PL189424B1

PL189424B1 - Nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous, ekstrakt komórkowy, sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego, sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), czujnik biologiczny do wykrywania w próbce RDX oraz sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez RDX

Info

Publication number: PL189424B1
Application number: PL97331464A
Authority: PL
Inventors: Stephen Nicklin; Neil Charles Bruce; Christopher Edward French; Emma Rachel Travis; Amrik Basran
Original assignee: Secr Defence Brit
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2005-08-31
Also published as: ZA977530B; NO990806D0; AU720888B2; HU224469B1; HUP9904338A2; CZ296506B6; NO324799B1; GB9617537D0; IL128603A0; US6274368B1; GB2316408A; IL128603A; AU4023197A; PL331464A1; EP0920493A1; CA2261289A1; HUP9904338A3; WO1998007839A1; NO990806L; JP4083226B2

Abstract

1. Nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous okreslony jako „11Y” i zdeponowany jako NCIMB 40820 oraz jego mutanty posiadajace aktywnosc enzyma- tyczna degradujaca heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5 -triazyne (RDX). P L 1 8 9 42 4 B 1 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous, ekstrakt komórkowy, sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego, sposób wykrywania w próbce heksahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX), czujnik biologiczny do wykrywania w próbce RDX oraz sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez RDX.

Wynalazek znajduje zastosowanie w dziedzinie wykrywania i biodegradacji materiałów wybuchowych. Wynalazek dotyczy w szczególności aerobowej biodegradacji heksogenu, czyli heksahydro-l,3,5~trinitro-l,3,5-triazyny (dalej określanej powszechnie stosowanym skrótem RDX) oraz sposobów i czujników do wykrywania RDX, wykorzystując ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradowania RDX.

Nowy ekstrakt komórkowy wykazujący aktywność enzymatyczną uwalniania azotyny z heterocyklicznej nitroaminy-RDX.

Nitroaminy, występujące wprawdzie w naturze wyjątkowo rzadko, produkowane są w znacznych ilościach przez przemysł chemiczny i stanowią ważną klasę materiałów energetycznych, mających zastosowanie jako materiały wybuchowe i pędne, a RDX w Stanach Zjednoczonych obecnie stanowi najważniejszy wojskowy materiał wybuchowy. Wytwarzanie, użytkowanie i dysponowanie RDX może prowadzić do zanieczyszczenia środowiska heksogenem. Istnieją obawy dotyczące zatruwania środowiska nitroaminami ze względu na ich stosunkowo dużą odporność, istnieje zatem zapotrzebowanie na środki do usuwania takich zanieczyszczeń ze środowiska bez wytwarzania innych niepożądanych zanieczyszczeń. Jest też pilne zapotrzebowanie na lepszą metodę wykrywania RDX, ponieważ obecnie proponowane układy analityczne najczęściej zawierają wielkie i wyrafinowane elementy wyposażenia, takie jak wysokowydajna chromatografia cieczowa (High Performance Liąuid Chromatography) i/lub wymagają specjalnie wyuczonych techników laboratoryjnych do ich stosowania.

Celem wynalazku jest dostarczenie enzymu, który byłby zdolny katalizować biodegradację RDX i który mógłby być stosowany w biologicznym układzie zapobiegania zanieczyszczeniom środowiska przez odpady RDX. Ponadto, celem niniejszego projektu jest dostarczenie enzymu, przydatnego w układach wykrywania RDX.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous określony jako „11 Y”i zdeponowany jako NCIMB 40820 oraz jego mutanty posiadające aktywność enzymatyczną degradującą heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazynę (RDX).

Przedmiotem wynalazku jest również ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną, charakteryzujący się tym, że katalizuje uwalnianie azotynu z heksahydro-1,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX) i pochodzi z komórek szczepu Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820 albo jego mutanta.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego posiadającego enzymatyczną aktywność degradującą RDX, charakteryzujący się tym, że hoduje się szczep Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820 albo jego mutanty, a następnie rozrywa się komórki i wydziela ekstrakt komórkowy.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania w próbce heksahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX), charakteryzujący się tym, że próbkę poddaje się działa4

189 424 niu ekstraktu komórkowego posiadającego aktywność enzymatyczną degradującą RDX i wykrywa się azotyn wytworzony w tej próbce.

Korzystnie, azotyn wykrywa się kolorymetrycznie.

Korzystnie, ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą RDX wytwarza się sposobem wymienionym powyżej, przy czym dodatkowo do próbki dodaje się ditiotreitol.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), charakteryzujący się tym, że próbkę poddaje się działaniu ekstraktu komórkowego posiadającego aktywność enzymatyczną degradującą RDX i wykrywa się formaldehyd wytworzony w tej próbce.

