AD (Van der Blick, A.M. et al.., Cander Res., 48: 5927-5932 (1988)), Rajiho buňky (ATCC CCL 86), Jurkatovy buňky (ATCC TIB 152), Namalwovy buňky (ATCC CRL 1432), buňky HL-60 (ATCC CCL 240), Daudiho buňky (ATCC CCL 213), buňky RPMI 8226 (ATCC CCL 155), buňky U-937 (ATCC CRL 1593), Bowesovy buňky melanomu (ATCC CRL 9607), buňky sublinie WI-38VA13 2R4 (ATCC CLL 75.1) a buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), jakož i různé heterohybridomální buňky) pro účely produkce hGH pro konvenční farmaceutickou dodávku.
k) Aktivace genu humánního hGH a izolace zacílených primárních, sekundárních a imortalizovaných fibroblastů člověka za použití pozitivního nebo kombinovaného, pozitivního a negativního, selekčního systému
Strategie pro konstrukci p5'hGH-mMT může být následována přídavným stupněm vložení genu neo do sousedství promotoru mMT. Kromě toho lze do sousedství se sekvencemi HUMGHCSA vpolylinkeru pUC123 zavést negativní selekční markér, například gpt (z pMSG (Pharmacia) nebo jiného vhodného zdroje). V prvním případě se izolují kolonie G418r a podrobí screeningu pomocí PCR amplifikace nebo analýzy DNA připravené ze směsi kolonií restrikčním enzymem a hybridizací Southern za účelem identifikace zacílených kolonií. V posledně uvedeném případě se kolonie G418r umístí do média obsahujícího thioxanthin za účelem selekce na integraci genu gpt (Bernard C. et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139 až 4141 (1987)). Kromě toho se může gen HSV-TK umístit na opačnou stranu insertu jako gpt, což umožňuje selekci na neo a proti jak gpt, tak TK růstem buněk v živném médiu pro humánní fíbroblasty s obsahem 400 pg/ml G418, 100μΜ 6-thioxanthinu a 25 μg/ml gancykloviru. Dvojitá negativní selekce by měla poskytnout téměř absolutní jistotu při výběru případů, kde zacílení skutečně proběhlo a konečné potvrzení poskytuje analýza hybridizací Southern.
Výše popsaných režimů zacílení se také může použít pro aktivaci exprese hGH v imortalizovaných humánních buňkách (například buňky HT1080 (ATCC CCL 121), buňky HeLa a deriváty buněk HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), buňky rakoviny prsu MCF-7 (ATCC BTH 22), leukemické buňky K-562 (ATCC CC1 243), buňky karcinomu KB (ATCC CCL 17), buňky karcinomu vaječníků 2780AD Van der Blick, A. M. et al., Cancer Res., 48: 5927-5932 (1988)), Rajiho buňky (ATCC CCL 86), Jurkatovy buňky (ATCC TIB 152), Namolwovy buňky (ATCC CRL 1432), buňky HL-60 (ATCC CCL 240), Daudiho buňky (ATCC CCL 213), buňky RPMI 8226 (ATCC CCL 155), buňky U-937 (ATCC CRL 1593), Bowesovy buňky melanomu (ATCC CRL 9607), buňky sublinie WI-38VA13 2R4 (ATCC CLL 75.1) a buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), jakož i různé heterohybridomální buňky) pro účely produkce hGH pro konvenční farmaceutickou dodávku.
-34CZ 295115 B6
Zacílené konstrukty připravené podle příkladů If a li a použité v příkladech lg, lg, lj a lk mohou být modifikovány tak, aby obsahovaly amplifíkovatelné selektovatelný markér (například ada, Dhfr nebo CAD), což je užitečné pro selekci buněk, v nichž je amplifíkován aktivovaný endogenní gen a amplifíkovatelné selekční markér. Takové buňky, které exprimují, nebo které jsou schopny exprimovat endogenní gen kódující terapeutický produkt, mohou sloužit pro produkci proteinů (například hGH nebo hEPO) nebo pro konvenční dodávku farmaceutického činidla, tj. pro generovou terapii.
1) Transfekce primárních a sekundárních fibroblastů exogenní DNA a selektovatelným markerovým genem elektroporací
Exponenciálně rostoucí fíbroblasty nebo fíbroblasty v časné stacionární fáze se trypsinizují a spláchnou z povrchu plastu živným médiem. Odebere se alikvotní vzorek buněčné suspenze pro spočítání buněk a ostatní buňky se odstředí. Odsaje se supernatant a peleta se resuspenduje v 5 ml elektroporačního pufru (20mM HEPS o pH 7,3, 137mM chlorid sodný, 5mM chlorid draselný, 0,7mM hydrogenfosforečnan sodný a 6mM dextrosa). Buňky se znovu odstředí, supernatant se odsaje a potom se buňky resuspendují v elektroporačním pufru obsahujícím 1 mg/ml acetylovaného albuminu z hovězího séra. Výsledná buněčná suspenze obsahuje přibližně 3 x 106 buněk/ml. Elektroporace by se měla provádět ihned po resuspendování. Plazmidová DNA v podobě nadšroubovice se přidá do sterilní kyvety (mezera mezi elektrodami 4 mm; Bio-Rad Laboratories). Konečná koncentrace DNA je přibližně alespoň 120 pg/ml. Potom se do kyvety přidá 0,5 ml buněčné suspenze obsahující asi 1,5 x 106 buněk a buněčná suspenze se jemně promíchá s roztoku DNA.
Elektroporace se provádí za použití zařízení Genepulser (Bio-Rad), přičemž kapacita je nastavena na 960 pF a napětí na 250 až 300 V. Úměrně se zvyšování napětí se snižuje přežití buněk, ale dramaticky se zvyšuje procentický podíl přeživších buněk se stabilně zavedenou DNA do genomu. Za těchto podmínek by měla doba pulsu trvat přibližně 14 až 20 ms.
Elektroporované buňky se uchovávají při teplotě místnosti po dobu asi 5 minut a potom se obsah kyvety jemně odstraní sterilní přenosovou pipetou. Buňky se přímo přidají do 10 ml předehřátého živného média (médium popsané výše s obsahem 15 % telecího séra) a lOcm misce a inkubují se za výše uvedených podmínek. Následující den se médium odsaje a nahradí 10 ml čerstvého média, načež následuje další 16 až 24hodinová inkubace. Subkultura buněk pro stanovení účinnosti klonování a pro selekci na G418-rezistentní kolonie se vytvoří následující den. Buňky se trypsinizují, spočítají a navzorkují a médium. Obvykle se fíbroblasty aplikují při koncentraci 103 buněk/lOcm miska (v případě stanovení účinnosti klonování) a při koncentraci 1 až 2x 104 buněk/lOcm miska (v případě selekce na rezistenci vůči G418).
Selekce humánních fibroblastů na rezistenci vůči G418 se provádí v médiu obsahujícím 300 až 400 pg/ml G418 (geneticin disulfát, což je sůl s přibližně 50% účinností; Gibco) v živném médiu pro fíbroblast (z 15% telecího séra). Účinnost klonování se stanoví za nepřítomnosti G418. Navzorkované buňky se inkubují 12 až 14 dnů a po této době se kolonie fixují formalinem, obarví krystalovou violetí a spočítají (v miskách určených pro stanovení účinnosti klonování) nebo se izolují za použití klonovací válců (v miskách s G418). Elektroporace a selekce králičích fibroblastů se provádí v podstatě stejným způsobem jako v případě humánních fibroblastů, pouze s tím rozdíle, že se použije odlišných selekčních podmínek. Králičí fíbroblasty se podrobí selekci na rezistenci vůči G418 v médiu s obsahem 1 g/ml G418.
Fíbroblasty se izolují z čerstvě odříznuté předkožky člověka. Kultury se zaočkují za použití 50 000 buněk/cm. Použije se DMEM z 10 % telecího séra. Když jsou kultury konfluentní, fíbroblasty se sklidí trypsinizací a elektroporací se provede transfekce. Elektroporační podmínky se vyhodnotí transfekcí plazmidem pcDNEO (viz obr. 5). Reprezentativní elektroporační experiment, při němž se používá téměř optimálních podmínek (60 pg plazmidu pcDNEO při elektroporačním napětí 250 V a kapacitanci 960 pF), vede ke vzniku jedné G418 kolonie na 588
-35 CZ 295115 B6 ošetřených buněk (0,17 % všech ošetřených buněk), tj. jednu G418 kolonii na 71 klonovatelných buněk (1,4 %).
Když se provede 9 oddělených elektroporačních experimentů za téměř optimálních podmínek (60 pg plazmidů pcDNEO při elektroporačním napětí 300 V a kapacitanci 960 pF), získá se průměrně 1 kolonie G418 na 1899 ošetřených buněk (0,05 %), přičemž naměřené rozmezí je 1/882 až 1/7 500 ošetřených buněk. To odpovídá v průměru 1 kolonii G148 na 38 klonovatelných buněk (2,6 %).
Nízkopasážované primární humánní fíbroblasty se převedou na buňky exprimující hGH kontransfekcí s plazmidy pcDNEO a pXGH5. Obvykle se 60 pg ekvimolámí směsi obou plazmidů transfekuje za téměř optimálních podmínek (elektroporační napětí 300 V a kapacitance nastavená na 960 pF). Výsledky tohoto experimentu vedou ke vzniku jedné kolonie G418 na 14 705 ošetřených buněk.
Data exprese hGH pro tyto a jiné buňky izolované za totožných transfekčních podmínek jsou sumarizována dále. Nakonec lze 98 % všech G418r kolonií expandovat pro vytvoření masových kultur.
Počet analyzovaných klonů G418r
Počet klonů exprimovaných G418r/hGH
Průměrná úroveň exprese hGH
Maximální úroveň exprese hGH
154
2,5 pg hGH/ΊΟ6 buněk/24 h 23,0 pg hGH/ΊΟ6 buněk/24 h
Stabilní transfektanty byly též získány elektroporací primárních nebo sekundárních humánních fíbroblastů za použití pXGH301, konstruktu DNA, v němž jsou přítomny geny neo a hGH ve stejné plazmidové molekule. Dvoustupňovým postupem se zkonstruuje pXGH301. ZpBR322 (polohy pBR322 23 až 651) se izoluje Sall-Clal fragment, a ten se vloží do Sall-Clal štěpeného pcDNEO, přičemž se zavede místo BamHI před (proti směru exprese) SV40 časně promotující oblast pcDNEO. Tento plazmid pBNEO, se štěpí BamHI a izoluje se 2,lkb fragment obsahující gen neo pod kontrolou SV40 časného promotoru. Tento fragment se vloží do pXGH5 štěpeného BamHI. Plazmid s jednou insercí 2,1 kb fragmentu BamHI se izoluje, v němž neo a hGH jsou přepsány ve stejném vzájemném směru. Tento plazmid se označí šifrou pXGH301. Tak například se 1,5 x 106 buněk elektroporuje 60 pg pXGH301 při napětí 300 V a kapacitanci 960 pF. Z transfekovaných sekundárních fíbroblastů se izolují kolonie rezistentní vůči G418 při četnosti 652 G418 rezistentních kolonií na 1,5 x 10 ošetřených buněk (1/2 299 ošetřených buněk). Přibližně 59 % těchto kolonií exprimuje hGH.
Příklad 2
Konstrukce zacílujících plazmidů, které poskytují chimérické transkripční jednotky, v nichž jsou fúzovány sekvence humánního růstového hormonu a erythropoietinu
Následující příklad slouží pro ilustraci dvou dalších provedení tohoto vynálezu, při nichž se normální regulační sekvence před (proti směru exprese) genem humánního erythropoietinu (hEPO) modifikují tak, aby umožnily expresi humánního erythropoietinu v primárních nebo sekundárních kmenech fíbroblastů, které v netransfekovaném stavu, v jakém se získají, neexprimují detekovatelná množství hEPO. V těchto provedeních jsou produkty zacílení chimérické transkripční jednotky, v nichž je první exon genu humánního růstového hormonu umístěn před exony 2 až 5 hEPO. Produktem transkripce, sestřihu a translace je protein, v němž jsou aminokyseliny 1 až 4 signálního peptidu hEPO nahrazeny aminokyselinovými zbytky 1 až 3 z hGH. Dvě uváděná provedení se od sebe liší relativními polohami třetích regulačních sekvencí,
-36CZ 295115 B6 které jsou vloženy, a specifickým profilem sestřihu, k němuž musí dojít, aby vznikl finální upravený transkript.
Zkonstruuje se plazmid pXEPO-10 pro nahrazení exonu 1 hEPO exonem 1 hGH genovým zacílením na endogenní gen hEPO v humánním chromozomu 7. Plazmid pXEPO-10 se zkonstruuje takto: nejprve se zkonstruuje intermediámí plazmid pT163 vložením 6kb fragmentu HindlII-BamHI (viz příklad lf) ležícího před (proti směru exprese) kódující oblastí hEPO do pBluescriptIISK+ (Stratagene, LaJolla, CA, USA), štěpeného HindlII-BamHI. Produkt této ligance se štěpí Xhol a HindlII a liguje k l,lkb HindlII-Xhol fragmentu zpMClneoPolyA (Thomas K.R. a Capecchi M. R., Cell 51: 503 až 512 (1987), který je dostupný od firmy Stratagene, LaJolla, CA, USA) pro vytvoření pT163. Oligonukleotidů 13.1 - 13.4 se využije při rekcích PCR pro vytvoření fúzovaného fragmentu, v němž jsou sekvence myšího metallothioneinového 1 (mMT-I) promotoru- hGH exonu 1 přídavně fúzovány k sekvencím hEPO intronu 1.
Nejprve se oligonukleotidů 13.1 a 13.3 použije pro amplifikaci přibližně 0,73kb fragmentu mMT-I promotor - hGH exon 1 z pXGH5 (obr. 5). Potom se oligonukleotidů 13.2 a 13.4 použije pro amplifikaci přibližně 0,57kb fragmentu, kteiý sestává převážně hEPO intronu 1 z humánní genomové DNA. Nakonec se tyto dva amplifikované fragmenty smísí a dále amplifikují s oligonukleotidy 13.1 a 13.4 pro vytvoření finálního fúzovaného fragmentu (fúzovaný fragment 3) lemovaného místem Sáli na 5' straně seskupení mMT-I a místem Xhol na 3' straně sekvence intronu 1 hEPO. Fúzovaný fragment 3 se štěpí Xhol a Sáli a liguje kpT163 štěpenému Xhol. Ligační směs se transformuje do E. coli a klon obsahující jeden insert fúzovaného fragmentu 3, v němž je místo Xhol regenerováno na 3' straně sekvencí intronu 1 hEPO se identifikuje a označí šifrou pXEPO-10.
13.1 5' TTTTGTCGAC GGTACCTTGG TTTTTAAAAC C
Sáli (SEQ ID NO KpnI 5)
13.2 5' CCTAGCGGCA (SEQ ID NO ATGGCTACAG GTGAGTACTC GCGGGCTGGG CG 6)
13.3 5' CGCCCAGCCC (SEQ ID NO GCGAGTACTC ACCTGTAGCC ATTGCCGCTA GG 7)
13.4 5' TTTTCTCGAG CTAGAACAGA TAGCCAGGCT G
Xhol (SEQ ID NO 8)
Oblast oligonukleotidu 13.1, která není vytištěna tučně, je identifikována jako oblast promotoru mMT-I s přirozeným místem KpnI u jejího 5' konce. Tučně vysázená oblast označuje ocas s místem Sáli pro konverzi 5' hranice na místo Sáli. Tučně vytištěná oblast oligomerů 13.2 a 13.3 označuje sekvence hGH, zatímco oblasti, které nejsou vytištěny tučně, představují sekvence intronu 1 z genu hEPO. Oblast v oligomerů 13,4, která není vytištěna tučně, je totožná s posledními 25 bázemi intronu 1 hEPO. Tučně vytištěná oblast zahrnuje ocas s místem Xhol pro konverzi 3' hranice amplifikovaného fragmentu na místo Xhol.
Plazmid pXEPO-11 se sestrojí pro zavedení promotoru mMT-I a exonu lhGH proti směru exprese strukturního genu hEPO a promotorové oblasti do endogenního loku hEPO v humánním chromozomu 7 genovým zacílením.
-37CZ 295115 B6
Plazmid pXEPO-l 1 se zkonstruuje takto:
Oligonukleotidů 13.1 a 13.5 až 13.7 se využije při rekcích PCR pro vytvoření fúzovaného fragmentu, v němž jsou sekvence myšího metallothioneionového 1 (mMT-I) promotoru - hGH exonu 1 přídavně fúzovány k sekvencím hEPO od -1 do -630 vzhledem ke kódovací oblasti hEPO. Nejprve se oligonukleotidů 13.1 a 13.6 použije pro amplifikací přibližně 0,75kb fragmému niMT-l promo=aon 11 pí® (ου: 3);
Pm si AligMutotidů Π.5 a 11.7 paušija pro flmplifítooi přibližně O.řtíkb fragmentu humánní genomové DNA, který sestává převážně ze sekvencí hEPO od -1 do -620 vzhledem ke kódující oblasti hEPO. Oba oligonukleotidy 13.5 a 13.6 obsahují lObp linkerovou sekvenci umístěno v oblasti hGH intron 1 - hEPO promotor, která odpovídá donorovému místu sestřihu intronu 1 hEPO.
Nakonec se tyto dva amplifikované fragmenty smísí a dále amplifíkují s oligonukleotidy
13.1 a 13.7 pro vytvoření finálního fúzovaného fragmentu (fúzovaný fragment 6) lemovaného místem Sáli na 5' straně seskupení mMT-1 a místem Xhol na 3' straně oblasti promotoru hEPO. Fúzovaný fragment 6 se štěpí Xhol a Sáli a liguje kpT163 štěpenému Xho. Ligační směs se transformuje do E. coli a klon obsahující jeden insert fúzovaného fragmentu 6, v němž je místo Xhol regenerováno na 3' straně sekvencí promotoru hEPO se identifikuje a označí šifrou pXEPO-11.
