JPH11512709A - 截形グリア細胞系由来神経栄養因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ドーパミン作動性細胞によるドーパミン取り込みを促進し、神経細胞の生存を促進する截形グリア細胞系由来神経栄養因子（截形ＧＤＮＦ）タンパク質と呼ぶ新規タンパク質を開示する。組換え遺伝子工学技術により截形ＧＤＮＦタンパク質を獲得する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 截形グリア細胞系由来神経栄養因子 発明の技術分野 一般には、本発明はドーパミン作動性ニューロンによるドーパミンの取り込み を促進し、パーキンソン病で死滅するニューロンの生存を助長する能力をもつ本 明細書中でグリア細胞系由来神経栄養因子（グリア由来神経栄養因子又はＧＤＮ Ｆとも呼ぶ）と呼ぶタンパク質に関する。本発明はより詳細には新規截形（ｔｒ ｕｎｃａｔｅｄ）ＧＤＮＦタンパク質に関する。発明の背景 神経栄養因子は神経系又は神経系により刺激される非神経組織に存在するタン パク質であり、神経及び／又はグリア細胞のの生存を促進し、その表現型分化を 維持する機能をもつ（Ｖａｒｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ ｅ １：３２７，１９７９； Ｔｈｏｅｎｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２ ３８，１９８５）。この生理的役割により、神経栄養因子は種々の神経変性疾患 で生じる神経細胞の変性及び分化機能の低下を治療するのに有用である。 特定神経栄養因子が神経損傷の治療に潜在的に有用であるた めには、損傷神経細胞の種類がその因子に応答性でなければならない。一般に、 種々の神経栄養因子は全く異なる種類の神経細胞に作用する。従って、種々の形 態の疾病又は傷害で生じ得る損傷ニューロン種の各々を治療できるように種々の 異なる神経栄養因子を利用できることが有利である。 神経栄養因子は種々の無関係の傷害から応答性ニューロンを保護することがで きる。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）はその軸索突起の切断により生じる死（ Ｒｉｃｈら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ １６：２６１，１９８７； Ｏｔｔｏ ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８３：１５６，１９８７）、胚発生中の個体発生死 （Ｈａｍｂｕｒｇｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：７６７，１９８４）及び タキソール又はシスプラチンの投与により生じる損傷（Ａｐｆｅｌら，Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．２９：８７，１９９１）から感覚ニューロンの有意部分を救済す る。この明白な保護の一般性に鑑み、ある神経栄養因子が実験的損傷から応答性 ニューロンを保護するならば、その因果関係は不明であるとしても、このような 神経栄養因子は患者にこれらのニューロンの損傷を引き起こす疾病を治療するの に有用であり得るという概念に至った。 所与の神経栄養因子は適正なニューロン特異性をもつ以外に、医薬治療として 使用するのに十分な量で入手できなければならない。神経栄養因子は一般に組織 中に少量しか存在しない（例えばＨｏｆｅｒとＢａｒｄｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３３ １：２６１，１９８８； Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１０２３，１９ ８９）ので、医薬的量の神経栄養因子を動物組織から直接調製するのは困難であ る。代替手段として、所望のタンパク質を製造するために組換え発現系を使用す ることが望ましい。 Ｌｉｎらは黒質ドーパミン作動性ニューロンの胚前駆体に及ぼす神経栄養活性 について生物サンプルをスクリーニングする方法を過去に記載している（参考資 料としてその開示内容を本明細書の一部とする１９９４年５月２３日付け米国特 許出願第０８／１８２，１８３号とその親出願、１９９２年９月１７日付けＰＣ Ｔ／ＵＳ９２／０７８８８（ＷＯ９３／０６１１６）、及びヨーロッパ特許出願 第９２９２１０２２．７号（公開ＥＰ第６１０２５４号）参照）。パーキンソン 病は線条体を刺激する中脳内のドーパミン作動性ニューロンの変性により特徴付 けられるで、このバイオアッセイはパーキンソン病の治療に使用可能な神経栄養 因子を同定するのに有用である（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ら，Ｎｅｕｒｏ．Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．７９：６５−７２，１９８７）。 Ｌｉｎらは更に、このような材料の１例であるグリオブラストーマ細胞系Ｂ４ ９からの条件付け培地から精製した新規神経栄養因子の特徴付けについても記載 している（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ ２４９：２２４−２７，１９７ ４）。この細胞系からの条件付け培地はドーパミン作動性神経栄養活性を含むこ とが過去に報告されている（Ｂｏｈｎら，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓ． １５：２７７，１９８９）。Ｌｉｎらの開示以前に、グリア細胞系由来神経栄養 因子（ＧＤＮＦ）は独立した生物活性物質として同定されておらず、即ち実質的 に純粋なタンパク質として単離されていなかった。更に、ＬｉｎらはＧＤＮＦを コードするヒト遺伝子のクローニング方法、ＧＤＮＦをコードするヒト遺伝子の 核酸配列及びＧＤＮＦタンパク質のアミノ酸配列を記載している。ＧＤＮＦ遺伝 子は発現ベクターにサブクローニングされ、ベクターを使用して生物学的に活性 なＧＤＮＦを発現させている。ＧＤＮＦタンパク質はジスルフィド結合により結 合した２２ｋＤａの２個の１３４アミノ酸サブユニットから構成されるホモダイ マーである。パーキンソン病等の神経損傷及び神経関連疾患の予防及び治療に ＧＤＮＦを使用することも記載されている。 ＧＤＮＦ治療は１種以上の神経細胞の生存及び／又は適正な機能を損なう症状 に起因する神経損傷の治療に役立つ。このような神経損傷は多種多様の原因によ り生じると考えられる。神経損傷は、（１）傷害部位の近傍の軸索突起及び／又 は神経細胞体の変性を生じる物理的傷害、（２）神経系の一部への血流の一時的 又は永久的停止（例えば卒中）、（３）化学療法剤（例えば癌治療剤であるシス プラチンやエイズ治療剤であるジデオキシシチジン（ｄｄＣ））等の神経毒素へ の意図的又は偶発的暴露、（４）糖尿病や腎不全等の慢性代謝病、あるいは（５ ）特定ニューロンポピュレーションの変性に起因するパーキンソン病、アルツハ イマー病及び筋萎縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性病により、１種以上の 神経細胞に生じると考えられる。 ＧＤＮＦ治療はパーキンソン病等の黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性 を伴う神経変性症状の治療に特に有用であると考えられる。現在行われているパ ーキンソン病の唯一の治療は、線条体中のドーパミン濃度の増加を目的とした一 時的軽減に過ぎない。ＧＤＮＦ治療は、線条体中のドーパミン作動性神 経末端のドーパミン作動性神経伝達を増加する（その結果として症状を緩和する ）だけでなく、変性プロセスの進行を遅らせ、あるいは停止させ、損傷黒質経路 を修復し、その機能を回復する効果があると予想される。ＧＤＮＦはヒト患者で ドーパミン作動性神経細胞の他の形態の損傷又は機能不全を治療するにも有用で あると考えられる。このような損傷又は機能不全は、精神分裂病や他の形態の精 神病で生じ得る。このような症状に現在行われている唯一の治療は対症療法であ り、ドーパミンレセプター又はドーパミン取り込み部位に作用する薬剤が必要で あり、これらのレセプターを含むニューロンポピュレーションを刺激するドーパ ミン作動性ニューロンの機能不全が疾病プロセスに関係があるらしいという見地 に立っている。発明の概要 １側面において、本発明は新規截形グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ ）タンパク質産物を提供する。１態様では、組換え遺伝子工学技術により截形Ｇ ＤＮＦタンパク質を製造する。別の態様では、化学的方法又は組換え技術と化学 的方法の組み合わせにより截形ＧＤＮＦタンパク質を合成する。 本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質産物はアミノ酸配列Ｘ− ［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙにより表されるタンパク質を含む。成熟ＧＤＮＦ タンパク質と比較し易くするために、図１のアミノ酸残基ナンバリング図（配列 番号２）を使用する。［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］は図１に示すＣｙｓ⁴¹〜Ｃｙｓ^{1 33} のアミノ酸配列（配列番号２）を表す。ＹはＣｙｓ¹³³のカルボキシ末端基又 はＩｌｅ¹³⁴のカルボキシ末端アミノ酸残基を表す。ＸはＣｙｓ⁴¹のメチオニン 化もしくは非メチオニン化アミン基又は以下の群： から選択されるアミノ末端アミノ酸残基を表す。前記截形ＧＤＮＦタンパク質産 物はＸ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙにより表されるようなアミノ酸配列をも つ截形ＧＤＮＦタンパク質産物とその変異体及び誘導体を含むと考えられる。従 って、本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質産物はＸ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］− Ｙにより表されるアミノ酸配列の付加、置換及び内部欠失変異体及び誘導体も含 む。截形ＧＤＮＦタンパク質産物は更に、截形ＧＤＮＦタンパク質のメチオニン 化又は非メチオニン化形態とグリコシル化又は非グリコシル化形態も含む。 本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質の例としては、メチオニン化又は非メチオニ ン化形態の［Ａｒｇ¹⁶−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｓｎ²²−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｐｒｏ²³− Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｓｅｒ²⁶−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｒｇ³²−Ｉｌe¹³⁴］、［Ｇｌｙ³³ −Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｌｙｓ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ａｓｎ³⁸−Ｉｌｅ¹³⁴］截形Ｇ ＤＮＦタンパク質とその変異体及び誘導体が挙げられる。本発明の好ましい截形 ＧＤＮＦタンパク質としては、メチオニン化又は非メチオニン化形態の［Ｌｙｓ³⁷ −Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ａｓｎ³⁸−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質とその変 異体及び誘導体が挙げられる。置 換変異体の例は［Ａｓｎ²²ΔＳｅｒ²²−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ｐｒｏ²³−Ｌｙｓ³⁷ ΔＡｓｎ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質である。付加変異体の例はＳ ｅｒ−［Ｐｒｏ²³−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質である。 本発明の別の側面では、截形ＧＤＮＦタンパク質はグリコシル化形態で製造し てもよいし、非グリコシル化形態でもよい。截形ＧＤＮＦタンパク質の誘導体は 、一般に水溶性ポリマーに截形ＧＤＮＦタンパク質が結合している。例えば、截 形ＧＤＮＦタンパク質を１個以上のポリエチレングリコール分子に結合すると、 水性環境での截形ＧＤＮＦタンパク質産物の沈殿を減らすことができる。 本発明の更に別の側面は、截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする種々のポリヌ クレオチドに関する。これらの核酸配列は一般に真核又は原核宿主細胞で截形Ｇ ＤＮＦを発現させるのに使用され、発現産物又はその誘導体はドーパミン作動性 細胞によるドーパミン取り込みを増加することができる。ポリヌクレオチドは細 胞治療又は遺伝子治療用にも使用できる。適切な核酸配列としては、図面に具体 的に示す配列や、付加的縮重配列（additional degenerate sequences）及び天 然対立遺伝子変 異配列が挙げられる。 本発明の別の側面は、増幅及び／又は発現調節配列に作動的に連結した截形Ｇ ＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。原核 及び真核宿主細胞の両者を前記ベクターで安定的に形質転換及びトランスフェク トし、截形グリア由来神経栄養因子を発現させることができる。本発明は更に、 前記形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を適切な栄養培地で培養し、場 合により、前記細胞により発現される截形ＧＤＮＦを宿主細胞及び／又は栄養培 地から単離することを特徴とする、截形ＧＤＮＦタンパク質の組換え製造にも関 する。本発明は更に、遺伝子治療又は細胞治療における截形ＧＤＮＦをコードす るポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを含むベクターの使用にも関する。 別の側面では、本発明は成熟ＧＤＮＦタンパク質と該タンパク質から誘導され る１種以上の截形ＧＤＮＦタンパク質の混合物を含む組換え製造ＧＤＮＦ組成物 にも関し、成熟ＧＤＮＦタンパク質は約４４ｋＤａの分子量をもち、截形ＧＤＮ Ｆタンパク質は約３６〜４０ｋＤａの分子量をもつ。ＧＤＮＦ組成物は約３６ｋ Ｄａの分子量をもつ第１の種と約４０ｋＤａの分子量 をもつ第２の種との少なくとも２種の截形ＧＤＮＦ種を含むものでもよい。約４ ０ｋＤａの分子量をもつ截形ＧＤＮＦ種は約２２ｋＤａの分子量をもつＧＤＮＦ モノマーと約１８ｋＤａの分子量をもつ截形ＧＤＮＦモノマーのヘテロダイマー である。前記混合物から截形ＧＤＮＦ種の１種以上を治療用に単離することも考 えられる。 本発明の別の側面は、截形ＧＤＮＦタンパク質産物を含む医薬組成物に関する 。一般に、截形ＧＤＮＦタンパク質産物は医薬的に許容可能なビヒクルと組み合 わせて調剤する。製造、貯蔵、取り扱い、送達及び／又は効力を助長するために 種々の他の配合剤を使用してもよい。本発明の別の側面では、截形ＧＤＮＦタン パク質産物はドーパミン作動性ニューロンのドーパミン取り込み及び生存を強化 する。従って、截形ＧＤＮＦタンパク質産物は、パーキンソン病等の傷害又は疾 病により生じる神経系の損傷の治療に特に適している。 本発明の他の側面及び利点は、本発明の実施を詳細に説明する以下の記載から 当業者に容易に理解されよう。図面の簡単な説明 本発明の多数の特徴及び利点は図面を参考に容易に理解され よう。 図１は成熟ヒトグリア細胞系由来神経栄養因子（ｈＧＤＮＦ）をコードする核 酸配列（配列番号１）を示す。成熟ヒトＧＤＮＦタンパク質のアミノ酸配列(配 列番号２)も示す。 図２は組換え截形ＧＤＮＦタンパク質の発現のために利用したプラスミド構築 図を示す。 図３はＧＤＮＦ及び截形ＧＤＮＦポリヌクレオチドをコードする別の核酸配列 (配列番号３９)の制限地図を示す。 図４はＧＤＮＦ及び截形ＧＤＮＦポリヌクレオチドをコードする更に別の核酸 配列(配列番号４０)の制限地図を示す。 図５は［Ｐｒｏ²³−Ｌｙｓ³⁷ΔＡｓｎ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク 質置換変異体(配列番号４２)をコードする核酸配列(配列番号４１)を示す。この タンパク質はＭｅｔ−Ｓｅｒ−［Ｐｒｏ²³−Ｌｙｓ³⁷ΔＡｓｎ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］ 截形ＧＤＮＦタンパク質付加／置換変異体と表すこともできる。 図６は［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質(配列番号４４)をコ ードする核酸配列(配列番号４３)を示す。 図７は［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質(配列番号４６)をコ ードする核酸配列(配列番号４５)を示す。 図８は数種の截形ＧＤＮＦタンパク質の例であるＭｅｔ−［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴ ］（配列番号４８）、Ｍｅｔ−［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴］（配列番号４９）及 びＭｅｔ−Ｓｅｒ−［Ｐｒｏ²³−Ｌｙｓ³⁷ΔＡｓｎ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］（配列番号 ５０）と成熟ｈＧＤＮＦのアミノ酸配列（配列番号４７）の比較を示す。発明の詳細な説明 ヒトグリア細胞系由来神経栄養因子（ｈＧＤＮＦ）は前駆物質として合成され 、プロセシングにより１３４アミノ酸の成熟タンパク質として分泌される。成熟 ヒトＧＤＮＦは図１に示すアミノ酸配列（配列番号２）をもつことが認められて いる。 本発明は、その生物活性を維持しながら成熟ＧＤＮＦタンパク質の寸法を小さ くできるという予想外の発見に基づく（本明細書では「切断」もしくは「截形」 タンパク質又は截形ＧＤＮＦタンパク質とも言う）。切断タンパク質はチャイニ ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でＧＤＮＦの組換え製造中に最初に発見され た。要約すると、組換えヒトＧＤＮＦ（ｒｈＧＤＮＦ）は次のように作製した。 成熟ヒトＧＤＮＦタンパク質の完全オープンリーディングフレームをコードする 核酸配列を発現プラスミドにクローニングした。（ＤＮＡ配列決定によりＧｅｎ Ｂａｎｋ 中のｈＧＤＮＦ配列の等価物として）核酸配列が正しいことを確認し、成熟ヒト ＧＤＮＦの公表配列（Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０，１１３０−１１３２ ，１９９３）に等しいアミノ酸配列に翻訳した。プラスミドＤＮＡを直鎖化し、 リン酸カルシウム沈殿法を用いてジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞（Ｃ ＨＯｄ−細胞）にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を選択培地 で培養し、選択プロセスに耐えて生存したコロニーを選択し、ｈＧＤＮＦ発現を 個々に分析した。 個々のクローンから無血清条件付け培地を集め、ｈＧＤＮＦに特異的な抗血清 を用いてウェスタンブロット分析した。抗血清は、大腸菌で発現させた組換えｈ ＧＤＮＦで免疫したウサギから誘導したウサギポリクローナル抗体から構成した 。還元条件下でこれらのサンプル中に存在するｈＧＤＮＦは、約２２ｋＤａ及び １８ｋＤａの見かけの分子量をもつ２つの主バンドに分解した。各バンドは夫々 約２２＋２２．５ｋＤａ及び１８＋１７．５ｋＤａのごく近接する二重項（簡単 にするために、以下の文中ではこれらの二重項を２２ｋＤａ及び１８ｋＤａバン ド又は種と呼ぶ）から構成されていた。 ＧＤＮＦは約２０〜２２ｋＤａの分子量をもつ成熟ＧＤＮＦ タンパク質の２つの同一のサブユニットから構成されるジスルフィド結合ホモダ イマーとして存在することが過去に報告されている。非還元条件下でＧＤＮＦを 分析すると、３２〜４２ｋＤａ（Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０，１１３０ −１１３２，１９９３）又は３３〜４５ｋＤａ（Ｌｉｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ ｅｍ．６３（２），７５８−７６８，１９９４）の幅広のバンドが確認されたと 報告されている。レンジの存在は成熟モノマー上のグリコシル化の不均一に起因 すると解釈され、脱グリコシル化実験で更に確証されている。 本発明の２２ｋＤａバンドは文献に報告されている成熟ＧＤＮＦタンパク質に 対応するが、１８ｋＤａバンドは従来報告されていない。２２ｋＤａ及び１８ｋ Ｄａタンパク質の相対量は個々のクローンから採取したサンプルにより相違した 。更に、同一クローンからの複数の回収物で２つのバンドの比が異なることが判 明した。更に、ＣＨＯで発現されたＧＤＮＦタンパク質を貯蔵すると、多くの場 合には１８ｋＤａバンドの存在が増加すると同時に２２ｋＤａバンドが減少する ことが判明した。 