Korzystnie, formaldehyd wykrywa się kolorymetrycznie.

Korzystnie, ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą RDX wytwarza się sposobem określonym powyżej, przy czym dodatkowo do próbki dodaje się ditiotreitol.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest czujnik biologiczny do wykrywania w próbce heksahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX), charakteryzujący się tym, że zawiera środki do kontaktowania próbki z ekstraktem komórkowym posiadającym enzymatyczną aktywność degradującą RDX i do utrzymywania próbki w warunkach odpowiednich dla enzymatycznej degradacji zanieczyszczenia oraz środki do wykrywania występowania reakcji heksahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX) katalizowanej przez ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX) w próbce.

Korzystnie, środki do wykrywania wystąpienia reakcji stanowią środki do wykrywania zmiany kolorymetrycznej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest czujnik biologiczny do wykrywania w próbce heksahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX), charakteryzujący się tym, że zawiera środki do szczepienia próbki hodowlą izolatu bakteryjnego Rhodococcus rhodochrous określonego jako „11Y” i zdeponowanego jako NCIMB 40820 lub jego mutanta i do utrzymywania próbki w warunkach odpowiednich do degradacji zanieczyszczenia przez izolat oraz środki do wykrywania wystąpienia reakcji heksahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX) katalizowanej przez izolat w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny (RDX) w próbce.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez heksahydro-1,3,5-trinitro-l,3,5-triazynę (RDX), charakteryzujący się tym, że dodaje się do środowiska ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną degradującą RDX i utrzymuje się mieszaninę w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia do momentu degradacji obecnej w materiale heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny.

Korzystnie, podczas utrzymywania mieszaniny w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia dodaje się do mieszaniny ditiotreitol.

Jak to już wspomniano, wynalazek wykorzystuje aktywny enzym, który katalizuje usuwanie azotynu z RDX. Ten aktywny enzym wykazuje mniejszą aktywność wobec podobnej heterocyklicznej nitroaminy, oktogenu - oktahydro-l,3,5,7-tetranitro-l,3,5,7-tetrazocyny (ΗΜΧ), jak również mniejszą aktywność wobec azotanowego estru - tetraazotanu pentaerytrytu - pentrytu (PENT). Stwierdzono, że enzym ten jest związany z membraną i może być wymyty z niej 5% trytonem (środek powierzchniowo czynny Rhohm & Haas).

Kofaktor taki jak NADPH, NADH, rES czy FAD me jest konieczny do uzyskania aktywności enzymatycznej, przy czym aktywność jest stabilna w obecności stosunkowo wysokich stężeń denaturantów i wzrasta w obecności mocznika. Enzym ten wykazuje też trwałą aktywność przy denaturacji cieplnej. Ponadto duża część enzymu pozostaje rozpuszczalna gdy zmniejsza się wartość pH do 3,5 lodowatym kwasem octowym.

Ekstrakt komórkowy wykazujący aktywność enzymatyczną według wynalazku uzyskuje się z wyizolowanego z natury szczepu bakteryjnego. Ten szczep bakteryjny to szczep Rhodococcus rhodochrous, określony tu jako 11Y. Ten nowo wyizolowany organizm bakteryjny sta189 424 nowi dalszy aspekt przedstawionego wynalazku. Próbkę nowo wyizolowanego organizmu, na podstawie Porozumienia Budapeszteńskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytów Mikroorganizmów do celów postępowań patentowych, zdeponowano 7 sierpnia 1996 pod numerem depozytowym NClMB 40820 w UK National Collection of Industrial and Marine Bacteria, 23 St. Machał Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Scotland.

Dalsze charakterystyki zdeponowanej bakterii 11Y są przedstawione niżej:

barwienie Gramma	+
zarodniki	-
ruchliwość	-
wzrost 37°C	+
41°C	+
45°C	-
katalaza	+
oksydaza	-
fermentacyjna	bez zmiitn w teście oksydacyjnoffermentacyjnym z guukoą.

Analiza ściany komórkowej i kwasów tłuszczowych dostarczyła następujących informacji:

Obecne są kwasy mykolowe (a-rozgałęzione, [3-^^Tydrcoksy kwasy tłuszczowe);

Diaminokwasem ścianek komórek jest mezoDAP

Profil kwasów tłuszczowych pokazuje, że większość obecnych kwasów to nasycone i nienasycone kwasy o łańcuchu prostym wraz z niewielką ilością 10-metylo rozgałęzionego kwasu, to znaczy kwasu tuberkulosteaynowego.