13.5 5' GACAGCTCAC CTAGCGGCAA TGGCTACAGG TGAGTACTC
AAGCTTCTGG GCTTCCAGAC CCAG (SEQ ID NO 9) HindlII
13.6 5' CTGGGTCTGG AAGCCCAGAA GCTTGAGTAC TCACCTGTAG
HindlII
CCATTGCCGC TAGGTGAGCT GTC (SEQ ID NO 10)
13.7 5' TTTTCTCGAG CTCCGCGCCT GGCCGGGGTC CCTC
Xhol (SEQ ID NO 11)
Oblasti oligopeptidu 13.5 a 13.6, které jsou vytištěny tučně, označují sekvence hGH. Oblasti vytištěné kurzívou odpovídající prvním 10 bp intronu 1 hEPO. Zbytek oligopeptidů odpovídá sekvencím hEPO od -620 do -597 relativně vzhledem ke kódující oblasti hEPO. Oblast oligopeptidu 13.7, která není vytištěna tučně je totožná s bázemi -1 až -24 vzhledem ke kódující oblasti hEPO. Oblast vytištěná tučně zahrnuje ocas s místem Xhol pro konverzi 3' hranice amplifikovaného fragmentu na místo Xhol.
Plazmid pXEPO-10 se může použít pro genové zacílování tak, že se pomocí BamHi a Xhol vyštěpí 7,3kb fragment obsahující fúzovaný produkt mMT-I/hGh, který je z obou stran lemován sekvencemi hEPO. Tento fragment (zacíleníový fragment 1) neobsahuje žádné kódující sekvence hEPO, nýbrž obsahuje pouze sekvence ležící mezi polohou -620 a přibližně -6620 proti směru exprese od kódující oblasti hEPO a sekvence intronu 1 hEPO pro řízení zacílení na lokus humánního EPO.
Zacílený fragment 1 se transfekuje do primárních nebo sekundárních fíbroblastů z lidské kůže za použití podobných podmínek, jaké jsou uvedeny vpříkladu lc. G418-rezistentní kolonie se
-38CZ 295115 B6 sesbírají z jednotlivých jamek 96-jamkových ploten a podrobí screeningu na expresi EPO testem ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Buňky, v nichž se transfekční DNA interfeguje náhodně do humánního genomu, nemohou produkovat EPO. Buňky, v nichž transfekční DNA podlehla homologní rekombinaci s intronem 1 endogenního hEPO a sekvencemi hEPO umístěnými proti směru exprese a dalšími sekvencemi hEPO obsahuje chimérický gen, v němž mMT-I promotor a nepřepsané sekvence a hGH 5' nepřeložené sekvence a hGH exon 1 nahrazují normální hEPO promotor a hEPO exon 1 (viz obr. 1). Sekvence, které nepocházejí z hEPO v zacílujícím fragmentu 1 jsou připojeny k sekvencím hEPO za (ve směru exprese) intronem 1 hEPO. Nahrazení normální regulační oblasti hEPO promotorem mMT-I aktivuje gen EPO ve fibroblastech, které normálně hEPO neexprimují. Nahrazení exonu 1 hEPO exonem lhGH má za následek vznik proteinu, v němž jsou čtyři první aminokyseliny signálního peptidů hEPO nahrazeny aminokyselinami 1 až 3 z hGH, za vzniku funkčního chimérického signálního peptidů, který se z maturovaného proteinu odstraní posttranslačním zpracováním a vyloučí se z exprimujících buněk.
Plazmidu pXEPO-11 se může použít pro genové zacílování tak, že se pomocí BamHl a Xhol vyštěpí 7,4kb fragment obsahující fúzovaný produkt mMT-I/hGH, který je z obou stran lemován sekvencemi hEPO. Tento fragment (zacílující fragment 2) neobsahuje žádné kódující sekvence hEPO, nýbrž obsahuje pouze sekvence ležící mezi polohou -1 a přibližně -6620 proti směru exprese od kódující oblasti hEPO pro řízení zacílení na lokus humánního EPO.
Zacílený fragment 2 se transfekuje do primárních nebo sekundárních fibroblastů z lidské kůže za použití podobných podmínek, jaké jsou uvedeny v příkladu lg. G418-rezistentní kolonie se sesbírají z jednotlivých jamek 96-jamkových ploten a podrobí screeningu na expresi EPO testem ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Buňky, v nichž se transfekční DNA integruje náhodně do humánního genomu, nemohou produkovat EPO. Buňky, v nichž tranfekční DNA podlehla homologní rekombinaci s endogenním promotorem hEPO a sekvencemi hEPO umístěnými proti směru exprese, obsahují chimérický gen, v němž mMT-I promotor a nepřepsané sekvence, hGH 5' nepřeložené sekvence a hGH exon 1 a lObp linker skládající se z první 10 bází hEPO intronu 1 jsou vloženy do místa HindlII ležící v poloze -620 relativně vzhledem ke kódující oblasti hEPO (viz obr. 2).
Umístění promotoru mMT-I ve směru proti směru exprese od normálně tichého promotoru hEPO bude řídit syntézu následující informace v primárních nebo sekundárních fibroblastech kůže: (5' až 3') nepřeložené sekvence metallothioneinu a hGH, hGH exon 1,10 bází DNA identických s prvními 10 bp hEPO intronu 1 a normální hEPO promotor a hEPO exon 1 (-620 až +13 vzhledem ke kódující oblasti hEPO). lObp sekvence linkeru z intronu 1 hEPO působí jako donorové místo sestřihu pro fúzi hGH exonu 1 k následujícímu (ve směru exprese) akceptorovému místu sestřihu, které leží bezprostředně před (proti směru exprese) exonem 2 hEPO. Při úpravě výsledného transkriptu se proto sestřihem odstraní exon 1 promotoru hEPO a sekvence intronu 1. Nahrazení exonu 1 hEPO exonem 1 hGH má za následek vznik proteinu, v němž jsou čtyři první amino- kyseliny signálního peptidů hEPO nahrazeny aminokyselinami 1 až 3 z hGH, za vzniku funkčního chimérického signálního peptidů, který se z maturovaného proteinu odstraní posttranslačním zpracováním a vyloučí se z exprimujících buněk.
Známými postupy se může sestrojit série konstruktů, které se podobají pXEPO-10 a pXEPO-11. V těchto konstruktech se mohou relativní polohy sekvencí promotoru mMT-I a hGH, jakož i poloha, v níž se sekvence mMT-I/hGH vkládají do předních (proti směruje exprese) sekvencí hEPO, měnit pro vytvoření alternativních chimérických transkripčních jednotek, které usnadňují zacílení genu, dosažení účinnější exprese fúzovaných transkriptů nebo jiných požadovaných vlastností. Takové konstrukty budou poskytovat podobné výsledky tak, že se fúzovaný gen hGH hEPO umístí pod kontrolu exogenního promotoru zacílením genu na normální lokus hEPO.
Tak například 6kb fragment HindlII-BamHI umístěný proti směru exprese od genu hEPO (viz příklad lf) obsahuje řadu sekvencí rozpoznávaných restrikčním enzymem, kterých lze použít
-39CZ 295115 B6 jako místo pro vložení genu neo a fúzovaného fragmentu mMT-I promotor/hGH. Jedním takovým místem je místo BglII ležící přibližně l,y3 kb před (proti směru exprese) místem HindlII. Toto místo je jedinečné v této oblasti a může se ho použít pro vložení jednoho nebo více selektovatelných markérů a regulační oblasti pocházející zjiného genu, která bude sloužit pro aktivaci exprese hEPO v primárních, sekundárních nebo imortalizovaných humánních buňkách.
Nejprve se zkonstruuje intermedární plazmid pT164 vložením 6kb fragmentu HindlII-BamHI (příklad lf) ležící před (proti směru exprese) kódující oblastí hEPO do pBluescriptIISK+ (Stratagene, LaJolla, Kalifornie, USA), štěpeného HindlII-BamHI. Plazmid pMClneoPolyA (Thomas K.R. a Capecchi M. R., Cell 51: 503 až 512 (1987), který je dostupný od firmy Stratagene, LaJolla, Ca, USA) se štěpí BamHI a Xhol, konce se otupí Klenowovým fragmentem z E. coli DNA polymerázy a výsledný 1,lkb fragment se purifikuje. pT164 se štěpí BglII a konce se otupí Klenowovým fragmentem z E. coli DNA polymerázy. Dva výše uvedené fragmenty s tupými konci se spolu ligují a vzniklý produkt se transformuje do kompetentních buněk E. coli. Klony obsahující jediný insert 1,1 kb fragmentu neo se izolují a analyzují restrikčním enzymem pro identifikaci klonů, v nichž je místo BglIII regenerované fúzí tupých míst Xhol a BglII umístěno 1,3 kb od jedinečného místa HindlII umístěného v plazmidů pT164. Výsledný plazmid pT165 se nyní může štěpit v jedinečném místě BglII lemujícím 5' stranu transkripční jednotky neo.
Oligonukleotidů 13.8 a 13.9 se využije při reakcích PCR pro vytvoření fúzovaného fragmentu, v němž jsou sekvence myšího metallothioneionového 1 (mMT-I) promotoru -hGH exonu 1 přídavně fúzovány k lObp fragmentu obsahujícímu donorové místo sestřihu. Zvolené donorové místo sestřihu odpovídá donorovému místu sestřihu intronu 1 přírodního hEPO, přestože se může použít většího počtu donorových míst sestřihu nebo konvenčních donorových míst sestřihu. Oligonukleotidů (13.8 a 13.9) se použije pro amplifikaci přibližně 0,73kb fragmentu mMT-I promotor - hGH exon 1 a pXGH5 (obr. 5). Amplifíkovaný fragment (fragment 7) se štěpí BhlII a liguje do BhlII štěpeného pT165. Ligační směs se transformuje do E. coli a identifikuje se klon obsahující jeden insert fragmentu 7, v němž místo KpnI v promotoru mMT-I sousedí s 5' koncem genu neo a mMT-I promotor je orientován tak, že je transkripce řízena směrem k jedinečnému místu HindlII, který se označí šifrou pXEPO-12.
5' AAAAAGATCT GGTACCTTGG TTTTTAAAAC CAGCCTGGAG
BglII KpnI (SEQ ID NO 12)
Oblast oligonukleotidu 13.8, která není vytištěna tučně, se identifikuje jako oblast promotoru mMT-I s přírodním místem KpnI u své 5' hranice. Oblast vytištěná tučně označuje ocas s místem Blil pro konverzi 5' hranice na místo BglII.
13.9 5' TTTTAGATCT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT TGCCGCTAGG
BglII (SEQ JD NO 13)
Oblast oligonukleotidu 13.9, která je vytištěna tučně, označuje sekvence hGH. Oblast vytištěná kurzívou odpovídá prvním 10 bp intronu 1 hEPO. Podtržené místo BglII je přidáno pro účely konstrukce plazmidů.
Plazmidů pXEPO-12 se může použít pro genový targeting tak, že se pomocí BamHI a HindlII vyštěpí 7,9kb fragment obsahující gen neo a fúzovaný produkt mMT-I/hGH, který je z obou stran lemován sekvencemi hEPO. Tento fragment (zacílující fragment 3) neobsahuje žádné kódující sekvence hEPO, nýbrž obsahuje pouze sekvence ležící přibližně mezi polohou -620
-40CZ 295115 B6 a přibližně -6620 proti směru exprese od kódující oblasti hEPO pro řízení zacílení na místo umístěné před (proti směru exprese) od loku humánního EPO.
Zacílený fragment 3 se transfekuje do primárních, sekundárních nebo imortalizovaných fibroblastů z lidské kůže za použití podobných podmínek, jaké jsou uvedeny v příkladu lb a lc. G418-rezistentní kolonie se sesbírají z jednotlivých jamek 96-jamkových ploten a podrobí screeningu na expresi EPO testem ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Buňky, v nichž se transfekční DNA integruje náhodně do humánního genomu, nemohou produkovat hEPO. Buňky, v nichž transfekční DNA podlehla homologní rekombinaci s endogenním promotorem hEPO a sekvencemi hEPO umístěnými proti směru exprese, obsahují chimérický gen, v němž mMT-I promotor a nepřepsané sekvence, hGH 5' nepřeložené sekvence v hGH exon 1 a lObp linker skládající se z prvních 10 bází hEPO intronu 1 jsou vloženy do místa BglII ležícího přibližně v poloze -1920 relativně vzhledem ke kódující oblasti hEPO.
Promotor mMT-I umístěný před (proti směru exprese) normálně tichým promotorem hEPO bude řídit syntézu, v primárních, sekundárních nebo imortalizovaných fibroblastech kůže (nebo jiných humánních buňkách), informace, která zní takto: (5' až 3') nepřeložené sekvence metallothioneinu a hGH, hGH exon 1, 10 bází DNA identických sprvními lObp hEPO intronu 1 a přední (proti směru exprese) oblast hEPO a hEPO exonu 1 (přibližně v rozmezí od -1920 do +13 vzhledem ke kódující oblasti hEPO). lObp sekvence linkeru z intronu 1 hEPO působí jako donorové místo sestřihu pro fúzi hGH exonu 1 k následujícímu (ve směru exprese) akceptorovému místu sestřihu, které leží bezprostředně před (proti směru exprese) exonem 2 hEPO. Při úpravě výsledného transkriptu se proto sestřihem odstraní přední (proti směru exprese) sekvence hEPO, exon 1 promotoru hEPO a sekvence intronu 1.
Když se použije pXEPO-10, pXEPO-11 a pXEPO-12, může se posttranskripční úprava informace zlepšit za použití in vitro mutageneze pro eliminaci akceptorového místa sestřihu ležícího v předních (proti směru exprese) sekvencích hEPO mezi promotorem mMT-I a hEPO exonem 1, což má za následek snížení úrovně produktivních sestřihů, kterých je zapotřebí pro vytvoření požadované informace. Nahrazení exonu 1 hEPO exonem 1 hGH má za následek vznik proteinu, v němž jsou čtyři první aminokyseliny signálního peptidů hEPO nahrazeny aminokyselinami 1 až 3 z hGH, za vzniku funkčního chimérického signálu peptidů, který se z maturovaného proteinu odstraní posttranslačním zpracováním a vyloučí se zexprimujících buněk.
Příklad 3
Cílená modifikace sekvencí proti směru exprese amplifikace zacíleného genu
Lidské buňky, ve kterých byl gen hEPO aktivován způsoby popsanými výše, mohou být indukovány pro amplifikaci transkripční jednotky neo/mMT-I/EPO, pokud zacílený plazmid obsahuje markerový gen, který může dodat rezistenci vůči vysoké hladině cytotoxického činidla pomocí amplifikace genu.
Selektovatelné markerové geny, jako je dihydrofolát reduktáza (dhfr, selekční činidlo: methotrexate), multifunkční gen CAD (kódující karbamylfosfát synthasu, aspartát transkarbamylázu a dihydro-oratázu; selekční činidlo: N-(fosfonoacetyl)-L-aspartát (PALA)), glutamin syntéza (selekční činidlo: methionin, sulfoximin (MSX)) a adenosin deamináza (ada; selekční činidlo: adenin nukleosid) byly dokumentovány kromě jiných genů jako geny amplifikovatelné v imortalizovaných humánních buněčných liniích (Wright, J. A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1791 až 1795 (1990); Cockett Μ. I. et al., Bio/Technology 8: 662 až 667(1990)).
-41 CZ 295115 B6
Při těchto studiích bylo zjištěno, že amplifíkace genu probíhá v řadě linií imortalizovaných lidských buněk. Za vhodných selekčních podmínek vykazují amplifíkaci mj. buňky karcinomu KB nebo buňky karcinomu vaječníků 2780AD.
Plazmidy pXEPO-10 a pXEPO-11 mohou být modifikovány vložením normálního nebo mutantního genu dhfr do jedinečného místa HindlII tohoto plazmidů. Po transfekci buněk HT1080 příslušnou DNA, selekci na rezistenci vůči G418 (dodanou genem neo) a identifikaci buněk, v nichž je gen hEPO aktivován genovým zacílením sekvencí neo, dhfr a mMT-1 do správné polohy před (proti směru exprese) genem hEPO, se tyto buňky mohou podrobit stupňovité selekci pomocí methotrexate (MTX), za účelem selekce na amplifíkaci dhfr a koamplifíkaci připojených sekvencí neo, mMT-1 a hEPO (Kaufman R. J., Technique 2: 221 až 236 (1990)). Používá se stupňovitého selekčního režimu, při němž se buňky nejprve exponují nízké hladině MTX (0,01 až 0,08μΜ) a potom se postupně koncentrace MTX zvyšuje až do 250μΜ nebo vyšší. Při selekci na amplifikované transfekované buněčné linie budou účinné lineární stupňovité přírůstky 0,04 až 0,08μΜ MTX a následující dvojnásobné zvýšení koncentrace MTX, přestože lze účinně použít i různých poměrně malých přírůstků koncentrace MTX.
Amplifíkace se monitoruje na základě zvyšování počtu kopií genu dhfr a potvrzuje se měřením in vitro exprese hEPO. Za použití této strategie se může zacílenou modifikací sekvencí ležících úplně mimo kódující oblast hEPO dosáhnout významné nadexprese hEPO.
Konstrukty, které se podobají konstruktům výše popsaným (příklady lf, lh, li, lk, 2 a 7), pro aktivaci exprese hGH v humánních buňkách je také možno dále modifikovat genovým zacílením do nekódujících sekvencí a následnou amplifíkaci tak, aby obsahovaly gen dhfr pro účely získání buněk, které vykazují nadexpresi genu hGH.
Příklad 4
Zacílení a aktivace loku humánního EPO v linii imortalizovaných lidských fíbroblastů
Sestrojí se zacílující konstrukt pXEPO-13 pro ověření hypotézy, že by bylo možno aktivovat endogenní gen hEPO v humánních fibroblastech.
Nejprve se zkonstruuje plazmid pT22.1 obsahující 63 bp genomové sekvence hEPO před (proti směru exprese) prvním kodonem genu hEPO fúzovaný k myšímu metallothioneinovému-1 promotor (mMT-1). Pro fúzi sekvencí mMT-I a hEPO se použije PCR za použití oligonukleotidů
22.1 až 22.4. Tyto primery mají následující vlastnosti: primer 22.1 je 21b oligonukleotid, který je homologní vůči segmentu promotor mMT-I začínající 28bp před (proti směru exprese) místem KpnI mMT-I; primery 22.2 až 22.3 jsou 58nukleotidové komplementární primery definující fúzi sekvencí hEPO a mMT-I, tak, že fúzovaný produkt obsahuje 28 bp sekvence hEPO začínající 35 bází před (proti směru exprese) prvním kodonem genu hEPO a sekvence mMT-I začínající u báze 29 oligonukleotidu 22.1 obsahující přírodní místo BhlII mMT-I a zasahující 30 bázemi do sekvence mMT-I; primer 22.4 je dlouhý 21 nukleotidů a je homologní vůči sekvencím hEPO začínajícím 725 bp za (ve směru exprese) od prvního kodonu genu hEPO.
