CZ296506B6

CZ296506B6 - Rhodococcus rhodochrous 11Y, bakteriální kmen NCIMB 40820, bunecný extrakt katalyzující uvolnování dusitanu z RDX a zpusob jeho výroby, zpusob a biosenzor pro zjistování prítomnosti RDX a zpusob biologického osetrení prostredí kontaminovaného RDX

Info

Publication number: CZ296506B6
Application number: CZ0057499A
Authority: CZ
Inventors: Nicklin@Stephen; Charles Bruce@Neil; Edward French@Christopher; Rachel Travis@Emma; Basran@Amrik
Original assignee: The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2006-03-15
Also published as: HUP9904338A2; AU4023197A; GB9617537D0; GB2316408A; CZ57499A3; JP2000516473A; PL331464A1; NO990806D0; US6274368B1; NO324799B1; NO990806L; AU720888B2; JP4083226B2; IL128603A0; ZA977530B; WO1998007839A1; DE69729200T2; HUP9904338A3; EP0920493B1; CA2261289A1

Abstract

Rhodococcus rhodochrous 11Y, bakteriální kmen oznacený jako "11Y" a ulozený jako NCIMB 40820, a jeho mutanty schopné produkovat bunecný extrakt mající enzymovou aktivitu, která rozkládá hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX); tento bunecný extrakt katalyzující uvolnování dusitanu z RDX a zpusob jeho výroby zahrnující kultivaci výse uvedenéhomikroorganismu, protrzení bunek a extrahování enzymové aktivity z protrzených bunek. Zpusob zjistování prítomnosti RDX ve vzorku vystavením vzorku pusobení tohoto bunecného extraktu a detekci uvolneného dusitanu nebo formaldehydu. Biosenzor pro detekci RDX a zpusob biologického osetrení prostredí kontaminovaného RDX vyuzívající výse uvedené enzymatické aktivity.

Description

Rhodococcus rhodochrous 11Y, bakteriální kmen NC1MB 40820, buněčný extrakt katalyzující uvolňování dusitanu z RDX a způsob jeho výroby, způsob a biosenzor pro zjišťování přítomnosti RDX a způsob biologického ošetření prostředí kontaminovaného RDX

Oblast techniky

Vynález se týká bakteriálního kmene a jeho mutantů schopných produkovat buněčný extrakt mající enzymovou aktivitu, která rozkládá hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin (RDX); tohoto buněčného extraktu katalyzujícího biodegradaci RDX, způsobu jeho výroby kultivací buněk bakteriálního kmene, způsobu a biosenzoru pro zjišťování přítomnosti RDX ve vzorku a způsobu biologického ošetření prostředí kontaminovaného RDX využívajícího výše uvedené enzymatické aktivity.

Dosavadní stav techniky:

Nitraminy, ačkoliv jsou v přírodě zjevně dost vzácné, jsou chemickým průmyslem vyráběny ve významných množstvích, a obsahují, například, důležitou třídu energetických materiálů, které mají použití jako výbušniny a hnací látky, a v současnosti je ve Spojených státech RDX nejdůležitější vojenskou výbušninou. Výroba, manipulace a likvidace RDX, to vše vede ke kontaminaci okolního prostředí RDX. Existuje znepokojení týkající se osudu nitraminů vzhledem k okolnímu prostředí s ohledem na jejich relativní rekalcitranci, a tudíž existuje potřeba pomocí odstraňování těchto kontaminujících látek z prostředí bez vzniku jiných nežádoucích znečištění. Rovněž existuje naléhavá potřeba lepší metody detekce RDX, než je v současnosti navrhována analytickými systémy, které se nejvíce spoléhají na objemné a komplikované druhy zařízení, jako je vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC), a/nebo vyžadují speciálně vyškolené laboratorní techniky na jejich použití.

Úkolem tohoto vynálezu je poskytnout enzym, který je schopný katalýzo vat biodegradaci RDX, a který může být použit v biologicky očisťujícím systému pro kontaminované prostředí RDX znečištěním. Dalším úkolem tohoto vynálezu je poskytnout enzym, který je vhodný pro detekční systémy na RDX.

Podstata vynálezu

Byla nalezena nová enzymová aktivita, která uvolňuje z RDX, heterocyklického nitraminů, dusitan.

Předmětem vynálezu je Rhodococcus rhodochrous 11Y, bakteriální kmen označený jako „11Y“ a uložený jako NCIMB 40820, a jeho mutanty schopné produkovat buněčný extrakt mající enzymovou aktivitu, která rozkládá hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin (RDX).

