CZ338097A3

CZ338097A3 - Kmeny mikroorganismů z čeledi Geotrichum candidum, jejich použití a způsob sladování obilovin

Info

Publication number: CZ338097A3
Application number: CZ973380A
Authority: CZ
Inventors: Patrick Boivin; M´Baka Malanda
Original assignee: Institut Francais Des Boissons De La Brasserie Malterie
Priority date: 1995-04-24
Filing date: 1996-04-23
Publication date: 1998-03-18
Also published as: AU5697296A; CZ296414B6; FR2733121A1; US5955070A; CA2218413A1; CA2218413C; EP0826029B1; WO1996034085A1; DE69616542D1; DE69616542T2; ATE207951T1; EP0826029A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká využití mikroorganismů při obilovin a jiných materiálů, například žita, ječmene, rýže, kukuřice, čiroku nebo sarrasinu pro potlačení vzniku jiné mikroflory a tím kontaminace uvedených obilovin nebo jiných materiálů. Vynález nalezne své použití ve sladovnictví a v důsledku toho i při výrobě piva, ale také při výrobě destilátů a v dalších oborech, při nichž se využívá obilovin a dalších rostlinných materiálů.

Dosavadní stav techniky

Obiloviny a další rostlinné materiály, například ječmen, mohou před sladováním již být různým způsobem zpracovávány a současně může dojít k jejich kontaminaci nejrůznějšími mikroorganismy. Například v případě ječmene jde zásadně o možnost přítomnosti bakterií, kvasinek a také vláknitých hub. Tato flora kontaminuje a kolonizuje zrna ječmene již před sklizní a pak dále v průběhu sladování. Povaha a množství těchto mikroorganismů závisí na podmínkách pěstování a na podnebí a také na délce a podmínkách při skladování’.

Různé analýzy, provedené za polních podmínek určily přibližně 100 různých typů kontaminace. Nejčastěji šlo o Alternaria, Cladosporium a Fusarium.

Mimo jiné bylo pozorováno, že při pozdní sklizni nebo při sklizni, prováděné za vlhkého počasí obsahují zrna velké množství Fusarium. Pokud jde o floru, která kontaminuje f * r · · · · · * » f- ♦ · · · · · ·' *> · · · · · * « · · · ·· » · ·

(·*

a kolonizuje zrna v průběhu skladování před sladováním, jde zejména o xerofilní vláknité houby. Převažujícími houbami jsou zejména Aspergillus a Penicillium. Problém tedy spočívá v tom, že různé postupy, při nichž se mění obiloviny zejména na slad, se provádění za podmínek, příznivých pro vývoj mikroflory, předem přítomné v zrnech. Jde zejména o vlhkost, teplotu, přítomnost živných látek a dobu pobytu v různých reaktorech, což všechno umož- 2 4 ňuje množení bakterií a kvasinek až do množství 10 až 10 a mimoto ještě dochází k podstatnému vývoji plísní. Pokud jde o různé stupně způsobu sledování, postupuje se tak, že po přípravě zrna se zrno máčí po dobu 40 hodin, čímž dojde k příjmu 35 až 45 % vody. Pak se nechá zrní klíčit přibližně 6 dnů při teplotě přibližně 16 °C. Pak se zrní hvozdí, což spočívá v sušení při různých úrovních teploty přibližně v rozmezí 50 až 80 °C. Pak se zrní zbaví klíčků a získaný slad se dále skladuje. Toto zpracování, při němž se nekontroluje mikroflora, představuje určité nebezpečí, pokud jde o kvalitu sladu a tím i o kvalitu dalších produktů, například piva. Může například dojít k tomu, že důsledkem kontaminace je vznik inhibitorů klíčení. Dále mohou vznikat nežádoucí enzymy, jako lipásy, oxidázy, proteázy a podobně. Některé z těchto mikro-

organismů ve větším množství mohou být příčinou nežádoucích

pachů nebo příchutí. Pivo, získané z tohoto materiálu může mít příchut po plísni nebo zemitou příchut a podobně. Obecně je možno uvést, že v pivovarnictví se může vyskytovat jev, který spočívá v tom, že lahvové pivo v okamžiku otevření lahve z lahve vystříkne nebo vypění v důsledku nestability oxidu uhličitého. Příčinou tohoto jevu jsou spe-

cifické mikroorganismy. Bylo by proto žádoucí udržet množství těchto mikroorganismů alespoň na určité malé úrovni, aby jejich množství nepřesáhlo určitou mez. Zvláště by bylo zapotřebí snížit množství mikroorganismů, které způsobují nestabilitu oxidu uhličitého, zvláště Fusarium.

Mimoto přítomnost některých dalších mikroorganismů, například bakterií typu Pediococcus může mít za následek rychlé zanášení filtrů.

