CZ298227B6

CZ298227B6 - Izolovaný polypeptid, odpovídající izolovaný polynukleotid, expresivní vektor a vakcinacní prostredek

Info

Publication number: CZ298227B6
Application number: CZ20004203A
Authority: CZ
Inventors: Thonnard@Joelle
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2007-07-25
Also published as: TR200003345T2; HUP0102853A1; DK1078064T3; CN1210401C; HUP0102853A3; NO330169B1; CA2328502A1; NO20005697D0; ES2247803T3; AU737196B2; JP2002514425A; US20060147462A1; DE69927017T2; GB9810285D0; NZ508322A; IL139612A0; NO20005697L; CZ20004203A3; WO1999058684A2; US7122197B1

Abstract

Izolovaný polypeptid, který je mozné pouzít ve vakcíne proti infekci Moraxella catarrhalis obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespon 85 % shody s aminokyselinovou sekvencí vybranouze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6po celé délce sekvence SEQ ID NO: 4 nebo sekvenceSEQ ID NO: 6. Soucást resení tvorí také odpovídající imunogenní fragment, schopný vyvolat imunitní odezvu, poprípade jako soucást vetsího fúzního proteinu. Vynález se rovnez týká odpovídajícího izolovaného polynukleotidu, kódujícího tyto struktury, expresivního vektoru s jeho obsahem a hostitelské bunky, obsahující takový vektor. Resení se týká také zpusobu produkce popsaného polypeptidu, expreseodpovídajícího polynukleotidu, vakcinacního prostredku a odpovídající protilátky.

Description

kolovaný póly peptid, odpovídající izolovaný póly nukleotid, expresi v ní vektor a vakcinační prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká polynukleotidu (kterc sc zde nazývají „pólynukleotidy BASB020). peptidů. které tyto póly nukleotidy kódují (které se zde nazývají „polynukleotidy BASB020“ nebo „BASB020). rekombinantních materiálů a metod vhodných pro jejich produkci. Vynález sc týká io způsobů použití takových póly peptidů a póly nukleotidů, které zahrnují vakcíny proti bakteriálním infekcím. Vynález popisuje diagnostické cesty vhodné pro detekci infekce jistými patogeny.

Dosavadní stav techniky

Organizmus Moraxella catarrhalis (který se také nazývá Branhamella catarrhalis) je gramnegativní bakterie, která se často izoluje z lidských horních cest dýchacích. Odpovídá za řadu patologických stavů, přičemž hlavním z nich je zánět středního ucha u novorozenců a dětí a zápal plic u starých lidí. Také odpovídá za sinusitidu, nosokomiální infekce a invazi vní onemocnění. 20 které se vyskytuje s menší frekvencí.

Zánět středního ucha je dětské onemocnění, které je důležité jak množstvím případů, tak i svým potenciálním následkem. Každý rok se ve spojených státech prokáže více jak 3,5 miliónů případů a odhaduje se. že 80 % dětí prodělá alespoň jeden případ zánětu středního ucha, dříve než dosáh25 ne 3 let (popisuje se v publikaci Klein. JO (1994) Clin. Inf. Dis 19: 823). Jestliže sc zánět středního ucha ne léčí, stává se chronickým a toto onemocnění povede ke ztrátě sluchu, které může být dočasná (v případě akumulace tekutiny ve středním uchu) nebo permanentní (jest I i že sc poškodí sluchový nerv). U kojenců taková ztráta sluchu může vést k oddálení okamžiku, kdy dítě začne mluvit.

Ze středního ucha dětí s otitidou se primárně izolují tři druhy bakterií: Streplococeus pneumoniae, netypovatelný Haemophilus influenzae (NTHi) a M. catarrhalis. Tyto druhy bakterií se nacházejí v 60 až 90% případů. Jisté studie ukazují, že bakterie 5. pneumoniae a NTHi reprezentují přibližně 30 % a M. catarrhalis přibližně 15 % případů zánětu středního ucha (popisuje 35 v publikaci Murphy. TF )1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Ze středního ucha sc mohou izolovat i jiné bakterie (H. influenzae typ B, .S' pyogenes atd.), ale v daleko nižší frekvenci (2 % případů nebo méně).

Epidemiologická data indikují, že v případě patogenů nalezených vc středním uchu kolonizace 40 horních cest dýchacích spolu s dalšími jevy je absolutně nutná při vývoji zánětu středního ucha (popisuje se v publikaci Dickinson, DP et al., (1988) J. Infect. Dis. 158: 205, Faden. HL et al. (1991) Ann. Otorhinol. Larvngol. 100: 612). To jc důležité při migraci bakterií do oblasti středního ucha prostřednictvím Bustách o vy trubice, po níž následuje zánětlivý proces. Tyto faktory jsou dnes známy. Je dáno, že dočasné anomálie imunitního systému, ke kterým dochází po virové 45 infekci, mohou například způsobit neschopnost kontrolovat kolonizaci dýchacích cest (popisuje sc v publikaci Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Jiné vysvětlení je, že expozice vůči faktorům prostředí umožňuje kolonizaci některých dětí, které sc následně stávají náchylné ke vzniku zánětu středního ucha, protože v oblasti středního ucha dochází k trvalému výskytu patogenů (popisuje se v publikaci Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60. 267).

Velmi málo se ví o imunitní odezvě vůči mikroorganizmu M. catarrhalis. Analýza kmenů izolovaných následně z nasofaryngu u malých dětí ve věku od 0 do 2 let ukazuje, že se často izolují nové kmeny. To ukazuje, že u kolonizovaných dětí se vyvolá účinná imunitní odezva proti uvedeným bakteriím (popisuje se v publikaci Faden, HL ct al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

- 1 CZ 298227 B6

L většiny testovaných dospělých lidí se identifikovaly baktericidní protilátky (popisuje sc v publikaci Chapman, AJ et al. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Kmeny M. calarrhalis se liší ve své kapacitě odolávat sérové baktericidní aktivitě: v obecném případě izoláty z nemocných jedinců jsou více rezistentní než izoláty z jedinců, kteří jsou pouze kolonizováni (popisuje se v publi5 kaci Hol. C et al.. (1993) Lancet 341: 1281, Jordán. KL et al. (1990) Ani. J. med. 88 (suppl. 5Λ):

28S). Sérová rezistence se proto považuje za faktor virulencc u bakterií. Opsonizační aktivita sc proto pozorovala u séra dětí, které se zotavují ze zánětu středního ucha.

Antigcny vůči kterým jsou cílené různé imunitní odezvy u lidí nebyly zatím stanoveny s výjimio koti OMP Bl, což je protein o molekulové hmotnosti 84 ()()(), jehož exprese reguluje železo a který rozeznává sérum pacientů se zápalem plic (popisuje se v publikaci Setlii S. et al. (1995) Infect. Immun. 63: 1516) a IJspA I a UspA2 (Chen D. et al., (1999), Infect. Immun. 67: 1310).

Za použití biochemických metod se charakterizovalo několik dalších membránových proteinu 15 přítomných na povrchu organizmu M. calarrhalis nebo při jejich implikaci při indukci ochranné imunity (popisuje se v publikaci Murphy. TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). V modelu myšího zápalu plic přítomnost protilátek vytvořených proti některým z membránových proteinů (IJspA, CopB) podporuje rychlejší odstranění pulmonární infekce. Jiný polypeptid (OMP CD) je u různých kmenů organizmu M. calarrhalis vysoce konzervativní a vykazuji homologii s porinem 20 organizmu Pseudomonas aeruginosa. který je účinný proti této bakterii ve zvířecích modelech.

Frekvence výskytu infekcí organizmem Moraxella calarrhalis dramaticky vzrostla v průběhu několika dekád. K tomu přispívá výskyt několika bakteriálních kmenů, které jsou rezistentní na antibiotika a zvyšují se populace lidí s oslabeným imunitním systémem. V současné době už není 25 neobvyklé izolovat kmeny Moraxella calarrhalis. které jsou rezistentní na některé nebo všechny standardní antibiotika. Tento jevy vyvolal potřebu vytvořit nové antimikrobiální činidla, vakcíny, způsoby testování léků a diagnostické testy, které jsou vhodné pro tyto organizmy.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří izolovaný polypeptid, který je možné použít vc vakcínč proti infekci Moraxella calarrhalis obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85 % shody s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 4 a SEQ ID 35 NO: 6 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 4 nebo sekvence SEQ ID NO: 6.

Součást podstaty vynálezu tvoří také odpovídající imunogenní fragment, schopný vyvolat imunitní odezvu, popřípadě jako součást většího fúzního proteinu. Vynález se rovněž týká odpovídajícího izolovaného polynukleotidu. kódujícího tyto struktury; expresivního vektoru sjeho obsahem ίο a hostitelské buňky, obsahující takový vektor.

Vynález se týká také způsobu produkce popsaného polypeptidu, exprese odpovídající polynukleotidu, vakcinačního prostředku, obsahujícího některou z uvedených struktur a příslušných protilátek, imunospecifických pro popsané polypeptidy.

Polypeptidy

Vynález popisuje polypeptidy organizmu Moraxella calarrhalis. které se zde nazývají polypeptidy „BASB020“ nebo „polypeptidy BASB020“ stejně jako jejich biologicky, diagnosticky. 50 pro fy lakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné varianty a kombinace, které je obsahují.

Vynález dále popisuje:

a) izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 55 85% shodu, upřednostňuje se alespoň 90% shoda, více se upřednostňuje alespoň 95 % shoCZ 298227 B6 da. nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99% nebo úplná shora se sekvencí uvedené v SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

b) polypeptid kódovaný izolovaným poiynuklcotidem, který obsahuje polynukleotidovou sek5 věnci, která vykazuje alespoň 85% shodu, přednostně alespoň 90% shodu, více se preferuje alespoň 95% shoda, dokonce více se preferuje alespoň 97 až 99% shoda nebo úplná shoda se sekvencí SEQ ID NO: 1. 3. 5 nebo 7 po cele délce sekvence SEQ ID NO: 1. 3. 5 nebo 7 nebo

c) polypeptid kódovaný izolovanou polynukleotidovou sekvencí, která kóduje polypeptid, který vykazuje alespoň 85% shodu, upřednostňuje se alespoň 90% shodu, více se upřednostňuje alespoň 95% shodu, dokonce více se upřednostňuje alespoň 97 až 99% nebo úplná shoda s aminokyselinovou sekvencí popsanou v SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

i? Polypeptidy BASB020 popsané v sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 jsou polypeptidy BASB020 z mikroorganizmu Moraxella catarrhatis kmeny MC2931 (ATCC 43617), MC29I2, MC2913 a MC'2969.

Vynález dále popisuje imunogenní fragment polypeptidu BASB020, který tvoří nepřerušovanou 20 část polypeptidu BASB020, který obsahuje stejnou nebo v podstatě stejnou imunogenní aktivitu jako polypeptid obsahu jící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8. Je nutné říci, že fragment (je-li to nezbytné spojený s nosičem) je schopný zvýšit imunitní odezvu, která rozeznává polypeptid BASB020. Takový imunogenní fragment může zahrnovat například polypeptid BASB020, kterému chybí N-terminální vedoucí sekvence a/nebo transmemhranová doména 25 a/nebo C-terminální kotevní doména. Imunogenní fragment BASB020 podle vynálezu obsahuje podstatně všechny extracelulární domény polypeptidu, které vykazují alespoň 85% shodu, upřednostňuje se alespoň 90% shodu, více se upřednostňuje alespoň 95% shoda, nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99% shoda sc sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 po celé délce sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2.

Fragment jc polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci, která je celá stejná jako část, nikoli celek, libovolné aminokyselinové sekvence libovolného polypeptidu podle vynálezu. Stejně jako polypeptidy BASB020, tak také fragmenty se mohou vyskytovat volně nebo mohou být obsaženy ve větším polypeptidu. vc kterém tvoří část nebo oblast. Nejvíce se preferuje jediná 35 nepřerušovaná oblast v jednom větším poly peptidu.

Preferované fragmenty zahrnují například zkrácené polypeptidy. které obsahují část aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 2, 4. 6 nebo 8 nebo její varianty , jako jsou nepřerušované série zbytků, které zahrnují N a/nebo C-terminální aminokyselinovou sekvenci. Také se preferují 40 degradované formy peptidů podle vynálezu produkované v hostitelské buňce. Dále se preferují fragmenty charakterizované strukturálními a funkčními charakteristickými znaky, jako jsou fragmenty, které obsahují dvoušroubovici nebo oblasti tvořící dvoušroubovici. beta list a oblasti tvořící beta list, smyčku a oblasti tvořící smyčku, šroubovici a oblasti tvořící dvoušroubovici. hydrofilni oblasti, hydrofobní oblasti, alfa alifatické oblasti, beta amfipatické oblasti, flexibilní oblasti. 45 oblasti tvoříc povrch, oblast vázající substrát a oblasti s vysokým antigenním indexem.

Další preferované fragmenty zahrnují izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 15, 20, 30. 40, 50 nebo 100 nepřerušovaných aminokyselin z aminokyselinové sekvence SE Q ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 nebo izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou 50 sekvenci, která má alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 nepřerušovaných aminokyselin krácených nebo vyjmutých z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

Fragmenty polypeptidu podle vynálezu se mohou použít při produkci odpovídající plné délce polypeptidu syntézou peptidu, tyto fragmenty sc proto mohou použít jako meziprodukty při pro55 dukci polypeptidu plné délky podle vynálezu.

-3CZ 298227 B6

Zvláště se preferují varianty, kde několik 5 až 10. 1 až 5. 1 až 3. 1 až 2 nebo 1 aminokyselina se substituuje, deletujc nebo aduje v libovolné kombinaci.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty podle vynálezu se mohou vyskytovat ve formě .,zralého‘^L proteinu nebo mohou být částí většího proteinu, jako je prekurzor nebo tužní protein. Jc výhodné zahrnout další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční a vedoucí sekvence. pro-sckvence, sekvence, které slouží k čištění velkého množství histidinových zbytků, nebo další sekvence vhodné pro stabilitu během rekombinantní produkce. Dále se také zvyšuje adice ío exogenního polypeptidu nebo Iipidového ocasu nebo polynukleotidových sekvencí, aby sc zvýšil imunogenní potenciál konečné molekuly.

Vynález popisuje geneticky manipulované rozpustné fúzní proteiny, které obsahují polypeptid podle vynálezu nebo jeho fragment a různé části konstantních oblastí těžkých a lehkých řetězců i? imunoglobulinů různých podtříd (IgG. IgM. IgA, IgE). Jako imunoglobulin se preferuje konstantní část těžkého řetězec lidského IgG, zvláště IgG 1, kde dochází k fúzi v pantové oblasti. V určitém provedení vynálezu se muže odstranit část Fc začleněním štěpící sekvence, která sc bude štěpil faktorem srážení krve Xa. Vynález se dále týká způsobu přípravy těchto fúžních proteinů genetickou manipulací a použití pro testování léků, diagnostiku a terapii. Vynález se také vztahují) je na polynuklcotidy, které kódují uvedené fúzní proteiny. Příklady technologie tužní ho proteinu se mohou zjistit v mezinárodní patentové přihlášce W( )94/2945 8 a WO94/22914,

Proteiny se mohou chemicky spojovat nebo exprimovat jako rekombinantní fúzní proteiny, což umožňuje zvýšit sílu exprese, aby se mohly produkovat v expresívním systému. Fúzní partner 25 může asistovat při vzniku cpitopů pomocných buněk 1 (imunologický fúzní partner), zvláště cpitopy pomocných buněk 1' rozeznávaných lidmi nebo mohou podílet na expresi proteinu (zesilovač exprese) a na získání vyššího výtěžku ve srovnání s nativním rekombinantním proteinem. Upřednostňuje se, aby fúzní partner byl jak imunologický fúzní partner tak zesilovač exprese.

Mezi fúzní partnery' patří protein D z organizmu Haemophilu influenzaei a nestrukturuj protein z viru chřipky NS1 (hemaglutinin). Dalším fúzním partnerem je protein známý jako LytA. Přednostně se používá C-terminální oblast uvedené molekuly. Protein LytA se získal z mikroorganizmu Sírepíococcus pneumonuu^ který se syntetizuje za použití N-acetyl L-alaninamídázy LytA (kódované genem LytA (popisuje se v publikaci Gene, 43 (1986) page 265-272)), je to autolyzin, 35 který⁷ specificky degraduje jisté vazby na peptidoglykanové kostře. C -terminální oblast proteinu LytA je odpovědná za afinitu vůči cholinu nebo některým cholinovým analogům jako je DEAE. l ato vlastnost se využila při vývoji expresívních plazmidu E. coli LytA, který je možné použít při expresi fúzních proteinů. Čištění hybridních proteinů, které obsahují fragment C-LytA na jeho N-konci, se popisuje v publikaci Biotcchnologv: 10, (1992) page 795-798). Je možné použít au opakovanou část molekuly LytA. která se nachází na C-terminálním konci počátku vc zbytku 178, například zbytku 188-305.

Vynález také zahrnuje varianty shora zmiňovaných polypeptidu, kterými jsou polypeptidy, které se liší od referenčních polypeptidu konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž zbytek 45 se substituuje jiným zbytkem s podobnou charakteristikou. Takové typické substituce probíhají mezi Ala, Val, Leu a llc. mezi Ser a Thr, mezi ky selými zbytky Asp a glu, mezi Asn a Gin a mezi bazickými zbytky Lys a Arg nebo aromatickými zbytky Phe a 1 y r.

