CZ296414B6 - Kmeny mikroorganizmu z celedi Geotrichum candidum, zpusob sladování obilovin a pouzití mikroorganizmu z celedi Geotrichum candidum pri sladování obilovin - Google Patents

Abstract

Kmeny mikroorganizmu z celedi Geotrichum candidum, získatelné selekcí a klonováním prírodních kmenumikroorganizmu s následujícími vlastnostmi: úcinnost lipázy nizsí nez 2,5 . 10.sup.-7.n. nKat/bunka, v podstate úplná inhibice nezádoucí flóry, vyvíjející se v prubehu sladování, neprítomnost mutagenní aktivity podle Amesova testu. Zpusob sladování obilovin, napríklad zita, jecmene, rýze, ciroku, kukurice nebo pohanky, pri kterém se materiál naockuje kmenem Geotrichum candidum v mnozství 10.sup.5.n. az 10.sup.9.n. jednotek pro tvorbu kolonií CFU/kg obilovin, pricemz se naockování muze provést jednou nebo vícekrát v prubehu jedné nebo vetsího poctu etap postupu. Pouzití mikroorganizmu z celediGeotrichum candidum pri sladování obilovin a jiných rostlinných materiálu k potlacení vývoje flóry,kontaminující a kolonizující obiloviny nebo jiné rostlinné materiály.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kmenů mikroorganizmů z čeledi Geotrichum candidum, způsobu sladování obilovin a použití mikroorganizmů z čeledi Geotrichum candidum při sladování obilovin a jiných rostlinných materiálů, jako jsou například žito, ječmen, rýže, kukuřice, čirok nebo pohanka. Uvedené mikroorganizmy jsou využívány pro potlačení vzniku jiné mikroflóry a tím kontaminace uvedených obilovin. Vynález nalezne své uplatnění ve sladovnictví a tím i při výrobě piva, ale také při výrobě destilátů a v dalších oborech, ve kterých se používá obilovin a jiných rostlinných materiálů.

Dosavadní stav techniky

Obiloviny a další rostlinné materiály, například ječmen, mohou být již před sladováním různým způsobem zpracovávány a současně může dojít k jejich kontaminaci nejrůznějšími mikroorganizmy. Například v případě ječmene jde zásadně o možnost přítomnosti bakterií, kvasinek a také hub vláknitého typu. Tato flóra kontaminuje a kolonizuje zrna ječmene již před sklizní a pak dále v průběhu sladování. Povaha a množství těchto mikroorganizmů závisí na podmínkách pěstování a na podnebí a rovněž také na délce a podmínkách skladování.

Při různých analýzách provedených za polních podmínek bylo zjištěno přibližně 100 různých typů kontaminace.

Nejčastěji šlo o mikroorganizmy Alternaria, Cladosporium a Fusarium.

Kromě toho bylo pozorováno, že při pozdní sklizni nebo při sklizni prováděné za vlhkého počasí obsahují zrna velké množství mikroorganizmů Fusarium. Pokud jde o flóru, která kontaminuje a kolonizuje“zrna v průběhu skladování před sladováním, jde zejména o xerofilní houby vláknitého typu. Převažujícími houbami jsou zejména Aspergillus a Penicillium.

Problém tedy spočívá v tom, že různé postupy, při nichž se mění obiloviny zejména na slad, se provádějí za podmínek příznivých pro vývoj mikroflóry, která je již v zrnech přítomna. Jde zejména o vlhkost, teplotu, přítomnost živých látek a dobu pobytu v různých reaktorech, což všechno umožňuje množení bakterií a kvasinek až do množství 10² až 10⁴ a mimoto ještě dochází k podstatnému vývoji plísní.

Pokud jde o různé stupně způsobu sladování postupuje se tak, že po přípravě zrna se zrno máčí po dobu 40 hodin, čímž dojde k příjmu 35 až 40 % vody. Pak se nechá zrno klíčit přibližně 6 dnů při teplotě přibližně 16 °C. V dalším postupu se zrno hvozdí, což znamená sušení při různých úrovních teploty přibližně v rozmezí 50 až 80 °C. Potom se zrno zbaví klíčků a získaný slad se dále skladuje.

Toto zpracování, při kterém se nekontroluje mikroflóra, představuje určité nebezpečí co se týče kvality sladu a tím i kvality dalších produktů, například piva. Může například dojít k tomu, že v důsledku kontaminace vzniknou inhibitory klíčení. Dále mohou vznikat nežádoucí enzymy, jako lipázy, oxidázy, proteázy a podobně. Některé z těchto mikroorganizmů mohou být ve větším množství příčinou nežádoucích pachů nebo příchutí. Pivo získané z tohoto materiálu může mít příchuť po plísni nebo zemitou příchuť a podobně.

Obecně je možno uvést, že v pivovarnictví se může vyskytovat jev, který spočívá v tom, že lahvové pivo v okamžiku otevření láhve z této láhve vystříkne nebo vypění v důsledku nestability oxidu uhličitého. Příčinou tohoto jevu jsou specifické mikroorganizmy. Bylo by proto vhodné a

-1 CZ 296414 B6 žádoucí udržet množství těchto mikroorganizmů alespoň na určité malé úrovni, aby jejich množství nepřesáhlo určitou mez. Zvláště by bylo zapotřebí snížit množství mikroorganizmů, které způsobují nestabilitu oxidu uhličitého, zvláště mikroorganizmů.fwsarzMm.