Základní nevýhodou vývoje plísní je zvýšené riziko tvorby mykotoxinů, a to zejména z plísní, které vytvářejí toxiny a přirozeně se vyskytují v obilovinách i v dalších rostlinných materiálech.

Přes svrchu uvedené nevýhody nedochází prozatím k podstatnému potlačování uvedené mikroflory ve sladovnictví. K tomuto účelu také prozatím nejsou k dispozici přípustné a současně účinné prostředky.

Pouze v průběhu máčení je možno provádět desinfekci například chlornanem sodným nebo vápenným mlékem. Tyto desinfekční prostředky mají jen malou účinnost na mikrofloru, mohou však představovat riziko pro některé stupně sladování. Zvláště v případě překročení určitých dávek může být potlačeno klíčení zrn a tím vznikají další problémy, zvláště pokud jde o chut výsledného piva.

Vynález si klade zá úkol odstranit svrchu uvedené nevýhody, zejména si klade za úkol potlačit nežádoucí mikrofloru použitím specifického mikroorganismu, zvoleného-na základě řady předběžných pokusů.

♦ » r · * · 9 9 r _{r r} • · «· ·· » » r r - 4 Bylo již navrhováno použití bakterií mléčného kvašení pro přípravu kyselého sladu a pro potlačení vývoje hub, zvláště Fusarium (WO 94/16053). Použití těchto bakterií v průběhu sladování dovoluje pouze částečnou inhibici růstu hub, avšak neumožní potlačit vznik mykotoxinů v průběhu poíj stupu sladování.

Podstata vynálezu

Podle vynálezu se navrhuje použít v průběhu sladování pro potlačení vzniku nežádoucí mikroflory mikroorganismus Geotrichum candidum.

Geotrichum candidum se přirozeně vyskytuje v zrnech ječmene v průběhu jejich klíčení i ve výsledném sladu. Tento mikroorganismus je na jedné straně schopen potlačit vznik flory, vytvářející toxiny v průběhu sladování a na druhé straně potlačit syntézu mykotoxinů a tak zlepšit biochemickou i fyzikálnechemickou kvalitu sladu.

Geotrichum candidum je mikroorganismus, který se vyskytuje v mlékárenství. Většina kmenů byla izolována z mléka a ze sýra. Jde o mikroorganismus, přírodně se vyskytující při zpracování mléka na sýry v mlékárenství byly dlouho vyvíjeny snahy potlačit vznik tohoto kvasinkového mikroorganismu, který může vyvolat vzhledové změny sýra. Na uvedený

- mikroorganismus byly „proto vyvíjeny různé zkoušky, tak,, aby bylo možno stanovit jeho úlohu při zlepšení organoleptických vlastností sýrů a současně zjistit jeho účinek na inhibici vývoje pathogenních bakterií a nežádoucích plísní.

Účinnost lipázy tohoto mikroorganismu, zjištěná při výrobě sýra, byla považována za nevýhodnou vlastnost vzhledem k možnosti vzniku organoleptických změn podle publikací • ·

* ·

- 5 Drost a další, ASBC Journal, 1990, 124 - 131, Kobayashi a další, Journal of fermentatíon and bioengineering, 1993, 371 - 375.

Vynález se tedy týká využití mikroorganismu Geotrichum candidum při sladování obilovin a dalších materiálů, u jako jsou žito, ječmen, rýže, čirok, kukuřice, sarrasin pro potlačení vývoje nežádoucí flory a tím i kontaminace a kolonizace uvedených materiálů.

Postupuje sé tak, že se v průběhu sladování materiál naočkuje vybranými kmeny Geotrichum candidum, a to ve formě čisté kultury nebo ve formě směsné kultury spolu s jedním nebo větším počtem dalších mikroorganismů, zejména bakterií mléčného kvašení.

Podle vynálezu se Geotrichum candidum užije v množství

9 7 8 až 10 , s výhodou 10 až 10 jednotek pro tvorbu kolonií, UFC, na kf obilovin nebo jiného materiálu za účelem potlačení vývoje nežádoucí mikroflory.

Výhoda tohoto postupu spočívá v podstatě v tom, že

Geotrichum candidum způsobí inhibici nežádoucí flory, například Fusarium,Penicillium, Aspergillus a mimoto současně potlačí i produkci sekundárních metabolitů této nežádoucí flory, jako tvorbu mykotoxinů a látek, které způsobují nestabilitu oxidu uhličitého a tím pěnění piva v lahvích. *

Uvedený mikroorganismus je fedý možno využít při ““ sladování obilovin a dalších materiálů, jako jsou žito, ječmen, rýže, čirok, kukuřice nebo sarrasin k zábraně pěnění nápojů, vyrobených z tohoto sladu.