Polypeptidy podle vynálezu se mohou připravit libovolným vhodným způsobem. Takové poly50 peptidy zahrnují izolované přirozeně sc vyskytující polypeptidy, polypeptidy produkované rekombinaci, synteticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy produkované kombinací uvedených metod. Způsoby přípravy takových pólypeplidú jsou dobře známy v oboru.

Nejvíce se preferuje, když se polypeptid podle vynálezu získal z organizmu Moraxellu caiarrhalis. Polypeptid se může získat z jiných organizmů stejného taxonomického rodu. Polypeptid podle vynálezu se muže také získat například z organizmů stejné taxonomické rodiny nebo řádu.

Polynukleotid)

Vynález popisuje polynukleotidy. které kóduji polypeptidy BASB020. zvláště polynukleotidy, které kódují polypeptid. který· se zde označila jako BASB020.

io Vc zvláště preferovaném provedení vynálezu polynukleotid obsahuje oblast kódující polypeptidy BASB020 obsahující sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1,3. 5 nebo 7, která zahrnuje gen v plné délce nebo jeho variantu.

Polypeptidy BASB020 uvedené v sekvenci SEQ ID NO: I. 3. 5 nebo 7 jsou polynukleotidy iš BASB020 z organizmu Moraxellu calarrhalis kmeny MC2931 (ATCC 43617), MC2912.

MC29I3 a MC’2969.

Dále vynález popisuje izolované molekuly nukleových kyselin, které kódují a/nebo exprimují polypeptidy a polynukleotidy BASB020, zvláště polypeptidy BASB020 mikroorganizmu Mora20 xella eutarrha lis, které například zahrnují neupravenou RNA, ribozymovou RNA, mRNA, cDNA, genomovou DNA, B-DNA a Z-DNA. Další provedení podle vynálezu zahrnují biologicky, diagnosticky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné polynukleotidy a polypeptidy a jejich varianty a kompozice, kterc jc obsahují.

Vynález se dále vztahuje na izolované polynukleotidy, které zahrnují alespoň jeden gen celé délky. který kóduje polypeptid BASB020 a vykazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8, a příbuzné polynukleotidy a jejich varianty.

V jiném zvláště preferovaném provedení podle vynálezu se popisuje polypeptid BASB020 3o z mikroorganizmu Moraxellu eufarrhalis, který' obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID

NO: 2, 4, 6 nebo 8 nebo její variantu.

Na základě znalostí polynukleotidovč sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7. polynukleotid podle vynálezu kódující polypeptid BASB020 se muže získat za použití standardních 35 klonovacích a testovacích metod, jako jsou ty vhodné pro klonování a sekvenování fragmentů chromozomální DNA z aktéřií za použití buněk mikroorganizmu Moraxellu eutarr hal lis Catlin. po čemž následuje získání klonu v plné délce. Například, aby se získala polynukleotidová sekvence podle vynálezu, jako je polynukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 1, 3. 5 nebo 7, v typickém případě knihovna klonů chromozomální DNA Moraxellu catarrhulis v buňkách <w E. coli nebo v některém jiném vhodném hostiteli se testuje radioaktivně značeným oligonukleotidem, přičemž se upřednostňuje 17 mer nebo delší získaný z částečné sekvence. Klony nesoucí DNA shodnou s DNA sondy se mohou odlišit za přísných hybridizačních podmínek. Sekvenování jednotlivých klonů identifikovaných hybridizací se sekvenačními primery navrženými z původního polypeptidu nebo polynukleotidovč sekvence je pak možné prodloužit polynukleoti45 dovou sekvenci v obou směrech za účelem stanovení genové sekvence v plnc délce. Takové sekvenování je možné provést například použitím denaturované dvou řetězcové DNA, která se připravila z plazmidového klonu. Vhodné metody sc popisují v publikaci Maniatis. T.. Eritsch, E.F. a Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory inanual. 2^nd Ed.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York (1989). (je vhodné prostudovat kapitoly 50 Screening By Hybridization 1.90 a Sequencing Denatured Double-Strandcd DNA Templatcs

13,70). Je možné uskutečnit přímé sekvenování genomové DNA za účelem získání sekvence plné délky. Každý polynukleotid uvedený v SEQ ID NO: 1. 3, 5 nebo 7 sc zkoumal v knihovně DNA získané z organizmu Moraxellu cuturrhalis,

- 5 CZ 298227 B6

Sekvence DNA uvedená v SEQ ID NO: 1, 3, 5. nebo 7 obsahuje otevřený čtecí rámec, který kóduje protein obsahující přibližně stejný počet aminokyselinových zbytku uvedených v SEQ ID

NO: 2, 4. 6 nebo 8. přičemž je možné vypočítat molekulovou hmotnost za použiti hodnot molekulové hmotnosti aminokyselinových zbytku, které jsou dobře známy v oboru.

Póly nukleotid uvedený v SEQ ID NO: 1 mezi počátečním kodonem nukleotidu č. 1 a terminačním kodonem. který' začíná nukleotidem č. 841 sekvence SEQ ID NO: 1. kóduje polypeptid SEQ ID NO: 2.

Polypeptid SEQ ID NO: 3 mezi počátečním kodonem v nukleotidu č. 1 a terminačním kodonem. který' začíná nukleotidem č. 841 sekvence SEQ ID NO: 3. kóduje polypeptid SEQ ID NO: 4.

Polynukleotid SEQ ID NO: 5 mezi počátečním kodonem v nukleotidu č. 1 a terminačním kodonem, který začíná nukleotidem č. 841 sekvence SEQ ID NO: 5. kóduje polypeptid SEQ ID NO: 6.

Polynukleotid SEQ ID ΝΌ: 7 mezi počátečním kodonem v nukleotidu č. 1 a terminačním kodonem, který začíná nukleotidem č. 841 sekvence SEQ ID NO: 7, kóduje polypeptid SEQ ID NO: 8.

Vynález dále popisuje izolovaný polynukleotid, který' obsahuje:

a) polynuklcotidovou sekvenci, která vy kazuje alespoň 85% identitu, upřednostňuje se alespoň 90% shoda, více sc upřednostňuje alespoň 95% shoda, nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99% nebo úplná shoda se sekvencí uvedené v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 v celé délce sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 nebo

b) polynuklcotidovou sekvencí, která vykazuje alespoň 85% shodu, přednostně alespoň 90% shodu, více se preferuje alespoň 95% shoda, dokonce více se preferuje alespoň 97 až 99% shoda nebo úplná shoda se sekvencí SEQ ID NO: 2. 4. 6 nebo 8.

Polynukleotid kódující polypeptid podle vynálezu zahrnuje homology a ortology získané z druhů organizmů, které jsou jiné než Moraxellu catcirrhalis a mohou se získat způsobem, který obsahuje kroky testování vhodné knihovny za přísných podmínek hybrid i zace (například za použití teploty a rozmezí 45 až 65 °C a koncentrace SDS od 0.1 do 1 %) sc značenou nebo dctekovatelnou sondou, která je tvořena sekvencí SEQ ID NO: I, 3, 5 nebo 7 nebo jejím fragmentem nebo tuto sekvenci nebo její fragment obsahuje, a izolaci genu plné délky a/nebo genomových klonů, které obsahují polynuklcotidovou sekvenci.

Vynález popisuje polynuklcotidovou sekvenci, která je shodná v plné délce s kódující sekvencí (otevřený čtecí rámce) v SEQ ID NO: 1. 3. 5 nebo 7. Vynález dále popisuje kódující sekvenci zralého polypeptidu nebo jeho fragmentu ve čtecím rámci s jinou kódující sekvencí, jako je sekvence kódující vedoucí nebo sekreční sekvenci, pře- nebo pro- nebo preproproteinovou sekvenci. Polynukleotid podle vy nálezu může také obsahovat alespoň jednu nekódující 5' nebo 3' sekvenci, jako je přepisované, ale nepřekládaná sekvence, terminační signály (jako jc rho závislý na rho-nezávislý terminační signál), místa vázající ribozom, Kozáková sekvence, sekvence, která stabilizuje mRNA, introny a polyadenylační signály. Polynukleotidová sekvence může také obsahovat další kódující sekvenci, která kóduje další aminokyseliny. Například může kódovat inarkerovou sekvenci, která umožňuje čištění fúzovaného polypeptidu. V jistých provedeních podle vynálezu je markerovou sekvencí hexahistidinový peptid, který poskytuje vektor pQE (Qiagen. lne.) (popisuje sc v publikaci Gentz ct al.. Proč. Nati. Acad. ScL, USA 86: 821-824 (1989)), nebo tag peptidu 11A (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), přičemž oba peptidy sc mohou použít při čištění fúzované polypeptidové sekvence. Polynukleotidy podle vynálezu také zahrnují, ale nejsou omezeny na polynukleotidy obsahující strukturální gen a přirozeně spojené sekvence, které řídí expresi genu.

-6CZ 29X227 B6

Nukleotidové sekvence kódující polypeptid BASB020 SEQ ID NO: 2. 4. 6 nebo 8 muže být shodná s polypeptidem kódujícím sekvenci, která jc obsažená v nukleotidech 1 až 840 SEQ ID

NO: 1. 3, 5 nebo 7. V jiném případě to může být sekvence, která vede k degeneraci genetického ? kódu, také kóduje polypeptid SEQ ID NO: 2. 4. 6 nebo 8.

Termín „polynukleotid kódující polypeptid znamená polynuklcotidy, které zahrnují sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, zvláště bakteriální polypeptid, zvláště pak polypeptid organizmu Moraxella calarrhali.s BASB020, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou 10 v SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8,

Termín také zahrnuje polynukleotid, který' zahrnuje jedinou nepřerušovanou oblast nebo přerušované oblasti kódující polypeptid (například póly nukleotidy přerušované integrovaným fágem, integrované začleněná sekvence a integrovaná vektorová sekvence, integrovaná sekvence trans15 pozonu, způsobeno editováním KNA nebo reorganizací genomové DNA) spolu s dalšími oblastmi, které mohou také obsahovat kódující a/nebo nekódující sekvence.

Vynález dále popisuje varianty póly nukleotidu, které kódují varianty polypeptidu, který obsahuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2. 4, 6 nebo 8. Fragmenty polynuklcolidů 20 podle vy nálezu se mohou použít například při syntéze póly nukleotidů plné délky podle vynálezu.

Zvláště preferované provedení vynálezu jsou polynuklcotidy, které kódují varianty BASB020, které mají aminokyselinou sekvenci polypeptidu BASB020 SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8, kde je několik 5 až 10, 1 až 3. 2, I nebo žádný aminokyselinový zbytek substituován, modifikován. 25 deletován nebo přidán v libovolné kombinaci. Zvláště se preferují ty, které vykazují tichou substituci. adici a delecí, které nemění vlastnosti a aktivity polypeptidu BASB020.

Další preferované provedení podle vynálezu popisuje polynukleotidy. které jsou alespoň z 85 % shodné $ celou svou délkou s polynukleotidem, který kóduje polypeptid BASB020, který má 30 aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2, 4. 6 nebo 8 a polynukleotidy, které jsou komplementární s takovými polynukleotidy, V jiném případě nejvíce se preferují polynukleotidy, které obsahují oblast, která jc alespoň z 90 % shodná v celé délce s polynukleotidem. který kóduje polypeptid BASB020 a komplementární polynukleotidy. Zvláště se preferují polynukleotidy, které vykazují alespoň 95% shodu v celé délce. Dále se preferují ty polynukleotidy. 35 které vykazují alespoň 97%, 98% a nejvíce preferují ty nukleotidy, které vykazují alespoň 99% shodu.

Preferované provedení vynálezu popisuje polynukleotidy kódující polypeptidy, které si uchovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu, jako zralý polypeptid kódovaný DNA se 40 sekvencí SEQ ID NO; 1,3,5 nebo 7.

V souladu sjistými preferovanými provedeními vynálezu se popisuji polynukleotidy, které hybridizují za zvláště přísných podmínek s polynukleotidovými sekvencemi BASB020, jako tv polynukleotidy v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 1/

Vynález dále popisuje polynukleotidy, které hybridizují s polynukleotidovou sekvencí. Stínilo ohledem sc vynález zvláště vztahuje k polvnuklcotidům, které hybridizují za přísných podmínek sc zde popsanými polynuklcotidy. Termíny ..přísné podmínky“ a „přísné hybridizační podmínky znamená, že k hybridizaci dojde pouze tehdy, jestliže sekvence vykazují alespoň 95 % a preferuje 50 sc alespoň 97% shodu mezi sekvencemi. Specifický příklad přísných hybridizačních podmínek je inkubace přes noc při teplotě 42 °C v roztoku, který obsahuje 50 % formaniidu, 5 x SSC (150 mM NaCI. 15 mM citrát sodný). 50 mM fosforečnan sodný (pH 7.6), 5x Dcnhardtův roztok, 10% síran dextranu a 20 mikrogramů na 1 mililitr denaturované, naštípanč DNA spermatu lososa. Pak následuje promyti hybridizačního podkladu v 0,lx SSC¹ při teplotě 65 °C, Hybridizace a pod55 minky promývání jsou dobře známy a vysvětlují sc v publikaci Sambrook et al„ Molecular

-7CZ 298227 B6

Cloning: A Laboratory manual. Sccond Edition. Cold Spring Harbor. N.Y.. (1989), zvláště v kapitole 11. Hybridizační roztok se muže také použít s polynuklcotidovými sekvencemi, které se popisují ve vynálezu.

Vynález dále popisuje póly nukleotid obsahující polvnukleotidovou sekvenci získanou testováním vhodné knihovny, která obsahuje celý gen s polvnukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: I, 3, 5 nebo 7 za přísných hybridizačních podmínek se sondou, která má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1. 3. 5 nebo 7, nebo s jejím fragmentem a izolaci uvedené polynukleotidovc sekvence. Fragmenty použitelné při získání takového polynuklcotidu zahrnují například zde popsané io sondy a primery.

V polynukleotidových testech podle vynálezu se mohou póly nukleotidy podle vynálezu použít jako hybridizační sondy vhodné pro RNA, cDNA a genomovou DNA za účelem izolovat celou délku cDNA a genomové klony, které kódují BASB020. a za účelem izolovat cDNA a genomové 15 klony jiných genu, které vykazují vysokou shodu, zvláště vysokou shodu sekvence s genem

BASB020. Takové sondy budou v obecném případě obsahovat alespoň 15 nukleotidových zbytků nebo párů bází. Upřednostňují se takové sondy, které obsahují alespoň 30 nukleotidových zbytků nebo párů bází a mohou také mít alespoň 50 nukleotidových zbytků nebo párů bází. Zvláště se preferují sondy, které mají alespoň 20 nukleotidových zbytků nebo párů bází a budou mít méně 20 než 30 nukleotidových zbytků nebo párů bází.

Kódující oblast genu BASB020 se může izolovat testováním za použití sekvence DNA popsané v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 za účelem syntézy oligonukleotidové sondy. Značený oligonukleotid má sekvenci komplementární se sekvencí genu podle vynálezu a použije se pak k testování 25 knihovny cDNA, genomové knihovny nebo mRNA za účelem stanovení, které členy knihovny sc sondou hybridizují.

Existuje několik metod, které jsou dostupné a dobře známe v oboru a které jsou vhodné pro získání DNA celé délky nebo pro prodloužení krátkých DNA. Jsou to například ty metody žalost) žene na metodě rychlé amplifikace konců cDNA (RAC'E) (popisuje sc například v publikaci

Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Jisté upravené metody, jako příklad můžeme uvést Marathon^IM (Clontech Eaboratories lne ), vykazují podstatně jednoduší zkoumání delších úseků cDNA. Při technologii Marathon^IM se cDNA připravily z mRNA extrahované z vybrané tkáně a adaptorové sekvence ligované na každý konec. Amplifikací nukleové kyseliny (PCR) se 35 amplifikuje „chybějící“ 5' konec DNA za použití kombinace pro gen a adaptor specifických oligonuklcotidových primerů. Jsou to primery' navržené tak. žc se vážou na ampl i Ukovaný produkt (v typickém případě jde o primer specifický pro adaptor, který sc dále váže na 3' konec v adaptorové sekvenci, a primer specifický pro gen, který se váže dále na 5'konec vybrané genové sekvence), Produkty uvedené reakce sc pak mohou ihned analyzovat sekvenováním DNA 40 a může se sestrojit DNA v plné délce, buď připojením produktu přímo k existující DNA za vzniku úplné sekvence, nebo proběhne oddělená PCR v plné délce za použití nových informací o sekvenci a navrhne se 5' primer.

Polvnukleotidy a polypeptidy podle vynálezu se mohou použít například jako činidla při výzku45 mu a materiály při testování léčby a diagnostických činidel vhodných pro léčbu onemocněni, zvláště pak při onemocnění lidí, jak se diskutuje dříve v textu u polynukleotidových testů.

Polvnukleotidy podle vynálezu, které jsou oligonukleotidy získaní ze sekvence SEQ ID NO: 1 až 8 se mohou použít ve zde popsaných procesech, ale přednostně v případě PCR za účelem stano50 vení, zda polvnukleotidy zde zcela nebo částečně identifikované se přepisují v bakteriích v infikované tkáni. Jc známo, že takové sekvence nacházejí také využití při diagnóze stádia infekce a ty pu infekce, kde je známý patogen.