Těchto primerů se použije pro amplifíkaci l,4kb fragmentu DNA obsahujícího fúzované sekvence mMT-I a hEPO (viz výše). Výsledný fragment se štěpí KpnI (PCR fragment obsahuje dvě místa KpnI: jedno přírodní místo KpnI v oblasti promotoru mMT-I a jedno přírodní místo KpnI v sekvenci hEPO) a purifíkuje. Plazmid pXEPO-1 se také štěpí KpnI, přičemž se uvolní l,4kb fragment a 6,4kb fragment. 6,4kb fragment se purifíkuje a liguje k 1,4kb KpnI PCR fúzovanému fragmentu. Výsledný konstrukt se označí šifrou pT22.1.
-42CZ 295115 B6
Druhý meziprodukt, pT22.2, se zkonstruuje ligací přibližně 6kb fragmentu HindlII-BamHI ležícího před (proti směru exprese) strukturním genem hEPO (viz příklad lf) kpBSIISK+ (Stratagene, LaJolla, Ca, USA) štěpenému BamHI a HindlII.
Třetí meziprodukt, pT22.3, se zkonstruuje tak, že se nejprve vyřízne l,lkb fragment Xhol/BamHI z pMCINEOpolyA (Stratagene, LaJolla, CA, USA) obsahujícího gen neomycin fosfotransferázy. Konce tohoto fragmentu se potom otupí Klenowovým fragmentem, DNA polymerázou I (New England Biolabs). Vzniklý fragment se liguje k místu HincII pBSIISK+ (jehož konce byly podobně otupeny DNA polymerázou I) za vzniku pT22.3.
Čtvrtý meziprodukt, pT22,4, se vyrobí purifíkací l,lkb fragmentu Xhol/HindlII obsahující gen neo z pT22.3 a vzniklý fragment se liguje k pT22.2. štěpenému Xhol a HindlII. pT22.4 tedy obsahuje gen neo, kteiý přiléhá na straně HindlII BamHI-HindlII fragmentu hEPO umístěného vepředu (proti směru exprese).
Nakonec se vytvoří pXEPO-13 tak, že se nejprve vyřízne 2,0kb fragment EcoRI/AcI zpT22.1. Místo EcoRI tohoto fragmentu definuje 5' hranici promotoru mMT-I, zatímco místi AccI tohoto fragmentu leží v exonu 5 hEPO. Fragment AccI/EcoRI obsahuje téměř úplnou expresní jednotku hEPO, v níž chybí pouze část exonu 5 a přírodní polyadenylační místo. Tento 2,0kb fragment EcoRI/AccI se purifikuje, jeho konce se otupí zpracováním Klenowovým fragmentem, DNA polymerázou I, a liguje k pT22.4 s tupými konci štěpenému Xhol.
Buňky HT1080 se transfekují pXEPO-13 štěpeným PvuI/BamHI. pXEPO-13 štěpený tímto způsobem poskytne 3 fragmenty: lkb vektorový fragment obsahující část genu amp a 1,7 kb fragment obsahující zbývající sekvence vektoru a tak přibližně 9kb fragment obsahující sekvence hEPO, neo a mMT-I. Tento přibližně 9kb fragment BamHI/PvuI obsahuje následující sekvence v pořadí od místa BamHI: přibližně 5,2 kb přední (proti směru exprese) genomové sekvence hEPO, 1,1 kb transkripční jednotky neo, 0,7kb promotoru mMT-I a 2,0kb fragment obsahující kódující sekvence hEPO seříznuté do exonu 5.
pg pXEPO-13 štěpeného tímto způsobem se použije pro elektroporací 12 milionů buněk (za elektroporačních podmínek popsaných v příkladu lb). Tato elektroporace se opakuje celkem 8 x, takže sejí podrobí celkem 96 milionů buněk. Buňky se smísí s médiem na buněčnou hustotu 1 milion buněk/ml a lml alikvotní vzorky se umístí do celkem 96 150mm ploten pro tkáňové kultury (Falcon), z nichž každá obsahuje minimálně 35 ml DMEM/15% telecího séra. Následující den se médium odsaje a nahradí čerstvým médiem obsahujícím 0,8pg/ml G418 (Gibco). Po 10 dnech inkubace se z každé plotny odebere vzorek média pro analýzu ELISA (R&D Systems, Minnapolis, MN, USA) pro stanovení hEPO. Šest z 96 ploten obsahuje přinejmenším 10 mU/ml hEPO. Šest z 96 ploten obsahuje přinejmenším 10 mU/ml hEPO. Jedna z těchto ploten (číslo 18) se vybere pro purifikaci kolonií exprimujících hEPO. Každá z 96 150mm ploten obsahuje přibližně 600G418 rezistentních kolonií (odhaduje se, že celkový počet G418 rezistentních kolonií na plotně č.l8 se trypsinizuje a v koncentraci 50 buněk/ml znovu navzorkuje na plotny s 364 jamkami (Sterilin). Po jednom týdnu inkubace jsou pozorovatelné jednotlivé kolonie s četností přibližně 10 kolonií na velkou jamku této 364jamkové plotny (použité plotny obsahují 16 malých jamek v rámci každé z 24 velkých jamek). V této době se provede u každé jamky screening na expresi hEPO. Dvě z velkých jamek obsahují médium s alespoň 20 mU/ml hEPO. Jamka č. A2 obsahuje 15 kolonií rozdělených mezi 16 malých jamek. Obsah každé z těchto malých jamek se trypsinizuje a přenese do 16 velkých jamek 96jamkové plotny. Po 7 dnech inkubace se z média z každé z těchto jamek odebere vzorek pro analýzu ELISA na hEPO. Pouze jedna jamka, jamka č. 10, obsahuje hEPO. Tento buněčný kmen se označí šifrou HT165-182A210 a expanduje se v kultuře pro kvantitativní analýzu hEPO, izolaci RNA a izolaci DNA. Při kvantitativním měření produkce hEPO se zjistí hodnota 250 mU/l(f’ buněk/24 hodin.
Jako próby pro RNA izolovanou z buněk TH165-18A2-10 se použije 0,2kb DNA zasahující do místa AccI v exonu 5 hEPO do místa BglII ve 3' nepřeložené oblasti. Zacílený konstrukt,
-43 CZ 295115 B6 pXEPO-13 seříznutý v místě AccI exonu 5 neobsahuje tyto AccI/BllII sekvence a slouží proto jako diagnostikům pro zacílení v loku hEPO. Pouze kmeny buněk, které podlehly rekombinaci homologním způsobem se sekvencemi přírodního hEPO jsou schopny produkovat sekvence hEPO mRNA homologní k sekvencím AccI/BhlII. Zjistilo se, že HT165/18A2-10 exprimuje 5 mRNA o předvídané velikosti hybridizující s 32P-značenou AccI/BglII hEPO próbou na blotech
Northern. Analýza restrikčním enzymem a analýza Sourthern blot potvrzuje, že gen neo a promotor MT-I byl zaměřen na jednu ze dvou allel hEPO v buňkách ΗΊΤ65-18Α2-10.
Tyto výsledky ukazují, že lze použít homologní rekombinace pro zacílení regulační oblasti na ío gen, který je normálně tichý v humánních fíbroblastech, přičemž dojde k funkční aktivaci tohoto genu.
22.1 5' CACCTAAAAT GATCTCTCTG G (SEQ ID NO 14)
22.2 5' CGCGCCGGGT GACCACACCG GGGGCCCTAG ATCTGGTGAA
GCTGGAGCTA CGGAGTAA (SEQ ID NO 15)
22.3 5' TTACTCCGTA GCTCCAGCTT CACCAGATCT AGGGCCCCCG
GTGTGGTCAC CCGGCGCG (SEQ ID NO 16)
22.4 5' GTCTCACCGT GATATTCTCG G (SEQ ID NO 17)
Příklad 5
Produkce bezintronových genů
Zacílení genu je také možno použít pro produkci upraveného genu, který neobsahuje introny, pro tranfer do kvasinek nebo bakterií za účelem exprese genu a in vitro produkce proteinu. Způsobem 20 popsaným výše se například může produkovat hGH v kvasinkách.
Sestrojí se dva separátní zacílující konstrukty. Zacílený konstrukt 1 (TC1) zahrnuje retrovirovou sekvenci LTR, například LTR viru Moloneyovy murinní leukémie (MoMLV), markér pro selekci v humánních buňkách (například gen neo z Tn5), markér pro selekci v kvasinkách (například 25 kvasinkový gen URA3), regulační oblast schopnou řídit expresi genu v kvasinkách (například promotor GAL4) a popřípadě sekvenci, která po fúzi k genu hGH umožní sekreci hGH z kvasinkových buněk (vedoucí sekvenci). Vektor může také zahrnovat sekvenci DNA, která umožňuje retrovirové obalení (packaging) v lidských buňkách. Tento konstrukt je organizován tak, že výše uvedené sekvence jsou na obou stranách lemovány hGH genomovými sekvencemi, 30 které po homologní rekombinaci se sekvencemi genomového hGH genu N budou integrovat exogenní sekvence v TC1 bezprostředně před (proti směru exprese) kodon 1 hGH genu N, (což odpovídá aminokyselině v poloze 1 maturovaného upraveného proteinu). Pořadí sekvencí DNA při integraci je následující: přední sekvence hGH a regulační sekvence, gen neo, LTR, gen URA3, promotor GAL4, kvasinková vedoucí sekvence, hGH sekvence včetně a za amino35 kyselinou 1 maturovaného proteinu.
Zacílený konstrukt 2 (TC2) zahrnuje sekvence potlačující pro replikaci plazmidu v kvasince (například dvoumikronový kruh nebo sekvence ARS), kvasinkové sekvence terminace transkripce, virovou LTR, a markerový gen pro selekci v lidských buňkách (například materiální 40 gen gpt). Tento konstrukt je organizován tak, že výše uvedené sekvence jsou na obou stranách lemovány hGH genomovými sekvencemi, které po homologní rekombinaci se sekvencemi
-44CZ 295115 B6 genomového hGH genu N budou integrovat exogenní sekvence v TC2 bezprostředně za (ve směru exprese) stop kodonem hGH genu N. Pořadí sekvencí DNA při integraci je následující: sekvence exonu 5 hGH, kvasinkové sekvence terminace transkripce, kvasinkové sekvence replikace plazmidu, LTR, gen gpt, a pGH 3' nepřeložené sekvence.
Lineární fragmenty pocházejí zTCl a TC2 se postupně zacílují na své odpovídající polohy lemující gen hGH. Po superinfekci těchto buněk pomocným retrorivem poskytne LTG řízená transkripce v této oblasti RNA s LTR sekvencemi na obou koncích. Sestřih této RNA poskytne molekulu, v níž jsou odstraněny normální hGH introny. Reversní transkripce upraveného transkriptu bude mít za následek akumulaci kopií dvouřetězcové DNA upraveného hGH fázového genu. Z dvojnásobně zacílených buněk infikovaných retrovirem se izoluje DNA, která se štěpí enzymem odštěpujícím transkripční jednotku pocházející z LTR. Štěpený materiál se liguje za podmínek favorizujících cirkularizaci, kružnicový produkt se zavede do kvasinkových buněk a buňky se postupně vystaví selekci na gen URA3. Pouze buňky, které převzaly gen URA3 (připojený k sekvencím zavedeným TC1 a TC2 a hGH genu) mohou růst. Tyto buňky obsahují plazmid, který exprimuje hGH protein po galaktosové indukci. hGH protein je z těchto buněk vylučován prostřednictvím fázového kvasinkové vedoucí peptidové sekvence, která se odštěpí po sekreci za vzniku maturované biologicky aktivní molekuly hGH.
Exprese v bakteriálních buňkách se dosahuje jednoduše tím, že se v TC1 a TC2 nahradí genem rezistence vůči ampicilinu zpBR322 kvasinkový gen URA3, promotorem tac (deBoer et al., Proč. Nalt. Acad. Sci. 80: 21 až 25 (1983)), kvasinkový promotor GAL4, bakteriální vedoucí sekvencí kvasinkové vedoucí sekvence, počátkem replikace z pBR322 dvoumikronový kruh nebo sekvence ARS a bakteriální terminací transkripce (například terminátorem transkripce trpA; Christie G. E. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 78: 4180 až 4184 (1981) kvasinková sekvence terminace transkripce.
Podobně lze hEPO exprimovat v kvasinkách a bakteriích jednoduše tak, že se hGH zacílující sekvence nahradí hEPO zacílujícími sekvencemi, přičemž kvasinková nebo bakteriální vedoucí sekvence se umístí bezprostředně před (proti směru exprese) kodon 1 hEPO (což odpovídá aminokyselinové poloze 1 v naturovaném upraveném proteinu).
Příklad 6
Aktivace a amplifíkace genu EPO v linii imortalizovaných lidských buněk
Zavedení exprese jednotky dhfr do jedinečného místa HindlII pXEPO-13 (viz příklad 4) má za následek vznik nového zacílujícího vektoru schopného dvojnásobné selekce a selekce buněk, v nich je amplifíkován gen dhfr. Jedinečné místo HindlII v pXEPO-13 definuje spoj genu neo a genomové sekvence přirozeně se vyskytující před (proti směru exprese) genem lidského EPO. Umístění genu dhfr do tohoto místa poskytuje konstrukt s geny neo a dhfr obklopenými sekvencí DNA pocházející z loku přírodního hEPO. Podobně jako pXEPO -13 jsou deriváty s vloženým genem dhfr užitečné pro zacílení na dokud hEPO homologickou rekombinací. takový konstrukt označený šifrou pREPO4 je znázorněn na obr. 6. Tento plazmid zahrnuje exony 1 až 4 a část exonu 5 genu humánního EPO, jakož i fragment HindlII-BamHI ležící před (proti směru exprese) kódující oblastí hEPO. pSVe, pTK a pmMT-I odpovídají promotorům z časné oblasti SV40, thymidin kinázovému (TK) genu z viru Herpes simplex (HSV) a genu myšího metallothioneinu-I.
Tento plazmid se připraví následujícím způsobem:
pXEPO-13 štěpený HindlII se přečistí a jeho konce se otupí Klenowovým fragmentem DNA polymerázou I pro získání expresní jednotky dhfr se plazmidový konstrukt pF8CIS9080 (Eeton et al., Biochemistry 25: 8343 až 8347 (1986)) štěpí EcoRI a Sáli. Z produktu štěpení se purifíkuje
-45CZ 295115 B6
2kb fragment obsahující dhfr expresní jednotku. Konce tohoto fragmentu se otupí Klenowovým fragmentem, DNA polymerázou I. Tento fragment obsahující dhfr se liguje k otupenému místu HindlII pXEPO-13. Alikvotní díl ligačního produktu se transformuje do E. coli a navzorkuje na ampicilinové selekční plotny. Po inkubaci přes noc při 37 °C se lokalizují jednotlivé bakteriální kolonie a tyto kolonie se sesbírají a nechají růst. Z kultur se zhotoví miniplazmidové přípravky a výsledná DNA se štěpí restrikčními enzymy za použití kombinace BglI + HindlII dále též za použití Sfil za účelem stanovení orientace vložených dhfr fragmentů. U plazmidové DNA z jednoho z těchto přípravků se zjistí 2kb inserce dhfr fragmentu. Orientace transkripce dhfr expresní jednotky v tomto plazmidu je opačná vzhledem k přilehlému genu neo. Tento konstrukt se označí šifrou pREPO4.
Plazmid pREPO4 se použije pro amplifikaci loku hEPO v buňkách po aktivaci endogenního genu hEPO homologní rekombinací. Aktivace genu tímto konstruktem umožňuje provést selekci na zvýšenou expresi dhfr za použití léčiva methotrexate (MTX). Ke zvýšené expresi ehfr dochází v důsledku zvýšení počtu kopií amplifikaci DNA. Výsledný efekt je, že dochází ke koamplifíkaci aktivovaného genu hEPO spolu se sekvencemi dhfr. Koamplifikace aktivovaného loku EPO by se měla projevit zvýšenou expresí EPO.
Experimenty se zacílováním se provádějí s buňkami HT1080 za použití pREPO4. Izoluje se linie HTREPO-52 exprimující hEPO. Tato linie se kvantitativně analyzuje na produkci EPO pomocí analýzy Southern a Northem Blot. Zjistí se, že tento kmen je zacílen jedinou kopií sekvencí dhfr/neo/mMT-I. Hladina exprese dosažná po selekci G418 (0,8 mg/ml) je přibližně 1300 mU/106 buněk/den. Jelikož zacílený lokus EPO obsahuje expresní jednotku dhfr, je možné provést selekci na zvýšenou expresi dhfr za použití antifolátového léčiva, MTX. Tento kmen se poté podrobí stupňovití selekci v 0,02, 0,05, 0,1, 0,2 a 0,4μΜ MTX. Výsledky počáteční selekce tohoto kmene jsou uvedeny v tabulce 4 a na obr. 7.
Tabulka 4
Buněčná linie MTX (μΜ) mU/106 buněk/24 h
52C20-5-0 0 1 368
52C20-5-0.01 0,01 1 744
52C20-5-0.02 0,02 11643
52C20-5-0.05 0,05 24 449
52-3-5-0.10 0,1 37 019
52-3-2-0.20 0,2 67 867
52-3-2-0.4B 0,4 99 919
Selekce se zvýšenou hladinou MTX vede k úspěchu při zvyšování exprese hEPO v linii HTREPO-52, přičemž je pozorováno 70% zvýšení produkce EPO v buněčné linii rezistentní vůči 0,4μΜ MTX. Potvrzení amplifikace loku hEPO se provede analýzou Southern Blok v buněčných liniích rezistentních vůči MTX. Při tomto se odhalí přibližně lOnásobné zvýšení počtu kopií aktivovaného loku hEPO vzhledem k rodičovské (nezacílené) hEPO allele.