Tato enzymová aktivita vykazuje nižší aktivitu proti podobnému heterocyklickému nitraminů oktahydro-l,3,5,7-tetranitro-l,3,5,7-tetrazocinu (HMX) a menší aktivitu proti esteru dusičnanu pentaerythritoltetranitrátu (PETN). Bylo zjištěno, že aktivita je spojená s membránou a může být z membrány solubilizována 5% tritonem. Požadavek na ko-faktor, jako NADPH, NADH, PES nebo FAD, pro enzymovou aktivitu není, a enzymová aktivita vykazuje stabilitu za přítomnosti relativně vysokých koncentrací denaturačních prostředků a aktivita se zvyšuje za přítomnosti močoviny. Enzymová aktivita je také relativně stabilní vůči tepelné denaturaci. Dále, vysoký podíl enzymové aktivity zůstává solubilizovatelný, když se pH sníží na 3,5 ledovou kyselinou octovou.

-1 CZ 296506 B6

Bakteriální kmen, z něhož se enzymová aktivita předloženého vynálezu získává, byl izolován z přírody a je kmenem Rhodococcus rhodochrous, zde označovaným 11Y. Vzorek nového izolátu byl uložen podle podmínek Budapešťské smlouvy na mezinárodním místě pro ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení, v britské sbírce „UK National Collection of Industrial and Marině bacteria, 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 IRY, Scotland“ dne 7. srpna 1996 pod číslem uložení NCIMB 40820.

Další charakteristiky uložené bakterie 11Y jsou uvedeny dále:

Gram-zbarvení	pozitivní
Spory		negativní
Pohyblivost		negativní
Růst	37 °C	pozitivní
	41 °C	pozitivní
	45 °C	negativní
Kataláza		pozitivní
Oxidáza		negativní
Fermentace		beze změny
v glukóze „OF“

Analýzy buněčné stěny a mastných kyselin poskytly následující informace:

Mykolové kyseliny jsou přítomny.

Diaminokyselina buněčné stěny je mesoDAP.

Profil mastných kyselinu ukazuje, že přítomnými majoritnímikyselinami jsou s přímým řetězcem nasycené a nenasycené kyseliny společně s malým množství 10-methyl-větvené kyseliny, např. tuberkulostearové.

Namísto přesně uloženého organismu lze použít jako výchozí organismu jeho mutant, například odvozený ozářením gama-paprsky, nebo chemický mutant, indukcí kultury nebo jiného média a pod. Schopnost jakéhokoliv takového organismu poskytnout enzymovou aktivitu může odborník v dané oblasti techniky snadno stanovit.

Předmětem vynálezu je dále buněčný extrakt mající enzymovou aktivitu degradující RDX připravitelný z buněk bakteriálního kmene Rhodococcus rhodochrous 11A definovaného výše nebo jejich mutantů, katalyzující uvolňování dusitanu zhexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu (RDX).

Předmětem vynálezu je dále také způsob výroby tohoto buněčného extraktu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kultivaci Rhodococcus rhodochrous 11Y sp. NCIMB 40820 nebo jejich mutantů, protržení buněk a extrahování enzymové aktivity z protržených buněk.

Aktivita enzymu může být produkována kultivací R. rhodochrous na RDX nebo NH₄C1 jako zdroji dusíku. K získání enzymové aktivity se buňky protrhnou jakýmkoliv běžným způsobem. Připraví se běžným postupem bezbuněčný extrakt. Potom může být extrakt rozdělen na frakce na ultracentrifuze a vytvořené pelety poskytují aktivní membránovou frakci.

Alternativně poskytuje supematant z ultracentrifugy aktivní rozpustný protein. Rozpustný protein může být částečně purifikován použitím aniontově-výměnné chromatografie a promýváním gradientem soli od 0-2 M chloridu sodného. Protein se eluuje jako jednotlivý pík v přibližně 350 mM chloridu sodném.

Enzymová aktivita získaná jako buněčný extrakt vyžaduje pro enzymovou aktivitu degradující RDX přítomnosti dithiothreitolu (DTT).

-2CZ 296506 B6

Schopnost nové enzymové aktivity katalyzovat odstraňování dusitanu z RDX umožňuje její využití pro detekci RDX.

