CZ297326B6

CZ297326B6 - Zkrácený neurotrofní faktor odvozený z gliové bunecné linie, zpusob jeho výroby, polynukleotid kódující zkrácený GDNF proteinový produkt, vektor obsahující tento polynukleotid, prokaryotická a eukaryotická hostitelská bunka transformovaná nebo transf

Info

Publication number: CZ297326B6
Application number: CZ0088298A
Authority: CZ
Inventors: Sylvia Hu@Shaw-Fen
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1996-09-16
Publication date: 2006-11-15
Also published as: JP2010279360A; HUP9802262A2; US20110251267A1; HU226220B1; JPH11512709A; DE69635675T2; AU7074696A; ATE314389T1; ES2255713T3; UA66339C2; IL144018A0; AU707528B2; SI0920448T1; IL144488A; SK288094B6; EP0920448A1; DE69635675D1; JP4909843B2; IL123761A; HK1021823A1

Abstract

Resení se týká nových proteinu, oznacovaných jakoupravené proteiny neurotrofního faktoru odvozeného z gliové bunecné linie (upravené GDNF proteiny),které podporují dopaminovou spotrebu dopaminergickými bunkami a podporují prezití nervových bunek. Rovnez se týká zpusobu získání upravených GDNF proteinu rekombinantními genetickými technikami genového inzenýrství, polynukleotidu kódujícího zkrácený GDNF proteinový produkt, vektoru obsahujícího tento polynukleotid, prokaryotické a eukaryotické hostitelské bunky transformované nebo transfektovanétímto polynukleotidem a farmaceutické kompozice obsahující zkrácený GDNF proteinový produkt.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká proteinů, zde označovaných jako neurotrofní faktory odvozené z gliové buněčné linie (rovněž označované jako neurotrofní faktory odvozené z glie nebo GDNF), které jsou charakteristické schopnosti podporovat dopaminovou spotřebu dopaminergickými neurony a podporovat přežití neuronů, které umírají při Parkinsonově chorobě. Vynález se zejména týká nových zkrácených GDNF proteinů, způsobu jejich výroby, polynukleotidu kódujícího zkrácený GDNF proteinový produkt, vektoru obsahujícího tento polynukleotid, prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky transformované nebo transfektované tímto polynukleotidem a farmaceutické kompozice obsahující zkrácený GDNF proteinový produkt.

Dosavadní stav techniky

Neurotrofní faktory jsou proteiny, které se nachází v nervovém systému nebo v ne-nervových tkáních inervováných nervovým systémem, jejichž funkcí je podporovat přežití a udržení fenotypické diferenciace nervových a/nebo gliových buněk (Varon a kol., Ann. Rev. Neuroscience 1:327, 1979; Thoenen a kol., Science 229:238, 1985). Díky této fyziologické roli mohou být neurotrofní faktory užitečné při léčení degenerace nervových buněk a ztrátě diferencované funkce, ke kterým dochází při různých neurodegenerativních onemocněních.

Aby mohl být příslušný neurotrofní faktor úspěšně použit při léčení nervových poruch, musí být příslušná třída(y) poškozených nervových buněk citlivá(é) na tento faktor. Různé neurotrofní faktory zpravidla ovlivňují přesně odlišené třídy nervových buněk. Je tedy výhodné k dispozici více různých diferenčních neurotrofních faktorů pro ošetření jednotlivých tříd poškozených neuronů, které se mohou vyskytovat u různých forem onemocnění nebo poškození.

Neurotrofní faktory mohou chránit citlivé neurony před celou řadou různých, vzájemně spolu zcela nesouvisících, poškození. Nervový růstový faktor (NGF) bude například chránit podstatnou část senzorických neuronů před smrtí způsobenou přerušením jejich axonálních procesů (Rich a kol., J. Neurocytol 16:261, 1987; Otto a kol., J. Neurosci. 83:156, 1987), před ontogenetickou smrtí během embryonálního vývoje (Hamburger a kol., J. Neurosci. 4:767, 1984) a před poškozením, způsobeným podáním taxolu nebo cisplatiny (Apfel a kol., Ann. Neurol. 29:87, 1991). Tato zjevná generalita proteinu vede k závěru, že pokud neurotrofní faktor chrání citlivé neurony před experimentálním poškozením, může být rovněž použit při léčení chorob, jejichž součástí je poškození těchto neuronů u pacientů i v případech, kdy je etiologie neznámá.

Daný neurotrofní faktor kromě toho, že je správně neuronově specifický, musí být dostupný v dostatečném množství, aby mohl být použit v rámci farmaceutického léčení. Vzhledem k tomu, že neurotrofní faktory se ve tkáních vyskytují zpravidla v malých množstvích (například Hofer a Barde Nátuře 331:261, 1988; Lin a kol., Science 246:1023, 1989), by bylo nepohodlné připravovat farmaceutická množství neurotrofních faktorů přímo ze zvířecích tkání. Pro přípravu větších množství požadovaného proteinu je vhodnou metodou použití rekombinantního expresního faktoru.

Lin a kol. již dříve popsal způsob prohledávání neurotrofní aktivity biologických vzorků na embryonálních prekurzorech dopaminergických neuronů černé hmoty (viz patent US 08/182,183, podaný 23. května 1994 a jeho patentové přihlášky; PCT/US92/07888, podaný 17. září 1992 (WO 93/06116); a Evropská patentová přihláška EP 610 264. Tento biologický test lze použít pro identifikaci neurotrofních faktorů, které by bylo možné použít při léčení Parkinsonovy choroby

-1 CZ 297326 B6 (Friedman a kol. Neuro. Sci. Lett. 79:65-72, 1987) jako choroby, která je charakteristická degenerací dopaminergických neuronů ve středním mozku, který inervuje žíhané tělísko.

Lin a kol. dále uvádí charakteristiku neurotrofního faktoru, který se purifikoval z jednoho takového zdroje, konkrétně z kondiciovaného kultivačního média, glioblastomové buněčné linie B49 (Schubert a kol., Nátuře 249:224-27, 1974). Již dříve bylo publikováno, že kondiciované médium z této buněčné linie má dopaminergickou neurotrofní aktivitu (Bohn a kol., Soc. Neurosci. Abs. 15:277, 1989). Před uvedením studie Lina a kol. Nebyl neurotrofní faktor, odvozený z gliové buněčné linie (GDNF), identifikován jako diskrétní biologicky účinná látka ani izolován jako v podstatě čistý protein. Kromě toho Lin a kol. popsal způsoby klonování lidských genů kódujících GDNF, nukleokyselinovou sekvenci lidských genů, které kódují GDNF a aminokyselinové sekvence GDNF proteinu. GDNF gen se nakloňoval do expresního vektoru a tento vektor se použil pro expresi biologicky účinného GDNF. GDNF protein je homodimerem tvořeným dvěma 134 aminokyselinovými, 22 kDa, jednotkami vzájemně spojenými disulfídovou vazbou. Popis dále zahrnuje použití GDNF při prevenci a léčení nervových poškození a nemocí souvisejících s nervovým poškozením, například Parkinsonovy choroby.

GDNF terapie je účinná při léčení nervového poškození způsobeného podmínkami, které ohrožují přežití a/nebo správnou funkci jednoho nebo více typů nervových buněk. Takové nervové poškození může mít celou řadu různých příčin. Nervové poškození, ke kterému může dojít u jednoho nebo více typů nervových buněk, může být způsobeno (1) fyzickým poškozením, které způsobí degeneraci axonálních procesů a/nebo nervových buněčných těl v blízkosti místa poškození; (2) dočasným nebo trvalým přerušením proudění krve do části nervového systému, například při mrtvici; (3) cíleným nebo náhodným vystavením neurotoxinů, například vystavením chemoterapeutickým látkám (například cisplatině) v rámci léčení rakoviny nebo dideoxycytidinu (ddC) při léčení AIDS; (4) chronickým onemocněním metabolizmu, například cukrovkou nebo jatemí dysfunkcí; nebo (5) neurodegenerativními chorobami, například Parkinsonovou chorobou, Alzheimerovou chorobou a amyotrofní laterální sklerózou (ALS), jejichž výsledkem je degenerace specifických neuronových populací.

GDNF terapie by mohla být využita zejména při léčení neurodegenerativních stavů, jejichž součástí je degenerace dopaminergických neuronů černé hmoty, například při léčení Parkinsonovy choroby. Pouze tato ošetření Parkinsonovy choroby mají paliativní účinek, zaměřující se na zvýšení hladiny dopaminu v žíhaném tělísku. Očekávaným účinkem GDNF terapie není jen zvýšení dopaminergické neurotransmise na dopaminergických nervových zakončeních v žíhaném tělísku, ale rovněž pozvolné snížení nebo dokonce zastavení rozvoje degenerativních procesů a regenerace poškozené nigrostriatální dráhy a obnova její funkce. GDNF může být rovněž použit při léčení dalších forem poškození nebo při zlepšení funkce dopaminergických nervových buněk u lidských pacientů. K těmto poškozením nebo nesprávným funkcím může docházet při schizofrenii a dalších formách psychózy. Pouze GDFN terapie, použitá v případě těchto chorobných stavů, je symptomatická a využívá účinné látky, které působí na dopaminové receptory nebo místa spotřeby dopaminu a současně zlepšují funkci dopaminergických neuronů, které inervují ty receptory nesoucí neuronové populace, které se podílí na chorobných procesech.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje nové proteinové produkty na bázi zkráceného neurotrofního faktoru odvozeného z gliové buněčné linie (GDNF). U jednoho provedení vynálezu jsou zkrácené GDNF proteiny připravovány rekombinantními technikami genového inženýrství. U alternativního provedení se zkrácené GDNF proteiny syntetizují chemickými technikami nebo kombinací rekombinantních a chemických technik.

Zkrácené GDNF proteinové produkty podle vynálezu zahrnují proteiny reprezentované aminokyselinovou sekvencí X-[Cys⁴¹-Cys’³³]-Y. Očíslované schéma aminokyselinových zbytků,

-2CZ 297326 B6 znázorněné na obr. 1 (SEQ ID NO: 2), má usnadnit srovnání se zralým GDNF proteinem.

[Cys⁴'-Cys¹³³] reprezentuje aminokyselinovou sekvenci Cys⁴¹ až Cys¹³³, jak ukazuje obr. 1 (SEQ

ID NO:2). Y znamená koncovou karboxylovou skupinu Cys¹³³ nebo karboxylový koncový aminokyselinový zbytek lle¹³⁴. X znamená methionylovou nebo nemethionylovou aminoskupinu

Cys⁴¹ nebo aminokyselinový zbytek (zbytky) N-konce, zvolené ze skupiny:

G

RG

NRG
		KNRG	(SEQ1DNO:3)
		GKNRG	(SEQ ID NO:4)
		RGKNRG	(SEQ ID NO:5)
		QRGKNRG	(SEQ ID NO;6)
		GQRGKNRG	(SEQ ID NO:7)
		RGQRGKNRG	(SEQ ID NO:8)
		RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:9)
	G	RRGQRGKNRG	(SEQIDNO:10)
	KG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:11)
	GKG	RRGQRGKNRG	(SEQ IDNO:12)
	RGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ IDNO-.13)
	SRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO;14)
	NSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQIDNO:15)
	ENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID N0:15)
	PENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO: 17)
	NPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:18)
	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:19)
A	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:20)
AA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:21)
AAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:22)
QAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:23)
RQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:24)
NRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:25)
RNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:26)
ERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:27)
RRRNRQřAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:28)
RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:29)
P RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:30)
LP RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:31)
VLP RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:32)

AVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:33)
MAVLP	?=.ERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQP.GKNRG	(SEQ ID NO:34)
QMAVLP	RREHNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO;3S)
KQbíAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RP.GQRGKNRG	(SEQ ID NO;36)
DKQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:37) s
PDKQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO;38)

Dá se předpokládat, že takto zkrácené GDNF produkty budou zahrnovat zkrácený GDNF protein, kteiý má aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou obecným vzorcem X-[Cys⁴¹-Cys^l33]-Y a jeho varianty nebo deriváty. Takže zkrácené GDNF produkty podle vynálezu budou rovněž zahrnovat adiční substituční a vnitřně deleční varianty a deriváty aminokyselinových sekvencí, reprezentovaných obecným vzorcem X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y. Zkrácené GDNF produkty budou dále zahrnovat methionylované nebo nemethionylované formy a stejně tak glykosylované a neglykosylované formy zkráceného GDNF proteinu.

Jako příklady zkrácených GDNF proteinů podle vynálezu lze uvést například [Arg^l6-Ile¹³⁴], [Asn²²-Ile¹³⁴], [Pro²³-Ile¹³⁴], [Ser²⁶-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴], [Gly³³-Ile¹³⁴], [Lys³⁷-Ile¹³⁴] a [Asn³⁸-Ile¹³⁴] zkrácené GDNF proteiny buď methylované, nebo nemethylované ajejich varianty a deriváty. Současně jsou výhodnými zkrácenými GDNF proteiny podle vynálezu například [Lys³⁷-Ile¹³⁴] a [Asn³⁸-Ile¹³⁴] zkrácené GDNF proteiny buď methylované, nebo nemethylované a jejich varianty a deriváty. Příkladnými substitučními variantami jsou [Asn ASer -Ile ] a [Pro²³-Lys³⁷AAsn³⁷-lle¹³⁴] zkrácené GDNF proteiny. Příkladnou adiční variantou je Ser-[Pro²³Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein.

U dalšího provedení vynálezu mohou být zkrácené GDNF proteiny připraveny v glykosylovaných nebo neglykosylovaných formách. Deriváty zkráceného DNF proteinu zpravidla zahrnují navázání GDNF proteinů na vodou rozpustný polymer. Zkrácený GDNF protein lze například konjugovat na jednu nebo více polyethylenglykolových molekul a snížit tím srážení zkráceného GDNF proteinového produktu ve vodném prostředí.

Vynález rovněž zahrnuje různé polynukleotidy kódující zkrácené GDNF proteiny. Tyto nukleokyselinové sekvence se zpravidla používají při expresi zkráceného GDNF v eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňce, přičemž expresní produkt nebo jeho derivát je charakteristický svou schopností zvyšovat spotřebu dopaminu dopaminergickými buňkami. Tyto polynukleotidy lze rovněž použít při buněčné nebo genové terapii. Mezi vhodné nukleokyselinové sekvence lze zahrnout ty sekvence, které jsou znázorněny na přiložených obrázcích a rovněž další degenerační sekvence a přirozeně se vyskytující alelové variace.

Vynález dále zahrnuje vektory obsahující nukleotidy, které kódují zkrácené GDNF proteiny a které jsou operativně spojeny s amplifikační a/nebo expresní kontrolní sekvencí. Jako prokaiyotické, tak eukaryotické hostitelské buňky mohou být stabilně transformovány nebo transfektovány těmito vektory s cílem exprimovat zkrácený neurotrofní faktor odvozený z glie. Vynález rovněž zahrnuje rekombinantní produkci zkráceného GDNF proteinu, při které se takto transformované nebo transfektované buňky nechají růst ve vhodném živném prostředí a zkrácený GDNF exprimovaný těmito buňkami se případně izoluje z hostitelských buněk a/nebo živného prostředí. Vynález dále zahrnuje použití polynukleotidů kódující zkrácený GDNF a vektorů obsahujících tyto polynukleotidy při genové nebo buněčné terapii.

Vynález rovněž poskytuje rekombinantně připravenou GDNF kompozici obsahující směs zralého GDNF proteinu a jednoho nebo více zkrácených GDNF proteinů, odvozených z této směsi, přičemž zralý GDFN protein má molekulovou hmotnost přibližně 44 kDa a zkrácený GDNF

-4CZ 297326 B6 protein má molekulovou hmotnost přibližně 36 až 40 kDa. GDNF kompozice může obsahovat alespoň dva zkrácené GDNF druhy, přičemž první druh má molekulovou hmotnost přibližně 36 kDa a druhý druh má molekulovou hmotnost 40 kDa. Zkrácené GDNF druhy, které mají molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa představují heterodimer GDNF monomeru majícího molekulovou hmotnost přibližně 22 kDa a zkráceného GDNF monomeru majícího hmotnost přibližně 18 kDa. Rovněž lze předpokládat, že z této směsi lze pro terapeutické použití izolovat jeden nebo více zkrácených GDNF druhů.

Další aspekt vynálezu zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující zkrácený GDNF produkt. Zkrácený GDNF proteinový produkt je zpravidla formulován společně s farmaceuticky přijatelným vehikulem. Pro usnadnění výroby, zlepšení skladování, manipulace, dopravy a/nebo účinnosti, lze použít celou řadu dalších formulačních materiálů. U dalšího provedení vynálezu produkty na bázi zkráceného GDNF proteinu zvyšují spotřebu dopaminu a zlepšují přežití dopaminergických neuronů. Produkty na bázi zkráceného GDNF proteinu jsou tedy vhodné zejména pro léčení poruch nervového systému způsobených poškozením nebo onemocněním, například Parkinsonovou chorobou.

Další aspekty a výhody vynálezu se stanou odborníkům v daném oboru zřejmějšími po prostudování následujícího podrobného popisu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 1) kódující zralý humánní neurotrofní faktor, odvozený z gliové buněčné linie (hGDNF). Obrázek rovněž znázorňuje aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:2) zralého humánního GDNF proteinu.

Obr. 2 znázorňuje diagram plasmidové konstrukce, vytvořené pro expresi rekombinantních zkrácených GDNF proteinů.

Obr. 3 znázorňuje restrikční mapu alternativní nukleokyselinové sekvence (SEQ ID NO:39) kódující GDNF a zkrácený GDFN polynukleotid.

Obr. 4 znázorňuje restrikční mapu ještě další nukleokyselinové sekvence (SEQ ID NO:40) kódující GDNF a zkrácený GDNF polynukleotid.

Obr. 5 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:41) kódující [Pro²³-Lys³⁷AAsn³⁷-Ile¹³⁴] zkrácenou GDNF proteinovou substituční variantu (SEQ ID NO:42). Tento protein může být rovněž označen jako Met-Ser-[Pro Lys AAsn -Ile ] zkrácená GDNF proteinová adičně substituční varianta.

Obr. 6 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:43) kódující [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein (SEQ ID NO:44).

Obr. 7 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:45) kódující [Gly³³-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein (SEQ ID NO:46).

Obr. 8 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci zralého hGDNF (SEQ ID NO:47) ve srovnání s několika příkladnými zkrácenými GDNF proteiny: Met-[Arg³²-Ile¹³⁴] (SEQ ID NO:48), Met-[Gly³³-Ile¹³⁴] (SEQ ID NO:49) a Met-Ser-[Pro²³-Lys³⁷AAsn³⁷-Ile¹³⁴] (SEQ ID NO:50).

Humánní neurotrofní faktor odvozený z gliové buněčné linie (hGDNF) se syntetizuje jako prekurzor, který se zpracovává a sekretuje jako zralý protein tvořený 134 aminokyselinami. Zjistilo se, že zralý humánní GDNF má aminokyselinovou sekvenci, která je znázorněna na obr. 1 (SEQ ID NO:2).

-5CZ 297326 B6

Vynález je založen na nečekaném zjištění, že velikost zralého GDNF proteinu lze redukovat (tento protein je zde označen jako „sestříný“ nebo „zkrácený“ protein nebo zkrácený GDNF protein) aniž by došlo ke ztrátě jeho biologické aktivity. Sestřižený protein byl prvně objeven během rekombinantní produkce GDNF v buňkách vaječníku čínského křečka (CHO). Stručně řečeno, rekombinantní humánní GDNF (rhGDNF) se připravil následujícím způsobem. Nukleokyselinová sekvence, kódující celý otevřený čtecí rámec zralého humánního GDNF proteinu, se nakloňovala do expresního plasmidu. Pomocí DNA sekvencování (jako ekvivalentu hGDNF sekvence v genové bance) se potvrdilo, že jde o správnou nukleokyselinové sekvence, která je identická s publikovanou sekvencí zralého humánního GDNF (Lin a kol., Science 260, 1130-1132, 1993). Plasmidová DNA se linearizovala a transfektovala do dihydrofolátreduktázodeficientních CHO buněk (CHOd~ buněk) pomocí metody jejíž podstatou je vysrážení fosforečnanu vápenatého. Transfektované buňky se kultivovaly v selektivním médiu a ty kolonie, které přežily selekční proces, se vybraly pro jednotlivé analytické studie hGDNF exprese.

Odebraná, séra prostá, kondiciovaná média z jednotlivých klonů se podrobila westernové blotové analýze, využívající antiséra, specifického pro hgGDNF. Antiséra zahrnovala králičí polyklonální protilátky, získané z těl králíků imunizovaných rekombinantní hGDNF exprimovaným v Escherichia coli. Za redukčních podmínek se hGDNF, který byl přítomen v těchto vzorcích, rozdělil do dvou hlavních pásů, které měly molekulové hmotnosti přibližně 22 kDa a 18 kDa. Každý pás byl tvořen těsně přilehlým vzájemně odsazeným dubletem, přibližně 22 + 22,5 kDa, resp. 18 + 17,5 kDa (pro zjednodušení budou tyto dublety označený jako 22 kDa a 18 kDa pásy nebo druhy).

GDNF, jak již bylo dříve zveřejněno, existuje jako disulfídem spojený homodimer, tvořený dvěma identickými jednotkami zralého GDNF proteinu, který má molekulovou hmotnost přibližně 20 až 22 kDa. Jak bylo dále zveřejněno, GDNF byl při analýze za neredukčních podmínek identifikován jako široký pás 32 až 42 kDa (Lin a kol., Science 260, 1130-1132, 1993) nebo 33 až 45 kDa (Lin a kol., J. Neurochem. 63(2), 758-768, 1994). Existence tohoto rozmezí byla interpretována jako důsledek heterogenity blykosylace na zralých monomerech, což se potvrdilo pomocí deglykosylačních experimentů.

Zatímco přítomný 22 kDa pás odpovídá zralému GDNF proteinu uváděnému v literatuře, informace o 18 kDa páru nebyly doposud publikovány. Relativní množství 22 kDa a 18 kDa proteinu se ve vzorcích odebraných z jednotlivých klonů lišila. Kromě toho se zjistilo, že i jednotlivé sklizně, odebrané ze stejného vzorku, vykazují různé poměry zmíněných dvou pásů. Rovněž se zjistilo, že skladování CHO-exprimovaného GDNF proteinu často vede ke zvýšení zastoupení 18 kDa pásu a současnému snížení zastoupení 22 kDa pásu.