Příklad 7
Produkce fúzového genu hEPO vložením promotoru CMV l,8kb před (proti směru exprese) genomovou oblast kódující hEPO
Konstrukce zacílující plazmidu pREPO15
Při konstrukci pREPO15 se nejprve fúzuje promotor MV k exonu 1 hGH pCR amplifikaci. l,6kb fragment se amplifikuje z hGH expresního konstruktu pXGH308, který obsahuje oblast CMV
-46CZ 295115 B6 promotoru počínaje nukleotidem 546 a konče nukleotidem 2105 v sekvenci HS5MIEP (Genbank) fúzovanou k sekvencím hGH počínaje nukleotidem 5225 a konče nukleotidem 7322 v sekvenci HUMGHCSA (Genbank) za použití oligonukleotidů 20 a 35.
Oligonukleotid 20 (35 bp, SEQ. ID NO: 18) hybridizuje k promotoru CMV v poloze -614 vzhledem k místu cap (v sekvenci HEHCMVP1, Genbank) a obsahuje místo Sáli a 5' konce.
Oligonukleotid 35 (42bp, SEQ ID NO: 19) je teplotně hybridizován k promotoru CMV v poloze +966 a přilehlému hGH exonu 1 a obsahuje prvních 10 bázových párů intronu 1 hEPO (který obsahuje část donorového místa sestřihu) a místo HindlII u 5.
Výsledný fragment PCR se štěpí HindlII a Sáli a purifikuje na gelu. Plazmid pT163 (příklad 2) se štěpí Xhol a HindlII a přibližně 1 ,lkb fragment obsahující expresní jednotku neo se purifikuje na gelu. l,6kb fragment CMV promotor/hGH exon 1/donorové místo sestřihu a l,2kb fragment neo se vzájemně ligují a produkt ligace se vloží do místa HindIIIpBSIISK+ (Stratagene lne.). Výsledný intermediární plazmid (označený šifrou pBNCHS) obsahuje expresní jednotku neo v opačné transkripční orientaci vzhledem k orientaci fragmentu CMV promotor/hGH exon 1/donorové místo sestřihu.
Druhý meziprodukt pREPO5deltaHindIII se zkonstruuje tak, že se nejprve štěpí pREPO5 enzymem HindlII. Působením tohoto restrikčního enzymu se uvolní fragmenty o délce 1,9 kb a 8,7 kb. 8,7kb fragment obsahující EPO zacílující sekvence se purifikuje na gelu a auroligací cirkularizuje. Výsledný kružnicový plazmid pREP5deltaHindIII obsahující pouze nekódující sekvence genomové DNA, které normálně lží před (proti směru exprese) genem hEPO. Tyto sekvence zahrnují sekvenci od polohy -5786 do polohy -1 vzhledem k exonu 1 EPO. Z pBNCHS se pomocí HindlII vyštěpí 2,8kb fragment obsahující neo, promotor CMV, exon 1 hGH a donorové místo sestřihu a tento fragment se purifikuje na gelu. Konce fragment se otupí Klenowovým fragmentem, DNA polymerázou I (New England Biolabs, lne.) a liguje k pREPO5deltaHindIII s otupenými konci po štěpení BglII. BglII štěpí v poloze -1779 BP před (proti směru exprese) exonem 1 hEPO v pREPO5delta-HindIII.
Výsledný konstrukt pREPO15 (obr. 8) obsahuje přední (proti směru exprese) EPO od polohy -5786 do polohy -1779 vzhledem ke kódující oblasti hEPO, expresní jednotku neo, promotor CMV, exon 1 hGH, donorové místo sestřihu a sekvence od polohy -1778 do polohy -lbp před (proti směru exprese) kódující oblastí hEPO. Tyto různé prvky jsou uspořádány ve výše uvedeném pořadí od konce 5' do 3' relativně vzhledem k nukleotidové sekvenci přední (proti směru exprese) oblasti hEPO.
Pro transfekci humánních buněk se pREPO15 štěpí Notl a Pvul za účelem uvolnění 8,6 kb zacílujícího fragmentu. Tento zacílující fragment obsahuje první zacílující sekvenci (4,8 kb) a druhou zacílující sekvenci (1,8 kb), které jsou homologické vůči DNA umístěné před (proti směru exprese) genem hEPO.
Buněčná kultura, transfekce a identifikace zacílených klonů exprimující EPO
Všechny buňky se uchovávají při 37 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého a 98% vlhkostí na DMEm s obsahem 10 % telecího séra (DMEM/10, HyClone Laboratories).
Transfekce sekundárních fibroblastů z předkožky člověka se provádí elektroporací 12 x 106 buněk v PBS (Gibco) za použití 100 pg DNA při napětí 250 V a kapacitanci 960 pF. Ošetřenými buňkami se zaočkuje 150mm plotny při hustotě 1 x 106 buněk/plotna. Následující den se médium vymění za DMEM/10 s obsahem 0,8 mg/ml G418 (Gibco). Selekce probíhá po dobu 14 dnů a poté se odeberou vzorky média pro produkci EPO. Všechny kolonie na plotnách vykazující
-47CZ 295115 B6 významnou hladinu hEPO (nad 5 mU/ml) podle stanovení EPO testem ELISA (Genzyme lne.) se izolují sterilním skleněným klonovacím válcem (Bellco) a přenesou do individuálních jamek 96jamkové plotny. Po inkubaci v délce 1 až 2 dny se pomocí zkoušky ELISA zvolí jamky vhodné pro produkci hEPO. Výsledné buněčné kmeny produkující hEPO se expandují v kultuře a použijí se pro zmrazení, izolaci nukleové kyseliny a kvantifikaci produkce EPO.
Transfekce buněk HT1080 (ATCC CCL 121) se provádí elektroporací 12 χ 106 buněk v PBS (Gibco) za použití 45 pg DNA při napětí 450 V a kapacitanci 250 pF. Růst a identifikace klonů se provádí stejným způsobem, jako v případě sekundárních fibroblastů lidské předložky, viz výše. Izolace klonálních buněčných linií produkujících hEPO se provádí metodou omezujícího ředění. Přitom se postupuje tak, že se nejprve nakloňují kolonie sklizené z ploten z první selekce v podobě směsí 10 až 15 kolonií na jamku 24jamkové plotny. Směsi produkující hEPO se navzorkují při buněčné hustotě odpovídající méně než 1 kolonie na jamku do 96jamkové plotny. Jednotlivé klony se expandují pro další analýzu způsobem popsaným u fibroblastů lidské předkožky, viz výše.
Charakterizace klonů exprimujících EPO pREPO15 neobsahuje žádné kódující sekvence hEPO. Při zacílení fragmentu neo/CMV promotor/hGH exon 1/donor sestřihu před (proti směru exprese) exon 1 hEPO, k expresi hEPO dochází iniciací transkripce (od CVM promotoru) za vzniku primárního transkriptu zahrnujícího sekvence DMV, exon 1 hGH a donorové místo sestřihu a 1,8 kb předních (proti směru exprese) sekvencí hEPO a normální hEPO exony, introny a 3' nepřeložené sekvence. Sestřih tohoto transkriptu probíhá od donorového místa sestřihu přilehlého k exonu 1 hGH do následujícího akceptorového místa sestřihu ve směru exprese, které je umístěno vedle exonu 2 EPO. Přitom vzniká nový intron, který se skládá z genomové sekvence před (proti směru exprese) genem hEPO, normálního promotoru hEPO, exonu 1 hEPO a intronu 1 hEPO. V maturovaném transkriptu exon 1 hGH nahrazuje exon 1 hEPO. Exon 1 hEPO kóduje pouze první čtyři a 1/3 aminokyselin z 26 aminokyselin signálního peptidu, který se odštěpí z prekurzorového proteinu před sekrecí z buňky. Exon 1 hGH kóduje první tři a jednu třetinu aminokyselin signálního peptidu hGH, který se také odštěpí od prekurzorového proteinu před sekrecí z buňky. Translace informace, při níž exon 1 hGH nahradí exon 1 hEPO, má tedy za následek vznik proteinu, v němž je signální peptid chimérou sekvence hGH a hEPO. Při odštěpení signálního peptidu během normálního posttranslačního štěpení vznikne maturovaná molekula hEPO, jejíž primární sekvence je nerozlišitelná od normálního produktu.
Transfekce pREPO15 do humánních fibroblastů má za následek expresi EPO těmito buňkami. V tabulce 5 jsou ukázány výsledky experimentů s zacílením za použití pREPO15 v humánních fibroblastech a buňkách HT1080. Zjištěná frekvence zacílení v normálních humánních fibroblastech je 1/264 G418r kolonií a v buňkách HT1080 1/450 G418r kolonií. Dále se kvantifikuje úroveň produkce hEPO obou těchto buněčných kmenů. Producent hEPO získaný transfekci humánních fibroblastů vykazuje sekreci 7 679 mU/106 buněk/den (tabulka 5). Aktivovaný producent hEPO získaný transfekci buněk HT1080 produkuje 12 582 mU/106 buněk/den (tabulka 5). Tyto výsledky ukazují, že aktivace loku hEPO je účinná a vyvolává produkci hEPO na relativně vysoké úrovni. Pro potvrzení případů zacílení proběhlých v loku EPO se použije analýzy restrikčním enzymem a hybridizací Southem.
Provede se analýza Southern blot klonů humánních fibroblastů a buněk HT1080, které byly zacíleny pREPO15. Na obr. 9a je znázorněna restrikční mapa rodičovského a zacíleného loku hEPO a na obr. 9b jsou ukázány výsledky analýzy zacíleného klonu humánních fibroblastů získané pomocí restrikčního enzymu a hybridizace Southem. Štěpné produkty získané pomocí BglII/EcoRI obsahují 5,9kb fragment a štěpné produkty získané pomocí BamHI obsahující a 6,6kb fragment, jako výsledek zacílený na lokus hEPO (pás TI). Oba tyto fragmenty vzniknou vložením 2,7kb DNA obsahující sekvence genu neo a promotoru CMV. Poněvadž je zacílena pouze jedna za dvou hEPO allel, jsou v těchto kmenech a v rodičovské DNA pozorovány frag
-48CZ 295115 B6 menty o délce 4,3 kb (BglII/EcoRI) a 10,6 kb (BamHi) reflektující nezměněný lokus hEPO (pásy HF). Tyto výsledky potvrzují, že k homologní rekombinaci došlo v loku hEPO za vzniku nové transkripční jednotky řídicí produkci humánního erythropoietinu.
Oligonukleotid
Sekvence
5' TTTTCTCGAG TCGACGACAT TGATTATTGA CTAGT (SEQ ID NO: 18)
5'TTTTAAGCTT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT GGTGGATCCC GT (SEQ ID NO: 19)
Tabulka 5
Transfekce pREPO15 a aktivace exprese hEPO v humánních buňkách
Typ Transfekovaných buněk
Humánní fibroblasty Buňky HT1080
Ošetřené buňky 3,3 x 107 3,1 x 107
“Kolonie G418r 264 2799
bPlotny s expresory EPO 1 6
Expresory EPO na kolonie G418r 1/264 1/450
Expresory hEPO/upravené buňky 1/3,3 x 107 1/5,2 xl O6
cExprese hEPO (mU/106 buněk/24h) 7679 12 582
Počet kolonií G418f se odhadne spočítáním kolonií na dvou plotnách, vypočtením průměru a extrapolací na celkový počet ploten.
Vzorky média z ploten s koloniemi G418r se podrobí zkoušce ELISA na EPO a plotny s hodnotou prvně hEPO vyšší než 5 mU/ml se spočítají. Jejich součet představuje počet případů aktivace EPO.
Produkce hEPO se kvantitativně stanoví za použití kmene humánních fibroblastů HF342-15 nebo buněčné linie HT1080, HTREPO15-6-6.
Příklad 8
Produkce a amplifikace fúzovaného genu hEPO vložením promotoru CMV 1,8 kb před (proti směru exprese) genomovou kódovací oblast hEPO
Vložením dhfr expresní jednotky do místa Clal umístěného na 5' konci genu neo pREPO15 se zkonstruuje plazmid pREP18 (obr. 10). Pro získání expresní jednotky dhfr se plazmidový konstrukt pF8CIS9080 (Eaton et al., Biochemistry 25: 8343 až 8347 (1986)) štěpí EcoRI a Sall. Z produkce štěpení se purifikuje 2kb fragment obsahující dhfr expresní jednotku. Konce tohoto fragmentu se otupí klenowovým fragmentem, DNA polymerázou I. Potom se k tomuto otupeném fragmentu liguje linker Clal (New England Biolabs). Produkt této ligace se potom štěpí Clal a liguje k pREPO15 štěpenému Clal. Alikvotní díl ligačního produktu se transformuje do E. coli
-49CZ 295115 B6 a navzorkuje na ampicilinové selekční plotny. Bakteriální kolonie se analyzují štěpením restrikčním enzymem za účelem stanovení orientace vloženého dhfr fragmentu. Jeden plazmid s dhfr v opačné transkripční orientaci než má gen neo se označení šifrou pREP 18(-). Druhý plazmid obsahující dhfr ve stejné transkripční orientaci, jakou má en neo, se označí šifrou 5 pREPO 18(+).
Buněčná kultura, transfekce a identifikace zacílených klonů exprimující EPO
Všechny buňky se uchovávají při 37 °C v atmosféře s oxidu uhličitého a 98% vlhkostí na DMEM s obsahem 10% telecího séra (DMEM/10, HyClone Laboratories). Transfekce buněk TH1080 (ATCC CCL 121) se provádí elektroporaci 12 χ 106 buněk v PBS (Gibco) za použití 45 pg DNA při napětí 450 V a kapacitanci 250 pF. Ošetřenými buňkami se zaočkují 150mm plotny při hustotě 1 χ 106 buněk/plotna. Následující den se médium vymění za DMEM/10 s obsahem 0,8 mg/ml G418 (Gibco). Selekce probíhá po dobu 14 dnů a poté se odeberou vzorky média pro 15 produkci hEPO. Všechny kolonie na plotnách vykazují významnou hladinu hEPO (nad 5 mU/ml) podle stanovení EPO testem ELISA (Genzyme lne.) se trypsinizují a buňky se znovu přenesou na plotny pro izolaci klonu. Izolace klonálních buněčných linií produkujících hEPO se provádí metodou omezujícího ředění. Přitom se postupuje tak, že se nejprve nakloňují kolonie v podobě směsí 10 až 15 kolonií na jamku 24jamkové plotny. Směsi produkující hEPO se navzorkují při buněčné hustotě odpovídající méně než 1 kolonií na jamku do 96jamkové plotny. Jednotlivé klony se expandují v kultuře pro účely zmrazování, izolace nukleové kyseliny a kvantifikace produkce hEPO.
Izolace buněk obsahujících amplifíkované sekvence dhfr selekcí za použití methotrexate
Zacílené buněčné linie G418r produkující hEPO se po transfekci pREPO18 nanesou na plotny při různé buněčné hustotě za účelem selekce pomocí methotrexate (MTX). Nové klony získané po selekci pomocí jedné koncentrace MTX se zkoušejí na produkci pEPO a znovu se přenesou na plotny obsahující médium s vyšší koncentrací MTX (obvykle se používá dvojnásobné koncen30 trace). Tento postup se opakuje tak dlouho, dokud se nedosáhne požadované úrovně produkce hEPO. V každém stupni rezistence vůči MTX se izoluje DNA a RNA pro příslušné analýzy Southern a Northern blot.
Charakterizace klonů exprimujících EPO pREPO18 se dvěma různými orientacemi dhfr se transfekuje do buněk HT1080. Přes transfekci se pREPO18(+) a pREPO 18(-) štěpí Xbal, přičemž se uvolní 7,9 kb zacílující fragment, který v dále uvedeném pořadí obsahuje 2,1 kb oblast genomové DNA před (proti směru exprese) exonem 1 hEPO (od polohy -3891 do polo -1779 relativně vzhledem kATG start kodonu 40 hEPO), 2kb oblast obsahující gen dhfr, 1,1 kb oblast obsahující gen neo a 1,5 kb oblast obsahující promotor CMV fúzovaný k exonu 1 hGH, 10 bp intronu 1 hEPO (obsahujících donorové místo sestřihu) a poté 1,1 kb oblast genomové DNA před (proti směru exprese) exonu lhEPO (od polohy -1778 do polohy -678 relativně vzhledem k ATG start kodonu hEPO). Četnost transfekce a zacílení vypočítaná ze dvou experimentů je uvedena v tabulce 6.
Při těchto experimentech se izoluje pět primárních klonů G418r. Tyto klony se expandují v kultuře pro kvantitativní analýzu exprese hEPO (tabulka 7). Jelikož pREPO 18 obsahuje gen dhfr, je možné provést selekci na buňky obsahující amplifíkované kopie zacílujícího konstruktu za použití MTX způsobem popsaným v příkladu 6. Analýzou pomocí restrikčního enzymu 50 ahybridizací Southern se potvrdí, že klony G418r jsou zacíleny na lokus hEPO. Tyto klony se podrobí stupňovité selekci pomocí MTX, jak to bylo popsáno výše.
-50CZ 295115 B6
Tabulka 6
Zacílení pREPO18 v buňkách HT1080
Konstrukt
pREP18(-) pREPO18(+)
Štěpení DNA Xbal Xbal
Ošetřené buňky 36 x 106 36 x 106
Kolonie G418r 16 980 19 290
Plotny s expresory hEPO 39 41
Expresory hEPO na kolonie G418r 1/435 1/470
Analyzované primární klony 1 4
Tabulka 7
Produkce hEPO v buněčných liniích HT1080 zacílených pREPO18
Buněčná linie Konstrukt hEPO (mU/106 buněk/24h)
18B3-147 pREPO18(+) 24 759
18B3-181 pREPO18(+) 28 831
18B3-145 pREPO18(+) 17 586
18B3-168 pREPO18(+) 5 293
18A3-119 pREPO 18(-) 2 881
Příklad 9
Aktivace a amplifikace endogenních genů α-interferonu, GM-CSF, G-CSF a FSHp v imortalizovaných lidských buňkách
Způsoby podle vynálezu a za použití konstruktu DNA podle vynálezu je možno aktivovat a amplifikovat širokou paletu endogenních celulárních genů. Dále je popsána obecná strategie pro aktivaci a amplifíkaci genu humánního α-interferonu (leukocytový interferon), GM-CSF (faktor stimulující kolonie - granulocyt/makrofát), G-CSF (faktor stimulující kolonie - granulocyt) a FSHP (β podjednotka hormonu stimulujícího folikuly).
a-Interferon
Gen humánního α-interferonu (sekvence HUMIFNAA podle Genbank) kóduje 188 aminokyselinový prekurzorový protein obsahující 23 aminokyselinový signální peptid. Tento gen neobsahuje žádné introny. Na obr. 11 je schematicky ilustrována jedna strategie pro aktivaci genu a-interferonu.