Bylo pozorováno, že kromě potlačení mikroorganismů ve sladu způsobuje Geotrichum candidum také snížení množství mastných kyselin, které mohou způsobit zhoršení chuti výsledného piva, včetně příchuti po plísni. Mimoto potlačuje uvedený mikroorganismus i floru, produkující polysacharidy, což usnadní filtraci.

Mimoto konečně dochází při použití některých kmenů Geotrichum candidum ke zlepšení vývoje bakterií mléčného kvašení, které opět potlačují vývoj nežádoucí flory a zlepšují kvalitu sladu snížením jeho pH.

Je při tom možno pozorovat určité rozdíly v účinku různých kmenů Geotrichum candidum na inhibici mikroflory, inhibici produkce sekundárních metabolitů touto nežádoucí mikroflorou, jakož i na inhibici tvorby mykotoxinů, látek, způsobujících pěnění nápojů a také na organoleptické a fyzikáně-chemické vlastnosti nápojů, zvláště piva.

Fyzikálně-chemickými vlastnostmi se rozumí zvláště:

- snížení obsahu mastných kyselin, které jsou často příčinou porušené chuti piva, například chuti po oxidech nebo chuti po plísni, snadnost filtrace v důsledku inhibice vývoje určité mikroflory, produkující polysacharidy,

- přítomnost pěnění.

Podle vynálezu je možno podrobit selekci kmeny Geotrichum candidum na základě jejich účinnosti a současně nepřítomnosti nevhodných vlastností, zejména slabé účinnosti lipázy.

Selekce žádoucích kmenů se týká selekce přírodně se vyskytujících kmenů ve sladu na základě kombinace kriterií, »

týkajících se kvality a účinnosti, některé z těchto požadavků jsou podstatné a další pouze zvyšují výhodnost kmene v souvislosti se splněním základních kriterií.

Mezi nezbytné vlastnosti patří:

a) slabá účinnost lipázy,

b) inhibice vývoje nežádoucí flory ve sladu,

c) nepřítomnost mutagenity nebo produkce toxinů kmenem.

Jako výhodné vlastnosti kmenů je možno uvést:

d) stálost roztoku spor déle než 6 měsíců,

8

e) vysoká produkce spor 10 až 10 /ml,

f) zvýšená rychlost filtrace, výhodná je zejména kombinace svrchu uvedených vlastností.

Syntéza lipázy v průběhu výroby sladu má být co nejmenší vzhledem k tomu, že tento enzym může vyvolat příchut piva po oxidech. Účinnost lipázy u kmenů Geotrichum candidum, vybraných pro použití při sladování má být velmi malá, aby nedocházelo k syntéze exogenní lipázy při sladování..

Vybrané kmeny byly tedy podrobeny selekci podle svrchu uvedených základních požadavků a), b) a c) v kombinaci s výhodnými vlastnostmi d), e) nebo f) nebo s větším počtem těchto výhodných vlastností současně.

Zvolené kmeny měly s výhodou účinnost lipázy nižší než 2,5.10” nKat/buňka při úplném potlačení nežádoucí flory, kmeny se nevyznačovaly vznikem mutací.

Mimoto by měla produkce spor dosahovat s výhodou

7 8 spor/ml, výhodné rozmezí je 10 až 10 spor/ml.

F F

Způsob selekce dovoluje vybrat kmeny Geotrichum candídum, při jejich použití bude možno dosáhnout dobrých . výsledků,. pokud .jde,o inhibici nežádoucí flory nebo zvýšení kvality sladu včetně možnosti snadné filtrace. Kmeny, získané touto selekcí byly uloženy 6. září 1994 do veřejné sbírky kultur, Collection Nationale de Culture de Micro-organismes, Institut Pasteur pod čísly 1-1475 a 1-1474. V průběhu zkoušek byly kmeny Geotrichum candidum v množství 10 ař 10 UFC/kg ječmene užity v máčecí vodě, použit byl ječmen střední kvality, six rangs ďhiver, při tomto zpracování bylo dosaženo sladu s velmi dobrou kvalitou.

V průběhu přihlášky a zvláště v příkladové části bude kmen 1-1474 označován GC3 a kmen 1-1475 bude označován jako kmen GC4.

Zpracování kmenem podle vynálezu nemá žádné nepříznivé důsledky na způsob výroby piva ani na vlastnosti vyrobeného piva. Mimoto je pivo, získané při použití Geotrichum candidum organolepticky zcela totožné s pivem, vyrobeným z nezpracovaného sladu. Také vznik aromatických látek není nijak nepříznivě ovlivněn.

Další výhody zpracování sladu podle vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny jednotlivé stupně sladování. Současně jsou vyznačeny stupně, v nichž je možno materiál naočkovat zvolenými mikroorganismy.

.. ._F * .t

Na obr. 2 je znázorněn vývoj účinnosti lipásy v průběhu sladování při použití nebo bez použití kmene Geotrichum candidum.