Při analýze kondiciovaného média z transfektovaných CHOď buněk, za neredukčních podmínek pomocí Westernových blotů, bylo možné pozorovat tři dobře rozlišené pásy s molekulovými hmotnostmi 36, 40 a 44 kDa. Toto zjištění je rovněž v rozporu s předcházejícími zprávami. Relativní intenzita těchto pásů byla různá, ale korelovala s poměrem 22 a 18 kDa monomemích pásů, přítomných v každém vzorku. Další analýza pomocí monoklonálního aktiséru ukázala, že zmíněné tři pásy v neredukčním gelu odpovídající třem různým dimerům, tvořeným dvěma monomery. Největší 44 kDa protein je, jak již bylo uvedeno, dimerem, dvou 22 kDa přirozených GDNF proteinů. 40kDa proteinový meziprodukt tvoří dimer, u kterého se molekulová hmotnost jednoho ze zralých proteinů redukovala na 18 kDa formu. Nejmenší 36 kDa dimer, jak se zdá, obsahuje dva 18 kDa proteiny tj. u obou 22 kDa forem byla redukována molekulová hmotnost. Tato data poprvé demonstrují nejen přítomnost nové formy GDNF monomerů ale rovněž přítomnost sestřiženého GDNF proteinu v dimerové konfiguraci. Rovněž se zjistilo, že při skladování se monomemí složení vzorku posouvá směrem k sestřižené formě a odpovídá dimerovým druhům, tj. množství 36 kDa proteinů se, jak se zdá, zvýšilo.

-6CZ 297326 B6

Následně se provedly studie, které měly identifikovat, která část proteinu byla eliminována nebo změněna, aby došlo k redukci molekulové hmotnosti v porovnání se sekvencí již publikovaného zralého GDNF proteinu. Nejprve se ověřilo, že redukce molekulové hmotnosti není důsledkem změn glykosylace.

GDNF obsahuje dvě potenciální N-navázané glykosylační místa. Nicméně sestřižený protein není jednoduše neglykosylovanou nebo glykosylovanou formou zralého GDNF. To bylo demonstrováno na glykosylačních experimentech v rámci kterých se vzorky ošetřily N-glykanázou, O-glykanázou a neuraminidázou. Na redukčních gelech se 18kDa protein zredukoval na 13,5 kDa pás N-glykanázovou digerací, což ukazuje na přítomnost ekvivalence 4,5 kDa N-navázaného cukru. Ošetření neuraminidázou a O-glykanázou způsobilo, že 18 kDa pás se posunul mírně k 17 kDa. To naznačuje přítomnost O-vázaných cukrů na protein. Bylo publikováno, že zralý 22 kDa pás je glykosylován a N-glykanázou rovněž redukován na 18 kDa (tj. rovněž 4,5 kDa). To se dále potvrdilo použitím monoklonální protilátky, která je specifická pro 22 kDa pás na gelu. Glykanázový diferenční vzor neredukovaného dimeru byl komplikovanější ale interpretovatelný a odpovídá počátečnímu označení tří forem.

Takže 4,5 kDa redukce molekulové hmotnosti proteinu byla dále považována za důsledek delece přibližně 30 až 35 aminokyselinových zbytků a nikoli za důsledek změn v glykosylaci. Na základě následujících zdůvodnění se očekávalo, že kdeleci bude nej pravděpodobněji docházet na N-konci zralého GDNF proteinu. Zralý GDNF celkem obsahuje 7 cystinů. Pokud by došlo k deleci na karboxylovém konci, potom by se ztratily 2 až 4 ze sedmi cystinů, a to by pravděpodobně vedlo k inaktivaci proteinu. Nicméně při podrobení testovaného vzorku, tvořeného převážně sestřiženou formou biologického testu, zaměřeným na měření neurotrofní aktivity na dopaminergické neurony, tento vzorek vykazoval srovnatelnou účinnost se vzorkem, který obsahoval proporcionálně více zralé formy GDNF.

Místo rozštěpení se potom určilo na základě aminokyselinové sekvenční analýzy purifikovaného proteinu. Vzorky se sekvencovaly pomocí proteinového sekvenceru Applied Biosystems 499A v deseti cyklech, postupem doporučeným výrobcem. Analytické techniky a postupy využívající sekvencování aminokyselin jsou odborníkům v daném oboru známy a další popis sekvencování proteinů uvádí například Fausset a kol., v Electrophoresis 12:22-27, 1991 a evropská patentová přihláška EP 423 980, podaná 4. října 1990, s názvem „Stem Cell Factor“). Analýza určila, že N-konce sestřiženého proteinu byl „RGQRGK“ neboli Arg-Gly-Gln-Arg-Gly-Lys. Zralý protein se tedy v kondiciovaném médiu zbavil prvních 31 aminokyselin. Zbývající aminokyselinová sekvence sestřiženého proteinu, která začíná aminokyselinovou Arg³², jinak odpovídá aminokyselinové sekvenci zralého GDNF proteinu znázorněné na obrázku 1 (SE ID NO:2).

Test dopaminergických neuronů prokázal účinnost [Arg³²-Ile¹³⁴] zkráceného proteinu. Dopaminergický test neurotrofní aktivity se používá pro identifikaci neurotrofních faktorů, které by mohly být přínosem při léčení Parkinsonovy choroby. Základem tohoto testu je již popsaný test (Friedman a kol., Neuro. Sci. Lett. 79:65-72, 1987) a může zahrnovat modifikace, které popsal Lin a kol. (viz WO 93/06116; a Evropská patentová přihláška EP 610 254)). Podrobný popis testuje součástí níže uvedeného příkladu 5.

Následný purifikační postup, po kterém následovalo aminokyselinové sekvencování, vedl k objevení dalšího proteinu, ve kterém bylo odstraněno prvních 36 aminokyselinových zbytků z N-konce zralého GDNF: [Lys³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein sN-koncovou sekvencí KNRG(C)VL—. Zbývající aminokyselinové zbytky sestřiženého proteinu se jinak opět shodovaly se zbytky aminokyselinové sekvence zralého GDNF proteinu. [Lys³⁷-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein se rovněž analyzoval biotestem zaměřený na spotřebu dopaminu. Ukázalo se, že tento zkrácený GDNF protein je rovněž aktivní při ED50 přibližně 50 pg/ml, podobně jako purifikovaný rekombinantní E. coli exprimovaný zralý GDNF.

-7CZ 297326 B6

Rovněž se zjistilo, že bakteriálně exprimovaný zralý GDNF je možné převést na zkrácenou formu. Zralý GDNF, exprimovaný v transformovaných buňkách E. coli se inkuboval CHO-odvozeným kondiciovaným médiem. Rekombinantní E. coli GDNF měl zdánlivou molekulovou hmotnost 17 kDa a redukčním gelu. Jakmile se tento materiál smísil s kondiciovaným médiem CHO buněk a inkuboval 5 dní při 4 °C, zredukovala se molekulová hmotnost proteinu na 12,5 kDa. K v podstatě kompletnímu rozštěpení došlo po jednohodinové nebo dvacetičtyřhodinové inkubaci, z čehož vyplývá, že se za těchto podmínek jedná o časově závislý proces. Rovněž se ukázalo, že prostá inkubace rekombinantního E. coli GDNF médiem, obsahujícím 0,1% fetální bovinní sérum, prováděná přes noc, neposkytuje sestřiženou formu, takže se zdá, že přítomnost živých buněk v kultuře je pro realizaci sestřihu nezbytná. Je tedy možné, aby sestřih probíhal v určitých tkáních in vivo.

Rovněž se zjistilo, že deriváty zralého E. co/z-exprimovaného hGDNF, například pelylátovaného GDNF lze zpracovat do zkrácené formy v přítomnosti CHO-derivovaného kondiciovaného média. Zralý GDNF může být naN-konci pegylovaný s cílem krátit jeho clearační dobu v oběhu. Pegylace zvětšuje velikost proteinu, přičemž modifikovaný zralý MGDF migruje za redukčních podmínek přibližně na 45 kDa. Stejně jako u nepegylované zralé formy, poskytuje inkubace pegylovaného E. coli GDNR (netranfektovaným) kondiciovaným médiem CHO buněk 12,5 kDa pás. V obou případech byly 12,5 kDa druhy na neredukčních gelech přítomny ve formě dimeru spojeného disulfidovou vazbou. Generování této sestřižené formy zralého proteinu pegylovaného na N-konci dále naznačuje, že sestřih probíhá na N-konci proteinu, což vyplývá ze ztráty pegylovaného zbytku na konci sestřihu.

Z těchto zjištění a skutečností, že sestřih může rovně probíhat in vivo vyplývá, že může být sestřiženou formou GDNF proteinu může být zcela přirozeně zpracovaná forma hGDNF za fyziologických podmínek. Byly tedy zváženy výhody produkce zkráceného GDNF proteinu nebo jeho derivátu pro terapeutické použití. Dalo by se například očekávat, že přímo exprimovaný nebo syntetizovaný zkrácený GDNF protein, například [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein, bude rezistentní proti výše popsané proteolytické aktivitě. Kromě toho pokud by bylo žádoucí připravit GDNF derivát, například pegylovaný [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein, dalo by se očekávat, že jeho výhodou bude nepřístupnost pro specifický sestřih, který byl pozorován u zralého GDNF derivátu.

Od zkrácených GDNF produktů lze očekávat i další výhody. Hodnota pl zkráceného proteinu, například [Arg³²-Ile¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu, se bude snižovat přibližně z 10 na přibližně 8,0 až 8,5. To činí protein podstatně méně zásaditějším, což je výhodou, pokud jde o navázání receptoru, snížení cytotoxicity v místě podání, například v místě aplikace intratekální injekce. Další výhodou je, že úsek prvních dvaceti šesti aminokyselin aminokyselinové sekvence zralého GDNF má dvě amidační místa. Arg-Asn-Art (aminokyseliny 14-16) a Glu-Asn-Ser (aminokyseliny 24-26). Dá se očekávat, že absence jednoho nebo obou těchto míst v zkráceném GDNF proteinu bude zvyšovat stabilitu proteinu.

Zkrácené GDNF produkty

U základního provedení mohou být zkrácené GDNF proteiny podle vynálezu reprezentovány následující aminokyselinovou sekvencí, přičemž očíslované schéma aminokyselinových zbytků na obr. 1 se použije pro usnadnění srovnání s aminokyselinovou sekvencí zralého GDNF proteinu:

X-[Cys^4,-Cys¹³³]-Y ve kterém [Cys⁴¹-Cys¹³³] znamená aminokyselinovou sekvenci Cys⁴¹ až Cys¹³³, která je znázorněna na obr. 1 (SEQ ID NO:2);

Y znamená karboxylovou koncovou skupinu Cys¹³³ nebo karboxylový koncový aminokyselinový zbytek Ile¹³⁴; a

-8CZ 297326 B6

X znamená methionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys⁴¹ nebo N-koncový aminokyselinový zbytek(y) zvolený(é) ze skupiny:

	G P.G
			NRG
			KNRG	(SEQ ID NO;3)
			GKNRG	(SEQ ID NO:4)
			RGKNRG	(SEQ ID NO:5}
			QRGKNRG	(SEQ ID NO:6)
			GQRGKNRG	(SEQ ID NO;7)
			RGQRGKNRG	(SEQ ID NO:8)
			RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:9)
		G	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:1O)
		KG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:11)
		GKG	rrgorgknrg	(SEQ ID NO:12)
		RGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:13)
		SRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:14)
		NSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID N0:15)
		ENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID N0:16)
		PENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:17)
		NPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:18)
		ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:19)
	A	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:20)
	AA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ !D NO;21)
	AAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ !D NO:22)
	QAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:23)
	RQAAA	ANPENSRGKG	RF.GQ RG KNRG	(SEQ ID NO:24)
	NRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:2S)
	RNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:26)
	EPNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:27)
	ΚΞΡΝκ.ΟΑΑΑ	ANPENSRGKG	RxG Q RG KNRG	(SEQ ID NO:28)
	FR. Ξ RNRQ AAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:29)
P	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	P-RGQRGKNRG	(SEQ ID NO:30)
LP	RR E RNR Q AAA	ANPENSRGKG	RRGQP.GKNRG	(SEQ ID NO:31)
VLP	RREFNRQAAA	ANPENSRGKG	RRG Q P.G KNRG	(SEQ ID NO:32)
AVTiP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:33)
KAVL?	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:34)
QMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:35)
KQKAVLP	RREFNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:36j
□KQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:37) ε
POKQX.WL?	RRE RNRQ AAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:38)

Výraz „zkrácený GDNF protein produkt“, jak je zde použit, zahrnuje biologicky aktivní syntetické nebo rekombinantní zkrácené GDNF proteiny, zkrácené GDNF proteiny získané ze zralého

-9CZ 297326 B6

GDNF, varianty biologicky aktivního zkráceného GDNF (včetně inzerčních, substitučních a delečních variant) a jejich chemicky modifikované deriváty. Tento výraz rovněž zahrnuje zkrácené GDNF proteiny, které jsou v podstatě homogenní s humánním GDNF proteinem, majícím aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2.

Výraz „biologicky aktivní“, jak je zde uveden, znamená, že zkrácený GDNF protein demonstruje podobné neurotrofní vlastnosti, ale ne nezbytně všechny stejné vlastnosti a ne nezbytně stejnou měrou jako GDNF protein mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2. Volba konkrétních sledovaných neurotrofních vlastností závisí na zamýšleném konečném použití zkráceného GDNF proteinového produktu. Zkrácené GDNF proteinové produkty jsou biologicky aktivní a mají podobný vliv na přežití dopaminergických neuronů jako zralý GDNF protein, jak ukázalo hodnocení dopaminové spotřeby a tyrosinhydroxylázové (TH) exprese, tj. příkladný biologický test, který bude diskutován v níže uvedených příkladech.

Výraz „v podstatě homologický“, jak je zde uveden, označuje stupeň homologie s humánním GDNF majícím aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, která výhodně přesahuje 70 %, výhodněji 80 % a nej výhodněji 90 % nebo i 95 %. Procento homologie, jak je zde uvedeno, se vypočte jako procento aminokyselinových zbytků v menší ze dvou sekvencí, která je zarovnána s identickými aminokyselinovými zbytky sekvence, kterým odpovídá, pokud čtyři mezery v úseku o délce 100 aminokyselin napomohou tomuto zarovnání jak definuje Dayhoff a Atlas of protein Sequence and Structure sv. 5, str. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. V podstatě homologický je rovněž libovolný zkrácený GDNF protein, který lze izolovat pomocí křížové reaktivity s protilátkami GDNF SEQ ID NO:2 nebo jehož geny lze izolovat hybridizaci genem nebo segmenty genu kódujícího GDNF SEQ ID NO: 1.

Jak bude zřejmé odborníkům v daném oboru po přečtení předloženého popisu, v podstatě homologické proteiny budou zahrnovat alespoň jednu deleci, adici nebo substituci aminokyselinových zbytků zkráceného GDNF proteinu reprezentovaného X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y. Produkce těchto variant bude popsána níže. Dále bude zřejmé, že vzhledem ktomu, že je vynález zřejmě adresován „zkráceným GDNF proteinům“, budou N-koncové adiční varianty zahrnovat adici methioninového zbytku nebo ne-GDNF aminokyselinového zbytku nebo sekvence, ale nebudou zahrnovat adici aminokyselinového zbytku (zbytků), které by vedly k rekonstrukci zralého GDNF proteinu. Zkrácené GDNF proteiny na bázi přirozeně se vyskytujících alelických mutantů nebo variant budou rovněž spadat do rozsahu vynálezu. Výroba variant GDNF proteinu bude podrobněji popsána níže.

Lin a kol.

popisuje úpravu zralého GDNF na karboxylovém konci, realizovanou proteolytickým zpracováním Lys-Arg zbytků, které tvoří šestý, resp. pátý zbytek od karboxylového konce zralého GDNF (tj. Lys -Arg podle očíslování aminokyselinových zbytků na obr. 1 (stejně tak v SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:2)). Taková úprava by mohla eliminovat dva cysteinové zbytky za zralého GDNF proteinu. To by mělo pravděpodobně za následek nesprávné sbalení proteinu a tedy vytvoření inaktivního proteinu. Na druhé straně si X-[Cys⁴¹-Cys^l33]-Y zkrácené GDNF proteinové produkty podle vynálezu zachovávají Cys¹³¹ a Cys¹³³ zbytky a představují aktivní proteiny, jak potvrzuje test dopaminové spotřeby.

U jednoho provedení podle vynálezu postrádají zkrácené GDNF proteinové produkty nejméně jedno deamidační místo. U jednoho provedení podle vynálezu postrádaly výhodné zkrácené GDNF proteinové produkty nejméně jedno deamidační místo. Tento nedostatek deamidačních míst měl za následek zvýšení biologické stability purifikovaného proteinu a snížení možnosti degradace produktů, výsledkem čehož bývá vyšší stabilita proteinu při skladování. Příkladným zkráceným GDNF je [Ser²⁶—Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein, který postrádá místa, která mohou jinak vést kdeamidaci zralého proteinu. Alternativně by mohl [Arg¹⁶—Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein postrádat alespoň první deamidační místo, které je přítomné ve zralém proteinu.

-10CZ 297326 B6

V současné době je výhodným zkráceným GDNF proteinovým produktem [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein. Tento zkrácený GDNF protein postrádá místo, ve kterém probíhá sestřih zralého proteinu nebo v jehož blízkosti tento sestřih probíhá. Takže se dá očekávat, že tento zkrácený GDNF protein bude rezistentní proti zpracování, které by mohlo rovněž probíhat in vivo. Dalším současně výhodným zkráceným GDNF proteinovým produktem je [Lys³⁷-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein. Při dalších úpravách, při kterých by došlo k odstranění zbytků až po Gly⁴⁰ a Ile¹³⁴, včetně, zN-konce, resp. C-konce by tato úprava dále redukovala pí hodnotu zkráceného proteinu. V současné době si nej výhodnější zkrácené GDNF proteiny zachovávají všechny cysteinové zbytky, které se nachází v přirozeném GDNF proteinu, ale které postrádají některá rozlišitelná místa pro rychlé proteolytické zpracování zkráceného GDNF proteinu během exprese a výroby nebo po následujícím in vivo podání. Tyto výhodné proteiny zahrnují [Arg³²—Ile¹³⁴], [Gly³³-Ile¹³⁴], [Gln³⁴-Ile¹³⁴], [Arg³⁵-Ile¹³⁴], [Gly³⁶-Ile¹³⁴], [Lys³⁷-Ile¹³⁴], [Asn³⁸-Ile¹³⁴], [Arg³⁹-Ile¹³⁴] zkrácené GDNF proteinové produkty.

Podobné výsledky, pokud jde o schopnost zvyšovat dopaminovou spotřebu embryonálními prekurzory dopaminergických neuronů černé hmoty, jaké byly popsány Linem a kol. pro zralý GDNF vykazují rovněž zkrácené GDNF proteiny podle vynálezu. Biologické testy prováděné na zkrácených GDNF proteinech budou dále popsány v níže uvedeném příkladu 4.

Nové zkrácené GDNF proteiny se zpravidla izolují a purifikují za vzniku zkrácených GDNF proteinů, které v podstatě neobsahují další (ne-GDNF) proteinové materiály. Výhodně jsou zkrácené GDNF proteinové produkty přibližně z 80 % prosté dalších proteinů, jejich přítomnost může být způsobena výrobní technologií použitou při výrobě zkráceného GDNF proteinového produktu. Zkrácené GDNF proteinové produkty jsou výhodně přibližně z 90 % prosté dalších proteinů, zvláště výhodně z 95 % prosté dalších proteinů a nejvýhodněji přibližně alespoň z 98 % prosté dalších proteinů. Kromě tohoto jedinečnou výhodou vynálezu je poskytnutí polynukleotidových sekvencí pro výrobu homogenních zkrácených GDNF proteinů. Použití polynukleotidové sekvence kódující [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein například umožňuje rekombinantní produkci zkráceného GDNF proteinu v E. coli a dalších vhodných expresních systémech. Jinými slovy nové polynukleotidy umožňují produkci zkrácených GDNF proteinů, které nejsou přístupné pro proteolytické zpracování nebo které mají zhoršený přístup pro toto zpracování nebo pro účinky jiných, výše popsaných, biochemických zpracování. Takže nové polynukleotidy usnadňují přípravu a/nebo izolaci jednotlivých druhů zkrácených GDNF proteinů tak, že zkrácené GDNF proteiny nebo jejich produkty neobsahují vůbec, nebo obsahují snížená množství, výše popsané směsi hetero- a homodimerů. Nicméně by se dalo předpokládat, že finální zkrácené GDNF proteinové produkty bude možné před podáním kombinovat níže popsaným způsobem s dalšími faktory, chemickými kompozicemi a/nebo vhodnými farmaceutickými formulačními materiály.

U jednoho provedení vynálezu se budou zkrácené GDNF proteiny výhodně produkovat pomocí rekombinantních technik, protože tyto techniky jsou schopny poskytnout podstatně vyšší množství proteinu při vyšší čistotě tohoto proteinu. Rekombinantně zkrácené GDNF proteinové formy zahrnují glykosylované a neglykosylované formy proteinu a protein exprimovaný v bakteriálních proteinových systémech, savčích buněčných systémech nebo hmyzích buněčných systémech. Alternativně lze zkrácené GDNF proteiny chemicky syntetizovat. V současné době výhodné produkční metody budou podrobněji popsány níže.

Varianty a deriváty zkráceného GDNF

A. Varianty zkráceného GDNF

Další aspekt vynálezu zahrnuje varianty zkráceného GDNF proteinu. Výraz „zkrácené GDNF proteinové produkty“, jak je zde použit, zahrnuje varianty proteinů, ve kterých byly zbytky aminokyselinové sekvence přirozeně se vyskytujícího GDNF deletovány („deleční varianty“), inzertovány („adiční varianty“) nebo substituovány („substituční varianty“). Tyto varianty se připravují zaváděním příslušných nukleotidových změn do DNA kódující protein nebo in vitro chemickou syntézou požadovaného proteinu. Odborníkům v daném oboru bude zřejmé, že lze

-11 CZ 297326 B6 provést celou řadu kombinací delecí, inzercí a substitucí za předpokladu, že konečný protein bude vykazovat GDNF biologickou aktivitu.

Odborníkům v daném oboru jsou známy techniky mutageneze pro náhradu, inzerci nebo deleci nejméně jednoho zvoleného aminokyselinového zbytku (například patent US 4 518 584). Při konstrukci variant aminokyselinových sekvencí existují dvě základní proměnné: poloha mutačního místa a povaha mutace. Při navrhování zkrácených GDNF variant bude poloha mutačního místa a povaha mutace záviset na biochemické vlastnosti (vlastnostech), která(é) se mají modifikovat. Mutační místa lze modifikovat individuálně nebo v sériích (1) nejprve substituci umírněnou volbou aminokyselin a následně radikálnějšími selekcemi, provedenými na základě dosažených výsledků, (2) delecí cíleného aminokyselinového zbytku, nebo (3) inzercí aminokyselinových zbytků sousedících s příslušnou polohou mutačního místa.

Delece aminokyselinových sekvencí se zpravidla pohybují od jednoho do třiceti aminokyselinových zbytků, obvykleji od jednoho do deseti aminokyselinových zbytků a zpravidla od jednoho do pěti aminokyselinových zbytků. Delece v „X“ části aminokyselinových zbytků, uspořádaných jako N-konec na Cys⁴¹, se mohou například pohybovat v rozmezí přibližně od jednoho do třiceti zbytků, zatímco delece mezi cysteinovými zbytky [Cys⁴¹-Cys¹³³] se zpravidla pohybují v rozmezí od jednoho od pěti zbytků v závislosti na umístění tak, že nenarušují sbalení proteinů. Delece v zkrácených GDNF proteinech lze provádět v úsecích nízké homologie se členy rodiny transformačního růstového faktoru-beta (TGF-β). Delece zkrácených GDNF proteinů v úsecích v podstatě homologických s dalšími sekvencemi TGF-β rodiny budou pravděpodobně mnohem podstatněji modifikovat biologickou aktivitu. Počet celkových delecí a/nebo po sobě jdoucích delecí se zvolí tak, aby se ochránila terciální struktura zkráceného GDNF proteinu v doméně ovlivnění, například cysteinovou křížovou vazbou.