Sestrojí se zacílující konstrukt zahrnující první zacílující sekvenci, která je homologní vůči sekvenčním umístěným před (proti směru exprese) genem, amplifikovatelný markerový gen, selektovatelný markerový gen, regulační oblast, místo CAP, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu a druhou zacílující sekvenci odpovídající sekvencím za (ve směru exprese) první zacílující sekvencí. Druhá zacílující sekvence by neměla zasahovat dále kupředu než k poloze -107 vzhledem k normálnímu startu kodonu, aby bylo možno se vyhnout nežádoucím ATG start kodonům.
Při této strategii jsou první a druhá zacílující sekvence v normálním cílovém genu umístěny bezprostředně vedle sebe, ale není to nutné (viz dále). Amplifikovatelné markerové geny a selek-51 tovatelné markerové geny vhodné pro selekci jsou uvedeny v tomto popisu. Amplifikovatelným markerovým genem může být stejný gen, který je zároveň selektovatelným markerovým genem, jejich polohy mohou být obrácené a jeden z těchto genů, nebo oba dva, mohou být umístěny v intronu zacílujícího konstruktu. Selektovatelný markerový gen je fakultativní a amplifikovatelný markerový gen je nutný pouze v tom případě, má-li se provádět amplifikace. Zavedení specifického místa CAP je fakultativní. Do zacílujícího konstruktu se popřípadě k akceptorovému místu sestřihu ve směru ke konci 3' a ke druhé zacílující sekvenci ve směru ke konci 5' může zavést sekvence exonu z jiného genu.
Regulační oblast, místo CAP donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu mohou být izolovány jako úplná jednotka z genu lidského elongačního faktoru la (F-la; sekvence HUMEF1A podle Genbank) nebo okamžitě časné oblasti cytomegaloviru (CMV; sekvence HEHCMVP1 podle Genbank) nebo se mohou složky uspořádaně spojit z jednotlivých složek izolovaných z různých genů.
Genomová DNA odpovídající přední (proti směru exprese) oblasti genu α-interferonu pro použití jako zacílující sekvence a pro sestavení zacílujícího konstruktu se může připravovat technikami rekombinace DNA, které jsou odborníkům v tomto oboru známé. Jak je to uvedeno v tomto popisu, může se v zacílujících konstruktech použít řady selektovatelných a amplifikovatelných markérů a aktivace amplifikace se mohou provádět ve velkém počtu typů buněk. Transfekce primárních, sekundárních nebo imortalizovaných lidských buněk a izolace homologně rekombinantních buněk exprimujících α-interferon se mohou provádět způsoby popsanými v příkladu 4 za použití zkoušky ELISA pro lidský α-interferon (Biosource International, Camarillo, CA, USA). Alternativně se mohou homologně rekombinantní buňky identifikovat PCR screeningem, jak je to popsáno v příkladu lg a lj. Izolace buněk obsahujících amplifikovaného loku α-interferonu se provádí způsobem popsaným v příkladu 6.
V homologně rekombinantních buňkách se produkuje prekurzor mRNA, který zahrnuje exogenní exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu, druhou zacílující sekvenci, kódující oblast lidského α-interferonu a 3' nepřeložené sekvence (obr. 11). Sestřih této informace poskytne funkční mRNA, kterou lze přeložit za účelem produkce humánního a-interferonu.
Velikost intronu, a tedy poloha regulační oblasti relativně vzhledem ke kódující oblasti genu se může měnit za účelem optimalizace funkce regulační oblasti. Zacílený konstrukt může obsahovat více exonů. Kromě toho, v normálním genu nemusí druhá zacílující sekvence ležet bezprostředně vedle nebo v blízkosti první zacílující sekvence, takže část normální přední oblasti genu jsou při homologní rekombinaci vypuštěny.
GM-CSF
Gen lidského GM-CSF (sekvence HUMGMCSFG podle Genbank) kóduje 144 aminokyselinový prekurzorový protein obsahující 17 aminokyselinový signální peptid. Gen obsahuje 4 exony a 3 introny a 50 N terminálních aminokyselin prekurzorů je kódována v prvním exonu. Na obr. 12 je schematicky ilustrována strategie pro aktivaci genu GM-CSF.
Sestrojí se zacílující konstrukt zahrnující první zacílující sekvenci, která je homologní vůči sekvencím umístěným před (proti směru exprese) genem, amplifikovatelný markerový gen, selektovatelný markerový gen, regulační oblast, místo CAP, exon kódující aminokyselinovou sekvenci, která je identická nebo funkčně ekvivalentní sekvenci prvních 50 aminokyselin GM-CSF, donorové místo sestřihu a druhou zacílující sekvenci odpovídající sekvencím za (ve směru exprese) první zacílující sekvencí. Při této strategie produkují homologně rekombinantní buňky prekurzor mRNA, který odpovídá exogennímu exonu a donorovému místo sestřihu, k druhé zacílující sekvenci, případně sekvencím mezi druhou zacílující sekvenci a start kodonem genu GM-CSF a exonům, intronům a 3' nepřeložené oblasti genu GM-CSF (obr. 11). Sestřih
-52CZ 295115 B6 této informace má za následek fůzi exogenního exonu k exonu 2 endogenního genu GM-CSF, který po přeložení produkuje GM-CSF.
Při této strategii jsou první a druhá zacílující sekvence v normálním cílovém genu umístěny bez5 prostředně vedle sebe, ale není to nutné (viz dále). Amplifíkovatelné markerové geny a selektovatelné markerové geny vhodné pro selekci jsou uvedeny v tomto popisu. Amplifíkovatelným markerovým genem může být stejný gen, který je zároveň selektovatelný markerovým genem nebo jejich polohy mohou být obrácené. Selektovatelný markerový gen je fakultativní a amplifikovatelný markerový gen je nutný pouze v tom případě, má-li se provádět amplifíkace. Selekto10 vatelný markér a/nebo amplifíkovatelný markér může být v zacílujícím konstruktu umístěn mezi donorovým místem sestřihu a druhou zacílující sekvencí. Zavedení specifického místa CAP je fakultativní.
Regulační oblast, místo CAP a donorové místo sestřihu mohou být izolovány jako ůplnájednotka 15 z genu lidského elongačního faktoru la (F-la; sekvence HUMEF1A podle GenBank) nebo okamžité časné oblasti cytomegaloviru (CMV; sekvence HEHCMVP1 podle Genbank) nebo se mohou složky uspořádaně spojit z příslušných složek izolovaných z různých genů (jako promotor mMT-Ι a místo CAP z genu hGH a exon 1 a donorové místo sestřihu z genu hEPO).
Může se použít také jiných přístupů. Tak například první a druhá zacílující sekvence mohou odpovídat sekvencím v prvním intronu genu GM-CSF. Alternativně se může také použít zacílujícího konstruktu, který se podobá konstruktu popsanému v souvislosti s α-interferonem; v tomto případě se zacílující konstrukt sestaví tak, aby obsahoval první zacílující sekvenci, která je homologní vůči sekvencím umístěným před (proti směru exprese) genem GM-CSF, amplifíkova25 telný markerový gen, selektovatelný markerový gen, regulační oblast, místo CAP, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu a druhou zacílující sekvenci odpovídající sekvencím za (ve směru exprese) první zacílující sekvencí.
V každém případě, v normálním genu nemusí druhá zacílující sekvence ležet bezprostředně vedle 30 nebo v blízkosti první zacílující sekvence, takže části normální přední oblasti genu jsou při homologní rekombinaci vypuštěny. Zacílený konstrukt může kromě toho obsahovat několik nekódujících nebo kódujících exonů. Genomová DNA odpovídající přední (proti směru exprese) nebo intronové oblasti genu humánního GM-CSF pro použití jako zacílující sekvence a pro sestavení zacílujícího konstruktu se může připravovat technikami rekombinace DNA, které jsou 35 odborníkům v tomto oboru známé. Jak je na to uvedeno v tomto popisu, může se v zacílujících konstruktech použít řady selektovatelných a amplifíkovatelných markérů a aktivace se může provádět ve velkém počtu typů buněk.
Transfekce primárních, sekundárních nebo imortalizovaných lidských buněk a izolace homo40 logně rekombinantních buněk exprimujících GM-CSF se mohou provádět způsoby popsanými v příkladu 4 za použití zkoušky ELISA pro lidský GM-CSF (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Alternativně se mohou homologně rekombinantní buňky identifikovat PCR screeningem, jak je to popsáno výše. Izolace buněk obsahujících amplifíkované kopie amplifíkovatelného markerového genu a aktivovaného loku GM-CSF se provádí způsobem popsaným 45 výše.
G-CSF
Gen lidského G-CSF (sekvence HUMGCSFG podle Genbank) kóduje 204 až 207 amino50 kyselinový prekurzorový protein obsahující 30 aminokyselinový signál peptid. Gen obsahuje exonů a 4 introny. První exon kóduje 13 aminokyselin signálního peptidu. Na obr. 13 je schematicky ilustrována strategie pro aktivaci genu G-CSF.
Sestrojí se zacílující konstrukt zahrnující první zacílující sekvenci, která je homologní vůči 55 sekvencím umístěným před (proti směru exprese) genem, amplifíkovatelný markerový gen,
-53 CZ 295115 B6 selektovatelný markerový gen, regulační oblast, místo CAP, exon kódující aminokyselinovou sekvenci, která je identická nebo funkčně ekvivalentní sekvenci prvních 13 aminokyselin signálního peptidů G-CSF, donorové místo sestřihu a druhou zacílující sekvenci odpovídající sekvencím za (ve směru exprese) první zacílující sekvencí. Při této strategii produkují homologně rekombinantní buňky prekurzor mRNA, který odpovídá exogennímu exonu a donorovému místo sestřihu, druhé zacílující sekvenci, případně sekvencím mezi druhem zacílující sekvencí a start kodonem genu G-CSF a exonům, intronům a 3' nepřeložené oblasti genu G-CSF (obr. 13). Sestřih této informace má za následek fúzi exogenního exonu k exonu 2 endogenního genu G-CSF, který po přeložení produkuje G-CSF. Schopnost funkčně nahradit prvních 13 aminokyselin signálního peptidů normálního G-CSF aminokyselinami přítomnými v exogenním exonu umožňuje provádět modifikace signálního peptidů, a tedy i sekrečních vlastností vyrobeného proteinu.
Při této strategii jsou první a druhá zacílující sekvence v normálním cílovém genu umístěny bezprostředně vedle sebe, ale není to nutné. V normálním genu druhá zacílující sekvence nemusí ležet bezprostředně vedle nebo v blízkosti první zacílující sekvence, takže části normální přední oblasti genu j sou při homologní rekombinaci vypuštěny. Amplifikovatelným markerovým genem může být stejný gen, který je zároveň selektovatelným markerovým genem nebo jejich polohy mohou být obrácené. Selektovatelný markerový gen je fakultativní a amplifikovatelný markerový gen je nutný pouze v tom případě, má-li se provádět amplifikace. Selektovatelný markér a/nebo amplifikovatelný markér může být v zacílujícím konstruktu umístěn mezi donorovým místem sestřihu a druhou zacílující sekvencí. Zavedení specifického místa CAP je fakultativní.
Regulační oblast, místo CAP a donorové místo sestřihu mohou být izolovány jako úplnájednotka z genu lidského elongačního faktoru la (F-la; sekvence HUMEF1A podle Genbank) nebo okamžité časné oblasti cytomegaloviru (CMV; sekvence HEHCMVP1 podle Genbank) nebo se mohou složky uspořádaně spojit z příslušných složek izolovaných různých genů (jako promotor mMT-Ι a místo CAP z genu hGH a exon 1 a donorové místo sestřihu z genu EPO). Zacílující konstrukt může obsahovat několik kódujících nebo nekódujících exogenních exonů, pokud je v některém z exonů zahrnut ATG start kodon, který je při sestřihu v rámci s maturovaným proteinem.
Může se použít také jiných přístupů. Tak například první a druhá zacílující sekvence mohou odpovídat sekvencím v prvním intronu genu G-CSF. Alternativně se může také použít zacílujícího konstruktu, který se podobá konstruktu popsanému v souvislosti s α-interferonem; v tomto případě se zacílují konstrukt sestaví tak, aby obsahoval první zacílující sekvenci, která je homologní vůči sekvencím umístěným před (proti směru exprese) genem G-CSF, amlifikovatelný markerový gen, selektovatelný markerový gen, regulační oblast, místo CAP, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu a druhou zacílující sekvenci odpovídající sekvencím za (ve směru exprese) první zacílující sekvencí.
Genomová DNA odpovídající přední (proti směru exprese) nebo intronové oblasti genu humánního G-CSF pro použití jako zacílující sekvence a pro sestavení zacílujícího konstruktu se může připravovat technikami rekombinace DNA, které jsou odborníkům v tomto oboru známé. Jak je to uvedeno v tomto popisu, může se v zacílujících konstruktech použít řady selektovatelných a amplifikovatelných markérů a aktivace se může provádět ve velkém počtu typů buněk. Transfekce primárních, sekundárních nebo imortalizovaných lidských buněk a izolace homologně rekombinantních buněk exprimujících G-CSF se mohou provádět způsoby popsanými v příkladu 4 za použití zkoušky ELISA pro lidský G-CSF (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Alternativně se mohou homologně rekombinantní buňky identifikovat PCR screeningem, jak je to popsáno výše. Izolace buněk obsahujících amplifikované kopie amplifikovatelného markerového genu a aktivovaného loku α-interferonu se provádí způsobem popsaným výše.
-54CZ 295115 B6
FSHp
Gen lidského FSHp (sekvence HUMFSH1 podle Genbank) kóduje 129 aminokyselinový prekurzorový protein obsahující 16 aminokyselinový signální peptid. Gen obsahuje 3 exony a 2 introny, přičemž první exon je nekódující. Aktivace FSHP se může provádět řadou různých strategií. Na obr. 14 je schematicky ilustrována jedna z nich.
Sestrojí se zacílující konstrukt zahrnující první zacílující sekvenci, která je homologní vůči sekvencím umístěným před (proti směru exprese) genem, amplifíkovatelný markerový gen, selektovatelný markerový gen, regulační oblast, místo CAP, exon, donorové místo sestřihu a druhou zacílující sekvenci odpovídající sekvencím za (ve směru exprese) první zacílující sekvencí. Při této strategii produkují homologně rekombinantní buňky prekurzor mRNA, který odpovídá exogennímu exonu a donorovému místo sestřihu, druhé zacílující sekvenci, případně sekvencím mezi druhou zacílující sekvencí a start kodonem genu FSHfí a exonům, intronům a 3'nepřeložené oblasti genu FSHp (obr. 14). Sestřih této informace má za následek fúzi exogenního exonu k exonu 2 endogenního genu FSHfí, který po přeložení může produkovat FSHp. Při této strategii jsou první a druhá zacílující sekvence v normálním cílovém genu umístěny bezprostředně vedle sebe, ale není to nutné (viz dále).
Může se použít také jiných přístupů. Tak například první a druhá zacílující sekvence mohou odpovídat sekvencím v prvním intronu genu FSHp. Alternativně se může také použít zacílujícího konstruktu, který se podobá konstruktu popsanému v souvislosti s α-interferonem; v tomto případě se zacílující konstrukt sestaví tak, aby obsahoval první zacílující sekvenci, která je homologní vůči sekvencím umístěným před (proti směru exprese) genem FSH3, amplifíkovatelný markerový gen, selektovatelný markerový gen, regulační oblast, místo CAP, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu a druhou zacílující sekvenci odpovídající sekvencím za (ve směru exprese) první zacílující sekvencí. Druhá zacílující sekvence by neměla zasahovat dále kupředu než v poloze -40 vzhledem k normálnímu místu startu transkripce FSlip, aby bylo možno se vyhnout nežádoucím ATG start kodonům.
V homologně rekombinantních buňkách se produkuje prekurzor mRNA, který zahrnuje exogenní exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu, druhou zacílující sekvenci, kódovací oblast lidského FSBfí a 3' nepřeložené sekvence. Sestřih této informace poskytne funkční mRNA, kterou lze přeložit za účelem produkce humánního FSHp Velikost intronu, a tedy poloha regulační oblasti relativně vzhledem ke kódující oblasti genu se může měnit za účelem optimalizace funkce regulační oblasti.
Při jakékoliv aktivační strategii v normálním genu nemusí druhá zacílující sekvence ležet bezprostředně vedle nebo v blízkosti první zacílující sekvence, takže části normální přední oblasti genu jsou při homologní rekombinací vypuštěny. Kromě toho, jedna zacílující sekvence může být umístěna před (proti směru exprese) genem a druhá může ležet v exonu nebo intronu genu FSHp.
Amplifikovatelným markerovým genem může být stejný gen, který je zároveň selektovatelným markerovým genem nebo jejich polohy mohou být obrácené a jeden nebo oba dva mohou být umístěny v intronu zacílujícího konstruktu. Amplifíkovatelné markerové geny a selektovatelné markerové geny vhodné pro selekci jsou uvedeny v tomto popisu. Selektovatelný markerový gen je fakultativní a amplifíkovatelný markerový gen je nutný pouze v tom případě, má-li se provádět amplifikace. Zavedení specifického místa CAP je fakultativní. Do zacílujícího konstruktu se popřípadě k akceptorovému místu sestřihu ve směru ke konci 3' a ke druhé zacílující sekvenci ve směru ke konci 5' může zavést sekvence exonu z jiného genu. Regulační oblast, místo CAP, exon, donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu mohou být izolovány jako úplná jednotka z genu lidského elongačního faktoru la (F-la; sekvence HUMEF1A podle Genbank) nebo okamžité časné oblasti cytomegaloviru (CMV; sekvence HEHCMVP1 podle Genbank) nebo se mohou složky uspořádaně spojit z jednotlivých složek izolovaných z různých
-55 CZ 295115 B6 genů. V každém případě, může být exogenní exon stejný nebo různý vzhledem k prvnímu exonu normálního genu FSH3 a v zacílujícím konstruktu může být přítomno více exonů.