形質転換ＣＨＯｄ−細胞からの条件付け培地を非還元条件下でウェスタンブロ ットにより分析すると、３６、４０及び４４ ｋＤａの見かけの分子量をもつ３つの明確に分解したバンドが観察された。この 知見も従来の報告に反するものであった。これらのバンドの相対強度は一定して いないが、サンプルの各々に存在する２２及び１８ｋＤａモノマーの比とよく相 関していた。モノクローナル抗血清により更に分析すると、非還元ゲル中の３つ のバンドは２種のモノマーから構成される３種の可能な二量体に対応することが 判明した。最大の４４ｋＤａタンパク質は従来報告されているような２個の２２ ｋＤａ成熟ＧＤＮＦタンパク質の二量体である。中間の４０ｋＤａタンパク質は 、一方の成熟タンパク質の分子量が１８ｋＤａ形態まで減少した二量体から構成 される。最小の３６ｋＤａ二量体は２個の１８ｋＤａタンパク質を含むと思われ 、即ち２２ｋＤａ形態の両者の分子量が減少している。このデータは、新規形態 のＧＤＮＦモノマーの存在だけでなく、二量体構造における切断ＧＤＮＦタンパ ク質の存在をも立証した最初のものである。貯蔵すると、サンプルのモノマー組 成は切断形態及び対応する二量体種の組成に向かって変化することも判明し、即 ち３６ｋＤａタンパク質の量が増加することが判明した。 次に、従来報告されている成熟ＧＤＮＦタンパク質と比較し てタンパク質のどの部分が除去又は変異して分子量が減少するのかを調べる研究 を行った。まず最初に分子量の減少はグリコシル化の変化には起因しないことが 分かった。 ＧＤＮＦは２つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を含み、グリコシル化される と報告されている。しかし、切断タンパク質は単に成熟ＧＤＮＦの非グリコシル 化又は低グリコシル化形態ではない。これは、サンプルをＮ−グリカナーゼ、Ｏ −グリカナーゼ及びノイラミニダーゼで処理する脱グリコシル化実験で実証され た。還元ゲル上で１８ｋＤａタンパク質はＮ−グリカナーゼ消化により１３．５ ｋＤａバンドまで還元され、Ｎ結合糖の４．５ｋＤａの等価物の存在を示した。 ノイラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼで処理すると、１８ｋＤａバンドは１７ ｋＤａまで僅かにシフトした。従って、タンパク質にＯ結合糖が存在すると予想 された。成熟２２ｋＤａバンドはグリコシル化されると報告されており、同様に Ｎ−グリカナーゼにより１８ｋＤａまで（即ち同様に４．５ｋＤａだけ）還元さ れた。これは、ゲル上の２２ｋＤａバンドに特異的なモノクローナル抗体を使用 することにより更に確認された。非還元二量体のグリカナーゼ消化パターンはよ り複雑であったが、解明可能であ り、３形態の初期帰属に一致した。 その結果、タンパク質の分子量の４．５ｋＤａの減少はグリコシル化の変化で はなく約３０〜３５アミノ酸残基の欠失に起因すると考えられた。この欠失は以 下の理由で成熟ＧＤＮＦタンパク質のアミノ末端に最も生じ易いと予想された。 成熟ＧＤＮＦは合計７個のシスチンを含む。欠失がカルボキシル末端から開始し たならば、７個のシスチンのうちの２〜４個が失われ、その結果、不活性タンパ ク質が生じ易いと思われる。しかし、主に切断形態から構成される試料をバイオ アッセイにかけ、そのドーパミン作動性ニューロン神経栄養活性を測定した処、 この試料は成熟形ＧＤＮＦを高比率で含む試料と同等の活性を示した。 次に、精製タンパク質のアミノ酸配列分析により切断部位を決定した。Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４９４Ａタンパク質シーケンサーを１０サイ クル使用して製造業者の指示に従ってサンプルを配列決定した。アミノ酸配列分 析技術及び手順は当業者に公知であるが、タンパク質の配列決定に関する詳細な 説明は、参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とするＦａｕｓｓｅｔら ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １２：２２−２７，１９９１及び１９９０年８月２４日付け米国特許出願第５７ ６，３１６号（１９９０年１０月４日付けヨーロッパ特許出願第９０３１０８９ ９号、公開ＥＰ第４２３９８０号、発明の名称「幹細胞因子」）に記載されてい る。分析の結果、切断タンパク質のアミノ末端は「ＲＧＱＲＧＫ」即ちＡｒｇ− Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓであることが判明した。即ち、条件付 け培地中の成熟タンパク質から最初から３１個のアミノ酸が除去されていた。ア ミノ酸Ａｒｇ³²から始まる切断タンパク質の残りのアミノ酸配列は、この欠失以 外は図１に示す成熟ＧＤＮＦアミノ酸配列（配列番号２）に一致していた。 ［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質は、ドーパミン作動性ニュ ーロンアッセイで定量的に活性であることが判明した。ドーパミン作動性神経栄 養活性アッセイは、パーキンソン病の治療に有益であると考えられる神経栄養因 子を同定するために使用されている。このアッセイは従来記載されているアッセ イ（参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とするＦｒｉｅｄｍａｎら， Ｎｅｕｒｏ．Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．７９：６５−７２，１９８７）を基礎とし、Ｌ ｉｎら（１９９４ 年５月２３日付け米国特許出願第０８／１８２，１８３号とその親出願、１９９ ２年９月１７日付けＰＣＴ／ＵＳ９２／０７８８８（ＷＯ９３／０６１１６）及 びヨーロッパ特許出願第９２９２１０２２．７号（公開ＥＰ第６１０２５４号） ）に記載されているように改変できる。アッセイの詳細な説明は後記実施例５に 記載する。 その後の精製操作と、アミノ酸配列決定の結果、成熟ＧＤＮＦのＮ末端から最 初から３６個のアミノ酸残基が除去された別のタンパク質即ちＫＮＲＧ（Ｃ）Ｖ Ｌ−−のＮ末端配列をもつ［Ｌｙｓ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質が 発見された。この場合も、切断タンパク質の残りのアミノ酸残基はこの欠失以外 は成熟ヒトＧＤＮＦアミノ酸配列と一致していた。［Ｌｙｓ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］截 形ＧＤＮＦタンパク質もドーパミン取り込みバイオアッセイで分析した。この截 形ＧＤＮＦタンパク質は、大腸菌で発現させた精製組換え成熟ＧＤＮＦと同様に 約５０ｐｇ／ｍｌのＥＤ５０で活性であることが判明した。 更に、細菌で発現させた成熟ＧＤＮＦを截形型に改変できることも分かった。 （Ｌｉｎらの上記米国特許出願第０８／１８２，１８３号に記載されているよう に）形質転換大腸菌で発現させた成熟ＧＤＮＦをＣＨＯ由来条件付け培地と共に イン キュベートした。組換え大腸菌ＧＤＮＦは還元ゲル上で１７ｋＤａの見かけの分 子量をもつ。材料をＣＨＯ細胞条件付け培地と混合し、４℃で５日間インキュベ ートした処、タンパク質は１２．５ｋＤａまで完全に切断された。この切断は１ 時間又は２４時間のインキュベーションでは不完全であり、このような条件下で 時間依存性プロセスであることが示唆された。０．１％ウシ胎児血清を含む培地 と共に組換え大腸菌ＧＤＮＦを一晩インキュベートしただけでは切断形態が生成 されないことも判明した。従って、切断プロセスが生じるには培養に生きた細胞 の存在が必要であると思われる。従って、切断現象は組織によってはｉｎ ｖｉ ｖｏでも生じると考えられる。 更に、（同様にＬｉｎらの上記米国特許出願第０８／１８２，１８３号に記載 されているような）ペジル化ＧＤＮＦ等の成熟大腸菌発現ｈＧＤＮＦの誘導体を ＣＨＯ由来条件付け培地の存在下で截形型に加工できることが判明した。成熟Ｇ ＤＮＦをアミノ末端でペジル化すると、その循環クリアランス時間を増すことが できる。ペジル化はタンパク質の寸法を増加し、修飾成熟ＧＤＮＦは還元条件下 で約４５ｋＤａで移動する。ペジル化大腸菌ＧＤＮＦをＣＨＯ細胞（未トランス フェクト）条件付け培地と共にインキュベートすると、非ペジル化成熟形態と同 様に １２．５ｋＤａバンドが生じた。どちらの場合も１２．５ｋＤａ種は非還元ゲル 上でジスルフィド結合二量体として存在していた。Ｎ末端ペジル化成熟タンパク 質からこの切断形が生成されたことから、タンパク質のＮ末端に切断現象が生じ たのは切断プロセス中にペジル化残基が失われたためであると考えられる。 これらの知見と、ｉｎ ｖｉｖｏでも切断現象が生じると予想されることから 、ＧＤＮＦタンパク質の截形型は生理的条件下のｈＧＤＮＦの最終天然プロセシ ング形態であると考えられる。従って、治療用截形ＧＤＮＦタンパク質又はその 誘導体を製造すると有利であると思われた。例えば、直接発現させるか又は合成 した截形ＧＤＮＦタンパク質（例えば［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタ ンパク質）は上記タンパク分解活性に耐性であると予想される。更に、ペジル化 ［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質等の截形ＧＤＮＦ誘導体を製 造することが所望される場合には、得られる誘導体は成熟ＧＤＮＦ誘導体で観察 される特異的切断に非感受性であるという利点をもつと予想される。 截形ＧＤＮＦタンパク産物には付加的利点も予想できる。第１に、［Ａｒｇ³² −Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質等の截形タンパク質のｐＩは約１０から 約８．０〜８．５まで低下 するであろう。従って、タンパク質は極めて低塩基性となり、その結果、鞘内注 射部位等の投与部位におけるレセプター結合の改善や細胞毒性の低下等の有益な 効果が得られる。第２に、成熟ＧＤＮＦアミノ酸配列の最初から２６個のアミノ 酸には、Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ（アミノ酸１４〜１６）とＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｓ ｅｒ（アミノ酸２４〜２６）の２つのアミド分解部位が存在する。截形ＧＤＮＦ タンパク質にはこれらの部位の一方又は両方が存在しないので、タンパク質の安 定性が増すと予想される。截形ＧＤＮＦタンパク質産物 基本態様では、本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質は成熟ＧＤＮＦタンパク質と 比較し易くするために図１のアミノ酸残基ナンバリング図を用いた下記アミノ酸 配列： Ｘ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙ （式中、［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］は図１に示すＣｙｓ⁴¹〜Ｃｙｓ¹³³のアミノ酸 配列（配列番号１）を表し、ＹはＣｙｓ¹³³のカルボキシ末端基又はＩｌｅ¹³⁴の カルボキシ末端アミノ酸残基を表し、ＸはＣｙｓ⁴¹のメチオニン化もしくは非メ チオニン化アミン基又は以下の群： から選択されるアミノ末端アミノ酸残基を表す）により表すことができる。 本明細書で使用する「截形ＧＤＮＦタンパク質産物」なる用語は、生物学的に 活性な合成又は組換え截形ＧＤＮＦタンパク質、成熟ＧＤＮＦから産生される截 形ＧＤＮＦタンパク質、生物学的に活性な截形ＧＤＮＦ変異体（挿入、置換及び 欠失変異体を含む）、及びその化学修飾誘導体を含む。配列番号２に示すアミノ 酸配列をもつヒトＧＤＮＦタンパク質に実質的に相同な截形ＧＤＮＦタンパク質 も含まれる。 本明細書で使用する「生物学的に活性」なる用語は、截形ＧＤＮＦタンパク質 が配列番号２に示すアミノ酸配列をもつＧＤＮＦタンパク質と必ずしも同一程度 まで全く同一の性質を示す必要はないが、これに類似の神経栄養性を示すことを 意味する。目的とする特定神経栄養性の選択は、截形ＧＤＮＦタンパク質産物を 投与する用途に依存する。截形ＧＤＮＦタンパク質産物は生物学的に活性であり 、後記実施例に記載するような典型的バイオアッセイ等でドーパミン取り込み及 びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現を評価すると、成熟ＧＤＮＦタンパク 質に類似のドーパミン作動性ニューロン生存特性を示す。 本明細書で使用する「実質的に相同」なる用語は、配列番号２に示すアミノ酸 配列をもつヒトＧＤＮＦタンパク質に対して好ましくは＞７０％、より好ましく は＞８０％、更に好ましくは＞９０％又は更には＞９５％の相同度を意味する。 本明細書に記載する相同百分率は、参考資料としてその開示内容を本明細書の一 部とするＤａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ ｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｖｏｌ．５，ｐ．１２４（１９７２），Ｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉ ｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載されているように、整列を助長す るのに１００アミノ酸長の４個のギャップを導入すればよい場合に、比較する配 列中の同一のアミノ酸残基であって整列する２種の配列の小さいほうに存在する アミノ酸残基の百分率として計算される。更に、配列番号２のＧＤＮＦに対する 抗体との交差反応性により単離できるか、又は配列番号１のＧＤＮＦをコードす る遺伝子もしくは該遺伝子のセグメントとのハイブリダイゼーションによりその 遺伝子を単離できるならば、任意の截形ＧＤＮＦタンパク質を実質的に相同とみ なす。 本明細書の記載から当業者に容易に理解されるように、実質 的に相同なタンパク質はＸ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙにより表される截形 ＧＤＮＦタンパク質のアミノ酸残基の１個以上の欠失、付加又は置換を含む。こ のような変異体の作製については以下に詳述する。本発明は明らかに「截形」Ｇ ＤＮＦタンパク質に関するものであるので、アミノ末端付加変異体はメチオニン 残基又は非ＧＤＮＦアミノ酸残基もしくは配列を含むと考えられるが、成熟ＧＤ ＮＦタンパク質を再構成するようなアミノ酸残基の付加は含まないことも理解さ れよう。天然対立遺伝子突然変異体又は変異体に基づく截形ＧＤＮＦタンパク質 も本発明の範囲に含まれる。変異体截形ＧＤＮＦタンパク質の製造については以 下に詳述する。 Ｌｉｎら（上記米国特許出願第０８／１８２，１８３号）は、成熟ＧＤＮＦの カルボキシル末端から夫々６番目及び５番目の残基であるＬｙｓ−Ａｒｇ残基の タンパク分解プロセシングによる成熟ＧＤＮＦのカルボキシル末端截形を記載し ている（即ち図１のアミノ酸残基ナンバリング（配列番号１又は配列番号２でも 同じ）によるとＬｙｓ¹²⁹−Ａｒｇ¹³⁰）。このような截形は成熟ＧＤＮＦタンパ ク質から２個のシステイン残基を除去すると思われる。その結果、タンパク質の 不適正な折り畳み を生じ易く、不活性なタンパク質を形成する恐れがある。これに対して本発明の Ｘ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙ截形ＧＤＮＦタンパク質産物はＣｙｓ¹³¹及び Ｃｙｓ¹³³残基を維持しており、ドーパミン取り込みアッセイにより活性タンパ ク質であると判定される。 本発明の１態様では、好ましい截形ＧＤＮＦタンパク質産物は１個以上のアミ ド分解部位を欠失している。このようなアミド分解部位の欠失は精製タンパク質 の生化学的安定性を増すと共に、予想される分解物を減らし、貯蔵安定性の高い タンパク質をもたらすと考えられる。截形ＧＤＮＦタンパク質産物の１例は、成 熟タンパク質のアミド分解をもたらすような部位を欠失する［Ｓｅｒ²⁶−Ｉｌｅ¹³⁴ ］截形ＧＤＮＦタンパク質である。あるいは、［Ａｒｇ¹⁶−Ｉｌｅ¹³⁴］截形 ＧＤＮＦタンパク質は成熟タンパク質に存在する少なくとも最初のアミド分解部 位を欠失している。 本発明の好ましい截形ＧＤＮＦタンパク質産物は［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截 形ＧＤＮＦタンパク質である。この截形ＧＤＮＦタンパク質は成熟タンパク質の タンパク分解切断部位又はその近傍部位を欠失している。従って、この截形ＧＤ ＮＦ タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏでも生じると思われるプロセシング現象に耐性であ ると予想される。本発明の好ましい別の截形ＧＤＮＦタンパク質産物は［Ｌｙｓ³⁷ −Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質である。この截形は、夫々Ｎ及びＣ末 端からＧｌｙ⁴⁰及びＩｌｅ¹³⁴までの残基を除去する他の截形と同様に、截形タ ンパク質のｐＩを更に低下させると思われる。本発明の最も好ましい截形ＧＤＮ Ｆタンパク質産物は成熟ＧＤＮＦタンパク質に存在する全システイン残基を維持 しながら、発現及び製造中又はｉｎ ｖｉｖｏ投与後の截形ＧＤＮＦタンパク質 の迅速なタンパク分解プロセシングに関与する部位を欠失している。これらの好 ましいタンパク質としては、［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴ ］、［Ｇｌｎ³⁴−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｒｇ³⁵−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｇｌｙ³⁶−Ｉｌｅ¹³⁴ ］、［Ｌｙs³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｓｎ³⁸−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ａｒｇ³⁹−Ｉ ｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質産物が挙げられる。 Ｌｉｎら（上記米国特許出願第０７／８５５，４１３号）により成熟ＧＤＮＦ について従来記載されている結果と同様に、本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質は 黒質ドーパミン作動性ニューロンの胚前駆体によるドーパミン取り込みを増加で きること が判明した。截形ＧＤＮＦタンパク質のバイオアッセイについては、後記実施例 ４に詳述する。 新規截形ＧＤＮＦタンパク質は一般に、他の（非ＧＤＮＦ）タンパク性材料を 実質的に含まない截形ＧＤＮＦタンパク質を形成するように単離精製される。好 ましくは、截形ＧＤＮＦタンパク質産物は、截形ＧＤＮＦタンパク質産物の製造 に使用する製造技術に起因し得る他のタンパク質を約８０％除去している。より 好ましくは、截形ＧＤＮＦタンパク質産物は他のタンパク質を約９０％除去し、 特に好ましくは他のタンパク質を約９５％除去し、最も好ましくは他のタンパク 質を約＞９８％除去している。更に、本発明は均一な截形ＧＤＮＦタンパク質を 製造するためのポリヌクレオチド配列を提供するという独自の利点を提供する。 例えば、［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌ クレオチド配列を使用すると、大腸菌及び他の適当な発現系で截形ＧＤＮＦタン パク質を組換え製造することができる。換言するならば、新規ポリヌクレオチド はタンパク分解プロセシングに非感受性であるか又はこのようなプロセシングも しくは上述したような他の生化学プロセシング効果に対する感受性の低い截形Ｇ ＤＮＦタンパ ク質を製造することができる。こうして、新規ポリヌクレオチドにより単一種の 截形ＧＤＮＦタンパク質を容易に製造及び／又は単離することができ、従って、 截形ＧＤＮＦタンパク質及び／又はその産物は上記ヘテロ及びホモダイマーの混 合物を全く又は少量しか含まない。他方、最終截形ＧＤＮＦタンパク質産物は、 追って詳述するように投与前に他の因子、化学組成物及び／又は適切な医薬配合 剤と配合できることが理解されよう。 本発明の１側面では、截形ＧＤＮＦタンパク質は高純度で比較的多量のタンパ ク質を獲得できるという理由から組換え技術により製造すると有利である。組換 え截形ＧＤＮＦタンパク質形態は該タンパク質のグリコシル化及び非グリコシル 化形態を含み、細菌、哺乳動物又は昆虫細胞系で発現される。あるいは、截形Ｇ ＤＮＦタンパク質は化学的に合成することもできる。本発明の好ましい製造方法 については追って詳述する。截形ＧＤＮＦ変異体及び誘導体 Ａ．截形ＧＤＮＦ変異体 本発明の別の側面は截形ＧＤＮＦタンパク質の変異体に関する。本明細書で使 用する「截形ＧＤＮＦタンパク質産物」なる用語は、天然ＧＤＮＦのアミノ酸配 列の残基からアミノ酸が欠 失（「欠失変異体」）、挿入（「付加変異体」）又は置換（「置換変異体」）し ている変異体タンパク質を含む。このような変異体は、タンパク質をコードする ＤＮＡに適当なヌクレオチド変異を導入するか又は所望のタンパク質のｉｎ ｖ ｉｔｒｏ化学合成により作製される。最終タンパク質がＧＤＮＦ生物活性をもつ のであれば、欠失、挿入及び置換の多数の組み合わせが可能であることが当業者 に理解されよう。 １個以上の選択されたアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失のための突然変異誘 発技術は当業者に周知である（例えば参考資料としてその開示内容を本明細書の 一部とする米国特許第４，５１８，５８４号参照）。アミノ酸配列変異体の構築 には、突然変異部位の位置と突然変異の種類という２つの主な変更が存在する。 