Adice aminokyselinové sekvence mohou zahrnovat fúze amino- a/nebo karboxylového konce dosahující délek jednoho až sta nebo více zbytků a rovněž vnitřní intrasekvenční inzerce jednoho nebo více aminokyselinových zbytků. Vnitřní adice se mohou zpravidla pohybovat přibližně od jednoho do deseti aminokyselinových zbytků, běžněji přibližně od jednoho do pěti aminokyselinových zbytků a obvykle přibližně od jednoho do tří aminokyselinových zbytků. Jak již bylo uvedeno výše, adiční varianty N-konce podle vynálezu zahrnují adici methioninu (například jako produkt přímé exprese GDNF v bakteriální rekombinantní buněčné kultuře) nebo ne-GDNF aminokyselinového zbytku nebo sekvence. N-koncové adiční varianty zahrnují adici aminokyselinového zbytku(ů), který(é) by způsobily rekonstrukci zralého GDNF proteinu. Dalším příkladem koncové inzerce je fúze heterologické N-koncové signální sekvence sN-koncem, která má usnadnit sekreci proteinu z rekombinantních hostitelských buněk. Tyto signální sekvence se zpravidla získají z použitých hostitelských buněčných druhů a jsou snimi homologické. Inzerce nebo adice mohou rovněž zahrnovat aminokyselinové sekvence odvozené ze sekvence dalších neurotrofních faktorů.

Další skupinou variant jsou aminokyselinové substituční varianty. Tyto varianty postrádají alespoň jeden aminokyselinový zbytek zralého GDNF proteinu a namísto tohoto zbytku mají inzertovaný jiný zbytek, viz například obr. 5, ve kterém byl přirozeně se vyskytující Asn²² nahrazen Ser, čímž se usnadnilo další odstraňování Met zbytku. Při použití X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y pro označení aminokyselinové sekvence a definice zkrácených GDNF proteinových produktů lze takto zkrácený GDNF protein označit buď jako substituční variantu Met-[Asn²²ASer²²-Ile¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu, nebo jako adiční variantu met-Ser-[Pro²³-Ile¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu. Substituční varianty zahrnují alelové varianty, které jsou charakteristické přirozeně se vyskytujícími nukleotidovými sekvenčními změnami v populaci druhů, které mohou, ale nemusí být výsledkem aminokyselinové změny.

Specifické mutace sekvencí zkrácených GDNF proteinů mohou zahrnovat modifikace glykosylačního místa (například šeřinu, threoninu nebo asparaginu). Absence glykosylace nebo pouze

- 12CZ 297326 B6 částečná glykosylace může vést k aminokyselinové substituci nebo deleci na libovolném, na asparagin navázaném, glykosylačním rozlišovacím místě nebo na libovolné místě proteinu, které je modifikováno adicí O-navázaného cukru. Na asparagin navázané glykosylační rozlišovací místo obsahuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznána příslušnými celulámími glykosylačními enzymy. Těmito tripeptidovými sekvencemi jsou buď Asn-Xaa-Thr, nebo AsnXaa-Ser, kde Xaa může znamenat jinou libovolnou aminokyselinou než Pro. Celá řada různých aminokyselinových substitucí nebo deleci na první a/nebo třetí aminokyselině glykosylačního rozpoznávacího místa (a/nebo aminokyselinové delece na druhé poloze) způsobuje, že v modifikované tripeptidové sekvenci nedochází ke glykosylaci, takže exprese vhodně zkrácených nukleotidových sekvencí produkuje varianty, které nejsou v tomto místě glykosylovány. Alternativně lze tuto sekvenci modifikovat přidáním glykosylačních míst do zkráceného GDNF proteinu.

Jedním způsobem identifikace aminokyselinových zbytků nebo úseků zkráceného GDNF pro mutagenezi je způsob označení jako „alaninová skenovací mutageneze“, kterou popsal Cunningham a Wells (Science, 244: 1081-1085, 1989). U tohoto způsobu se identifikuje aminokyselinový zbytek nebo skupina cílových zbytků (například zbytků s nábojem, jakými jsou Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradí se neutrální nebo záporně nabitou aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyalaninem), čímž se ovlivní vzájemná reakce aminokyselin s okolním vodným prostředím v buňce nebo vně buňky. Ty domény, které demonstrují funkční senzitivitu k substitucím, se následně čistí zavedením dalších nebo alternativních zbytků v místech substituce. Takže se předem stanoví místa pro zavedení modifikace a pro optimalizaci aminokyselinové sekvence. V daném místě lze provést skenování alaninu nebo náhodnou mutagenezi, přičemž u vzniklých variant se zjišťuje optimální kombinace požadované aktivity a stupně aktivity.

Nejžádanější místa pro substituční mutageneze zahrnují místa, ve kterých jsou aminokyseliny, nacházející se v GDNF proteinech, z různých druhů, které se podstatně liší, pokud jde o objem vedlejšího řetězce, náboj a/nebo hydrofobicitu. Další žádaná zajímavá místa zahrnují ta místa, ve kterých se nachází zbytky GDNF-podobných proteinů získaných z různých druhů, které jsou identické. Tyto pozice jsou zpravidla důležité pro biologickou aktivitu proteinu. Tato místa se nejprve modifikují substitucí, prováděnou v podstatě konzervativním způsobem. Tyto konzervativní substituce jsou shrnuty v tabulce 1 pod záhlavím, které uvádí výhodné substituce. Pokud je výsledkem těchto substitucí změna biologické aktivity, potom může procházet k podstatnějším změnám (exemplárním substitucím) a/nebo dalším adicím/delecím.

Tabulka 1

Aminokyselinové substituce

Původní zbytek Výhodné substituce Příkladné substituce

Ale	(A)	Val	Val; Leu; Ile
Arg	(R)	Lys	Lys; Gin; Asn
Asn	(N)	Gin	Gin; His; Lys; Arg
Asp	(D)	Glu	Glu
Cys	(C)	Ser	Ser
Gin	(Q)	Asn	Asn
Glu	(E)	Asp	Asp
Gly	(G)	Pro	Pro
His	(H)	Arg	Asn; Gin; Lys; Arg
Ile	(I)	Leu	Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
Leu	(L)	Ile	norleucin; Ile; Val Met; Ala; Phe
Lys	(K)	Arg	Arg; Gin; Asn

- 13 CZ 297326 B6

Met	(M)	Leu	Leu; Phe; Ile
Phe	(F)	Leu	Leu; Val; Ile; Ala
Pro	(P)	Gly	Gly
Ser	(S)	Thr	Thr
Thr	(T)	Ser	Ser
Trp	(W)	Tyr	Tyr
Tyr	(Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Val	(V)	Leu	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucin

Dá se očekávat, že konzervativní modifikace aminokyselinové sekvence (a odpovídající modifikace pro kódování nukleokyselinových sekvencí) produkují zkrácené GDNF proteiny, které mají funkční a chemické vlastnosti podobné vlastnostem zkrácených GDNF proteinů, popsaných v níže uvedených příkladech. Podstatné modifikace funkčních a/nebo chemických vlastností zkráceného GDNF proteinu mohou být zase způsobeny zvolením substitucí, které se podstatně liší svým účinkem na (a) zachování struktury polypeptidového hlavního řetězce v úseku substituce, například listové nebo šroubovicové konformace, (b) změnu hydrofobicity proteinu v cílovém místě, nebo (c) objem vedlejšího řetězce. Přirozeně se vyskytující zbytky jsou rozděleny do skupin na základě společných vlastností bočního řetězce:

1) hydrofobní: norleucin, Met Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, Thr;

3) kyselinový: Asp, Glu;

4) základní: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

5) zbytky mající řetězcovou orientaci: Gly, Pro; a

6) aromatický: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativní substituce mohou zahrnovat výměnu členu jedné z těchto tříd za druhý. Takto substituované zbytky lze zavést do úseků zkrácených GDNF proteinů, které jsou homologické s dalšími TGF-β proteiny nebo do nehomologických úseků tohoto proteinu.

B. Deriváty zkráceného GDNF

Chemicky modifikované deriváty zkráceného GDNF nebo variant zkráceného GDNF může odborník v daném oboru připravit na základě zde uvedeného popisu. Pro derivatizaci zkrácených GDFN proteinů jsou nej vhodnějšími chemickými skupinami vodou rozpustné polymery. Vodou rozpustný polymer je žádoucí protože protein, na který se váže, se nesráží ve vodném prostředí, například ve fyziologickém prostředí. Polymer bude výhodně farmaceuticky přijatelný pro přípravu terapeutického produktu nebo kompozice. Odborník v daném oboru bude schopen konjugát polymeru a proteinu použit pro terapeutické účely a v případě že ano, bude schopen určit požadovanou dávku, dobu oběhu, odolnost proti proteolýze a další podmínky. Účinnost derivatizace lze stanovit podáním derivátu v požadované formě (tj. pomocí osmotického čerpadla nebo výhodněji injekcí nebo infuzí nebo ve formě formulované pro orální nebo pulmonámí podání nebo jiný způsob podání) a určením jeho účinnosti.

Vhodné vodou rozpustné polymery zahrnují neomezujícím způsobem polyethylenglykol (PEG), kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, monomethoxypolyethylenglykol, karboxymethylcelulózu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-l,3-dioxolan, poly-l,3,6-trioxan, kopolymer ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, polyaminokyseliny (buď homopolymery, nebo nahodilé kopolymery), poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, homopolymery propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátované polyoly (například

- 14CZ 297326 B6 glycerol), polyethylenglykolpropionaldehyd a jejich směsi. Výraz „polyethylenglykol“, jakje zde uveden, zahrnuje veškeré formy PEG, které se používají pro derivatizaci dalších proteinů, například monoalkoxypolyethyleglykolu s 1 až 10 atomy uhlíku v alkoxyskupině nebo aryloxypolyethylenglykolu. Výhodou při výrobě polypropylenglykolpropionaldehydu může být jeho dobrá stabilita ve vodě. Polymer může mít libovolnou molekulovou hmotnost a může být větvený nebo nevětvený.

Vynález se zejména týká zkrácených GDFN proteinových produktů zahrnujících zkrácený GDNF protein navázaný na alespoň jednu PEG molekulu. U dalšího provedení se vynález týká zkráceného GDFN proteinu navázaného na alespoň jednu PEG molekulu přes acylovou nebo alkylovou vazbu.

Pegylaci lze provádět za použití libovolné pegylační reakce známé v daném oboru. Viz například: Focus on Growth Factors 3(2): 4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; a Malík a kol., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (popisuje pegylaci GM-CSF pomocí tresylchloridu). Výhodně se pegylace provádí pomocí acylační nebo alkylační rekce s reakčním, vodou rozpustným polymerem. Prostředky výhodné pro derivatizaci budou podrobněji diskutovány níže. Pro acylační reakce se výhodně zvolí polymer(y), který(é) má (mají) jednu reakční esterovou skupinu. Pro redukční alkylační reakce se výhodně zvolí polymer(y), který(é) má (mají) jednu reakční aldehydovou skupinu. Pro řízení stupně polymerace je výhodné modifikovat zvolený polymer tak, aby měl jednu reakční skupinu, například aktivní esterovou skupinu v případě acylace nebo aldehydovou skupinu v případě alkylace. Vodou rozpustný polymer se zpravidla nezvolí z přirozeně se vyskytujících glykosylových zbytků, protože ty se obvykle běžněji připravují pomocí savčích rekombinantních expresních systémů.

Acylace

Pegylace acylací prováděná v rámci vynálezu zpravidla zahrnuje aktivní esterový derivát polyethylenglykolu zkrácený GDNF proteinem. K provádění pegylačního procesu lze použít libovolnou známou nebo následně objevenou reakční PEG molekulu. Výhodným aktivovaným PEG esterem je PEG esterifíkovaný na N-hydroxysukcinimid („NHS“). Výrazem „acylace“, jak je zde uveden, se rozumí například následující typy vazeb mezi zkráceným GDNF proteinem a vodou rozpustným polymerem, jakým je PEG:amidová vazba, karbamátová vazba, urethanová vazba apod. Viz Bijoconjugate Chem. 5:133-140 (1994). Reakčními podmínkami mohou být libovolné, pro pegylaci vhodné, reakční podmínky, které jsou v dané oboru známy, ale měly by se vyloučit takové podmínky, například teplota, rozpouštědlo a pH, které by inaktivovaly zkrácený GDNF protein, které má být modifikován.

Výsledkem pegylační acylace bude zpravidla polypegylovaný zkrácený GDNF protein, ve kterém jsou lysinové ε-aminoskupiny pegylované pomocí acylové vazebné skupiny. Spojovací vazbou budou výhodně amid. Výsledným produktem bude rovněž výhodně v podstatě pouze (například > 95%) mono-, di- nebo tri-pegylovaný produkt. Nicméně v závislosti na specifických použitých reakčních podmínkách se bude zpravidla tvořit i odpovídající množství konjugátů s vyššími stupni pegylace. Pokud je to žádoucí, je možné ze směsi pomocí standardních purifikačních technik, například dialýzy, vysolování, ultrafíltrace, iontoměničové chromatografie, gelové filtrační chromatografie a elektroforézy, separovat čistší pegylované konjugáty.

Alkylace

Pegylace alkylací zpravidla zahrnuje uvedení koncového aldehydového derivátu PEG do reakce s zkráceným GDNF proteinem v přítomnosti redukčního činidla. Alkylační pegylaci lze rovněž získat polypegylovaný zkrácený GDNF protein. Kromě toho lze manipulovat s reakčními podmínkami tak, aby pegylace proběhla v podstatě pouze na α-aminoskupině N-konce proteinu (tj. aby se získaly monopegylované druhy). Jak v případě monopegylace, tak i v případě polypegylace jsou PEG skupiny výhodně navázány na protein přes -CH₂-NH-skupinu. Pokud jde o -CH₂skupinu, tento typ vazby je zde označován jako „alkylová“ vazba.

- 15 CZ 297326 B6

Selektivní chemickou modifikaci N-konce lze provádět pomocí redukční alkylace, která využívá různé reaktivity různých typů primárních aminokyselin (lysin versus N-konec), dostupných pro derivatizaci příslušného proteinu. Za vhodných reakčních podmínek se dosáhne v podstatě selektivní derivatizace proteinu naN-konci polymerem obsahujícím karbonylovou skupinu. Prováděním reakce při pH, která umožní využít výhody rozdílných pK_a ε-aminoskupin lysinových zbytků a α-aminoskupin N-koncového zbytku proteinu, se může například dosáhnout selektivní pegylace N-konce proteinu. Pomocí této selektivní derivatizace se řídí navázání vodou rozpustného polymeru na protein. Konjugace s polymerem probíhá převážně na N-konci proteinu a nedochází k žádné podstatnější modifikaci ostatních reakčních skupin, například aminoskupin v lysinovém postranním řetězci. Při použití redukční alkylace má výhodně vodou rozpustný polymer jeden reakční aldehyd pro navázání proteinu. Lze použít polyethylenglykolpropionaldehyd, kteiý obsahuje jeden reakční aldehyd.

Vynález zahrnuje pegylované zkrácené GDNF proteiny, u kterých je (jsou) PEG skupina (PEG skupiny) navázány přes acylovou nebo alkylovou skupinu. Jak již bylo diskutováno výše, tyto zkrácené GDNF proteiny mohou být monopegylované nebo polypegylované (například obsahující 2-6, výhodně 2-5, PEG skupin). PEG skupiny jsou zpravidla navázány na protein přes anebo ε-aminoskupiny aminokyselin, ale rovněž je třeba vzít v úvahu, že PEG skupiny mohou být navázány na libovolnou aminoskupinu proteinu, která je dostatečně reaktivní na to, aby se za vhodných reakčních podmínek navázala na PEG skupinu. Polyethylenglykol může být tedy kovalentně navázán na protein přes reakční skupinu, například volnou aminoskupinu nebo karboxylovou skupinu. Reakčními skupinami jsou ty skupiny, na které se může navázat molekula aktivovaného PEG. Aminokyselinové zbytky, které mají volnou aminoskupinu, mohou zahrnovat lysinové zbytky a N-koncový aminokyselinový zbytek. Ty, které mají volnou karboxylovou skupinu, mohou zahrnovat zbytky tvořené kyselinou asparagovou, zbytky tvořené kyselinou glutamovou a C-koncový aminokyselinový zbytek. Sulfhydrylové skupiny lze rovněž použít jako reakční skupiny pro navázání PEG molekuly (PEG molekul). Pro terapeutické účely je zpravidla výhodné navázání na aminoskupinu, například navázání na N-konec nebo lysinovou skupinu. Navázání na zbytky, důležité pro navázání receptorů, by se mělo vyloučit v případě, že toto navázání receptorů je žádoucí.

V jednom aspektu vynálezu poskytuje v podstatě homogenní přípravu konjugátu monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu, ve kterém byla molekula proteinu navázána v podstatě pouze (tj. > 95%) v jediném místě. Konkrétněji, pokud se použije PEG, vynález rovněž poskytuje pegylovaný a zkrácený GDNF protein, který postrádá možné antigenové vazebné skupiny a má PEG molekulu přímo navázánu na zkrácený GDNF protein.

Kromě toho lze deriváty připravit za použití glykosylovaného, neglykosylovaného nebo deglykosylovaného zkráceného GDNF proteinu. Zpravidla se používají neglykosylované zkrácené GDNF proteiny. Prokaryotou exprimovaný [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein lze například chemicky derivatizovat tak, aby zahrnoval m ono- nebo póly-, (například 2 až 4, PEG zbytky, navázané přes acylovou nebo alkylovou skupinou).

Chemickou derivatizaci lze běžně provádět za libovolných vhodných podmínek, používaných pro reakci biologicky účinné látky s aktivovanou polymemí molekulou. Způsoby přípravy pegylovaných zkrácených GDNF proteinů budou zpravidla zahrnovat (a) reakci zkráceného GDNF proteinu s polyethylenglykolem (například reakčním esterovým nebo aldehydovým derivátem PEG) za podmínek, za kterých se zkrácený GDNF protein naváže na nejméně jednu PEG skupinu; a (b) získání reakčního produktu(ů). Optimální reakční podmínky pro acylační reakce se běžně určují případ od případu na základě známých parametrů a požadovaného výsledku. Čím větší je například poměr PEG ku proteinu, tím vyšší je procento polypegylovaného produktu. Optimální poměr (ve smyslu účinnosti reakce, tj. poměr při kterém po ukončení reakce nezbude žádný nezreagovaný protein nebo polymer) lze určit pomocí faktorů, jakými jsou například poža

- 16CZ 297326 B6 dováný stupeň derivatizace (například mono-, di-, tri-, atd.), molekulová hmotnost zvoleného polymeru, struktura polymemího řetězce, (větvená nebo nevětvená) a použité reakční podmínky.

Redukční alkylace, produkující v podstatě homogenní populaci konjugátu monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu, bude zpravidla zahrnovat (a) reakci zkráceného GDNF proteinu s reakční PEG molekulou za redukčních alkylačních podmínek při pH, které umožňují selektivní modifikaci proteinu s reakční PEG molekulou za redukčních alkylačních podmínek při pH, které umožňují selektivní modifikaci a-aminokyseliny na N-konci zkráceného GDNF proteinu; a (b) získání reakčního produktu(ů).

Pro v podstatě homogenní populaci konjugátu monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu jsou redukčními alkylačními reakčními podmínkami ty podmínky, které umožňují selektivní navázání vodou rozpustného polymemího zbytku na N-konec zkráceného GDNF proteinu. Tyto reakční podmínky zpravidla poskytují pK_a diference mezi lysinovými aminoskupinami a a-aminoskupinou na N-konci (pK_a je pH, při kterém je 50 % aminoskupin protonováno a 50 % nikoliv). Hodnota pH rovněž ovlivňuje poměr použitého polymeru a proteinu. Zpravidla platí, že při nižší pH hodnotě je třeba použít větší přebytek polymeru ku proteinu (tj. čím méně reaktivní je N-koncová α-aminoskupina, tím více polymeru je zapotřebí pro dosažení optimálních podmínek). V případě vyššího pH nemusí být poměr polymeru ku proteinu tak vysoký (tj. čím reaktivnější skupiny jsou dostupné, tím méně polymemích molekul je zapotřebí). Pro účely vynálezu bude pH hodnota zpravidla ležet v rozmezí od 3 do 9, výhodně od 3 do 6.

Dalším důležitým parametrem je molekulová hmotnost polymeru. Zpravidla plat, že čím větší molekulovou hmotnost má polymer, tím méně polymemích molekul se může navázat na protein. Při optimalizaci těchto parametrů by mělo být obdobným způsobem zváženo větvení polymeru. Zpravidla platí, že čím vyšší je molekulová hmotnost (více větší), tím vyšší je poměr polymerrprotein. Pro zde uvažované pegylační reakce je výhodnou průměrnou molekulovou hmotností přibližně 2 kDa až 100 kDa (výraz „přibližně“ označuje ± 1 kDa). Výhodnou průměrnou molekulovou hmotností je přibližně 5 kDa až 50 kDa, zvláště výhodně přibližně 1 kDa až 25 kDa. Poměr vodou rozpustného polymeru ku zkrácenému GDNF proteinu se bude zpravidla pohybovat v rozmezí od 1:1 do 100:1, výhodně (pro pegylaci) od 1:1 do 20:1 a (pro monopegylaci) od 1:1 do 5:1.

Při použití výše popsaných podmínek bude redukční alkylace poskytovat selektivní navázání polymeru na libovolný zkrácený GDNF protein, který má na N-konci α-aminoskupinu, a poskytne v podstatě homogenní přípravu konjugátu monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu. Výraz „konjugát monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu“ označuje derivát obsahující jednu polymemí molekulu navázanou na zkrácený GDNF protein. Konjugát monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu bude mít výhodně polymemí molekulu situovanou na N-konci, ale nikoli na iysinových postranních aminoskupinách. Přípravek bude výhodně tvořen z více než 90 % konjugátem monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu a výhodně z více než 95 % bude tvořen konjugátem monopolymeru a zkráceného GDNF proteinu, přičemž zbytek pozorovaných proteinů bude nezreagovaný (tj. protein, postrádající polymemí zbytek).

Pro redukční alkylaci by se mělo použít redukční činidlo, které je stabilní ve vodném roztoku a které je výhodně schopno redukovat pouze Schiffovu bázi, která se tvoří při iniciaci redukční alkylace. Příkladná redukční činidla lze zvolit ze skupiny tvořené borohydridem sodným, kyanoborohydridem sodným, dimethylaminoboranem, trimethylaminoboranem a pyridinboranem. Zvláště výhodným redukčním činidlem je kyanoborohydrid sodný. Další reakční parametry, například rozpouštědlo, reakční dobu, teplotu, atd. a prostředky purifíkace produktů lze určit případ od případu na základě běžně dostupných informací, týkajících se derivatizaci proteinů vodou rozpustnými polymery.