Genomová GNA odpovídá přední (proti směru exprese) oblasti genu humánního FSHp pro použití jako zacílující sekvence a pro sestavení zacílujícího konstruktu a může připravovat technikami rekombinace DNA, které jsou odborníkům v tomto oboru známé. Jak je to uvedeno v tomto popisu, může se v zacílujících konstruktech použít řady selektovatelných a amplifikovatelných markérů a aktivace se může provádět ve velkém počtu typů buněk. Je-li to žádoucí, může se produkt aktivovaného genu FSHP produkovat v typu buňky, který exprimuje humánní glykoproteinovou α-podjednotku, jejíž produkt tvoří heterodimer s produktem genu FSFip. Může se jednat o buněčný kmen nebo linii vyskytující se v přírodě.
Alternativně se gen α-podjednotky humánního glykoproteinu (sekvence HUMGLYCA1 podle Genbank) může koexprimovat s produktem genu FSHp. Taková koexprese se může provádět expresí gen nebo cDNA α-podjednotky humánního glykoproteinu pod kontrolou vhodného promotoru, nebo aktivací genu α-podjednotky humánního glykoproteinu způsoby uvedenými v tomto popisu.
Transfekce primárních, sekundárních nebo imortalizovaných lidských buněk a izolace homologně rekombinantních buněk exprimujících FSIip se mohou provádět způsoby popsanými výše za použití zkoušky ELISA pro lidský FSHp (Accurate Chemical and Scientific, Westburry, NY, USA). Alternativně se mohou homologně rekombinovat buňky identifikovat PCR screeningem, jak je to popsáno výše. Izolace buněk obsahujících amplifíkované kopie amplifikovatelného markerového genu a aktivovaného loku α-interferonu se provádí způsobem popsaným výše.
Ekvivalenty
Odborníkům v tomto oboru je na první pohled nebo po provedení rutinních experimentů zřejmé, že existuje mnoho ekvivalentů specifických provedení vynálezu uvedených v tomto popisu. Takové ekvivalenty samozřejmě také spadají do rozsahu připojených nároků.

Claims (26)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Konstrukt DNA měnící expresi zacíleného genu v buňce, když je tento konstrukt DNA homologně rekombinován s cílovým místem v chromozomální DNA buňky, který obsahuje
    a) zacílující sekvenci homologní vůči cílovému místu;
    b) exogenní regulační sekvenci;
    c) exon;a
    d) nepárové donorové místo sestřihu u 3' konce exonu;
    přičemž po homologní rekombinaci zacílující sekvence s cílovým místem obsahuje chromozomální DNA buňky, kromě všech endogenních exonů zacíleného genu, exon pocházející z konstruktu, a přičemž zacílený gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, interleukin 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulcytů a makrofágů (GM-CSF), FSH-β,
    -56CZ 295115 B6
    TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, protein kinázy C, urikinázy, antitrombinu III, DNAasy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
  2. 2. Konstrukt DNA podle nároku 1, kde exon pocházející z konstruktu se skládá z odlišné sekvence DNA, než je sekvence DNA prvního endogenního exonu zacíleného genu.
  3. 3. Konstrukt DNA podle nároku 1, v němž jsou po homologní rekombinaci zacílující sekvence s cílovým místem prvky b) až d) umístěny před místem iriciace transkripce zacíleného genu.
  4. 4. Konstrukt DNA podle nároku 3, kde se exon skládá z odlišné sekvence DNA, než je sekvence DNA prvního exonu zacíleného genu.
  5. 5. Konstrukt DNA podle nároku 3, kde zacílený gen kóduje alfa-galaktosidázu.
  6. 6. Konstrukt DNA podle nároku 3, kde exon pocházející z konstruktu je stejný jako první exon genu FSH-β.
  7. 7. Konstrukt DNA podle nároku 6, kde získaná buňka exprimuje α-podjednotku lidského glykoproteinu.
  8. 8. Konstrukt DNA podle nároku 6, kde buňka exprimuje gen α-podjednotky lidského glykoproteinu pod kontrolou exogenního promotoru.
  9. 9. Konstrukt DNA podle nároku 3, kde zacílený gen kóduje faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF).
  10. 10. Konstrukt DNA podle nároku 9, kde exon pocházející z konstruktu kóduje prvních 50 aminokyselin prekurzorového proteinu faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF).
  11. 11. Konstrukt DNA podle nároku 9, kde exon pocházející z konstruktu kóduje sekvenci obsahující funkční signální peptid.
  12. 12. Konstrukt DNA podle nároku 3, kde zacílený gen kóduje faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF).
  13. 13. Konstrukt DNA podle nároku 12, kde exon pocházející z konstruktu kóduje prvních 13 aminokyselin signálního peptidů faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF).
  14. 14. Konstrukt DNA podle nároku 1, v němž jsou po homologní rekombinaci zacílující sekvence s cílovým místem prvky b) až d) umístěny před místem iniciace transkripce zacíleného genu, a v němž exogenní regulační sekvence je regulační sekvencí genu adenoviru, regulační sekvencí genu kolagenu, regulační sekvencí genu aktivní, regulační sekvencí genu HMG-CoA reduktázy nebo regulační sekvencí genu EF-la.
  15. 15. Způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně
    a) získání buňky, jejíž genom zahrnuje
    i) zacílený gen obsahující endogenní regulační oblast, a ii) cílové místo;
    -57CZ 295115 B6
    b) získání konstruktu DNA podle nároku 1;
    c) transfekci buňky konstruktem DNA podle b) za vzniku transfekované buňky;
    d) udržování transfekované buňky za podmínek vhodných pro homologní rekombinaci za vzniku homologně rekombinantní buňky, jejíž genom obsahuje exogenní regulační sekvenci, exon pocházející z konstruktu a donorové místo sestřihu pocházející z konstruktu, kromě všech endogenních exonů zacíleného genu; a
    e) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro transkripci pod kontrolou exogenní regulační sekvence za vzniku transkriptu exonu pocházejícího z konstruktu, zacíleného genu a jakékoliv sekvence ležící mezi exonem pocházejícím z konstruktu a zacíleným genem přičemž RNA transkriptu odpovídajícího donorovému místu sestřihu pocházejícímu z konstruktu orientuje sestřih do akceptorového místa sestřihu v transkriptu, který odpovídá místu v zacílujícím genu, a přičemž zacílený gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urokinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve, X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
  16. 16. Způsob podle nároku 15, vy z n a č uj í c í se t í m , že dále zahrnuje
    f) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro sestřih a translaci transkriptu; a
    g) potvrzení, že byl vyroben translační produkt tohoto transkriptu.
  17. 17. Způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně
    a) získání buňky, jejíž genom zahrnuje
    i) zacílený gen obsahující endogenní regulační oblast, a ii) cílové místo;
    b) získání konstruktu DNA podle nároku 3;
    c) transfekce buňky konstruktem DNA za vzniku transfekované buňky;
    d) udržování transfekované buňky za podmínek vhodných pro homologní rekombinaci za vzniku homologně rekombinantní buňky, jejíž genom obsahuje exogenní regulační sekvenci, exon pocházející z konstruktu a donorové místo sestřihu pocházející z konstruktu, které jsou všechny umístěny podle směru exprese před endogenním místem iniciaci transkripce zacíleného genu;a
    e) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro transkripci pod kontrolou exogenní regulační sekvence za vzniku transkriptu exonu pocházejícího z konstruktu, zacíleného genu a jakékoliv sekvence ležící mezi exonem pocházejícím z konstruktu a zacíleným genem, přičemž RNA transkriptu odpovídajícího donorovému místu sestřihu pocházejícímu z konstruktu orientuje sestřih do akceptorového místa sestřihu v transkriptu, které odpovídá místu
    -58CZ 295115 B6 v zacílujícím genu, a přičemž zacílený gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonů gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulcytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urokinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
  18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že dále zahrnuje
    f) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro sestřih a translaci transkriptu; a
    g) potvrzení, že byl vyroben translační produkt tohoto transkriptu.
  19. 19. Způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně
    a) získání buňky, jejíž genom zahrnuje
    i) zacílený gen obsahující endogenní regulační oblast, a ii) cílové místo;
    b) získání konstruktu DNA podle nároku 1;
    c) transfekce buňky konstruktem DNA za vzniku transfekované buňky;
    d) udržování transfekované buňky za podmínek vhodných pro homologní rekombinací za vzniku homologně rekombinantní buňky, jejíž genom obsahuje exogenní regulační sekvenci, exon pocházející z konstruktu a donorové místo sestřihu pocházející z konstruktu, které jsou všechny umístěny podle směru expresu před endogenním místem iniciace transkripce zacíleného genu;a
    e) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro transkripci pod kontrolou exogenní regulační sekvence za vzniku transkriptu exonu pocházejícího z konstruktu, zacíleného genu a jakékoliv sekvence ležící mezi exonem pocházejícím z konstruktu a zacíleným genem, přičemž RNA transkriptu odpovídající donorovému místu sestřihu pocházejícímu z konstruktu orientuje sestřih do akceptorového místa sestřihu v transkriptu, které odpovídá místu v zacílujícím genu, přičemž exogenní regulační sekvence je regulační sekvencí genu adenovirů, regulační sekvencí genu kolagenu, regulační sekvencí genu aktinu, regulační sekvencí genu imunoglobulinu, regulační sekvencí genu HMG-CoA reduktázy nebo regulační sekvencí genu EF-la.
  20. 20. Způsob podle nároku 19, vy z n a č uj í c í se t í m , že dále zahrnuje
    f) udržování homologně rekombinantní buňky za podmínek vhodných pro sestřih a translaci transkriptu; a
    g) potvrzení, že byl vyroben translační produkt tohoto transkriptu.
  21. 21. Kultivovaná buňka obratlovce, v jejímž genomu je zabudována transkripční jednotka pocházející z konstruktu podle nároku 1, přičemž tato transkripční jednotka obsahuje exogenní regulační sekvenci, exogenní exon, a donorové místo sestřihu u 3' konce exogenního exonu, přičemž všechny tyto prvky jsou umístěny podle směru exprese před endogenním místem
    -59CZ 295115 B6 iniciace transkripce endogenního genu a donorové místo sestřihu je operativně připojeno k endogennímu akceptorovému místu sestřihu druhého endogenního exonu endogenního genu, a přičemž endogenní gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urokinázy, antihrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
  22. 22. Izolovaná kultivovaná buňka obratlovce, v jejímž genomu je zabudována transkripční jednotka pocházející z konstruktu podle nároku 3, přičemž tato transkripční jednotka obsahuje exogenní regulační sekvenci, exogenní exon a donorové místo sestřihu u 3' konce exogenního exonu, donorové místo sestřihu je operativně připojeno k endogennímu akceptorovému místu sestřihu druhého endogenního exonu endogenního genu, buňka obsahuje, kromě všech endogenních exonů přítomných v endogenním genu, exogenní exon a přičemž endogenní gen kóduje protein zvolený ze souboru sestávajícího z interferonu gamma, faktorů růstu nervů, FSH-β, TGF-β, faktoru nekrózy nádorů, glukagonu, faktoru-2 růstu kostí, faktoru-7 růstu kostí, TSH-β, interleukinu 1, interleukinu 2, interleukinu 3, interleukinu 6, interleukinu 11, interleukinu 12, faktoru stimulujícího kolonie granulcytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (MCS), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), protein kinázy C, urokinázy, antitrombinu III, DNAsy, α-galaktosidázy, tyrosin hydroxylázy, srážecího faktoru prvek V, srážecího faktoru krve VII, srážecího faktoru krve X, srážecího faktoru krve XIII, antagonisty IL-2 a rozpustného CD4.
  23. 23. Kultivovaná buňka obratlovce podle nároku 22, zvolená ze souboru sestávajícího z buňky HT1080, buňky HeLa a derivátu buňky HeLam, buňky rakoviny prsu MCF-7, leukemické buňky K-562, buňky karcinomu KB, buňky karcinomu vaječníků 2780AD, Rajiho buňky, Jurkatovy buňky, Namalwovy buňky, buňky HL-60, Daudiho buňky, buňky RPMI 8226, buňky U-937, buňky Bowesova melanomu, buňky sublinie WL-38VA13 2R4 a buňky MOLT-4.
  24. 24. Kultivovaná buňka obratlovce podle nároku 22, kde exogenní regulační sekvence je regulační sekvencí genu adenoviru, regulační sekvencí genu kolagenu, regulační sekvencí genu, aktinu, regulační sekvencí genu ímunoglobulinu, regulační sekvencí genu HMG-CoA reduktázy nebo regulační sekvencí genu EF-la.
  25. 25. Kultivovaná buňka obratlovce podle nároku 21, která je potomkem buňky původně transfekované konstuktem podle nároku 1.
  26. 26. Kultivovaná buňka obratlovce podle nároku 22, která je potomkem buňky původně transfekované konstruktem podle nároku 3.
CZ19963258A 1994-05-13 1995-05-11 Konstrukt DNA měnící expresi zacíleného genu v buňce, způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce a izolovaná kultivovaná buňka obratlovce CZ295115B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/243,391 US5641670A (en) 1991-11-05 1994-05-13 Protein production and protein delivery
PCT/US1995/006045 WO1995031560A1 (en) 1994-05-13 1995-05-11 Dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ325896A3 CZ325896A3 (en) 1997-12-17
CZ295115B6 true CZ295115B6 (cs) 2005-05-18

Family

ID=22918596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19963258A CZ295115B6 (cs) 1994-05-13 1995-05-11 Konstrukt DNA měnící expresi zacíleného genu v buňce, způsob in vitro pozměňování exprese zacíleného genu v buňce a izolovaná kultivovaná buňka obratlovce

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5641670A (cs)
EP (1) EP0759082A1 (cs)
JP (1) JPH10500570A (cs)
KR (1) KR100379356B1 (cs)
AU (1) AU709058B2 (cs)
BR (1) BR9507874A (cs)
CA (1) CA2190289A1 (cs)
CZ (1) CZ295115B6 (cs)
FI (1) FI964536A7 (cs)
HU (1) HUT76844A (cs)
IL (1) IL113708A0 (cs)
MX (1) MX9605542A (cs)
NO (1) NO964802L (cs)
NZ (1) NZ285945A (cs)
RU (1) RU2267533C2 (cs)
SK (1) SK146196A3 (cs)
UA (1) UA34493C2 (cs)
WO (1) WO1995031560A1 (cs)
ZA (1) ZA953879B (cs)

Families Citing this family (346)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US7144731B2 (en) 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
US20040181044A1 (en) * 1989-10-16 2004-09-16 Zsebo Krisztina M. Method of stimulating growth of epithelial cells by administering stem cell factor
JP2657113B2 (ja) * 1989-10-16 1997-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド 幹細胞因子
US6852313B1 (en) 1989-10-16 2005-02-08 Amgen Inc. Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor
US5733761A (en) * 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6270989B1 (en) * 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
US5981730A (en) 1994-04-13 1999-11-09 The General Hospital Corporation RPS gene family, primers, probes, and detection methods
US7597886B2 (en) * 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7820798B2 (en) * 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
EP0920508A1 (en) * 1996-08-23 1999-06-09 Chiron Corporation HUMAN POLYHOMEOTIC 1 ($i(hph1)) ACTS AS AN ONCOGENE
JP4436934B2 (ja) * 1996-09-13 2010-03-24 ノボザイムス，インコーポレイティド 変更された量のポリペプチドを生成するｄｎａ挿入突然変異を有する細胞
MX340738B (es) 1996-09-13 2016-07-22 Shire Human Genetic Therapies Terapia para deficiencia de a-galactosidasa a.
IL129222A0 (en) 1996-10-01 2000-02-17 Geron Corp Telomerase reverse transcriptase
US7332338B2 (en) 1996-10-04 2008-02-19 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Vectors for making genomic modifications
US6855545B1 (en) 1996-10-04 2005-02-15 Lexicon Genetics Inc. Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
US6136566A (en) * 1996-10-04 2000-10-24 Lexicon Graphics Incorporated Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
US20040072243A1 (en) * 1996-10-11 2004-04-15 Lexicon Genetics Incorporated Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
ES2312179T3 (es) 1996-12-06 2009-02-16 Amgen Inc. Terapia combinada que utiliza un inhibidor del il-1 para el tratamiento de enfermedades mediadas por el il-1.
WO1998025959A2 (en) * 1996-12-11 1998-06-18 Chiron Corporation Secreted human proteins
US20020168718A1 (en) * 1997-04-03 2002-11-14 California Institute Of Technology Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering
ATE414775T1 (de) 1997-05-16 2008-12-15 Novozymes Inc Polypeptide mit prolyldipeptidylaminopeptidase- aktivität und dafür kodierende nukleinsäuren
US7378506B2 (en) * 1997-07-21 2008-05-27 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US6639050B1 (en) 1997-07-21 2003-10-28 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US6395484B1 (en) * 1997-07-23 2002-05-28 Roche Diagnostics Gmbh Identification of human cell lines for the production of human proteins by endogenous gene activation
JP4541539B2 (ja) * 1997-07-23 2010-09-08 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー 内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの製造
PT986644E (pt) 1997-07-23 2007-01-31 Roche Diagnostics Gmbh Preparação de eritropoietina por activação genética endógena com promotores virais
AU776280B2 (en) * 1997-07-23 2004-09-02 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
KR100622203B1 (ko) * 1997-07-23 2006-09-07 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는 사람 세포주를 확인하는 방법
AU729489B2 (en) 1997-07-23 2001-02-01 Roche Diagnostics Gmbh Production of human mutated proteins in human cells by means of homologous recombination
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
IL135242A0 (en) * 1997-09-26 2001-05-20 Athersys Inc Expression of endogenous genes by non-homologous recombination of a vector construct with cellular dna
US6897066B1 (en) * 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US6740503B1 (en) 1997-09-26 2004-05-25 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
ZA989497B (en) * 1997-10-20 2000-04-19 Roche Diagnostics Gmbh Positive-negative selection in homologous recombination.