Mimoto přítomnost některých dalších mikroorganizmů, například bakterií typu Pediococcus, může mít za následek rychlé zanášení filtrů.

Základní nevýhodou vývoje plísní je zvýšené riziko tvorby mykotoxinů, a to zejména z plísní, které vytvářejí toxiny a přirozeně se vyskytují v obilovinách i v dalších rostlinných materiálech.

Přes výše uvedené nevýhody nedochází zatím ve sladovnictví k podstatnému potlačování uvedené mikroflóry. K tomuto účelu také prozatím nejsou k dispozici přípustné a současně účinné prostředky.

Pouze v průběhu máčení je možno provádět dezinfekci, například chlornanem sodným nebo vápenným mlékem. Tyto dezinfekční prostředky mají jen malou účinnost na mikroflóru, mohou však představovat riziko pro některé stupně sladování. Zvláště v případě překročení určitých dávek může být potlačeno klíčení zrn, přičemž takto vznikají další problémy, zvláště pokud jde o chuť výsledného piva.

Vynález si klade za úkol odstranit výše uvedené nevýhody, zejména si klade za úkol potlačit nežádoucí mikroflóru použitím specifického mikroorganizmu, zvoleného na základě řady předběžných výzkumů.

Z dosavadního stavu techniky je znám návrh na použití bakterií mléčného kvašení pro přípravu kyselého sladu a pro potlačení vývoje hub, zejména kmene Fusarium (viz publikovaná mezinárodní patentová přihláška WO 94/16053). Použití těchto bakterií v průběhu sladování dovoluje pouze částečnou inhibici růstu hub, avšak neumožní potlačit vznik mykotoxinů v průběhu postupu sladování.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří kmeny mikroorganizmů z čeledi Geotrichum candidum, získatelné selekcí a klonováním přírodních kmenů mikroorganizmu snásledujícími vlastnostmi:

- účinnost lipázy nižší než 2,5 . 10^-7 nKat/buňka,

- v podstatě úplná inhibice nežádoucí flóry, vyvíjející se v průběhu sladování,

- nepřítomnost mutagenní aktivity podle Amesova testu.

Výhodně mají tyto kmeny kromě toho jednu, dvě nebo tři z následujících vlastností:

stálost jejich spor v roztoku je delší než 6 měsíců,

- produkce spor je vyšší než 10⁷/ml, kmeny mohou zlepšit rychlost filtrace zápary.

Těmito uvedenými kmeny jsou výhodně kmeny uložené vCNCM pod čísly 1-1474 a 1-1475.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob sladování obilovin, například žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo pohanky podle schématu, uvedeného na obr. 1, jehož podstata spočívá v tom, že se materiál naočkuje libovolným kmenem Geotrichum candidum, viz výše, v množství 10⁵ až 10⁹ jednotek pro tvorbu kolonií CFU/kg obilovin.

Ve výhodném provedení tohoto postupu se k naočkování užije 10⁷ až 10⁸ CFU na kg obilovin.

-2CZ 296414 B6

Uvedený mikroorganizmus se výhodně naočkuje jednou nebo vícekrát v průběhu jedné nebo většího počtu následujících etap: příprava obilovin nebo jiných rostlinných materiálů, první máčení, poslední máčení, střední máčení, přenos z máčení do etapy klíčení, v průběhu klíčení, při přenosu z etapy klíčení na hvozdy nebo v průběhu sušení na hvozdech.

Při provádění tohoto postupu podle vynálezu je výhodné, jestliže se kjeho provádění užijí kmeny uložené v CNCM pod čísly 1-1474 nebo 1-1475.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití mikroorganizmu z čeledi Geotrichum candidum při sladování obilovin a jiných rostlinných materiálů, jako žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo pohanky k potlačení vývoje flóry, kontaminující a kolonizující obiloviny nebo jiné rostlinné materiály.

Při tomto použití uvedených mikroorganizmů se výhodně použije jeden nebo větší počet vybraných kmenů Geotrichum candidum, zejména výše definovaných kmenů. Rovněž je výhodné, jestliže se mikroorganizmus naočkuje v průběhu sladování ve formě čisté kultury nebo ve formě směsné kultury ve spojení s jedním nebo větším počtemjiných mikroorganizmů.

Rovněž je výhodné jestliže se při tomto použití mikroorganizmus naočkuje střídavě bakteriemi mléčného kvašení nebo bakteriemi ve formě směsné kultury.

Při použití těchto mikroorganizmů se uvedený mikroorganizmus výhodně užije k naočkování v množství 10⁵ až 10⁹, s výhodou 10⁷ až 10⁸ jednotek pro tvorbu kolonií CFU/kg obilovin nebo jiného rostlinného materiálu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití některého z kmenů definovaných výše v průběhu sladování obilovin nebo jiných rostlinných materiálů, například žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo pohanky k potlačení fenoménu pěnění nebo vystřikování nápoje, připraveného ze sladu.

Jak již bylo uvedeno navrhuje se podle předmětného vynálezu použít v průběhu sladování pro potlačení vzniku nežádoucí mikroflóry mikroorganizmusGeotrichum candidum.