Ještě dalším předmětem vynálezu je proto způsob zjišťování přítomnosti hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu (RDX) ve vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje vystavení vzorku působení buněčného extraktu majícího RDX-degradující enzymovou aktivitu uvedeného výše a detekci dusitanu, který se z uvedeného vzorku uvolňuje. Dusitan se přitom s výhodou detekuje obvyklými způsoby kolorimetricky.

Eliminace dusitanu z RDX může vytvořit nestabilní meziprodukt, který se pak spontánně štěpí za vzniku řady menších molekul včetně formaldehydu a amoniaku. Dalším předmětem předloženého vynálezu je tedy způsob zjišťování přítomnosti hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu (RDX) ve vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje vystavení vzorku působení buněčného extraktu majícího RDX-degradující enzymovou aktivitu uvedeného výše a detekci formaldehydu, který se z uvedeného vzorku uvolňuje. Formaldehyd se přitom s výhodou detekuje pomocí kolorimetrických postupů známých ze stavu techniky.

Předmětem vynálezu se dále také biosenzor pro detekci hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu (RDX) ve vzorku, který obsahuje prostředky pro kontaktování vzorku s buněčným extraktem majícím RDX degradující enzymovou aktivitu a uchovávání vzorku za podmínek vhodných pro degradaci kontaminované látky enzymovou aktivitou, a prostředky pro detekci výskytu tímto extraktem katalyzované reakce hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu (RDX), pokud je hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin (RDX) ve vzorku přítomen.

Předmětem vynálezu je dále také biosenzor pro detekci hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu (RDX) ve vzorku, který obsahuje prostředky pro naočkování vzorku kulturou bakteriálního izolátu Rhodococcus rhodochrous, jak je definován výše, a uchovávání vzorku za podmínek vhodných pro degradaci kontaminátu izolátem, a prostředky pro detekci výskytu tímto izolátem katalyzované reakce hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu (RDX), pokud je tato látka ve vzorku přítomna. Prostředkem pro detekci výskytu reakce je s výhodou kolorimetrická změna.

Konečně je předmětem vynálezu také způsob biologického ošetření prostředí kontaminovaného hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinem (RDX), při němž se do prostředí přidá buněčný extrakt mající RDX degradující enzymovou aktivitu definovaný výše a potom se prostředí udržuje za podmínek vhodných pro degradaci kontaminované látky buněčným extraktem, aby mohl být hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin (RDX) přítomný v prostředí spotřebován. Krok udržování směsi za podmínek vhodných pro degradaci kontaminované látky buněčným extraktem majícím enzymatickou aktivitu přednostně zahrnuje přidání dithiothreitolu do směsi.

Prostředím kontaminovaným hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinem (RDX) může například být proud odpadů materiálu obsahujícího RDX, který pochází z destrukce výbušných náplní obsahujících RDX, nebo vzorek zeminy nebo jiného materiálu kontaminovaného RDX. V prvním případě se může biologické očišťující zpracování běžně provádět v reakční nádobě, zatímco ve druhém případě se může enzymová aktivita zavádět přímo do materiálu. Další vhodné postupy účinného ošetření jsou pro odborníka ze stavu techniky zjevné.

-3CZ 296506 B6

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude dále popsán pomocí příkladů s odkazem na následující obrázky, kde:

Obr. 1 znázorňuje dusitan produkovaný RDX v průběhu inkubace buněčného extraktu Rhodococcus Rhodochrous 11Y.

Obr. 2 znázorňuje dusitan a formaldehyd produkovaný v průběhu inkubace celé buňky RDX buňkami Rhodococcus Rhodochrous 11Y.

Obr. 3 znázorňuje změny dusitanu produkovaného v Inkubacích částečně purifikované extraktu z Rhodococcus rhodochrous 11Y s koncentrací dithiothreitolu.

Obr. 4 znázorňuje dusitan uvolňovaný z inkubace RDX s částečně purifíkovaným extraktem se změnami koncentrací denaturačních látek.

Obr. 5 znázorňuje uvolňování dusitanu proti době varu pro inkubace tepelně zpracovaného částečně purifíkovaného extraktu s RDX.

Obr. 6 znázorňuje profil pH při uvolňování dusitanu z inkubací částečně purifíkovaného extraktu s RDX a při spontánní hydrolýze RDX.

Obr. 7 znázorňuje uvolněný dusitan a formaldehyd v průběhu inkubací částečně purifíkovaného extraktu s RDX.