Lze zvolit přípravu směsi konjugátu polymerů a proteinů acylační a/nebo alkylační metodou a poskytnout výhodou je, že lze zvolit proporcionální zastoupení konjugátu monopolymeru a pro

- 17CZ 297326 B6 teinu ve směsi. Takže pokud je to žádoucí, lze připravit směs proteinů, která má na sobě navázat různý počet polymemích molekul (tj. di—, tri-, tetra-, atd.) a kombinovat ji s konjugátem monopolymeru a proteinu, připraveným způsoby podle vynálezu, a tak získat směs s předem stanoveným zastoupením konjugátu monopolymeru a proteinu.

Polynukleotidy kódující zkrácené DNF proteiny

Vynález dále poskytuje nové polynukleotidy, které kódují zkrácené GFDN proteiny. Pokud se tyto použijí jako hybridizační sonda nebo amplifíkační primer, potom by nukleokyselinová sekvence měla být v podstatě prostá všech ostatních nukleokyselinových sekvencí. Při použití 10 v rámci rekombinantní proteinové exprese bude nukleotidová sekvence v podstatě prostá nukleotidových sekvencí kódujících další proteiny, pokud tím není myšlen fúzní protein. Na základě předloženého popisu a s použitím univerzální kodonové tabulky je odborník v daném oboru schopen snadno určit všechny nukleotidové sekvence, které kódují aminokyselinové sekvence zkrácených GDNF proteinů. V současné době výhodné nukleotidové sekvence zahrnují ty 15 polynukleotidy, které kódují [Arg¹⁶-Ile¹³⁴], [Ser²⁶—Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴] a [Lys³⁷-Ile¹³⁴] zkrácené

GDNF proteiny. Příklady různých polynukleotidů, které kódují zkrácené GDNF proteiny, jsou znázorněny na obrázcích 5, 6 a 7 a rovněž na obrázcích 1,3 a 4. Odborníkovu v daném oboru bude zřejmé, že nové polynukleotidy, které kódují krácené GDNF proteiny, zahrnují ty nukleokyselinové sekvence, které kódují varianty zkrácených GDFN proteinů, ať jsou připraveny uměle 20 nebo se vyskytují přirozeně.

Rekombinantní expresní techniky, prováděné podle výše uvedeného popisu, lze použít při produkci polynukleotidů a expresi různých zkrácených GDNF proteinů. Vložením nukleotidové sekvence, která kóduje zkrácený GDFN protein, do příslušného vektoru může odborník v daném 25 oboru například snadno připravit velké množství požadované nukleotidové sekvence. Sekvence se mohou následně použít pro generování detekčních sond a amplifikačních primerů. Alternativně může být polynukleotid, kódující zkrácený DNF protein, vložen do expresního vektoru. Zavedením expresního vektoru do příslušného hostitele lze produkovat větší množství požadovaného zkráceného GDNF proteinu.

Jak je zde dále uvedeno, pro propagaci nukleotidových sekvencí a/nebo produkci zkráceného GDNF proteinu existuje celá řada vhodných systémů hostitel/vektor. Tyto systémy zahrnují neomezujícím způsobem plasmidový, virový a inzerční vektor a prokaryotické a eukaryotické hostitele. Odborník v daném oboru může přizpůsobit systém hostitel/vektor, který je schopen 35 propagovat nebo exprimovat heterologickou DNA, tak, aby produkovala nebo exprimovala sekvence podle vynálezu.

Pomocí těchto rekombinantních technik lze zkrácené GDNF proteiny podle vynálezu snadno vyrábět v komerčním měřítku. Kromě toho může odborník v daném oboru na základě předlože40 ného popisu předpokládat, že nové nukleokyselinové sekvence, které zahrnují degenerační nukleokyselinové sekvence, kódující zkrácené GDNF proteiny, specificky znázorněné na obrázcích, varianty těchto zkrácených GDNF proteinů a ty nukleotidové sekvence které hybridizují, výhodně za přísných hybridizačních podmínek, doplňují tyto nukleotidové sekvence (viz Maniatis a kol., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory, str. 45 387 až 389, 1992). Přikládanými přísnými hybridizačními podmínkami jsou hybridizace ve 4 x

SSC při 62 až 67 °C, následně promývání v 0,1 x SSC při 62 až 67 °C, přibližně po dobu jedné hodiny. Alternativními přísnými hybridizačními podmínkami jsou hybridizace ve 45 až 55% formamidu, 4 x SSC při 40 až 45 °C. Jsou zde rovněž zahrnuty DNA sekvence, které hybridizují na komplementární sekvence zkráceného GDNF proteinu za uvolněných hybridizačních pod50 mínek a které kódují zkrácený GDNF protein podle vynálezu. Příklady těchto uvolněných hybridizačních podmínek jsou 4 x SSC při 45 až 55 °C nebo hybridizace 30 až 40% formamidem při 40 až 45 °C.

- 18CZ 297326 B6

Vynález rovněž poskytuje rekombinantní DNA konstrukty zahrnující vektorovou DNA společně s DNA sekvencí, kódující zkrácený DNF protein. V těchto konstruktech je nukleokyselinová sekvence, kódující zkrácený GDNF protein (s nebo bez signálních peptidů), v operačním spojení s vhodnou expresní kontrolní nebo regulační sekvencí, která je schopna řídit replikaci a/nebo expresi zkráceného GDNF proteinu ve zvoleném hostiteli.

Rekombinantní exprese zkráceného GDNF proteinu

Příprava polynukleotidů, kódujících zkrácený GDNF

Nukleokyselinové sekvence, kódující zkrácený GDNF, nebo zralý GDNF výchozí materiál, mohou být snadno získány celou řadou způsobů včetně chemické syntézy, cDNA nebo prohledávání genomové knihovny, prohledávání expresní knihovny a/nebo PCR amplifikací cDNA. Tyto a další metody, použitelné pro izolování těchto nukleotidových sekvencí, uvádí například Sambrook a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, Ny, 1989), Ausubel a kol., vyd. (Currend Protocols inMolecular Biology, Current Protocols Press, 1994) a Berger a Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, sv. 152, Academie Press, lne., San Diego, Ca, 1987). Výhodnými nukleokyselinovými sekvencemi kódujícími GDNF jsou savčí sekvence.

Chemické syntézy nukleokyselinové sekvence, která kóduje zkrácený GDNF protein, mohou být rovněž realizovány za použití v daném oboru známých metod, například metod, které popisuje Engels a kol. (Angew. Chem. Intl., Ed., 28:716-734, 1989). Tyto způsoby mimo jiné zahrnují fosfotriesterové, fosforamiditové a H-fosfonátové způsoby syntézy nukleokyselinové sekvence. Délka nukleokyselinové sekvence, kódující zkrácený GDNF protein, bude mít několik stovek bazických párů (bp) nebo nukleotidů. Velké nukleotidové sekvence, například ty, jejichž délka je větší než přibližně 100 nukleotidů, lze syntetizovat jako několik fragmentů. Tyto fragmenty lze ligovat dohromady za vzniku nukleokyselinové sekvence, kódující zkrácený GDNF protein. Výhodným způsobem je polymer podporující syntéza, která používá standardní fosforamiditovou chemii.

Alternativně lze vhodnou nukleokyselinovou sekvenci získat prohledáváním příslušné cDNA knihovny (tj. knihovny, připravené nejméně z jednoho tkáňového zdroje, o kterém se předpokládá, že by mohl exprimovat protein) nebo genomové knihovny (knihovny, připravené z celkové genomové DNA). Zdrojem cDNA knihovny je zpravidla tkáň ze všech druhů, o kterých se dá předpokládat, že exprimují GDNF v podstatnějších množstvích. Zdrojem genomové knihovny může být libovolná tkáň nebo tkáně libovolného savce nebo jiných druhů, o kterých se předpokládá, že deponují gen, kódující GDNF nebo GDNF homolog. Cílem prohledávání knihovny je potvrzení přítomnosti GDNF cDNA/genu pomocí alespoň jedné nukleokyselinové sondy (oligonukleotidu, cDNA nebo genomových DNA fragmentů, které vykazují přijatelnou hladinu homologie s GDNF nebo GDNF homologickou cDNA nebo genem, který se má klonovat), která bude selektivně hybridizovat s GDNF nebo GDNF homologickou(ými) cDNA nebo genem(y), které jsou přítomné v uvedené knihovně. Pro prohledávání knihovny se zpravidla použijí sondy, které kódují krátký úsek GDNF DNA sekvence druhu, který je stejný nebo podobný druhu, ze kterého byla knihovna připravena. Alternativně mohou být sondami degeneráty, jako je zde uvedeno.

Prohledávání knihovny se zpravidla provádí temperováním oligonukleotidové sondy nebo cDNA na klony v knihovně za přísných podmínek, které zabraňují nespecifickému navázání ale umožňují navázání těchto klonů, které mají vysokou hladinu homologie, se sondou nebo primerem. Obvyklé přísné hybridizační a promývací podmínky závisí částečně na velikosti (tj. počtu nukleotidů v celé délce sekvence) cDNA nebo oligonukleotidové sondy a na tom, zda je sondou degenerát. Při navrhování hybridizačního roztoku je rovněž třeba zvážit pravděpodobnost získání klonu(ů) (tj. zdali je prohledávána cDNA nebo genomová knihovna; v případě, že je prohledávána cDNA knihovna, je pravděpodobnost, že je skladována cDNA přítomna, velká).

- 19CZ 297326 B6

V případě, že se jako sondy použijí DNA fragmenty (například fragmenty cDNA), budou typické hybridizační podmínky zahrnovat podmínky popsané Ausubelem a kol, ed., viz výše. Po hybridizaci se blot obsahující knihovnu promyje za vhodně přísných podmínek, které závisí na několika faktorech, například na velikosti sondy, očekávané homologii sondy s klonem, typu knihovny, která se prohledává, počtu klonů, které se prohledávají apod. Příklady přísných promývacích roztoků (které mají zpravidla nízkou iontovou sílu a používají se při relativně vysokých teplotách) jsou následující. Jedním takovým promývacím roztokem je 0,015 M NaCl, 0,005 M citrát sodný a 0,1% SDS při 55 až 65 °C. Dalším takovým přísným pufrem je 1 mM Na₂EDTA, 40 mM NaHPC>4, pH 7,2 a 1% SDS přibližně při 40 až 50 °C. Dalším proplachem je 0,2 x SSC a 0,1% SDS přibližně při 50 až 65 °C.

Existují rovněž exemplární protokoly přísných promývacích podmínek pro prohledávání cDNA nebo genomových knihoven za použití oligonukleotidových sond. První protokol používá například 6 x SSC s 0,05 procenty difosforečnanu sodného při teplotě přibližně 35 až 62 °C v závislosti na délce sondy. Sondy o délce čtrnáct bází se promývají při teplotě 35 až 40 °C, sondy o délce sedmnácti bází se promývají při teplotě 45 až 50 °C, sondy o délce dvaceti bází se promývají při teplotě 52 až 57 °C a sondy o délce dvaceti tří bází se promývají pří teplotě 57 až 63 °C.

V případě, že se nespecifické vazby pozadí zdají vysoké, teplota se může zvýšit o 2 až 3 °C. Druhý protokol používá pro promývání tetramethylamoniumchlorid (TMAC). Jedním takovým přísným promývacím roztokem je 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a 0,2% SDS.

Dalším vhodným způsobem pro získání nukleokyselinové sekvence kódující GDNF protein je polymerázová řetězová reakce (PCR). Při tomto způsobu se z tkáně, která exprimuje GDNF, extrahuje poly(A)+RNA nebo celková RNA. Z RNA se pomocí enzymatické reverzní transkriptázy následně připraví cDNA. Následně se do samotné cDNA přidají dva primery, které jsou zpravidla komplementární ke dvěma separátním úsekům GDNF cDNA (oligonukleotidů) spolu s polymerázou, například Taq polymerázou, přičemž tato polymeráza amplifikuje cDNA úsek mezi těmito dvěma primery.

Pokud zvolený způsob přípravy nukleokyselinové sekvence, kódují požadovaný zkrácený GDNF protein, vyžaduje použití oligonukleotidových primerů nebo sond (například prohledávání PCR, cDNA nebo genomové knihovny), potom by měly mít oligonukleotidové sekvence, zvolené jako sondy nebo primery, odpovídající délku a dostatečnou zřejmost, aby minimalizovaly množství nespecifických vazeb, ke kterým by došlo během prohledávání knihovny nebo PCR amplifikace. Základem konkrétní sekvence sond nebo primer jsou zpravidla vysoce homologické sekvence nebo úseky stejného nebo podobného genu druhého organismu. Případně mohou být sondy nebo primery zcela nebo částečně degenerovány, tj. obsahovat směs sond a primerů, která kóduje stejnou aminokyselinovou sekvenci, ale za použití různých kodonů. Alternativním postupem přípravy degenerovaných sond je umístění inosinu do některých kodonových pozic nebo do všech kodonových pozic, které se u jednotlivých druhů liší. Oligonukleotidové sondy nebo primery lze připravit chemickými syntetizačními metodami používanými pro syntézu výše popsané DNA.

Zkrácené GDNF proteiny, jejichž podstatu tvoří tyto nukleokyselinové sekvence, kódují GDNF, a rovněž jeho mutantní formy nebo varianty, spadají rovněž do rozsahu vynálezu. Jak již bylo uvedeno výše, sekvence mutantních forem nebo variant je sekvence, která obsahuje alespoň jednu nukleotidovou substituci, deleci a/nebo inzerci v porovnání se standardním typem sekvence, která má za následek expresi aminokyselinových sekvenčních variací standardního typu aminokyselinové sekvence. V některých případech mohou existovat přirozeně se vyskytující GDNF aminokyselinové mutantní formy nebo varianty díky existenci přirozených alelových variací. Zkrácené GDNF proteiny na bázi těchto přirozeně se vyskytujících mutantů nebo variant rovněž spadají do rozsahu vynálezu. Příprava syntetických mutantních sekvencí je v daném oboru rovněž známa a popisuje ji například Wells a kol. (Gene, 34:315, 1985) a Sambrook a kol., viz výše.

-20CZ 297326 B6

Vektory

Genomová DNA nebo cDNA kódující zkrácený GDNF protein se vloží do vektoru, který se použije pro další klonování (amplifikace DNA) nebo expresi. Vhodné vektory jsou komerčně dostupné nebo mohou být specificky konstruovány. Selekce nebo konstrukce konkrétního vektoru bude záviset na 1) tom, zda má být použit pro DNA amplifikaci nebo pro DNA expresi, 2) velikosti DNA, která má být vložena do vektoru a 3) hostitelské buňce (například savčí, hmyzí, kvasinkové, fungální, rostlinné nebo bakteriální buňce), která má být transformována vektorem. Jednotlivé vektory obsahují různé složky, přičemž složení těchto složek závisí na funkci vektoru (amplifikaci DNA nebo expresi DNA) a jeho slučitelnosti s příslušnou hostitelskou buňkou. Vektorové složky zpravidla zahrnují alespoň jednu z následujících složek: signální sekvenci, počátek replikace, alespoň jeden selekční nebo značkovací gen, zesilovací prvek, promotor, transkripční terminační sekvenci, apod. Tyto složky lze získat z přirozených zdrojů nebo syntetizovat známými postupy. Vektory podle vynálezu zahrnují nukleokyselinovou sekvenci, která kóduje sledovaný zkrácený GDNF protein, operativně navázaný na nejméně jednu kontrolní nebo regulační sekvenci, která je schopna řídit, regulovat nebo jinak ovlivňovat expresi zkráceného GDNF proteinu zvolenou hostitelskou buňkou.

Signální sekvence

Signální sekvence může být složkou vektoru nebo části GDNF DNA, která se vloží do vektoru. Nativní GDNF DNA kóduje signální sekvenci na N-konci proteinu, která se odštěpí v průběhu posttranslačního zpracování proteinu za vzniku zralého GDNF proteinu. Do rozsahu vynálezu spadají zkrácené GDNF polynukleotidy s nativní signální sekvencí a dalšími pre-pro sekvencemi a rovněž zkrácené GDNF polynukleotidy, ze kterých je nativní signální sekvence odstraněna a nahrazena heterologickou signální sekvencí. Zvolenou heterologickou signální sekvencí by měla být sekvence, kterou hostitelská buňka rozpozná a zpracuje, tj. rozštěpí pomocí signální peptidázy. Pro prokaryotické hostitelské buňky, které nativní GDNF signální sekvenci nerozpínají a nezpracují, je tato signální sekvence substituována prokaryotickou signální sekvencí, zvolenou například ze skupiny alkalinfosfatázy, penicilinázy nebo tepelně stabilní enterotoxinových II vodičů. V případě kvasinkové sekrece se může nativní GDNF signální sekvence substituovat kvasinkovou invertázou, alfa faktorem nebo kyselinofosfatázovými vodiči. Savčí expresi vyhovuje nativní signální sekvence jako taková ačkoliv ostatní savčí signální sekvence mohou být rovněž vhodné.

Počátek replikace

Expresní a klonující vektory zpravidla zahrnují nukleokyselinovou sekvenci, která vektoru umožňuje replikovat se v nejméně jedné zvolené hostitelské buňce. V klonovacích vektorech je touto sekvencí zpravidla sekvence, která vektoru umožňuje replikovat nezávisle hostitelskou chromozomální DNA a zahrnuje počátek replikace nebo autonomně replikující sekvence. Těmito sekvencemi jsou různé známé bakterie, kvasinky a viry. Počátek replikace v plasmidu pBR322 je vhodný pro většinu gram-negativních bakterií a pro klonování vektorů v savčích buňkách se používají různé počátky (například SV40, polyom, adenovir, VSV nebo BPV). Savčí expresní faktory počátek replikační složky většinou nevyžadují (například SV40 počátek se často používá pouze proto, že obsahuje raný promotor).

Selekční gen

Expresní a klonovací vektory zpravidla obsahují selekční gen. Tento gen kóduje „markér“, což je nezbytný protein pro přežití nebo růst transformovaných hostitelských buněk, pokud se tyto buňky nacházejí v selektivním kulturním médium. Hostitelské buňky které nebyly transformovány vektorem nebudou obsahovat selektivní gen a tak v kultivačním médiu nepřežijí. Typické selekční geny kódují proteiny, (a) které mu propůjčí odolnost proti antibiotikům nebo jiným toxinům, například ampicilinu, neomycinu, methotrexatu nebo tetracyklinu; (b) které doplňují auxotrofní deficience; nebo (c) které dodávají důležité živiny, které neposkytuje kultivační médium.

-21 CZ 297326 B6

Další selekční geny lze použít pro amplifikaci genu, který se bude exprimovat. Amplifikace je proces, ve kterém se geny, po kterých je při produkci proteinu kritického pro růst větší poptávka, opakují v chromozomech při postupném generování rekombinantních buněk. Mezi markéry, vhodné pro savčí buňky, patří například dihydrofolátreduktáza (DHFR) a thymidinkináza. Transformované savčí buňky se zatíží selekčním tlakem, kterému jsou díky markéru, přítomnému ve vektoru, schopny se přizpůsobit pouze tyto transformované savčí buňky. Selekční tlak si vynucuje kultivace transformovaných buněk za podmínek, za kterých se koncentrace selekčního činidla v médiu postupně mění, což vede k amplifikaci jak selekčního genu, tak DNA, která kóduje zkrácený GDNF a díky tomu se z amplifíkované DNA syntetizuje větší množství zkráceného GDNF.

Například buňky transformované DHFR selekčním genem se nejprve identifikují kultivací všech transformovaných buněk v kultivačním médiu, které obsahuje methotrexát, což je konkurenční antagonizující činidlo DHFR. Vhodnou hostitelskou buňkou, pokud se použije standardní typ DHFR, je buněčná linie vaječníku čínského křečka, postrádající DHFR aktivitu (viz například Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77(7):4216-4220 (1980)). Transformované buňky se následně vystaví působení zvýšených hladin methotrexátu. To vede k syntéze více kopií DHFR genu a současně k více kopiím další DNA, přítomné v expresním vektoru, například DNA kódující zkrácený GDNF protein.

Promotor

Expresní a klonovací vektory podle vynálezu budou zpravidla obsahovat promotor, který je rozpoznán hostitelským organizmem a kteiý je operativně navázán na nukleokyselinovou sekvenci, kódující zkrácený GDNF protein. Promotory jsou nepřenesené sekvence, uspořádané před (5') počátečním kodonem strukturálního genu (zpravidla přibližně 100 až 1000 bp), které kontrolují přenos a přenos příslušné nukleokyselinové sekvence, například sekvence kódující zkrácený GDNF. Promotory jsou běžně rozděleny do dvou skupin na indukovatelné promotory a základní promotory. Indukovatelné promotory iniciují zvýšenou úroveň transkripce z DNA za jejich kontroly v odpovědi na určitou změnu kultivačních podmínek, například na přítomnost nebo nepřítomnost živin nebo změnu teploty. Je znám velký počet promotorů, které jsou rozpoznány celou řadou různých potenciálních hostitelských buněk. Tyto promotory jsou operativně navázány na DNA, kódující zkrácený GDNF, odstraněním promotoru ze zdroje DNA restrikční enzymatickou digerací a zavedením sekvence požadovaného promotoru do vektoru. Nativní GDNF promotorova sekvence může být použita pro řízení amplifikace a/nebo exprese zkrácené DNF DNA. Výhodným promotorem je heterologický promotor, ale pouze v případě, že umožňuje větší přepis a vyšší výtěžek exprimovaného proteinu v porovnání s nativním promotorem a pokud je slučitelný s hostitelským buněčným systémem, který byl pro tyto účely zvolen.

Vhodnými promotory pro prokaryotické hostitele jsou například beta-laktamázy a laktózový promotorovy systém; alkalinfosfatázový a tryptofanový (trp) promotorový systém; a hybridní promotory, například tac promotor. Rovněž jsou vhodné další známé bakteriální promotory. Jejich nukleokyselinové sekvence byly již publikovány, což umožnilo odborníkovi vdaném oboru ligovat je do požadované DNA sekvence (sekvencí) za použití spojovníků nebo adaptérů, které jsou potřebné pro dodání všech požadovaných restrikčních míst.

Vhodné promotorové sekvence pro kvasinkové hostitele jsou v oboru rovněž známy. Kvasinkové zesilovače jsou zvláště výhodně používány spolu s kvasinkovými promotory. Vhodné promotory pro savčí hostitelské buňky jsou již známy a zahrnují promotory získané zgenomů virů, například viru polyoma, viru fowlpox, adenoviru (například adenoviru 2), viru bovinního papilomu, viru ptačího sarkomu, cytomegaloviru, retroviru, viru hepatitidy Ba nej výhodněji opičího viru 40 (SV40). Další vhodné savčí promotory zahrnují heterologické savčí promotory, například promotory tepelného šoku a aktinové promotory. V současné době se při výrobě GDNF proteinů v CHO buňkách používá jako promotor SRa. Viz Takabe a kol., Mol. Cell. Biol., 8(1): 466-472 (1988). Vhodným expresním vektorem je pDSRa2, který bude popsán níže.