Ekstrakt komórkowy wykazujący enzymatyczną aktywność może być wytworzony przez hodowlę R. rhodochrous na RDX lub NH4CI jako źródle azotu. W celu otrzymania ekstraktu komórki mogą być rozerwane dowolnym konwencjonalnym sposobem. Dogodnie sporządza się ekstrakt wolny od komórek. Ekstrakt może być następnie frakcjonowany drogą ultrąwirowania i części stałe zebrane, co daje w rezultacie aktywną frakcję membranową.

Alternatywnie, supernatant z ultrawirowania dostarcza rozpuszczalne aktywne białko. Rozpuszczalne białko może być częściowo oczyszczone przez zastosowanie anionowymiennej chromatografii i wymywanie z liniowym gradientem soli 0 - 2 M chlorku sodu. Białko eluuje się jako pojedynczy pik przy około 350 mM chlorku sodu.

Enzymatyczna aktywność otrzymana jako ekstrakt komórek wymaga obecności ditiotreitolu (DTT) (odczynnik Cleland'a) do enzymatycznej degradacji RDX.

Zamiast stosowania zdeponowanego mikroorganizmu można zastosować jego mutanty, na przykład pochodzące z naświetlania promieniami gamma lub stosowania chemicznego mutagenu, indukcję przez hodowlę na innym medium etc., albo jego transkoniuganty z inną bakterią albo sztucznie wytwarzane warianty. Zdolność każdego takiego organizmu do wykazania enzymatycznej aktywności może być łatwo określona przez fachowca z tej dziedzany.

Zdolność nowego ekstraktu komórkowego wykazującego aktywność enzymatyczną do katalizowania usuwania azotynu z RDX umożliwia stosowanie go do wykrywania RDX. Zgodnie zatem z dalszym aspektem wynalazku, przedstawiono sposób wykrywania obecności RDX w próbce, który polega na tym, że próbkę poddaje się działaniu enzymatycznej aktywności degradowania RDX i wykrywaniu każdego azotynu uwolnionego z tej próbki. Przydatna do takiego wykrywania może być dobrze znana w stanie techniki metoda kolorymetryczna.

Usuwanie azotynu z RDX może dawać nietrwałe produkty pośrednie, które następnie ulegają spontanicznej degradacji, dając szereg mniejszych cząsteczek, a w tym formaldehyd i amoniak. W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku przedstawiono zatem sposób wykrywania obecności RDX w próbce, który polega na wystawieniu próbki na enzymatyczną aktywność degradowania RDX i wykrywanie każdej ilości wytworzonego formaldehydu. Takie wykrywanie może być dokonane też znaną, w stanie techniki metodą kolorymetryczną.

W dalszym aspekcie prezentowany wynalazek przedstawia bioczujnik wykrywania RDX w próbce, który stanowi środki do kontaktowania próbki z ekstraktem komórkowym degradującym RDX i środki do wykrywania występowania reakcji RDX katalizowanej przez aktywność enzymatyczną, jeśli w próbce obecny jest RDX. Środki do wykrywania występowania reakcji dogodnie może stanowić przetwornik kolorymetryczny. Takie czujniki mogą

189 424 stanowić bazę przenośnych wykrywaczy do analizowania zakresu zanieczyszczenia środowiska odpadami RDX.

Dalszy aspekt prezentowanego wynalazku to sposób biologicznej obróbki naprawczej środowiska zanieczyszczonego RDX, który to sposób obejmuje etapy dodawania do zanieczyszczonego środowiska ekstraktu komórkowego wykazującego aktywność enzymatyczną i utrzymywania mieszaniny w warunkach odpowiednich do degradacji RDX przez aktywność enzymatyczną tak, aby obecny w materiale RDX został zużyty.

Zużywanym materiałem może być, na przykład strumień ścieków materiałów zawierających RDX pochodzący z destrukcji ładunku zawierającego RDX łub próbka ziemi zanieczyszczonej RDX, albo inny materiał. W pierwszym przypadku biologiczną obróbkę naprawczą można dogodnie przeprowadzić w zbiorniku reakcyjnym, podczas gdy w tym ostatnim przypadku ekstrakt komórkowy można wprowadzić bezpośrednio do materiału. Inne metody obróbki nie będą stanowiły problemu dla specjalistów.