截形ＧＤＮＦ変異体に設計に際して、突然変異部位の位置と突然変異の種類は修 飾しようとする生化学特性により異なる。突然変異部位は、例えば（１）まず同 類アミノ酸選択で置換した後、得られた結果に応じてよりラジカルな選択で置換 するか、（２）標的アミノ酸残基を欠失させるか、（３）位置決定した部位の隣 接位置にアミノ酸残基を挿入することにより、個々に又は連続して修飾すること ができる。 アミノ酸配列欠失は一般に約１〜３０アミノ酸残基、より通常は約１〜１０残 基、典型的には約１〜５残基である。例えば、Ｃｙｓ⁴¹のＮ末端に配置されたア ミノ酸残基の「Ｘ」部分の欠失は約１〜３０残基でもよいが、［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙ ｓ¹³³］のシステイン残基はタンパク質折り畳みを破壊しないように、一般にそ の位置に応じて約１〜５残基である。截形ＧＤＮＦタンパク質における欠失はト ランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーメンバーに対して相 同性の低い領域に形成できる。他のＴＧＦ−βファミリー配列に対して実質的に 相同な領域で截形ＧＤＮＦタンパク質から欠失させると、生物活性がより有意に 変化する傾向がある。総欠失及び／又は連続欠失の数は、影響を受ける領域、例 えばシステイン架橋における截形ＧＤＮＦタンパク質の三次構造を維持するよう に選択される。 アミノ酸配列付加としては、１残基〜１００残基以上の長さのアミノ及び／又 はカルボキシル末端融合と、単一又は多重アミノ酸残基の内部配列内挿入が挙げ られる。内部付加は一般に約１〜１０アミノ酸残基、より一般には約１〜５アミ ノ酸残基、通常は約１〜３アミノ酸残基であり得る。上述のように、本発 明のアミノ末端付加変異体はメチオニン（例えば細菌組換え細胞培養におけるＧ ＤＮＦの直接発現のアーチファクト）又は非ＧＤＮＦアミノ酸残基もしくは配列 の付加を含むと考えられる。アミノ末端付加変異体は、成熟ＧＤＮＦタンパク質 の再構成をもたらすようなアミノ酸残基の付加を含まない。末端挿入の別の例と して、組換え宿主細胞からのタンパク質の分泌を助長するように異種Ｎ末端シグ ナル配列をＮ末端と融合してもよい。このようなシグナル配列は一般に、所期宿 主細胞種から得られ、従ってこのような細胞種と相同である。挿入又は付加変異 体は、他の神経栄養因子の配列に由来するアミノ酸配列を含んでいてもよい。 別の群の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は截形ＧＤＮＦ タンパク質から少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その代わりに別の残 基が挿入されている。例えば、Ｍｅｔ残基を更に除去し易くするために天然Ａｓ ｎ²²をＳｅｒに置換した図５参照。Ｘ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙアミノ酸 配列式と截形ＧＤＮＦタンパク質産物の本発明の定義を使用すると、このような 截形ＧＤＮＦタンパク質は置換変異体Ｍｅｔ−［Ａｓｎ²²ΔＳｅｒ²²−Ｉｌｅ^{13 4} ］截形ＧＤＮＦ タンパク質又は付加変異体Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−［Ｐｒｏ²³−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤ ＮＦタンパク質と呼ぶことができる。置換変異体は、アミノ酸置換を生じるか否 かに拘わらず種ポピュレーションの天然ヌクレオチド配列変異を特徴とする対立 遺伝子変異体でもよい。 截形ＧＤＮＦタンパク質の配列の具体的な突然変異としては、グリコシル化部 位（例えばセリン、スレオニン又はアスパラギン）の修飾が挙げられる。グリコ シル化又は単に部分的なグリコシル化の不在は、任意のアスパラギン結合グリコ シル化認識部位又はＯ結合炭水化物の付加により修飾されたタンパク質の任意部 位におけるアミノ酸置換又は欠失に起因すると考えられる。アスパラギン結合グ リコシル化認識部位は適当な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるト リペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ又 はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒであり、ここでＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸 でよい。グリコシル化認識部位の第１又は第３番目のアミノ酸位置の一方又は両 方に種々のアミノ酸置換又は欠失（及び／又は第２位のアミノ酸欠失）が存在す ると、修飾トリペプチド配列にグリコシル化は生じない。従って、適当に 改変されたヌクレオチド配列が発現されると、前記部位がグリコシル化されてい ない変異体を生じる。あるいは、截形ＧＤＮＦタンパク質にグリコシル化部位を 付加するように配列を修飾してもよい。 突然変異誘発に用いる截形ＧＤＮＦアミノ酸残基又は領域の指定方法の１例は ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４： １０８１−１ ０８５，１９８８）により記載されている「アラニン走査突然変異誘発」と呼ば れる方法である。この方法では、標的残基のアミノ酸残基又は基（例えばＡｒｇ 、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ等の帯電残基）を指定し、中性又は負電荷 をもつアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置換し、アミノ 酸を細胞の内側又は外側の周囲水性環境と相互作用させる。次に、置換部位に付 加又は代替残基を導入することにより、置換に機能的感受性を示す領域を限定す る。こうしてアミノ酸配列修飾を導入する部位を予め決定し、所与の部位での突 然変異の性能を最適化するために、アラニン走査又はランダム突然変異誘発を実 施し、所望の活性及び活性度の最適組み合わせを求めて変異体をスクリーニング する。 置換突然変異誘発に最も有利な部位としては、種々の種からのＧＤＮＦタンパ ク質に存在するアミノ酸が側鎖の大きさ、電荷及び／又は疎水性の点で実質的に 相違する部位が挙げられる。他の有用な部位としては、種々の種から得られるＧ ＤＮＦ様タンパク質の特定残基が同一である部位が挙げられる。このような位置 は一般にタンパク質の生物活性に重要である。まず最初に、これらの部位を比較 的同類的に置換して修飾する。このような同類置換を表１の好ましい置換の欄に 示す。このような置換により生物活性が変化するならば、より実質的な変異（典 型的な置換）を導入及び／又は他の付加／欠失を実施し、得られた産物をスクリ ーニングする。 アミノ酸配列に穏当な改変（及びコーディング核酸配列の対応する修飾）を加 えると、後記実施例に記載する截形ＧＤＮＦタンパク質に類似の機能的及び化学 的特性をもつ截形ＧＤＮＦタンパク質を生じると予想される。他方、截形ＧＤＮ Ｆタンパク質の機能的及び／又は化学的特性の実質的変更は、（ａ）置換領域の ポリペプチド主鎖の構造（例えばシート又は螺旋構造等）、（ｂ）標的部位のタ ンパク質の電荷もしくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の大きさのいずれかを維持する 効果の点で有意に異なる置換を選択することにより達せられる。天然残基は共通 の側鎖性質に基づいて次のように分類される。 １）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、 ２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、 ３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、 ４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、 ５）側鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び ６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。 穏当でない置換は、これらの分類の１つのメンバーを別のメンバーに置換する ものと言える。このような置換残基は、他の ＴＧＦ−βタンパク質と相同の截形ＧＤＮＦタンパク質の領域に導入してもよい し、タンパク質の非相同領域に導入してもよい。Ｂ．截形ＧＤＮＦ誘導体 本明細書の開示に基づき、当業者は截形ＧＤＮＦ又は截形ＧＤＮＦ変異体の化 学修飾誘導体を作製できる。截形ＧＤＮＦタンパク質の誘導体化に最も適した化 学種としては水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーはこれと結合したタ ンパク質が生理的環境等の水性環境で沈殿しないという理由で望ましい。ポリマ ーは治療用製品又は組成物の製造に医薬的に許容可能であることが好ましい。当 業者はポリマー／タンパク質結合体を治療に使用するか否か、治療用の場合には 所望の投与量、循環時間、耐タンパク分解性及び他の要因に基づいて所望のポリ マーを選択することができよう。誘導体化の効果は、所望形態（即ち浸透圧ポン プ、より好ましくは注射もしくは注入、又は他の経口、肺もしくは他の送達経路 用剤形）で誘導体を投与し、その効果を判定することにより確認することができ る。 適切な水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）、エチレングリコール／プロピレング リコールのコポリマー、モノメトキシポリエチレングリコール、カルボキシメチ ルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、 ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無 水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムポリマー） 、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコー ルホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリ オキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリエチレングリコールプ ロピオンアルデヒド及びその混合物が挙げられる。本明細書で使用するポリエチ レングリコールとは、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ又はアリールオキシポリ エチレングリコールのように、他のタンパク質を誘導体化するために使用されて いるＰＥＧ形態の任意のものを意味する。ポリエチレングリコールプロピオンア ルデヒドはその水中安定性により製造が有利であると思われる。ポリマーは任意 の分子量でよく、枝分かれしていてもいなくてもよい。 本発明は特に、少なくとも１個のＰＥＧ分子に結合した截形ＧＤＮＦタンパク 質を含む截形ＧＤＮＦタンパク質産物に関す る。別の側面では、本発明はアシル又はアルキル結合を介して少なくとも１個の ＰＥＧ分子に結合した截形ＧＤＮＦタンパク質に関する。 ペジル化は当該技術分野で公知のペジル化反応の任意のものにより実施するこ とができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３（ ２）：４−１０（１９９２）；ＥＰ第０１５４３１６号；ＥＰ第０４０１３８４ 号；及びＭａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（ １９９２）（塩化トレシルを使用したＧＭ−ＣＳＦのペジル化の報告）参照。ペ ジル化は反応性水溶性ポリマーとのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実 施するのが好ましい。これらの好ましい誘導体化手段については以下に詳述する 。アシル化反応では、単一反応性エステル基をもつポリマーを選択するのが好ま しい。還元アルキル化反応では、単一反応性アルデヒド基をもつポリマーを選択 するのが好ましい。更に、単一反応基（例えばアシル化には活性エステル、アル キル化にはアルデヒド）をもつように選択ポリマーを修飾し、重合度を調節でき るようにしてもよい。天然グリコシル残基は通常は哺乳動物組換え発現系により 簡便に製造されるので、一般に、水 溶性ポリマーは天然グリコシル残基からは選択しない。 アシル化 本発明では、アシル化によるペジル化は一般にポリエチレングリコールの活性 エステル誘導体を截形ＧＤＮＦタンパク質と反応させることにより行われる。ペ ジル化工程を実施するためには任意の公知又は今後発見される反応性ＰＥＧ分子 を使用することができる。好ましい活性化ＰＥＧエステルはＮ−ヒドロキシスク シンイミド（「ＮＨＳ」）にエステル化したＰＥＧである。本明細書で使用する 「アシル化」とは、非限定的な例として截形ＧＤＮＦタンパク質とＰＥＧ：アミ ド、カルバメート、ウレタン等の水溶性ポリマーの結合を意味する。Ｂｉｏｃｏ ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）参照。反応条件は ペジル化技術で公知の条件又は今後開発される条件の任意のものから選択するこ とができるが、修飾しようとする截形ＧＤＮＦタンパク質を不活化するような温 度、溶媒及びｐＨレベル等の反応条件への暴露は回避又は制限すべきである。 アシル化によるペジル化の結果、一般にリジンε−アミノ基がアシル結合基を 介してペジル化されたポリペジル化截形ＧＤ ＮＦタンパク質が得られる。アミドによる結合が好ましい。また、得られる生成 物が実質的に単独で（例えば≧９５％）モノ、ジ又はトリペジル化されているこ とも好ましい。他方、使用する特定反応条件に依存する量でペジル化度の高い結 合物が若干形成される場合もある。所望により、特に透析、塩析、限外濾過、イ オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び電気泳動等の標 準精製技術により混合物から高純度ペジル化結合体を製造することもできる。 アルキル化 本発明では、アルキル化によるペジル化は一般に還元剤の存在下でＰＥＧの末 端アルデヒド誘導体を截形ＧＤＮＦタンパク質と反応させることにより実施され る。アルキル化によるペジル化もポリペジル化截形ＧＤＮＦタンパク質を生成す ることができる。更に、実質的にタンパク質のＮ末端のα−アミノ基のみでペジ ル化を助長するように反応条件を操作することもできる（即ちモノペジル化種） 。モノペジル化又はポリペジル化のいずれの場合もＰＥＧ基は−ＣＨ₂−ＮＨ基 を介してタンパク質に結合しているのが好ましい。特に−ＣＨ₂−基に関して、 この型の結合を本明細書では「アルキル」結合と呼ぶ。 特定タンパク質で誘導体化に利用可能な種々の型の第１アミノ基（Ｎ末端に対 するリジン）の反応性の差を利用する還元アルキル化により、選択的Ｎ末端化学 修飾を実施することができる。適当な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマ ーによりＮ末端でタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達せられる。例えば 、リジン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基のｐＫａ 差を利用できるようなｐＨで反応を実施することにより、タンパク質を選択的に Ｎ末端ペジル化することができる。このような選択的誘導体化により、水溶性ポ リマーとタンパク質の結合が制御され、ポリマーとの結合は主にタンパク質のＮ 末端で行われ、リジン側鎖アミノ基等の他の反応基の有意修飾は生じない。還元 アルキル化を使用する場合、水溶性ポリマーはタンパク質との結合に関わる反応 性アルデヒドをただ１つだけもつことが好ましい。例えば、単一反応性アルデヒ ドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用する。 本発明は、ＰＥＧ基がアシル又はアルキル基を介して結合したペジル化截形Ｇ ＤＮＦタンパク質を含む。上述のように、このような截形ＧＤＮＦタンパク質産 物はモノペジル化物でもポ リペジル化物（例えば２〜６個、好ましくは２〜５個のＰＥＧ基を含む）でもよ い。ＰＥＧ基は一般にアミノ酸のα又はε−アミノ基でタンパク質に結合してい るが、適切な反応条件下でＰＥＧ基に結合するように十分反応性の基であるなら ば、タンパク質の任意の反応基にＰＥＧ基を結合できるとも考えられる。例えば 、遊離アミノ基又はカルボキシル基等の反応基を介してポリエチレングリコール をタンパク質に共有結合させてもよい。反応基は活性化ＰＥＧ分子を結合可能な 基である。遊離アミノ基をもつアミノ酸残基としては、リジン残基とＮ末端アミ ノ酸残基が挙げられる。遊離カルボキシル基をもつアミノ酸残基としては、アス パラギン酸残基、グルタミン酸残基及びＣ末端アミノ酸残基が挙げられる。スル フヒドリル基もＰＥＧ分子を結合する反応基として使用することができる。治療 目的では、例えばＮ末端又はリジン基等のアミノ基に結合するのが一般には好ま しい。レセプター結合が所望される場合にはレセプター結合に重要な残基に結合 するのは避けるべきである。 １側面では、本発明はポリマー分子が実質的に単独位置のみ（即ち≧９５％） に結合しているモノポリマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体の実質的に均一な 調製物を提供する。より詳 細には、ＰＥＧを使用する場合には、本発明は場合により抗原結合基を欠失し、 截形ＧＤＮＦタンパク質と直接結合したＰＥＧ分子をもつペジル化截形ＧＤＮＦ タンパク質も提供する。 更に、グリコシル化、非グリコシル化又は脱グリコシル化截形ＧＤＮＦタンパ ク質を使用して誘導体を製造することもできる。一般には非グリコシル化截形Ｇ ＤＮＦタンパク質を使用する。例えば、原核生物で発現させた［Ａｒｇ³²−Ｉｌ ｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質を化学誘導体化し、アシル又はアルキル基を介 して結合した１個又は複数（例えば２〜４個）のＰＥＧ分子を含むようにするこ とができる。 一般に、化学誘導体化は生物学的に活性な物質を活性化ポリマー分子と反応さ せるために使用するのに適した任意の条件下で実施することができる。ペジル化 截形ＧＤＮＦタンパク質の製造方法は一般に、（ａ）截形ＧＤＮＦタンパク質が １個以上のＰＥＧ基と結合するような条件下で截形ＧＤＮＦタンパク質をポリエ チレングリコール（例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）と反 応させる段階と、（ｂ）反応物を得る段階を含む。一般に、アシル化反応に最適 な反応条件は公知パラメーターと所望の結果に基づいて個々に決定される。例え ば、ＰＥＧ対タンパク質の比が大きいほど、ポリペジル化物の百分率が高い。（ 過剰の未反応タンパク質又はポリマーが存在しないという意味での反応効率に関 する）最適比は所望の誘導体化度（例えばモノ、ジ、トリ等）、選択するポリマ ーの分子量、ポリマーが枝分かれしているか否か、使用する反応条件等の因子に より決定することができる。 モノポリマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体の実質的に均一なポピュレーシ ョンを製造するための還元アルキル化は、一般に（ａ）截形ＧＤＮＦタンパク質 のアミノ末端でα−アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したｐＨで還元条 件下に截形ＧＤＮＦタンパク質を反応性ＰＥＧ分子と反応させる段階と、（ｂ） 反応物を得る段階を含む。 モノポリマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体の実質的に均一なポピュレーシ ョンでは、還元アルキル化反応条件は截形ＧＤＮＦタンパク質のＮ末端に水溶性 ポリマー部分を選択的に結合できるような条件である。このような反応条件は、 一般にリジンアミノ基とＮ末端のαアミノ基の間にｐＫａ差を提供する（ｐＫａ はアミノ基の５０％がプロトン化され、５０％がプロトン化されないｐＨである ）。ｐＨは使用するポリマーとタ ンパク質の比にも影響を与える。一般に、ｐＨが低いほど、高いポリマー対タン パク質比が所望される（即ちＮ末端αアミノ基が低反応性であるほど、最適条件 に達するために多量のポリマーが必要となる）。ｐＨが高い場合には、ポリマー 対タンパク質比を大きくする必要はない（即ち高反応性基を利用できるので、必 要なポリマー分子数は少なくて済む）。本発明の目的では、ｐＨは一般に３〜９ 、好ましくは３〜６の範囲である。 ポリマーの分子量も考慮すべきである。一般に、ポリマーの分子量が大きいほ ど、タンパク質に結合できるポリマー分子の数は少ない。また、これらのパラメ ーターを最適化する際にはポリマーの分枝度も考慮すべきである。一般に、分子 量が大きいほど（又は分枝度が高いほど）ポリマー対タンパク質比は高い。一般 に、本発明で意図するペジル化反応では、好ましい平均分子量は約２ｋＤａ〜約 １００ｋＤａである（「約」なる用語はポリエチレングリコールの調製物中に指 定分子量よりも高い分子や低い分子があることを示す）。好ましい平均分子量は 約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、特に好ましくは約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである 。