Obr. 8 znázorňuje dusitan uvolněný z inkubací částečně purifíkovaného extraktu různých výbušnin obsahujících dusitan.

Příklady provedení

Příklad 1

1. Příprava enzymatické aktivity bakteriálního kmeneRhodococcus Rhodochrous 11Y

Rhodococcus Rhodochrous 11Y byl izolován použitím standardních postupů známých ze stavu techniky, ze vzorků shromážděných z přírodního zdroje obohacením RDX jako zdrojem dusíku.

R. rhodochrous 11Y byl kultivován v 1 litru definovaného prostředí sestávajícího z 2,17 g/1 Na₂HPO₄ a 1,325 g/1 KH₂PO₄, pH 7,0, obsahujícího 0,4% glukózu (hmotn./obj.), stopové prvky (jak jsou uvedeny Pfennigem a Lippertem, Arch. Microbiology, 1966, 55, 726-739) a buď 1 mM RDX nebo 6mM NH₄C. Buňky byly inkubovány při 180ot./min ve třepacím inkubátoru při 30 °C.

Bezbuněčné extrakty byly získány z buněk kultivovaných výše uvedených postupem. Buňky byly peletovány rychlým otáčením 10 000 g po 15 min při 4 °C v centrifuze Sorval RC-5C vybavené rotorem GS-3. Tyto buňky byly resupendovány ve 2 ml 50 mM Tricinového pufru (pH 8,0) na gram hmotnosti vlhkých buněk. Buňky byly rozrušeny působením ultrazvukem v MSE Soniprep (Fisons, Instruments, FSA Ltd.) použitím 6x15 pm prasknutí za 15 sekund, střídavě s 30 sekundami ochlazování v rozdrceném ledu. Buněčný odpad a nerozlámané buňky byly odstraněny na centrifuze při 13 000 g po 1 min při 4 °C v mikrocentrifuze (Sigma). Tento supematant byl použit jako bezbuněčný extrakt. Membránová frakce byla získána z bezbuněčného extraktu na ultracentrifuze při 109 000 g po 1 hodinu při 4 °C (Beckman Optimal TLX Ultracentrifuga TLA 45 rotor), pelety byly promyty a resuspendovány v 50 mM Tricinového pufru (pH 8,0) na koncentraci 3 mg/ml proteinu.

-4CZ 296506 B6

2. Chemikálie

RDX byl nejvyšší čistoty a ostatní chemikálie byly analytického stupně, a, pokud není uvedeno jinak, byly získány od BDP Ltd. (Poole, UK), Sigma Chemical Company Ltd. (Poole, UK) nebo Aldrich (Gillingham, UK).

3. Zkoušky:

ío RDX degradace

Štěpení RDX bylo stanoveno HPLC monitorováním mizení RDX, v 50 mM Tricinu (pH 8,0), obsahujícím RDX (50 μΜ, konečná koncentrace), 5 mM DTT a 40 μΐ bezbuněčného extraktu nebo membránové frakce ve výsledném objemu 1 ml.

15.

Obdobně bylo štěpení RDX sledováno monitorováním uvolňování dusitanu použitím Griessova reakčního činidla (Rosenblatt, Burrows, Mithell a Partner, 1991: „Organic Explosives and Related Compouds“ v „Handbook of Environmental Chemistry 3 (G), vydal O. Hunzinger, Springer-Verlag). Zkouška probíhala postupem popsaným výše. Byla přidána kyselina sulfanili20 nová (0,6 mM, konečná koncentrace) a ponechána stát 15 min, potom byl přidán N-l-naftylenhylendiamin (0,4 mM konečná koncentrace) a po 5 min barvivo, jehož vývoj byl sledován spektrofotometricky při 540 nm.

Protein

Protein byl testován rutinním postupem Coomassie metodou barvení vazby (Anal. Biochem (1976) 72, 248-254) použitím komerčně dostupného reagens a albuminového standardu hovězího séra (Pierce Ltd. - získaný přes Life Science Labs Ltd., Luton). Odpovídající podíl (20 μΐ) vzorku obsahující 0,2 - 1 mg proteinu/ml byl přidán do 1 ml reagens a reakce byla ponechána 30 probíhat po 5 min při teplotě místnosti před odečtením absorbance při 595 nm proti slepému pokusu pufru (20 μΐ) plus reagens (1 ml). Porovnání s křivkou standardu ze standardních hodnot (0 - 1 mg/ml) umožnilo výpočet koncentrace proteinu ve vzorku.