Według jeszcze dalszego aspektu prezentowanego wynalazku ekstrakt komórkowy do degradowania RDX jest wykorzystywany do alternatywnej biologicznej obróbki naprawczej środowiska zanieczyszczonego RDX. Sposób ten obejmuje etap zaszczepienia środowiska próbką wyizolowanego organizmu bakteryjnego Rhodococcus rhodochrous oznaczonego jako 11Y i pozwolenie na skonsumowanie RDX obecnego w środowisku. Środowiskiem może być, na przykład strumień odpadów materiału zawierającego RDX bibo próbka ziemi zanieczyszczonej RDX lub inny materiał. W pierwszym przypadku biologiczną obróbkę naprawczą można dogodnie przeprowadzić w zbiorniku reakcyjnym, podczas gdy w tym ostatnim przypadku izolat może być wprowadzony bezpośrednio do środowiska przez zaszczepienie nim gleby, inne metody obróbki nie będą stanowiły problemu dla specjalistów.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest odtworzony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia azotyn wytwarzany podczas inkubacji RDX ekstraktu komórkowego z Rhodococcus rhodochrous 11Y, fig. 2 przedstawia azotyn i formaldehyd wytworzony z RDX podczas inkubacji całymi komórkami Rhodococcus rhodochrous 11Y, fig. 3 przedstawia zmiany azotynu wytwarzanego w inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z Rhodococcus rhodochrous 11Y ze stężeniem ditiotreitolu, fig. 4 przedstawia azotyn uwalniany z inkubacji RDX z częściowo oczyszczonym ekstraktem ze zmianą stężenia denaturantów, fig. 5 przedstawia uwalnianie azotynu w stosunku do czasu gotowania dla inkubacji obrabianego cieplnie częściowo oczyszczonego ekstraktu z RDX, fig. 6 przedstawia profil wartości pH w zależności od uwalnianego azotynu z inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z RDX i spontanicznej hydrolizy RDXm, fig. 7 przedstawia azotyn i formaldehyd uwolniony podczas przebiegu inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z RDXm, zaś fig. 8 przedstawia azotyn uwolniony z inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z różnymi materiałami wybuchowymi, zawierającymi azotyn.

Przykład 1

1. Wytwarzanie ekstraktu komórkowego o aktywności enzymatycznej z bakteryjnego szczepu Rhodococcus rhodochrous 11Y

Rhodococcus rhodochrous 11Y wyizolowano stosując techniki standardowe w stanie techniki, z próbek zebranych z naturalnego źródła przez wzbogacenie RDX jako źródłem azotu.

Rhodococcus rhodochrous 11Y hodowano w 1 litrze medium składającego się z 2,17 g/1 Na₂HPO₄ i 1,325 g/1 KH₂PO₄ o wartości pH 7,0, zawierającego 0,4% glukozy (wag/obj), pierwiastki śladowe (jak opisano przez Pfenig'a i Lipperfa w Arch. Microbiology, 196, 55, 726-739) i bądź 1 mM RDX albo 6 mM NH₄C1. Kolby inkubowano w inkubatorze wstrząsowym przy 180 obr/min i temperaturze 30°C.

Otrzymano w ten sposób wolne od komórek ekstrakty z hodowli komórek. Komórki oddzielono przez wirowanie przy 10000 g w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C w wirówce Sorval RC-5C, wyposażonej w wirnik GS-3. Komórki ponownie zawieszono w 2 ml 50 mM buforu Tricine (pH 8,0) na gram wilgotnych komórek. Komórki zniszczono działaniem ultradźwięków w MSE Soniprep (Fisons, Instruments, FSA Ltd.) stosując 6 x 12 pm impulsów w ciągu 15 sekund, na przemian z 30 sekundowym chłodzeniem w topniejącym lodzie. Szczątki komórek i nieuszkodzone komórki usunięto przez wirowanie przy 13 000 g w ciągu 1 minuty w temperaturze 4°C w mikro wirówce (Sigma). Supematant użyto jako ekstrakt wol189 424 ny od komórek. Frakcję membranową otrzymano z wolnego od komórek ekstraktu przez ultrawirowanie przy 109 000 g w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C (wirnik Beckman Optima TLX Ultracentrifuge TLA 45), osad przemyto i resuspendowano w 50 mM buforu Tricine (pH 8,0) do stężenia 2 mg/ml białka.

2. Chemikalia

RDX był najwyższej czystości, a inne o stopniu czystości „do analizy”, i jeśli nie podano inaczej, były otrzymane z BDH Ltd. (Poole, UK), Sigma Chemical Company Ltd. (Poole, UK) lub Aldrich (Gillingham, UK).

3. Próby

Degradacja RDX

Degradację RDX określano przez monitorowanie zanikania RDX drogą HPLC w 50 mM Tricine (pH 8,0), zawierającego RDX (50 mM, końcowe stężenie), 5 mM DTT i 40 (ii wolnego od komórek ekstraktu lub frakcji membranowej w końcowej objętości 1 ml.

Alternatywnie degradację RDX obserwowano monitorując uwalnianie azotynu przy użyciu odczynnika Griess'a (Rosenblatt, Burrows, Mitchell and Partner, 1991; „Organie Explosives and Related Compounds” w Handbook of Enviromental Chemisatry 3 (G), wydane przez O. Hutzinger'a Springer-Verlag). Próbę prowadzono jak opisano wyżej. Dodano kwas sulfanilowy (0,6 mM, końcowe stężenie) i pozostawiono na 15 minut, następnie dodano N-lnaftyloetyleno-diaminę (0,4 mM, końcowe stężenie) i po 5 minutach powstałe zabarwienie mierzono spektrofotometrycznie przy 540 nm.