Na obr. 3 je znázorněn diagram, znázorňující kinematiku filtrace při použití a bez použití vybraných kmenů Geotrichum candidum.

Podle vynálezu je možno zlepšit kvalitu sladu a jeho mikrofloru, přičemž může jít o slad z obilovin nebo jiných rostlinných materiálů, jako jsou žito, ječmen, rýže, čirok, kukuřice nebo sarrasin.

Vynález se však zejména týká zpracování ječmene na slad, i když je zřejmé, že vynález nemůže být omezen na toto použití a je možno jej využít v případě všech obilovin nebo rostlinných materiálů, které je možno podrobit sladování.

Na obr. 1 je schematicky znázorněno šest stupňů výroby sladu, I, II, III, IV, V a VI. Postupuje se tak, že po úpravě zrna v první etapě I se ječmen máčí ve vodě až do zvýšení obsahu vody až na 35 až 45 %. Bylo již uvedeno, že v průběhu máčení se voda jednou nebo opakovaně mění, tak, aby bylo zrno zásobeno kyslíkem.

Po druhé etapě II přechází zvlhčený ječmen do etapy III, kde dochází k jeho klíčení. Pak se ječmen ukládá na hvozdech v etapě IV, kde dochází k sušení zrna při teplotě v 'rozmezí 5Ó áž '80 °C, přičemž v každém patře se dodržuje ' “ stanovená doba sušení.

V etapě V se ječmen zbavuje klíčků. Výsledný slad se pak skladuje, což tvoří poslední etapu VI postupu.

Je zcela zřejmé, že přidávání vody, uchovávání při uvedených teplotách v průběhu sladování a další uvedené podmínky podporují vznik jakékoliv mikroflory, která byla přítomna již před začátkem postupu.

Podle vynálezu je možno dosáhnout inhibice vývoje této mikroflory přidáním vhodného mikroorganismu z čeledi Geotrichum candidum.

Na obr. 1 je toto přidávání možno uskutečnit v průběhu sladování v místech, která jsou označena šipkami, očíslovanými 7 až 12.

Mikroorganismus Geotrichum candidum je tedy možno naočkovat za současného provzdušnění spolu s první máčecí vodou. Dále je možno mikroorganismus přímo přidat k zrnům ječmene před máčením. Mimoto je možno mikroorganismus přidat v průběhu máčení, a to dvakrát nebo třikrát do opakovaně měněné máčecí vody v případě, že ječmen je silně kontaminován.

Očkování je možno uskutečnit také v průběhu přepravy ječmene z jednotky pro máčení do stupně, v němž dochází ke klíčení, například spolu s aktivátorem klíčení. Toto přidávání nevyvolává žádné problémy Vzhledem k tomu, že se v průběhu sladování aktivátory klíčení k zrnům ječmene zcela běžně přidávají.

Konečně, jak je na obr. 1 znázorněno, je možno mikroorganismus přidávat v průběhu klíčení, při přepravě na hvozdy nebo při sušení zrna.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

* » ·

- 11 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsob selekce kmenů Geotrichum candidum

V následující tabulce I je znázorněna aktivita lipázy v nanomolech za sekundu na buňku v případě různých kmenů Geotrichum candidum po inkubaci po dobu jednoho týdne při teplotě 20 °C v živném prostředí se sladovým extraktem. Kmeny L⁺ a L^- jsou kmeny Geotrichum candidum, izolované z mlékáren a sýráren s velkou účinností lipázy. Ostatní kmeny byly izolovány ve sladovnách. Je zřejmé, že kmeny ze sladoven mají podstatně nižší aktivitu lipázy než kmeny z mlékáren. Zkouška, prováděná v kapalném prostředí dovoluje podrobit selekci různé kmeny Geotrichum candidum na základě nízké účinnosti lipázy.

Tabulka I kmeny L⁺ L GC1 GC2 GC3 účinnost lipázy

10^-7 nKat/buňka 6,4 2,5 0,3 1,7 1,5

_. Při .druhém testu se .prokazuje..vliv různých vybraných kmenů na celkovou účinnost lipázy v zrnu, vyjádřeno v nanomolech za sekundu na gram sušiny v průběhu sladování v přítomnosti nebo v nepřítomnosti Geotrichum candidum. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce II.

Tabulka II kmeny kontrola GC1 GC2 GC3 GC4 GC5 účinnost lipázy v zeleném sladu nKat/g 19,9 15,1 16,9 14,8 11,0 11,0

Touto zkouškou se stanoví celková účinnost lipázy v zeleném sladu, která je výsledkem účinnosti z ječmene a z vývoje mikroflory. Zkouška byla provedena bez naočkování a po naočkování různými kmeny Geotrichum candidum, u nichž se předpokládá inhibice mikroflory, produkující lipázu. Z výsledků je zřejmé, že skutečně došlo ke snížení účinnosti lipázy v zeleném sladu ve srovnání s kontrolami. Tato zkouška dovoluje selekci kmenů Geotrichum candidum podle nízké účinnosti lipázy v zeleném sladu.