Vynález dále popisuje póly nukleotidy, které kódují polypeptid, který je zralý protein plus další 55 N nebo C terminální aminokyseliny nebo aminokyseliny uvnitř zralého polypeptid u (když zralá

-8CZ 298227 B6 forma obsahuje více jak jeden polypeptidový řetězec). Takové sekvence mohou mít mimo jiné důležitou úlohu při zpracování proteinu z prekurzoru na zralou formu, mohou umožňovat transport proteinu, mohou prodlužovat nebo zkracovat poločas rozpadu proteinu nebo umožňují manipulaci proteinu v testu nebo jeho produkci. V obecném případě to je případ in vivo. kdy aminokyseliny se mohou ze zralého proteinu odstranit buněčnými enzymy.

V případě každého polynukleotidu podle vynálezu se vytváří komplementární polynukleotid. Preferuje se. aby tyto komplementární polynuklcotidy byly zcela komplementární a každý polynukleotidcm. se kterým jsou komplementární.

Prekurzorový protein, který má zralou formu polypeptidu fúzovaného s jednou nebo více prosekvcncí může být neaktivní forma polypeptidu. Když se prosekvence odstraní, pak se takové deaktivované prekurzory v obecném případě aktivují. Některé nebo všechny prosekvence se mohou před aktivací odstranit. V obecném případě se takové prekurzory nazývají pro-protciny.

Vedle standardních nukleotidů A, G, C. T/U se termín ,.N může také použit při popisu jistých polynukleotidu podle vynálezu. Termín .,N znamená, že libovolný ze čtyř DNA nebo RNA nukleotidů se muže objevit v tímto způsobem označeno poloze v sekvenci DNA nebo RNA. Preferuje se, když N není nukleová kyselina, která když se kombinuje s přilehlými nukleotidovýmí polohami, když se Čte ve správném čtecím rámci, bude mít účinek při vytvoření prematuračního terminačního kodonu v takovém čtecím rámci.

Polynukleotid podle vynálezu může kódovat zralý protein, zralý protein plus vedoucí sekvenci (která se může označit jako preprotein), prekurzor zralého proteinu, který má jednu nebo více pro sekvencí, které nejsou vedoucími sekvencemi preproteinu nebo preproproteinu. který je prckurzorem proproleinu, jenž má vedoucí sekvenci a jedu nebo více prosekvencí. které se v obecném případě odstraní během kroků zpracování, přičemž vznikají aktivní nebo zralé formy polypeptidu.

Vynález dále popisuje použití polynukleotidu podle vynálezu vhodného pro terapeutické nebo profytaktické účely zvláště genetickou imunizaci.

Při použití polynukleotidu podle vynálezu při genetické imunizaci se přednostně použijí vhodné metody zavedení, jako je přímé zavedení plazmidovc DNA injekcí do svalů (Wolf et al.. Huni. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpc et al., Huni. Gene Thcr. (1983) 4: 419), zavedení DNA v komplexu se specifickým proteinovým nosičem (Wu et al. J. Biol. Chcin. (1989) 264: 16985). ko-precipitacc DNA s fosforečnanem vápenatým (popisuje se v publikaci Bcnvenisity and Reshcf., PNAS USA (1986) 83: 9551), kapsulizacc DNA v různých formách lipozomů (Kanada et al.. Science (1989) 243: 375), bombardování částicemi (popisuje se v publikaci Tang et al., Nátuře (1992 356: 152), Eisenbraun et al.. DNA Cell Biol. (1993) 12: 79) a infekce in vivo za použití klonovaných retrovirových vektorů (Seegcr ct al., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vektory, hostitelské buňky, expresívní systémy

Vynález také popisuje vektory, kterc obsahují polynukleotid nebo polypeptid podle vynálezu, hostitelské buňky, které jsou geneticky upraveny, vektory' podle vynálezu a produkci polypeptidu podle vynálezu rekombinantními metodami. Také se mohou použít trans lační systémy, kterc neobsahují buňky, a mohou se použít při produkci uvedených proteinů za použití RNA získané z konstrukcí DNA podle vynálezu.

Rekombinantní polypeptidy podle vynálezu se mohou připravil způsobem, který je dobře znám v oboru z geneticky upravených hostitelských buněk, které obsahují expresívní systémy. Vynález popisuje expresívní systémy, kterc obsahují polynukleotid nebo polynuklcotidy podle vynálezu, hostitelské buňky, které jsou geneticky upravené uvedeným expresívním systémem a produkci polypeptidu podle vynálezu rekombinantním způsobem.

-9 CZ 298227 B6

V případě rekombinantní produkce polypeptidů podle vynálezu se hostitelské buňky mohou geneticky upravit tak. že začleňují expresivní systémy nebo jejich části nebo póly nukleotide podle vynálezu. Zavedení póly nukleotidu do hostitelské buňky se může ovlivnit metodami popsa5 nými v mnoha standardních laboratorních manuálech, jako je Davis et al., Basic Mathods in molecular biology. (1986) a Sambrook et al.. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Barbor N. Y. (1989). jako je transfekce fosforečnanem vápenatým, transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem. transfekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kalionickými lipidy, elektroporace, transdukcc. balistické io zavedení a infekce.

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako jsou buňky streptokoků. stafylokoku, enterokoků. E. coli. streptomyces. sinic. Bacillus subtilis. Neisseria meningiíidis. a Moraxella calarrhalis, buň ky h u b, j ako j sou buή ky k v a s i nek, Klu veron/ vces, Saccharo15 myces, basidiomycet, Candida albicans a Aspergillus, hmyzích buněk, jako jsou buňky

Drosophila S2 a Spodoptera Sf9, zvířecích buněk, jako jsou buňky CHO, COS, HeLa. Cl27. 3T3. BHK. 293, CV-I a buňky Bowesova melanomu, rostlinných buněk, jako jsou buňky gymnosperm nebo angiosperm.

Při produkci polypeptidů podle vynálezu se mohou použít různé expresivní systémy. Takové vektory mezi jinými zahrnují chromozomální, epizomální vektory a vektory odvozené z virů, například vektory získané z bakteriálních plazmidu, z hakteriofága. z transpozonů, / kvasinkových epizomú, z inzerčních elementů, kvasinkových chromozomálních elementů, z virů, jako jc bakulovirus, papovavirus, jako je SV40. viry vakcinie. adenoviry, viry planých neštovic, virus pseudovztekliny, pikornaviry. retroviry a alfaviry a vektory' získané jejich kombinací, jako jsou ty získané z plazmidových a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou kosmidy a fágemidy. Konstrukce cxpresívních systémů mohou obsahovat kontrolní oblasti, které regulují vyvolávají expresi. V obecném případě se může použít pro expresi libovolný systém nebo vektor vhodný pro udržení, propagaci nebo expresi polynuklcotidů a/nebo pro expresi pólypeptidu v hostitelko ské buňce, Do expresívního systému je možné začlenit vhodnou sekvenci DNA libovolným známým způsobem, jako se například popisuje v publikaci Sambrook et al, Molecular Cloning. A laboratory manual. 2^,d Ed.: Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Cold Spring Harbor. New York (1989).

Do rckombinantních cxpresívních systémů u eukaryont. které jsou vhodné pro sekreci přepisovaného proteinu do lumenu cndoplazmatického retikula, do periplazmatickcho prostoru nebo do extrabuněčného prostředí, se mohou do expresívního polypeptidů začlenit vhodné sekreční signály. Tyto signály mohou být vzhledem k polypeptidů endogenní nebo to mohou být hctcrologní signály.

Polypeptidy podle vy nálezu se mohou získat nebo čistit z kultur rckombinantních buněk metodami, které jsou dobře známy v oboru a zahrnují srážení síranem amonným nebo etanolem. kyselou extrakci, chromatografií s výměnou kat iontů nebo a n iontů, chromatografií nebo fosfocelulózc, chromatografií s hydrofóbními interakcemi, afinitní chromatografií, hydroxylapatitovou chroma45 tografíi a chromatografií s loktinem. V případě čištění se nejvíce preferuje afinitní chromatografie s kovovými ionty (1MAC). Aby se regenerovaly aktivní konformace v případě, že polypeptid sc denaturuje během vnitro buněčné syntézy, izolace a/nebo čištění, je možné použít dobře známé metody vhodné pro opětné sbalení proteinu.

Expresívním systémem může také být rekombinantní živý organizmus, jako je virus nebo bakterie. Gen se může začlenit do genomu živého rekombinantní ho viru nebo bakterie. I noku láce a in vivo infekce s tímto živým vektorem povede k in vivo expresi antigenu a k indukci imunitní odezvy. Viry a bakterie používané pro tyto účely jsou například poxviry (například vakcinie. plané neštovice), alfaviry (Sindbis virus, Semliki Eorcst virus, virus encefalitidy venezuelských 55 koní), adenoviry. adeno asociované vity, picornaviry (poliovirus. rhinovirus), herpes viry (virus

- 10CZ 298227 B6 planých neštovic, atd.), Listeria. Salnionella. Shigella, Neisseria, BCG. Tyto viry a bakterie mohou byl virulentní nebo různými způsoby oslabené za účelem získat živé vakcíny. Takové živé vakcíny jsou také popsány vc vynálezu.

Diagnostické, prognostické, sérotypovací a mutační testy

Tento vy nálezu se také popisuje použití póly nukleotidů BASB020 a polypeptidů podle vy nálezu pro použití diagnostických činidel. Detekce polynukleotidu a/nebo polypeptidů BASB020 v eukaryontech, zvláště pak u savců a zvláště pak u lidí bude poskytovat diagnostické metody pro κι diagnózu onemocnění, stádia onemocnění nebo odezvy infekčního organizmu na lék. Eukarvonti, zvláště savci a zvláště lidé, a zvláště Ti, kteří jsou infikováni nebo se očekává, že budou infikováni organizmem, který obsahuje gen nebo protein BASB020. se mohou detekovat na úrovni nukleové kyseliny nebo aminokyseliny různými známými metodami.

i? Polypcptidy a polynukleotidy vhodné pro prognózu, diagnózu a jiné analýzy se mohou získat z infikovaných a/nebo neinfi kovaných tělních materiálů jednotlivců. Polynukleotidy z libovolných zdrojů, zvláště DNA nebo RNA se mohou použít přímo pro detekci nebo se mohou aplikovat enzymaticky za použití PCR. nebo libovolné amplifikační metody. RNA, zvláště mRNA, cDNA a genomová DNA se mohou také použít stejným způsobem. Za použití amplifikace.

charakterizace druhů a kmenů infekčních nebo rezidentních organizmů, které jsou přítomny ujedinců, jc možné provést analýzu genotypu vybraného polynukleotidu organizmu. Delece a inzerce se mohou detekovat změnou velikosti ampl i fi kovaného produktu vc srovnání s genotypem referenční sekvence vybrané z příbuzného organizmu, upřednostňuji se různé druhy stejného rodu nebo různých kmen stejného druhu. Bodové mutace se mohou identifikovat hybridizací 25 amplifikované DNA se značenými polynukleotidovými sekvencemi BASB020. Perfektně nebo podstatně párované sekvence sc mohou odlišit od duplexů, které nejsou správně spárovány tím, že se štěpí DNázou nebo RNázou nebo detekcí rozdílů teplot dcnaturacc nebo renaturačních kinctik. Rozdíly polynukleotidové sekvence se mohou také detekovat změnami elektroforetické mobility polynukleotidových fragmentů na gelu v porovnání s referenční sekvencí, l o je možné provést s nebo bez denaturačního činidla. Polynukleotidové rozdíly sc mohou také detekovat přímým sekvenovánírn DNA nebo RNA (popisuje se v publikaci Myers et al. Science 230: 1242 (1985)). Změny sekvencí ve specifických polohách sc mohou také projevit testy ochrany proti nuklcázám, jak oje RNáza, VI a S1 nebo metodou chemického štěpeni. Popisuje se například v publikaci Cotton et al.. Proč. Nati. Acad. Sci.. USA. 85: 4397- 4401 (1985).

V jiném provedení podle vynálezu se mohou konstruovat sady oligonukleotidových sond obsahující nukleotidovou sekvenci BASB020 nebo její fragmenty, aby se provedlo účinné testování například genetických mutací, sérotypu. taxonomické klasifikace nebo identifikace. Uvedené metody jsou dobře známy v oboru a vykazují obecnou použitelnost a mohou se použít pro zkou4o mání mnoha problémů, které zahrnují expresi genu, genetické vazby a genetickou variabilitu (popisuje sc například v publikaci Chce et al., Science, 274: 610 (1996)).

Vynález popisuje diagnostický kit. který obsahuje:

a) polynukleotid podle vynálezu, upřednostňuje se nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 nebo její fragment,

b) nukleotidová sekvence komplementární sc sekvencí popsanou v odstavci a).

c) polypeptid podle vynálezu, upřednostňuje se polvpeptid SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 nebo fragmenty nebo

d) protilátky proti polypeptidů podle vynálezu, přičemž se upřednostňuje polypeptid sekvence SEQ ID NO: 2.4. 6 nebo 8.

Jc vhodné, aby libovolný takový kit popsaný v odstavci a), b). c) nebo d) obsahoval podstatný komponent. Takový kit se použije při diagnostikování onemocnění nebo náchylnosti k onemocnění.

Vynález také popisuje použití póly nukleotidu podle vynálezu jako diagnostických činidel. Detekce mutované formy polynukleotidu podle vynálezu, upřednostňuje sc SEQ ID NO: 1. 3, 5 nebo 7. který je asociován s onemocněním nebo s jeho patogenitou, je diagnostický nástroj, který je možné použít při diagnostice onemocnění, pří prognóze průběhu onemocnění, stanovení stádia onemocnění nebo náchylnosti k onemocnění, které vniká na základě slabé nebo silnější exprese κι nebo změněné exprese polynukleotidu. Na úrovni polynukleotidu se mohou detekovat organizmy, zvláště infekční organizmy které vykazují mutace v takovém polynukleotidu. Detekce se může provést různými zde popsanými metodami.

Buňky pocházejí z organizmu který nese mutace nebo polymorfizmy (alclové varianty) v poly15 nukleotidu a/nebo pólypeptidu podle vynálezu se mohou také detekovat na úrovni polynukleotidu nebo polypeptidu různými metodami, což umožňuje například sérotypování. R Γ-PCR se může například použít při detekci mutací v RNA. Zvláště se preferuje použití RT-PCR vc spojení s automatizovaným detekčním systémem, jako je například GeneScan. Pro stejné účely je možné použít RNA, cDNA nebo genomovou DNA: Jako příklad pro identifikaci a analýzu mutací se 20 mohou použít PCR příměry komplementární s polynukleotidem, který kóduje polypeptid BASB020.

Vynález dále popisuje primery s 1, 2. 3 nebo 4 nukleotidy, které se odstranily z 5' a/nebo 3' konce. Tyto primery' se mohou například použít mezi jinými při amplifikaci DNA a/nebo RNA 2? BASB020 izolované ze vzorku získaného z jednotlivec, jako jc například tělesný materiál. Příměry se mohou použít při amplifikaci polynukleotidu izolovaného z infikovaného jednotlivce tak, Žc póly nukleotid se pak může vystavit různým metodám vysvětlení polynukleotidové sekvence. Tímto způsobem se mohou detekovat mutace polynukleotidové sekvence a mohou se použít při diagnóze a prognóze infekce nebo jejího stádia nebo průběhu nebo serotypu a/nebo klasifikaci 30 infekčního činidla.

Vynález dále popisuje způsob diagnostikování onemocnění, upřednostňují se bakteriální infekce způsobené organizmem Moraxella catarrhalisk který' zahrnuje stanovení ve vzorku z jednotlivce, jako je vzorek tělesného materiálu, zesílenou expresi polynukleotidu. který má sekvenci SEQ ID 35 NO: I, 3. 5, nebo 7. Zesílená nebo zeslabená exprese polynukleotidu BASB020 se může stanovit za použití libovolné z metod, která je dobře známá v oboru pro kvantifikaci polynukleotidu. Touto metodou je například amplifikace, PCR, RT-PCR, ochrana před RNázou. northernovo bletování, spektrometrie a jiné hybridizační metody.

io Diagnostický test podle vynálezu vhodný pro detekci nadměrné exprese polypeptidu BASB020, která se porovnává se vzorkem normální tkáně se může použít při detekci přítomnosti infekce. Metody testů, které se mohou použít pro stanovení množství polypeptidu BASB020 vc vzorku, jsou dobře známy v oboru. Takové metody testů zahrnují radioimunologické testy, testy kompetitivního navázání, analýzu westernovým přenosem, protilátkový sendvičový test, detekci protilá15 tek a test ELISA.

Póly nukleotidy podle vynálezu se mohou použít jako komponenty sad polynukleotidů. přičemž se upřednostňují sady s velmi hustými řadami nebo mřížkou. Tyto souboru s vysokou hustotou je zvláště možné použít pro účely diagnózy a prognózy. Například sada bod, kdy každý obsahuje 50 odlišný gen a dále obsahuje polynuklcotid nebo póly nukleotidy podle vynálezu se může použít při testování sondou tak. že se provede hybridizace nebo amplifikace nukleových kyselin, za použití sond získaných z tělesného vzorku, aby se stanovila přítomnost určité polynukleotidové sekvence nebo příbuzné sekvence u jednotlivce. Taková přítomnost může indikovat přítomnost patogenu. zvláště organizmu Moraxella catarrhalis a může se použít při diagnostikování a/nebo prognóze onemocnění nebo průběhu onemocnění. Preferuje se mřížka obsahující řadu variant polynuklcotidové sekvence SEQ ID NO: 1,3.5 nebo 7.