4. Výsledky

RDX - degradace

Surový extrakt byl inkubován při 30 °C s 50 mM Tricinu obsahujícího 50 μΜ RDX a 5 mM DTT v časovém rozmezí od 0 do 60 min. Koncentrace RDX byla stanovena použitím HPLC. Bylo 40 pozorováno, že koncentrace RDX se snižuje.

Membránová frakce byla inkubována při 30 °C s 50 mM Tricinu obsahujícího 50 pm RDX a 5 mM DTT v časovém rozmezí od 0 do 60 min. Koncentrace RDX byla detekována použitím HPLC. Bylo pozorováno, že se koncentrace RDX s plynoucím časem snižuje.

Produkce dusitanu

Surový extrakt byl inkubován při 30 °C s 50 mM Tricinu obsahujícího 50 μΜ RDX a 5 mM DTT v časovém rozmezí 0 až 60 min. Koncentrace dusitanu potom byla měřena použitím Griessova 50 reakčního činidla. Bylo pozorováno, že koncentrace dusitanu se zvyšuje, jak je ukázáno na obr. 1.

Přidávání některého z ko-faktorů NADH, NADPH, PES nebo FAD neovlivňuje rychlost produkce dusitanu, indikující vyčerpávání enzymové aktivity nezávislé na ko-faktoru.

-5CZ 296506 B6

Membránová frakce inkubovaná s 50 pm RDX při 30 °C také produkovala dusitan. Solubilizace této aktivity byla možná s 5% tritonem.

Příklad 2

Buňky bakterií R. rhodochrous 11Y byly kultivovány v prostředí sestávajícím z 2,17 g/1 Na2HPO₄ a 1,325 g/1 KH₂PO₄, pH 7,0, s 0,4% glukózou (hmotn./obj.), 6 mM atomů dusíku a stopovými prvky (Pfennig a Lippert, supra). Kultury byly inkubovány při 170 ot./min v rotační třepačce při 30 °C.

Celé buňky 11Y byly získány odstředěním kultur pozdní exponenciální fáze při 7000 g po 10 min v centrifuze Sorvall RC5C použitím rotoru GS3. Buňky byly promyty a suspendovány v 50 mM Tricinu pH 8,0 na koncentraci 0,5 g/ml vlhké hmotnosti buněk.

Degradace RDX v inkubacích celých buněk 11Y byla testována v 50 mM Tricinu, pH 8,0, obsahujícího RDX (300 μΜ konečná koncentrace) a 10 μΐ celých buněk v konečném objemu 1 ml. Mizení RDX bylo monitorováno použitím chromatografíe na tenké vrstvě (TLC) s detekcí používající Griessova reakčního činidla (Rosenblatt a kol., supra). Obdobně byla monitorována produkce formaldehydu použitím standardního Hantzch spektrofotometrického testu; 500 μΐ vzorku bylo smíseno s 500 μΐ formaldehydového reagens (20 mM cetylacetonu, 2 mM octanu amonného a 50 mM kyseliny octové) (Nash, 1953, Biochemical Joumal, Vol. 55, str. 416). Potom byl vzorek inkubován při 58 °C po 10 min a při 418 nm měřena žlutě zbarvená formace použitím spektrofotometru s diodovou mřížkou. K vytvoření kalibrační křivky byly použity známé koncentrace formaldehydu (od 1 do 500 μΜ).

Vzorky s celými buňkami byly inkubovány při 30 °C ve 12hodinovém časovém období. Bylo pozorováno, že koncentrace dusitanu se zvyšovala, jak je patrné na obr. 2. Obr. 2 také ukazuje, že koncentrace formaldehydu se rovně zvyšovala.

Celé buňky byly rozrušeny v „French Pressure cell Press“ použitím minicel při tlaku 11 000 psi (tedy 75 845 kPa). Buněčné zbytky a nezlámané buňky byly odstraněny na centrifuze při 13 000 ot./min po 1 min při 4 °C v mikrocentrifuze, a supematant byl použit jako surový buněčný extrakt.