Vývoj určitých typů mikroflory v průběhu výroby sladu může způsobit změny chování materiálu při filtraci, a tím potíže při výrobě piva. Snížení možnosti filtrace může být způsobeno tvorbou polysacharidu, odstranit tyto potíže je možno syntézou enzymů, které štěpí tyto materiály, jako jsou beta-glukanázy a pentosanázy nebo inhibici mikroflory, která produkuje polysacharidy. Vzhledem k tomu, že různé kmeny Geotrichum candidum mohou působit různým způsobem, byly prováděný zkoušky na filtrovatelnóst sladu, Filtration TEPRAL. ^?V následující tabulce III jsou uvedeny hodnoty pro kinetiku filtrace a promývání materiálu po naočkování nebo bez naočkování kmeny Geotrichum candidum v průběhu výroby sladu. GC1, GC2, GC3 a GC5 jsou různé kmeny Geotrichum candidum, použité k těmto zkouškám.

Tabulka III

kmen	kontrola*	GC1	GC2	GC3	GC5
kinetika	filtrace
g/min		23,2	27,6	28,8	40	8,8
kinetika g/min	promývání	42	42,8	40	56,4	10,4

bez naočkování.

Jak je zřejmé z tabulky III, záleží kinetika filtrace na použitém kmenu Geotrichum' candidum. Kmeny, zpomalující filtraci není možno použít.

Produktivita Geotrichum candidum a stabilita tohoto organismu v průběhu času je při výběru kmenů důležitým ekonomickým parametrem. Zkoušky na produktivitu a na stálost při teplotě 4 °C prokázaly velké rozdíly v případě jednotlivých kmenů. V následující tabulce IV jsou uvedeny příslušné hodnoty pro různé kmeny Geotrichum candidum.

Tabulka IV

kmen	GC1	GC2	GC3	GC4	GC5
produktivita-počet	··-	- -	. . . .	·· —	— -
spor/ml (χΙΟθ)	20	100	50	90	22
% životaschopných spor
po 8 týdnech při 4 °C	80 %	8 %	50 %	90 %	100 %

r e

Je zřejmé, že kmeny Geotrichum candidum mají různou produktivitu i stabilitu.

Inhibici nežádoucí flory, vyvíjející se při .sladování je rovněž možno u různých kmenů ověřit.

Uvedené zkoušky byly doplněny toxikologickými zkouškami a zkouškami na mutagenitu kmenů.

Různé uvedené zkoušky dovolily vybrat ty kmeny Geotrichum candidum, při jejichž použití je možno dosáhnout velmi dobrých výsledků, pokud jde o inhibici nežádoucí flory a o zlepšení kvality sladu, zvláště účinnosti lipázy a snadnosti filtrace.

Příklad-2

Účinek Geotrichum canaidum na vývoj mikroflory

Výhoda použití kmenů na začátku postupu spočívá v potlačení vývoje nežádoucí mikroflory.

POkusy prokázaly, že dobrých výsledků je možno dosáhnout při naočkování 10 až 10 , s výhodou 10 až 10 jednotek pro tvorbu kolonií, UFC/kg obilovin nebo jiného rostlinného materiálu. Mikroorganismus je možno naočkovat jednou nebo vícekrát v průběhu postupu. Mimoto je možno jej použít ve formě čisté kultury nebo ve formě směsi' s dalšími mikroorganismy, například bakteriemi mléčného kvašení. Konečně je možno střídat použití čisté kultury Geotrichum candidum a směsné kultury.

Bylo zjištěno, že uvedeným způsobem je možno zajistit potlačení nežádoucích mikroorganismů a zlepšení ostatních vlastností výsledného sladu. Jde zejména o potlačení tvorby nežádoucích enzymů, například oxidáz nebo naopak o produkci žádoucích enzymů, jako celluláz. Je také možno modifikovat vůni sladu pouze použitím Geotrichum candidum nebo střídavým naočkováním tímto mikroorganismem a specifickým mikroorganismem pro zajištění žádoucího výsledku.

Výsledky uvedených zkoušek jsou shrnuty v následující tabulce V.

Tabulka V

plíseň	ječmen	kontr-olní	slad s
	s Fusarium	slad	Geotrichum
% kontaminovaných zrn
Alternaria	20	5	0
Aspergillus	20	15	0
Fusarium	100	40	5
Penicillium	30	10	5
Geotrichum	0	0	100
V tabulce V	jsou uvedena v	procentech	množství zrn,

kontaminovaných nejběžnějšími plísněmi, zvláště Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium a Geotrichum v ječmenu, obsahujícím Fusarium, v kontrolním sladu, který nebyl ničím naočkován a ve sladu, naočkovaném Geotrichum candidum. Výsledky jsou velmi průkazné. Ve sladu, připraveném po naočkování Geotrichum candidum je pouze 5 % zrn kontaminováno plísněmi

Fusarium a Penicillium, v kontrolním sladu je 40 % zrn napadeno Fusarium a přibližně 10 % Penicillium.