Zesilovací prvek

Sekvence zesilovače může být do vektoru vložena pomocí vyšších eukaryot s cílem posílit transkripci DNA sekvence, kódující zkrácený GDNF protein podle vynálezu. Zesilovači jsou cis-působící prvky DNA, jejichž délka dosahuje zpravidla přibližně 10 až 300 bp, a které působí na promotor tak, že zvyšují jeho transkripci. Zesilovače mají relativní orientaci a poziční nezávislost. Nachází se na 5' a 3' konci vzhlede k transkripční jednotce. Je známo několik sekvencí zesilovače poskytovaných savčími geny (např. globin, elastáza, albumin, alfa-feto-protein a inzulín). Nicméně zpravidla se použije zesilovač z viru. Zesilovač SV40, zesilovač cytomegalovirového raného promotoru, polyamový zesilovač a adenovirové zesilovače jsou příkladnými zesilovacími prvky pro aktivaci eukaryotických promotorů. Zatímco zesilovače lze rozdělit do vektoru v poloze 5' a 3' k zkrácené GDNF DNA, nachází se zpravidla v místě 5' od promotoru.

Transkripční terminace

Expresní vektory použité v eukaryotických hostitelských buňkách (kvasinkových, fungicidních, hmyzích, rostlinných, zvířecích, lidských nebo nukleovaných buňkách z dalších multicelulámích organizmů) budou rovněž obsahovat sekvence nezbytné pro ukončení transkripce a pro stabilizaci mRNA. Tyto sekvence jsou běžně dostupné z 5' konce a příležitostně z 3' nepřeneseného úseku eukaryotických DNA nebo cDNA. Tyto úseky obsahují nukleotidové segmenty přeprané jako polyadenylátované fragmenty v nepřenesené oblasti mRNA, kódující zkrácený GDNF.

Konstrukce vhodných vektorů, obsahujících alespoň jednu z výše uvedených složek společně s požadovaným zkráceným GDNF proteinem, kódujícím sekvenci, se provádí standardními ligačními technikami. Izolované plasmidy nebo DNA fragmenty se rozštěpí, upraví a religují v požadovaném pořadí pro generování požadovaných plasmidů. Pro potvrzení toho, že byly zkonstruovány správné sekvence, se mohou pro transformaci E. coli použít ligační směsi a úspěšné transformanty lze vybrat pomocí známých technik, například pomocí výše popsané ampicilinové nebo tetracyklinové rezistence. Potom se z transformantů připraví plasmidy, které se analyzují restrikční endonukleázovou digescí a/nebo se sekvencují za účelem potvrzení přítomnosti požadovaného konstruktu.

Rovněž lze použít vektory, které poskytují přechodnou expresi DNA, kódující zkrácený GDNF protein v savčích buňkách. Přechodná exprese zpravidla zahrnuje použití expresního vektoru, který je schopen účinně replikovat v hostitelské buňce tak, že hostitelská buňka akumuluje mnoho kopií expresního vektoru a ten zase syntetizuje vysoké hladiny požadovaného proteinu kódovaného zmíněným expresním vektorem. Přechodné expresní systémy, které obsahují vhodný expresní vektor a hostitelskou buňku, umožňují běžnou pozitivní identifikaci proteinů, kódovaných klonovanými DNA, a rovněž rychlé prohledávání požadovaných biologických nebo fyziologických vlastností těchto proteinů. Přechodné expresní systémy jsou tedy použitelné zejména při identifikaci variant sledovaného proteinu.

Selekce a transformace hostitelských buněk

Vynález rovněž poskytuje hostitelské buňky (např. bakteriální, savčí, hmyzí, kvasinkové nebo rostlinné buňky) transformované nukleokyselinovými sekvencemi, použitelné při expresi rekombinantního zkráceného GDNF proteinu. Transformovaná hostitelská buňka je kultivována za vhodných podmínek, které umožňují expresi nukleokyselinové sekvence. Selekce vhodných hostitelských buněk a způsobů transformace, kultivace, amplifikace, prohledávání a produkce produktu a purifikace jsou v daném oboru známy. Viz například Gething a Sambrook, Nátuře, 293: 620-625 (1981) nebo alternativně Kaufman a kol., Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) nebo Howley a kol., patent US 4,419,446. Zkrácený GDNF protein může být exprimován v E. coli, jak popisuje Lin a kol., (WO 93/06116). Línova studie zahrnuje expresi zralého GDNF. Další příkladné materiály a metody budou podrobněji diskutovány níže. Transformovaná hostitelská buňka se kultivuje ve vhodném médiu a exprimovaný faktor se následně případně izoluje a

-23 CZ 297326 B6 purifikuje z kultivačního média (nebo z buňky, pokud exprimoval intracelulámě) pomocí vhodných prostředků, které jsou v daném oboru známé.

Vhodnými hostitelskými buňkami pro klonování nebo exprimování vektorů v rámci vynálezu jsou prokaryotické, kvasinkové, nebo vyšší eukaryotické buňky, které byly popsány výše. Prokaryotické hostitelské buňky zahrnují neomezujícím způsobem eubakterii, například gram-negativní nebo gram-pozitivní organizmy, například E. coli, zejména druhy B. subtilis, Pseudomonas, například P. auruginosa, Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescans. Alternativně jsou vhodné in vitro metody klonování, např. PCR nebo další nukleokyselinové polymerázové reakce.

Kromě prokaryotických hostitelských buněk mohou být vhodnými hostiteli pro expresi zkrácených GDNF proteinů eukaryotičtí mikrobi, nitkovité houby nebo kvasinky. Z nižších eukaryotických hostitelských mikroorganizmů se nejčastěji používá Saccharomyces cerevisiae, neboli běžné pekařské kvasnice, ale rovněž je známa a běžně dostupná celá řada dalších generací druhů a kmenů.

Vhodnými hostitelskými buňkami pro exprese glykosylovaného zkráceného GDNF proteinu jsou buňky, odvozené z vícebuněčných organizmů. Tyto hostitelské buňky jsou schopny komplexního zpracování a glykosylačních aktivit. V podstatě lze použít libovolnou vyšší eukaryotickou buněčnou kulturu, pokud tato kultura zahrnuje buňky obratlovců a bezobratlých včetně rostlinných a hmyzích buněk. Zpravidla se používají buňky obratlovců, protože propagace buněk obratlovců v kultuře (tkáňové kultuře) je známou metodou. Příklady použitelných savčích hostitelských buněčných linií zahrnují neomezujícím způsobem CV1 buněčnou linii opičí ledviny transformovanou pomocí SV40 (COS-7), humánní embryonální linie (293 nebo 293 buňkami nakloňované pro růst v suspenzní kultuře), ledvinové buňky nedospělého křečka a buňky vaječníku čínského křečka. Další vhodné savčí buněčné linie zahrnují neomezujícím způsobem HeLa, myší L-929 buňky, 3T3 linie odvozené ze švýcarských, Balb-c nebo NIH myší, BHK nebo HaK křeččí buňky.

Pro účely vynálezu jsou v podstatě stejné vhodnými hostitelskými buňkami bakteriální buňky. V oblasti biotechnologie jsou dobře známými hostitelskými buňkami například různé kmeny E. coli (například HB101, DH5oc, DH10 a MC1061). Rovněž lze použít různé kmeny Streptomyces spp. V současnosti jsou výhodnými hostitelskými buňkami (například Escherichia coli) a savčí buňky (například buňky vaječníku čínského křečka, COS buňky atd.).

Hostitelské buňky jsou transfektovány a výhodně transformovány výše popsanou expresí nebo klonovacími vektory a kultivovány v běžném živném prostředí. Médium může být modifikováno podle potřeby tak, aby bylo vhodné pro indukování promotoru, selekci transformantů nebo amplifikaci genů, kódujících požadované sekvence. Transfekce a transformace se provádí za použití standardních technik, které jsou odborníkům v daném oboru známy a které se zvolí tak, aby byly vhodné pro zvolené hostitelské buňky. Pro savčí buňky bez buněčných stěn lze například použít metodou srážení fosforečnanu vápenatého. Rovněž lze použít elektroporaci, mikroinjektáž a další známé techniky.

Kultivace hostitelských buněk

Transformované buňky, použité pro produkci zkrácených GDNF proteinů podle vynálezu, se pěstují ve vhodném prostředí. Toto prostředí může být obohaceno, pokud je to nezbytné, hormony a/nebo dalšími růstovými faktory (například inzulínem, transferinem nebo epidermálním růstovým faktorem), solemi (například chloridem sodným, solemi vápníku, solemi hořčíku a fosforečnanem), pufry (například HEPES), nukleosidy (například adenosin a thymidin), antibiotiky (například gentamicinem), stopovými prvky (definovanými jako anorganické sloučeniny, které jsou zpravidla přítomné v konečných mikromolámích koncentracích) a glukózou nebo jiným energetickým zdrojem. Rovněž je zřejmé, že kultivační médium může obsahovat další doplňky, které budou v médiu obsaženy ve vhodných koncentracích. Vhodné kultivační podmín

-24CZ 297326 B6 ky, použitelné při kultivaci zvolených hostitelských buněk, jako například teplota, pH hodnota apod., jsou odborníkům v daném oboru známy.

Zkrácené GDNF proteiny lze rovněž připravovat homologickou rekombinací nebo rekobinantní produkční metodou za použití řídicích prvků zavedených do buněk, které již obsahují DNA kódující GDNF. Homologická rekombinace je technika původně vyvinutá pro cílové geny, jejímž úkolem je indukovat nebo opravovat mutace v transkripčně aktivovaných genech (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 36:301 (1989)). Základní technika byla vyvinuta jako způsob zavádění specifických mutací do specifických oblastí savčího genomu (Thomas a kol., Cell. 44:419-428, 1986; Thomas a Capacchi, Cell. 51:503-512, 1987; Doetschman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 85:8583-8587, 1988) nebo pro opravu specifických mutací vdefektních genech (Doetschman a kol., Nátuře, 330:576-578, 1987). Příkladné homologické rekombinatní techniky popisuje patent US 5,272,071 (EP 91 90 3051, a mezinárodní publikace č. WO 91/09955).

Pomocí homologické rekombinace může být DNA sekvence, která má být vložena do genomu, nasměrována do specifického úseku sledovaného genu jejím navázáním na cílovou DNA. Cílová DNA je DNA, která je komplementární (homologická) s úsekem genomové DNA. Malé části cílové DNA, které jsou komplementární s konkrétním úsekem genomu, se uvedou v průběhu replikačního procesu DNA do kontaktu s parentálním řetězcem. Obecnou vlastností DNA, která byla zavedena do buňky, je hybridizovat a tedy rekombinovat se s dalšími částmi endogenní DNA přes sdílené homologické úseky. Pokud se tento komplementární řetězec naváže na oligonukleotid, který obsahuje mutaci nebo odlišnou sekvenci DNA, rovněž se zabuduje do nově syntetizovaného řetězce jako výsledek rekombinace. Díky funkci korektury může nová sekvence DNA sloužit jako matrice. Transferovaná DNA je tedy zabudována do genomu.

Pokud je sekvence příslušného genu známá, například nukleokyselinová sekvence GDNF, potom lze pre-pro sekvenci nebo expresní kontrolní sekvenci, což je část DNA která je komplementární ke zvolenému úseku genu, syntetizovat nebo jinak získat, například vhodnou restrikcí, nativní DNA na specifických rozlišovacích místech vážících sledovaný úsek. Tato část slouží jako cílová sekvence po vložení do buňky, která se bude hybridizovat na homologický úsek uvnitř genomu. Pokud tato hybridizace proběhne v průběhu replikace, potom bude tato část DNA a libovolná další sekvence navázaná na tuto část působit jako Okazakův fragment a bude zpětně zavedena do nově syntetizovaného řetězce DNA.

Podle vynálezu jsou úseky, které jsou navázány na tyto druhy cílové DNA úseky DNA, které mohou ovlivňovat expresi GDNF proteinu. Prvek promotor/zesilovač, supresor nebo exogenní transkripční modulační prvek se zavedou do genomu příslušné hostitelské buňky v místě, které se nachází v blízkosti DNA, kódující požadovaný zkrácený GDNF a s takovou orientací, aby mohly ovlivnit transkripci DNA, kódující požadovaný zkrácený GDNF. Kontrolní prvek nekóduje zkrácený GDNF ale řídí část DNA přítomné v genomu hostitelské buňky. Takže exprese zkrácených GDNF proteinů lze dosáhnout nikoliv samotnou transfekcí DNA, která kóduje zkrácený GDNF, ale spíce použití cílové DNA (obsahující úseky homologické se sledovaným endogenním genem) sloučené s DNA regulačními segmenty, které poskytují endogenní genové sekvenci rozlišitelné signály pro transkripci zkráceného GDNF proteinu.

Homologické rekombinantní metody lze podle vynálezu rovněž použít pro modifikaci buňky, která za normálních podmínek obsahuje transkripčně tichý GDNF gen, přičemž tato modifikace bude produkovat buňky, exprimující GDNF. GDNF protein může být následně zpracován tak, aby poskytl zkrácený GDNF protein (proteiny).

Zkrácené GDNF farmaceutické kompozice

Zkrácené GDNF proteinové farmaceutické kompozice zpravidla zahrnují terapeuticky účinné množství zkráceného GDNF proteinového produktu ve směsi s nejméně jedním farmaceuticky a

-25CZ 297326 B6 fyziologicky přijatelným formulačním materiálem. Vhodné formulační materiály zahrnují neomezený způsob antioxidanty, konzervační látky, barviva, ochucovadla a ředicí činidla, emulgační činidla suspendační činidla, rozpouštědla, plniva, látky zvětšující objem, pufry, dopravní vehikula, ředidla, masťové základy a/nebo farmaceutické adjuvansy. Vhodným vehikulem může být například voda pro injektování, fyziologický solný roztok nebo syntetický mozkomíšní mok (CSF) případně obohacený dalšími materiály, běžnými pro kompozice určené pro parenterální podání. Dalšími příkladnými vehikuly jsou neutrální pufrovaný fyziologický roztok nebo fyziologický roztok smísený se sérovým albuminem.

Hlavní rozpouštědlo ve vehikulu může mít vodnou nebo bezvodou povahu. Kromě toho může vehikulum obsahovat další farmaceuticky přijatelné masťové základy, které budou modifikovat nebo udržovat pH hodnotu, osmolaritu, viskozitu, čirost, barvu, sterilitu, stabilitu, rychlost rozpouštění nebo vůni uvedené formulace. Vehikulum může ještě dále obsahovat ještě další farmaceuticky přijatelné masťové základy, které budou modifikovat nebo udržovat stabilitu, rychlost rozpouštění nebo lychlost uvolňování zkráceného GDNF proteinového produktu nebo podporovat absorbci nebo penetraci proteinového produktu přes hematocerebrální bariéru. Těmito masťovými základy jsou látky, které se obvykle zpravidla používají při formulacích dávek pro parenteruální podání buď v jednotkové dávce nebo vícedávkové formě nebo pro přímou infuzi do CSF kontinuální nebo periodickou infuzi implantované pumpy.

Potom, co je terapeutická kompozice zformulována, se může skladovat ve sterilních látkách nebo roztok, suspenze, gel, emulze, pevná látka nebo dehydratovaný nebo lyofilizovaný prášek. Tyto formulace mohou být skladovány buď v instantní formě, nebo například v lyofílizované formě, která vyžaduje před podáním rekonstituci.

Optimální farmaceutickou formulaci zvolí odborník v daném oboru na základě způsobu podání a požadované dávky. Viz například Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), str. 1435-1712. Kompozice může rovněž zahrnovat částicové přípravky polymemích sloučenin kyseliny poly(2-hydroxypropanové), kyseliny polyglykolové nebo může být součástí liposomu. Rovněž lze použít kyselinu hylauronovou, která podporuje dlouhodobé přetrvávání v oběhu. Tyto kompozice mohou mít vliv na fyzikální stav, stabilitu, rychlost in vivo uvolňování a rychlost in vivo clearance přítomných proteinů a derivátů podle vynálezu.

Dalšími vhodnými účinnými aplikačními formami jsou například parenterální pozvolna se uvolňující formulace, inhalační spreje, orálně aktivní formulace nebo čípky. Současné zkrácené GDNF proteinové farmaceutické kompozice jsou formulovány pro patenterální podání, například intracerebroventrikulámí injektování. Tyto parenterálně podané terapeutické kompozice mají zpravidla formu pyrogenu prostého parenterálně přijatelného vodného roztoku obsahujícího zkrácený GDNF proteinový produkt ve farmaceuticky přijatelném vehikulu. Výhodným vehikulem je fyziologický solný roztok.

Rovněž lze vzít v úvahu, že určité formulace obsahující zkrácený GDNF proteinový produkt mají být podány orálně. Zkrácený GDNF proteinový produkt, který se podává tímto způsobem, může být zapouzdřen a případně může být formulován s nosiči, které se obvykle používají při přípravě pevných látkových forem. Kapsle může být navržena tak, aby uvolňovala aktivní složku formulace v trávicím traktu, kde je její biologická dostupnost maximální a presystematická degradace minimální. Formulace může zahrnovat další masťové základy, které usnadní absorpci zkráceného GDNF proteinového produktu. Rovněž mohou být použita ředidla, ochucovadla, vosky s nízkou teplotou tání, rostlinné oleje, maziva, suspendační činidla, tablety, dezintegrující činidla a pojivá.

Podání zkráceného GDNF proteinového produktu

Zkrácený GDNF proteinový produkt lze podat parenterálně, subkutánní, intramuskulámí, intravenózní, transpulmonální, transdermální, intratekální nebo intracerebrální cestou. Proteinové

-26CZ 297326 B6 růstové faktory, které neprojdou hematocerebrální bariérou mohou být aplikovány přímo intracerebrálně nebo jiným způsobem společně s dalšími prvky, které je přepraví přes zmíněnou bariéru. Je výhodné, pokud se zkrácený GDNF proteinový produkt podá intracelebroventrikulárně nebo do mozkového nebo míšního subarachnoidálního prostoru. Zkrácený GDNF proteinový produkt lze rovněž podávat intracerebrálně přímo do mozkového panenchymu. Pozvolna se uvolňují implantáty v mozku, které obsahují neurotrofní faktor zapouzdřený v biologicky degradovatelné polymemí matrici, mohou rovněž dopravovat zkrácený GDNF proteinový produkt. Zkrácený GDNF proteinový produkt může být podán extracerebrálně v chemicky modifikované formě nebo obalený tak, aby přešel hematocelebrální bariérou nebo může být podán společně s alespoň jedním činidlem, které podpoří penetraci zkráceného GDNF proteinového produktu touto bariérou. Ukázalo se například, že konjugát NGF a monoklonálních protilátek antitransferinového receptorů dopraví tento proteinový produkt do mozku pomocí navázání na transferinové receptory. Pro dosažení dávky zkráceného GDNF proteinového produktu lze použít opakované denní nebo méně časté injekce nebo lze zkrácený GDNF proteinový produkt podáván formou kontinuální nebo periodické infuze z implantované pumpy s konstantním nebo programovatelným prouděním. Frekvence dávek bude záviset na farmakokinetických parametrech formulovaného zkráceného GDNF proteinového produktu a způsobu jeho podání.

Bez ohledu na způsob podání se specifická dávka zpravidla vypočte na základě tělesné hmotnosti nebo povrchové plochy těla jedince, kterému má být aplikována. V případě mozkových chorob se specifická dávka zpravidla vypočte na základě přibližně hmotnosti mozku pacienta, kterou lze stanovit na základě tělesné hmotnosti nebo plochy povrchu těla pacienta. Další upřesnění výpočtu, nezbytné pro stanovení vhodné dávky výše zmíněných formulací pro ošetření, je rutinní prací odborníka v daném oboru. Příslušné dávky lze určit za použití testů, které se používají pro stanovení dávek a ze získané závislosti dávka-odezva. Finální dávkový režim stanoví příslušný ošetřující lékař, který musí zvážit různé faktory ovlivňující působení účinných látek, například věk, celkový stav, tělesnou hmotnost, pohlaví a stravu pacienta, závažnost dané infekce, dobu podávání účinné látky a další klinické faktory.

Zkrácený GDNF proteinový produkt podle vynálezu může být rovněž použit samotný nebo v kombinaci s dalšími růstovými faktory při léčení nervových chorob. Zkrácený GDNF proteinový produkt lze například použít, při léčení určitých forem nervových chorob, v kombinaci s nervovým růstovým faktorem. Dále lze zkrácený GDNF proteinový produkt použít společně s dalšími faktory nebo dalšími molekulami včetně chemických kompozic. Při léčení Parkinsonovy choroby se zkrácený GDNF proteinový produkt může použít samotný nebo v kombinaci s podáním levodopa, přičemž zkrácený GDNF by měl zvyšovat produkci endogenního dopaminu a neuronální spotřebu zvýšené koncentrace dopaminu.

Jak již bylo uvedeno výše, rovněž je třeba uvážit, že další neurotrofní neboli neurony zásobující faktory jsou nezbytné při léčení určitých neuronálních buněčných populací nebo určitých typů. Další faktory, které mohou být použity ve spojení s zkráceným GDNF, zahrnují neomezujícím způsobem: mitogeny, například inzulín, inzulínu podobné růstové faktory, epidermální růstový faktor, vazoaktivní růstový faktor, polypeptid aktivující adenylátcyklázu podvěsku mozkového, interferon a somatostatin; neurotrofní faktory, jako například z mozku odvozený neurotrofní faktor, neurotrofin-3, neurotrofín-4/5, neurotrofin-6, inzulínu podobný růstový faktor, ciliámí neurotrofní faktor, kyselinový a bazický fibroblastový růstový faktor, fibroblastový růstový faktor-5, transformační růstový faktor-β, kokain-amfetaminový regulovaný tran skript (CART) a zralý GDNF; a další růstové faktory, například epidermální růstový faktor, faktor inhibující leukémii, interleukiny, interferony a kolonie stimulující faktory; a rovněž molekuly a materiály, které jsou funkčními ekvivalenty těchto faktorů.

Je zřejmé, že pro dané ošetření může být výhodné kontinuální podání nebo trvalá doprava zkráceného GDNF proteinového produktu. Zatímco kontinuální podání lze realizovat pomocí mechanických prostředků, například infuzní pumpy, je zřejmé, že lze praktikovat i další způsoby kontinuálního nebo v podstatě kontinuálního podání. Například chemickou derivatizaci se může

-27CZ 297326 B6 dosáhnout trvale se uvolňujících forem, které umožňují kontinuální přítomnost předem stanoveného množství účinné látky v krevním řečišti, daném předem stanoveným dávkovým režimem.

Zkrácené GDNF proteinového produkty tedy zahrnují zkrácený GDNF protein, efektivně derivatizovaný pro kontinuální podání.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadá terapie, zahrnující například intracerebrální implantaci buněk, produkující zkrácený GDNF protein. Toto provedení vynálezu zahrnuje implantování buněk, které jsou schopny syntetizovat nebo sekretovat biologicky aktivní formu zkráceného GDNF proteinu do těla pacientů. Těmito buňka produkujícími zkrácený GDNF protein mohou být buňky, které normálně neprodukují neurotrofní faktor, ale které byly modifikovány tak, aby produkovaly zkrácený GDNF nebo buňky, jejichž schopnost produkovat GDNF protein byla rozvinuta transformací polynukleotidem, vhodným pro expresi a sekreci zkráceného GDNF proteinu. Aby se minimalizovala potenciální imunologická reakce u pacientů, způsobená podáním GDNF proteinů cizích druhů, je výhodné pro produkci zkráceného humánního GDNF proteinu použít buňky lidského původu.