Protilátky s

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu nebo jejich varianty nebo buňky jc cxprimující se mohou použít jako imunogeny vhodné pro produkci protilátek, které jsou imunospecifické v případě takových polypeptidů nebo polynukleotidů.

ίο V jisté preferovaném provedení vynálezu sc popisují protilátky proti polvpeptidům nebo polvnukleotidům BASB020.

Protilátky vytvořené proti polvpeptidům nebo póly nukleotidům podle vynálezu se mohou získat aplikací zvířeti polypeptidů a/nebo polynukleotidů podle vynálezu nebo fragmentů, které nesou i? epitop. analogů nebo buněk, které je exprimují. Pro tylo aplikaci se postupuje podle rutinního protokolu. Při přípravě monoklonálních protilátek libovolná metoda známá v oboru poskytuje protilátky produkované nepřerušovanou kultivací buněčných linií. Příklady zahrnují různé metody, které sc například popisuji v publikaci Kohler. G. and Milstein, C., Nátuře 256: 195 497 (1975), Kozbor et al„ hnmunology Today 4: 72 (1983). Colc et al, pg. 77-06 in Monoclonal 20 Antibodies and cancer therapy, Alan R. Liss. lne. (1985).

Metody pro přípravu jednořetčzcových protilátek (patent US 4 946 778) se mohou upravit pro produkci jednořetězcových protilátek vůči polvpeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu. Za účelem exprese humanizovaných protilátek, které jsou imunospecifické pro polypeptid nebo 25 polynukleotid podle vynálezu se mohou také použít transgcnní myši nebo jiné organizmy nebo zvířata.

V jiném případě se může pro výběr genů protilátek s vazebnými aktivitami vůči polypeptidů podle vynálezu použít metoda objevení fága s vazebnými aktivitami vůči polypeptidů podle vynálc30 zu, který' vzniká PCR amplifikací V-genů lidských lymfocytů. kde se testuji protilátky proti

BASB020, nebo z naivní knihovny (McCafferty. et al.. (1990), Nátuře 348. 552 554, Marks et al., (1992)). Afinita těchto protilátek se může také zdokonalit například přesouváním řetězce (popisuje v publikaci Clackson et al., (1991) Nátuře 352: 628).

Shora v textu popsané protilátky se mohou použít při izolaci nebo identifikaci klonů, které exprimují polypeptidy nebo polynukleotidy podle vynálezu, aby se mohly čistit polypeptidy nebo polynukleotidy například afin i tni chromatograllí.

Protilátky proti polypeptidů BASB020 nebo polynukleotidů BASB020 se mohou použít při léčbě Li infekcí, zvláště bakteriálních infekcí.

Polypeptidové varianty zahrnují antigenně, epitopem nebo imunologicky ekvivalentní varianty, které tvoří předmětnou věc vy nálezu.

Upřednostňuje se, aby sc protilátky nebo jejich varianty upravily a tím se staly pro jednotlivce méně imunogenni. Jestliže jednotlivec jc člověk, pak se protilátky mohou humanizovat. To znamená. že oblast stanovující komplementaritu nebo oblasti protilátek získaných z hybridomů se transplantovaly do lidských monoklonálních protilátek, například jak sc popisuje v publikaci Jones et ak, (1986), Nátuře 321, 522-525 nebo Tempcst et al., (1991) Biotechnology 9. 266-273.

Antagonisti a agonisli testy a molekuly

Polypeptidy se polynukleotidy podle vynálezu se mohou také použít k odhadu schopnosti navázáni malých molekul substrátů a ligandů, například buňky, přípravky, kterc neobsahuj i buňky, 5? chemické knihovny a směsi přírodních produktů. Tyto substráty a ligandy mohou být přirozené substráty' a lígandy nebo to mohou být strukturální nebo funkční napodobeniny , (popisuje sc v publikaci Coligan et al.. Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991)).

Testovací metody mohou jednoduše měřit navázání sloučeniny na polypeptid nebo polynukleotid nebo na buňky nebo na membrány nesoucí polypeptid nebo polynukleotid nebo fúzní protein polypeptidu způsobem přímého nebo nepřímého značení asociovaného sc sloučeninou. V jiném případě testovací metoda může zahrnovat kompetici se značeným kompetitorem. Dále tyto testovací metody se mohou použít při testování skutečnosti, zda sloučenina je výsledkem signálu vytvořeného aktivací nebo inhibicí polypeptidu nebo póly nukleotidu za použití detekčního systému vhodného pro buňky; které obsahuji polypeptid nebo polynukleotid. Inhibitory aktivace jsou v obecném případe testovány v přítomnosti známého agonisty a pozoroval se účinek agonisty na aktivaci v přítomnosti sloučeniny. Konstitutivné aktivní polypeptid a/nebo konstitutivně exprimované polypeptidy a polynuklcotidy sc mohou použít při testování v případě agonistú nebo inhibitorů v nepřítomnosti agonistú nebo inhibitorů, přičemž sc testuje, zda použití testované sloučeniny vede k inhibicí aktivace polypeptidu nebo póly nukleotidu. Dále testovací metody mohou jednoduše zahrnovat kroky smíchání sloučeniny s roztokem, který obsahuje polypeptid nebo polynukleotid v přítomnosti sloučeniny podle vynálezu za vzniku směsi, přičemž se měří aktivita polypeptidu a/nebo polynuklcotídu BASB020 ve směsi. Aktivita polypeptidu a/nebo polynuklcotidu BASB020 ve směsi se porovnává se standardem. Fúzní proteiny , jako jsou ty vytvořené pro část Fc a polypeptid BASB020. se mohou také použít pro testování s vysokou průchodností pro identifikaci antagonistů polypeptidu podle vy nálezu stejně jako fylogeneticky a/nebo funkčně příbuzné polypeptidy (popisuje se v publikaci D. Bennett et al., T Mol. Rccognitíon. 8: 52-58 (1995) a K. Johanson ct al„ J. Biol. Chem. 270 (16): 9456-9471 (1995)).

Polynuklcotidy, polypeptidy a protilátky, které se váží a/nebo interagují s polypeptidem podle vynálezu se mohou také použít při metodách pro stanovení účinku přidaných sloučenin na produkci mRNA a/nebo polypeptidu v buňkách. Test El JSA se může zkonstruovat tak, aby byl vhodný pro měření množství vylučovaného polypeptidu nebo množství polypeptidu spojeného s buňkou za použití monoklonálních nebo polyklonálních protilátek za použití standardních metod, které jsou dobře známy v oboru. Tento test sc může použít pro objevení činidel, které ínhibují nebo zvyšují produkci polypeptidu (který se také nazývá antagonista nebo agonista) z vhodně upravených buněk nebo tkání.

Vynález dále popisuje způsob testování sloučenin za účelem zjištění, která z nich zesiluje (agonista) nebo blokuje (antagonista) působení polypeptidu nebo póly nukleotidů BASB020, zvláště těch sloučenin, které působí bakteriostaticky a/nebo bakteriocidnč. Způsob stanovení může zahrnovat metodu s vysokou průchodností. Například při vyhledávání agonistú nebo antagonistů se syntetická reakční směs, buněčná část, jako je membrána, buněčný obal nebo stěna nebo jejich izolát obsahující polypeptid BASB020 a značený substrát nebo ligand takového polypeptidu inkubuje v nepřítomnosti nebo v přítomnosti molekuly, která může být agonistou nebo antagonistou BASB020. Schopnost sloučeniny agonizoval nebo antagonizovat polypeptid BASB020 odráží zvýšenou vazebnou aktivitu značeného ligandu nebo sníženou produkci produktu z takového substrátu. Molekuly, které se váží bezdůvodně, to znamená, že indukují účinky polypeptidu BASB020 jsou s velkou pravděpodobností dobrými antagon i sty. Molekuly, které se dobře váží a zvyšují rychlost produkce produktu ze substrátu, zvyšují transdukci signálu nebo zvyšují aktivitu chemického tunelu jsou antagonisty. Detekce rychlosti nebo množství produkce produktu ze substrátu, signální transdukce nebo aktivity chemického tunelu se může zvýšit použitím reportního systému. Reportuí systémy, které se mohou použít, zahrnují například kolorimetrický systém, systém značeného substrátu, který se převádí na produkt, reportu í gen. který je odpovědný za změny aktivity polynukleotidu BASB020 nebo polypeptidu a vazebné testy, které jsou dobře známy v oboru.

Jiným příkladem testu vhodného pro agonistú BASB020 je kompetitivní test, který kombinuje BASB020 a potenciálního agonistú s molekulami vázajícími BASB020. rekombinantní molekuly vázající BASB020, přirozené substráty nebo ligandy nebo napodobeniny ligandů nebo substrátů

- 14CZ 298227 Β6 za podmínek vhodných pro kompetitivní inhibiční test. BASB020 sc muže značit například radioaktivní nebo kolorimetrickou sloučeninou tak. že se muže přesně stanovit počet molekul

BASB020 navázaných na vazebnou molekulu nebo přeměnou na produkt, aby se odhadla účinnost potencionálního antagonisty.

Potencionální antagonisti zahrnující mezi jinými malé organické molekuly, peptidy. polypeptidy a protilátky, které se vážou na polynukleotid a/nebo polypeptid podle vynálezu a tak inhibují nebo vypínají svou aktivitu nebo expresi. Potencionální antagonisté také mohou tvořit malé organické molekuly, peptid. polypeptid, jako jsou příbuzný protein nebo protilátka, které sc váží na stejná místa na vazebné molekule, jako je vazebná molekula, aniž indukuje aktivitu vyvolané BASB020, přičemž brání působení nebo expresi pólypeptidů BASB020 a/nebo polynukleotidů tím žc vyloučí polypeptidy a/nebo póly nukleotidy BASB020 z navázání.

Potencionální antagonisté zahrnují malou molekulu, která váže a obsazuje vazebné místo polypeptid u, přičemž brání navázání buněčných vazebných molekul tak, že dochází k prevenci normální biologické aktivity. Příklady malých molekul zahrnují, ale nejsou omezeny na male organické molekuly, peptidy nebo molekuly podobno peplidům. Další potencionální antagonisté zahrnují antisense molekuly (popisuje se v publikaci Okano. J. Ncurochcin. 56: 560 (1991)), Oligonukleotides as antisense inhibitors of gene expression, CRC Press, Boča Raton. I L (1988)). Preferované potencionální antagonisté zahrnují sloučeniny příbuzné BASB020 a jeho varianty.

Vynález popisuje geneticky manipulované rozpustné fúzní proteiny, které obsahují polypeptid podle vynálezu nebo jeho fragmenty a různé části konstantních oblastí těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM. IgA, IgE), Preferovaným iniunoglobulineni je konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgG I, kde fúze probíhá v pantové oblasti. V určitém provedení vynálezu část FC se může odstranit jednoduše začleněním štěpící sekvence, která se může štěpit krevním srážecím faktorem Xa. Tento vynález popisuje proces pro přípravu těchto fúzních proteinů genetickou manipulací a jejich použití při testováni léků, diagnostikování a terapii. Vynález dále popisuje póly nukleotidy kódující takové fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů se popisuje v mezinárodní patentové přihlášce WO94/29458 a WO94/229I4.

Každá ze zde popsaných polynukleotidových sekvencí sc může použít při zkoumání a vývoji antibakteriálních sloučenin. Kódovaný protein se může po expresi použít jako cíl pro testování antibakteriálních léků. Polynukleotidová sekvence kódující aminoterminální oblasti kódovaného proteinu nebo Sliine Delgarnovy sekvence nebo jiných sekvencí umožňující translaci mRNA se může použít ke konstrukci antisense sekvencí, aby řídily expresi kódující sekvence.

Vynález popisuje použití polypept idu, póly nukleotidu, agonisty nebo antagonisty podle vynálezu, aby interferoval s počáteční fyzikální interakcí mezi patogenem nebo patogeny a eukaryonty, přičemž se upřednostňují savci, hostitelé odpovědní za následnou infekci. Molekuly podle vynálezu se mohou použít při prevenci adheze bakterií, zvláště grainpozitivních bakterií a/nebo gram negativních bakterií na eukaryotní extracelulární matricové proteiny na zařízeních, které se zavádějí na delší dobu, nebo na extracelulární matricové proteiny v ranách. Zvláště preferovaní eukaryonti jsou savci. Dále k blokování bakteriální adheze mezi eukaryonty, eukaryontními. zvláště savčími, cxtracclulárními matricovými proteiny a bakteriálními proteiny BASB020, které zprostředkovávají poškození tkáně a/nebo pro zablokování normální progrese patogeneze při infekcích, které jsou vyvolané jinak než implantací zařízení na delší dobu nebo jinými chirurgickými metodami.

Vynález dále popisuje agonistu a antagonistu BASB020, přednostně baktcriostatické nebo baktericidní agonisty a antagonisty.

Antagonisty a agonisty podle vynálezu se mohou použít například při prevenci, inhibici a/nebo léčbě onemocnění.

- 15CZ 298227 Β6

Vynález dále popisuje monitory polypeptidu podle vynálezu, Mimotop je polypeptidová sekvence podle vynálezu. Mimotop je peptidová sekvence, která je v podstatě podobná přirozenému peptidu (sekvencí nebo strukturou), která je rozeznávána protilátkami, jenž rozeznávají přirozený peptid nebo je schopen tvořit protilátky, které rozeznávají přirozený peptid. když je spojen s vhodným nosičem.

Peptidové mimotopy sc mohou navrhnout pro určité účely adicí, delecí nebo substitucí vyvolaných aminokyselin. Peptidy se pak mohou modifikovat za účelem jednoduší konjugace s proteinovým nosičem. Například se požaduje v případě stejných konjugačních metod, aby zahrnovaly terminální cystein. Navíc sc požaduje v případě peptidu konjugovaných s proteinovým nosičem. aby zahrnoval hydrofobní konec vzdálený od konjugováného konec peptidu tak, že volný nekonjugovaný konec peptidu zůstává spojen s povrchem nosičového proteinu. Peptidy se mohou například změnit tak, aby obsahovaly N-terminální cystein a C-terminální hydrofobní amidovaný ocas. V jiném případě acide nebo substituce D-stcreoizomerní formy jedné nebo více aminokyselin umožňuje vznik derivátu, který' například zvyšuje stabilitu peptidu.

V jiném případě peptidové mimotopy sc mohou identifikovat za použití protilátek, které jsou schopnv sc samy vázat na pólypeptidy podle vynálezu za použití metod, jako jc technologie zobrazující fágy (EP 0 552 267 B1). Tento způsob dává vzniku velkému množství peptidových sekvencí, které napodobují přirozené peptidy a jsou proto schopné vázat se na protilátky proti přirozenému peptidu, ale mohou také sdílet podstatnou sekvenční homologii s přirozeným polypeptidem.

Vakcíny

Vynález popisuje způsob indukce imunologické odezvy u jednotlivců zvláště savců, přičemž se upřednostňují lide, který zahrnuje inokulaci jedinců polynukleotidem BASB020 a/nebo polypeptidem nebo jeho fragmentem nebo jeho variantou, adekvátní při produkci protilátek a/nebo imunitní odezvy Ί buněk, aby ochránily uvedené jedince před infekcí, zvláště bakteriální infekcí, zvláště pak infekcí mikroorganizmem Monixelki calarrhalis. Také sc popisují metody, kdy taková imunologická odezva zpomaluje bakteriální replikaci. Vynález dále popisuje způsob indukce imunologické odezvy u jednotlivce, který' zahrnuje zavedení jednotlivého vektoru, sekvence nebo ribozymu, aby řídil expresi polynukleotidu a/nebo polypeptidu BASB020 nebo jeho fragmentu nebo varianty in vivo za účelem indukovat imunologickou odezvu tak, aby se produkovaly protilátky a/nebo imunitní odezva T buněk zahrnující například T buňky produkující cytokin nebo cytotoxické 1 buňky, aby se chránil uvedený jedinec, přednostně člověk před nemocí ať už onemocnění začalo nebo ještě ne. .leden příklad aplikace genů je jejich zavedení do požadovaných buněk ve formě potahu na částicích nebo jiným způsobem. Takový vektoru nukleové kyseliny může obsahovat DNA, RNA. ribozym, upravenou nukleovou kyselinu, DNA/RNA. komplex DNA-prolein nebo komplex RNA-protein.

Vynález dále popisuje imunologickou kompozici, která když se zavede do jedince, přednostně člověka, je v něm schopna indukovat imunologickou odezvu, dále popisuje indukci imunologické odezvy u takového jedinec proti polynukleotidu a/nebo polypeptidu BASB020, přičemž kompozice obsahuje rckombinantni polynukleotid a/nebo polypeptid BASB020 a/nebo DNA anebo RNA, která kóduje a exprimuje antigen uvedeného polynukleotidu BASB020. jím kódovaný polypeptid nebo jiný polypeptid podle vynálezu. Imunologická odezva se může použít při terapii a profylaxi a může mít formu proti látkové imunity a/nebo buněčné imunity, jako je buněčná imunita pocházející z CTL nebo CD4+ T buněk.

Polypeptid BASB020 nebo jeho fragment se může fúzovat s ko-proteinem nebo s chemickou látkou, která může nebo nemůže sama produkovat protilátky, přičemž je schopna stabilizovat první protein a produkovat fúzovaný nebo modifikovaný protein, který bude mít antigenní a/nebo imunogenní vlastnosti a upřednostňují sc ochranné vlastnosti, l ak fúzovaný rekombinantní pro- 16CZ 298227 B6 tein přednostně dále obsahuje antigenní koprotein, jako je lipoprotein D z organizmu Haemophilus influenzae, což je glutathion-S-transferá/a (GST) nebo beta-galaktozidáza nebo libovolný jiný relativně velký ko-protein, který rozpouští protein a umožňuje jeho produkci a čištění. Koprotein však může působit jako adjuvans ve smyslu toho, že poskytne obecnou stimulaci imunít5 ního systému organizmu, kterému se protein může aplikovat. Ko-protein se může připojit buď k C , nebo N-konci proteinu.