Geotrichium candidum se přirozeně vyskytuje v zrnech ječmene v průběhu jeho klíčení i ve výsledném sladu. Tento mikroorganizmus je na jedné straně schopen potlačit vznik flóry vytvářející toxiny v průběhu sladování a na druhé straně je schopen potlačit syntézu mykotoxinů a tak zlepšit biochemickou i fyzikálně-chemickou kvalitu sladu.

Geotrichum candidum je mikroorganizmus, který se vyskytuje v mlékárenství. Většina kmenů byla izolována z mléka a ze sýra. Jde o mikroorganizmus vyskytující se v přirozeně při zpracování mléka na sýry, přičemž v mlékárenství byly již dlouho vyvíjeny snahy potlačit vznik tohoto kvasinkového mikroorganizmu, který může vyvolat vzhledové změny sýra. S tímto mikroorganizmem byly proto prováděny různé testy, aby bylo možno stanovit jeho úlohu při zlepšování organoleptických vlastností sýrů a současně zjistit jeho účinek na inhibici vývoje patogenních bakterií a nežádoucích plísní.

Účinnost lipázy tohoto mikroorganizmu, zjištěná při výrobě sýra, byla považována na nevýhodnou vlastnost vzhledem k možnosti vzniku organoleptických změn, viz Drost a kol. ASBC Joumal, 1990, 124 až 131, Kobayashi a kol., Journal of fermentation and bioengineering, 1993, 371 až 375.

Vynález je tedy zaměřen na využití tohoto mikroorganizmu Gotrichum candidum při sladování obilovin a dalších materiálů rostlinné povahy, jako jsou žito, ječmen, rýže, čirok, kukuřice a pohanka, pro potlačení vývoje nežádoucí flóry a tím i kontaminace a kolonizace uvedených materiálů.

-3CZ 296414 B6

Postupuje se tak, že se v průběhu sladování materiál naočkuje vybranými kmeny Geotrichum candidum, a to ve formě čisté kultury nebo ve formě směsné kultury spolu s jedním nebo větším počtem dalších mikroorganizmů, zejména bakterií mléčného kvašení.

Podle předmětného vynálezu se Geotrichum candidum použije v množství 10⁵ až 10⁹, výhodně 10⁷ až 10⁸ jednotek pro tvorbu kolonií CFU na kg obilovin nebo jiného rostlinného materiálu, za účelem potlačení vývoje nežádoucí mikroflóry.

Výhody tohoto vynálezu spočívají v tom, že Geotrichum candidum způsobí inhibici nežádoucí flóry, například Fusarium, Penicillium, Aspergillus, a kromě toho současně potlačí i produkci sekundárních metabolitů této nežádoucí flóry, jako tvorbu mykotoxinů a látek, které způsobují nestabilitu oxidu uhličitého a tím i pěnění piva v lahvích.

Uvedený mikroorganizmus je tedy možno použít při sladování obilovin a dalších materiálů, jako jsou žito, ječmen, rýže, čirok, kukuřice nebo pohanka k zábraně pěnění nápojů vyrobených z tohoto sladu.

Podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že kromě potlačení mikroorganizmů ve sladu způsobuje Geotrichum candidum také snížení množství mastných kyselin, které mohou způsobit zhoršení chuti výsledného piva, včetně příchuti po plísni. Mimoto potlačuje tento mikroorganizmus i flóru produkující polysacharidy, což usnadní filtraci.

V neposlední řadě je třeba uvést, že při použití některých kmenů Geotrichum candidum se dosáhne zlepšení vývoje bakterií mléčného kvašení, které zase potlačují vývoj nežádoucí flóiy a zlepšují kvalitu sladu snížením jeho hodnoty pH.

Přitom je možno pozorovat určité rozdíly v účinku jednotlivých kmenů Geotrichum candidum na inhibici mikroflóry, inhibici produkce sekundárních metabolitů touto nežádoucí mikroflórou, jakož i na inhibici tvorby mykotoxinů, látek způsobujících pěnění nápojů a také na organoleptické a fyzikálně-chemické vlastnosti nápojů, zejména piva.

Těmito fyzikálně-chemickými vlastnostmi se rozumí zejména:

- snížení obsahu mastných kyselin, které jsou často příčinou narušené chuti piva, například chuti po oxidech nebo chuti po plísni,

- snadnost filtrace v důsledku inhibice vývoje určité mikroflóry produkující polysacharidy,

- přítomnost pěnění.

Podle vynálezu je možno různé kmeny Geotrichum candidum podrobit selekci na základě jejich účinnosti a současně nepřítomnosti nevhodných vlastností, zejména slabé účinnosti lipázy.

Tento výběr se týká selekce přirozeně se vyskytujících kmenů ve sladu na základě kombinace kritérií, mezi které patří jejich kvalita a účinnost, přičemž některé z těchto požadavků jsou podstatné a další pouze zvyšují výhodnost kmene v souvislosti se splněním základních kritérií.

Mezi nezbytné vlastnosti patří:

(a) slabá účinnost lipázy, (b) inhibice vývoje nežádoucí flóry ve sladu, (c) nepřítomnost mutagenity nebo produkce toxinů tímto kmenem.

Jako výhodné vlastnosti těchto kmenů je možno uvést:

(d) stálost roztoku spor déle než 6 měsíců,

-4CZ 296414 B6 (e) vysoká produkce spor 10⁷ až 10⁸/ml, (f) zvýšená rychlost filtrace, přičemž výhodná je zejména kombinace výše uvedených vlastností.