Białko

Białko badano rutynowo metodą Brandford'a wiązania barwnika Coomassie [Anal. Biochem. (1976), 72, 248-254], stosując dostępny w handlu odczynnik i standard albuminy surowicy bydlęcej (Pierce Ltd., otrzymane przez Life Science Labs Ltd, Luton). Próbki (20 pl), zawierające 0,2 -1 mg białka/ml dodano do 1 ml odczynnika i pozwolono na przebieg reakcji w ciągu 5 minut w temperaturze pokojowej przed odczytaniem absorbancji przy 595 nm wobec samego buforu (20 ul) plus odczynnik (1 ml). Porównanie ze standardową krzywą standardowych wartości (0-1 mg/ml) pozwoliło na wyliczenie stężenia białka w próbce.

4. Wyniki

Degradacja RDX

Surowy ekstrakt inkubowano w temperaturze 30°C z 50 mM Tricine, zawierającego 50 pM RDX i 5 mM DTT w przedziale czasów od 0 do 60 minut. Stężenie RDX określano drogą HPLC. Stwierdzono, że stężenie RDX zmniejszało się.

Frakcję membranową inkubowano w temperaturze 30°C z 50 mM Tricine, zawierającego 50 pM rDx i 5 mM DTT w przedziale czasów od 0 do 60 minut. Stężenia RDX określano drogą HPLC. Stwierdzono, że stężenie RDX zmniejszało się z upływem czasu.

Wytwarzanie azotynu

Surowy ekstrakt inkubowano w temperaturze 30°C z 50 mM Tricine, zawierającego 50 pM RDX i 5 mM DTT w przedziałach czasu od 0 do 60 minut. Stężenia azotynu mierzono przy użyciu odczynnika Griess'a. Zauważono, że stężenia azotynu wzrastały, jak pokazano na rysunku fig. 1.

Dodawanie któregokolwiek kofaktora NADH, NADPH, PES lub FAD nie wpływało na ilość wytwarzanego azotynu, wskazując na aktywność enzymatyczną, niezależną od zubożającego kofaktora.

Frakcja membranowa inkubowana z 50 pM RDX w temperaturze 30°C też wytwarzała azotyn. Solubilizacja tej aktywności była możliwa przy pomocy 5% trytonu.

Przykład 2

Komórki szczepu R. rhodochrous 11Y hodowano na pożywce składającej się z 2,17 g/l Nu2HPO₄ i 1,325 g/l KH2PO4, pH 7,0, z 0,4% (w/o) glukozy, 6 mM atomów azotu i pierwiastkami śladowymi (Pfennig & Lippert, jak wyżej). Hodowle inkubowano w temperaturze 30°C w obrotowej wstrząsarce przy 170 obr/min.

Całe komórki 11Y zebrano przez odwirowanie późniejszej fazy wykładniczej hodowli przy 7000 g w ciągu 10 minut w wirówce Sorvall RC5C z użyciem wirnika GS3. Komórki

189 424 przemyto i zawieszono w 50 mM Tricine o pH 8 do stężenia 0.5 g/ml wilgotnego ciężaru komórek.

Degradację RDX podczas inkubacji całych komórek 11Y badano w 50 mM Tricine o pH 8. zawierającego RDX (300 μΜ stężenie końcowe) i 10 μΜ całych komórek w końcowej objętości 1 ml. Zanikanie RDX monitorowano przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej (TLC) z detekcją przy użyciu odczynnika Gricss'a (Rosenblatt i in. jak wyżej). Alternatywnie wytwarzanie formaldehydu monitorowano stosując standardową próbę spektrofotometryczną; 500 μΐ próbkę zmieszano z 500 μl odczynnika formaldehydowego (20 mM acetyloacetonu. 2 mM octanu amonu i 50 mM kwasu octowego) (Nash, 1953, Biochemical Journal, Vol. 55, str. 416). Następnie próbkę inkubowano w temperaturze 58°C w ciągu 10 minut i tworzenie się żółtego zabarwienia mierzono przy 418 nm z użyciem spektrofotometru z układem diodowym. Do wykreślenia krzywej kalibracyjnej zastosowano znane stężenia formaldehydu (od 1 do 500 μΜ).

Próbki całych komórek inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 12 godzin. Stwierdzono wzrastanie stężenia azotynu jak pokazuje fig. 2. Fig. 2 pokazuje, że wzrosło też stężenie formaldehydu.