Vynález popisuje kompozice, zvláště pak vakcinační kompozice a metody zahrnující polypeptidy a/nebo póly nukleotidy podle vynálezu a imunomodulační sekvence DNA. jako se popisují m v publikaci Sáto. Y. et al.Science 273: 352 (1996)).

Vynález dále popisuje metody za použití popsaného polynuklcotidu nebo jeho fragmentů, které ukazují, že kódují ncvariabilní oblasti bakteriálních buněčných povrchových proteinů v polynukleotidových konstrukcích užívaných při takových genetických imunizačních experimentech 15 ve zvířecích modelech infekce organizmem Moraxellu calarrhalis. l akové experimenty jsou zvláště použitelné při identifikaci proteinových epitopů, které jsou schopny vyvolat pro fy takt ickou nebo terapeutickou imunitní odpověď. Věří se, že tento přístup umožní přípravu monoklonálních protilátek určité hodnoty. Tyto protilátky se získaly z požadovaného orgánu zvířete které úspěšně odolalo onemocnění nebo u kterého se onemocnění úspěšně vyléčilo, a použily se při 20 vývoji pro fy taktických činidel nebo terapeutické léčby bakteriální infekce, zvláště infekce organizmem Moruxellu calarrhalis, u savců, zvláště lidí.

Vynález dále zahrnuje vakcinační formulaci, která obsahuje imunogenní rekombinantní polypeplid a/nebo polynukleotid podle vynalezu spolu s vhodným nosičem, jako jc farmaceuticky přija25 telný nosič. Protože polypeptidy a polynukleotidy se mohou v žaludku rozložit, upřednostňuje se, aby sc každý aplikoval parenterálně, což zahrnuje například aplikaci podkožně, do svalu, do žíly nebo do kůže. Formulace vhodné pro paren terální aplikaci zahrnuje vodné a nevod né sterilní roztoky vhodné pro zavedení injekcí, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatieke sloučeniny a rozpuštěné látky, které dělají formulaci izotonickou s tělními tekutinami, přičemž se jo upřednostňuje krev jedince a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspendační činidla nebo zahušťovací činidla. Formulace mohou být přítomny v kontejnerech ve formě jednotkové dávky a vícenásobné dávky. Například vc formě zatavených ampulí a zkumavek a mohou se uchovávat v lyofilizované formě, kdy je nutné bezprostředně před použitím přidat pouze sterilní kapalný nosič.

Vakcinační formulace podle vynálc/u může také obsahovat systémy adjuvans. které vyvolávají odezvu typu Ti l 1.

Imunitní odezva se může zhruba rozdělit do dvou kategorií. Je to humorální odezva a odezva 40 zprostředkovaná buňkami (tradičně se charakterizuje protilátkami a buněčným efektorovými mechanizmy ochrany). Tyto kategorie odezvy se definují odezvou typu TH1 (odezva zprostředkovaná buňkami) a odezvou typu TI 12 (humorální odezva).

Extrémní imunitní odezvy typu Tlil sc mohou charakterizovat vytvořením antigenně specific45 kých haplotypovč omezených cytotoxických T lymfocytů a přirozenou odezvou buněk K. V případě myší se odezvy typu THI často charakterizují vytvořením protilátek subtypu IgG2a, zatímco lidské protilátky odpovídají protilátkám typu IgGl. Imunitní odezvy typu TH2 se charakterizují vytvořením širokého rozmezí i zo typ li imunoglobulinu, které zahrnují v případě myší IgGl. IgA a IgM.

Uvažuje se, že hnací síla vzniku těchto typů imunitní odezvy jsou cytokiny. Velké množství cytokinů typu THI má tendenci upřednostňovat indukcí imunitní odezvy zprostředkované buňkami za vznikli antigenů. zatímco velké množství cytokinů typu TH2 má tendenci upřednostňovat indukci humorální imunitní odezvy na antigen.

- 17CZ 298227 B6

Odlišnost imunitní odezvy typu TH1 a TH2 není absolutní. Ve skutečnosti jedinec bude podporovat imunitní odezvu, která se popisuje jako převážně TH1 nebo převážně TH2. Jc však často vhodné uvažovat rodinu cytokinu popsaných v souvislosti s myšími klony T buněk CD4+ve (popisuje se v publikaci Mossměnn, T.R, and Coffmann. R.L. (1989). Tlil a TH2 celíš: different pattems of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Rcvievv of Immunology, 7. p 145-173). Odezvy typu Tlil se spojují s produkcí cytokinu lNE-γ a 1L-2 T-lymfocyty. Jiné cytokiny často přímo spojované s indukcí imunitní odezvy typu THI nejsou produkované T-buňkami, jako II-12. Naopak odezvy typu TH2 se spojují se sekrecí 11-4. II-5. 11-6 a 11.-13.

Je známo, že jisté vakcinační adjuvans jsou zvláště vhodná pro stimulaci cytokinovc odezvy typu THI a TH2. Nejlepší indikátory' rovnováhy TH1:TI 12 imunitní odezvy po vakcinaci nebo infekci zahrnuje přímé měření produkce cytokinu TH1 nebo TI 12 pomocí T lynifocytú in vitro po opětné stimulaci antigenem a/nebo měření poměry proti látkové odezvy, která je specifická pro antigen.

Adjuvans typu TU 1 je adjuvans, které přednostně stimuluje izolované populace T-buněk, aby produkovaly velké množství cytokinu typu Tlil, když jsou opětně stimulovány antigenem in vitro a podporuji vývoj cytotoxických lynifocytú CD8+ a antigenné specifické imunoglobulinové odezvy spojené s ízotypem typu TI 11.

Adjuvans, které přednostně stimulují buněčnou odezvu THI se popisují v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/00153 a WO 95/17209.

Jedno takové adjuvans je 3-de O-acetylovaný monofosforyl-lipid A (3D-MPL). Popisuje sc v GB 2220211 (Ribi). Z chemického pohledu jde o směs 3-de-O-acetylovaného mono fosfory Ilipidu A (3D-MPL) sacylovanými řetězci v poloze 4, 5 nebo 6 a vyrábí se firmou Ribi Immunochem, Montana. Preferovaná forma 3-de-O-acetylovaného monofosforyl-lipidu A sc popisuje v evropském patentu EP 0 689 454 B1 (SrnilhKline Beecham Biologicals SA).

Upřednostňuje se, aby částice 3D MPL byly dostatečně malé, aby se sterilizovaly filtrací přes membránu o velkosti filtru 0,22 mikronů (evropský patent EP 0 689 454).

V jedné dávce je přítomno 10 až 100 pg, upřednostňuje se 25 až 50 pg, 3D-MPL. přičemž andgen je v typickém případě přítomen v rozmezí 2 až 50 pg na jedná dávku.

Jiné preferované adjuvans obsahuje QS21, nctoxické frakce získané z kúry Quillaja Saponaria Molina čištěné HPLC. Mohou se smíchat s 3-de-O-acetylováným monofosforyl-lipidem A (3D-MPL) spolu s nosičem.

Způsob produkce QS21 se popisuje z patentu US 5 057 540.

formulace obsahující nereaktogenní adjuvans QS21 se popisují v dřívějším stavu techniky (WO 96/33739). Ukázalo se, že takové formulace obsahující QS21 a cholesterol jsou úspěšně stimulující adjuvans THI, když jsou tvořeny spolu s antigenem.

Další adjuvans, která jsou preferovanými stimulátory buněčné odezvy zahrnují iinunomodulační oligonukleotidv například nemetylované sekvence CpG, jak se popisuje v publikaci WO 96/02555.

Také sc uvažuje, že kombinace různých stimulačních adjuvans THI. které se popisují shora v textu, je stimulátorem buněčné odezvy THI. QS21 sc může tvořit spolu s 3D-MPL. Poměr QS21:3D-MPL jc v typickém případě 1:10 až 10:1, upřednostňuje se 1:5 až 5:1 a často 1:1. Preferované rozmezí optimální synergic je 2,5:1 až 1:1 3DMPLQS21.

- 18CZ 298227 B6

Nosič se také přednostně vyskytuje ve vakcinační kompozici podle vynálezu. Nosič muže být olej ve vodní emulzi nebo hliníková sůl. jakoje fosforečnan nebo hydroxid hlinitý.

Preferované emulze oleje ve vodě obsahuje metabolizovaný olej, jako je squalen. alfa tokoferol a Tween 80. Zvláště se preferuje, když antigeny ve vakcinační kompozici podle vynálezu se kombinují $ QS21 a 3D-MPL. Navíc olej ve vodní emulzi může obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikapry lín.

V typickém případě se lidem aplikuje dávka QS21 a 3D-MPL v rozmezí 1 až. 200 pg. 10 až 10 pg, upřednostňuje se 10 až 50 pg. V typickém případě olej ve vodě bude obsahovat 2 až 10 % skvalenu. 2 až 10% alfa-tokofcrolu a 0,3 až 3 % tweenu 80. Upřednostňuje se. aby poměr skvalen : alfa-tokoferol byl roven nebo menší než. 1, protože tak sc tvoří stabilnější emulze. Spán 85 také může být zastoupen 1%. V některých případech může být výhodné, že vakcíny podle vynálezu budou obsahovat stabilizátor.

Emulze netoxických olejů ve vodě obsahující netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například Tween 80 ve vodném nosiči. Vodný nosič může například být fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem.

Zvláště silná formulace adjuvans zahrnuje QS21, 3D-MPL a tokoferol. který tvoří ve vodě emulzi, jak se popisuje v dokumentu WO 95/17210.

Vynález dále popisuje póly valen tni vakcinační kompozici, která obsahuje vakcinační formulaci podle vynálezu v kombinaci s jinými antigeny, zvláště antigeny. které jsou použitelné pro léčbu rakoviny, autoimunitního onemocnění a příbuzných stavů. Taková póly valen tni vakcinační kompozice může zahrnovat adjuvans indukující odezvu TH-1, jak sc popisuje shora v textu.

Zatímco vynález popis jisté polynukleotidy a polypeptidy BASB020. rozumí se. že to pokrývá fragmenty přirozeně se vyskytujících polypeptidu a polynukleotidů a podobných polypeptidu a polynukleotidů sadící, delecí nebo substitucí, které v podstatě neovlivňují imunogenní vlastnosti rekombinantních polypeptidu nebo polynukleotidů.

Kompozice, sady a aplikace

Vynález popisuje kompozice obsahující polynukleolid a/nebo polypeptid BASB020 vhodný pro aplikaci do buňky nebo do více buněčného organizmu.

Vynález se také popisuje kompozice, které obsahují zde popsaný póly nukleotid a/nebo polypeptidy nebo jejich agonisty nebo antagonisty. Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu sc mohou použít v kombinaci s nesterilním nebo sterilním nosičem nebo nosiči pro použití s buňkami. tkáněmi nebo organizmy, jako je farmaceutický nosič vhodný pro aplikaci jedinci. Takové kompozice obsahují například doplňky do kultivačního média nebo terapeuticky účinné množství polypeptidu a/nebo polynukleotidů podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ekcipient. Takové nosiče mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrózu, vodu, glyccrol, etanol a jejich kombinaci. Sloučenina by měla být vhodná pro zvolený mód aplikace. Vynález se dále popisuje diagnostickou a farmaceutickou sadu, která obsahuje jeden nebo více kontejnerů naplněných jedním nebo více složkami shora uvedené kompozice podle vynálezu.

Polypeptidy, polynukleotidy a jiné sloučeniny podle vynálezu se mohou použít samotné nebo vc spojení s jinými sloučeninami, jako jsou terapeutické sloučeniny.

Farmaceutické kompozice se mohou aplikovat libovolným účinným a vhodným způsobem například povrchovou, orální, anální, vaginální, intravenózní, intrapcritoncální, intramuskulární. podkožní, intranasální nebo intradermální aplikací.

- 19CZ 298227 B6

V případě terapie nebo jako pro fy! akt ické aktivní činidlo se může aplikovat jedinci injekcí. Může se například vyskytovat ve formě sterilní vodné disperze, přednostně izotonickc.

? Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice, které obsahují terapeuticky účinné množství polypeptidu a/nebo polynukleotidu. jako je například rozpustná forma polypeptidu a/nebo pólynukleotidu podle vynálezu, agomstický nebo antagonistický peptid nebo sloučenina s malými molekulami v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ekcipientem. Takové nosiče zahrnují ale nejsou omezeny na fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrózu. io vodu, glyccrol, ctanol a jejich kombinaci. Vynález dále popisuje farmaceutickou sadu, která obsahuje jeden nebo více kontejnerů naplněných jednou nebo více složkami kompozic podle vynálezu. Polypeptidy. polynukleotidy a jiné sloučeniny podle vynálezu se mohou použít buď samotné, nebo vc spojení s jinými sloučeninami, jako jsou terapeutické sloučeniny,

Kompozice se budou upravovat pro určitý způsob aplikace, například pro systémový nebo orální způsob aplikace. Preferované způsoby systémové aplikace zahrnují například injekci, v typickém případě intravenózní injekci. Mohou sc také použít jiné způsoby aplikace injekcí, jako jc podkožní. intramuskuIární nebo intraperitoneální. Alternativní způsoby pro systémovou aplikaci zahrnují transmukozální a transdermální aplikaci za použití penctrantů. jako jsou žlučové sole 20 nebo kyselina fusidová nebo jiné detergenty, Navíc polypeptid nebo jiné sloučeniny podle vynálezu se mohou tvořil jako střevní nebo kapsulované formulace, je možné použít orální aplikaci. Aplikace takových sloučenin může být také povrchová a/nebo lokalizovaná, vc formě masti, past, gelů, roztoků, prášku a podobně.

2? V případě aplikace savcům a zvláště lidem se očekává, že denní dávka aktivního činidla je buď 0,01 mg/kg až 10 mg/kg, v typickém případě přibližně 1 mg/kg. Lékaři musí stanovit optimální dávku, která je vhodná pro jedince a bude kolísat s věkem, hmotností a bude odpovídat určitému jedinci. Shora uvedené dávky jsou příklady průměrného příkladu. To muže být samozřejmě ojedinělý případ. Výhodné jsou vyšší nebo nižší rozsahy dávek a jsou také v rozsahu vy nálezu.

Rozsah požadované dávky závisí na volbě peptidu. způsobu aplikace, podstaty formulace, podstaty stavu jednotlivce a úsudku lékaře. Vhodné dávky jsou však v rozmezí 0,1 až 100 pg/kg jednotlivce.

Vakcinační kompozice je v běžném případě v injektovatclné formě. Běžné adjuvans se může použít ke zvýšení imunitní odezvy. Vhodná jednotková forma pro vakcinaci je 0,5 až 5 pg/kg antigenu a taková dávka se přednostně aplikuje 1 až 3 krát s intervalem 1 až 3 týdny. V uvedeném rozmezí dávky se nepozorovaly u sloučenin podle vy nálezu, které budou bránit jejich aplikaci vhodným jedincům, žádné nežádoucí toxické účinky.

Velké rozmezí potřebných dávek je nutné očekávat u různých dostupných sloučenin a v případě lišících sc účinností způsobu aplikace. Například v případě orální aplikace se bude očekávat, žc jsou nutné vyšší dávky, než v případě intravenózní injekce. Různé další dávky se mohou nastavit za použití standardních empirických způsobů optimalizace, jak je dobře známo v oboru.

Databáze sekvencí, sekvence na hmotném médiu a algoritmy

Polynuklcotidovc a polypeptidové sekvence tvoří hodnotný zdroj informací vhodný pro stanovení jejich dvou až třírozměrné struktury a pro identifikaci dalších sekvencí s podobnou homologií. 50 Tyto přístupy jsou umožněny nej jednodušším způsobem tak, že se sekvence uchovávají na médiu, které je možno zpracovat na počítači a pak je možné tyto data použít v programu struktur známých makromolekul nebo při vyhledávání v databázi sekvenci za použiti známých vyhledávacích nástrojů, jako je program GCG.

-20CZ 298227 B6

Vynález dále popisuje způsoby vhodné pro analýzu charakterů sekvencí nebo pruhů sekvencí, zvláště genetických sekvencí nebo kódovaných proteinových sekvencí. Preferované metody sekvenční analýzy' zahrnují například metody analýzy sekvenční homologie. jak jc analýza podobnosti a shody, analýza DNA a RNA a analýza struktury proteinu, analýza uspořádání sekvence, kvadistická analýza, analýza sekvenčního motivu, stanovení otevřeného čtecího rámce.

vyvolání bází nukleových kyselin, analýza použití kodonu, trimování bází nukleové kyseliny a analýza píku sekvenčního chromatogramu.

Metoda založená na použití počítače se používá pro stanovení homologie. Tento způsob obsahuje io kroky poskytující první polynukleotidovou sekvenci obsahující kroky poskytující první polynukleotidovou sekvenci obsahující sekvenci póly nukleotidu podle vynálezu na mediu, které je možné zpracovat na počítači a je možné pozorovat alespoň jeden druhý póly nukleotid nebo polypeptidovou sekvenci za účelem identifikace homologie.

i? Metoda založená na použití počítače se používá pro stanovení homologie, přičemž uvedená metoda zahrnuje: získání první polypeptidové sekvence, která obsahuje sekvenci polypeptidu podle vynálezu na médiu, jenž je možné zpracovat na počítači a pozorovat uvedenou první polypeptidovou sekvenci s alespoň jednou další polynukleotidou nebo polypeptidovou sekvencí za účelem identifikovat homologii.