水溶性ポリマーと截形ＧＤＮＦタンパク質の比は一般に１：１〜１００：１、 好ましくは（ポリペジル化 では）１：１〜２０：１、及び（モノペジル化では）１：１〜５：１である。 上記条件を使用すると、還元アルキル化はアミノ末端にα−アミノ基をもつ任 意の截形ＧＤＮＦタンパク質にポリマーを選択的に結合することができ、モノポ リマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体の実質的に均一な調製物を提供する。本 明細書で使用する「モノポリマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体」なる用語は 截形ＧＤＮＦタンパク質に結合した単一ポリマー分子を含む誘導体を意味する。 モノポリマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体は、リジンアミノ側鎖でなくＮ末 端に配置されたポリマー分子をもつことが好ましい。調製物は好ましくは＞９０ ％モノポリマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体、より好ましくは＞９５％モノ ポリマー／截形ＧＤＮＦタンパク質結合体であり、検出可能なタンパク質の残余 は未反応である（即ちポリマー部分をもたないタンパク質）。 還元アルキル化では、還元剤は水溶液中で安定であるべきであり、初期還元ア ルキル化プロセスで形成されるシッフ塩基のみを還元できることが好ましい。還 元剤の例はホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミ ンボラン、 トリメチルアミンボラン及びピリジンボランから構成される群から選択すること ができる。特に好ましい還元剤はシアノホウ水素化ナトリウムである。溶媒、反 応時間、温度等の他の反応パラメーターと生成物の精製手段は水溶性ポリマーに よるタンパク質の誘導体化に関する一般に入手可能な情報に基づいて個々に決定 することができる。 アシル化及び／又はアルキル化方法によりポリマー／タンパク質結合体の混合 物を製造するように選択してもよく、本発明は、混合物に配合するモノポリマー ／タンパク質結合体の割合を選択できるという利点がある。従って、所望により 様々な数（即ちジ、トリ、テトラ等）のポリマー分子を結合したタンパク質の混 合物を製造し、本発明の方法を使用して製造したモノポリマー／タンパク質結合 体材料と組み合わせ、所定の割合のモノポリマー／タンパク質結合体を含む混合 物を取得できる。截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド 本発明は更に截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする新規ポリヌクレオチドを提 供する。ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして使用する場 合、核酸配列は実質的に他の全核酸配列を含まない。組換えタンパク質発現で使 用するに は、融合タンパク質が所望される場合を除き、核酸配列は一般に他のタンパク質 をコードする核酸配列を実質的に含まない。本明細書の記載に基づき、汎用コド ン表を使用すると、当業者は截形ＧＤＮＦタンパク質のアミノ酸配列をコードす る全核酸配列を容易に決定することができる。本発明で好ましい核酸配列として は、［Ａｒｇ¹⁶−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｓｅｒ²⁶−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴ ］及び［Ｌｙｓ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌ クレオチドが挙げられる。種々のポリヌクレオチドの例は図５、６及び７に示す ものや、截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする図１、３及び４の部分である。截 形ＧＤＮＦタンパク質をコードする新規ポリヌクレオチドが人工又は天然を問わ ず変異体截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列を含むことも当業者に理 解されよう。 以下の記載に従って組換え発現技術を実施すると、これらのポリヌクレオチド を製造し、種々の截形ＧＤＮＦタンパク質を発現させることができる。例えば、 截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列を適当なベクターに挿入すること により、当業者は大量の所望のヌクレオチド配列を容易に製造することができる 。その後、この配列を使用して検出プローブ又は増幅 プライマーを作製することができる。あるいは、截形ＧＤＮＦタンパク質をコー ドするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することもできる。発現ベクター を適当な宿主に導入することにより、所望の截形ＧＤＮＦタンパク質を大量に製 造することができる。 以下に詳述するように、核酸配列の増殖及び／又は截形ＧＤＮＦタンパク質の 製造には多数の宿主／ベクター系を利用できる。非限定的な例としては、プラス ミド、ウイルス及び挿入ベクターと、原核及び真核宿主が挙げられる。当業者は 異種ＤＮＡを増殖又は発現することが可能な宿主／ベクター系を改変して本発明 の配列を産生又は発現させることができる。 このような組換え技術により、本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質は商用量で容 易に製造される。更に、本明細書の開示に鑑み、新規核酸配列は図面に具体的に 示す截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする縮重核酸配列、このような截形ＧＤＮ Ｆタンパク質の変異体、及び好ましくはストリンジェントハイブリダイゼーショ ン条件下でこれらの核酸配列の相補体とハイブリダイズする核酸配列（Ｍａｎｉ ａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ）； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，３８７〜３８ ９頁，１９８２参照）を含むことが当業者に理解されよう。ストリンジェントハ イブリダイゼーション条件の例は、６２〜６７℃で４×ＳＳＣ中でハイブリダイ ゼーション後、６２〜６７℃で０．１×ＳＳＣで約１時間の洗浄である。他のス トリンジェントハイブリダイゼーション条件は４０〜４５℃で４５〜５５％ホル ムアミド、４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションである。リラックスハイブ リダイゼーション条件下で截形ＧＤＮＦタンパク質の相補的配列とハイブリダイ ズし、本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列も本発明に含ま れる。このようなリラックスストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の 例は４５〜５５℃で４×ＳＳＣ又は４０〜４５℃で３０〜４０％ホルムアミドを 用いたハイブリダイゼーションである。 本発明は、截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列と共にベクターＤ ＮＡを含む組換えＤＮＡ構築物も提供する。このようなＤＮＡ構築物において、 （シグナルペプチドの有無に拘わらず）截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核 酸配列は選択された宿主で截形ＧＤＮＦタンパク質の複製及び／又は発 現を誘導することが可能な適切な発現制御又は調節配列と作動的に結合している 。截形ＧＤＮＦタンパク質の組換え発現 截形ＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドの作製 截形ＧＤＮＦをコードする核酸配列又は成熟ＧＤＮＦ出発材料は、非限定的な 例として化学的合成、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリースクリーニング、発現ラ イブラリースクリーニング及び／又はｃＤＮＡのＰＣＲ増幅等の種々の方法で容 易に得ることができる。これらの方法及びこのような核酸配列を単離するために 有用な他の方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）及びＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍ ｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．１５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９８ ７）により記載されている。ＧＤＮＦをコードする好ましい核酸配列は哺乳動物 配列である。 截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列の化学的合成は、例えばＥｎｇ ｅｌｓら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４， １９８９）により記載されているような当該技術分野で周知の方法を使用しても 実施することができる。これらの方法のうちでは、特にホスホトリエステル、ホ スホラミダイト及びＨ−ホスホネートによる核酸配列合成法が挙げられる。截形 ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列は数百塩基対（ｂｐ）又はヌクレオチ ド長である。例えば約１００ヌクレオチド長を上回る大きい核酸配列を数個のフ ラグメントとして合成することができる。その後、フラグメントを相互に連結す ると、截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列を形成することができる。 好ましい方法の１例は、標準ホスホラミダイト化学を使用したポリマーによる合 成である。 あるいは、適当なｃＤＮＡライブラリー（即ちタンパク質を発現すると考えら れる１種以上の組織材料から調製したライブラリー）又はゲノムライブラリー（ 全ゲノムＤＮＡから調製し たライブラリー）をスクリーニングすることにより適切な核酸配列を得ることも できる。ｃＤＮＡライブラリーの材料は一般には妥当な量のＧＤＮＦを発現する と考えられる任意の種からの組織である。ゲノムライブラリーの材料はＧＤＮＦ 又はＧＤＮＦ同族体をコードする遺伝子をもつと考えられる任意の哺乳動物又は 他の種からの任意の組織であり得る。ライブラリーに存在するＧＤＮＦ又はＧＤ ＮＦ同族体ｃＤＮＡ又は遺伝子と選択的にハイブリダイズする１種以上のプロー ブ（クローニングしようとするＧＤＮＦ又はＧＤＮＦ同族体ｃＤＮＡ又は遺伝子 に対して許容可能な相同レベルをもつオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ又はゲノム ＤＮＡフラグメント）を使用し、ＧＤＮＦｃＤＮＡ／遺伝子の存在についてライ ブラリーをスクリーニングすることができる。このようなライブラリースクリー ニングに一般に使用するプローブは通常はライブラリーの調製に用いた種と同一 又は類似の種からのＧＤＮＦ ＤＮＡ配列の小領域をコードする。あるいは、プ ローブは本明細書に記載するような縮重配列でもよい。 ライブラリースクリーニングは一般に、プローブ又はプライマーに対して有意 相同レベルをもつクローンとの結合を可能に し且つ非特異的結合を阻止するストリンジェンシー条件下でライブラリー中のク ローンにオリゴヌクレオチドプローブ又はｃＤＮＡをアニールすることにより実 施される。典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄ストリンジェンシー条件は ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドプローブの寸法（即ちヌクレオチド長数）や、 プローブが縮重配列であるか否かにも依存する。ハイブリダイゼーション溶液を 設計するときはクローンの獲得確率（即ちｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン グするのか又はゲノムライブラリーか、ｃＤＮＡライブラリーであるならば、目 的ｃＤＮＡが高レベルで存在する確率）も考慮する。 ＤＮＡフラグメント（例えばｃＤＮＡ）をプローブとして使用する場合には、 典型的なハイブリダイゼーション条件は、上記Ａｕｓｕｂｅｌら編に記載されて いるような条件を含む。ハイブリダイゼーション後、プローブ寸法、クローンに 対するプローブの予想される相同性、スクリーニングするライブラリーの種類、 スクリーニングするクローン数等の数種の因子に依存して適当なストリンジェン シーでライブラリーを含むブロットを洗浄する。（通常はイオン強度が低く、比 較的高温で使用される）ストリンジェント洗浄溶液の例を以下に挙げる。このよ うなストリンジェント洗浄液の１例は５５〜６５℃で０．０１５Ｍ ＮａＣｌ， ０．００５Ｍクエン酸ナトリウム及び０．１％ＳＤＳである。別のストリンジェ ント緩衝液の例は約４０〜５０℃で１ｍＭ Ｎａ₂ＥＤＴＡ，４０ｍＭ ＮａＨ ＰＯ₄，ｐＨ７．２及び１％ＳＤＳである。他のストリンジェント洗浄液の例は 約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳである。 更に、オリゴヌクレオチドプローブを使用してｃＤＮＡ又はゲノムライブラリ ーをスクリーニングする場合に典型的なストリンジェントな洗浄条件のプロトコ ルも存在する。例えば、第１のプロトコルではプローブの長さに応じて約３５〜 ６２℃の温度で０．０５％ピロリン酸ナトリウムを含む６×ＳＳＣを使用する。 例えば、１４塩基プローブは３５〜４０℃、１７塩基プローブは４５〜５０℃、 ２０塩基プローブは５２〜５７℃、２３塩基プローブは５７〜６３℃で洗浄する 。非特異的なバックグラウンド結合が高いと思われる場合には温度を２〜３℃上 げてもよい。第２のプロトコルではテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡ Ｃ）を洗浄に使用する。このようなストリンジェント洗浄溶液の１例は３Ｍ Ｔ ＭＡＣ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０及び０．２％ＳＤＳである。 ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列を得るために利用可能な別の方法は ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法では、ＧＤＮＦを発現する組 織からポリ（Ａ）＋ＲＮＡ又は全ＲＮＡを抽出する。次に逆転写酵素を使用して ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。次に、一般にはＧＤＮＦ ｃＤＮＡの２つの別 個の領域に相補的な２種のプライマー（オリゴヌクレオチド）をＴａｑポリメラ ーゼ等のポリメラーゼと共にｃＤＮＡに加えると、ポリメラーゼは２種のプライ マーの間のｃＤＮＡ領域を増幅する。 所望の截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列を作製するのに選択した 方法がオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブの使用を必要とする場合（例 えばＰＣＲ、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリースクリーニング）には、プローブ 又はプライマーとして選択するオリゴヌクレオチド配列は、ライブラリースクリ ーニング又はＰＣＲ増幅中に生じる非特異的結合の量を最小限にするように十分 な長さと十分明確な配列をもつべきである。プローブ又はプライマーの実際の配 列は、通常は同一遺伝子又は別の生物からの類似遺伝子に由来する保存又は高相 同性配列又は領域に基づく。場合により、プローブ又はプライ マーは完全又は部分縮重配列でもよく、即ち異なるコドンを使用しながら全て同 一のアミノ酸配列をコードするプローブ／プライマー混合物でもよい。縮重プロ ーブを作製する代わりに、種によって異なるコドン位置の一部又は全部にイノシ ンを配置してもよい。オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは上記のよう なＤＮＡの化学合成法により作製できる。 ＧＤＮＦをコードするこれらの核酸配列に基づく截形ＧＤＮＦタンパク質とそ の突然変異体又は変異体配列も本発明の範囲に含まれる。上述のように、突然変 異体又は変異体配列は野生型配列に比較して１個以上のヌクレオチド置換、欠失 及び／又は挿入を含み、その結果として野生型アミノ酸配列に比較してアミノ酸 配列変異を発現する配列である。場合によっては、自然対立遺伝子変異の存在に より、天然ＧＤＮＦアミノ酸突然変異体又は変異体が存在することもある。この ような天然突然変異体又は変異体に基づく截形ＧＤＮＦタンパク質も本発明の範 囲に含まれる。合成突然変異体配列の作製は当該技術分野で周知であり、例えば Ｗｅｌｌｓら（Ｇｅｎｅ，３４：３１５，１９８５）やＳａｍｂｒｏｏｋら，前 出に記載されている。 ベクター 截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡをベクターに 挿入して更にクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現させる。利用可能なベクタ ーは市販されており、又はベクターを特別に構築してもよい。適当なベクターの 選択又は構築は、１）ＤＮＡ増幅に使用するのか、ＤＮＡ発現に使用するのか、 ２）ベクターに挿入するＤＮＡの寸法、及び３）ベクターで形質転換する宿主細 胞（例えば哺乳動物、昆虫、酵母、真菌、植物又は細菌細胞）に依存する。各ベ クターはその機能（ＤＮＡの増幅又はＤＮＡの発現）と目的宿主細胞との適合性 に依存して種々の成分を含む。ベクター成分の非限定的な例としては一般に、シ グナル配列、複製起点、１個以上の選択又はマーカー遺伝子、エンハンサーエレ メント、プロモーター、転写終結配列等の１種以上が挙げられる。これらの成分 は天然材料から得てもよいし、公知手順で合成してもよい。本発明のベクターは 選択された宿主細胞による截形ＧＤＮＦタンパク質の発現を誘導、制御又は他の 方法で司ることが可能な下記発現制御又は調節配列の１種以上に作動的に連結し た目的截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列を含む。 シグナル配列 シグナル配列はベクターの成分でもよいし、ベクターに挿入するＧＤＮＦ Ｄ ＮＡの一部でもよい。天然ＧＤＮＦ ＤＮＡは、タンパク質の翻訳後プロセシン グ中に切断されて成熟ＧＤＮＦタンパク質を形成するタンパク質のアミノ末端の シグナル配列をコードする。天然シグナル配列及び他のプレープロ配列をもつ截 形ＧＤＮＦポリヌクレオチドと、天然シグナル配列を欠失し、異種シグナル配列 で置換した截形ＧＤＮＦポリヌクレオチドが本発明の範囲に含まれる。選択する 異種シグナル配列は宿主細胞により認識及びプロセシングされる配列、即ちシグ ナルペプチダーゼにより切断される配列とすべきである。天然ＧＤＮＦシグナル 配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞では、シグナル配列を例えばア ルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ又は熱安定性エントロトキシンＩＩリー ダーの群から選択される原核シグナル配列で置換する。酵母分泌では、天然ＧＤ ＮＦシグナル配列を酵母インベルターゼ、α因子又は酸ホスファターゼリーダー で置換すればよい。哺乳動物細胞発現では、天然シグナル配列でよいが、他の哺 乳動物シグナル配列も利用できる。 複製起点 発現及びクローニングベクターは一般に、１種以上の選択された宿主細胞でベ クターを複製させる核酸配列を含む。クローニングベクターでは、この配列は一 般にはベクターを宿主染色体ＤＮＡから独立して複製させる配列であり、複製起 点又は自律複製配列を含む。このような配列は種々の細菌、酵母及びウイルスで 周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は殆どのグラム陰性菌に利 用でき、哺乳動物細胞でのクローニングベクターには種々の起点（例えばＳＶ４ ０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）が有用である。一般に、 哺乳動物発現ベクターには複製起点成分は不要である（例えばＳＶ４０起点を使 用することが多いが、これは単に初期プロモーターを含むという理由に過ぎない ）。 選択遺伝子 発現及びクローニングベクターは一般に選択遺伝子を含む。この遺伝子は選択 培地で培養する場合に形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要な「マーカー」タ ンパク質をコードする。ベクターで形質転換されなかった宿主細胞は選択遺伝子 を含まないので、培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ） 抗生物質又は他の毒素（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート 又はテトラサイクリン）に対する耐性を与え、（ｂ）栄養要求欠損を補充し、又 は（ｃ）培地から得られない必須栄養を供給するタンパク質をコードする。 