Aktivita surového extraktu při štěpení RDX a produkci dusitanu byla testována následovně: Zkouška se prováděla v 50 mM Tricinovém pufru s pH 8,0, obsahujícím RDX (50 μΜ konečná koncentrace) 5 mM DTT a 40 μΐ surového extraktu v konečném objemu 1 ml. Degradace RDX byla stanovena monitorováním ubývání RDX prostřednictvím TLC s detekcí používající Griesova reakčního činidla. K měření produkovaného dusitanu byly proteiny vysráženy přídavkem 2 μΐ ledové kyseliny octové a potom odebrány odstředěním v mikrocentrifuze (5 min. 13 000 ot./min.) Byla provedena standardní Griessova reakce na dusitan. Byla pozorována degradace RDX a doprovázející produkce dusitanu.

Subcelulámí frakcionace bylo dosaženo ultracentrifugací surového extraktu při 109 000 g po 1 hod. při 4 °C (Beckman Optima TLX ultracentrifuga TLA 45 rotor), supematant reprezentoval rozpustné proteiny a peleta membránové frakce. Peleta byla promyta a resuspendována v 50 mM Tricinovém pufru s pH 8,0 na koncentraci 2 mg/ml proteinu před studiem aktivity.

Schopnost degradovat RDX byla pozorována u obou frakcí s největším podílem v membránové frakci.

Enzymová aktivita degradující RDX v solubilizovatelném proteinu byla částečně purifikována Q-sefarózovou kolonou použitím 50 mM Tris pufru pH 8,5 a solným gradientem 0-2 M NaCl.

-6CZ 296506 B6

Protein se eluoval jako jednotlivý pík při asi 350 mM chloridu sodném. Bylo pozorováno, že částečně purifíkovaný protein je tepelně stabilní a byl denaturován v 6 M močoviny, ale při ředění 2 M močoviny byl opět svinut.

Příklad 3

1. Růst R. Rhodochrous a částečná purifíkace enzymu litrů R. Rhodochrous 11Y bylo kultivováno ve 20 mM KH2PO4, 0,4% glukóze (hmotn/hmotn.), 2 ml stopových prvků (Pfenning a Lippert, supra), a 1 mM RDX jako jediného zdroje dusíku při 30 °C. Buňky byly pěstovány ve 21itrových buňkách a odebrány byly odstředěním, právě když dosáhly stacionární fáze růstu, v centrifuze Sorvall RC56 použitím rotoru GS3 při 10 000 g po 15 min při 4 °C. Buněčná peleta (57 g vlhké hmotnosti buněk) byla resuspendována ve 120 ml 50mM Tris pH 8,0. Suspenze byla homogenizována použitím „French pressure cell“ při 34 000 psi (tedy 241 325 kPa) (tři průchody), následovalo odstředění (centrifuga Sorvall RC5C s použitím rotoru SS-34 při 30 000 g po 30 min při 4 °C) k peletování buněčných zbytků. Supematant byl odebrán a opět odstředěn (centrifuga Beckman XL-90 s použitím rotoru Ti-70 při 25 000 g po 2 hod při 4 °C) k peletování bakteriálních membrán. Bylo zjištěno, že supernatanty i pelety vykazují schopnost degradovat RDX za uvolňování dusitanu, jak bylo stanoveno Greissovým testem. Supematant z kroku vysokorychlostního odstřeďování byl použit pro další purifikaci.

pH vzorku supematantu bylo sníženo na 3,5 ledovou kyselinou octovou a vzorek byl inkubován na ledu po 30 min. Bylo zjištěno, že kolem 60 % proteinu z vysokorychlostního supematantu agregovalo a bylo odebráno dalším odstředěním (centrifuga Sorvall RC5C s použitím rotoru SS34 při 30 00 g po 30 min při 4 °C). Potom bylo pH supematantu posuzováno na 8,0 použitím 1M hydroxidu sodného a extrakt byl testován na uvolňování dusitanu vázaného RDX, jak je popsáno v příkladu 1. Bylo zjištěno, že větší díl aktivity zůstává vázán po zpracování ledovou kyselinou octovou (kolem 75 %). Tento vzorek byl použit ve všech následujících testech.

2. Požadavky na substrát

Použitím částečně purifíkovaného proteinu byly zkoumány požadavky na ko-faktory. Bylo zjištěno, že neexistuje žádná potřeba ko-faktorů, jako NADPH nebo NADH. Závislost degradace RDX na koncentraci diothiothreitolu (DTT), byla zkoumána následovně: 26 pg částečně purifikovaného proteinu bylo inkubováno za přítomnosti 4M močoviny, 0,3 mM RDX, 50 mM Tricinu s pH 8,5 při 37 °C po 10 min. Koncentrace DTT se měnila a konečný objem byl upraven na 200 μΐ. Množství uvolněného dusitanu bylo měřeno použitím spektrofotometrického testu, jak je opsán v příkladu 1. Množství uvolňování dusitanu s koncentrací DTT je znázorněno na obr. 3. Ten ukazuje preferenci přítomnosti DTT s tím, že kolem 3 mM DTT je požadováno pro dosažení maximální aktivity. DTT se používá k udržení redukčního prostředí, kde jsou buňky rozrušovány.