Definice

Termín „shoda“ znamená vztah mezi dvěma a více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěma a více polynukleotidovými sekvencemi, jak se stanoví porovnáním sekvencí. Termín „shoda“ 25 také znamená stupeň sekvenční příbuznosti mezi polypeptidovou a polynukleotidovou sekvencí.

jak se stanoví párováním mezi pruhy takových sekvencí. Termín „shoda“ se může vypočítat známou metodou, která se popisuje v publikaci Computational Molecular Biology. Lesk, A.M., ed. Oxford University Press, Nevv York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomc Projects, Smith, D. W„ ed„ Academie Press, New York, 1993, Computcr Analysis of Sequence Data. 30 Part 1, Griffln, Λ.Μ., and Griffin, FLG„ cds„ Human Press, New Jerscy. 1994, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G„ Academie Press, 1987 a Sequence Analysis Primer, Gibskov, M„ and Devereux, J., eds. M. Stockton Press, New York, 1991 a Carillo. IL, and Lipman. D,, SIAM ,L Applied Math„ 48: 1073 (1988). Metody pro stanovení shody jsou kodifikovány veřejně dostupnými počítačovými programy. Metody zpracování a počítači slouží pro 35 stanovení shody mezi dvěma sekvencemi, které zahrnují ale nejsou omezeny na program GAP v programu GCG (Devereux. J. et al„ Nucleic Acíds Research 12(1): 387 (1984)). BLASTP, BLASTN (AltschuL S.F. et al., J. molcc. Biol. 215: 403—410 (1990) a FASTA (Pearson and Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85. 244-2448 (1988)). Program BLAST je veřejně přístupný u firmy NCB1 a jiných zdrojů (BLAST Manual, AltschuL S„ et al„ NCB] NLM N1H Bethesda, 40 ND 20894. AltschuL S. et al„ J, Mol. Biol. 215. 403^410 (1990). Pro stanovení shody jc možné také použít Smith Waterman algoritmus.

Parametry pro porovnání polypeptidové sekvence zahrnují:

Algoritmus: popisuje se v publikaci Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)

Srovnávací matrice: BLOSSUM62 (popisuje se v publikaci HenikoíT and Flenikoff. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919(1992) ‘ prodleva: 8 délka prodlevy: 2

Program použitelný pro tyto parametry je dostupný jako program ,.gap u firmy Genetics Computer Group, Madison Wl. Dříve v textu uvedené parametry jsou základními parametry pro porovnání peptidu.

Parametry pro porovnání polypeptidové sekvence zahrnují:

Algoritmus: popisuje se v publikaci Needlcman and Wunsch. J. Mol. Biol. 48: 443—453 (1970)

Srovnávací matrice: BLOSSUM62 (popisuje se v publikaci Henikoff and Henikoff, Proč. Nati, io Acad. Sci. USA. 79: 10915-10919 (1992) ‘ prodleva: 8 délka prodlevy:

Program použitelný pro tyto parametry jc dostupný jako program ..gap u firmy Genetics Computer Group. Madison WL Dříve v textu uvedené parametry jsou základními parametry pro porovnání peptidů.

2o Parametry pro porovnání polypeptidové sekvence zahrnují:

Algoritmus: popisuje se v publikaci Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443Q53 (1970)

Srovnávací matrice: párování = + 10, nesprávné párování - 0 prodleva: 508 délka prodlevy: 3

Program použitelný pro tyto parametry je dostupný jako program ..gap“ u firmy Genetics Computer Group, Madison WL Dříve v textu uvedené parametry jsou základními parametry' pro 30 porovnání peptidů.

Preferovanými významy pro termín „shoda“ v případě póly nukleotidů a póly peptidů jsou uvedeny v odstavcích (1) a (2) dále v textu.

(1) Provedení polynukleotidu dále zahrnuje izolovaný polynukleotid, který obsahuje polynukleotidovou sekvenci, jenž vykazuje alespoň 50, 60, 70, 80. 85. 90, 95. 97 nebo 100% shodu s referenční sekvencí SEQ ID NO: 1, kde uvedená polynukleotidová sekvence může být shodná s referenční sekvencí SEQ ID NO: 1 nebo může zahrnovat jisté celé číslo nukleotidových změn při porovnání s referenční sekvencí, kde uvedené změny se vybraly ze skupiny obsahující alespoň jednu nukleotidovou deleci, substituci, která zahrnuje tranzici nebo tranzverzi nebo inzerci a kde se mohou uvedené změny objevit v 5* a 3' terminální poloze referenční nukleotidové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito terminálními polohami, rozmístěnými bud'jednotlivě mezi nukleotidy referenční sekvence, nebo v jedné nebo více nepřerušovaných skupin v referenční sekvenci a kde uvedený počet nukleotidových změn sc stanoví násobením celkového počtu nukleotidů v sekven4? ci SEQ ID NO: I celým číslem, které se definuje procento shody, děleno 100 a pak se získané číslo odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů a sekvencí SEQ ID NO: 1 nebo n_n < x„ - (x_n x y).

kde symbol n_n znamená počet nukleotidových změn, x_n jc celkový počet nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 1. symbol y je 0,50 v případě 50 %. 0.60 v případě 60 %, 0,70 v případě 70 %, 0,8 v případě 80 %, 0.85 v případě 85 %, 0,90 v případě 90 %. 0.95 v případě 95 %, 0,97 v případě 97 % nebo 1.00 v případě 100 % a x je symbol násobení a výsledná hodnota x_lt ay, která není celé číslo jc zaokrouhlena dolů na nejbližší celé číslo dříve než se odečte od hodnoty symbo55 lu x_n. Změny polynuklcolidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID NO: 2 může dát vzniku

- 22 CZ 298227 B6 nesmyslné nebo v rámci posunuté mutaci v této kódující sekvenci a tím se změní polypeptid kódovaný takovým to změněným polynukleotidem.

Polynukleotidová sekvence podle vynálezu muže být shodná s referenční sekvencí SEQ ID NO: 1. Shoda muže být 100% nebo sekvence může zahrnovat až jisté celé číslo změn v nuklcotidové kyselině ve srovnání s referenční sekvencí tak. že procento shody je menší než 100% shoda, lakové změny se vybraly ze skupiny obsahující alespoň jednu deleci nukleové kyseliny, substituci zahrnující tranzici a tranzverzi nebo inzerci a kde se na 5' nebo 3' konci nebo kdekoliv mezi těmito terminál ním i polohami referenční polynukleotidové sekvence mohou objevit uvedené změny. Tyto změny mohou být jednotlivě rozsety mezi nukleovými sekvencemi v referenční sekvenci nebo mohou tvořit nepřerušované skupiny. Počet změn v nukleové kyselině pro dané procento shody se může stanovit násobením celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 1 celým číslem, které se definuje procento shody, děleno 100 a pak se získané číslo odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: I nebo:

n_n < x_n - (x_t1 x v).

kde symbol η,_Ί znamená počet nukleotidovyeh změn. x_ri je celkový počet nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 1. symbol Y je 0.70. v případě 70 %. 0,8 v případě 80 %, 0,85 v případě 85 %, atd. a x je symbol násobení a výsledná hodnota x₍₁ a y. která není celé číslo je zaokrouhlena dolů na nej bližší celé číslo dříve než se odečte od hodnoty symbolu x„.

(2) Provedení polypeptidu podle vynálezu zahrnuje izolovaný polypeptid, který vykazuje alespoň 50, 60, 70, 80, 85, 90. 95. 97 nebo 100% shodu s polypeptidovou referenční sekvencí SEQ ID NO: 2. kde uvedená pólypeptidová sekvence může být shodná s referenční sekvencí SEQ ID NO: 2 nebo může zahrnovat až jisté celé číslo změn aminokyselin ve srovnání s referenční sekvencí, kde uvedené změny se vybraly zc skupiny zahrnující alespoň jednu deleci aminokyseliny, substituci zahrnující konzervativní nebo nckonzervativni substituci, nebo inzerci a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v N- nebo C-terminálních polohách referenční polypeptidové sekvence nebo libovolně mezi těmito terminálními polohami roztroušené jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci a kde uvedený počet změn aminokyselin sc stanoví násobením celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 2 celým číslem, které se definuje procento shody, děleno 100 a pak se získané číslo odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo:

n_a < x_;1 - (x_:i x y), kde symbol n_a znamená počet změn aminokyselin. x_a jc celkový počet aminokyselin v sekvenci SEQ ID NO: 2. symbol y je 0,50 v případě 50 %. 0,60 v případě 60 %, 0.70 v případě 70 %, 0,8 v případě 80. 0,85 v případě 85 %, 0,90 v případě 90 %, 0,95 v případě 95 %, 0.97 v případě 97 % nebo 1,00 v případě 100 % a x jc symbol násobení a výsledná hodnota symbolu x_a a y, která není celé číslo je zaokrouhlena dolů na nejbližší celé číslo dříve než se odečte od hodnoty symbolu x._r

Polypeptidová sekvence podle vynálezu může být shodná s referenční sekvenci SEQ ID NO: 2. Shoda může být 100% nebo sekvence může zahrnoval až jisté celé číslo změn v nukleové kyselině ve srovnání s referenční sekvencí tak. že procento shody je menší než 100% shoda. Takové změny se vybraly ze skupiny obsahující alespoň jednu deleci nukleové kyseliny, substituci zahrnující konzervativní nebo nckonzervativni substituci nebo inzerci a kde se na 5' nebo 3' konci nebo kdekoliv mezi těmito terminálního polohami referenční polynukleotidové sekvence mohou objevit uvedené změny. Tyto změny mohou být jednotlivě rozsety mezi nukleovými sekvencemi v referenční sekvenci nebo mohou tvořil nepřerušované skupiny. Počet změn v nukleové kyselině pro dané procento shody se může stanovil násobením celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 2 celým číslem, které se definuje procento shody, děleno 100

-23 CZ 298227 Β6 a pak sc získané číslo odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID

NO: 2 nebo:

n_;1 < x_;i - (x_a x y), kde symbol n_a znamená počet změn aminokyselin, x_a je celkový počet aminokyselin v sekvenci SEQ ID NO: 2, symbol y je 0.50 v případě 50 %. 0.60 v případě 60 %, 0,70 v případě 70 %. 0.8 v případě 80 %, 0,85 v případě 85 %, 0.90 v případě 90 %, 0,95 v případě 95 %, 0.97 v případě 97 % nebo 1.00 v případě 100 % a x jc symbol násobeni a výsledná hodnota symbolu x_a a y. která není celé číslo je zaokrouhlena dolů nebo nejbližší celé číslo dříve než se odečte od hodnoty symbolu x_a.

n_a < x_a - (x_a x y), kde symbol n_a znamená počet změn aminokyselin, x_;l jc celkový počet aminokyselin v sekvenci SEQ ID NO: 2, symbol y jc 0,50 v případe 50 %. 0,60 v případě 60 %, 0,70 v případě 70 %. 0,8 v případě 80 %, 0.85 v případě 85 %. 0,90 v případě 90 %, 0.95 % v případe 95 %. 0,97 v případe 97 % nebo 1,00 v případě 100 % a x je symbol násobení a výsledná hodnota symbolu x_a a y. které není celé číslo je zaokrouhlena dolů na nejbližší celé číslo dříve než se odečte od hodnoty symbolu x_;i.

Termín „jedinec” znamená organizmus, zvláště více buněčných cukaryont, který zahrnuje metazoický organizmus, savce, ptáka, skot, opice, primáta a člověka.

Termín ..izolovaný znamená změněný ..člověkem ze kterého přirozeného stavu, to znamená, jestliže se vyskytuje v přírodě, je upraven nebo vyjmut z jeho původního prostředí nebo obojí. Například polynukleotid nebo polypeptid, který se přirozeně vyskytuje v živém organizmu se nepovažuje za „izolovaným ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený od okolního materiálu. který ho obklopuje v jeho přirozeném stavu se nazývá „izolovaný. Polynukleotid nebo polypeptid, který se zavede do organizmu transformací, genetickou manipulací nebo libovolnou metodou rekombinace se považuje za „izolovaným dokonce je-li přítomen v uvedeném organizmu, ať už uvedený organizmus je živý nebo neživý.

Termín „polynuklcotidy znamená polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, který může být neupravená RNA nebo DNA nebo upravená RNA nebo DNA zahrnující jedno- nebo dvouřetězeovou oblast.

Termín „varianta znamená polynukleotid nebo polypeptid, který' sc liší od polynukleotidu nebo polypeptidu, ale zachovává si podstatné vlastnosti. Typická varianta polynukleotidu se liší svou nukleotidovou sekvencí od jiného referenčního polynukleotidu. Změny v nukleotidové sekvenci variant mohou nebo nemohou měnit aminokyselinovou sekvenci polynukleotidu kódovaného referenčním polynuklcotidem. Nukleotidové změny mohou být výsledkem substitucí, adicí, dclecí. fůzí a zkrácení aminokyselin v polypeptidu kódovaném referenční sekvencí, jak se popisuje dále v textu. Typická varianta polypeptidu se liší aminokyselinovou sekvencí od jiného referenčního polypeptidu. V obecném případě se rozdíly omezují na sekvence referenčního polypeptidu a varianta jc velmi podobná a v mnoha oblastech identická. Varianta a referenční polypeptid sc muže lišit aminokyselinovou sekvencí jednou nebo více substitucemi, adicemi, delecemi v libovolné kombinaci. Substituovaný nebo začleněný aminokyselinový zbytek může nebo nemůže být kódován genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polypeptidu sc může vyskytovat v přírodě, jako alelová varianta nebo může být variantou, která se v přírodě nevyskytuje. Varianty polynukleotidu a polypeptidu. které sc v přírodě nevyskytují sc mohou připravit metodou mutageneze nebo přímou syntézou.

Termín „onemocnění znamená libovolný druh onemocnění způsobené bakteriální infekcí. Mezi tato onemocnění patří například zánět středního ucha u kojenců a dětí, zápal plic u starých lidí.

-24C.7. 298227 B6 sinusitida, nosokomiální infekce a invazivní onemocnění, chronicky zánět středního ucha spojený se ztrátou sluchu, akumulaci tekutiny vc středním uchu, poškozením sluchového nervu, oddálení začátku mluvení, infekce horních cest dýchacích a zánět středního ucha.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I: Sek véno vání sekvence DNA genu BASB020 /organizmu Moraxella caiarrhalis io kmen ATCC 43617 za účelem zjištěni a potvrzení uvedené sekvence.

Sekvence SEQ ID NO: 1 genu BASB020 se poprvé objevila v databázi lncyte PalhoSeq. která obsahuje neukončenou genomovou sekvenci DNA organizmu Moraxella caiarrhalis kmen ATC 43617 (který se také označuje jako kmen Mc2931). Translace polynukleotidové sekvence 15 BASB020 zobrazené v SEQ ID NO: 2 ukázala podstatnou podobnost (36% shody v přesahu.

který obsahuj 227 aminokyselin) s hetnolyzinovým proteinem TlyC organizmu Serpzulina hyodysenleriae.