Całe komórki rozdrobniono w krzywikowej prasie komórkowej z użyciem ΜinikoΜÓrki przy ciśnieniu 74,3x10⁵ N/m² (11 000 psi). Szczątki komórek i nie zniszczone komórki oddzielono przez wirowanie przy 13 000 obr/min w ciągu 1 minuty w temperaturze 4°C w mikrowirówce, stosując supernatant jako surowy ekstrakt komórek.

Aktywność degradacji RDX i wytwarzania azotynu surowego ekstraktu badano następująco: próbę przeprowadzano w 50 mM buforu Tricine o pH 8,0, zawierającego RDX (50 μM końcowe stężenie), 5 mM DTT i 40 μΐ surowego ekstraktu w końcow-ej objętości 1 ml. Degradację RDX określano przez monitorowanie zanikania RDX drogą chromatografii cienkowarstwowej z użyciem odczynnika Griess'a do wykrywania. Do pomiaru wytworzonego azotynu strącono białka przez dodanie 2 μl lodowatego kwasu octowego i następne oddzielenia przez wirowanie w mikrowirówce (5 minut, 13 000 obr/min). Na azotyn przeprowadzono standardową reakcję Griess'a. Obserwowano degradację RDX i wytwarzanie zanieczyszczającego azotynu.

Subkomórkową frakcję osiągnięto przez ultrawirowanie surowego ekstraktu przy 109 000 g w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C (Ultrawirówka Beckman Optima TLX z wirnikiem TLA45), gdzie supernatant reprezentuje rozpuszczalne białka, a osad frakcję membranową. Osad przemyto i przed badaniem aktywności ponownie zawieszono w 50 mM buforu Tricine o pH 8,0 do stężenia 2 mg/ml białka.

Zdolność degradowania RDX obserwowano w obu frakcjach z większością we frakcji membranowej.

Ekstrakt komórkowy wykazujący enzymatyczną aktywność degradowania RDX w rozpuszczalnym białku oczyszczono częściowo na kolumnie Q-sepharose, stosując 50 mM buforu Tris o pH 8,5 i gradient soli 0 - 2M NaCl. Eluowano białko jako pojedynczy- pik przy około 350 mM chlorku sodu. Częściowo oczyszczone białko okazało się trwałe termicznie i denaturowało się w 6M mocznika, ale odbudowywało strukturę po rozcieńczeniu do 2M mocznika.

Przykład 3

1. Hodowla Rhodococcus rhodochrous i częściowe oczyszczanie enzymu

161 Rhodococcus rhodochrous 11Y hodowano w 20 mM KH2PO4, 0,4% (w/w) glukozy, 2 m1 pierwiastków śladowych (Pfennig & Lippert, jak wyżej) i 1 mM RDX jako jedyne źródło azotu w temperaturze 30°C. Komórki namnażano w 21 kolbach i zbierano przez wirowanie, gdy tylko osiągnęły stacjonarną fazę wzrostu, w wirówce Sorvall RC5C stosując wirnik GS3 przy 10000 g w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Osad komórek (57 g wilgotnego ciężaru komórek) ponownie zawieszono w 120 ml 50 mM Tris o pH 8,0. Zawiesinę homogenizoowano w krzywikowej komorze ciśnieniowej pod ciśnieniem 241xl0⁵ N/m2 (35 000 psi) (trzy przejścia) z następnym wirowaniem (wirówka Sorvall RC5C z użyciem wirnika SS-34 przy 30 000 g w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C), zbierając wszelkie resztki komórek. Supernatant oddzielono i wirowano powtórnie (ultrawirówka Beckman XL-90 z użyciem wirnika Ti-70 przy 25 000 g w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C), zbierając membrany bakteryjne. Stwierdzono, że zarówno supematanty jak i osady posiadają zdolność degradowania RDX z uwalnia189 424 niem azotynu, co potwierdzono próbą Griess'a. Supernatant z etapu wirowania z dużą szybkością użyto do dalszego oczyszczania.

Wartość pH supematantu zredukowano do 3,5 lodowatym kwasem octowym i inkubowano próbkę na lodzie w ciągu 30 minut. Stwierdzono, że około 60% białka z supemantantu z wirowania z dużą szybkością uległa agregacji i została oddzielona przez, dalsze wirowanie (wirówka Sorvall RC5C z użyciem wirnika SS-34 przy 30 000 g w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C). Wartość pH supematantu przesunięto do 8,0 stosując IM wodorotlenek sodu, a ekstrakt badano na uwalnianie azotynu z RDX jak opisano w przykładzie 1. Stwierdzono, że większość (około 75%) enzymu pozostała rozpuszczalna po poddaniu działaniu lodowatym kwasem octowym. Tę próbkę użyto do wszystkich następnych prób.