Syntéza lipázy v průběhu výroby sladu má být co nejmenší vzhledem k tomu, že tento enzym může vyvolat příchuť piva po oxidech. Účinnost lipázy u kmenů Geotrichum candidum, vybraných pro použití při sladování, má být velmi malá, aby tak nedocházelo k syntéze exogenní lipázy při sladování.

Vybrané kmeny byly tedy podrobeny selekci podle výše uvedených základních požadavků (a), (b) a (c) v kombinaci s výhodnými (d), (e) a (f) nebo s větším počtem těchto výhodných vlastností současně.

Zvolené kmeny měly s výhodou účinnost lipázy nižší než 21,5 . 10~⁷ nKat/buňku při úplném potlačení nežádoucí flóry, přičemž se tyto kmeny nevyznačovaly vznikem mutací.

Kromě toho by měla výhodně produkce spor dosahovat s výhodou 10⁷ spor/ml, podle ještě výhodnějšího provedení 10⁷ až 10⁸ spor/ml.

Způsob selekce dovoluje vybrat kmeny Geotrichum candidum takovým způsobem, aby při jejich použití bylo možno dosáhnout dobrých výsledků, pokud se týče inhibice nežádoucí flóry nebo zvýšení kvality sladu, včetně možnosti snadné filtrace. Kmeny získané touto selekcí byly uloženy 6. září 1994 ve veřejné sbírce kultur, Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur pod čísly 1-1474 a 1-1475. V průběhu zkoušek byly použity kmeny Geotrichum candidum v množství 10⁷ až 10⁸ CFU/kg ječmene v máčecí vodě, přičemž byl použit ječmen střední kvality „six rans d hiver“, přičemž při tomto zpracování bylo dosaženo výroby sladu s velmi dobrou kvalitou.

V popisu předmětného vynálezu, zejména v příkladové části, bude kmen č. 1-1474 označován GC3 a kmen č. 1-1475 bude označován jako kmen GC4.

Použití uvedeného mikroorganizmu pro účely podle předmětného vynálezu nemá žádné nepříznivé důsledky na postup výroby piva ani na vlastnosti vyrobeného piva. Kromě toho je pivo získané při použití Geotrichum candidum organolepticky zcela totožné s pivem vyrobeným z nezpracovaného sladu. Také vznik aromatických látek není nijak nepříznivě ovlivněn.

Další výhody předmětného vynálezu, zejména zpracování sladu, budou zřejmé z následujícího popisu současně s přiloženými obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny jednotlivé stupně sladování. Současně jsou vyznačeny jednotlivé stupně, ve kterých je možno materiál naočkovat zvolenými mikroorganizmy.

Na obr. 2 je znázorněn vývoj účinnosti lipázy v průběhu sladování při použití nebo bez použití kmene Geotrichum candidum.

Na obr. 3 je znázorněn diagram, znázorňující kinematiku filtrace při použití a bez použití vybraných kmenů Geotrichum candidum.

Podle vynálezu je možno zlepšit kvalitu sladu a jeho mikroflóru, přičemž může jít o slad z obilovin nebo jiných rostlinných materiálů, jako jsou žito, ječmen, rýže, čirok, kukuřice nebo pohanka.

-5CZ 296414 B6

Vynález se však zejména týká zpracování ječmene na slad, i když je zřejmé, že vynález nemůže být omezen na toto použití a je možno jej využít v případě všech obilovin nebo rostlinných materiálů, které je možno podrobit sladování.

Na obr. 1 je schematicky znázorněno šest stupňů výroby sladu, I, II, III, IV, V a VI. Postupuje se tak, že po úpravě zrna v první etapě I se ječmen máčí ve vodě až do zvýšení obsahu vody až na 35 až 45 %. Bylo již uvedeno, že v průběhu máčení se voda jednou nebo opakovaně mění, tak, aby bylo zrno zásobeno kyslíkem.

Po druhé etapě II přechází zvlhčený ječmen do etapy III, kde dochází k jeho klíčení. Pak se ječmen ukládá na hvozdech v etapě IV, kde dochází k sušení zrna při teplotě v rozmezí 50 až 80 °C, přičemž v každém patře se dodržuje stanovená doba sušení.

V etapě V se ječmen zbavuje klíčků. Výsledný slad se pak skladuje, což tvoří poslední etapu IV postupu.

Je zcela zřejmé, že přidávání vody, uchovávání při uvedených teplotách v průběhu sladování a další uvedené podmínky podporují vznik jakékoliv mikroflóry, která byla přítomna již před začátkem postupu.

Podle vynálezu je možno dosáhnout inhibice vývoje této mikroflóry přidáním vhodného mikroorganizmu z čeledi Geotrichum candidum.

Na obr. 1 je toto přidávání možno uskutečnit v průběhu sladování v místech, která jsou označena šipkami, očíslovanými 7 až 12.

Mikroorganizmus Geotrichum candidum je tedy možno naočkovat za současného provzdušnění spolu s první máčecí vodou. Dále je možno mikroorganizmus přímo přidat k zrnům ječmene před máčením. Mimoto je možno mikroorganizmus přidat v průběhu máčení, a to dvakrát nebo třikrát do opakovaně měněné máčecí vody v případě, že ječmen je silně kontaminován.