発現される遺伝子を増幅するために他の選択遺伝子を使用してもよい。増幅は 、増殖に必須のタンパク質の産生に大いに必要とされる遺伝子が組換え細胞の連 続世代の染色体内でタンデムに反復するプロセスである。哺乳動物細胞に利用可 能な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）とチミ ジンキナーゼが挙げられる。形質転換哺乳動物細胞を選択圧下におき、形質転換 細胞のみを特別に改変してベクター中に存在するマーカーにより生存できるよう にする。選択圧は、培地中の選択物質の濃度が連続的に変化して選択遺伝子と截 形ＧＤＮＦをコードするＤＮＡの両者を増幅させるような条件下で形質転換細胞 を培養することにより加えられる。その結果、増幅ＤＮＡから多量の截形ＧＤＮ Ｆが合成される。 例えば、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセートを含む培地 で全形質転換細胞を培養することにより、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細 胞をまず同定する。野生 型ＤＨＦＲを使用する場合に適当な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損するチャイ ニーズハムスター卵巣細胞系である（例えばＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７７（７）：４２１６−４２２ ０（１９８０）参照）。次に、形質転換細胞を高レベルのメトトレキセートに暴 露する。その結果、ＤＨＦＲ遺伝子の多重コピーが合成され、それと同時に発現 ベクター中に存在する他のＤＮＡ（例えば截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする ＤＮＡ）の多重コピーも合成される。 プロモーター 本発明の発現及びクローニングベクターは一般に、宿主生物により認識され、 截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモータ ーを含む。プロモーターは構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に配置された 非翻訳配列（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）であり、截形ＧＤＮＦをコー ドする配列等の特定核酸配列の転写及び翻訳を制御する。プロモーターは従来、 誘導的プロモーターと構成的プロモーターの２種類に分類されている。誘導的プ ロモーターは栄養又は温度変化の有無等の培養条件の何らかの変化に応答してそ の制御下のＤＮＡから高レベルの転写を開始する。種々の潜在宿主細胞により認 識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素 消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列を ベクターに挿入することにより、截形ＧＤＮＦをコードするＤＮＡに作動的に連 結される。天然ＧＤＮＦプロモーター配列を使用して截形ＧＤＮＦ ＤＮＡの直 接増幅及び／又は発現を誘導することもできる。他方、天然プロモーターよりも 多量の発現タンパク質の転写と高収率を可能にし、使用に選択した宿主細胞系に 適合可能である場合には、異種プロモーターが好ましい。 原核宿主で使用するのに利用可能なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ 及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔ ｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター（例えばｔａｃプロモー ター）が挙げられる。他の公知細菌プロモーターも利用できる。これらのプロモ ーターのヌクレオチド配列は公表されているので、当業者は任意の必要な制限部 位を提供するのに必要なリンカー又はアダプターを使用して所望のＤＮＡ配列に 連結することができる。 酵母宿主で使用するのに利用可能なプロモーター配列も当該技術分野で周知で ある。酵母エンハンサーを酵母プロモーターと併用すると有利である。哺乳動物 細胞で使用するのに適したプロモーターは周知であり、例えばポリオーマウイル ス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピロー マウイルス、トリサルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス 、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましい例としてサルウイルス４０（ＳＶ４０）等 のウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の利用可能な哺乳動物プ ロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば熱ショックプロモータ ー及びアクチンプロモーター）が挙げられる。ＣＨＯ細胞でＧＤＮＦタンパク質 を産生させるのに本発明で使用したプロモーターはＳＲαである。Ｔａｋｅｂｅ ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．８（１）：４６６−４７２（１９８８）参照 。適切な発現ベクターの１例は、追って詳述するｐＤＳＲα２である。 エンハンサーエレメント 本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列の高等真核生物によ る転写を増加するために、ベクターにエンハ ンサー配列を挿入してもよい。エンハンサーは通常は約１０〜３００ｂｐ長のＤ ＮＡのシス作用エレメントであり、その転写を増加するようにプロモーターに作 用する。エンハンサーは向きや位置から比較的独立している。エンハンサーは転 写単位の５’及び３’に検出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能な数種の エンハンサー配列が知られている（例えばグロブリン、エラスターゼ、アルブミ ン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかし、一般にはウイルスからの エンハンサーを使用する。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ ロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハン サーが真核プロモーターの活性化を亢進するエレメントの例である。エンハンサ ーは截形ＧＤＮＦ ＤＮＡの５’又は３’位でベクターにスプライスしてもよい が、一般にはプロモーターから５’位に配置する。 転写終結 真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物から の有核細胞）で使用する発現ベクターは更に、転写の終結とｍＲＮＡの安定化に 必要な配列も含む。このような配列は通常は真核ＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び 場合により ３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は截形ＧＤＮＦをコードするｍＲＮ Ａの非翻訳部分でポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセ グメントを含む。 所望の截形ＧＤＮＦコーディング配列と共に上記成分の１種以上を含む適切な ベクターの構築は標準連結技術により実施される。単離プラスミド又はＤＮＡフ ラグメントを切断し、順化し、必要なプラスミドを生成するために所望の順序に 再連結する。正しい配列が構築されたことを確認するためには、連結混合物を使 用して大腸菌を形質転換し、形質転換に成功した細胞を上記のようなアンピシリ ン又はテトラサイクリン耐性等の公知技術により選択すればよい。次いで形質転 換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼにより分析し、及び／ 又は配列決定し、所望の構築物の存在を確認する。 哺乳動物細胞で截形ＧＤＮＦをコードするＤＮＡの一過性発現を可能にするベ クターを使用してもよい。一般に、一過性発現は宿主細胞で効率的に複製するこ とが可能な発現ベクターを使用し、宿主細胞に発現ベクターの多数のコピーを蓄 積させ、その結果、発現ベクターによりコードされる所望のタンパク質を高レベ ルで合成させる。適切な発現ベクターと宿主細胞を含 む一過性発現系は、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質の簡便な正 の同定と、所望の生物学的又は生理的性質に関する前記タンパク質の迅速なスク リーニングを可能にする。従って、一過性発現系はタンパク質の変異体を同定す るのに特に有用である。 宿主細胞の選択及び形質転換 組換え截形ＧＤＮＦタンパク質を発現させるのに使用する核酸配列で形質転換 した宿主細胞（例えば細菌、哺乳動物、昆虫、酵母又は植物細胞）も本発明によ り提供される。形質転換した宿主細胞を、核酸配列の発現を可能にする適当な条 件下で培養する。適切な宿主細胞と形質転換、培養、増幅、スクリーニング並び に生成物産生及び精製方法は当該技術分野で周知である。例えばＧｅｔｈｉｎｇ とＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０−６２５（１９８１）； Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５（７）：１７５０−１７ ５９（１９８５）； 又はＨｏｗｅｌｅｙら，米国特許第４，４１９，４４６号 参照。截形ＧＤＮＦは、成熟ＧＤＮＦの発現に関するＬｉｎらの記載（米国特許 出願第０７／８５５，４１３号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０７８８８号、 ＷＯ９３／０６１１６） に従って大腸菌で発現させることができる。他の典型的な材料及び方法について は以下に詳述する。形質転換した宿主細胞を適切な培地で培養した後、発現され た因子を場合により当業者に公知の適当な手段により培地から（又は細胞内で発 現される場合には細胞から）回収、単離及び精製する。 本発明のベクターをクローニング及び発現させるのに適した宿主細胞は上述の ような原核、酵母又は高級真核細胞である。原核宿主細胞の非限定的な例として は、グラム陰性又はグラム陽性生物等の真正細菌が挙げられ、例えば大腸菌、バ シラス属（例えば枯草菌）、シュードモナス種（例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓ ａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓである。あるいは、ＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応 等のｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング法も利用できる。 原核宿主細胞に加え、糸状菌類や酵母等の真核微生物も截形ＧＤＮＦタンパク 質の発現宿主として利用できる。下級真核宿主微生物のうちではＳａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（俗名パン酵母）が最もよく使用されるが 、多数の他の属、種及び株も周知であり、一般に入手可能である。 グリコシル化截形ＧＤＮＦタンパク質の発現に適した宿主細胞は多細胞生物か ら得られる。このような宿主細胞は複雑なプロセシング及びグリコシル化活性が 可能である。脊椎動物細胞であるか、植物及び昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞で あるかを問わず、原則として任意の高級真核細胞培養物を使用できる。脊椎動物 細胞の培養（組織培養）増殖は周知方法であるので、一般には脊椎動物細胞を使 用する。有用な哺乳動物宿主細胞系の非限定的な例としては、ＳＶ４０により形 質転換したサル腎ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児腎系（２９３又は懸濁培養 増殖のためにサブクローニングした２９３細胞）、乳児ハムスター腎細胞、及び チャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。他の利用可能な哺乳動物細胞系 の非限定的な例としては、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａ ｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３系、ＢＨＫ又はＨａＫハムスタ ー細胞系が挙げられる。 本発明に利用可能な宿主細胞として細菌細胞も有用である。例えば、種々の大 腸菌株（例えばＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１）がバイオテ クノロジー分野で宿主細胞として周知である。ストレプトミセス種等の種々の株 も使用で きる。截形ＧＤＮＦタンパク質を製造するのに本発明で好適な宿主細胞は細菌細 胞（例えば大腸菌）と哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、 ＣＯＳ細胞等）である。 宿主細胞を上記発現又はクローニングベクターでトランスフェクト、好ましく は形質転換し、慣用栄養培地で培養する。培地はプロモーターの誘導、形質転換 細胞の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変しても よい。トランスフェクション及び形質転換は、利用する宿主細胞に適するように 選択された当業者に周知の標準技術を使用して実施される。例えば、細胞壁をも たない哺乳動物細胞では、リン酸カルシウム沈殿法を使用できる。エレクトロポ レーション、マイクロインジェクション及び他の公知技術も使用できる。 宿主細胞の培養 本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質を製造するために使用する形質転換細胞は適 切な培地で培養する。培地は必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（例 えばインスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナト リウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、 抗生物質（例えばゲンタマイシン）、微量元素（通常はマイクロモル範囲の最終 濃度で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は他のエネル ギー源を補充してもよい。当業者に理解される通り、他の補充剤も適当な濃度で 加えてもよい。選択した宿主細胞で使用するのに適した温度、ｐＨ等の培養条件 も当業者に周知である。 截形ＧＤＮＦタンパク質は相同組換え、即ちＧＤＮＦをコードするＤＮＡを既 に含んでいる細胞に導入した制御エレメントを使用する組換え製造方法により製 造することも可能である。相同組換えは、転写活性遺伝子に突然変異を誘導又は 修正するように遺伝子をターゲティングするために本来開発された技術である（ Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．ａ ｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１（１９８９））。基本技術は哺乳動物ゲ ノムの特定領域に特定突然変異を導入する方法（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ．４ ４：４１９−４２８，１９８６； ＴｈｏｍａｓとＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ．５１：５０３−５１２，１９８７； Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５８３−８５８７，１９８８）として又は 欠損遺伝子内の特定突然変 異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ．３３０：５７６− ５７８，１９８７）に開発された。典型的な相同組換え技術は、参考資料として その開示内容を本明細書の一部とする米国特許第５，２７２，０７１号（ＥＰ第 ９１９０３０５１号、ＥＰ公開第５０５５００号、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４ ２、国際公開ＷＯ９１／０９９５５）に記載されている。 相同組換えにより、ゲノムに挿入しようとするＤＮＡ配列をターゲティングＤ ＮＡに結合することにより目的遺伝子の特定領域に導くことができる。ターゲテ ィングＤＮＡはゲノムＤＮＡのある領域に相補的（相同）なＤＮＡである。ゲノ ムの特定領域に相補的なターゲティングＤＮＡの小断片をＤＮＡ複製プロセス中 に親鎖と接触させる。細胞に挿入されたＤＮＡは、共通相同領域を介して内因Ｄ ＮＡの他の断片とハイブリダイズし、従って、これと組換えするという一般性質 をもつ。突然変異又は異なるＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドにこの相補鎖 を結合するならば、この相補鎖は組換えの結果として新しく合成された鎖にも組 み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、新しいＤＮＡ配列を鋳型 として使用することができる。従って、転写されたＤＮＡはゲノムに組み込まれ る。 ＧＤＮＦの核酸配列等の特定遺伝子の配列が分かっている場合には、遺伝子の 選択領域に相補的なＤＮＡの断片であるプレ−プロ配列又は発現制御配列を合成 することができ、あるいは目的領域の境界となる特定認識部位で天然ＤＮＡを適 当に制限消化するなどの方法でこのような配列が得られる。この断片は細胞に挿 入するとターゲティング配列として機能し、ゲノムの内側でその相同領域とハイ ブリダイズする。ＤＮＡ複製中にこのハイブリダイゼーションが生じるならば、 このＤＮＡ断片とこれに結合した任意の付加的配列は岡崎フラグメントとして作 用し、新しく合成されたＤＮＡ娘鎖にバックステッチされる。 本発明では、ＧＤＮＦタンパク質の発現に相互作用すると考えられるＤＮＡの 領域がターゲティングＤＮＡのこれらの断片に結合している。例えば、所望の截 形ＧＤＮＦをコードするＤＮＡの転写に作用するに十分近傍の位置及び向きで所 期宿主細胞のゲノムにプロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、 又は外因転写調節エレメントを挿入する。制御エレメントは截形ＧＤＮＦをコー ドせず、宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、截形ＧＤ ＮＦタンパク質の発現は、截形ＧＤＮＦ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトラ ンスフェクションによって達せられるのではなく、截形ＧＤＮＦタンパク質の転 写のための認識可能なシグナルを内因遺伝子配列に提供するＤＮＡ調節セグメン トと結合したターゲティングＤＮＡ（目的の内因遺伝子に対して相同の領域を含 む）の使用によって達せられる。 本発明によると、相同組換え法を使用して通常は転写に不活性なＧＤＮＦ遺伝 子を含む細胞を改変し、ＧＤＮＦを発現する細胞を作製することもできる。その 後、ＧＤＮＦタンパク質をプロセシングすると、截形ＧＤＮＦタンパク質を形成 することができる。截形ＧＤＮＦ医薬組成物 截形ＧＤＮＦタンパク質産物医薬組成物は一般に、１種以上の医薬的及び生理 的に許容可能な配合剤と混合した治療上有効な量の截形ＧＤＮＦタンパク質産物 を含む。利用可能な配合剤の非限定的な例としては、酸化防止剤、防腐剤、着色 剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶剤、充填剤、増量剤、緩衝液、送 達ビヒクル、希釈液、賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられる。例えば 、利用可能なビヒクルとしては注射用水、生理的食品水、又は人工脳髄液（ＣＳ Ｆ）が挙げられ、 場合により、非経口投与用組成物に通常用いられる他の材料を補充してもよい。 天然緩衝食品水又は血清アルブミンと混合した食品水も典型的ビヒクルである。 ビヒクル中の主溶媒は水性でも非水性でもよい。更に、ビヒクルは製剤のｐＨ 、オスモル濃度、粘度、透明度、色、滅菌度、安定性、溶解速度又は臭いを変更 又は維持するために他の医薬的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。また、 ビヒクルは截形ＧＤＮＦタンパク質産物の安定性、溶解速度又は放出速度を変更 又は維持するため、あるいは截形ＧＤＮＦタンパク質産物の血液脳関門吸収又は 通過を助長するために更に別の医薬的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。 このような賦形剤は単位剤形もしくは多剤形の非経口投与製剤又は移植ポンプか らの連続もしくは周期的注入によるＣＳＦへの直接注入用製剤を調剤するために 通常慣用的に使用されている物質である。 