CA2309541C (en) 1997-11-03 2011-01-11 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
WO1999028346A1 (de) * 1997-12-03 1999-06-10 Roche Diagnostics Gmbh Erythropoietin mit hoher spezifischer aktivität
US7037663B2 (en) * 1998-02-19 2006-05-02 Eastern Virginia Medical School Human zona pellucida protein 3 and uses thereof
US7019114B2 (en) 1998-02-19 2006-03-28 Eastern Virginia Medical School Recombinant, biologically active human zona pellucida protein 3 (HZP3) to test male fertility
AU3066699A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Johns Hopkins University, The Smallpox inhibitor of complement enzymes (spice) protein and methods of inhibiting complement activation
AU3072799A (en) 1998-03-19 1999-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Cytokine receptor common gamma chain like
US6436707B1 (en) * 1998-03-27 2002-08-20 Lexicon Genetics Incorporated Vectors for gene mutagenesis and gene discovery
US6808921B1 (en) * 1998-03-27 2004-10-26 Lexicon Genetics Incorporated Vectors for gene mutagenesis and gene discovery
IL139433A0 (en) * 1998-05-07 2001-11-25 Transkaryotic Therapies Inc Genomic sequences upstream of the coding region of the ifn-alpha2 gene for protein production and delivery
WO1999057291A1 (en) * 1998-05-07 1999-11-11 Transkaryotic Therapies, Inc. Genomic sequences upstream of the coding region of the g-csf gene for protein production and delivery
RU2229309C2 (ru) * 1998-05-07 2004-05-27 Транскариотик Терапиз, Инк. МОДИФИЦИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА FSHβ С ПОМОЩЬЮ ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ
AU4213999A (en) * 1998-05-27 1999-12-13 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide by modifying the copy number of a gene
AU771111B2 (en) 1998-07-21 2004-03-11 Emd Millipore Corporation A polynucleotide comprising a ubiquitous chromatin opening element (UCOE)
US6894022B1 (en) 1998-08-27 2005-05-17 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US7241730B2 (en) 1998-08-27 2007-07-10 Universitat Zurich Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering: fibrin formulations with peptides
US7601685B2 (en) * 1998-08-27 2009-10-13 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
SE9803099D0 (sv) 1998-09-13 1998-09-13 Karolinska Innovations Ab Nucleic acid transfer
ATE386804T1 (de) 1998-10-15 2008-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Gene mit veränderter expression in metastatischen brust- oder dickdarm- krebszellen
US6416975B1 (en) 1998-11-12 2002-07-09 Gliatech, Inc. Human glycine transporter type 2
DK1137773T3 (da) 1998-12-07 2008-12-08 Zymogenetics Inc Væsktfaktorhomolog ZVEGF3
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
EP1961813B1 (en) 1998-12-16 2011-08-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Human cyclin-dependent kinase (hPNQALRE)
WO2000049162A2 (en) * 1999-02-19 2000-08-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
AU3501700A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Human Genome Sciences, Inc. Human endokine alpha and methods of use
AU3731400A (en) * 1999-03-05 2000-09-21 Trustees Of University Technology Corporation, The Methods and compositions useful in inhibiting apoptosis
AU3511500A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Trustees Of University Technology Corporation, The Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide-induced clinical conditions
US6849605B1 (en) * 1999-03-05 2005-02-01 The Trustees Of University Technology Corporation Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections
WO2000051625A1 (en) * 1999-03-05 2000-09-08 The Trustees Of University Technology Corporation Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of herpes viruses
KR100743640B1 (ko) 1999-03-09 2007-07-27 지모제넥틱스, 인코포레이티드 신규한 사이토킨 ｚａｌｐｈａ 11 리간드
CN100510096C (zh) 1999-03-22 2009-07-08 诺沃奇梅兹有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
JP2002541213A (ja) 1999-04-13 2002-12-03 インヘール セラピューティック システムズ， インコーポレイテッド 不妊症の処置のための乾燥粉末処方物の肺投与
AU6403700A (en) * 1999-06-15 2001-01-02 Genetrol Biotherapeutics, Inc. Methods for enhancing the production of cytokines in cell culture
EP2241623A3 (en) 1999-07-07 2010-12-01 ZymoGenetics, Inc. Monoclonal antibody against a human cytokine receptor
EP2275559A3 (en) 1999-09-28 2011-03-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
JP2003527833A (ja) 1999-10-14 2003-09-24 クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 花虫類に由来する発色団／蛍光体、およびそれらの使用法
MXPA02005014A (es) * 1999-11-19 2003-02-27 Transkaryotic Therapies Inc Constructo de acido nucleico para produccion optimizada de productos.
EP1232175B1 (en) 1999-11-22 2009-07-08 ZymoGenetics, Inc. Method of forming a peptide-receptor complex with zsig33 polypeptides.
US6951839B1 (en) 1999-11-30 2005-10-04 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
US8168178B2 (en) 1999-11-30 2012-05-01 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
WO2001042442A2 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Cytos Biotechnology Ag Activation of endogenous genes by genomic introduction of a replicon
AU2292601A (en) 1999-12-23 2001-07-03 Zymogenetics Inc. Novel cytokine zcyto18
EP1985701B1 (en) 2000-01-10 2012-05-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Genes differentially expressed in breast cancer
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US6569681B1 (en) 2000-03-14 2003-05-27 Transkaryotic Therapies, Inc. Methods of improving homologous recombination
US20030084471A1 (en) 2000-03-16 2003-05-01 David Beach Methods and compositions for RNA interference
EP1728862A1 (en) 2000-03-16 2006-12-06 Genetica, Inc. Methods and compositions for RNA interference
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20030195707A1 (en) * 2000-05-25 2003-10-16 Schork Nicholas J Methods of dna marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
US20020077775A1 (en) * 2000-05-25 2002-06-20 Schork Nicholas J. Methods of DNA marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
EP2431054A3 (en) 2000-06-15 2013-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
GB0018876D0 (en) * 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
UA81743C2 (uk) 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US7138262B1 (en) * 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
DE60143959D1 (de) 2000-08-25 2011-03-10 Basf Plant Science Gmbh En kodieren
US20020150541A1 (en) * 2000-09-12 2002-10-17 Gene Trol Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
US20030129162A1 (en) * 2000-09-12 2003-07-10 Lau Allan S. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
EP1318834A2 (en) * 2000-09-12 2003-06-18 Genetrol Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising mixtures of human cytokines and methods of producing the same
AU2002236569A1 (en) * 2000-12-04 2002-06-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Treatment of cancer by reduction of intracellular energy and pyrimidines
US7381713B2 (en) * 2000-12-04 2008-06-03 Sioan-Kettering Institute For Cancer Research Treatment of cancer by reduction of intracellular energy and pyrimidines
EP1345628B1 (en) 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
AU2002233230B2 (en) * 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
WO2002059337A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Georgetown University School Of Medicine Anti-apoptopic gene scc-s2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002064612A2 (en) 2001-02-09 2002-08-22 Human Genome Sciences, Inc. Human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10
WO2002072790A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 Myriad Genetics, Inc Tsg101-gag interaction and use thereof
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
AU2002258728A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081640A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene shinc-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081641A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081639A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
JP2004536579A (ja) 2001-04-13 2004-12-09 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド 血管内皮増殖因子２
US7309783B2 (en) * 2001-05-09 2007-12-18 The University Of Connecticut Mammalian early developmental regulator gene
US7262174B2 (en) * 2001-05-09 2007-08-28 Geron Corporation Treatment for wounds
EP2293067B1 (en) 2001-06-26 2016-04-20 Senomyx, Inc. T1R hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
CN1610830A (zh) 2001-07-10 2005-04-27 塞诺米克斯公司 特异性t2r味觉受体在鉴定阻断苦味觉的化合物中的应用
US6867189B2 (en) * 2001-07-26 2005-03-15 Genset S.A. Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders
EP1421104A4 (en) * 2001-08-02 2005-08-24 Trinity Biomedical Technology HUMANE ZONA PELLUCIDA PROTEINS AND METHOD FOR THEIR USE IN THE DIAGNOSIS OF MALE INFERENCE
IL160229A0 (en) * 2001-08-10 2004-07-25 Genset Sa Polynucleotides, polypeptides encoded thereby and their use
US20050064587A1 (en) * 2001-09-07 2005-03-24 Lawrence Rosenberg Pancreatic small cells and uses thereof
PT2308888T (pt) 2001-11-14 2017-05-03 Janssen Biotech Inc Anticorpos anti-il-6, composições, métodos e utilizações
US20050118586A1 (en) * 2001-11-28 2005-06-02 Stephane Bejanin Human cdnas and proteins and uses thereof
US7247609B2 (en) * 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
WO2003054158A2 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 The University Of Chicago Rapidly maturing fluorescent proteins and methods for using the same
AU2002364586A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Delta Biotechnology Limited Albumin fusion proteins
US7255874B1 (en) 2001-12-21 2007-08-14 Closure Medical Corporation Biocompatible polymers and adhesives: compositions, methods of making and uses related thereto
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
DK1961811T3 (da) 2002-01-18 2010-11-08 Zymogenetics Inc Cytokinligand til behandling af asthma og luftvejs-hyper-responsivitet
WO2003066824A2 (en) 2002-02-07 2003-08-14 Aventis Behring Gmbh Albumin-fused kunitz domain peptides
EP1585386A4 (en) 2002-02-20 2009-09-02 American Integrated Biolog Inc GENE PRODUCTION IN SALIVA
WO2009095742A1 (en) * 2008-01-31 2009-08-06 Cellectis New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof
US20100151556A1 (en) * 2002-03-15 2010-06-17 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
AU2003215869B2 (en) * 2002-03-15 2008-04-24 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
US7244565B2 (en) * 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7138512B2 (en) * 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2003231028A1 (en) 2002-04-22 2003-11-03 Novozymes Biotech, Inc. Methods for increasing homologous recombination of a nucleic acid sequence
DK1503788T3 (da) 2002-04-25 2011-10-17 Shire Human Genetic Therapies Behandling af alpha-galactosidase A-deficiens
US20030228317A1 (en) * 2002-05-22 2003-12-11 Prafulla Gokhale Gene BRCC-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2004009775A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Targacept, Inc. Methods and compositions relating to chimeric nicotinic receptor subunits
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CN100480391C (zh) 2002-11-18 2009-04-22 诺维信股份有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子变体
NZ540288A (en) * 2002-11-22 2009-06-26 Univ Johns Hopkins Target for therapy of cognitive impairment
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US7285269B2 (en) * 2002-12-02 2007-10-23 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor
WO2004053144A2 (en) * 2002-12-10 2004-06-24 Ottawa Health Research Institute Modulation of stem cell differentiation by modulation of caspase-3 activity
US20050048041A1 (en) * 2003-01-13 2005-03-03 Rao Mahendra S. Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
WO2004064785A2 (en) 2003-01-14 2004-08-05 Dana Farber Cancer Institute Cancer therapy sensitizer
JP2006518997A (ja) * 2003-01-21 2006-08-24 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 新規アシルコエンザイムａ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−３（ｍｇａｔ３）をコードするポリヌクレオチドおよびその用途
EP3202899B1 (en) 2003-01-28 2020-10-21 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
CA2515708A1 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Transkaryotic Therapies, Inc. Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other sulfatase deficiencies
WO2004098634A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Protein arginine n-methyltransferase 2 (prmt-2)
US20060252120A1 (en) * 2003-05-09 2006-11-09 Kieliszewski Marcia J Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US20050106222A1 (en) * 2003-06-11 2005-05-19 Ailor Eric N. Method to increase protein production in culture
AR046078A1 (es) 2003-08-06 2005-11-23 Senomyx Inc Nuevos sabores, modificadores de sabores, sustancias gustativas, mejoradores de gusto, sustancias gustativas y/o mejoradoras del gusto umani o dulce y uso de los mismos.
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US11311574B2 (en) 2003-08-08 2022-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
CN1860232A (zh) * 2003-09-30 2006-11-08 莱克康遗传公司 鉴别基因功能的方法和组合物
WO2005065079A2 (en) * 2003-11-10 2005-07-21 Angiotech International Ag Medical implants and fibrosis-inducing agents
AU2004293841B2 (en) 2003-11-20 2009-10-08 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament and uses thereof
ES2380022T3 (es) * 2003-12-03 2012-05-07 Monika KRÖZ Proteínas de fusión a interleucina-11
SI1696947T1 (sl) * 2003-12-19 2014-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Uporaba eritropoetina pri zdravljenju motenj porazdelitve železa pri kroničnih vnetnih črevesnih boleznih
MXPA06008126A (es) * 2004-01-14 2008-02-14 Univ Ohio Metodos para la produccion de peptidos/proteinas en plantas y peptidos/proteinas producidos de este modo.
EP1732944B1 (en) * 2004-04-07 2012-09-05 The University of Chicago Monomeric red fluorescent proteins
US8623812B2 (en) 2004-04-19 2014-01-07 Ohio University Cross-linkable glycoproteins and methods of making the same
CA2567526A1 (en) * 2004-05-26 2005-12-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Cancer treatment method by inhibiting mage gene expression or function
EP1789070B1 (en) 2004-08-03 2012-10-24 Biogen Idec MA Inc. Taj in neuronal function
AU2005287278B2 (en) * 2004-09-16 2011-08-04 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
US20060147443A1 (en) * 2004-12-22 2006-07-06 Kuros Biosurgery Ag Synthetic biomaterials having incorporated therein bioactive factors through enzymatically degradable linkages
WO2006071200A2 (en) 2004-12-30 2006-07-06 Agency For Science, Technology And Research Chinese hamster apoptosis-related genes
MX2007008319A (es) * 2005-01-06 2007-10-04 Kuros Biosurgery Ag Matrices suplementadas para la reparacion de fracturas oseas.
US8575101B2 (en) 2005-01-06 2013-11-05 Kuros Biosurgery Ag Supplemented matrices for the repair of bone fractures
WO2006073711A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Kuros Biosurgery Ag Use of a matrix comprising a contrast agent in soft tissues
EP1859028B1 (en) 2005-02-10 2015-12-02 Regents Of The University Of Minnesota Vascular endothelial cells
US20060194740A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Ulevitch Richard J NOD1 as an anti-tumor agent
US20060234973A1 (en) * 2005-04-14 2006-10-19 Kevin Fitzgerald Transcription factor RNA interference reagents and methods of use thereof
JO3058B1 (ar) 2005-04-29 2017-03-15 Applied Molecular Evolution Inc الاجسام المضادة لمضادات -اي ال-6,تركيباتها طرقها واستعمالاتها
US20070011752A1 (en) * 2005-05-06 2007-01-11 American Integrated Biologics, Inc. Production of human proteins in transgenic animal saliva
EP1891107B1 (en) 2005-05-12 2011-07-06 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
SI2452694T1 (sl) 2005-06-30 2019-05-31 Janssen Biotech, Inc. Protitelesa proti-IL-23, sestavki in postopki uporabe
US20080242834A1 (en) * 2005-07-08 2008-10-02 Ohio University Methods of Predicting Hyp-Glycosylation Sites For Proteins Expressed and Secreted in Plant Cells, and Related Methods and Products
EP1904652A2 (en) * 2005-07-08 2008-04-02 Brystol-Myers Squibb Company Single nucleotide polymorphisms associated with dose-dependent edema and methods of use thereof
US20070202512A1 (en) * 2005-08-19 2007-08-30 Bristol-Myers Squibb Company Human single nucleotide polymorphisms associated with dose-dependent weight gain and methods of use thereof
WO2007030820A2 (en) 2005-09-09 2007-03-15 The Johns Hopkins University Manipulation of regulatory t cell and dc function by targeting neuritin gene using antibodies, agonists and antagonists
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
WO2007142667A2 (en) 2005-10-13 2007-12-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of patients with autoantibody positive disease
EP3312194A1 (en) 2005-10-20 2018-04-25 Senomyx, Inc. Cell lines expressing chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
WO2007060495A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
WO2007053732A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Promoter polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods
CN101300489A (zh) 2005-11-03 2008-11-05 红点生物公司 Trpm5离子通道的高通量筛选实验
HUE034269T2 (en) 2005-12-29 2018-02-28 Janssen Biotech Inc Human anti-IL-23 antibodies, preparations, methods and applications
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
HRP20120994T1 (hr) 2006-02-07 2012-12-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stabilizirana smjesa glukocerebrozidaze
US9109204B2 (en) * 2006-02-28 2015-08-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for compact aggregation of dermal cells
TWI428448B (zh) * 2006-03-24 2014-03-01 Syntonix Pharmaceuticals Inc 作為第九因子（ｆａｃｔｏｒ ｉｘ）原肽處理酶之ｐｃ５
ES2640453T3 (es) 2006-04-21 2017-11-03 Senomyx, Inc. Procesos para preparar composiciones saborizantes sólidas
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008013861A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of trpa1 activation by a lower alkyl phenol
PL2054074T3 (pl) * 2006-08-04 2015-03-31 Prolong Pharmaceuticals Llc Zmodyfikowana erytropoetyna
US9505823B2 (en) * 2006-08-07 2016-11-29 TEV A Biopharmaceuticals USA, Inc. Albumin-insulin fusion proteins
JP2008044926A (ja) * 2006-08-14 2008-02-28 Trustees Of Columbia Univ In The City Of New York Ｗｎｔ信号伝達に関係した分泌タンパク質
WO2008065372A2 (en) 2006-11-28 2008-06-05 Nautilus Biotech, S.A. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
US20080234194A1 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Harold Brem Growth factor mediated cosmeceuticals and use thereof to enhance skin quality
EP2139447A2 (en) * 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
DK2136850T3 (da) * 2007-04-13 2012-04-10 Kuros Biosurgery Ag Polymervævforsegling
JP2010524467A (ja) 2007-04-16 2010-07-22 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 規定の糖タンパク質産物および関連の方法
AR067536A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
ES2614735T3 (es) 2007-07-23 2017-06-01 Janssen Biotech, Inc. Métodos y composiciones para tratar los trastornos relacionados con fibrosis usando antagonistas de la IL-17
EP2195656A4 (en) 2007-08-21 2011-10-19 Senomyx Inc HUMAN T2R BITTERITY RECEPTORS AND USES THEREOF
WO2009059305A2 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
WO2009073511A2 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods
WO2009083544A2 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
WO2009089380A2 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for p2ry5 mediated regulation of hair growth and mutants thereof
JP2011523357A (ja) 2008-05-06 2011-08-11 ジョスリン ダイアビーティス センター インコーポレイテッド 褐色脂肪細胞分化を誘導するための方法および組成物
KR20160116056A (ko) 2008-08-14 2016-10-06 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 항-ｉｌ-12/ｉｌ-23 항체
ES2705714T3 (es) 2008-10-31 2019-03-26 Janssen Biotech Inc Métodos y usos de dominio de Fibronectina tipo III basado en estructuras de composiciones
BRPI1008532B1 (pt) 2009-02-12 2021-12-14 Janssen Biotech, Inc Arcabouço de proteína isolada, método para construção de uma biblioteca de arcabouço de proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de ácido nucleico isolado, célula hospedeira de bactéria ou fungo, composição, dispositivo médico e artigo de manufatura para uso farmacêutico ou de diagnóstico em seres humanos
EP2453856B1 (en) 2009-07-15 2019-02-20 NewSouth Innovations Pty Limited Agent provided to the cochlea and cochlear implant
NZ713967A (en) 2009-07-28 2017-01-27 Shire Human Genetic Therapies Compositions and methods for treating gaucher disease
SI3998078T1 (sl) 2009-08-28 2026-02-27 Genzyme Corporation Encimsko nadomestno zdravljenje z naraščajočim odmerkom za zdravljenje pomanjkanja kisle sfingomielinaze
EP2525808A2 (en) 2010-01-19 2012-11-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
HUE036157T2 (hu) 2010-03-30 2018-06-28 Janssen Biotech Inc Humanizált IL-25 ellenanyagok
CN103118708B (zh) 2010-09-14 2015-08-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法
WO2012061537A2 (en) 2010-11-02 2012-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
WO2012075151A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Novozymes, Inc. Promoters for expressing genes in a fungal cell
WO2012075412A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Michael Verneris Generation of natural killer cells and lymphoid tissue inducer-like (lti-like) nk-22 cells
US8924138B2 (en) 2010-12-07 2014-12-30 Vnomics Corp. System and method for measuring and reducing vehicle fuel waste
CN103261420B (zh) 2010-12-16 2016-01-20 诺维信股份有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
CN103620032B (zh) 2010-12-31 2016-02-24 生物蛋白有限公司 抗体的快速人源化
WO2012101671A1 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
AU2012222833B2 (en) 2011-03-03 2017-03-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
EP2686027B1 (en) 2011-03-16 2021-05-05 Kuros Biosurgery AG Pharmaceutical formulation for use in spinal fusion
RU2495933C2 (ru) * 2011-05-30 2013-10-20 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТКАНЕВОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА (ТАП) ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ) ИЛИ [-1]МЕТИОНИЛ-ФРАГМЕНТ ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ)
WO2013013017A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modifying the glycosylation of lysosomal storage disorder therapeutics
CN104519905A (zh) 2012-03-02 2015-04-15 夏尔人类遗传性治疗公司 用于治疗iii型戈谢病的组合物和方法
WO2013177287A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-28 Georgia Regents University Methods and vectors for gene targeting with inducible specific expression
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
WO2014016873A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a
CN103864913A (zh) 2012-12-18 2014-06-18 联亚生技开发股份有限公司 重组蛋白
WO2014128257A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Sanofi Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
EP2851086A1 (en) 2013-09-20 2015-03-25 Sanofi Serpins: methods of therapeutic ß-cell regeneration and function
EP2769732A1 (en) 2013-02-22 2014-08-27 Sanofi Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
WO2014152497A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
US10066001B2 (en) 2013-03-15 2018-09-04 Apotex Inc. Enhanced liquid formulation stability of erythropoietin alpha through purification processing
WO2014182970A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
US11013917B2 (en) 2013-06-21 2021-05-25 Newsouth Innovations Pty Limited Method and apparatus for close-field electroporation
US11306328B2 (en) * 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
JP7175608B2 (ja) 2014-11-19 2022-11-21 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 加齢に伴うフレイルのための治療としてのオステオカルシン
CA2874083C (en) 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
WO2016116966A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
AU2016321298A1 (en) 2015-09-09 2018-03-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of ER-MAM localized APP-C99 and methods of treating Alzheimer's Disease
WO2017053423A1 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Erasmus University Medical Center Anti-cd47 antibodies and methods of use
US10188750B1 (en) 2015-10-23 2019-01-29 University Of South Florida Self-replicating cell selective gene delivery compositions, methods, and uses thereof
ES2892972T3 (es) 2015-11-02 2022-02-07 Univ Texas Métodos de activación de CD40 y bloqueo de punto de control inmunitario
CN109071653A (zh) 2016-03-29 2018-12-21 詹森生物科技公司 用增加的抗-il12和/或-23抗体给药间隔治疗牛皮癣
KR102470282B1 (ko) 2016-07-15 2022-11-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐｅｇ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법
RU2019104074A (ru) 2016-07-15 2020-08-18 Посейда Терапьютикс, Инк. Химерные рецепторы антигенов и способы их применения
WO2018014039A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors (cars) specific for muc1 and methods for their use
CA3037961A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating psoriasis with anti-il23 specific antibody
CA3036926C (en) 2016-09-30 2022-05-31 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
US20190119636A1 (en) 2017-10-23 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
ES3051391T3 (en) 2016-10-06 2025-12-29 Poseida Therapeutics Inc Inducible caspases and methods for use
US11208474B2 (en) 2016-11-16 2021-12-28 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriasis with anti-IL23 specific antibody
WO2018140121A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active psoriatic arthritis
MX2019009377A (es) 2017-02-07 2019-12-11 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-tnf, composiciones y metodos para el tratamiento de la espondilitis anquilosante activa.