Očkování je možno uskutečnit také v průběhu přepravy ječmene z jednotky pro máčení do stupně, v němž dochází ke klíčení, například spolu s aktivátorem klíčení. Toto přidávání nevyvolává žádné problémy. Vzhledem k tomu, že se v průběhu sladování aktivátory klíčení k zrnům ječmene zcela běžně přidávají.

Konečně, jak je na obr. 1 znázorněno, je možno mikroorganizmus přidávat v průběhu klíčení, při přepravě na hvozdy nebo při sušení zrna.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsob selekce kmenů Geotrichum candidum

V následující tabulce I je znázorněna aktivita lipázy v nanomolech za sekundu na buňku v případě různých kmenů Geotrichum candidum po inkubaci po dobu jednoho týdne při teplotě 20 °C v živném prostředí se sladovým extraktem. Kmeny L⁺ a L“ jsou kmeny Geotrichum candidum, izolované z mlékáren a sýráren s velkou účinností lipázy. Ostatní kmeny byly izolovány ve sladovnách. Je zřejmé, že kmeny ze sladoven mají podstatně nižší aktivitu lipázy než kmeny z mlékáren. Zkouška, prováděná v kapalném prostředí dovoluje podrobit selekci různé kmeny Geotrichum candidum na základě nízké účinnosti lipázy.

-6CZ 296414 B6

Tabulka I kmeny____________I?_________LF_________GC1_______GC2_______GC3 účinnost lipázy

10~⁷ nKat/buňka 6,4 2,5 0,3 1,7 1,5

Při druhém testu se prokazuje vliv různých vybraných kmenů na celkovou účinnost lipázy v zrnu, vyjádřeno vnanomolech za sekundu na gram sušiny v průběhu sladování v přítomnosti nebo v nepřítomnosti Geotrichum candidum. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce H.

Tabulka Π kmeny_____________kontrola GC1______GC2______GC3_____GC4______GC5 účinnost lipázy v zeleném sladu nKat/g 19,9 15,1 16,9 14,8 11,0 11,0

Touto zkouškou se stanoví celková účinnost lipázy v zeleném sladu, která je výsledkem účinnosti z ječmene a z vývoje mikroflóry. Zkouška byla provedena bez naočkování a po naočkování různými kmeny Geotrichum candidum, u nichž se předpokládá inhibice mikroflóry, produkující lipázu. Z výsledků je zřejmé, že skutečně došlo ke snížení účinnosti lipázy v zeleném sladu ve srovnání s kontrolami. Tato zkouška dovoluje selekci kmenů Geotrichum candidum podle nízké účinnosti lipázy v zeleném sladu.

Vývoj určitých typů mikroflóry v průběhu výroby sladu může způsobit změny chování materiálu při filtraci, a tím potíže při výrobě piva. Snížení možnosti filtrace může být způsobeno tvorbou polysacharidu, odstranit tyto potíže je možno syntézou enzymů, které štěpí tyto materiály, jako jsou beta-glukanázy a pentosanázy nebo inhibicí mikroflóry, která produkuje polysacharidy. Vzhledem ktomu, že různé kmeny Geotrichum candidum mohou působit různým způsobem, byly prováděny zkoušky na filtrovatelnost sladu, „Filtration TEPRAL“. V následující tabulce ΙΠ jsou uvedeny hodnoty pro kinetiku filtrace a promývání materiálu po naočkování nebo bez naočkování kmeny Geotrichum candidum v průběhu výroby sladu. GC1, GC2, GC3 a GC5 jsou různé kmeny Geotrichum candidum, použité ktěmto zkouškám.

Tabulka III kmen kontrola* GC1 GC2 GC3 GC5

kinetika filtrace g/min	23,2	27,6	28,8	40	8,8
kinetika promývání
g/min	42	42,8	40	56,4	10,4

bez naočkování.

Jak je zřejmé z tabulky III, záleží kinetika filtrace na použité kmenu Geotrichum candidum. Kmeny, zpomalující filtraci není možno použít.

Produktivita Geotrichum candidum a stabilita tohoto organizmu v průběhu času je při výběru kmenů důležitým ekonomickým parametrům. Zkoušky na produktivitu a na stálost při teplotě 4 °C prokázaly velké rozdíly v případě jednotlivých kmenů. V následující tabulce IV jsou uvedeny příslušné hodnoty pro různé kmeny Geotrichum candidum.

Tabulka IV

kmen	GC1	GC2	GC3	GC4	GC5
produktivita-počet spor/ml (xlO6)	20	100	50	90	22
% životaschopných spor po 8 týdnech při 4 °C	80%	8%	50%	90%	100 %

Je zřejmé, že kmeny Geotrichum candidum mají různou produktivitu i stabilitu.

Inhibici nežádoucí flóry, vyvíjející se při sladování je rovněž možno u různých kmenů ověřit.

Uvedené zkoušky byly doplněny toxikologickými zkouškami a zkouškami na mutagenitu kmenů.

Různé uvedené zkoušky dovolily vybrat ty kmeny Geotrichum candidum, při jejichž použití je možno dosáhnout velmi dobrých výsledků, pokud jde o inhibici nežádoucí flóry a o zlepšení kvality sladu, zvláště účinnosti lipázy a snadnosti filtrace.

Příklad 2

Účinek Geotrichum candidum na vývoj mikroflóry

Výhoda použití kmenů na začátku postupu spočívá v potlačení vývoje nežádoucí mikroflóry.