Příklad 3

Vliv Geotrichum candidum na produkci mykotoxinů při sladování

V následující tabulce VI je znázorněn inhibiční účinek Geotrichum candidum na produkci mykotoxinů při sladování. Zkoušky byly provedeny stanovením Zeralenone v případě ječmene, napadeného fusariemi, kontrolního ječmene bez jakéhokoliv naočkování a ječmene, naočkovaného geotrichum.

Tabulka VI ječmen kontrolní s Fusarium slad slad s Geotrichum

Zeralenone ^ug/kg

100

Příklad 4

Vliv naočkování Geotrichum na účinnost lipázy

Výhody použití mikroorganismu podle vynálezu jsou také zřejmé z diagramu, znázorněného na obr. 2 a vyjadřujícího vývoj účinnosti lipázy v průběhu sladování bez použití a při použití Geotrichum candidum. Na ose úseček jsou znázorněny etapy postupu při výrobě sladu, na ose pořadnic je uvedena účinnost lipázy, jde o celkovou lipázu v zrnu, vyjádřenou v nanomolech za sekundu na gram sušiny. Je možno pozorovat velký rozdíl v hodnotách pro zelený slad mezi křivkou T, která odpovídá kontrolnímu, ničím nenaočkovanému sladu a křivkami Al, A2, A3, které odpovídají naočkování různými kmeny Geotrichum candidum, označenými Al, A2 a A3.

Je tedy zřejmé, že naočkováním kmeny Geotrichum candidum je možno potlačit vývoj mikroflory a dosáhnout zlepšení, které spočívá především v následujících vlastnostech:

- inhibice nežádoucí flory, zejména Fusarium, Penicil- lium a Aspergillus, inhibice tvorby sekundárních metabolitů nežádoucí flory, mykotoxinů a prekursorů penivosti piva, vývoj bakterií mléčného kvašení, které mohou zesílit inhibiční účinek na nežádoucí floru a zlepšit kvalitu sladu přirozeným snížením pH.

Výsledky způsobu podle vynálezu jsou o to cennější, že jsou doprovázeny dalším zlepšením kvality produktu, jde zejména o následující parametry:

- snížení množství mastných kyselin, které mohou způsobit změnu chuti piva, například chuti po oxidech nebo po plísních, zlepšení filtrace v důsledku inhibice flory, která produkuje polysacharidy.

Příklad 5

Účinék použití Geotrichum candidum na filtraci zápary Zlepšení, jehož je možno dosáhnout při filtraci, je znázorněno na obr. 3, kde je graficky uvedena kinetika filtrace postupem, označovaným Brassin Tepral. Na ose úseček je uveden čas v minutách, na ose pořadnic množství zfiltrované zápary v gramech. Křivka T odpovídá kontrolnímu sladu, který nebyl nijak zpracován, je zřejmý podstatný rozdíl ve srovnání s křivkami Gl, G2 a G3, které odpovídají sladu, naočkovanému různými kmeny Geotrichum candidum, a to GC1,

GC2 a GC3.

Příklad 6

Vliv naočkování Geotrichum candidum na kvalitu máčecí vody

Bylo pozorováno, že naočkování materiálu Geotrichum candidum v průběhu máčení má příznivý vliv na máč.eoí vodu. Analýza prokázala, že naočkování uvedeným kmenem snižuje nároky na zásobení kyslíkem, DCO.

V následující tabulce VII jsou uvedeny výsledky, které byly dosaženy při použití Geotrichum candidum, kmene

1-1475 v množství 10 UFC/kg ječmene typu deux rangs de printemps.

Při sladování bylo použito standardního postupu, to znamená, že máčení probíhalo takto:

1.	stupeň:	5	hodin	ve	vodě,	7	hodin	na	vzduchu,
2.	stupeň:	5	hodin	ve	vodě,	7	hodin	na	vzduchu,
3.	stupeň:	5	hodin	ve	vodě,	7	hodin	na	vzduchu.

Je zřejmé, že získané výsledky jsou velmi významné ve srovnání s kontrolními výsledky,' které odpovídají sladování ječmene bez naočkování Geotrichum candidum.

Je zřejmé, že použití Geotrichum candidum podle vynálezu znamená zřejmý pokrok při celém postupu sladování.