3. Rozpustnost a stabilita

Koncentrování částečně purifíkovaného roztoku enzymu použitím ultrafiltrační jednotky Amicon (řezy membrány 3 kDa, 70 psi/asi 483 kPa při 4 °C) vede k agregaci proteinu a snižování akti-j vity. Bylo zjištěno, že agregovaný protein může být resolubilizován v 8 M močoviny, 5 mM DTTj a 50 mM Tris s pH 8,0 a aktivita obnovena.1

Stabilita enzymové aktivity za přítomnosti silných denaturačních činidel byla měřena testováním uvolňování dusitanu z RDX za přítomnosti vzorku proteinu s močovinou nebo guinidin-hydrochloridem. Podmínky testu byly: 50 mM Tricinu s pH 8,5, 0,3 mM RDX, 5 mM DTT při 37 °C po 10 min s 26 pg proteinu. Uvolňování dusitanu bylo měřeno spektrofotometricky, jak je popsá- j

-7CZ 296506 B6 no v příkladu 1. Závislost RDX aktivity na koncentraci denaturačního činidla je znázorněna na obr. 4.

Je zřejmé, že enzym vykazuje neobvykle vysokou stabilitu za přítomnosti vysokých koncentrací denaturačních činidel. Rozdíly v aktivitě, pozorované s močovinou, která převážně působí přerušením vodíkových vazeb a hydrofobními interakcemi s proteiny, a guanidin-hydrochloridem, který převážně přerušuje iontové interakce a v menším rozsahu hydrofobní interakci, předpokládají, že iontové interakce mohou hrát ve stabilitě enzymové aktivity větší roli.

Jelikož byla aktivita štěpící RDX zvyšována přítomností močoviny, probíhaly všechny následující zkoušky za přítomnosti 4 M močoviny.

Ke stanovení tepelné stability enzymové aktivity částečně puntíkovaného proteinu byl vzorek zahříván na 100 °C a vzorky byly odebírány v různých intervalech a testovány po 10 min s 20 μΐ vroucího vzorku, 50 mM Tricinu s pH 8,5,4 M močoviny, 5 mM DTT a 0,3 mM RDX při 37 °C. Uvolňování dusitanu bylo měřeno spektrofotometricky a výsledky jsou znázorněny na obr. 5.

Je zřejmé, že enzymová aktivita je relativně stabilní vůči teplu, ztrácí se pouze kolem 20 % aktivity po 10 min při 100 °C.

4. profil pH

Byl zkoumán profil pH částečně purifikovaného extraktu. Podmínky testu byly: 50 mM vhodného pufru, 4 M močoviny, 0,3 mM RDX a 5 mM DTT. Vzorky byly inkubovány při 37 °C po 10 min s 26 pg částečně purifikovaného proteinu. Alkalická hydrolýza 0,3 mM RDX byla také měřena za identických podmínek a výsledky jsou znázorněny na obr. 6. Je zřejmé, že enzymová aktivita výrazně zvyšuje uvolňování dusitanu z RDX ve srovnání se spontánním rozpadem přes rozmezí pH.

5. Produkce dusitanu a formaldehydu

Produkce dusitanu a formaldehydu z enzymového rozpadu RDX byla testována v 50 mM Tricinu s pH 8,5,4 M močoviny, 0,15 mM RDX a 5 mM DTT při 37 °C s 26 pg částečně purifikovaného extraktu, a bylo měřeno množství uvolněného dusitanu a produkovaného formaldehydu s časem použitím standardních spektrofotometrických testů, jak jsou popsány v příkladu 1.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 7. Množství formaldehydu a dusitanu uvolněných z RDX byla podobná, a předpokládá se, že mechanismus enzymatického rozpadu RDX bude podobný, jako se předpokládá pro alkalickou hydrolýzu RDX (Croke a Okamoto, 1978, Joumal of Organic Chemistry, Vol. 44, str. 2100-2103; Heilmann a kol. 1996, Enviromnemtal Science Technology, Vol. 30, č. 5, str. 1485-1492), kde odstranění dusitanové skupiny z RDX vytvoří nestabilní meziprodukt, který se spontánně štěpí za vniku řady menších molekul včetně formaldehydu.