2. Wymagania wobec substratów

Stosując częściowo oczyszczone białko badano wymagania w odniesieniu do kofaktorów. Stwierdzono, że kofaktory takie jak NADPH czy NAHD nie są potrzebne. Zależność degradacji RDX od stężenia ditiotreitolu (DTT) badano następująco:

(ig częściowo oczyszczonego białka inkubowano w obecności 4M mocznika, 0,3 mM RDX, 50 mM Tricine o pH 8,5 w temperaturze 37°C w ciągu 10 minut. Stężenie DTT zmieniano, utrzymując końcową objętość 200 pl. Uwolnioną ilość azotynu mierzono stosując badanie spektrofotometryczne opisane w przykładzie 1. Uwolnioną ilość azotynu przy stężeniu DTT pokazuje fig. 3. Pokazano, że obecności około 3 mM DTT jest potrzebna do osiągnięcia maksimum aktywności. DTT stosuje się do utrzymania środowiska redukcyjnego po rozbiciu komórek

3. Rozpuszczalność i stabilność

Zatężenie roztworu częściowo oczyszczonego enzymu przy użyciu jednostki ultrafiltracyjnej Amocon [membrana 3 kDa, ciśnienie 0,5x10⁵ N/m² (70 psi), w temperaturze 4°C] prowadzi do agregacji białka i zmniejszenia aktywności. Stwierdzono, że zagregowane białko może być ponownie rozpuszczone w 8M moczniku, 5 mM DTT i 50 mM Tris o pH 8,0 i zostaje przywrócona jego aktywność.

Trwałość ekstraktu wykazującego aktywność enzymatyczną w obecności silnie denaturujących środków mierzono w próbie uwalniania azotynu z RDX w obecności próbki białka z mocznikiem czy chlorowodorkiem guanidyny. Warunki próby były następujące: 50 mM Tricine o pH 8,5, 0,3 mM RDX, 5mM DTT w temperaturze 37°C w ciągu 10 minut z 26 pg białka; mierzono uwalnianie azotynu w próbie spektrofotometrycznej, opisanej w przykładzie 1. Zależność aktywności wobec RDX od stężenia denaturanta pokazuje fig. 4.

Można zauważyć, że enzym wykazuje niezwykłą stabilność w obecności wysokich stężeń denaturantów. Różnica obserwowanej aktywności z mocznikiem, który działa głównie przez rozerwanie wiązań wodorowych i hydrofobowe współdziałanie w obrębie białka, oraz z chlorowodorkiem guanidyny, który głównie przerywa jonowe oddziaływania i w mniejszym stopniu oddziaływania hydrofobowe, sugeruje, że oddziaływania jonowe mogą odgrywać większą rolę w stabilizowaniu enzymatycznej aktywności.

Ponieważ aktywność degradowania RDX była zwiększona przez obecność mocznika, wszystkie dalsze próby prowadzono w obecności 4M mocznika.

W celu określenia trwałości cieplnej enzymatycznej aktywności częściowo oczyszczonego białka, próbki ogrzewano w temperaturze 100°C, a pobierano próbki w różnych przedziałach i badano w ciągu 10 minut z 20 μ.1 gotowanej próbki, 50 mM Tricine o pH 8,5, 4 M mocznika, 5 mM DTT i 0,3 mM RDX w temperaturze 37°C. Uwalnianie azotynu mierzono spektrofotometrycznie, a wyniki przedstawiono na fig. 5.

Widać, że enzymatyczna aktywność jest stosunkowo trwała wobec temperatury, tracąc jedynie około 20% aktywności po 10 minutach w temperaturze 100°C.

Profil wartości pH

Badano profil wartości pH częściowo oczyszczonego ekstraktu. Warunki prób były następujące: 50 mM odpowiedniego buforu, 4 M mocznika, 0,3 mM RDX i 5 mM DTT. Próbki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 10 minut z 26 |ig częściowo oczyszczonego białka. Alkaliczną hydrolizę 0,3 mM RDX mierzono również w identycznych warunkach, a wyniki

189 424 przedstawiono na fig. 6. Jak widać enzymatyczna aktywność znacząco zwiększa uwalnianie azotynu z RDX w porównaniu ze spontanicznym rozkładem w związku z pH.