β ·

- 19 Tabulka VII

Analýza máčecí vody DCO (mg 0₂/l)

	kontroly	kmen 1-1475	•
1. máčecí voda	969	633	μ
2. máčecí voda	691	614
3. máčecí voda	883	336

Vynález byl popsán v souvislosti s některými výhodnými provedeními, je však zřejmé, že by bylo možno uskutečnit ještě řadu modifikací, spadajících do rozsahu vynálezu, takže vynález nemůže být na uvedená provedení omezen.

Příklad 7

Toxicita Geotrichum candidum při Amesově testu a na kuřecím embryu

Byly zkoumány dva izoláty, GC3 a GC4.

Provedení pokusu

Extrakty kultur byly připraveny tak, že oba- izoláty GC93133 a GC9320T' byly pěstoványna polosyntetickém.živném . prostředí s glukosou (Czapek), šlo o kapalné prostředí, v němž byla použita technika pěstování podle publikace P. Lafont a J. Lafont, Ann. Inst. Pasteur, 1970, 118, 340 - 348, současně byl mikroorganismus pěstován v tomtéž kapalném prostředí s obsahem želatiny. Po inkubaci 6 dnů při teplotě 25 °C, byly kultury i s živným prostředím extrahovány chloroformem r r e

e • · · r

• *

- 20 řr při teplotě varu pod zpětným chladičem, byl postupně použit 3x1 objem chloroformu. Po oddělení byly chloroformové fáze spojeny, zfiltrovány přes filtrační papír Whatman, zbaveny vody a odpařeny do sucha pod dusíkem. Odparekbyl zbaven tuků promytím petroletherem (extrakt A). Vodná fáze byla po filtraci odpařena do sucha při teplotě nižší než 45 °C (extrakt B).

Mycelium, které se vyvinulo na kapalném živném prostředí, zpevněném želatinou, bylo rozrušeno ve vodném roztoku chloridu draselného s koncentrací 5 % po okyselení 20 ml kyseliny sírové/1, jeden objem tohoto materiálu byl pak smísen se 7 objemi acetonitrilu a po 18 hodinách stání při teplotě 4 °C byla suspenze zfiltrována, zbavena tuků promytím petroletherem a postupně dvakrát extrahována chloroformem při teplotě místnosti. Chloroformová fáze byla pod dusíkem odpařena do sucha (extrakt C).

Zkoušky na toxicitu na kuřecím embryu

K pokusům byla použita homogenní skupina vajec, snesená téhož dne v téže umělé líhni. Zkoumané produkty byly naočkovány podle publikace P. Lafont a J. Lafont, Bull. Acad. Vét. Fr., 1979, 52, 119 - 124. Pak byla vejce inkubována až do vylíhnutí a vývoj embrya byl sledován prosvícením vajec jednou za týden.

V případě extraktů A a C byl očkovací materiál připraven asepticky ve směsi ethylalkoholu a vody v objemovém poměru 50 : 50. V případě extraktu B byl koncentrát ve vodě sterilizován filtrací přes membránu Millipore G.

r f v * · r r * 9 r· « r- r ·r · .- » • · · « - A

- 21 Test na genotoxicitu u bakterií (Amesův test)

Heterotrofní kmeny Salmonella typhimurium TA1535, TA1538, TA98 a TA10, byly použity podle metody, popsané v publikaci B, N. Ames, J. McCarin a E.' Yamasaki, Mut. Res., 1975, 31, 347 - 364 v materiálu pro bakteriologické manipulace .

Extrakty A a C byly včleněny do povrchové vrstvy pevného živného prostředí s želatinou ve formě asepticky připravených roztoků v dimethylsulfoxidu. Extrakty B byly před použitím sterilizovány filtrací.

Pozitivní kontroly byly připraveny použitím aflatoxinu B^ a 3,4-benzpyrenu jako genotoxických látek.

Výsledky

Toxicita pro kuřecí embrya

Pro každé vajíčko odpovídal naočkovaný materiál mg sušiny mycelia v případě extraktu A a C a 1 ml kultury v případě extraktu B.

Pro různé skupiny vajec je podíl vylíhlých kuřat uveden v následující tabulce VIII. Nebylo možno pozorovat žádný významný rozdíl mezi kontrolami a vejci, do nichž byly naočkovány extrakty kultur obou izolátů.

Ani u žádného z kuřat nebylo možno pozorovat výskyt žádné malformace.

- 22 - -9

Tabulka VIII

Podíl vylíhlých kuřat v % extrakt A extrakt B extrakt C

GC 93133 ^X	95	100 ‘ 90
GC 93201 ^XX	90	90 95
nenaočkované kontroly	xx		92,5
naočkované kontroly:	rozpouštědlo pro	extrakty A a C	95
	destilovaná voda	X	90

skupina 20 vajec xx skupina 40 vajec.