治療組成物を調剤したら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体又は脱水 もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存することができる。このような 製剤は即使用可能な形態で保存してもよいし、例えば投与前に再構成が必要な凍 結乾燥形態で保存してもよい。 最適医薬製剤は投与経路と所望の投与量に依存して当業者により決定される。 例えば、参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とするＲｅｍｉｎｇｔｏ ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１８版（１９９０ ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２ ）１４３５〜１７１２頁参照。組成物は更に、ポリ乳酸、ポリグルコール酸等の ポリマー化合物の粒状調製物を含んでいてもよいし、リポソームに封入してもよ い。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環持続時間を促進する効果があると考え られる。このような組成物は本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定 性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度を変更でき る。 非経口徐放製剤、吸入ミスト、経口活性製剤又は座薬等の他の有効な投与形態 も考えられる。本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質産物医薬組成物は例えば脳髄内 注射等の非経口投与用に調製される。このような非経口投与治療組成物は一般に 医薬的に許容可能なビヒクル中に截形ＧＤＮＦタンパク質産物を含む非経口的に 許容可能なパイロジェンフリー水溶液の形態である。好ましいビヒクルの１例は 生理的食塩水である。 截形ＧＤＮＦタンパク質産物を含む所定の製剤は経口投与することも考えられ る。このように投与する截形ＧＤＮＦタンパク質産物はカプセル封入することが でき、固体剤形の配合に慣用的に使用されているキャリヤーの存在下又は不在下 で調剤できる。カプセルは生体利用性が最大となり且つ全身循環前の分解が最小 となる時点で胃腸管に製剤の活性部分を放出するように設計することができる。 截形ＧＤＮＦタンパク質産物の吸収を助長するために付加的な賦形剤を加えても よい。希釈剤、矯味矯臭剤、低融点ろう、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤 及び結合剤も使用してもよい。截形ＧＤＮＦタンパク質産物の投与 截形ＧＤＮＦタンパク質産物は皮下、筋肉内、静脈内、経肺、経皮、鞘内又は 大脳内経路により非経口投与することができる。血液脳関門を通過しないタンパ ク質成長因子は大脳内に直接投与するか、又は関門間を輸送する他のエレメント と共に投与すればよい。截形ＧＤＮＦタンパク質産物は脳髄内又は脳もしくは脊 髄くも膜下腔に投与するのが好ましい。截形ＧＤＮＦタンパク質産物は脳実質に 直接大脳内投与してもよい。生分解性ポリマーマトリックスに埋封した神経栄養 因子を含む徐放インプ ラントを脳に移植し、截形ＧＤＮＦタンパク質産物を送達することもできる。截 形ＧＤＮＦタンパク質産物は、血液脳関門を通過するように化学的に修飾又はパ ッケージした形態で大脳外に投与してもよいし、截形ＧＤＮＦタンパク質産物の 関門通過を促進することが可能な１種以上の物質と併用投与してもよい。例えば 、ＮＧＦとモノクローナル抗トランスフェリンレセプター抗体の結合体はトラン スフェリンレセプターとの結合により脳に輸送されることが示されている。所望 用量の截形ＧＤＮＦタンパク質産物を投与するためには、毎日又はより低頻度で 繰り返し注射してもよいし、一定又はプログラム可能な流量の移植ポンプから截 形ＧＤＮＦタンパク質産物を連続又は周期的に注入してもよい。投与頻度は調剤 する截形ＧＤＮＦタンパク質産物の薬物動態パラメーターと、投与経路によって 異なる。 投与方法に関係なく、比用量は一般に体重又は体表面積に従って計算される。 脳疾患では、比用量は一般に患者の概算大脳重量に従って計算され、大脳重量も 体重又は体表面積に基づいて推定できる。上記製剤の各々を利用する治療に適し た用量を決定するために必要な更に精密な計算は、特に本明細書に開示する用量 情報及びアッセイを参考にして当業者により日常的方 法で実施される。用量が適当であるか否かは、適当な用量応答データと組み合わ せて使用量を決定する確立アッセイを使用して確認することができる。特定症状 の治療方法に用いる最終投与計画は、薬剤作用に影響する種々の因子（例えば患 者の年齢、症状、体重、性別及び食事、感染の重篤度、投与時間並びに他の臨床 因子）を考慮して主治医により決定される。 本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質産物は更に、神経疾患の治療で単独又は他の 成長因子と組み合わせて使用できる。例えば、截形ＧＤＮＦタンパク質産物は所 定形態の神経疾患の治療に神経成長因子と併用できる。更に、化学組成物を含む 他の因子又は他の分子を截形ＧＤＮＦタンパク質産物と併用してもよい。パーキ ンソン病の治療では、截形ＧＤＮＦタンパク質産物を単独又はレボドパと併用投 与することが考えられ、截形ＧＤＮＦは内因ドーパミンの産生と高濃度のドーパ ミンのニューロン取り込みを強化すると思われる。 上述のように、所定のニューロン細胞ポピュレーション又はある種の傷害もし くは疾病を治療するためには、付加的な神経栄養又はニューロン栄養因子が有用 又は必要であるとも考えられる。截形ＧＤＮＦと併用できる他の因子の非限定的 な例とし ては、マイトジェン（例えばインスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子 、血管作用成長因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、インタ ーフェロン及びソマトスタチン）、神経栄養因子（例えば脳由来神経栄養因子、 ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン− ６、インスリン様成長因子、繊毛神経栄養因子、酸性及び塩基性フィブロブラス ト成長因子、フィブロブラスト成長因子−５、トランスフォーミング成長因子− β、コカインアンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）並びに成熟ＧＤＮＦ）、 及び他の成長因子（例えば上皮成長因子、白血病阻害因子、インターロイキン、 インターフェロン及びコロニー刺激因子）並びにこれらの因子の機能的等価物で ある分子及び材料が挙げられる。 治療によっては截形ＧＤＮＦタンパク質産物の連続投与又は持続送達が有利で あると考えられる。連続投与は注入ポンプを使用するなど機械的手段により達成 できるが、他の連続又は準連続投与方法も実施できると考えられる。例えば、化 学誘導体化によりタンパク質の持続放出形態が得られ、所定の投与計画に基づい て予測可能な量で血流中の連続的存在を可能にする。 従って、截形ＧＤＮＦタンパク質産物はこのような連続投与を実現するように誘 導体化された截形ＧＤＮＦタンパク質を含む。 截形ＧＤＮＦタンパク質細胞治療、例えば截形ＧＤＮＦタンパク質を産生する 細胞の大脳内移植も考えられる。本発明のこの態様では、生物活性形態の截形Ｇ ＤＮＦタンパク質を合成及び分泌することが可能な細胞を患者に移植することが 考えられる。このような截形ＧＤＮＦタンパク質産生細胞は、通常は神経栄養因 子を産生しないが、截形ＧＤＮＦを産生するように改変された細胞や、截形ＧＤ ＮＦタンパク質の発現及び分泌に適したポリヌクレオチドで形質転換することに よりそのＧＤＮＦ産生能を増加した細胞であり得る。外来種のＧＤＮＦの投与に より患者に免疫反応が生じる可能性を最小限にするためには、細胞はヒト起源で あり且つヒト截形ＧＤＮＦタンパク質を産生することが好ましい。 細胞の脳組織浸潤を避けるために移植細胞をカプセル封入してもよい。截形Ｇ ＤＮＦタンパク質産物を放出できるが、患者の免疫系又は周囲組織からの他の有 害因子による細胞の破壊を阻止する生体適合性の半透ポリマーエンクロージャー 又は膜にヒト又は非ヒト動物細胞を封入して患者に移植することができ る。あるいは、截形ＧＤＮＦを産生するようにｅｘ ｖｉｖｏ形質転換した患者 自身の細胞をカプセル封入せずに患者に直接移植してもよい。 生きた細胞の膜封入方法は当業者に周知であり、封入細胞の作製と患者へのそ の移植は実施可能である。例えば、参考資料としてその開示内容を本明細書の一 部とする米国特許第４，８９２，５３８号、５，０１１，４７２号及び５，１０ ６，６２７号参照。生きた細胞を封入するシステムは、特に参考資料としてその 開示内容を本明細書の一部とするＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／ １０４２５にも記載されている。更に、参考資料としてその開示内容を本明細書 の一部とするＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４７０； Ｗｉ ｎｎら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２２−３２９，１９９１； Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５ ，１９９１； Ｔｒｅｓｃｏら，ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３，１９９２も参 照されたい。 截形ＧＤＮＦタンパク質をコードする核酸配列を患者に直接導入する截形ＧＤ ＮＦタンパク質ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療も 考えられる。例えば、アデノ随伴ウイルスベクター等の適当な送達ベクターを介 して又は介さずに核酸構築物の局所注射により、截形ＧＤＮＦタンパク質をコー ドする核酸配列を標的細胞に導入する。別のウイルスベクターの非限定的な例と しては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス及びパピロー マウイルスベクターが挙げられる。所望の核酸構築物もしくは所望の核酸配列を 含む他の適当な送達ベクターの局所注射、リポソームによる導入、直接注射（裸 のＤＮＡ）、レセプターによる導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、又は微粒子ボ ンバードメント（遺伝子銃）により、ｉｎ ｖｉｖｏ物理的導入が可能である。 本明細書に記載する截形ＧＤＮＦタンパク質産物製剤は獣医学及びヒト適用に 使用することができ、「患者」なる用語は限定的に解釈すべきでないことに留意 されたい。獣医学適用の場合では、用量範囲は上記と同一にすべきである。 本発明の截形ＧＤＮＦタンパク質を更に特性決定する手段として、Ｘ−［Ｃｙ ｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙアミノ酸配列内のエピトープ等の截形ＧＤＮＦタンパク 質に結合する抗体を製造することができる。当業者は周知の公表手順を使用し、 本発明の アミノ酸配列によりコードされる種々のタンパク質を特異的に認識してこれと結 合するモノクローナル及びポリクローナル抗体又は組換え抗体を取得することが できる。その後、このような抗体を使用して截形ＧＤＮＦタンパク質を精製及び 特性決定することができる。あるいは、これらの抗体はその抗原であるタンパク 質の治療阻害剤としても使用できる。 本発明の他の側面及び利点は、下記実施例から理解されよう。実施例１は哺乳 動物細胞系における成熟ＧＤＮＦの発現と截形ＧＤＮＦタンパク質の作製に関す る。実施例２は細菌細胞系における成熟ＧＤＮＦの発現に関する。実施例３は細 菌細胞系における種々の截形ＧＤＮＦタンパク質の発現に関する。実施例４はド ーパミン作動性ニューロン神経栄養活性アッセイで成熟ＧＤＮＦタンパク質と截 形ＧＤＮＦタンパク質の生物活性を比較する。 実施例 実施例１ ＣＨＯ細胞における成熟ヒトＧＤＮＦの発現及びＣＨＯ細胞由来截形ＧＤＮＦタ ンパク質の精製 材料 下記材料を使用してジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細 胞（例えばＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，ＵＳＡ ７７（７）：４２１６−４２２０（１９８０）に記載されている ようなＣＨＯｄ−細胞）でヒトＧＤＮＦを発現させる。 ＣＨＯｄ−培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）−高グルコース （Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、５％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＭＥＭ非必須 アミノ酸（１％）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ヒポキサンチン／チミジン（１％） （Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、及びグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（ １％）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むものとした。 選択培地は、ＤＭＥＭ（高グルコース）、５％透析ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏ ｎｅ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸、及びグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイ シンを含むものとした。 ２×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）は、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１２ｍＭデキストロース、及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むものとした。 Ｔｒｉｓ緩衝食塩水＋Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．５、 及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むものとした。 方法 トランスフェクション及び選択 ＣＨＯｄ−細胞（２０継代）をＣＨＯｄ−増殖培地中細胞８×１０⁵個／皿の 密度で６０ｍｍ組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）に接種した。翌日、トランスフェク ションから約３時間前に細胞上の培地を新鮮な培地に交換した。 周知技術を使用して適当なＧＤＮＦ ｃＤＮＡを含むプラスミド構築物を調製 した。例えば、参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とする本願出願人 と同一名義の１９９０年３月２９日付け同時係属米国特許出願第５０１，９０４ 号（１９９０年５月１８日付けヨーロッパ特許出願第９０３０５４３３号、公開 ＥＰ第３９８７５３号及びＷＯ９０／１４３６３（１９９０）も参照）に記載の 方法に実質的に従ってプラスミド構築物ｐＤＳＲα２を調製した。ベクターの構 造編成を示すプラスミド地図の例を図２に示す。図１、３及び４に示す配列等の 成熟ＧＤＮＦタンパク質をコードする種々の核酸配列を使用してもよいことが当 業者に理解されよう。 ｐｃＤＮＡ３に基づく発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から制限酵素消化により、ヒトＧＤＮＦコーディン グ配列とコンセンサスＫｏｚａｋ配列ＣＣＡＣＣ（ＡＴＧ）を含むＨｉｎｄＩＩ Ｉ−Ｘｂａｌ ＤＮＡフラグメントを回収した。ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａｌで切 断したｐＤＳＲα２にＤＮＡフラグメントを直接クローニングした。得られたプ ラスミドをｐＳＷ５と命名した。トランスフェクションの前にｐＳＷ５のプラス ミドＤＮＡをＰｕｖＩ部位で直鎖化した。 ｐＤＳＲα２（図２）はプラスミドｐＣＤ（ＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇ，Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２８０−２８９，１９８３）の誘導体であり、（ １）ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをウシ濾胞刺激ホルモンのα−サブユニッ トであるα−ｂＦＳＨからのシグナルで置換し（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：６８７３−６８８２，１９８３）、（ｉｉ） 形質転換細胞の選択及び増殖を可能にするように発現カセットの下流にマウスジ ヒドロ葉酸レダクターゼミニ遺伝子（Ｇａｓｓｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６５２２−６５２６，１９８２）を挿入し、（ｉｉｉ） ヒトＴ細胞Ｉ型白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）の長い末端反 復配列（ＬＴＲ）の「Ｒエレメント」と「Ｕ５」配列の一部を含む２６７ｂｐフ ラグメントを従来の記載（Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８： ４６６−４７２，１９８８）通りにＳＶ４０プロモーターとスプライスシグナル の間にクローニング及び挿入したという主に３点を改変した。 最終濃度３．０μｇ／皿のＧＤＮＦ−プラスミドＤＮＡ、７．０μｇ／皿のマ ウス腎ゲノムキャリヤーＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２５μｌ／皿の２．５Ｍ ＣａＣｌ₂及び最終容量２５０μｌ／皿までの滅菌蒸留水を含むＤＮＡ溶液を 調製した。ｐＤＳＲα２ベクターＤＮＡ又はキャリヤーＤＮＡ単独を含むＤＮＡ 溶液も夫々正負対照として同様に調製した。溶液に気泡を通しながら、ＤＮＡ溶 液を等容量の２×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水に滴下した。ＤＮＡ／ＨＢＳ溶液を室温 で３０分間インキュベートした。 ＣＨＯｄ−細胞培養物から培地を除去し、ＤＮＡ溶液５００μｌ／皿を加えた 。皿を室温で３０分間インキュベートした後、ＣＨＯｄ−培地（５．０ｍｌ）を 各皿に加えた。次に、皿を３７℃で一晩インキュベートした。 翌日に培地を新鮮なＣＨＯｄ−培地に交換した。その翌日に 細胞がコンフルエントに達した時点で培養物をトリプシン処理し、１×６０ｍｍ 皿対８×１００ｍｍ皿の比で１００ｍｍ皿（Ｆａｌｃｏｎ）に再プレーティング した。細胞を選択培地で再プレーティングした。２〜３日おきに培養物に新鮮な 培地を再補充した。 １５日後に、トランスフェクトした細胞のコロニーをガラスクローニングシリ ンダーで単離し、トリプシン処理し、２４穴皿（Ｆａｌｃｏｎ）に再プレーティ ングした。ＧＤＮＦ／ｐＳＷ５をトランスフェクトした細胞から合計４０個のコ ロニーを単離した。皿に残っている細胞をトリプシン処理し、プールし、２個の １００ｍｍ皿に再プレーティングした（各ＤＮＡ構築物毎に１個のプール）。 トランスフェクトした細胞のスクリーニング ２４穴及びプール培養物をコンフルエントまで増殖させ、その時点で増殖培地 を除去し、無血清培地（４００μｌ／ウェル即ち４ｍｌ／皿）に交換した。細胞 を４８時間インキュベートし、条件付け培地を回収した。条件付け培地サンプル のＧＤＮＦタンパク質発現をウェスタンブロットにより分析した。条件付け培地 のアリコート（２０μｌ又は４０μｌ）を電気泳動サン プル緩衝液（β−メルカプトエタノールを含むか又は含まない）で希釈した。β −メルカプトエタノールを含むサンプルを３分間煮沸した（還元条件）。還元及 び非還元サンプルの両者を１６％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）で試験 した。ゲルをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓ ｃｈｕｅｌｌ ＢＡ−８３、０．２μ）にエレクトロブロットした。ブロットを ＴＢＳＴで濯いだ後、ＴＢＳＴ中５％ドライミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）のブ ロッキング溶液中で室温で３０分間インキュベートした。次にブロットをＧＤＮ Ｆ抗血清（大腸菌由来ＧＤＮＦに対するウサギポリクローナル抗血清、５％ドラ イミルク／ＴＢＳＴ中１：１０００）で室温で１時間処理した。次にブロットを ＴＢＳＴで濯ぎ、１×１０分間及び２×５分間１％ドライミルク／ＴＢＳＴで洗 浄した。次に抗ウサギＩｇ−ウマ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（１ ％ドライミルク／ＴＢＳＴ中１：１５，０００）で２０分間処理した。