Sekvence genu BASB020 se dále potvrdila experimentálně. Pro tyto účely se genomová DNA 20 extrahovala z 1O¹⁰ buněk organizmu Moraxella caiarrhalis (kmen ATCC 43617) za použití sada vhodného pro extrakci genomové DNA Qiagen (firma Qiagen Gmbh) a 1 pg tohoto materiálu se podrobil amplifikaci pomocí PCR za použití primerů E4578la (5-ATCC TGA Α ΓΑ AAA CCG AGT G-3^f) (SEQ ID NO: 9) E475782a (5'- GAC ATT GGC CGC AAC A TG C-3') (SEQ ID

NO: 10). Tento produkt PCR se může čistit na zařízení Biorobot 9600 (Quigen GmbH) a DNA se 25 sekvenuje za použití sady „Big Dye Cyelc Sequencing kit“ (od firmy Pcrkin-Elmer) a sekvenátor

DNA AB1 377/PRISM. Sekvenování DNA sc provedlo na obou řetězcích s redundancí 2 a sekvence plné délky a uspořádala za použití software Scquencher^IM (Applied Biosystcms). Výsledná sekvence DNA se může stál 100% shodnou se SEQ ID NO: 1.

w

Příklad 2: Analýza proměnlivosti genu BASB020 mezi několika kmeny organizmu Moraxella caiarrhalis

2A: Analýza délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Genomová DNA se extrahovala z 16 kmenů organizmu M. caiarrhalis (uvedených v tabulce č. I). jak se popisuje dále v textu. Bakterie M. caiarrhalis se nanesly na plotny s BHI agarem za účelem získání jednotlivých kolonií a kultivovaly se přes noc při teplotě 37 °C. Izolovaly se tři nebo čtyři jednotlivé kolonie a použily se k inokulaci přibližné 1,5 ml kultivační půdy BHI 40 (infúze z mozku a srdce), které se nechaly růst přes noc v inkubátoru za stálého míchání při přibližně 300 otáčkách za minutu při teplotě 37 °C. Erlcnmeyerovy nádoby o objemu 500 ml, které obsahují přibližně 150 ml půdy BHI, se inkubovaly po dobu přibližně 12 až 16 hodin při teplotě 37 °C v inkubátoru za stálého míchání 175 ot./inin, za vzniku buněčné hmoty vhodné pro izolaci DNA. Buňky se shromáždily centrifugací na rotoru Servali GSA při přibližně 2000 x g po i? dobu 15 minut při teplotě místnosti. Supernatant se odstranil a buněční pelet sc suspendoval v přibližně 5 ml sterilní vody. Přidal se stejný objem lyzačního pufru (200 mM Nad, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCI. pl I 8.0. 0.5 % (hmotn./objem), SDS, 0.5 % (objem) 2-merkaptoetanolu a 250 pg/ml proteinázy K) a buňky se suspendovaly za slabého míchání a rozmělnění. Buněčná emulze se inkubovala po dobu přibližně 12 hodin při teplotě 50 °C, kdy se lyžovaly buňky 50 a uvolnila se chromozomální DNA. Proteinový materiál se srážel přidáním 5 ml saturovaného

NaCI (koncentrace je přibližně 6 M vc sterilní vodě) a centrifugace se uskutečnila při 5500 x g na rotoru Sorvall SS34 při teplotě místnosti. Chromozomální DNA sc srážela z vyčeřeného supernatantu přidáním dvou objemů 100 % etanolu. Srážená DNA se shromáždila a promyla se za mírného míchání v malém objemu 70% roztoku etanolu. Čištěná chromozomální DNA se suspendo55 vala ve stabilní vodě a nechala se rozpustit přes noc při teplotě 4 °C za mírného kolébání, Kon-25CZ 298227 B6 centracc rozpuštěné DNA se stanovila spektrofotometrickv při vlnové délce 260 nm za použití extinkčního koeficientu 1,0 a odpovídá přibližně hodnotě 50 pg/ml.

tento materiál se dále amplifikovat za použití PCR amplifikace s olygonukleotidy MC -IIly35 BamF(5^f~AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC A TG CGT GG Γ CIT AGG CG I

TGG TI A TCC ACG G-3') (SEQ ID NO: 1 I) a MC-1 Ily3-SalRC (5-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA I TC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG-3') (SEQ ID NO: 12). Odpovídající amplikon genu BASB020 se nezávisle vystavil hydrolýze za použití restrikčních enzymů (AciL Alul, Hphl, Msel Nalil, Tsp5t)91) a restrikční produkty se ío separovaly elektrofbrézou a agarózovém a póly akry lamidovcm gelu za použití standardních postupů molekulární biologie, které sc popisují v publikaci ..Molecular Clonning. a Laboratory Manual, Second Edition. Eds.: Sambrook, Fritsch and Maniatis. Cold Spring Harbor press 1989. Fotografie výsledných elektroforctických gelů jsou zobrazeny na obrázku č. 1. V případě každého kmene sc vyhodnocovaly a kombinovaly se paterny RFLP odpovídající 6 restrikčním enzy15 nuím. Pak se definovaly skupiny kmenů, které sdílí shodnou kombinaci patcrnů RFLP. Za použití uvedených metod kmeny testované v této studii spadají do 6 gcnomových skupin (skupina 1: Mc2904, Mc2905. Mc2906. Me2969; Skupina 2; Mc2907, Mc29l3· Skupina 3: Mc2908, Mc2909. Mc2931. Mc2975: Skupina 4: Mc29IO, Mc2912, Mc2956; Skupina 5: Mc29l 1: Skupina 6: Mc2926). Tato data podporují skutečnost, že organizmus Moraxella catarrhalis 2d používaný v této studii vykazuje rozdílnost v nukleotidové sekvenci genu BASB020.

2B: Sekvenování DNA u jiných kmenů.

Kmen ATCC 43617 (Mc2931) užívaný pro stanoveni sekvence BASB020 se klasifikoval pomocí 25 RFLP ve skupině číslo 3. Za použití experimentálních postupů, jak sc popisuje v příkladu 1, se také stanovila sekvence genu BASB020 v případě reprezentantů tří jiných RFLP genoinových skupin kmenů organizmu Moraxella catarrhalis (skupina 1: Mc2969, skupina 2: Mc29 ] 3 a skupina 4: Mc29l2), Polynukleotidové sekvence genu BASB020 kmene Mc2912. Mc2913 a Mc2969 jsou zobrazeny v SEQ ID NO; 3, 5 a 7. Tyto polynukleotidové sekvence se přeložily 30 do aminokyselinových sekvencí, které jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 4. 6 a 8. Za použiti programu MegAlign ze souboru programů DNA STAR Lasergenc se uskutečnilo vícenásobné uspořádání polynuklcotidových sekvencí SEQ ID NO: I , 3, 5 nebo 7 a jc zobrazeno na obrázku č. 2. Porovnání shody párování je shrnuto v tabulce č. 2, což naznačuje, že sekvence čtyř nukleotidových genů BASB020 jsou všechny podobné se stupněm podobnosti vyšším než 99 %. Za použití 35 stejného programu se provedlo vícenásobná uspořádání polypeptidových sekvencí SEQ ID NO:

2, 4. 6 a 8 a je zobrazeno na obrázku č. 3. Porovnání shody párování je shrnuto v tabulce č. 3. což naznačuje, že čtyři sekvence proteinu BASB020 jsou všechny podobné se stupněm podobnosti rovným nebo vyšším než 99 %.

-26CZ 298227 B6

Tabulka č. 1: Rysy kmenů organizmu Moraxella catrrhalis užívaných v léto studii

kmen	izolovaný ve státě	z
Mc2904	USA	tympanocentéza
Mc2905	USA	tympanocentéza
Mc2906	USA	tympanocentéza
Mc2907	USA	tympanocentéza
Mc2908	USA	akutní otitidová tympanocentéza
Mc2909	USA	tympanocentéza
Mc2910	USA	tympanocentéza
Mc2911	USA	akutní otitidová tympanocentéza
Mc2912	USA	akutní otitidová tympanocentéza
Mc2913	USA	akutní otitidová tympanocentéza
Mc2926	USA	tympanocentéza
Mc2931/ATCC	USA	transtrachealni aspirát
Mc2956	Finsko	tekutina ze středního ucha
MC2960	Fisnko	tekutina ze středního ucha
Mc2969	Norsko	nasofaryng (faryngitida- rinitida)
Mc2975	Norsko	nasofaryng (rinitida)

Tabulka č. 2: Shody párů polynukleotidových sekvencí BASB020 (vyjádřeno v %)

	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 1	99,5	99,2	99,3
SEQ ID NO: 3		99,6	99,3
SEQ ID NO: 5 ^Ί			99,4

-27CZ 298227 B6

Tabulka č. 3: Shody párů polypcplidových sekvencí BASB020 (vyjádřeno v %)

	SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: S
SEQ ID NO: 2	99, 6	99,6	100
SEQ ID NO: 4		100	99, 6
SEQ ID NO: 6			99,6

Příklad č. 3: Konstrukce plazmidu vhodného pro expresi rekombinanlní BASB020

A. Klonováni BASB020

Restrikční místa BamHl a Suli zavedené do přímého (SEQ ID NO: 11) a reverzního (SEQ ID NO: 12) amplifikačního primerů umožňuje přímé klonování produktu PCR o velikosti 504 bp do volně dostupného expresivního plazmidu v E. coli pQE30 (QiaGen. nesoucí rezistenci na ampicilin) tak, že zralý protein BASB020 se muže exprimovat jako fúzní protein obsahující tag aílniiní chromatografie (His)6 na N-konci. Produkt PCR BASB020 se čistil zamplifikační reakční směsi za použití centrifugační kolony založené na gelu BamHl a SalE které jsou nezbytné pro klonování. Čištěný produkt PCR se následně štěpil restrikčními enzymy BamHl a Sall, jak doporučuje výrobce (Lifc Technologics). Po prvním štěpení restrikčními enzymy sc produkt PCR Čistil pomocí centrifugační kolony, jak se uvádí shora v textu, aby se odstranily sole a kolona se eluovala vc sterilní vodě před druhým enzymatickým trávením. Fragment štěpení DNA sc opět čistil za použití centrifugační kolony založené na gelu drive než došlo k ligaci s plazmidem pQE30.

B. Produkce expresivního vektoru

Abv se mohl připravit expresívní plazmid PQE30 vhodný pro ligaci. Štěpil se podobně restrikčními enzymy BamHl a Sall a pak sc ošetřil telecí intestinální fosfatázou (CÍP, při koncentraci 5' konce přibližně 0,2 jednotek/pmol, Lile Technology), jak doporučuje výrobce, aby se předešlo samoligaci. Přibližně pětinásobný molární přebytek štěpeného fragmentu připraveného vektoru se pak použil v ligační reakci. Standardní ligační reakce (teplota jc přibližně 16 °C\ po dobu 16 hodin) za použití metod, které jsou dobře známy v oboru, proběhla za použití T4 DNA ligázy (přibližně 2 jednotky/reakci, Lifc Technology). Alikvot ligace (přibližné 5 μΐ) se použil pro transformaci elektro-kompetentních buněk Ml5(pRE4) podle metod dobře známých v oboru. Po přibližně dvou až třech hodinách inkubace při teplotě 37 °C na půdě LB o objemu I ml sc transformované buňky nanesly na plotny s agarem LB, který obsahuje kanamycin (50 gg/ml) a ampicilin (100 pg/ml). Všechny antibiotika sc zahrnuly do selekčního média, aby sc zjistilo, že transformované buňky nesou plazmid pREP4 (KnR), který nese gen laclg nezbytný pro potlačení exprese proteinů indukovatclnýeh 1PTG na pQE3() a plazmidu pQE30-BASB020 (ApR). Plotny se inkubovaly pres noc při teplotě 37 'C po dobu 16 hodin. Jednotlivé kolonie KnR/apR se vypíchal sterilním párátkem a použily sc pro inokulaci čerstvých ploten KnR/ApR stejně jako kultivační půdy LB KnR/ApR o objemu přibližně 1 ml.

Oba druhy ploten a kultivační pudy se inkubovaly při teplotě 37 °C přes noc ve standardním inkubátoru (plotny) nebo za stálého míchání ve vodní lázni.

Analýza PCR založená na celých buňkách se použila pro ověření transformanlů. zda obsahují inzert DNA BASB020. Přibližně I ml kultivační půdy LB Kn/Ap kultivované přes noc sc přeneslo do polypropylenových zkumavek o objemu 1,5 ml a buňky se shromáždily centrifugací v Backmanově centrifuze (centrifugace proběhla po dobu 3 minut, při teplotě místnosti, při

000 x g). Buněčný pelet se suspendoval v přibližné 200 μΐ sterilní vody a alikvot o objemu μΐ se použil pro PCR amplifikaci, kde konečný objem reakce je přibližně 50 μΐ a reakce obsahuje přímý a reverzní amplifikační primer. Konečné koncentrace komponentů reakcí PCR byly v podstatě stejné Jako ty, které se specifikují v příkladu 2, s tou výjimkou, že se použilo přibližně jednotek Taq polymerázy. Počáteční denaturační krok při teplotě 95 °C se prodloužil až na dobu 3 minuty, aby sc zajistilo terminální otevření bakteriálních buněk a uvolnění plazmidovc DNA. Při PCR amplifikaci fragmentu MC-P6 z lyžovaných vzorků transformantu se použil termální cyklovač ΛΒΙ model 9700 a 32 cyklů a tříkrokový termální amplifikační profil. To znameio ná teplota 95 °C po dobu 45 vteřin, 55 až 58 °C po dobu 45 vteřin, teplota 72 °C po dobu I minuty. Po termální amplifikaci se alikvot o objemu přibližně 20 μΙ analyzoval elektroforézou na agarózovém gelu (0.8% agaróza v pufru Tris-acetát-EDTA (TAE)). Fragmenty DNA sc po gelové elektroforéze vizualizovaly UV zářením a barvily se ethidiumbromidem. Paralelně s testovanými vzorky sc na elektroforetickcm gelu nacházel standard molekulové velikosti DNA (žebříček 15 s fragmenty s molekulovou hmotností I Kb. Life Tcchnologies) a použil se k odhadu velikosti produktů PCR. Transformanty, které produkovaly očekávaný PCR produkt o molekulové hmotnosti 504 bp, sc identifikovaly jako kmeny obsahující expresní konstrukci BASBQ20. U kmenů obsahujících expresívní plazmid se pak analyzovala indukovatelná exprese rekombínantního BASB020.

C. Expresívní analýza PCR pozitivních transformantu

V případě každého pozitivního transformantu identifikovaného shora v textu se přibližně 5 ml půdy LB, která obsahuje kanamycin (50 pg/ml) a ampicilin (100 pg/rnl) inokulovalo buňkami 25 z plotny a nechaly se kultivovat přes noc při teplotě 37 °C za stálého míchání (přibližně 250 ot.

za minutu). Alikvot kultury inkubované přes noc (přibližný objem 1 ml) se inokuloval do Erlenmeyerovy baňky, která obsahuje přibližně 25 ml půdy LB Kn/Ap a nechala se růst při teplotě 37 °C za stálého míchání (přibližně 250 ot. za min.) až do okamžiku, kdy zákal kultury dosáhl O.D. 600 přibližně hodnoty 0,5, což znamená, že kultura dosáhla střední logaritmické fáze růstu 30 (obvykle přibližně okolo 1.5 až 2 hodin). V tuto dobu se přibližně polovina kultury (přibližně

12.5 ml) přenesla do druhé nádoby o objemu 125 ml a inkubovala se exprese rekombínantního proteinu BASB020 přidáním 1PTG (LOM zásobní roztok připravený ve sterilní vodě, Sigma), přičemž konečná koncentrace jc 1 mM. Inkubace neindukovaných kultur a kultur indukovaných IPTG pokračovala další 4 hodiny při teplotě 37 °C za stálého míchání. Vzorky (o objemu 1 ml) 35 indukovaných a neindukovaných kultur se odstranily po době indukce a buňky se shromáždily centrifugací na centrifuze při teplotě místnosti po dobu 3 minuty. Individuální buněčné pelety se suspendovaly v 50 μΐ sterilní vody, pak se smíchaly sc stejným objemem 2 x koncentrovaného vzorkového pufru Laemelli SDS-PAGE, který' obsahuje 2-merkaptoetanol a umístily se do vroucí vody po dobu 3 minut, aby se denaturoval protein. Stejné objemy (přibližně 15 μΐ) surové4o ho IPTG-ind ti kovaného nebo neindukovaného buněčného lyzátu se naneslo ve dvou provedeních na 12% Tris/glycin polyakrylamidový gel (mini gely o tloušťce I mm, Novcx). Indukované a neindukované lyzátové vzorky sc analyzovaly na elektroforéze spolu s předem obarvenými markéry molekulových hmotnostní (SecBluc, Novex) za běžných podmínek za použití standardního pufru SDS/Tris/glycin (BioRad). Po elektroforéze se gel obarvil briliantovou modří podle 45 Commassie R250 (BioRad) a pak sc odbarvil, aby se vizualizovaly nové proteiny BASB020 indukované IPTB. Druhý gel se elektroblotováI na membránu PVDF (velikost pórů je 0,45 mikronů, novcx) po dobu 2 hodiny při teplotě 4 °C za použití blotačního zařízení BioRad Mini-Protcan II a Towbinova metanolového (20%) transferového pufru. Blokování membrány a inkubace protilátek se uskutečnily podle metod známých v oboru. Aby se potvrdila exprese 50 a identita rekombínantního proteinu BASB020, použily se nionoklonální anti—RGS(I Iis)3 protilátky, po níž následují druhé králičí anti-mysí protilátky konjugovanc s HRP (QiaGen). Vizualizace paternu reaktivních anti-His se dosáhlo za použití buď ΛΒΤ nerozpustného substrátu, nebo za použití Hyperfi Imu s chem i luminiscenčním systémem Amershani ECL.

-29CZ 298227 B6

D: Potvrzení sekvence

Aby se dále potvrdilo, že odchází k expresi IPTG-indukovatelného rekombinantního proteinu BASB020 ve správném otevřeném čtecím rámci a že nedochází k expresi nežádoucí molekuly (to je posun v rámci), stanovila se sekvence DNA klonovaného inzertu, / jednoho řetězce za použití sekvenační metody PCR s asymetrickým cyklem se získala sekvence DNA genu BASB020 organizmu Λ/. catrrhaUs (ΛΒ1 Prism Dye-Terminator Cvcle Sequencing. Perkin-Elmer). Sekvenační reakce sc provedl} za použití neštěpené expresivní plazmidové DNA (přibližně 0.5 gg/rnx) jako templátu a vhodného příměru specifického pro vektor pQE30 a sekvenačního primerů specifického pro ORE (přibližně 3,5 pmol/rxn). Vedle templátu a sekvenačního primerů každá sekvenační reakce (o objemu 20 μΙ) obsahovala 4 různé dNTP (to je A. G, c, a T) a 4 odpovídající ddNTP (to je ddA, ddG, ddC a DDT) terminační nukleotidy. Každý terminátor se konjugoval s jedním nebo se čtyřmi fluorescenčními barvivý, joe, Tam, Rox nebo Fam. Jednořetězcové sekvenační elongační produkty se zakončily v náhodné poloze podle templátu začleněním ddNTP terminátorů značeným barvivém. Terminační produkty značené barvivém se čistily za použití m i krocení rifugačn ích chromatografiekých kolon, které oddělují molekuly podle velikosti (Princeton Genetics) a sušily sc vc vakuu, suspendovaly se v pufru vhodném pro vytvoření suspenze templátu (Perkin-Elmer) pro kapilární clcktroíbrézu nebo deionizovaný formámid v případě PAGE. Vše se dcnaturovalo při teplotě 95 °C po dobu 5 minut a vše sc analyzovalo kapilární ulcktroforézou s vysokým rozlišením (automatický sekvenátor DNA ABI 310, PerkinElmer) nebo PAGE s vysokým rozlišením (automatický sekvenátor DNA AB] 310, PerkinElmer), jak doporučuje výrobce. Shromáždila se data sekvence DNA produkovaná z jednotlivých reakcí a automaticky se analyzovalo relativní maximum intenzit fluorescence na počítači PowcrMAC za použití ABI Scquence Analysis Software (Perkin-Elmer). Jednotlivě autoanalyzované sekvence DNA se editovaly manuálně za použití softwaru Auto Assembler (Perkin-Elmer). Sekvcnování stanovilo, že expresívní plazmid obsahoval správnou sekvenci ve správném otevřeném čtecím rámci.