5. Wytwarzanie azotynu i formaldehydu

Wytwarzanie azotynu i formaldehydu z enzymatycznego rozkładu RDX badano w 50 mM Tricine o pH 8,5, 4 M mocznika, 0,15 mM RDX i 5 mM DTT w temperaturze 37°C z 26 pg częściowo oczyszczonego ekstraktu, a ilość uwolnionego azotynu i wytworzonego formaldehydu mierzono w czasie stosując standardową próbę spektrofotometryczną, opisaną w przykładzie 1. Wyniki przedstawiono na rysunku fig. 7. Ilości formaldehydu i azotku uwolnionego z RDX były podobne, co sugerowało, że mechanizm enzymatycznego rozkładu RDX może być podobny do proponowanego dla hydrolizy alkalicznej RDX (Croce and Okamoto, 1978, Journal of Organie Chemistry, Vol. 44, strony 2100-2103; Heilmann i in., 1996, Environmental Science Technology, Vol. 30, nr 5, str. 1485-1492), gdzie usunięcie grupy azotynowej z RDX tworzy nietrwały produkt pośredni, który spontanicznie rozkłada się, dając szereg mniejszych cząsteczek włączając formaldehyd.

6. Specyficzność materiału wyjściowego

Badano specyficzność materiału wyjściowego poddając testowaniu aktywność enzymatyczną degradowania HMX lub PENT, obu materiałów wybuchowych zawierających azotyn. Próby prowadzono w 50 mM Tricine, 4 M mocznika, 0,3 mM odpowiedniego materiału wybuchowego i 5 mM DTT w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut z 26 |ig częściowo oczyszczonego ekstraktu, a wyniki porównano z RDX. Wyniki przedstawiono na rysunku fig. 8. Jak widać enzymatyczna aktywność działała wobec wszystkich badanych materiałów wybuchowych, ale z wyraźną preferencją (to znaczy większą aktywnością) wobec RDX.

189 424

UWOLNIONY AZOTYN (n moli) UWOLNIONY AZOTYN (n moli)

PH

189 424

Fig.8.

189 424

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous określony jako „11Y” i zdeponowany jako NCIMB 40820 oraz jego mutanty posiadające aktywność enzymatyczną degradującą heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazynę (RdX).
2. Ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną, znamienny tym, że katalizuje uwalnianie azotynu z heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) i pochodzi z komórek szczepu Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820 określonego w zastrz. 1 albo jego mutanta.
3. Sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego posiadającego enzymatyczną aktywność degradującą RDX określonego w zastrz. 2, znamienny tym, że hoduje się szczep Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820' określony w zastrz. 1 albo jego mutanty, a następnie rozrywa się komórki i wydziela ekstrakt komórkowy.
4. Sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), znamienny tym, że próbkę poddaje się działaniu ekstraktu komórko wego posiadającego aktywność enzymatyczną degradującą RDX określonego w zastrz. 2 i wykrywa się azotyn wytworzony w tej próbce.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że azotyn wykrywa się kolorymetrycznie.
6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą RDX wytwarza się sposobem określonym w zastrz. 3, przy czym dodatkowo do próbki dodaje się ditiotreitol.
7. Sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), znamienny tym, że próbkę poddaje się działaniu ekstraktu komórkowego posiadającego aktywność enzymatyczną, degradującą RDX określonego w zastrz. 2 i wykrywa się formaldehyd wytworzony w tej próbce.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że formaldehyd wykrywa się kolorymetrycznie.
9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą RDX wytwarza się sposobem określonym w zastrz. 3, przy czym dodatkowo do próbki dodaje się ditiotreitol.
10. Czujnik biologiczny do wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5triazyny (RDX), znamienny tym, że zawiera środki do kontaktowania próbki z ekstraktem komórkowym posiadającym enzymatyczną aktywność degradującą RDX opisanym w zastrz. 2 i do utrzymywania próbki w warunkach odpowiednich dla enzymatycznej degradacji zanieczyszczenia oraz środki do wykrywania występowania reakcji heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5triazyny (RDX) katalizowanej przez ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) w próbce.
11. Czujnik biologiczny według zastrz. 10, znamienny tym, że środki do wykrywania wystąpienia reakcji stanowią środki do wykrywania zmiany kolorymetrycznej.
12. Czujnik biologiczny do wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5triazyny (RDX), znamienny tym, że zawiera środki do szczepienia próbki hodowlą izolatu bakteryjnego Rhodococcus rhodochrous opisanego w zastrz. 1 i do utrzymywania próbki w warunkach odpowiednich do degradacji zanieczyszczenia przez izolat oraz środki do wykiwania wystąpienia reakcji heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) katalizowanej przez izolat w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) w próbce.

189 424
13. Czujnik biologiczny według zastrz. 12, znamienny tym, że środki do wykrywania wystąpienia reakcji stanowią środki do wykrywania zmiany kolorymetrycznej.
14. Sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez heksahydro-1,3,5trinitro-l,3,5-triazynę (RDX), znamienny tym, że dodaje się do środowiska ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną degradującą RDX opisany w zastrz. 2 i utrzymuje się mieszaninę w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia do momentu degradacji obecnej w materiale heksahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazyny.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że podczas utrzymywania mieszaniny w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia dodaje się do mieszaniny ditiotreitol.