Zapouzdřením implantovaných buněk se vyloučí infiltrace buněk do mozkové tkáně. Humánní nebo nehumánní zvířecí buňky mohou být implantovány do těl pacientů v biologicky slučitelném polopropustném polymemím obalu nebo membráně, která umožní uvolnění zkráceného GDNF produktu ale která zabrání destrukci buněk imunitním systémem pacienta nebo jinými škodlivými faktory okolní tkáně. Alternativně by bylo možné implantovat do těla pacienta přímo pacientovy vlastní buňky transformované ex vivo tak, aby produkovaly zkrácený GDNF protein, přičemž tyto buňky lze implantovat bez jakéhokoliv zapouzdření.

Metodologie pro membránové zapouzdření živých buněk je odborníkům v daném oboru známa a příprava zapouzdření buněk a jejich implantace do těl pacientů je popsána například v patentu US 4 892 538; US 5 011 472; a US 5 106 627. Sytém pro zapouzdřování živých buněk rovněž popisuje PCT přihláška WO 91/10425 od Aebischera a kol., viz také PCT přihláška WO 91/10470 od Aebischera a kol.; Winn a kol., Exper. Neurol., 113:322-329, 1991; Aebischer a kol., Exper. Neurol., 111:269-275, 1919; Tresco akol.^&UO, 38:17-23, 1992.

Při terapii in vivo zkráceným GDNF proteinovým genem se nukleokyselinová sekvence, kódující GDNF protein, zavádí přímo do těla pacienta. Nukleokyselinová sekvence, kódující zkrácený GDNF protein, se například zavádí do cílových buněk lokální injektáží nukleokyselinového konstruktu, případně spolu s vhodným dopravním vektorem, například s adenoasociovaným vektorem. Alternativní virové vektory zahrnují neomezujícím způsobem vektory retroviru, adenoviru, viru herpes simplex a papilomového viru. Fyzického přenosu lze dosáhnout in vivo místní injektáží požadovaného nukleokyselinového konstruktu nebo jiného vhodného dopravního vektoru obsahujícího požadovanou nukleokyselinovou sekvenci, liposomem, mediátovaného transferu, přímé injektáže (holé DNA), receptorem mediovaného transferu (komplex ligand-DNA) nebo bombardováním mikročásticemi (genová pistole).

Je třeba zmínit, že zde popsané zkrácené GDNF proteinové formulace mohou být použity pro veterinární a rovněž humánní aplikace a že výraz „pacient“ by neměl mít omezující význam. V případě veterinární aplikace by mělo být dávkové rozmezí stejné jako ve výše popsaném případě.

Jako prostředek dále charakterizující zkrácené GDNF proteiny podle vynálezu mohou být vyvinuty protilátky, které váží zkrácený GDNF protein podle vynálezu, například epitopeny v X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y aminokyselinové sekvenci. Odborník v daném oboru může použít známé publikované postupy pro získání monoklonálních a polyklonálních antibiotik nebo rekombinantních antibiotik, které specificky rozpoznávají a váží různé proteiny kódované aminokyselinovými sekvencemi podle vynálezu. Tato antibiotika lze následně použít pro purifikaci a charakterizaci zkráceného GDNF proteinu. Alternativně lze protilátky použít jako terapeutické inhibitory proteinů, proti kterým jsou směrovány.

-28CZ 297326 B6

Další znaky a výhody vynálezu se stanou zřejmějšími po prostudování následujících ilustrativních příkladů. Příklad 1 je adresován expresi zralého GDNF savčího buněčného systému a přípravě zkráceného GDNF proteinu. Příklad 2 je adresován expresi zralého GDNF v bakteriálním buněčném systému. Příklad 3 je adresován expresi různých zkrácených GDNF proteinů v bakteriálním buněčném systému. Příklad 4 porovnává biologickou aktivitu zralého GDNF proteinu a zkráceného GDNF proteinu v testu dopaminergické neuronové neurotrofní aktivity.

Následující příklady jsou pouze ilustrativního charakteru a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese zralého humánního GDNF v CHO buňkách a purifíkace z CHO-odvozeného zkráceného GDNF proteinu

Materiály

Následující materiály se použití při expresi humánního GDNF v dihydrofolátreduktázu a postrádajících CHO buňkách (CHOď buňky například popisuje Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 77(7): 4216-4220 (1980)).

CHOd médium obsahovalo: Dulbeccovo modifikované médium Eagle (DMEM) s vysokým obsahem glukózy (Gibco/BRL); 5% fetální bovinní sérum (HyClone); MEM nepostranných aminokyselin (1%) (Gibco/BRL); hypoxanthin/thymidin (1%) (Gibci/BRL); a glutamin/penicilin/streptomycin (1%) (Irvin Scientific).

Selektivní médium obsahovalo: DMEM (vysoký obsah glukózy); 5% dialyzované fetální bovinní sérum (HyClone); MEM nepodstatné aminokyseliny; a glutamin/penicilin/streptomycin.

2X HEPES-pufrovaný fyziologický roztok (HSB) obsahoval: 280 mM NaCl; 10 mM KC1; 1,5 mM Na₂HPO₄; 12 mM dextrózy; a 50 mM HEPES.

Tris-pufrovaný fyziologický roztok plus Tween (TBST) obsahoval: 137 mM NaCl; 20 mM Tris/HCl pH 7,5; a 0,1% Tween-20.

Metody

Transfekce a selekce

CHOd buňky (průchod 20) se inokulovaly do 60mm misek pro kultivaci tkání (Falcon) při hustotě 8x10⁵ buněk na misku v CHOd' růstovém médiu. Následující den, přibližně tří hodiny před transfekcí, se médium na buňkách nahradilo čerstvým médiem.

Plasmidové konstrukty obsahující příslušnou GDNF cDNA se připravily za použití známých technik. Plasmidový konstrukt pDSRa2 se například připravil způsobem, který byl v podstatě shodný se způsobem popsaným v následující patentové přihlášce US 501 904 podané 29. března 1990 (viz také Evropská patentová přihláška 90305433, publikovaná přihláška EP 398 753, podaná 18. května 1990 a WO/14363 (1990)). Příkladná plasmidová mapa, která ilustruje strukturní organizace vektoru, je znázorněna na obrázku 2. Je zřejmé, že pro sestavení plasmidové mapy lze použít rovněž celou řadu různých nukleokyselinových sekvencí, kódujících zralý GDNF protein, například lze použít sekvence znázorněné na obrázcích 1, 3 a 4.

-29CZ 297326 B6

HindlII- Xbal DNA fragment obsahující humánní GDNF, který kóduje sekvence a konvenční

Kozákovy sekvence, CCACC (ATG), se izolovaly restrikční enzymatickou digerací z expresního vektoru na bázi pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). DNA segment se přímo nakloňoval do

HindlII/Xbal řezu pDSRa2. Výsledný plasmid se označil pSW5. Plasmid DNA pSW5 se před transfekcí linearizoval v místě Puvl.

pDSRcc2 (obrázek 2) je derivátem plasmidu pCD (Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280-289, 1983) se třemi hlavními modifikacemi: (i) SV40 polyadenylační signál se nahradil signálem z α-podjednotky bovinního folikulámího stimulačního hormonu, α-bFSH (Goodwin a kol., Nucleic Acids Res. 11: 6873-6882, 1983); (ii) myší dihydrofolátreduktázový minigen (Gasser a kol, Proč. Nati. Acad. Sci. 79: 6522-6526, 1982) vložený ze expresní kazetu, který umožnil selekci a amplifikaci transformantů; a (iii) 267 bp fragment obsahující „R-prvek“ a část „U5“ sekvencí dlouhé koncové repetice (LTR) viru humánní T-buněčné leukémie typu I (HTLV-I) se nakloňoval a vložil mezi SV40 promotor a již popsané sestřihové signály (Takabe a kol., Mol Cell Biol. 8: 466-472, 1988).

Připravily se roztoky DNA, které obsahovaly konečnou koncentraci 3,0 pg/misku GDNF-plasmidové DNA, 7,0 pg/misku genomové nosné DNA myších ledvin (Clontech), 25 pl/misku 2,5M CaCl₂ a sterilní destilovanou vodu do konečného obsahu 250 pl/misku. Podobným způsobem se připravily DNA roztoky obsahující pDSRa2 vektorovou DNA nebo samotnou nosnou DNA, jako pozitivní, resp. negativní kontrolní roztoky. DNA roztoky se přidaly po kapkách do shodného objemu 2X HEPES-pufrovaného solného roztoku za současného probublávání roztoku vzduchem. DNA/HBS roztoky se inkubovaly 30 minut při pokojové teplotě.

Po odstranění média z CHOd' buněčných kultur se do každé misky s kulturou přidalo 500 pl DNA roztoků. Misky se inkubovaly 30 minut při pokojové teplotě. Po uplynutí této doby se do každé misky přidalo 5,0 ml CHOd' média. Potom se misky inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C.

Následující den se médium nahradilo čerstvým CHOd' médiem. Den potom, co buňky vytvořily spojitou vrstvu, se kultury trypsinizovaly a přeočkovaly do lOmm misek (Falcon) v poměru 1 x 60mm misku ku 8 χ 1 OOmm miskách. Buňky se přemísťovaly v selektivním médiu. Kulturám se každé dva až tři dny dodávalo čerstvé médium.

Po patnácti dnech se kolonie transfektovaných buněk izolovaly za použití skleněných klonovacích válců, trypsinizovaly a přeočkovaly na 24jamkové plotny (Falcon). Z GDNF/pSW5-transfektovaných buněk se izolovalo celkem 40 kolonií. Zbývající buňky na plotnách se trypsinizovaly, spojily a přemístily do dvou lOOmm misek (jedno spojení pro každý DNA konstrukt).

Prohledávání transfektovaných buněk

24jamkové a spojené kultury se potom, co vytvořily spojitou vrstvu, zbavily růstového média a toto médium se nahradilo séra prostým médiem (400 μΐ/jamku nebo 4 ml/misku). Buňky se inkubovaly 48 hodin, načež se kondiciované médium sklidilo. GDNF proteinová exprese vzorků kondiciovaného média se analyzovala pomocí westernového blotu. Alikvotní podíly kondicovaného média (20 μΐ nebo 40 μΐ) se naředily elektroforézovým vzorkovým pufrem (s nebo bez β-merkaproethanolu). Vzorky obsahující β-merkaptoethanol se tři minuty vařily (redukční podmínky). Jak redukované, tak neredukované vzorky se analyzovaly na 16% Tris-glycinových gelech (Novex). Gely se elektroforeticky přenesly na nitrocelulózové filtry (Schleicher a Schuell BA-83, 0,2 μ). Gelové membrány se promyly TBST a následně inkubovaly třicet minut při pokojové teplotě v blokačním roztoku 5% sušeného mléka (Camation) v TBST. Membrány se následně ošetřovaly jednu hodinu při pokojové teplotě GDNF antisérem (králičí polyklonální antisérum působící proti z E. coli odvozenému GDNF; 1:100 v 5% mléku v TBSDT). Membrány se následně promývaly 1x10 minut TBST a 2 x 5 minut 1% mlékem v TBST. Potom se ošetřovaly 20 minut anti-králičí, peroxidázou Ig-selského křenu konjugovanou sekundární protilátkou (1:15 000 a v 1% mléku v TBST). Membrány se promývaly 1 x 20 minut a 2 x 10 minut TBST a

-30CZ 297326 B6 následně se jednu minutu ošetřovaly ECL reakčními činidly (Amersham) a exponovaly na

Hyperfilm-ECL (Amersham).

Následující postup popisuje purifíkaci CHO—exprimovaného GDNF a CHO—derivovaného, sestřihem zkráceného, GDNF homodimeru zjednoho litru kondiciovaného média. Vzhledem ke značné aktivitě proteázy v CHO médiu, která způsobuje sestřih řetězce na zbytku 31, může postup zahrnovat použití proteázového inhibitoru v průběhu purifikace.

Krok 1.

Kuličková chromatografie

Přidáním jedné padesátiny objemu 1 M MES, pH 6,0 se připravilo séra prosté kondiciované médium 20 mM 2-[N-morfolino]ethansulfonát (MES), pH 6,0. Přidalo se dvacet pět mililitrů SP sepharózové pryskyřice Sepharose Big Bead (Pharmacia), uvedené do rovnovážného stavu, pomocí 20 mM MES, pH 6,0, a míchalo se při 4 °C jednu hodinu. Pryskyřice se nechala usadit a následně se izolovala oddekantováním kondiciovaného média. Neusazená pryskyřice se získala přefiltrováním oddekantovaného média přes fritový kotoučový filtr. Usazená pryskyřice a pryskyřice následně izolovaná filtrací se resuspendovala a nalila do kolony o průměru 2,5 cm, promyla se třemi objemy kolony (dále jen CV) 0,15 M NaCl, 20 mM MES, pH 6,0 (pufr A). Protein se eluoval 300 ml gradientem pufru A až 1,0 M NaCl, 20 mM MES, pH 6,0 (pufru B) při průtoku 0,2 obsahu kolony/minut, přičemž absorbance se monitorovala při 280 nm. Sebraly se frakce obsahující 1,1 objemu kolony. Přítomnost GDNF ve frakcích se detekovala analýzou westernového přenosu. Frakce obsahující GDNF se sloučily pro další purifíkaci. GDNF se eluoval mezi 0,3 a 0,6 M NaCl.

Krok 2.

HPLC C4 chromatografie

Sloučená frakce z kroku 1, která se připravila jako 0,1% (obj/obj) trifluoroctová kyselina (TFA), se vakuově přefiltrovala přes 0,45 pm filtr a zavedla do kolony Vydac C4 (0,46 x 25cm) kondiciované 10% vodným roztokem acetonitrilu, 0,1% TFA (pufr A). Protein se 50 minut eluoval 2%/min lineárním gradientem (od pufru A do 90% vodného roztoku acetonitrilu, 0,1% TFA (pufru B)), přičemž absorbance se monitorovala při 280 nm. Odebraly se lmm frakce, u kterých se zjišťovala přítomnosti GDNF pomocí analýzy westernového blotu. GDNF se eluoval mezi 45% a 55% acetonitrilem. Frakce se vysušily ve vakuu.

Krok 3.

Vysoce výkonná S chromatografie

Frakce obsahující GDNF z kroku 2 se znovu rozpustily v jednom mililitru 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 a aplikovaly do 0,75 x 7,5 cm TST-Gel 5WP vysoce výkonné S kolony (Toso Haas). Lineární gradient 0,4%/min běžel od 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 (pufr A) do 1,0 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 (pufr B) 50 minut při průtoku 1 ml/min. Odebraly se jednominutové frakce a absorbance se měřila při 280 nm. Při 35% B pufru se gradient změnil na 6,5%/min gradient, trvající 10 minut. Analýza westernového blotu na odebraných frakcích ukázala čtyři hlavní GDNF složky. Tři ze složek byly eluovány během, 0,4%/min gradientu a čtvrtá se eluovala během 6,5%/min gradientu. Podobné složky se sloučily a použily pro sekvencování. Sekvencováním se identifikovaly přibližně 29 až 36 kD odebrané frakce jako [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein. Přibližně 38 až 40 kD složka se identifikovala jako [Arg³²-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF/zralý GDNF heterodimer. Přibližně 41 až 44 kD složka, která se izolovala během druhé části gradientu, se identifikovala pomocí sekvencování jako zralý GDNF homodimer.

Příklad 2

Zralý humánní GDNF produkovaný E. coli

-31 CZ 297326 B6

Bakteriální exprese zralého humánního GDNF lze dosáhnout pomocí způsobu popsaného Linem a kol.

(WO 93/06116; a Evropská patentová přihláška EP 610 254). Odborníkovi v daném oboru je po prostudování předloženého vynálezu zřejmé, že po expresi v E. coli nebo dalších bakteriích lze použít nebo přizpůsobit celou řadu různých materiálů a způsobů. V expresních procesech lze využít například střídající se polynukleotidy, zejména ty polynukleotidy, které jsou znázorněny na obrázcích 1, 3 a 4.

Opakované sbalení a purifikace zralého GDNF

Transformované buňky se zpracovaly při 5 °C (není-li stanoveno jinak) následujícím způsobem: buněčná pasta (30 g) se suspendovala do konečného objemu 200 mililitrů za použití 25 mM Tris, pH 8,5 obsahujícího 5 mM EDTA, čímž se připravila finální 15% buněčná suspenze (hm/obj.) Buňky se zcela dispergovaly za použití ručního nízkostřižného homogenizéru Biospec. Suspenze se dvakrát protáhla mikrofluidizérem při 100 MPa, čímž se buňky rozlomily a uvolnila se inkluzní těla. Výsledný homogenizát se následně odstřeďoval 30 minut při 16 000 x g. Peleta inkluzních těl z odstřeďování se promyla resuspenzí v ledové vodě do konečného objemu 240 mililitrů za použití homogenizéru Biospec, jako v předchozím případě za vzniku suspenze. Vzorek této suspenze se udržoval pro HPLC analýzu stupně GDNF exprese. Zbývající suspenze se odstřeďovala 30 minut při 16 000 x g. Supematant se vypustil a malé množství studené vody se přidalo do odstředivé láhve a ta se mírně provířila za účelem odstranění volně vytvořené membránové vrstvy na vrcholu pelet inkluzních těl. Peleta se resuspendovala pomocí homogenizéru Biospec za použití dostatečného objemu studené vody, čím se získala koncentrace GDNF 2 mg/ml. Inkluzní těla se následně solubilizovala smísením konečné suspenze inkluzních těl (25 ml) a 8M guanidin HC1 (25 ml) obsahující 180 mM cystein HC1 a 50 mM Tris HC1, pH 8,7. Solubilizační směs se míchala při 25 °C 60 až 90 minut a po uplynutí této doby se nalila za stálého míchání do 2 M močoviny (450 ml, při 5 °C) obsahující 20 mM Tris HC1, pH 8,75 a 0,2 M guanidin HC1. Tato znovu sbalená směs se pozvolna míchala 72 hodin při 5 °C.

Znovu sbalený GDNF se částečně purifikoval následujícím způsobem: pufr, tvořený 20 mM octanem sodným (250 ml, pH 5), se při 5 °C za intenzivního míchání přidal do znovu sbalené směsi a pH hodnota se nastavila na 5 přidáním ledové kyseliny octové. Výsledná sraženina se odstranila 45minutovým odstřeďováním při 13 600 x g a při 5 °C. Supematant, získaný tímto odstřeďováním, se použil jako zásobní roztok pro následný purifikační krok, který zahrnuje kationtovou iontoměničovou chromatografii pomocí SP-velkokuličkové pryskyřici (Pharmacia). Kolona pracovala při 5 °C a 20 mM octanu sodného (pH 5) se použilo pro uvedení do rovnovážného stavu, promývání a jako eluční pufrovací systém. Pryskyřicové lože (5 ml) se dezinfikovalo pěti objemy kolony (CV) 0,2N NaOH a následně uvedlo do rovnovážného stavu pomocí octanového pufru (5 CV). Zásobní roztok (190 ml) se zavedl do kolony rychlostí 0,5 CV/minutu a následně se propláchnul 10 CV průplachem octanovým pufrem při stejném průtoku. GDNF se následně eluoval z pryskyřice 20 CV lineárním gradientem NaCl od 0,3M do 0,9M v octanovém pufru při průtoku 0,1 CV/min. U eluátu z kolony se monitorovala absorbance při 280 nm a sebral se jako frakce, které se analyzovaly pomocí SDS-PAGE. Frakce obsahující GDNF se odebíraly od čela DDNF píku (10% výška píku) k patě píku (10% výška píku). Protein v těchto odebraných frakcích tvoři zcela GDNF, který v závislosti na použití produkčního kmene obsahoval 32% až 12% kontaminaci modifikovanými GDNF formami. Odebrané frakce se následně dialyzovaly proti PBS nebo dalšímu formulačnímu pufru a v některých případech se zahustily ultrafíltrací na 25 mg/ml. Jak standardní typ, tak analogické formy GDNF, purifíkovaného tímto postupem se charakterizovaly HPLC s reverzní fází, kationtoměničovou HPLC, hmotovou spektrometrií a endotoxinovými hladinami, aby se pozorovala čistota přípravků v závislosti na odpovídajících produkčních kmenech.

-32CZ 297326 B6

Příklad 3

Rekombinantní produkce zkráceného GDNF v E. coli

Příkladné zkrácené proteiny se produkovaly v podstatě způsobem, který popisuje Lin a kol. (patentová přihláška US 08/182,183, podaná 23. května 1994, viz výše). Rovněž lze použít alternativní bakteriální expresní materiály a způsoby, které byly popsány výše. V E. coli exprimované zkrácené GDNF proteiny zahrnují [Pro²³-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴] a [Gly³³—Ile¹³⁴] zkrácené GDNF proteiny, které jsou znázorněny na obr. 5 a 6, resp. 7. Zkonstruovaly se polynukleotidy, kódující tyto exemplární zkrácené GDNF proteiny, které jsou znázorněny na obr. 5, 6 a 7, ale rovněž lze použít odpovídající polynukleotidy znázorněné na obrázcích 1, 3 a 4. Polynukleotidy se zkonstruovaly pomocí standardních PCR postupů, které jsou popsány v PCR Technology, Principles and Application for DNA Amlification, Henry A., Erlich, Ed., Stockton Press, NY, 1989 (kapitola 6, Using PCR to Engineer DNA).

Příklad 4

Biotest stanovující dopaminergickou Neuronovou neurotrofní aktivitu

U E. coli exprimovaných [Pro²³-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴, [Gly³³-Ile¹³⁴] a [Lys³⁷-Ile¹³⁴] zkrácených GDNF proteinů z příkladu 3 a CHO-odvozeného [Arg³²-lle¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu z příkladu 1 se kvantitativně stanovovala jejich schopnost podporovat dopaminovou spotřebu dopaminergickými neurony černé hmoty.

Materiály

Při testu, který určoval přežití dopaminergických neuronů v přítomnosti zkrácených GDNF proteinů se použily následující materiály.

Buněčné kultivační médium

Vysokoglukózové Dulbeccovo modifikované médium Eagle (DMEM; katalog #11965-092), Hamovo F 12 médium (F12; #11765-021), Leibovitzovo L15 médium bez hydrogenuhličitanu sodného (#41300-039), B27 médiový doplněk (#17504-010), penicilín a streptomycin (#15070-014), L-glutamin (#25030-016), Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (D-PBS; #14190-052), Hankův vyrovnávací solný roztok s vápenatou a hořečnatou solí (HBSS; #24020-026), kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonovou (HEPES; #15630-015), myší laminin (#23017-015) a albuminovou frakci Vbovinního séra (#110-18-017) dodala společnost GIBCO, Gransd Island, NY. Tepelně inaktivované koňské sérum bylo od společnosti HyClone, Logan, Utah. Conalbumin (C-7786), poly-L-omithin hydrobromid (P-3655), bovinní inzulín (1-5500), humánní transferin (T-2252), putrescin (P-6024), progesteron (P-6149), selenit sodný (S—9133) a metrizamid (M-3383) byly od společnosti Sigma Chemical company, SaintLouis, MO. Papain, deoxyribonukleáza I (DNAáza) a ovalbumin (papain dissociation systém) byly od společnosti Worthington Biochemicals, Freehold, NJ.