ブロット を濯ぎ、ＴＢＳＴで１×２０分間及び２×１０分間洗浄した後、ＥＣＬ試薬（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）で１分間処理し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈ ａｍ）を感光した。 下記プロセスは、ＣＨＯで発現させたＧＤＮＦとＣＨＯに由来する切断ＧＤＮ Ｆホモダイマーを条件付け培地１リットルから精製するプロセスである。ＣＨＯ 培地には有意なプロテアーゼ作用があり、残基３１で鎖を切断するので、この手 順では精製中にプロテアーゼ阻害剤を使用してもよい。ステップ１．ビーズクロマトグラフィー： １／５０容量の１Ｍ ＭＥＳ，ｐＨ６．０を加えることにより、無血清条件付 け培地を２０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホネート（ＭＥＳ），ｐ Ｈ６．０にした。２０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ６．０で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２５ｍｌを加え、４℃ で１時間撹拌した。樹脂を沈殿させて条件付け培地をデカントすることにより樹 脂を集めた。デカントした培地を焼結ディスクフィルターで濾過し、未沈殿樹脂 を回収した。沈殿した樹脂と濾過により回収した樹脂を再懸濁し、直径２．５ｃ ｍのカラムに注入し、３カラム容量の０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＭＥＳ ，ｐＨ６．０（Ａ緩衝液）で洗浄した。２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら ０．２カラム容量／分の流速でＡ緩衝液から１．０Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｍ ＥＳ，ｐＨ ６．０（Ｂ緩衝液）への３００ｎｌのグラジエントでタンパク質を溶離した。１ ．１カラム容量を含むフラクションを集めた。フラクション中のＧＤＮＦの存在 をウェスタンブロット分析により検出した。ＧＤＮＦを含むフラクションを更に 精製するためにプールした。ＧＤＮＦは０．３〜０．６Ｍ ＮａＣｌで溶出した 。ステップ２．ＨＰＬＣ Ｃ４クロマトグラフィー： ステップ１からのプールを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と し、０．４５μフィルターで減圧濾過し、１０％アセトニトリル、０．１％ＴＦ Ａ水溶液（Ａ緩衝液）で条件付けしたＶｙｄａｃ Ｃ４カラム（０．４６×２５ ｃｍ）にアプライした。２８０ｎｍの吸光度を測定しながらＡ緩衝液から９０％ アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ｂ緩衝液）への２％／分の直線勾配で ５０分間かけてタンパク質を溶離した。１ｍｌフラクションを集め、ＧＤＮＦの 存在をウェスタンブロット分析により検出した。ＧＤＮＦは４５％〜５５％アセ トニトリルで溶出した。フラクションを減圧乾涸した。ステップ３．高性能Ｓクロマトグラフィー： ステップ２からのＧＤＮＦを含むフラクションを１ｍｌの ０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０に再可溶化し、０．７ ５×７．５ｃｍ ＴＳＫ−Ｇｅｌ ５ＷＰ高性能Ｓカラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ ）にアプライした。０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０（ Ａ緩衝液）から１．０Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０（Ｂ緩衝 液）への０．４％／分の直線勾配で流速１ｍｌ／分で５０分間かけて溶離した。 １分毎にフラクションを集め、２８０ｎｍの吸光度を測定した。３５％Ｂ緩衝液 で勾配を１０分間かけて６．５％／分まで変化させた。フラクションのウェスタ ンブロット分析は、４個の主ＧＤＮＦ成分を示した。これらの成分のうちの３個 は０．４％／分勾配中に溶出し、４番目の成分は６．５％／分勾配中に溶出した 。同様の成分から適当なプールを調製し、配列決定した。配列決定分析の結果、 約２９〜３６ｋＤプールは［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質で あることが確認された。約３８〜４０ｋＤの成分は［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截 形ＧＤＮＦ／成熟ＧＤＮＦヘテロダイマーであることが確認された。最後に、勾 配の最後の部分で単離された約４１〜４４ｋＤの成分は成熟ＧＤＮＦホモダイマ ーであることが配列決定により確認された。 実施例２ 大腸菌における成熟ヒトＧＤＮＦの産生 成熟ヒトＧＤＮＦの細菌発現は、Ｌｉｎらの方法（参考資料としてその開示内 容を本明細書の一部とする１９９４年５月２３日付け米国特許出願第０８／１８ ２，１８３号とその親出願、１９９２年９月１７日付けＰＣＴ／ＵＳ９２／０７ ８８８（ＷＯ９３／０６１１６）及びヨーロッパ特許出願第９２９２１０２２． ７号（公開ＥＰ第６１０２５４号））により実施できる。本発明の記載に基づき 、大腸菌及び他の細菌での適切な発現に種々の材料及び方法を容易に使用又は応 用できることが当業者に理解されよう。例えば、図１、３及び４に示すような代 替ポリヌクレオチドを発現プロセスで使用してもよい。発現された成熟ＧＤＮＦの再生及び精製 形質転換細胞を（特に指定しない限り）５℃で次のように処理した。最終容量 ２００ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５に細胞ペ ースト（３０ｇ）を懸濁し、１５％（ｗ／ｖ）の最終細胞スラリーを得た。Ｂｉ ｏｓｐｅｃハンドヘルド低剪断ホモジナイザーを使用して細胞を十分に分散させ た。スラリーを１４，５００ｐｓｉのマイクロ流動化装 置に２回通し、細胞を破壊して封入体を放出させた。得られたホモジネートを次 に１６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上記と同様にＢｉｏｓｐｅｃホモ ジナイザーを使用し、遠心分離により得られた封入体のペレットを最終容量２４ ０ｍｌまでの冷水に再懸濁して洗浄し、スラリーを形成した。このスラリーのサ ンプルをＧＤＮＦ発現レベルのＨＰＬＣ分析用に取り分けた。残りのスラリーを １６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を捨て、遠心びんに少量の冷水 を加えて静かに渦形成し、封入体ペレットの上にまばらに形成された膜層を除去 した。Ｂｉｏｓｐｅｃホモジナイザーで十分な容量の冷水を使用してＧＤＮＦ２ ｍｇ／ｍｌの濃度にペレットを再懸濁した。次に最終封入体懸濁液（２５ｍｌ） と１８０ｍＭ システインＨＣｌ及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ８．７ を含む８ＭグアニジンＨＣｌ（２５ｍｌ）を混合することにより、封入体を可溶 化した。可溶化混合物を２５℃で６０〜９０分間撹拌した後、２０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ ＨＣｌ，ｐＨ８．７５と０．２ＭグアニジンＨＣｌを含む２Ｍ尿素（４５０ ｍｌ，５℃）に混合しながら注入した。再生混合物を５℃で７２時間ゆっくりと 撹拌した。 再生したＧＤＮＦを次のように部分精製した。５℃の２０ｍＭ酢酸ナトリウム 緩衝液（２５０ｍｌ，ｐＨ５）を迅速に撹拌しながら再生混合物に加え、ｐＨを 氷酢酸で５に調整した。生じた沈殿を５℃で１３，６００×ｇで４５分間遠心分 離して除去した。この遠心分離からの上清を次の精製段階のロード溶液として使 用し、ＳＰ−大ビーズ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるカチオン交換クロマト グラフィーにかけた。カラムは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を平衡、濯 ぎ及び溶離緩衝系として使用して５℃で操作した。樹脂ベッド（５ｍｌ）を５カ ラム容量（ＣＶ）の０．２Ｎ ＮａＯＨで処理した後、酢酸緩衝液（５ＣＶ）で 平衡化した。ロード溶液（１９０ｍｌ）を０．５ＣＶ／分でカラムにアプライし た後、同一流速で１０ＣＶの酢酸緩衝液で濯いだ。次に０．１ＣＶ／分の流速で 酢酸緩衝液中ＮａＣｌ０．３Ｍから０．９Ｍの２０ＣＶ直線勾配でＧＤＮＦを樹 脂から溶離した。カラム溶出液の２８０ｎｍの吸光度をモニターし、フラクショ ンとして集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイした。１０％ピーク高さのＧＤ ＮＦピークの前縁から１０％ピーク高さのピークの後縁までのＧＤＮＦを含むフ ラクションをプールした。このプール中のタンパク質は完全 にＧＤＮＦであり、使用した産生株に応じて改変ＧＤＮＦ形として３２％〜１２ ％の汚染を含んでいた。次にプールをＰＢＳ又は他の組成の緩衝液で透析し、場 合により限外濾過により２５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。この手順により精製した 野生型及び類似形態のＧＤＮＦを逆相ＨＰＬＣ、カチオン交換ＨＰＬＣ、質量ス ペクトル分析及びエンドトキシンレベルにより特性決定し、調製物の純度を対応 する産生株と比較した。 実施例３ 大腸菌における截形ＧＤＮＦの組換え製造 Ｌｉｎらに記載されている方法（上記１９９４年５月２３日付け米国特許出願 第０８／１８２，１８３号）に実質的に従って典型的なＧＤＮＦタンパク質を製 造した。上述したような代替細菌発現材料及び方法を使用してもよい。夫々図５ 、６及び７に示すような［Ｐｒｏ²³−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］及 び［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質を大腸菌で発現させた。こ れらの典型的截形ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは図５、６ 及び７に示すように構築したが、図１、３及び４に示すような対応するポリヌク レオチドを使用してもよい。これらのポリヌクレオチドは、参考資料としてその 開示内容を本明細書の一部とするＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉ ｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ，Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ ｓｓ，ＮＹ，１９８９（第６章、Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ）に記載されているような標準ＰＣＲ手順により構築した。 実施例４ ドーパミン作動性ニューロン神経栄養活性のバイオアッセイ 実施例３の大腸菌で発現させた［Ｐｒｏ²³−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｒｇ³²−Ｉｌ ｅ¹³⁴］、［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ｌｙｓ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦ タンパク質と実施例１のＣＨＯ由来［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタン パク質が黒質ドーパミン作動性ニューロンによるドーパミン取り込みを促進する 能力を定量的に評価した。 材料 截形ＧＤＮＦタンパク質の存在下におけるドーパミン作動性ニューロンの生存 を評価するアッセイでは、次の材料を使用する。 細胞培地 高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、カタログ番号＃１１９ ６５−０９２）、ハムＦ１２培地（Ｆ１２、＃１１７６５−０２１）、重炭酸ナ トリウムを含まないライボビッツＬ１５培地（＃４１３００−０３９）、Ｂ２７ 培地補充剤（＃１７５０４−０１０）、ペニシリン／ストレプトマイシン（＃１ ５０７０−０１４）、Ｌ−グルタミン（＃２５０３０−０１６）、ダルベッコの リン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、＃１４１９０−０５２）、カルシウム及びマグ ネシウム塩を含むハンク平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、＃２４０２０−０２６）、Ｎ −２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ 、＃１５６３０−０１５）、マウスラミニン（＃２３０１７−０１５）及びウシ 血清アルブミンフラクションＶ（＃１１０−１８−０１７）は全てＧＩＢＣＯ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手した。熱不活化ウマ血清はＨｙＣｌｏ ｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈから入手した。コンアルブミン（Ｃ−７７８６）、 臭化水素酸ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｐ−３６５５）、ウシインスリン（Ｉ−５５ ００）、ヒトトランスフェリン（Ｔ−２２５２）、プトレッシン（Ｐ−６０２４ ）、 プロゲステロン（Ｐ−６１４９）、亜セレン酸ナトリウム（Ｓ−９１３３）、メ トリザミド（Ｎ−３３８３）は全てＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ ｎｙ，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手した。パパイン、デオキシリボヌ クレアーゼＩ（ＤＮアーゼ）及びオボアルブミン（パパイン解離系）はＷｏｒｔ ｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪから入手 した。 Ｆａｌｃｏｎ滅菌９６穴マイクロプレート（＃３０７２）、組織培養プラスチ ック容器及びポリプロピレン遠心分離管はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡから入手した。Ｎｕｎｃ Ｌａｂ−Ｔｅｋ組織培養チャンバ ーカバーガラス（＃１３６４３９）はＢａｘｔｅｒ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから入 手し、２０μｍ（＃４６０）ナイロンメッシュはＴｅｔｋｏ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ ，ＮＹから入手し、４”解剖鉗子と４”鉗子鋏はＲｏｂｏｚ Ｓｕｒｇｉｃａｌ ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣから入手した。 抗体及び関連試薬 ポリクローナルウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（ＴＥ１０１）はＥｕ ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈ，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ Ｐａｒｋ，ＮＪから入手し、ポリクローナルウサギ抗ニューロン特異的エノラー ゼ抗体（ＮＳＥ，ＡＢ９５１）はＣｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡか ら入手し、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びペルオキシダーゼ結合アビジン／ ビオチン複合体（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ；ＶｅｃｔａｓｔａｉｎキットＰＫ−６１ ００）はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃ Ａから入手した。３’，３’−ジアミノベンジジンはＣａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから入手した。ＰＢＳ中のＳ ｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（＃３７５１５）はＰｉｅｒｃｅ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手した。Ｔｒｉ ｔｏｎ Ｘ−１００（Ｘ−１００）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｎ６５０７） 及び過酸化水素（３０％ｖ／ｖ；Ｈ１００９）はＳｉｇｍａから入手した。ＧＢ Ｒ−１２９０９ドーパミン取り込み阻害剤（Ｄ−０５２）はＲＢＩ，Ｎａｔｉｃ ｋ，ＭＡから入手した。３Ｈ−ドーパミン（トリチウム化ドーパミン、ＮＥ−１ ３１；２１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏ ｓｔｏｎ，ＭＡから入手した。Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘシ ンチレーションカクテルはＷａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランドから入手し た。透明ＶｉｅｗＰｌａｔｅ−９６マイクロプレート（＃６００５１８２）はＰ ａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄ ｅｎ，ＣＴから入手した。他の全試薬は特に指定しない限り、Ｓｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。 培地の調製 ＤＭＥＭとＦ１２培地の１：１混合物として基本培地を調製し、５０倍濃縮ス トック溶液としてＢ２７培地補充剤を補充した。最終濃度約２ｍＭのＬ−グルタ ミン、約１００ＩＵ／ｌのペニシリン及び約１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシ ンを加えた。熱不活化ウマ血清を最終濃度約１５％まで加えた。混合後、ｐＨを 約７．３に調整し、培地を４℃に維持した。培地は、実験内変動を最小限にする ように使用直前に新たに調製した。タンパク質吸着を最小限にするように常にプ ラスチックピペット及び容器を使用した。 培養基質 基質ニューロンの最適結合と神経突起生長を助長するために、マイクロタイタ ープレート表面（培養基質）を次のようにポリ −Ｌ−オルニチンとラミニンで順次被覆して修飾した。プレート表面を０．１Ｍ 硼酸（ｐＨ８．４）中０．１ｍｇ／ｍｌ滅菌ポリ−Ｌ−オルニチン溶液で室温で 少なくとも１時間完全に被覆した後、Ｓｕｐｅｒ−Ｑ水で滅菌洗浄した。次に水 洗物を吸引し、ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌマウスラミニン溶液を加え、３７℃で ２時間インキュベートした。これらの手順は、結果の再現性を確保するためにプ レートの使用直前に実施した。 胎児ラット黒質培養物の調製 胎児ラット脳を黒質ドーパミン作動性ニューロン源として使用した。胎生１５ 日の予定妊娠Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。各実験毎に最大 ３６匹の胎児（約３リットル）を処理した。妊娠したラットをＣＯ₂に暴露して 殺し、その腹腔を解剖鋏で切り開き、子宮から胎児を取り出した。次に胎児の脳 を切開し、血液と髄膜を除去し、確定解剖目標（ＡｌｔｍａｎとＢａｙｅｒ，Ａ ｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９５）を使用し て黒質を含む腹側被蓋領域を解剖した。組織を氷冷Ｄ−ＰＢＳに集め、解離培地 （ＨＢＳＳ中１２０単位パパイン及び２０００単位ＤＮ アーゼ）１０ｍｌに移した後、約２００ｒｐｍに設定した回転プラットフォーム 震盪機で約３７℃で４５分間インキュベートした。次に火仕上げパスツールピペ ットで細胞を潰して分散させ、２０μｍ Ｎｉｔｅｘメッシュで篩別して未解離 組織を捨て、ＩＥＣ臨床遠心機を使用して２００×ｇで５分間遠心分離した。得 られた細胞ペレットを、オボアルブミンと約５００単位のＤＮアーゼを含むＨＢ ＳＳに再懸濁し、４％オボアルブミン溶液（ＨＢＳＳ中）に重層し、５００×ｇ で約１０分間遠心分離した。最終ペレットを完全培地（上記参照）に再懸濁し、 約２８，０００細胞／ｍｌに調整し、ポリオルニチンとラミニンで予め被覆して おいた９６穴マイクロプレートの６ｍｍウェルに分注（９０μｌ）した。すぐに 細胞の結合が生じ、プレーティング効率は約７５％であった。 ドーパミン作動性ニューロンの免疫組織化学 Ｌｏｕｉｓら（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２６２： １２７４−１２８３，１９９２； Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：６８９−６９２， １９９３）により記載されている間接イムノペルオキシダーゼ法を下記のように 若干改変して使用し、黒質の培養物中のドーパミン作動性ニューロンを特性決定 した。培養物をＤ−ＰＢＳ，ｐＨ７．