Pokusy prokázaly, že dobrých výsledků je možno dosáhnout při naočkování 10⁵ až 10⁹, s výhodou 10⁷ až 10⁸ jednotek pro tvorbu kolonií, CFU/kg obilovin nebo jiného rostlinného materiálu. Mikroorganizmus je možno naočkovat jednou nebo vícekrát v průběhu postupu. Mimoto je možno jej použít ve formě čisté kultury nebo ve formě směsi s dalšími mikroorganizmy, například bakteriemi mléčného kvašení. Konečně je možno střídat použití čisté kultury Geotrichum candidum a směsné kultury.

Bylo zjištěno, že uvedeným způsobem je možno zajistit potlačení nežádoucích mikroorganizmů a zlepšení ostatních vlastností výsledného sladu. Jde zejména o potlačení tvorby nežádoucích enzymů, například oxidáz nebo naopak o produkci žádoucích enzymů, jako celuláz. Je také možno modifikovat vůni sladu pouze použitím Geotrichum candidum nebo střídavým naočkováním tímto mikroorganizmem a specifickým mikroorganizmem pro zajištění žádoucího výsledku.

Výsledky uvedených zkoušek jsou shrnuty v následující tabulce V.

Tabulka V

plíseň	ječmen s Fusarium	kontrolní slad	slad s Geotrichum
% kontaminovaných zrn
Altemaria	20	5	0
Aspergillus	20	15	0
Fusarium	100	40	5
Penicillium	30	10	5
Geotrichum	0	0	100

V tabulce V jsou uvedena v procentech množství zrn, kontaminovaných nejběžnějšími plísněmi, zvláště Altemaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium a Geotrichum v ječmenu, obsahujícím Fusarium, v kontrolním sladu, který nebyl ničím naočkován a ve sladu, naočkovaném Geotrichum candidum. Výsledky jsou velmi průkazné. Ve sladu, připraveném po naočkování

-8CZ 296414 B6

Geotrichum candidum je pouze 5 % zrn kontaminovaného plísněmi Fusarium a Penicillium, v kontrolním sladuje 40 % zrn napadeno Fusarium a přibližně 10 % Penicillium.

Příklad 3

Vliv Geotrichum candidum na produkci mykotoxinů při sladování

V následující tabulce Vije znázorněn inhibiční účinek Geotrichum candidum na produkci mykotoxinů při sladování. Zkoušky byly provedeny stanovením Zeralenone v případě ječmene, napadeného fusariemi, kontrolního ječmene bez jakéhokoliv naočkování a ječmene, naočkovaného Geotrichum.

Tabulka VI ječmen kontrolní slad s _____________________s Fusarium___________slad_________________Geotrichum_________ Zaralenone pg/kg 3 100 3

Příklad 4

Vliv naočkování Geotrichum na účinnost lipázy

Výhody použití mikroorganizmu podle vynálezu jsou také zřejmé z diagramu, znázorněného na obr. 2 a vyjadřujícího vývoj účinnosti lipázy v průběhu sladování bez použití a při použití Geotrichum candidum. Na ose úseček jsou znázorněny etapy postupu při výrobě sladu, na ose pořadnic je uvedena účinnost lipázy, jde o celkovou lipázu v zrnu, vyjádřenou v nanomolech za sekundu na gram sušiny. Je možno pozorovat velký rozdíl v hodnotách pro zelený slad mezi křivkou T, která odpovídá kontrolnímu, ničím nenaočkovanému sladu a křivkami AI, A2, A3, které odpovídají naočkování různými kmeny Geotrichum candidum, označenými AI, A2 a A3.

Je tedy zřejmé, že naočkováním kmeny Geotrichum candidum je možno potlačit vývoj mikroflóry a dosáhnout zlepšení, které spočívá především v následujících vlastnostech:

- inhibice nežádoucí flóry, zejména Fusarium, Penicillium a Aspergillus, inhibice tvorby sekundárních metabolitů nežádoucí flóry, mykotoxinů a prekurzorů pěnivosti piva,

- vývoj bakterií mléčného kvašení, které mohou zesílit inhibiční účinek na nežádoucí flóru a zlepšit kvalitu sladu přirozeným snížením pH.

Výsledky způsobu podle vynálezu jsou o to cennější, že jsou doprovázeny dalším zlepšením kvality produktu, jde zejména o následující parametry:

- snížení množství mastných kyselin, které mohou způsobit změnu chuti piva, například chuti po oxidech nebo po plísních,

- zlepšení filtrace v důsledku inhibice flóry, která produkuje polysacharidy.

Příklad 5

Účinek použití Geotrichum candidum na filtraci zápary

Zlepšení, jehož je možno dosáhnout při filtraci, je znázorněno na obr. 3, kde je graficky uvedena kinetika filtrace postupem, označovaným „Brassin Tepral“. Na ose úseček je uveden čas v minutách, na ose pořadnic množství zfiltrované zápary v gramech. Křivka T odpovídá kontrolnímu sladu, který nebyl nijak zpracován, je zřejmý podstatný rozdíl ve srovnání s křivkami Gl, G2 a G3, které odpovídají sladu, naočkovanému různými kmeny Geotrichum candidum, a to GC1, GC2aGC3.