CN117959418A (zh) 2017-03-13 2024-05-03 波赛达治疗公司 用于选择性消除和替换造血干细胞的组合物和方法
AU2018329741B2 (en) 2017-09-08 2025-02-20 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for chimeric ligand receptor (CLR)-mediated conditional gene expression
TW201922780A (zh) 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
US10329543B2 (en) 2017-10-23 2019-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
JP2021502349A (ja) 2017-11-06 2021-01-28 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ２３特異的抗体で乾癬性関節炎を治療する安全かつ有効な方法
SG11202004864TA (en) 2017-12-01 2020-06-29 Seattle Genetics Inc Cd47 antibodies and uses thereof for treating cancer
US12415844B2 (en) 2017-12-20 2025-09-16 Poseida Therapeutics, Inc. BCMA specific VCAR compositions and methods for use
WO2019129876A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
WO2019129877A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
US20200362002A1 (en) 2017-12-29 2020-11-19 Hoffmann-La Roche Inc. Process for providing pegylated protein composition
MX2020009265A (es) 2018-03-05 2020-10-01 Janssen Biotech Inc Metodos para tratar la enfermedad de crohn con un anticuerpo especifico anti-il23.
TWI908706B (zh) 2018-03-07 2025-12-21 美商波西達治療公司 ＣＡＲＴｙｒｉｎ組成物和使用方法
EP3781941B1 (en) 2018-04-20 2026-01-14 Janssen Biotech, Inc. Chromatography column qualification in manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
US20200025776A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Janssen Biotech, Inc. Sustained Response Predictors After Treatment With Anti-IL23 Specific Antibody
AU2019335014A1 (en) 2018-09-05 2021-03-25 Poseida Therapeutics, Inc. Allogeneic cell compositions and methods of use
IL326284A (en) 2018-09-24 2026-04-01 Janssen Biotech Inc A safe and effective method for treating ulcerative colitis with an anti-IL12/IL23 antibody
IL283192B2 (en) 2018-11-20 2025-10-01 Janssen Biotech Inc A safe and effective method for treating psoriasis with a specific anti-IL-23 antibody
MA54562A (fr) 2018-12-18 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Méthode sûre et efficace de traitement du lupus avec un anticorps anti-il12/il23
CA3124103A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Nanotransposon compositions and methods of use
JP7689074B2 (ja) 2019-01-15 2025-06-05 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 若年性特発性関節炎の治療のための抗ｔｎｆ抗体、組成物、及び方法
WO2020152544A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibody compositions for use in methods for the treatment of psoriatic arthritis
WO2020183269A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
KR20210141998A (ko) 2019-03-14 2021-11-23 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-tnf 항체 조성물의 제조 방법
EP3938384A4 (en) 2019-03-14 2022-12-28 Janssen Biotech, Inc. PREPARATION PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY COMPOSITIONS
EA202192505A1 (ru) 2019-03-14 2022-03-29 Янссен Байотек, Инк. Способы получения композиций антитела к фно
JP2022526493A (ja) 2019-03-18 2022-05-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗体を用いた小児被験者の乾癬の治療方法
JP7805788B2 (ja) 2019-05-23 2026-01-26 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｉｌ－２３及びｔｎｆアルファに対する抗体の併用療法による炎症性腸疾患の治療方法
JP2022536279A (ja) 2019-06-03 2022-08-15 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 乾癬性関節炎を治療するための抗ｔｎｆ抗体組成物及び方法
MX2021014882A (es) 2019-06-03 2022-03-25 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-tnf, composiciones y métodos para el tratamiento de la espondilitis anquilosante activa.
MA56124A (fr) 2019-06-04 2022-04-13 Janssen Biotech Inc Méthode sûre et efficace de traitement de l'arthrite psoriasique au moyen d'un anticorps spécifique anti-il23
TW202112354A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 遮蔽抗體調配物
TW202112801A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 純化遮蔽抗體之方法
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
AU2020338947A1 (en) 2019-08-27 2022-03-31 Tonix Pharma Limited Modified TFF2 polypeptides
US20220372105A1 (en) 2019-09-05 2022-11-24 Poseida Therapeutics, Inc. Allogeneic cell compositions and methods of use
AU2020407235A1 (en) 2019-12-20 2022-07-07 Poseida Therapeutics, Inc. Anti-MUC1 compositions and methods of use
AU2021230361A1 (en) 2020-03-04 2022-09-08 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of Metabolic Liver Disorders
WO2021183795A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
WO2021211628A1 (en) 2020-04-14 2021-10-21 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for use in the treatment of cancer
US20210347880A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Janssen Biotech, Inc. Methods of Treating Crohn's Disease with Anti-IL23 Specific Antibody
IL298389A (en) 2020-05-21 2023-01-01 Janssen Biotech Inc Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to il-23 and tnf alpha
WO2022013745A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating psoriatic arthritis with anti-il23 specific antibody
US20220073603A1 (en) 2020-07-30 2022-03-10 Janssen Biotech, Inc. Method of Treating Psoriasis in Pediatric Subjects with Anti-IL12/IL23 Antibody
US20240000969A1 (en) 2020-10-21 2024-01-04 Poseida Therapeutics San Diego Compositions and methods for delivery of nucleic acids
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
EP4298205A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
EP4297728A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
WO2022187671A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of hemophilia
EP4305062A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriatic arthritis patients with inadequate response to tnf therapy with anti-il23 specific antibody
IL305802A (en) 2021-03-12 2023-11-01 Janssen Biotech Inc A safe and effective method for the treatment of rheumatoid arthritis with a specific anti-IL23 antibody
EP4367136A1 (en) 2021-07-09 2024-05-15 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
US12534524B2 (en) 2021-07-09 2026-01-27 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-TNF antibody compositions
JP2024527581A (ja) 2021-07-09 2024-07-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗体組成物を生産するための製造方法
US20240352080A1 (en) 2021-07-14 2024-10-24 Seagen Inc. Antibody Masking Domains
EP4405387A1 (en) 2021-09-24 2024-07-31 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
CA3234642A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Poseida Therapeutics, Inc. Transposases and uses thereof
EP4413141A1 (en) 2021-10-04 2024-08-14 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon compositions and methods of use thereof
EP4423126B1 (en) 2021-10-29 2026-05-06 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating crohn's disease with anti-il23 specific antibody
EP4433501A1 (en) 2021-11-15 2024-09-25 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating crohn's disease with anti-il23 specific antibody
US20230159633A1 (en) 2021-11-23 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Method of Treating Ulcerative Colitis with Anti-IL23 Specific Antibody
US20250099383A1 (en) 2022-01-21 2025-03-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
EP4482967A1 (en) 2022-02-23 2025-01-01 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified cells and methods of use thereof
EP4526342A1 (en) 2022-05-18 2025-03-26 Janssen Biotech, Inc. Method for evaluating and treating psoriatic arthritis with il23 antibody
EP4568990A1 (en) 2022-08-11 2025-06-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric cd8-alpha co-receptor compositions and methods of use
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte
AU2023383916A1 (en) 2022-11-22 2025-07-10 Janssen Biotech, Inc. Method of treating ulcerative colitis with anti-il23 specific antibody
EP4634373A1 (en) 2022-12-16 2025-10-22 University of Rochester Repairment of barrier dysfunction in esophagus
KR20250155027A (ko) 2023-02-21 2025-10-29 포세이다 테라퓨틱스, 인크. Aav piggybac 트랜스포존 폴리뉴클레오티드 조성물 및 이의 사용 방법
KR20250166122A (ko) 2023-02-21 2025-11-27 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법
EP4669746A1 (en) 2023-02-21 2025-12-31 Poseida Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND GENOMIC EDITING PROCESSES
AU2024252899A1 (en) 2023-04-05 2025-11-13 Poseida Therapeutics, Inc. Transposases and uses thereof
KR20250167671A (ko) 2023-04-05 2025-12-01 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 키메라 트랜스포사제 및 그의 용도
EP4689090A1 (en) 2023-04-05 2026-02-11 Poseida Therapeutics, Inc. Transposase polynucleotides and uses thereof
IL324386A (en) 2023-05-10 2026-01-01 Poseida Therapeutics Inc Transposases and uses thereof
WO2025064507A1 (en) 2023-09-19 2025-03-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for integration of viral vectors
WO2025160432A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Poseida Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing in vivo persistence and potency of cell therapy
CA3249015A1 (en) 2024-03-20 2025-10-31 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating crohn’s disease with anti-il23 specific antibody
WO2025259466A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 University Of Rochester Gm-csf and gm-csf-induced dendritic cells enhance fracture healing and bone repair
WO2025262604A1 (en) 2024-06-17 2025-12-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating crohn's disease with anti-il23 specific antibody
CA3258952A1 (en) 2024-06-27 2026-03-01 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating ulcerative colitis with anti-il23 specific antibody
WO2026064550A1 (en) 2024-09-19 2026-03-26 Poseida Therapeutics, Inc. Transposases and uses thereof
WO2026080393A1 (en) 2024-10-07 2026-04-16 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for use in car cell therapies

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
AU572108B2 (en) * 1983-01-19 1988-05-05 Genentech Inc. Human tpa production using vectors coding for dhfr protein
US4680174A (en) * 1984-05-24 1987-07-14 Damon Biotech, Inc. Induction of immune response by immunization with encapsulated antigen-producing cells
US4822736A (en) * 1984-07-05 1989-04-18 Baylor College Of Medicine Amplification of adenosine deaminase genes in mammalian cells using adenosine, alanosine, uridine, and deoxycoformycin
IL79289A (en) * 1985-07-05 1992-01-15 Whitehead Biomedical Inst Introduction and expression of foreign genetic material into keratinocytes using a recombinant retrovirus
EP0236059B1 (en) * 1986-02-27 1994-04-27 Snow Brand Milk Products Co. Ltd. Preparation of erythropoietin-producing cells and production process of erythropoietin using same
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
GB8615942D0 (en) * 1986-06-30 1986-08-06 Animal & Food Research Council Peptide production
CA1341356C (en) * 1987-05-01 2002-04-09 Richard F. Selden Transkaryotic implantation
GB8718779D0 (en) * 1987-08-07 1987-09-16 Grosveld F G Dna sequence & expression vector
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5043270A (en) * 1989-03-31 1991-08-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intronic overexpression vectors
JP3193999B2 (ja) * 1989-06-23 2001-07-30 アメリカ合衆国 非選択性遺伝子の同定可能な発現のための能率的方法
EP0945515A3 (en) * 1989-11-06 2002-08-21 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
US5272071A (en) * 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
ES2151463T5 (es) * 1989-12-22 2012-10-29 Merck Serono Sa Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos
FI914947A0 (fi) * 1990-02-22 1991-10-21 Biogen Inc Foerbaettrad expression av polypeptider.
IT1241123B (it) * 1990-04-19 1993-12-29 Consiglio Nazionale Ricerche Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in dna ricombinanti episomiali,loro preparazione e loro impiego
WO1991019796A1 (en) * 1990-06-12 1991-12-26 Baylor College Of Medicine Method for homologous recombination in animal and plant cells
DE69133557D1 (de) * 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
IE913929A1 (en) * 1990-11-13 1992-05-20 Immunex Corp Bifunctional selectable fusion genes
ATE177784T1 (de) * 1990-12-07 1999-04-15 Univ Florida Rekombinante zellen, die stark chromosomal- integrierte heterologe gene exprimieren
SG93780A1 (en) * 1991-05-06 2003-01-21 Cell Genesys Inc Gene manipulation and expression using genomic elements
AU664847B2 (en) * 1991-05-15 1995-12-07 Cell Genesys, Inc. Genomic modifications with homologous DNA targeting
WO1993004169A1 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
PT101031B (pt) * 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
MX9305183A (es) * 1992-08-27 1994-05-31 Us Agriculture Intron portatil, molecula de adn genomico viral, virus vivo y vacuna que los contiene y metodo para su obtencion.
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery

Also Published As

Publication number Publication date
NO964802L (no) 1997-01-09
EP0759082A1 (en) 1997-02-26
FI964536L (fi) 1997-01-09
NO964802D0 (no) 1996-11-12
WO1995031560A1 (en) 1995-11-23
IL113708A0 (en) 1995-08-31
AU709058B2 (en) 1999-08-19
CA2190289A1 (en) 1995-11-23
BR9507874A (pt) 1997-08-19
SK146196A3 (en) 1998-02-04
US5641670A (en) 1997-06-24
CZ325896A3 (en) 1997-12-17
MX9605542A (es) 1998-05-31
NZ285945A (en) 1998-03-25
FI964536A0 (fi) 1996-11-12
KR100379356B1 (ko) 2003-06-09
JPH10500570A (ja) 1998-01-20
KR970703429A (ko) 1997-07-03
RU2267533C2 (ru) 2006-01-10
UA34493C2 (uk) 2001-03-15
HUT76844A (en) 1997-11-28
FI964536A7 (fi) 1997-01-09
ZA953879B (en) 1996-01-18
AU2550495A (en) 1995-12-05
HU9603144D0 (en) 1997-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5641670A (en) Protein production and protein delivery
EP0672160B1 (en) Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
US6565844B1 (en) Protein production and protein delivery
US6537542B1 (en) Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy and protein production
US6924365B1 (en) Optimized messenger RNA
US20140350089A1 (en) Optimized messenger rna
WO2002064799A2 (en) Optimized messenger rna
US20050129669A1 (en) DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
EP1325138A2 (en) Optimized messenger rna
CN1256986C (zh) 蛋白质的生产和蛋白质的输送
AU738395B2 (en) DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
AU726446B2 (en) Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
EP2275559A2 (en) Optimized messenger RNA
HK1152345A (en) Optimized messenger rna

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20150511