４中４％パラホルムアルデヒドで室温で約 ３０分間固定した後、Ｄ−ＰＢＳ（６ｍｍウェル当たり２００μｌ）で３回洗浄 した。次に、固定した培養物を１％ＮＰ−４０を含むＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｂｌｏ ｃｋブロッキング緩衝液中でインキュベートし、抗体の浸透を増加した。次に、 一次ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を同一緩衝液に約１：２０００に希 釈して加え、回転震盪機で３７℃で１時間インキュベートした。Ｄ−ＰＢＳで３ 回洗浄後、ヤギ抗ウサギビオチン化ＩｇＧを約１：５００に希釈して使用して結 合抗体を検出し、これらの二次抗体を細胞と共に３７℃で約１時間インキュベー トした。次に細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体を１：５００に希釈した アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体で検出し、細胞を３７℃で約４５ 分間インキュベートした。Ｄ−ＰＢＳで更に３回洗浄後、０．０４％３’，３’ −ジアミノベンジジン−（ＨＣｌ）４、０．０６％ＮｉＣｌ₂及び０．０２％過 酸化水素を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４の溶液中で培養物を５ 〜２０分間反応させた。 ニューロン生存の測定 黒質培養物を固定し、前記のように免疫染色処理した後、 ２００倍明視野顕微鏡で試験した。チロシンヒドロキシラーゼで染色するニュー ロンの数を９６穴マイクロプレートの６ｍｍウェル全体で数えた。生存可能なニ ューロンは定形細胞体をもち、主軸索様突起と数個の樹状突起があるとみなした 。不整形の空胞のある核周囲部細胞体や分裂した神経突起をもつなど変性の徴候 を示すニューロンは計数から除いた（但し、変性ニューロンの大部分は培養基質 から分離していた）。ドーパミン作動性ニューロン細胞数は、ＴＨ陽性ニューロ ン／６ｍｍウェル又は対照ドーパミン作動性ニューロン密度に対する倍数として 表した。 ドーパミン取り込みの測定 透明ＶｉｅｗＰｌａｔｅ−９６マイクロプレートで調製しておいた１５日齢胎 児ラット黒質ニューロンの培養物でドーパミン取り込みを測定した。約１２０ｍ Ｍ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．２ｍＭ Ｍ ｇＳＯ₄、３２ｍＭ ＮａＨＰＯ₄、１．３ｍＭ ＥＤＴＡ及び５．６ｍＭ Ｄ− グルコースを含む改変クレブス−リンゲル溶液、ｐＨ７．４から構成される予熱 取り込み緩衝液（約１００μｌ）で培養物を洗浄した。取り込み緩衝液には、ド ーパミンの酸化を 阻止するために１ｍＭアスコルビン酸と５０μＭパルジリンも加えた。次に細胞 を取り込み緩衝液中で３７℃で約１０分間プレインキュベートした。次に、トリ チウム化したドーパミン（³Ｈ−ＤＡ、２１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を取り込み緩衝液 ７５μｌ中約５０ｎＭの濃度で黒質培養物に加え、培養物を３７℃で約６０分間 インキュベートした。ドーパミン取り込み阻害剤ＧＢＲ−１２９０９（１μＭ） を含む取り込み緩衝液と共に培養物をインキュベートすることにより、非特異的 ドーパミン取り込みを測定した。非特異的取り込みは総取り込みの約１％未満で あった。インキュベーション培地を吸引して取り込みアッセイを停止した後、氷 冷取り込み緩衝液（約１２０μｌ）で３回迅速に洗浄した。次に、Ｏｐｔｉｐｈ ａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチレーションカクテル（２００μｌ）を加えて細 胞を溶解させ、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏｂｅｔａＰｌｕｓ ９６穴マイクロプ レートカウンターを使用してシンチレーションスペクトル分析により放射能を測 定した（即ち培養物中に保持されたトリチウムのシンチレーション計数によりド ーパミン取り込みを分析する）。結果をｄｐｍ／６ｍｍウェル又は対照培養物に 対する倍数として表す。 アッセイドーパミン作動性ニューロン生存及び形態学的発生 ドーパミン作動性ニューロンを多く含む１５日齢胎児（Ｅ１５）ラット黒質の 培養物を使用して、截形ＧＤＮＦタンパク質がドーパミン作動性ニューロンの生 存に及ぼす効果を立証した。ポリオルニチンとラミニンで被覆した９６穴マイク ロプレートで種々の濃度（約１ｐｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌ）の下記タンパク 質、即ち大腸菌で発現させた成熟ｈＧＤＮＦ、大腸菌で発現させた［Ｐｒｏ²³− Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ｌｙ ｓ³⁷−Ｉｌe¹³⁴］截形Ｇｌｙタンパク質、ＣＨＯ細胞で発現させた成熟ｈＧＤＮ Ｆ、並びにＣＨＯ細胞由来［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質の 存在下又は単独で培養物を６日間まで増殖させた。培地は１５％熱不活化ウマ血 清（Ｅ１５培養物）又は２．５％熱不活化ウマ血清、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥ Ｓ、インスリン及びトランスフェリン（Ｐ６培養物）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１ ２から構成した。ドーパミン生合成の律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ （ＴＨ）の免疫染色をドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして使用した。 菱脳中のノルアドレナ リン作動性ニューロンもＴＨに陽性染色するので、中脳の脳質に限定した領域を 解剖し、ノルアドレナリン作動性細胞体を含む尾側の領域を避けるように十分注 意した。６日後に、Ｅ１５培養物は主に（上記）ニューロン特異的エノラーゼ免 疫染色により確認される約７０％のニューロンと、３０％の（平坦で暗い外観を もつ）非ニューロン細胞から構成され、ドーパミン作動性ニューロンはニューロ ンポピュレーションの約１０〜１５％であった。 ６日後に培養物をパラホルムアルデヒドで固定し、これらの培養物中のドーパ ミン作動性ニューロンを識別するマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼで免 疫染色した。６ｍｍウェル中に存在する全チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニュー ロンを明視野顕微鏡で計数した。各実験条件毎に３〜６個の異なるウェルを分析 した。結果を対照培養物中に存在するチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロン の数の百分率として表した。 ＣＨＯ細胞で発現させたＧＤＮＦ又は大腸菌で発現させたＧＤＮＦの２種のＧ ＤＮＦ１．０ｎｇ／ｍｌで処理したＥ１５黒質の培養物は未処理対照培養物より も夫々約３８％及び２７％多くのＴＨ免疫反応性ニューロンを含んでおり、どち ら のＧＤＮＦ種もドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することを示した。１ ．０ｎｇ／ｍｌの截形ＧＤＮＦタンパク質で処理したＥ１５黒質の培養物は、ｉ ｎ ｖｉｔｒｏで６日後に培養物中のＴＨ陽性ニューロン数に同様の増加を示し 、ＣＨＯ細胞由来［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質では４２％ 、大腸菌で発現させた［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴］截 形ＧＤＮＦタンパク質では夫々２６％及び１７％増加した。 対照培養物と成熟及び截形ＧＤＮＦタンパク質で処理した培養物を比較すると 更に、全ＧＤＮＦタンパク質がドーパミン作動性ニューロンの形態学的分化に顕 著な効果をもつことも判明した。［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ｇｌｙ³³−Ｉ ｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質の効果は夫々の対応する成熟ＧＤＮＦタンパ ク質と同一であった。全ＧＤＮＦ処理培養物中のＴＨ免疫反応性ニューロンは、 対照培養物中のＴＨ陽性ニューロンに比較して有意に複雑で広範囲の神経突起分 枝をもち、神経突起分枝度が高く、細胞体の総寸法が大きかった。ドーパミン取り込み ドーパミン取り込みは高親和性ドーパミン再取り込みトラン スポーター部位の数及び活性の尺度であり、ドーパミン作動性ニューロンの機能 的分化を表す。成熟ＧＤＮＦ又は截形ＧＤＮＦタンパク質の存在下又は不在下で ｉｎ ｖｉｔｒｏで６日後にＥ１５ラット黒質の培養物でドーパミン取り込みを 測定した。これらの培養物においてドーパミン取り込みはドーパミン作動性ニュ ーロンの特徴的薬理プロフィルをもち、即ちドーパミン作動性ニューロンに特異 的なドーパミン輸送阻害剤（ＩＤ５０＝２０ｎＭ）である１．０μＭ ＧＢＲ− １２９０９によりほぼ完全にブロックされた（＞９８％）。従って、ノルエピネ フリン輸送体を介してドーパミンを取り込むことができるが、ＧＢＲ−１２９０ ９阻害に非感受性の汚染性ノルアドレナリン作動性ニューロンの存在はドーパミ ン取り込み測定値に影響していないと考えられる。ＣＨＯ細胞で発現させた成熟 ＧＤＮＦとＣＨＯ由来［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］截形ＧＤＮＦタンパク質の効果 は同一であり、約６５％増加し、ＥＤ５０は約２０ｐｇ／ｍｌであった。図５に 示すような大腸菌で発現させた［Ｐｒｏ²³−Ｌｙｓ³⁷ΔＡｓｎ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴］ 截形Ｄタンパク質は６５％の増加を示し、ＥＤ５０は約４０μｇ／ｍｌであった 。大腸菌で発現させた成熟タンパク質と大腸菌で発現させ た［Ａｒｇ³²−Ｉｌｅ¹³⁴］、［Ｇｌｙ³³−Ｉｌｅ¹³⁴］及び［Ｌｙｓ³⁷−Ｉｌｅ¹³⁴ ］截形ＧＤＮＦタンパク質のドーパミン取り込み効果は同一であり、約５０ ％増加し、ＥＤ５０は約５０ｐｇ／ｍｌであった。 以上の結果は、截形ＧＤＮＦタンパク質が黒質ドーパミン作動性ニューロンの 強力な生存促進及び分化誘導因子として作用することを示す。従って、截形ＧＤ ＮＦタンパク質は情動の鋭さの低下、随意及び不随意筋運動の減退、筋硬直及び 振戦を特徴とする神経障害であるパーキンソン病の治療に特に有利であると考え られる。このような症状は黒質内のドーパミン産生ニューロンの進行性変性に起 因すると考えられる。これらのニューロン（「ドーパミン作動性ニューロン」） の変性は線条体と呼ばれる脳の隣接領域でドーパミンの低下をもたらす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 14/47 14/52 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/36 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸配列： Ｘ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙ （式中、［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］は図１（配列番号２）に示すＣｙｓ⁴¹〜Ｃｙ ｓ¹³³のアミノ酸配列を表し、ＹはＣｙｓ¹³³のカルボキシ末端基又はＩｌｅ¹³⁴ のカルボキシ末端アミノ酸残基を表し、ＸはＣｙｓ⁴¹のメチオニン化もしくは非 メチオニン化アミン基又は以下の群： から選択されるアミノ末端アミノ酸残基を表す）をもつ截形グリア細胞系由来神 経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質産物並びにその付加、置換及び内部欠失変異 体及び誘導体。 ２．Ｘ＝ＲＱＡＡＡ ＡＮＰＥＮＳＲＧＫＧ ＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧ（配列番号 ２４）である請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物又はその変異体。 ３．Ｘ＝ＮＰＥＮＳＲＧＫＧ ＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧ（配列番号１８）である請 求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物又はその変異体。 ４．Ｘ＝ＰＥＮＳＲＧＫＧ ＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧ（配列番号１７）である請求 項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物又はその変異体。 ５．Ｘ＝ＳＲＧＫＧ ＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧ（配列番号１４）である請求項１に 記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物又はその変異体。 ６．Ｘ＝ＲＧＱＲＧＫＮＲＧ（配列番号８）である請求項１に記載の截形ＧＤＮ Ｆタンパク質産物又はその変異体。 ７．Ｘ＝ＧＱＲＧＫＮＲＧ（配列番号７）である請求項１に記載の截形ＧＤＮＦ タンパク質産物又はその変異体。 ８．Ｘ＝ＫＮＲＧ（配列番号３）である請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク 質産物又はその変異体。 ９．Ｘ＝ＮＲＧである請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物又はその変 異体。 １０．前記アミノ酸配列がグリコシル化されている請求項１から９のいずれか一 項に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物。 １１．前記アミノ酸配列がグリコシル化されていない請求項１から９のいずれか 一項に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物。 １２．前記誘導体が水溶性ポリマーに結合したＸ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］− Ｙアミノ酸配列である請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物。 １３．請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物をコードするポリヌクレオ チド。 １４．図１に示す配列の一部を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。 １５．図３に示す配列の一部を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。 １６．図４に示す配列の一部を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。 １７．図５に示す配列を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。 １８．図６に示す配列を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。 １９．図７に示す配列を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。 ２０．発現制御配列に作動的に連結した請求項１３に記載のポリヌクレオチドを 含むベクター。 ２１．請求項１３に記載のポリヌクレオチドで形質転換又はトランスフェクトさ れた原核又は真核宿主細胞。 ２２．截形ＧＤＮＦタンパク質の製造方法であって、請求項２１に記載の宿主細 胞を適切な栄養培地で培養し、場合により、前記細胞又は前記栄養培地から前記 截形ＧＤＮＦを単離することを特徴とする前記方法。 ２３．前記宿主細胞が大腸菌である請求項２２に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質 の製造方法。 ２４．前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項２２に記載 の截形ＧＤＮＦタンパク質の製造方法。 ２５．截形グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質の製造方法で あって、 （ａ）請求項２０に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクトされた原核 又は真核宿主細胞を培養する段階と、 （ｂ）前記宿主細胞が截形ＧＤＮＦタンパク質を発現できるような条件下に前記 宿主細胞を維持する段階と、 （ｃ）場合により、前記宿主細胞により発現された截形ＧＤＮＦ タンパク質を単離する段階を含む前記方法。 ２６．請求項１３に記載の外因ポリヌクレオチドを含む原核又は真核宿主細胞の 組換え発現産物である截形ＧＤＮＦタンパク質。 ２７．医薬的に許容可能なビヒクルと共に請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパ ク質産物を含む医薬組成物。 ２８．医薬的に許容可能なビヒクルと共に請求項２２に記載の方法により製造さ れた截形ＧＤＮＦタンパク質を含む医薬組成物。 ２９．医薬的に許容可能なビヒクルと共に請求項２５に記載の方法により製造さ れた截形ＧＤＮＦタンパク質を含む医薬組成物。 ３０．請求項２７に記載の医薬組成物を患者に投与することを特徴とするパーキ ンソン病の治療方法。 ３１．請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列を患者に投与し、前記截形ＧＤ ＮＦタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ産生させることを特徴とするパーキンソン病の 治療方法。 ３２．請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列で形質転換された細胞を患者に 移植し、前記截形ＧＤＮＦタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ産生させることを特徴とするパーキンソン病の治療方法。 ３３．成熟ＧＤＮＦタンパク質と１種以上の截形ＧＤＮＦタンパク質を含むグリ ア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）組成物であって、前記成熟ＧＤＮＦタン パク質が約４４ｋＤａの分子量をもち、前記截形ＧＤＮＦタンパク質が約２９〜 ４０ｋＤａの分子量をもつ前記ＧＤＮＦ組成物。 ３４．少なくとも２種の截形ＧＤＮＦタンパク質を含み、第１種が約３６ｋＤａ の分子量をもち、第２種が約４０ｋＤａの分子量をもつ請求項３３に記載のＧＤ ＮＦ組成物。 ３５．約４０ｋＤａの分子量をもつ前記第２種の截形ＧＤＮＦが約２２ｋＤａの 分子量をもつ成熟ＧＤＮＦモノマーと約１８ｋＤａの分子量をもつ截形ＧＤＮＦ モノマーのヘテロダイマーである請求項３４に記載のＧＤＮＦ組成物。 ３６．請求項３３に記載のＧＤＮＦ組成物から単離され、約２９〜４０ｋＤａの 分子量をもつ截形ＧＤＮＦタンパク質。 ３７．請求項３３に記載のＧＤＮＦ組成物から単離され、約２９〜３６ｋＤａの 分子量をもつ截形ＧＤＮＦタンパク質。 ３８．組換えにより改変された細菌又は哺乳動物細胞により発 現される成熟ＧＤＮＦタンパク質から誘導される截形ＧＤＮＦタンパク質であっ て、アミノ酸配列： Ｘ−［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］−Ｙ （式中、［Ｃｙｓ⁴¹−Ｃｙｓ¹³³］は図１（配列番号２）に示すＣｙｓ⁴¹〜Ｃｙ ｓ¹³³のアミノ酸配列を表し、ＹはＣｙｓ¹³³のカルボキシ末端基又はＩｌｅ¹³⁴ のカルボキシ末端アミノ酸残基を表し、ＸはＣｙｓ⁴¹のアミン基又は以下の群： から選択されるアミノ末端アミノ酸残基を表す）をもつ截形ＧＤＮＦタンパク質 並びにその付加、置換及び内部欠失変異体。 ３９．Ｘが から構成される群から選択される請求項３８に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質及 びその変異体。 ４０．成熟ＧＤＮＦタンパク質が組換えにより改変された細菌細胞により発現さ れ、前記截形ＧＤＮＦタンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ産生さ れる請求項３８に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質。 ４１．治療上有効な量の請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物を１種以 上の医薬的に許容可能なビヒクルと混合してなる医薬組成物の製造方法。 ４２．疾病又は傷害に起因する神経系の損傷を治療するための請求項１に記載の 截形ＧＤＮＦタンパク質産物の使用。 ４３．パーキンソン病の治療のための請求項４２に記載の截形ＧＤＮＦタンパク 質産物の使用。 ４４．疾病又は傷害に起因する神経系の損傷を治療するための医薬組成物の製造 のための請求項１に記載の截形ＧＤＮＦタンパク質産物の使用。