-9CZ 296414 B6

Příklad 6

Vliv naočkování Geotrichum candidum na kvalitu máčecí vody

Bylo pozorováno, že naočkování materiálu Geotrichum candidum v průběhu máčení má příznivý vliv na máčecí vodu. Analýza prokázala, že naočkování uvedeným kmenem snižuje nároky na zásobení kyslíkem, DCO.

V následující tabulce VII jsou uvedeny výsledky, které byly dosaženy při použití Geotrichum candidum, kmene 1-1475 v množství 10⁷ CFU/kg ječmene typu „deux rangs de printemps“.

Při sladování bylo použito standardního postupu, to znamená, že máčení probíhalo takto:

- 1. stupeň: 5 hodin ve vodě, 7 hodin na vzduchu,

- 2. stupeň: 5 hodin ve vodě, 7 hodin na vzduchu,

3. stupeň: 5 hodin ve vodě, 7 hodin na vzduchu.

Je zřejmé, že získané výsledky jsou velmi významné ve srovnání s kontrolními výsledky, které odpovídají sladování ječmene bez naočkování Geotrichum candidum.

Je zřejmé, že použití Geotrichum candidum podle vynálezu znamená zřejmý pokrok při celém postupu sladování.

Tabulka VH

Analýza máčecí vody DCO (mg O₂/l) kontroly kmen 1-1475

1. máčecí voda	969	633
2. máčecí voda	691	614
3. máčecí voda	883	336

Vynález byl popsán v souvislosti s některými výhodnými provedeními, je však zřejmé, že by bylo možno uskutečnit ještě řadu modifikací, spadajících do rozsahu vynálezu, takže vynález nemůže být na uvedená provedení omezen.

Příklad 7

Toxicita Geotrichum candidum při Amesově testu a na kuřecím embryu

Byly zkoumány dva izoláty, GC3 a GC4.

Provedení pokusu

Extrakty kultur byly připraveny tak, že oba izoláty GC93133 a GC93201 byly pěstovány na polosyntetickém živném prostředí s glukózou (Czapek), šlo o kapalné prostředí, v němž byla použita technika pěstování podle publikace P. Lafont a J. Lafont, Ann. Inst. Pasteur, 1970, 118, 340 až 348, současně byl mikroorganizmus pěstován v tomtéž kapalném prostředí s obsahem želatiny. Po inkubaci 6 dnů při teplotě 25 °C, byly kultury i s živným prostředím extrahovány chloroformem při teplotě varu pod zpětným chladičem, byl postupně použit 3x1 objem chloroformu. Po oddělení byly chloroformové fáze spojeny, zfiltrovány přes filtrační papír Whatman, zbaveny vody a odpařeny do sucha pod dusíkem. Odparek byl zbaven tuků promytím petroletherem (extrakt A). Vodná fáze byla po filtraci odpařena do sucha při teplotě nižší než 45 °C (extrakt B).

-10CZ 296414 B6

Mycelium, které se vyvinulo na kapalném živném prostředí, zpevněném želatinou, bylo rozrušeno ve vodném roztoku chloridu draselného s koncentrací 5 % po okyselení 20 ml kyseliny sírové/1, jeden objem tohoto materiálu byl pak smísen se 7 objemi acetonitrilu a po 18 hodinách stání při teplotě 4 °C byla suspenze zfíltrována, zbavena tuků promytím petroletherem a postupně dvakrát extrahována chloroformem při teplotě místnosti. Chloroformová fáze byla pod dusíkem odpařena do sucha (extrakt C).

Zkoušky na toxicitu na kuřecím embryu

K pokusům byla použita homogenní skupina vajec, snesená téhož dne v téže umělé líhni. Zkoumané produkty byly naočkovány podle publikace P. Lafont a J. Lafont, Bull. Acad. Vet. Fr., 1979, 52, 119 až 124. Pak byla vejce inkubována až do vylíhnutí a vývoj embrya byl sledován prosvícením vajec jednou za týden.

V případě extraktů A a C byl očkovací materiál připraven asepticky ve směsi ethylalkoholu a vody v objemovém poměru 50:50. V případě extraktu B byl koncentrát ve vodě sterilizován filtrací přes membránu Millipore G.

Test na genotoxicitu u bakterií (Amesův test)

Heterotrofní kmeny Salmonella typhimuriumTA155, TA1538, TA98 a TA10, byly použity podle metody, popsané v publikaci B. N. Ames, J. McCann a E. Yamasaki, Mut. Res., 1975, 31, 347 až 364 v materiálu pro bakteriologické manipulace.

Extrakty A a C byly včleněny do povrchové vrstvy pevného živného prostředí s želatinou ve formě asepticky připravených roztoků v dimethylsulfoxidu. Extrakty B byly před použitím sterilizovány filtrací.

„Pozitivní kontroly“ byly připraveny použitím aflatoxinu Bi a 3,4-benzpyrenu jako genotoxických látek.

Výsledky

Toxicita pro kuřecí embrya

Pro každé vajíčko odpovídal naočkovaný materiál 15 mg sušiny mycelia vpřípadě extraktu A a C a 1 ml kultury v případě extraktu B.

Pro různé skupiny vajec je podíl vylíhlých kuřat uveden v následující tabulce VIH. Nebylo možno pozorovat žádný významný rozdíl mezi kontrolami a vejci, do nichž byly naočkovány extrakty kultur obou izolátů.

Ani u žádného z kuřat nebylo možno pozorovat výskyt žádné malformace.