Sterilní 96jamkové mikroplotny Falcon (#3072), umělohmotné pomůcky a polypropylenové kyvety odstředivky pro trnové kultury byly od společnosti Becton-Dickinson, Oxnard, CA. Skleněné zvony Nunc Lab-Tek pro tkáňovou kulturu (#136439) byly od společnosti Baxter, Irvine, CA; 20pm (#460) nylonové síto bylo od společnosti Tetko, Elmsford, NY; a 4 lékařské kleště a 4 lékařské nůžky byly od společnosti Roboz Surgical, Washington, DC.

Protilátky a příbuzná reakční činidla

Polyklonální králičí anti-tyrosinové hydroxylázové protilátky (TE101) od společnosti Eugene Těch, Rigefield Park, NJ; polyklonální králičí antineuronal-specifícké enolázové protilátky (NSE, AB951), byly od společnosti Chemicon, Temecula, CA; a biotynylátovaný kozí anti-králičí IgG a peroxidázou konjugovaný avidin/biotinový komplex (ABC Elitě; Vertastain kit

-33 CZ 297326 B6

PK-6100) byly od společnosti Vector Laboratories, Burlingame, CA. 3',3-diaminobenzidin by od společnosti Cappel Laboratories, West Chester, PA. Blokační pufr Superblock a PBS (#37515) byl od společnosti Chemical Company, Rockford, IL. Triton X-100 (X100), Nonidet P40 (N6507) a peroxid vodíku (30%), obj/obj; H1009) byl od společnosti Sigma. GBR-12909 inhibitor dopaminové spotřeby (D-052) byl od společnosti RBI, Natick MA. ³H-dopamin (tritiovaný dopamin, NE-131; 21 Ci/mmol) byl od společnosti New England Nuclear, Boston, MA. Scintilační koktejl Optiphase Supermix byl od společnosti Wallac, Turku, Finland. Bílé ViewPlate-06 mikroplotny (#6005182) byly od společnosti Packard Intruments Corporation, Meriden, CT. Všechny další reakční činidla dodala, není-li stanoveno jinak, společnost Sigma Chemical Company.

Příprava média

Základní médium se připravilo jako 1:1 směs DMEM a média F12, která se obohatila B27 médiovým doplňkem, přidaným jako padesátinásobek koncentrovaného zásobního roztoku. L-glutamin se přidal při konečné koncentraci 2 mM, penicilín přibližně při 10 IU/1 a streptomycin přibližně při 100 mg/1. Konečná koncentrace přidaného tepelně inaktivovaného koňského séra byla přibližně 15%. Po smísení se pH hodnota nastavila přibližně na 7,3 a médium se udržovalo při 4 °C. Médium se připravilo těsně před použitím, aby se minimalizovaly odchylky během experimentu. Absorbance proteinů se minimalizovala použitím umělohmotných pipet a nádob.

Kultivační substrát

Za účelem podepření optimálního přichycení neuronů substrátu a neuritový růst se povrchy mikrotitrační plotny (kultivační substrát) modifikovaly postupným potažením poly-L-omithinem a lamininem. Povrchy plotny se zcela pokryly 0,1 mg/ml sterilního roztoku poly-L-promithinu v 0,1 M kyseliny borité (pH 8,4), při pokojové teplotě, na dobu alespoň jedné hodiny a potom se promyly vodou Super-Q. Promývací voda se následně odsála a na povrchy plotny se přidal 1,0 pg/ml roztoku myšího laminu v PBS a následovala dvouhodinová inkubace při 37 °C. Aby se zajistila reprodukovatelnost výsledků, prováděly se tyto procedury bezprostředně před použitím ploten.

Příprava kultur černé hmoty embryonální krysy

Mozky embryonálních krys Sprague-Dawley se použily jako zdroj dopaminergických neuronů. Použily se 15 dní staré zárodky krys Sprague-Dawley. Pro každý příklad se použilo maximálně 36 embryí (přibližně 3 i). Gravidní krysy se usmrtily pomocí CO₂, jejich abdominální dutiny se otevřely pomocí lékařských nůžek a plody se vyjmuly z dělohy. Mozky plodu se následně rozřezaly, zbavily krve a menigů a ventrální termální plocha obsahující černou hmotu a rozřezala za použití známých anatomických zásad (Altman a Bayer, Has of Prenatal Rat Brain Development, CRC Press, Boča Raton, FL, 1995). Tkáně se ukládaly do ledově studeného D-PBS, převedly do 10 mililitrů disociačního média (120 jednotek papainu a 2000 jednotek DNAázy a HBSS) a následně se inkubovaly 45 minut, přibližně při 37 °C, na rotační platformové protřepávačce, přibližně při 200 ot./min. Buňky se následně dispergovaly triturací pomocí ohněm leštěných Pasteurových pipet, prosily přes 20μιη síto Nitex, čímž se zbavily nedisociované tkáně a odstřeďovaly pět minut při 200 x g za použití IEC klinické odstředivky. Výsledné buněčné pelety se resuspendovaly do HBSS obsahujícího ovalbumin a přibližně 500 jednotek DNAázy, navrstvené na 4% ovelbuminovém roztoku (v HBSS), a odstřeďovaly přibližně 10 minut při 500 x g. Finální pelety se resuspendovaly v kompletním kultivačním médiu (viz výše), zkorigovaly přibližně na 28 000 buněk/ml a naočkovaly v alikvotních podílech (90 μΐ) do 6mm jamek 96jamkových mikroploten, které byly předem potaženy polyomithinem a lamininem. Navázání buněk probíhalo rychle a povlak pokrýval přibližně 75 % povrchu.

Imunohistochemie dopaminergických neuronů

Mírně modifikovaná nepřímá imunoperoxidázová metoda, kterou popisuje Louis a kol. (J. Pharmacol. Exp. Therap., 262:1274-1283, 1992; Science, 259:689-692, 1993) se použila pro

-34CZ 297326 B6 charakterizaci dopaminergických neuronů v kulturách černé hmoty. Kultury se přibližně 30 minut fixovaly při pokojové teplotě, 4% paraformaldehydem v D-/BS, pH 7,4 a následně třemi proplachy v D-PBS (200 μΐ na 6mm jamku). Fixované kultury se následně inkubovaly v blokačním pufru Superblock v PBS, obsahujícím 1 % NP^IO, čímž se zvýšila penetrace protilátek. Následně se ve stejném pufru aplikovaly primární králičí anti-tyrosinové hydroxylázové protilátky při naředění přibližně 1:2000 a inkubovaly se jednu hodinu při 37 °C na rotační protřepávačce. Po třech propláchnutích D-PBS se navázané protilátky detekovaly pomocí kozího anti-králičího biotinylátovaného IgG, přibližně při naředění 1:500; tyto sekundární protilátky se inkubovaly buňkami při 37 °C přibližně jednu hodinu. Buňky se následně třikrát promyly D-PBS a sekundární protilátky se detekovaly pomocí avidin-biotinperoxidázového komplexu, naředěného na 1:500, a buňky se inkubovaly přibližně 45 minut při 37 °C. Po dalších třech proplaších D-PBS kultury reagovaly 5 až 20 minut v 01 M Tris-HCl, pH 7,4, který obsahoval 0,04% 3',3'-diaminobenzidin-(HCl)4, 0,06 % NiCl₂ a 0,02 % peroxidu vodíku.

Hodnocení přežívání neuronů

Kultury černé hmoty se fixovaly a zpracovaly pro účely výše popsaného imunologického zabarvení a následně se analyzovaly pomocí průtlačné optiky při 200násobném zvětšení. Ve všech 6mm 96jamkových mikroplotnách se spočetly neurony zabarvené tyrosinhydroxylázou. Životaschopné neurony byly charakterizovány jako neurony, které mají pravidelně tvarové buněčné tělo s hlavním axonem a několika dendrity. Neurony, které vykazovaly známky degenerace, například nepravidelná, vakuová perikara nebo fragmentované neurity, byly ze sčítání vyloučeny (nicméně většina degenerovaných neuronů se z kultivačního substrátu oddělila). Počet dopaminergických neuronových buněk se vyjádřil buď jako TH-pozitivní neurony/6mm jamku, nebo jako změna sbalení, vztažená ke kontrolní hustotě dopaminergických neuronů.

Určení spotřeby dopaminu

Dopaminová spotřeba se určovala na kulturách neuronů černé hmoty 15 dní starých embryonálních krys v bílých mikroplotnách ViewPlate-96. Kultury se promyly předehřátým sorpčním pufrem (přibližně 100 μΐ), který je tvořen modifikovaným Krebs-Ringerovým roztokem, pH 7,4 obsahujícím přibližně 120 mM NaCl, 4,7 mM KC1, 1,8 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 32 mM NaHPO₄, 1,3 mM EDTA a 5,6 mM D-glukózy. Sorpční pufr rovněž obsahoval 1 mM kyseliny askorbové a 50 pm pargylinu, které měly zabránit oxidaci dopaminu. Buňky se následně přibližně 10 minut preinkubovaly při 37 °C v sorpčním pufru. Do kultur černí hmoty se následně přidal tritiovaný dopamin (³H-DA, 21 Ci/mmol), přičemž jeho koncentrace představovala přibližně 60 minut při 37 °C. Nespecifická dopaminová spotřeba se určila inkubací kultur se sorpčním pufrem obsahujícím inhibitor dopaminové sorpce GBR-12909 (1 μΜ). Nespecifická spotřeba představovala méně než přibližně jedno procento celkové spotřeby. Testy spotřeby se ukončily odsátím inkubačního média a následnými třemi rychlými proplachy ledově studeným sorpčním pufrem (přibližně 120 μΐ). Buňky se následně lyžovaly přidáním scintilačního koktejlu Optiphase Supermix (200 μΐ) a radioaktivita se určila scientilační spektrometrií za použití čítače 96jamkových mikroploten Wallac MicrobetaPlus (tj. spotřeba dopaminu se analyzovala scintilačním sčítáním zadrženého tritia v kultuře). Výsledky se vyjádřily buď jako dpm/6mm jamku, nebo jako změna sbalení vzhledem ke kontrolním kulturám.

Testy

Přežití dopaminergických neuronů a morfologický vývoj

Kultura černé hmoty 15 dní starých (El 5) embryonálních krys, obohacené o dopaminové neurony, se použily pro demonstraci vlivů zkrácených GDNF proteinů na přežití dopaminergických neuronů. Kultury se nechaly růst v polyemithinem a laminem potažených 96jamkových mikroplotnách šest dní samotné nebo v přítomnosti různých koncentrací (rozmezí přibližně od 1 pg/ml přibližně od 10 ng/ml) následujících proteinů; v E. coli exprimovaného zralého hGDNF; v E. coli exprimovaného [Pro²³-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴], [Gly³³—Ile¹³⁴] a [Lys³⁷—Ile¹³⁴] kráceného GDNF

-35 CZ 297326 B6 proteinu; v CHO buňkách exprimovaného zralého hGDNF; a CHO-odvozeného [Arg³²-Ile¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu. Kultivační médiu, tvořené DMEM/F12 obohacené 15% tepelně inaktivovaným koňským sérem (kultury El5) nebo 2,5% tepelně inaktivovaným koňským sérem, D-glukózou, HEPES, inzulínem a transferinem (kultury P6). Imunozabarvení tyrosinhydroxylázy (TH), dopaminovou syntézu omezující enzym, se použilo jako markér pro dopaminové neurony. Protože noradrenalinové neurony v rombencefalonu rovněž pozitivně barví TH, je třeba velmi opatrně vyříznout pouze oblast ventrálního tegmentu mesencefalonu a vynechat kaudálnější oblasti, obsahující noradrenergická buněčná těla. Po šesti dnech byly kultury El5, zpravidla tvořené přibližně ze 70 % neurony (identifikováno výše popsaným neuronálně specifickým enolázovým imunozabarvením) a ze 30 % ne-neuronálními buňkami (které měly zploštělý, fázově tmavý vzhled); přičemž dopaminergické neurony představují přibližně 10 až 15% neuronové populace.

Po šesti dnech se kultury fixovaly paraformaldehydem a imunologicky zabarvily pro tyrosinhydroxylázu, což je markér, který identifikuje dopaminergické neurony v těchto kulturách. Všechny tyrosinhydroxylázově-pozitivní neurony, přítomné v 6mm jamce, se sečetly pod průhlednou optikou. Tři až šest různých jamek se použilo pro analýzu jedné experimentální podmínky. Výsledky se vyjádřily jako procento počtu tyrosinhydroxylázově-pozitivních neuronů, které se nachází v kontrolních kulturách.

Kultury El5 černé hmoty, ošetřené 1,0 ng/ml GDNF, CHO buňkami exprimovaného GDNF nebo E. coli exprimovaným GDNF, obsahovaly přibližně o 38 %, resp. 27 % TH-imunoreaktivních neuronů více než neošetřené kontrolní kultury, což naznačuje, že oba GDNF druhy podporují přežití dopaminergických neuronů. Kultury El 5 černé hmoty, ošetřené 1,0 ng/ml zkráceného GDNF proteinu, vykazovaly podobné zvýšení počtu TH-pozitivních neuronů v kulturách po šesti dnech in vitro: 42 % v případě CHO-odvozeného [Arg³²—Ile¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu; a 26%, resp. 17 % v případě E. coli exprimovaného [Arg³²-Ile¹³⁴] a [Gly³³—Ile¹³⁴} zkráceného GDNF proteinu.

Srovnání kontrolních kultur a kultur ošetřených zralých a zkrácených GDNF proteinem rovněž odhaluje zesílený účinek všech GDNF proteinů na morfologickou diferenciaci dopaminergických neuronů. Účinky [Arg³²—Ile¹³⁴] a [Gly³³—Ile¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu byly identické s účinky jim odpovídajících zralých GDNF proteinových komplementárních dílů TH-imunoreaktivní neurony ve všech kulturách ošetřených GDNF vykazovaly podstatně komplexnější a extenzivnější neuritickou arborizaci a rovněž vyšší stupeň rozvětvení neuritů a celkově větší tělesnou velikost než TH-pozitivní neurony v kontrolních kulturách.

Dopaminová spotřeba

Dopaminová spotřeba měří počet a aktivitu vysoce afinitivních dopaminově resorpčních transportních míst a odráží funkční diferenciaci dopaminergických neuronů. Dopaminová spotřeba se měřila na kulturách černé hmoty El5 krys po šesti dnech in vitro buď se zralým GDNF, nebo zkráceným GDNF proteinem nebo bez něho. U těchto kultur měla dopaminová spotřeba farmakologicky profilové vlastnosti dopaminových neuronů, tj. byla v podstatě blokována (více než z 98%), 1,0 μΜ GBR-12909 inhibitorem dopaminového transportu specifickým pro dopaminergické neurony (ID50 = 20 nM). To naznačuje, že míra dopaminové spotřeby neodráží přítomnost kontaminujících noradrenergických neuronů, které mohou spotřebovávat dopamin prostřednictvím norepinefrinových transportenů ale nejsou citlivé na GBR-12909 inhibici. Účinky CHO-buňkami exprimovaného zralého GDNF a CHO-odvozeného [Arg³²-lle¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu byly identické přibližně 65% zvýšením při ED50, přibližně 20 pg/ml. E. coli exprimovaný [Pro²³-Lys³⁷AAsn³⁷-Ile¹³⁴] zkrácený GDNF protein, znázorněný na obr. 5, vykazuje 65% zvýšení při ED50 přibližně 40 pg/ml. Účinky dopaminové spotřeby E. coli exprimovaného zralého proteinu a E. coli exprimovaného [Arg³²—Ile¹³⁴], [Gly³³—Ile¹³⁴] a [Lys³⁷—Ile¹³⁴] zkráceného GDNF proteinu byly stejné: přibližně 50% zvýšení při ED50, přibližně 50 pg/ml.

-36CZ 297326 B6

Tyto výsledky naznačují, že zkrácené GDNF proteiny působí jako potenciální faktory, které podporují přežití s indukující diferenciaci dopaminergických neuronů černé hmoty. Předpokládá se, že jako takové jsou použitelné při léčení Parkinsonovy choroby, neurologické nemoci charakteristické sníženou emoční bystrostí, zpomalující jak vůlí ovládaný, tak vůlí neovladatelný svalový pohyb, a způsobující ztuhlost a třes. Tyto symptomy jsou známy progresivní degenerace neuronů produkujících dopamin, které se nachází v černé hmotě. Degenerace těchto neuronů („dopaminergických neuronů“) způsobuje zvýšení dopaminu v sousední oblasti mozku, označované jako žíhané tělísko.

Sekvenční protokol (1) údaje k SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 402 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) Druh molekuly: protein (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1..402 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

TCA Ser 1

CCA GAT AAA

CAA Gin 5

ATG GCA GTG CTT CCT AGA

AGA Arg

GAG CGG AAT

CGG Arg

48

Pro

Asp

Lys

Met:

Ala Val

Leu

Pro 10

Arg

Glu

Arg

Asn 15

CAG

GCT

GCA

GCT

GCC

AAC

CCA

GAG

AAT

TCC

AGA

GGA

AAA

GGT

CGG

AGA

96

Gin

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

20

25

30

GGC

CAG

AGG

GGC

AAA

AAC

CGG

GGT

TGT

GTC

TTA

ACT

GCA

ATA

CAT

TTA

144

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

35

40

45

AAT

GTC

ACT

GAC

TTG

GGT

CTG

GGC

TAT

GAA

ACC

AAG

GAG

GAA

CTG

ATT

192

Asn

Val

Thr

Asp

Len

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu

Ile

50

55

60

TTT

AGG

TAC

TGC

AGC

GGC

TCT

TGC

GAT

GCA

GCT

GAG

ACA

ACG

TAC

GAC

240

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Glu

Thr

Tyr

Asp

65

70

75

80

-37CZ 297326 B6

AAA Lys

ATA TTG AAA

AAC Asn 85

TTA Leu

TCC Ser

AGA Arg

AAT AGA AGG CTG GTG AGT GAC AAA

288

Ile

Leu

Lys

Asn

Arg 90

Arg

Leu

Val

Ser

Asp 95

Lys

GTA

GGG

CAG

GCA

TGT

TGC

AGA

CCC

ATC

GCC

TTT

GAT

GAC

CTG

TCG

336

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Leu

Ser

100

105

110

TTT

TTA

GAT

AAC

CTG

GTT

TAC

CAT

ATT

CTA

AGA

AAG

CAT

TCC

GCT

384

Phe

Leu

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

115

120

125

AAA

AGG

TGT

GGA

TGT

ATC

402

Lys

Arg

cys

Gly

zv. ... «-jra

Ile

i ί η Λ. ν (1) údaje k SEQ ID NO: T.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 134 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Ser 1

Pro

Asp

Lys

Gin 5

Met

Ala

Val

Leu

Pro 10

Arg

Glu

Arg

Asn 15

Arg

C-ln

Ala

Ala 20

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn 25

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly 30

Arg

Gly

Gin

Arg 35

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly 40

Cys

Val

Leu

Thr

Ala 45

Ile

His

Leu

Asn

Val 50

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu 55

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys 60

Glu

Leu

Ile

Phe 65

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly 70

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala 75

Glu

Thr

Tyr

Asp 80

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn 85

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg 90

Arg

Leu

Val

Ser

Asp 95

Lys

Val

Gly

Gin

Ala 100

Cys

Arg

Pro

Ile 105

Ala

Phe

Asp

Asp 110

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp 115

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr 120

His

Ile

Leu

Arg

Lys 125

His

Ser

Ala

Lys Arg Cys Gly Cys Ile

130 (1) údaje k SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

-38CZ 297326 B6 (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Gly Lys Asn Arg Gly

5 (1) údaje k SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 (1) údaje k SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5

-39CZ 297326 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 (1) údaje k SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 (1) údaje k SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 (1) údaje k SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid

-40CZ 297326 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 10 (1) údaje k SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

10 (1) údaje k SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 10 (1) údaje k SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

10 (1) údaje k SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselin

-41 CZ 297326 B6 (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 15 10 15 (1) údaje k SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

Asn Ser Arg Gly Lys Giv Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 10 15 (1) údaje k SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg

10 15

Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

-42CZ 297326 B6

Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly

Gin Arg Gly Lys

Asn

Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární o

(ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys

10 15

Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly

10 15

Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

-43CZ 297326 B6

Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg

10 15

Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:

Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin 15 10 15

Arg Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:

Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly

10 15

Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:

-44CZ 297326 B6

Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

10 15

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:

Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg

10 15

Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:

Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly

10 15

Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:

-45 CZ 297326 B6

Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys

10 15

Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 27:

Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly

10 15

Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 28:

Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg

10 15

Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 29:

-46CZ 297326 B6

Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser

10 15

Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 30 (1) údaje k SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 30:

Pro

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

Gin

Ala

AÍ3

Asn

Pro

Glu

1

5

10

15

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

25 30 (1) údaje k SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 31:

Leu 1

Pro Arg Arg Glu Arg 5

Asn Arg Gin Ala 10

Ala

Ala Ala

Asn

Pro 15

Glu

Asn

Ser Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

20

25

30

(1) údaje k SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 32:

-47CZ 297326 B6

Val

Leu Pro

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

Gin

Ala

Aia

Ala

Asn

Pro

1

5

10

15

Glu

Asn Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

20

25

30

Gly (1) údaje k SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 33:

Ala

Val

Leu

Pro

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

Gin

Ala

Asn

1

5

10

15

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

20

25

30

Arg

Gly

(1) údaje k SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 34:

Met Ί

Al a

Val

Leu

Pro 5

Arg Arg

Glu

Arg řisn Arg Gin Ala 10

Ala

Ala 15

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

20

25

30

Asn

Arg

Gly

35

(1) údaje k SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 aminokyselin

(B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 35:

Gin

Met

Ala

Val

Leu

Pro

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

Gin

Ala

1

5

10

15

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

20

25

30

Lys

Asn

Arg

Gly

(1) údaje k SEQ ID NO: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 36:

Lys

Gin

Met

Ala Val 5

Leu

Pro Arg

Arg Glu 10

Arg Asn Arg

Gin

Ala 15

Ala

Ά13

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

20

25

30

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

(1) údaje k SEQ ID NO: 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 37:

Asp

Lys

Gin

Met

Ala

Val Leu

Pro

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

Gin

Ala

1

5

10

15

Ala

Al a

Ala

Asn

Pro

Glu As n

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

20

25

30

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

-49CZ 297326 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 38:

Pro

Asp

Lys

Gin

Met

Ala

Val

Leu Pro

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

Gin

2

5

10

15

Aid

Ala

Asn

Prc

Gj-ú

Asn Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

20

25

30

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

G Σ y

5 (1) údaje k SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 417 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 39:

CATATGTCTC	CGGATAAACA	AATGGCTGTT	CTTCCACC-TC	GTGAACGTAA	CCGTCAGGCG	60
GCCGCTGCTA	ACCCGGAGAA	TTCCCGTGGT	AAAGGTCGTC	GTGGTCAGCG	TGGTAAAAAC	120
CGCGGTTGCG	TTCTGACCGC	TATCCACCTG	AACGTTACCG	ACCTGGGTCT	CGGTTACGAA	1S0
ACCAAAGAAG	AATTAATCTT	CCGTTACTGC	TCCGGTTCCT	GCGACGCTGC	TGAAACCACG	240
TACGACAAAA	TCCTGAAAAA	CCTGTCCCGT	AACCGTCGTC	TGGTTTCCGA	CAAAGTTGGT	300
CAAGCTTGCT	GCCGTCCGAT	CGCTTTCGAC	GACGACCTGT	CCTTCCTGGA	CGACAACCTG	360
GTTTACCACA	TCCTGCGTAA	ACACTCCGCT	AAGCGTTGCG	GTTGCATCTA	AGGATCC	417

(1) údaje k SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 417 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 40:

-50CZ 297326 B6

CATATGAGCC	CGGACAAACA	GATGGCAGTA	CTTCCACGTC	GTGAACGTAA	TCGCCAGGCA	60
GCAGCTGCAA	ACCCGGAAAA	CTCCCGTGGT	AAAGGTCGCC	GTGGCCAGCG	CGGCAAAAAC	120
CGTGGTTGTG	TTCTGACTGC	AATCCACCTG	AACGTTACTG	ACCTGGGTCT	GGGCTACGAA	180
ACCAAAGAAG	AACTGATCTT	CCGCTACTGC	AGCGGCTCTT	GCGACGCAGC	TGAAACCACT	240
T A.C G AC A_AAA	TCCTGAAAAA	CCTGTCCCGT	AACCGCCGTC	TGGTAAGCGA	CAAAGTAGGT	300
CAGGCATGCT	GCCGTCCGAT	CGCATTCGAC	GATGACCTGA	GCTTCCTGGA	TGACAACCTG	360
GTTTACCACA	TCCTGCGTAA	ACACTCCGCT	AAACGCTGCG	GTTGCATCTA	AGGATCC	417

(1) údaje k SEQ ID NO: 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 345 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1..342 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 41:

ATG

TCC

CCA

GAA

AAT

TCT

CGT

GGT

AAA

GGT

CGT

GGT

CAG

CGT

GGT

48

Met

Ser

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

135

140

145

150

AAT

AAC

CGC

GGT

TGC

GTT

CTG

ACC

GCT

ATC

CAC

CTG

AAC

GTT

ACC

GAC

95

Asn.