6. Specifikace substrátu

Byla zkoumána specifičnost substrátu testováním, zda enzymová aktivita štěpí HMX nebo PETN, obě výbušniny obsahující dusitan. Testy se prováděly v 50 mM Tricinu, 4 M močoviny, 0,3 mM příslušné výbušniny a 5 mM DTT při 37 °C po 20 min s 26 pG částečně purifikovaného extraktu a výsledky byly porovnávány s RDX. Výsledky jsou znázorněny na obr. 8. Je patrné, že enzymová aktivita byla účinná proti všem testovaným výbušninám, ale jasná preference (tedy vyšší aktivita) patřila RDX.

Claims

1. Rhodococcus rhodochrous 11Y, bakteriální kmen označený jako „11Y“ a uložený jako NCIMB 40820, a jeho mutanty schopné produkovat buněčný extrakt mající enzymovou aktivitu, která rozkládá hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin, RDX.

2. Buněčný extrakt mající enzymovou aktivitu degradující RDX připravitelný z buněk Rhodococcus rhodochrous 11Y podle nároku 1 nebo jejich mutantů, katalyzující uvolňování dusitanu z hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5--triazinu, RDX.

3. Způsob výroby buněčného extraktu majícího enzymovou aktivitu degradující RDX podle nároku 2, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci Rhodococcus rhodochrous 11Y sp. NCIMB 40820 podle nároku 1 nebo jejich mutantů, protržení buněk a extrahování enzymové aktivity z protržených buněk.

4. Způsob zjišťování přítomnosti hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu, RDX, ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje vystavení vzorku působení buněčného extraktu majícího RDX-degradující enzymovou aktivitu podle nároku 2 a detekci dusitanu, který se z uvedeného vzorku uvolňuje.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se dusitan detekuje kolorimetricky.

6. Způsob zjišťování přítomnosti hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu RDX ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje vystavení vzorku působení buněčného extraktu majícího RDX-degradující enzymovou aktivitu podle nároku 2 a detekci formaldehydu, který se z uvedeného vzorku uvolňuje.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se formaldehyd detekuje kolorimetricky.

8. Způsob podle některého z nároků 4až 7, vyznačující se tím, že buněčný extrakt mající RDX degradující enzymovou aktivitu se vyrábí způsobem podle nároku 3 a způsob zahrnuje krok přidávání dithiothreitolu do vzorku.

9. Biosenzor pro detekci hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu RDX ve vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje prostředky pro kontaktování vzorku sbuněčným extraktem majícím RDX degradující enzymovou aktivitu podle nároku 2 a uchovávání vzorku za podmínek vhodných pro degradaci kontaminované látky enzymovou aktivitou, a prostředky pro detekci výskytu tímto extraktem katalyzované reakce hexahydro-l,3,5-trmitro-l,3,5-triazinu RDX, pokud je hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin RDX ve vzorku přítomen.

10. Biosenzor pro detekci hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazmu RDX ve vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje prostředky pro naočkování vzorku kulturou bakteriálního izolátu Rhodococcus rhodochrous, jak je definován v nároku 1, a uchovávání vzorku za podmínek vhodných pro degradaci kontaminátu izolátem, a prostředky pro detekci výskytu tímto izolátem katalyzované reakce hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazinu RDX, pokud je hexahydro-1,3,5trinitro-l,3,5-triazin RDX ve vzorku přítomen.

11. Biosenzor podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že prostředkem pro detekci výskytu reakce je kolorimetrická změna.

-9CZ 296506 B6

12. Způsob biologického ošetření prostředí kontaminovaného hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5triazinem, RDX, vyznačující se tí m , že se do prostředí přidá buněčný extrakt mající RDX degradující enzymovou aktivitu podle nároku 2 a potom se prostředí udržuje za podmínek

5 vhodných pro degradaci kontaminované látky buněčným extraktem, aby mohl být hexahydro- l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin, RDX, přítomný v prostředí spotřebován.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že krok udržování směsi za podmínek vhodných pro degradaci kontaminované látky buněčným extraktem majícím enzymatickou ío aktivitu zahrnuje přidání dithiothreitolu do směsi.