Tabulka Vm

Podíl vylíhlých kuřat v %
extrakt A	extrakt B	extrakt C
GC93133X 95	100	90
GC 93201 90	90	95
nenaočkované kontroly		92,5
naočkované kontroly: rozpouštědlo pro extrakty A aCJ	95
destilovaná vodax		90

^x skupina 20 vajec skupina 40 vajec.

-11 CZ 296414 B6

Amesův test

Byly provedeny dvě postupné zkoušky při použití následujícího množství extraktů, vztaženo na sušinu mycelia nebo objem kultury na ml živného prostředí se želatinou, na němž byly pěstovány bakteriální kmeny:

- extrakty A a C: 20 a 200 mg extrakt B: 1 a 10 ml.

Za svrchu uvedených pokusných podmínek neměly extrakty dvou izolátů Geotrichum candidum žádný účinek na výskyt mutací u kmene Salmonella typhimurium. Na rozdíl od tohoto pozorování bylo možno pozorovat v Petriho miskách v případě aflatoxinu B_t, použitého v koncentraci 1 μΐ/ml počet mutací v rozmezí 49 (± 12) a 195 (± 24) a v případě použití 3,4-benzpyranu v koncentraci 0,2 pg/ml počet mutací v rozmezí 28 (± 10) a 218 (± 41) na jednu misku.

Mimoto bylo prokázáno, že extrakty kultur obou izolátů Geotrichum candidum neměly žádný antibiotický účinek na kmeny Salmonella.

Je tedy možno uzavřít, že in vitro nevytváří ani jeden z izolátů GC3 a GC4 žádné toxické nebo teratogenní látky pro obratlovce ani žádné látky s genotoxickým účinkem.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (14)

1. Je tedy možno uzavřít, že in vitro nevytváří ani jeden z izolátů GC3 a GC4 žádné toxické nebo teratogenní látky pro obratlovce ani žádné látky s genotoxickým účinkem.

   PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kmeny mikroorganizmů z čeledi Geotrichum candidum, získatelné selekcí a klonováním přírodních kmenů mikroorganizmu snásledujícími vlastnostmi:

   - účinnost lipázy nižší než 2,5 . 1CT⁷ nKat/buňka,

   - v podstatě úplná inhibice nežádoucí flóry, vyvíjející se v průběhu sladování, nepřítomnost mutagenní aktivity podle Amesova testu.
2. 2. Kmeny podle nároku 1, které mimoto mají jednu, dvě nebo tři z následujících vlastností:

   - stálost j ej ich spor v roztoku je delší než 6 měsíců,

   - produkce spor je vyšší než 10⁷/ml, kmeny mohou zlepšit rychlost filtrace zápary.
3. 3. Kmeny podle nároku 2, uložené v CNCM pod čísly 1-1474 a 1-1475.
4. 4. Způsob sladování obilovin, například žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo pohanky podle schématu, uvedeného na obr. 1, vyznačující se tím, že se materiál naočkuje kmenem Geotrichum candidum podle některého z nároků 1 až 3 v množství 10⁵ až 10⁹ jednotek pro tvorbu kolonií, CFU/kg obilovin.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se knaočkování užije 10⁷ až 10⁸ CFU na kg obilovin.
6. 6. Způsob podle některého z nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že se mikroorganizmus naočkuje jednou nebo vícekrát v průběhu jedné nebo většího počtu následujících etap: příprava obilovin nebo jejich rostlinných materiálů, první máčení, poslední máčení, střední máčení, přenos zmáčení do etapy klíčení, v průběhu klíčení, při přenosu z etapy klíčení na hvozdy nebo v průběhu sušení na hvozdech.

   -12CZ 296414 B6
7. 7. Způsob podle některého z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že se k jeho provádění užijí kmeny uložené v CNCM pod čísly 1-1474 nebo 1-1475.
8. 8. Použití mikroorganizmu z čeledi Geotrichum candidum při sladování obilovin a jiných rostlinných materiálů, jako žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo pohankyk potlačení vývoje flóry, kontaminující a kolonizující obiloviny nebo jiné rostlinné materiály.
9. 9. Použití podle nároku 8, při němž se užije jeden nebo větší počet vybraných kmenů Geotrichum candidum.
10. 10. Použití podle nároku 8 nebo 9, při němž se užije Geotrichum candidum podle některého z nároků 1 až 3.
11. 11. Použití podle některého z nároků 8 až 10, při němž se mikroorganizmus naočkuje v průběhu sladování ve formě čisté kultury nebo ve formě směsné kultury ve spojení s jedním nebo větším počtem jiných mikroorganizmů.
12. 12. Použití podle nároku 11, při němž se mikroorganizmus naočkuje střídavě s bakteriemi mléčného kvašení nebo ve formě směsné kultury s těmito bakteriemi.
13. 13. Použití podle některého z nároků 8 až 12, při němž se uvedený mikroorganizmus užije k naočkování v množství 10⁵ až 10⁹, s výhodou 10⁷ až 10⁸ jednotek pro tvorbu kolonií CFU/kg obilovin nebo jiného rostlinného materiálu.
14. 14. Použití některého z kmenů podle některého z nároků 1 až 3 v průběhu sladování obilovin nebo jiných rostlinných materiálů, například žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo pohanky k potlačení fenoménu pěnění nebo vystřikování nápoje, připraveného ze sladu.