Asn

Arg

Gly

cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

155

160

165

CTG

GGT

CTC

GGT

TAC

GAA

ACC

AAA

GAA

TTA

ATC

TTC

CGT

TAC

TGC

144

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

170

175

180

TCC

GGT

TCC

TGC

GAC

GCT

GAA

ACC

ACG

TAC

GAC

AAA

ATC

CTG

AAA

192

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Glu

Thr

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

185

190

195

AAC

CTG

TCC

CGT

AAC

CGT

CTG

GTT

TCC

GAC

AAA

GTT

GGT

CAA

GCT

240

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

200

205

210

TGC

CGT

CCG

ATC

GCT

TTC

GAC

CTG

TCC

TTC

CTG

GAC

288

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

215

220

225

2 30

AAC

CTG

GTT

TAC

CAC

ATC

CTG

CGT

AAA

CAC

TCC

GCT

AAG

CGT

TGC

GGT

3 3 6

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

235

240

245

TGC ATC TAA 345

Cys Ile (1) údaje k SEQ ID NO: 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 114 aminokyselin

-51 CZ 297326 B6 (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 42:

Met 1

Ser

Pro Glu

Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly

5

10

15

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

20

25

30

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

35

40

45

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Glu

Thr

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

50

55

60

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

Lys

Val

Gly

Gin.

Ala

65

70

75

80

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

85

90

95

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

100

105

110

Cys Ile (1) údaje k SEQ ID NO: 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 315 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1..312 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 43:

-52CZ 297326 B6

> rf*'/'·' Met 115

CGT Arg

GGT CAA CGT GGT

AAA AAC

CGC GGT TGC GTT

CTG Leu

ACT Thr

GCA Ala

ATC lle 130

48

Gly

Gin Arg

Gly 120

Lys

Asn

Arg

Gly Cys 125

Val

CAC

AAC

SJ i X

aL x

GAC

CTG

GGT

CTG

GGC

TAC

GAA

ACC

AAA

GAA

96

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

135

140

145

CTG

ATC

TTC

CGC

TAC

TGC

AGC

GGC

TCT

TGC

GAC

GCA

GCT

GAA

ACC

ACT

144

Leu

lle

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Glu

Thr

150

155

160

TAC

GAC

AAA

ATC

CTG

AAA

AAC

CTG

TCC

CGT

AAC

CGC

CGT

CTG

GTA

AGC

192

Tyr

Asp

Lys

lle

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

val

Ser

165

170

175

GAC

AAA

GTA

GGT

CAG

GCA

TGC

CGT

CCG

ATC

GCA

TTC

GAC

GAT

GAC

240

Asp

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Arg

Pro

lle

Ala

Phe

Asp

180

185

190

CTG

AGC

TTC

CTG

GAT

GAC

AAC

CTG

GTT

TAC

CAC

ATC

CTG

CGT

AAA

CAC

268

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

lle

Leu

Arg

Lys

His

195

200

205

210

TCC

GCT

AAA

CGC

TGC

GGT

TGC

ATC

TAA

315

Ser

Ala

Lys

Arg

cys

Gly

Cys

lle

215 (1) údaje k SEQ ID NO: 44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 104 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 44:

Met Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lle 15 10 15

	His	Leu	Asn	Val 20	Thr	Asp	Leu
	Leu	lle	Phe 3S	Arg	Tyr	Cys	Ser
	Tyr	Asp 50	Lys	lle	Leu	Lys	Asn 55
	Asp 65	Lys	Val	Gly	Gin	Ala 70	Cys
	Leu	Ser	Phe	Leu	Asp 85	Asp	Asn
	Ser	Ala	Lys	Arg 100	Cys	Gly	Cys
15

Gly	Leu	Gly	Tyr	Glu	Thr	Lys	Glu	Glu
	25					30
Gly	Ser	Cys	Asp	Ala	Ala	Glu	Thr	Thr
40					45
Leu	Ser	Arg	Asn	Arg	Arg	Leu	Val	Ser
				60
Cys	Arg	Pro	lle	Ala	Phe	Asp	Asp	Asp
			75					80
Leu	Val	Tyr	His	lle	Leu	Arg	Lys	His
		90					95

lle

-53 CZ 297326 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 312 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1..309 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 45:

ATG GGT CAA CGT

GGT Gly

AAA Lys 110

AAC CGT

GGT TGT

GTT Val 115

CTG ACT GCA

ATC Ile

CAC His 120

48

Met Gly 105

Gin

Arg

Asn

Arg

Gly

Cys

Leu

Thr

Ala

CTG

AAC

GTT

ACT

GAC

CTG

GGT

CTG

GGC

TAC

GAA

ACC

AAA

GAA

CTG

96

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu

125

130

135

ATC

TTC

CGC

TAC

TGC

AGC

GGC

TCT

TGC

GAC

GCA

GCT

GAA

ACC

ACT

TAC

144

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Glu

Thr

Tyr

140

145

150

GAC

AAA

ATC

CTG

AAA

AAC

CTG

TCC

CGT

AAC

CGC

CGT

CTG

GTA

AGC

GAC

192

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

155

160

165

AAA

GTA

GGT

CAG

GCA

TGC

CGT

CCG

ATC

GCA

TTC

GAC

GAT

GAC

CTG

240

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Leu

170

175

180

AGC

i

CTG

GAC

MC

CTG

GTT

TAC

CAC

ATC

CTG

CGT

AAA

CAC

TCC

268

Ser

Phe

Leu

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

185

190

195

200

GCT

AAA

CGC

TGC

GGT

TGC

ATC

TAA

312

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly Cys

Ile

205 (1) údaje k SEQ ID NO: 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 103 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 46:

-54CZ 297326 B6

Met

Arg

Gly

Gin

Are

Gly

Lys

Asn

Are

r Gly

Cys

Val

Leu Thr Ala Il<

1

5

10

15

H i s

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

20

25

30

Lco

Ile

Phe

Axg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

cys

Asp

Ala

Glu

Thr

35

40

45

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val

Ser

50

55

60

Asp

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

65

70

75

80

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

85

90

95

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

100 (1) údaje k SEQ ID NO: 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 135 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 47:

Met

Ser

Pro

Asp

Lys

Gin

Met

Ala

Val

Leu

Pro

Arg

Glu

, Arg Asn

1

5

10

15

Arg

Gin

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly Lys

Gly Arg

20

25

30

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

. Thr

Ala

l Ile His

35

40

45

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu

50

55

60

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Glu

Thr

Tyr

65

70

75

80

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

85

90

95

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Leu

100

105

110

Ser

Phe

Leu 115

Asp

Asn

Leu

Val 120

Tyr

His

Ile

Leu .

Arg 125

Lys

His

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

130

135

-55CZ 297326 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 104 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 48:

Met

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

1

5

10

15

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

20

25

30

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Glu

Thr

35

40

45

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val

Ser

50

55

60

Asp

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Arg

Pro

Zle

Ala

Phe

Asp

65

70

75

80

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

85

90

95

Ser

Ala

Lys

Arg

cys

Gly

cys

Ile

100 (1) údaje k SEQ ID NO: 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 103 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 49:

-56CZ 297326 B6

Met

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

1

5

10

15

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu

20

25

30

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

cys

Asp

Ala

Glu

Thr

Tyr

35

40

45

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

50

55

60

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Leu

65

70

75

80

Ser

Phe

Leu

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

85

90

95

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

100 (1) údaje k SEQ ID NO: 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 114 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 50:

Met 1

Ser

Pro

Glu

Asn 5

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly 10

Arg

Gly

Gin

Arg 15

Gly

Asn

Arg

Gly 20

Cys

Val

Leu

Thr

Ala 25

Ile

His

Leu

Asn

Val 30

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu 35

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys 40

Glu

Leu

Ile

Phe 45

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly 50

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala 55

Glu

Thr

Tyr

Asp 60

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn 65

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg 70

Arg

Leu

Val

Ser

Asp 75

Lys

Val

Gly

Gin

Ala 80

Cys

cys

Arg

Pro

Ile 85

Ala

Phe

Asp

Asp 90

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp 95

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr 100

His

Ile

Leu Arg

Lys 105

His

Ser

Ala

Lys

Arg 110

Cys

Glý

Cys Ile

-57CZ 297326 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zkrácený GDNF proteinový produkt odvozený z gliové buněčné linie tvořený aminokyselinovou sekvencí

X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y ve které [Cys⁴¹-Cys¹³³] sestává z Cys⁴¹ až Cys¹³³ SEQ ID NO:2;

Y znamená karboxylovou koncovou skupinu Cys¹³³ nebo karboxylový koncový aminokyselinový zbytek Ile¹³⁴;

X znamená methionylátovanou nebo nemethionylátovanou aminoskupinu Cys⁴¹ nebo N-koncový aminokyselinový zbytek(y) zvolený(é) ze skupiny:

G

RG

NRG

KNRG (SEQ ID NO:3) gknxg (SEQ ID NO:4) RGKNRG (SEQ ID NO:5) qrgknrg (SEQ ID NO:6) GQRGKNRG (SEQ ID NO17) RGQRGKNRG (SEQ ID NO:8) RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:9) G RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:10) kg rrgqrgknrg (SEQ ID 140:11)

GKG rrgqrgknrg (SEQ ID NO:12)

RGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:13)

-58CZ 297326 B6

SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:14) NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ 10 NO:15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ!DNO:16) PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:17) NPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:18) ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:19) A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:20) AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:21) AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:22) QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO123) RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:24) NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:25) RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:26) ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:27) RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:28) RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:29) P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:30) LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:31) VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:32) AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:33) MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:34) QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:35) KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:36) DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO;37) and PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:38)

a substituční nebo deleční variantu X, přičemž uvedená varianta jez více než 70 % identická s aminokyselinovou sekvencí X definovanou výše, kde mohou být v délce 100 aminokyselin zavedeny 4 mezery, které napomohou tomuto zarovnání, přičemž zkrácený GDNF proteinový produkt odvozený gliové buněčné linie je schopen neurotrofně působit na dopaminergické nervové buňky.

2. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO: 24).
3. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = NPENSRGKG RRQRGKNRG (SEQ ID NO: 18).
4. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO: 17).
5. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO: 14).
6. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = RGQRGKNRG (SEQ IDNO:8).

-59CZ 297326 B6
7. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = GQRGKNRG (SEQ ID NO: 7).
8. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = K.NRG (SEQ ID NO:3).
9. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde X = NRG.
10. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1 až 9, kde je aminokyselinová sekvence glykosylovaná.
11. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1 až 9, kde je aminokyselinová sekvence neglykosylovaná.
12. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1, kde je derivátem X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y aminokyselinová sekvence konjugovaná na vodou rozpustný polymer.
13. Polynukleotid kódující zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1.
14. Polynukleotid podle nároku 13 obsahující část sekvence znázorněné na obrázku 1.
15. Polynukleotid podle nároku 13 obsahující část sekvence znázorněné na obrázku 3.
16. Polynukleotid podle nároku 13 obsahující část sekvence znázorněné na obrázku 4.
17. Polynukleotid podle nároku 13 obsahující část sekvence znázorněné na obrázku 5.
18. Polynukleotid podle nároku 13 obsahující část sekvence znázorněné na obrázku 6.
19. Polynukleotid podle nároku 13 obsahující část sekvence znázorněné na obrázku 7.
20. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 13, operativně navázaný na expresní kontrolní sekvenci.
21. Prokaryotická a eukaryotická hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná polynukleotidem podle nároku 13.
22. Způsob přípravy zkráceného GDNF proteinového produktu odvozeného z gliové buněčné linie podle nároku 1, vyznačený tím, že zahrnuje:

a) kultivaci prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky transformované nebo transfektované vektorem podle nároku 20;

(b) udržování uvedené hostitelské buňky za podmínek umožňujících expresi zkráceného GDNF proteinového produktu uvedenou hostitelskou buňkou; a (c) případnou izolaci zkrácenou GDNF proteinového produktu exprimovaného uvedenou hostitelskou buňkou.
23. Způsob přípravy zkráceného GDNF proteinového produktu podle nároku 22, vyznačený tím, že hostitelskými buňkami jsou buňky E. coli.
24. Způsob přípravy zkráceného GDNF proteinového produktu podle nároku 22, vyznačený tím, že hostitelskými buňkami jsou buňky vaječníků čínského křečka.

-60CZ 297326 B6
25. Farmaceutická kompozice pro léčbu Parkinsonovy choroby, vyznačená tím, že obsahuje zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1 s farmaceuticky přijatelným nosičem.
26. Farmaceutická kompozice pro léčbu Parkinsonovy choroby, vyznačená tím, že obsahuje zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1 s farmaceuticky přijatelným nosičem.
27. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 1 odvozený od zralého GDNF proteinu exprimovaného rekombinantně modifikovanou bakterií nebo savčí buňkou.
28. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 27, kde se X zvolí ze skupiny tvořené:

G

RG

NRG knrg (SEQIDNO:3) GKNRG (SEQ!DNO:4)

RGKnrg (SEQIDNO;5) qrgknrg (SEQIDNO:6)

GQRGKNRG (SEQIDNO:7) RGQRGKNRG (SEQ ID NO;8) a RRGQRGKNRG (SEQ ID N0:9) a substituční nebo deleční variantu X, přičemž uvedená varianta je z více než 70 % identická s aminokyselinovou sekvencí X definovanou výše, kde mohou být v délce 100 aminokyselin zavedeny 4 mezery, které napomohou tomuto zarovnání, přičemž zkrácený GDNF proteinový produkt odvozený z gliové buněčné linie je schopen neurotrofně působit na dopaminergické nervové buňky.
29. Zkrácený GDNF proteinový produkt podle nároku 27, kde je zralý GDNF protein exprimován rekombinantně modifikovanou bakteriální buňkou a zkrácený GDNF proteinový produkt je produkován in vitro nebo in vivo.

30. Použití upraveného GDNF proteinového produktu podle nároku 1 pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu poškození nervového systému způsobeného nemocí nebo úrazem.

9 výkresů

-61 CZ 297326 B6

Obr. 1

Zralý humánní GDNF

TCA Ser CCA Pro GAT AAA CAA ATG GCA GTG Val CTT Leu CCT AGA AGA Arg GAG Glu CGG Arg AAT Asn 15 Asp Lys Gin Met 5 Ala Pro 10 Arg CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly 20 25 30 CGG AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly cys Val Leu Thr Ala 35 40 ⁴⁵ ATA CAT TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys 50 55 60 GAG GAA CTG ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala 65 70 75 GAG ACA ACG TAC GAC AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg 80 85 90 AGG CTG GTG AGT GAC AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro Ile 95 100 105 GCC TTT GAT GAT GAC CTG TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr 110 115 120 CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

125 130

-62CZ 297326 B6

4000

-63 CZ 297326 B6

Obr. 3A

Sekvence metGDNF degenerátu DNA

CATATGTCTCCGGATAAACAAATGGCTGTTCTTCCAC

1----------+

E

Nc

Oo tR

II

GTCGTGAACGTAACCGTCAGGCGGCCGCTGCTAACCCGGAGAATTCCCGTGGTAAAGGTC

61---------+---------+---------+---------+---------++ 120

S a

c

I

I GTCGTGGTCAGCGTGGTAAAAACCGCGGTTGCGTTCTGACCGCTATCCACCTGAACGTTA

121--------- +---------+---------+---------4----------+---------+ 180

P s

h

A

I

CCGACCTGGGTCTCGGTTACGAAACCAAAGAAGAATTAATCTTCCGTTACTGCTCCGGTT

181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

-64CZ 297326 B6

Obr. 3B

241 s

u n

I

CCTGCGACGCTGCTGAAACCACGTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGTC

E H a i m n 1 d P 1 I v 0 I u s I I I

GTCTGGTTTCCGACAAAGTTGGTCAAGCTTGCTGCCGTCCGATCGCTTTCGACGACGACC

300

301

361

421

---------4.---------4.---------*---------4---------4----------+

TGTCCTTCCTGGACGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAGCGTT

---------4---------4---------4---------4----------4---------4

360

420

B a m

H

I GCGGTTGCATCTAAGGATCC ---------₊.... + 440

-65CZ 297326 B6

121

181

241

301 metGDNF degenerátu DNA

CATATGAGCCCGGACAAACAG +

ATGGCAGTACTTCCACGTCGTGAACGTAATCGCCAGGCAGCAGCTGCAAACCCGGAAAAC ---------4.---------₊---------4-------------------₊---------₊

TCCCGTGGTAAAGGTCGCCGTGGCCAGCGCGGCAAAAACCGTGGTTGTGTTCTGACTGCA +

I

ATCCACCTGAACGTTACTGACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTC

---------4----------+---------4----------+---------4----------* t

I

CGCTACTGCAGCGGCTCTTGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAAC

---------₊---------+---------₊---------₊

I

CTGTCCCGTAACCGCCGTCTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATC

4----------4----------4-

120

180

300

GCATTCGACGATGACCTGAGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAA

4---------------------------+

420

CACTCCGCTAAACGCTGCGGTTGCATCTAAGGATCC ---------₊---------4.---------4-------456

-66CZ 297326 B6

Obr. 5 [Pro²³-LYS³⁷ÁAsn³⁷-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein

ATGTCCCCAGAAAATTCTCGTGGTAAAGGTCGTCGTGGTCAGCGTGGTAATAACCGCGGT

21---------+---------+---------+---------+---------_-+ go

MSPENSRGKGRRGQRGNNRG

TGCGTTCTGACCGCTATCCACCTGAACGTTACCGACCTGGGTCTCGGTTACGAAACCAAA

81---------+---------+---------+---------+---------++ 140

CVLTAIHLNVTDLGLGYETK

GAAGAATTAATCTTCCGTTACTGCTCCGGTTCCTGCGACGCTGCTGAAACCACGTACGAC

141---------«---------+---------+---------+---------++ 200

EELIFRYCSGSCDAAETTYD

AAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGTCGTCTGGTTTCCGACAAAGTTGGTCAAGCT

201 _~ — —+ —— — — — — — — + —— ——' — — — — + — — — —————— 4. ————————— > — —— — — + 260

KILKNLSRNRRLVSDKVGQA

TGCTGCCGTCCGATCGCTTTCGACGACGACCTGTCCTTCCTGGACGACAACCTGGTTTAC

261 — — —------.4. — — — — — —----f---------- + -— — ——μ---------4 —------— — 4- 320

CCRPIAFDDDLSFLDDNLVY

CACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAGCGTTGCGGTTGCATCTAA

321---------+---------+---------+---------+----HILRKHSAKRCGCI*

-67CZ 297326 B6

Obr. 6 [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein atgcgtggtcaacgtggtaaaaaccgcggttgcgttctgactgcaatccacctgaacgtt

41---------₊---------+---------*---------+---------+---------+100 mrgqrgknrgcvltaihlnv

ACTGACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTCCGCTACTGCAGCGGC

101---------+---------+---------+---------+---------++ 160

TDLGLGYETKEELIFRYCSG

TCTTGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGC

161---------₊---------+---------+---------+---------4----------+220

SCDAAETTYDKILKNLSRNR

CGTCTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATCGCATTCGACGATGAC

221---------m----------+---------+---------·----------++ 280

RLVSDKVGQACCRPIAFDDD

CTGAGCTrCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAACGC

281 ---------+---------+---------+---------+---------++ 340

LSFLDDNLVYHILRKHSAKR

TGCGGTTGCATCTAA

341 ---------+ 355

C G C I *

-68CZ 297326 B6

Obr. 7 [Gly³³-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein

ATGGGTCAACGTGGTAAAAACCGTGGTTGTGTTCTGACTGCAATCCACCTGAACGTTACT

41---------ί----------+----------i---------------------*---------* 100

MGQRGKNRGCVLTAI HLNVT

GACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTCCGCTACTGCAGCGGCTCT

101-------- - ♦---------⁺---------*---------·*----------+ - ------> 160

DLGLGYETKEELI FRYCSGS

TGCGACGCAGCTGAAA.CCACTTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGCCGT

161---------+---------+---------+---------*---------++ 220 cdaaettydkilknlsrnrr

CTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATCGCATTCGACGATGACCTG

221 ---------+---------+---------+---------*----------* 280

LV SDKVGQACCRPIAFDDDL

AGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAACGCTGC

281 ---------+---------+·---------+---------+---------++ 340

SFLDDNLVYHILRKHSAKRC

GGTTGCATCTAA

341352

G C I ·

-69CZ 297326 B6

Obr. 8

Srovnáni proteinových sekvenci

GDNF MSPDKQMAVL PRRERNRQAA AANPENSRGK GRRGQRGKNR GCVLTAIHLN -31 GDNF .MRGQRGKNR GCVLTAIHLN -32 GDNF . . MGQRGKNR GCVLTAIHLN -22 GDNF -MSPENSRGK GRRGQRGNNR GCVLTAIHLN 51 100 GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ -31 GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ -32 GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ -22 GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ 101 135 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI -31 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI -32 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI -22 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI

Konec dokumentu