Amesův test

Byly provedeny dvě postupné zkoušky při použití následujícího množství extraktů, vztaženo na sušinu mycelia nebo objem kultury na ml živného prostředí se želatinou, na němž byly pěstovány bakteriální kmeny:

extrakty A a C: 20 a 200 mg

- . extrakt B: . 1 a 10 ml. . _

Za svrchu uvedených pokusných podmínek neměly extrakty dvou izolátů Geotrichum candidum žádný účinek na výskyt mutací u kmene Salmonella typhimurium. Na rozdíl od tohoto pozorování bylo možno pozorovat v Petriho miskách v případě aflatoxinu B^, použitého v koncentraci 1/Ul/ml

počet mutací v rozmezí 49 (± 12) a 195 (± 24) a v případě použití 3,4-benzpyranu v koncentraci 0,2 /Ug/ml počet mutací v rozmezí 28 (± 10) a 218 (± 41) na jednu misku.

Mimoto bylo prokázáno, že extrakty kultur obou izolátů Geotrichum candidum neměly žádný antibiotický účinek na kmeny Salmonella.

Je tedy možno uzavřít, že in vitro nevytváří ani jeden z izolátů GC3 a GC4 žádné toxické nebo teratogenní látky pro obratlovce ani žádné látky s genotoxickým účinkem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY r _{r r} r r r r r r f.

' 9 · _f e ♦ fl < r f~ *

1. Kmeny mikroorganismů z čeledi Geotrichum candidum, získatelné selekcí a klonováním přírodních kmenů mikroorganismu s následujícími vlastnostmi:

—7 účinnost lipázy nižší než 2,5 . 10 nKat/buňka,

- v podstatě úplná inhibice nežádoucí flory, vyvíjející se v průběhu sladování, nepřítomnost mutagenní aktivity podle Amesova testu.
2. Kmeny podle nároku 1, které mimoto mají jednu, dvě nebo tři z následujících vlastností:

stálost jejich spor v roztoku je delší než 6 měsíců, produkce spor je vyšší než 10 /ml, kmeny mohou zlepšit rychlost filtrace zápary.
3. Kmeny podle nároku 2, CNCM 1-1474 a 1-1475.
4. Způsob sladování obilovin, například žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo sarrazinu podle schématu, uvedeného na obr. 1,vyznaču jící se tím, že se materiál naočkuje kmenem Geotrichum candidum podle někte-
5 9 rého z nároků 1 až 3 v množství 10 až 10 jednotek pro tvorbu kolonií, UFC/Kg obilovin.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačuj íc í

7 8 se t í m , že se k naočkování užije 10 až 10 UFC na kg obilovin.
6. Způsob podle některého z nároků 4 nebo 5, vyznačující se tím, že se mikroorganismus t

r . .. * • * ♦ · · ř r

naočkuje jednou nebo vícekrát v průběhu jedné nebo většího počtu následujících etap: příprava obilovin nebo jiných rostlinných materiálů, první máčení, poslední máčení, střední máčení, přenos z máčení do etapy klíčení, v průběhu klícení, při přenosu z etapy klíčení na hvozdy nebo v průběhu sušení na hvozdech.

V
7. Způsob podle některého z nároků 4 až 6, v y značující se tím,že se k jeho provádění užijí kmeny CNCM 1-1474 nebo 1-1475.
8. Použití mikroorganismu z čeledi Geotrichum candidum při sladování obilovin a jiných rostlinných materiálů, jako žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo sarrasinu k potlačení vývoje flory, kontaminující a kolonizující obiloviny nebo jiné rostlinné materiály.
9. Použití podle nároku 8, při němž se užije jeden nebo větší počet vybraných kmenů Geotrichum candidum.
10. Použití podle nároků 8 nebo 9, při němž se užije Geotrichum candidum podle některého z nároků 1 až 3.
11. Použití podle některého z nároků 8 až 10, při němž se mikroorganismus naočkuje v průběhu sladování ve formě čisté kultury nebo ve formě směsné kultury ve spojení s jedním nebo větším počtem jiných mikroorganismů.
12. Použití podle nároku 11, při němž se mikroorga-. . . nismus naočkuje střídavě s bakteriemi mléčného kvašení nebo ve formě směsné kultury s těmito bakteriemi.
13. Použití podle některého z nároků 8 až 12, při němž se uvedený mikroorganismus užije k naočkování v množství r r

9 9 r r 9 9 ♦ · 9 f r r ·- » » f n 9 9 · * · » » r

- 26 10^ až 10θ, s výhodou 10? až 10θ jednotek pro tvorbu kolonií, UFC/kg obilovin nebo jiného rostlinného materiálu.
14. Použití některého z kmenů podle některého z nároků 1 až 3 v průběhu sladování obilovin nebo jiných rostlinných materiálů, například žita, ječmene, rýže, čiroku, kukuřice nebo sarrasinu k potlačení fenoménu pěnění nebo vystřikování nápoje, připraveného ze sladu.