Příklad 4: Produkce rekombinantního BASB020

Bakteriální kmen

Rekombinantní expresívní kmen organizmu E. coli MLS (pREP4), který obsahuje plazmid (pQE30) kódující BASB020 z organizmu M. eutarrhalis, se použil při produkci buněčné hmoty při čištění rekombinantního proteinu. Expresívní kmen se kultivoval na plotnách s LB agarem, které obsahují 50 pg/ml kanalycinu („Kn) a 100 pg/ml ampicilinu (..Ap'·). aby se zajistilo, že se kontrolní plazmid pREP4 laclq a expresívní konstrukce pQE30-BASB020 udrží. V případě kryoochrany při teplotě -80 ^ŮC se kmen pomnožil na půdě LB se stejnou koncentrací antibiotik a pak se smísil se stejným objemem půdy LB, která obsahuje 30 % (hmotn./objem) glyccrolu.

Kultivační média

Fcrmcntační médium používané při produkci rekombinantního proteinu obsahovalo 2x koncentrovanou půdu YT (Difco) obsahující 50 pg/ml kanamycinu („Kn“) a 100 pg ml ampicilinu („Ap“). Do kultivačního média sc do fcrmentároru přidalo činidlo bránící pěnění v koncentraci 0,25 ml/l (Antifoam 204. Sigma). Aby se indukovala exprese rekombinantního proteinu BASB020, přidal sc do fermentoru IPTG (isopropyl-fi-D- thiogalaktopyranozid) (konečná koncentrace je ImM).

-30CZ 298227 R6

Fermentacc

Erlenmeyořova nádoba o objemu 500 ml vykazující pracovní objem 50 ml se inokulovala 0,3 ml rychle roztáté zmrazené kultury nebo několika koloniemi ze selektivní kultury na agarových plotnách a inkubovaly se přibližné 12 hodin při teplotě 37 ± I °C za stálého míchání při 150 ot. za minutu (Innova 2100. New Brunswick Scientific). Tato kultura se pak použila k i noku láci 5 I pracovního objemu fermentoru. který' obsahuje 2x koncentrovanou půdu YT a obě antibiotika Kn a apod. Fermentor (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se provozoval při teplotě 37 ± 1 °C. pří 0,2 až 0,4 VVM vzduchu a při 250ot./min. Rushtonova míchadla. Hodnota pH sc nekontrolovala ani v kultivačních nádobách ani vc fermentoru. Během fermcntace se ve fermentoru udržovala rozmezí hodnot pH 6,5 až 7.3. Když kultura dosáhla stádia růstu střední logaritmické fáze (O.D. 600 odpovídá 0,7), do fermentoru se přidalo IPTG (1 M zásobní roztok, připravený vc sterilní vodě). Buňky sc indukovaly po dobu 2 až 4 hodin a pak se sklízely ccntrifugaci za použití centrifugy 2SRS Heraeus (Sepatech) nebo RC5C super rychlé centrifugy (Sorvall Instruments). Buněčná pasta se skladovala při teplotě -20 °C až do zpracování.

Čištění

Chemikálie a materiály

Látky imidazol. hydrochlorid guanidinu. Tris (hydroxymethyl) a EDTA (ethylcndiamintetraoctová kyselina) kdy stupeň čistoty odpovídá biotechnologickému stupni čistoty nebo lepší sc získaly u firmy Ameresco Chemical, Solon, Ohio. Triton X—100 (t-oktylfenoxypolyethoxyetanol), monobazický fosforečnan sodný a močovina odpovídající stupni čistoty činidla nebo lepší a získaly se od firmy Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Ledová kyselina octová a kyselina chlorovodíková se získaly u firmy Millincrodt Baker lne., Phi 11ipsburg, New Jersey. Methanol se získal u institute Fisher Scientific. Eairlawn. New Jersey. Pefabloc®SC (4—(2 aminoetyl)bezensulfonyl fluorid), tablety koktejlu úplného inhibitoru proteáz a PMSF (fenylmetyl-sulfonylfluorid) se získal u firmy Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Bestatin, Pcpstatin A a proteázový inhibitor E-64 se získal od firmy Calbiochent, Lajolla, California. Fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (Dullbecco) (Ix PBS) se získal od firmy Quality Biological, lne., Gaithcrsburg, Maryland. Fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (Dullbecco) (10 x PBS) se získal od firmy Bio Whittaker, Walkcrsville. Maryland. Protilátky PentaHis bez BSA sc získaly od firmy QiaGen, Valcncia, California. Kozí anli-myší IgC AffiniPure konjugované s peroxidázou sc získaly od Jackson Immuno Research, West Grove. Penn. Jednoduchý roztok AEC se získal od firmy Zymed, south San Francisco, California. Všechny další chemikálie vykazovaly stupeň čistoty vhodný pro reakční činidlo nebo vyšší.

Pryskyřice Ni-NTA Superflow se získala od firmy QianGen lne.. Valenci a, California. Předem připravené Tris-glycin 4 až 20 % a 10 až 20 % polyakrylamidový gen, prováděcí pufry a roztoky, předem obarvené standardy SeeBluc. vícenásobně obarvené standardy MultiMark a PVDF transferové membrány sc získaly od llrmy Novcx, Sab Diego, California. Sada pro barvení stříbrem vhodná pro SDS PAGE se získala od firmy Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Toky o. Japan. Roztok vhodný pro barvení podle Comassie se získal od llrmy Bio Rad Laboratories, Hercules, California, Acrodisc® PF filtr vc formě injekcí s velikostí pórů 0.2 μπι se získal od firmy Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Filtry ve formě injekcí GD/X o poloměru 25 mm se získaly od firmy Whatman lne., Clifton, New Jersey. Střívka pro dialýzu s MWCO 8000 sc získaly od firmy BioDcsign lne. Od New York, Carmal New York. Činidla pro test s proteinem BCA a dyalyzační střívka z kůže hada s MWCO 3500 se získaly od firmy Pierce Chemical Co.. Rock ford, lllinois.

Extrakční protokol

Buněčná pasta se roztála při teplotě místnosti po dobu 30 až 60 minut. Pět až šest gramů materiálu se navážilo do centrifugačních zkumavek na jedno použití o objemu 50 ml. Dále se přidalo

-31 CZ 298227 Β6 rnl/g pufru hydrochloridu guanidinu (Gu-HCl) (6M hydrochlorid guanidinu. 100 mM rnonobazického fosforečnanu sodného, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X—100, pí i 8.00). Buněčná pasta se resuspendovala za použití homogcnizéru PRO300D při rychlosti 3/4 prášku za jednu minutu. Extrakční směs se udržovala při teplotě místnosti a jemné sc míchala po dobu 60 až 90 minut. Po 60 až 90 minutách se extrakční směs centrifugovala při 15 800 x g po dobu 15 minut (centrifuga Sorvall RC5C, 11 500 ot./min.). Supernatant (Sl) se slil a uschoval se pro další čištění. Pelet (PÍ) se uchoval pro další analýzu.

Navázáno BASB020 na pryskyřici nikl-NTA

K S1 se přidaly 3 až 4 ml prysky řice Ni-NTA. Pak se tato směs uchovávala při teplotě místnosti za jemného mícháni po dobu jedné hodiny. Po uplynutí jedné hodiny se S1/Ni-NTA nanesl na kolonu XK16 Pharmacia. Kolona sc pak promyla 1M pufrem Gu-HCl (IM hydrochlorid guanidinu, 10 mM monobazický fosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0.05% Triton X—100, pH 8,0). Pak následuje promytí fosfátový m pufrem (100 inM monobazický fosforečnan sodný. lOmM Tris a 0,05 % Triton X 100. píI 6,3). Protein se pak eluoval z kolony 250 mM imidazolovým pufrem (250 mM. 100 mM monobazický fosforečnan sodný; 10 mM Tris a 0.05 % Triton X-100. pH 5,9).

Konečná formulace

BASB020 se vytvořil dialýzou přes noc proti třem výměnám 0.1 % Triton X 1000 a lxPBS pH 7,4, aby se odstranil zbylý Gu-HCl a irnidazol. Čištěný protein se charakterizoval a použil se pro produkci protilátek, jak se popisuje dále v textu.

Biochemická charakterizace

SDS-PAGE a analýza westernovým přenosem

Rekombinantní čištění protein se rozdělil na 4 až 20 % polyakrylamidovem gelu a clektroforcticky se přenesl na membrány PVDF při napětí 100 V po dobu I hodiny, jak se popisuje shora v textu (popisuje sc v publikaci Thcbaine et al., 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350 4354). Membrány PVDE se pak předem ošetřily 25 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem Dulbccco. který obsahuje 5 % netučné sušené mléko. Všechny následné inkubace se provedly za použití předem upraveného pufru.

Membrány PVDE se inkubovalv s 25 ml pre-imunitního séra v ředění 1:500 nebo králičího anti His imunitního séra po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Membrány PVDE se pak promyly dvakrát promývacím pufrem (putr 20 mM I ris pH 7,5. který obsahuje l50ntM chlorid sodný a 0,05 % Tween-20). Membrány PVDF se inkubovalv s 25 ml kozích anti—králičích IgG značených peroxidázou v ředění 1 : 5000 (Jackson ImmunoRescarch Laboratories, Wcst Grove. PA) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Membrány PVDF se pak promy ly 4 krát promývacím pufrem a vyvíjely sc 3-aminy-9-atylkarbazolem a peroxidem močoviny (poskytuje Zymed, San Francisco, CA), přičemž sc s každou látkou inkubuje po dobu 10 minut.

Výsledky SDS-PAGE (obrázek č. 4) vykazují protein s molekulovou hmotností 32 000 až 35 000 čištěný více než 90 % a ten je reaktivní s anti-RGS(His) protilátkami na westernových blotech SDS-PAGE (obrázek č. 5).

Sek věnování protienů

Sekvenování aminokyselin na N konci čištěného proteinu sc uskutečnilo za účelem potvrdit produkci správného rekombinantního proteinu za použití dobře definovaných chemických protokolů na sekvenátoru Hewlett-Packard model G1000A s modelem 1090 FC a na sekvenátoru I lewlett-Packard model 241 s modelem 1100 LC.

-32CZ 298227 B6

Přiklad 5: Produkce antiséra proti rekombinanlnímu BASB020

Polyvalentní antiscrum určené protiproteinu BASB020 se vytvořilo vakcinací dvou králíků s éiš5 těným rekornbinantním proteinem BASB020. Každé zvíře se imunizovalo celkem třemi dávkami do svalu (i.m.). Dávka je tvořena 20 pg proteinu BASB020 obsažených v jedné injekci (začíná se kompletní Freundovým adjuvans a pak následuje nekompletní Freundovo adjuvans) v přibližně 21 denních intervalech. Pres první imunizací a 35. a 57. den se zvířatům odebrala krev.

ίο Titry protilátek proti proteinu BASB020 se stanovily testem ELIS A za použití čištěného rekombinantního proteinu BASB020 (0,5 pg/prohlubeň). litr se definoval jako nej vyšší ředění rovné nebo vyšší než 0,1. jak se vypočítalo s následující rovnice: průměrná hodnota OD ze dvou testovaných vzorků antiséra - průměrná hodnota OD ze dvou testovaných vzorků pufru. Titry po třech imunizacích se pohybovaly mezi hodnotou 3000 a 8000.

Antiséra se použila jako první protilátky za účelem identifikovat protein westernovým blotein. jak se popisuje shora v textu v příkladu 4. Analýza westernový m přenosem prokázala přítomnost anti-BASB020 protilátek v séru imunizovaných zvířat.

Příklad 6: Imunologická charakterizace

Analýza westernovým přenosem

Několik kmenů organizmu M. caterrhalisi zahrnuje ATCC 49143 a ATCC 43617, stejně jako klinické izoláty z různých geografických oblastí, sc kultivovaly na plotnách s čokoládovým agarem po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO₂. Několik kolonií se použilo k inokulaci 25 ml půdy Muller Hinton v nádobě o objemu 250 ml. Kultury se nechaly kultivovat přes noc a shromáždily sc centrifugách Buňky se rozpustily suspendováním 30 pg buněk ve 150 μΐ 3(i vzorkového pufru vhodného pro test PAGE (360 mM pufr Tris pil 8,8. obsahující 4% dodecylsulfát sodný a 20 % glyccrol) a suspenze se inkubovala při teplotě 100 °C po dobu 5 minut. Rozpouštěné buňky sc dělily na 4 až 20 % polyakrvlamidových gelech a separované proteiny se elektroforetieky přenesly na PVDF membrány při napětí 100 V po dobu 1 hodiny, jak se popisuje dříve v textu (Thebaine et al., 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354). Membrány

PVDF se pak předem upravily 25 ml fyziologického roztoku upraveného fosforečnanovým pufrem Dulbecco, který obsahuje 5 % netučného sušeného mléka. Všechny následné inkubace se provedly za použití předem upraveného pufru.

Membrána PVDF sc inkubovaly s 25 ml preimunního séra v ředění 1:500 nebo králičího imunit) ního séra po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Membrány PVDF sc pak dvakrát promyly promývacím pufrem (20 mM I ris pufr, pEI7.5. který obsahuje 150mM chlorid sodný a 0.05% Tween-20). Membrány PVDF se inkubovaly s 25 ml kozích anti-králičích IgG značených peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Membrány PVDF sc pak promyly čtyřikrát promývacím pufrem a vyvíjely se 15 3-amino-9-atylkarbazolem a peroxidem močoviny (poskytuje Zymed, San Francisco. CA), přičemž se s každou látkou inkubuje po dobu 10 minut.

Protein o molekulové hmotnosti 32 000 až 35 000 (což odpovídá očekávané molekulové hmotnosti proteinu BASB020). který' reaguje s antisérem. se detekoval ve všech kmenech organizmu 50 Moraxella.

J.l ·

Příklad 7: Přítomnosti protilátek proti proteinu BASB020 v séru rekonvalescenta

Analýza westernovým přenosem čistého rekombinantního proteinu BASB020 se uskutečnila, jak 5 se popisuje v příkladu 4 a 6 s výjimkou, že lidské sérum s dětí infikovaných organizmem

M. calairhalis se použilo jako první proti látkový přípravek. Výsledky ukazují, žc an ti sér um z přirozeně infikovaných jednotlivců reaguje s čištěným rckombinantním proteinem, jak je zobrazeno na obrázku č. 6, to

Příklad 8: Účinnost vakcíny BASB020: odstranění organizmu M. cularrhulis z plic u myší.

Ochranná kapacita čištěného rekombinantního proteinu BASB020 se testovala u myšího modelu.

Tento myší model je založen na analýze invaze plic organizmem \1. catarrhalis. který následuje i? po standardní intranasální dávce aplikované vakcinovaným myším.

Skupiny šesti myší BALB/c (samice, 6 týdnů staré) se podkožně imunizovaly 100 μΐ vakcíny, která odpovídá 10 pg dávky, a posilovači dávka se aplikuje dva týdne později. Jeden týden po aplikaci posilovači dávky se myším aplikovala instalací 50 μΙ bakteriální suspenze (+/2o 10^f> CFU/50 μΙ) do levé nozdry při anestezi (myším se aplikuje anesteze. kterou tvoří kombinace ketaminu a xylazinu, 0.24 mg xylazinu (Rompun) a 0,8 mg ketaminu (Imalgcne)/100 μΙ). Myši se usmrtily 4 hodiny po aplikaci bakteriální suspenze a plíce sc asepticky vyňaly a jednolitě sc homogenizovaly. Hodnota loglO průměrného počtu CFU/plíce sc stanovila spočítáním kolonií kultivovaných na plotnách s agarem Mueller-Hinton po nanesení na plotny 20 μΙ 5 sériových 25 ředění homogenátu. Pro každou skupinu sc stanovil aritmetický průměr hodnot loglO průměrného počtu CFU/plíci a standardní odchylky.

Výsledky sc statisticky analyzovaly aplikací jednocestného testu ANOVA za předpokladu rovnosti odchylky (kontrolováno testem podle Brown a Forsythe) a normality (kontrolováno za 30 použití testu podle Shapiro a Wilka). Rozdíly mezi skupinami se analyzovaly za použití Dunnctova testu, testu rozmezí podle Studenta a Tukey (HSD) a testu podle Studená. Newmana a Keulse.

Experimentální skupiny myší se imunizovaly buď proteinem BASB020 absorbovaným na AlPOj (10 μg proteinu BASB020 na 100 μg AIPO₄), nebo s usmrcenými celými buňkami (kwc) orga35 nizmu Λ/. catarrhalix kmen ATCC 43617 adsorbovaném na AIPO4 (5x10^K buněk na 100gg

A1PO₄) nebo se 100 pg Α1ΡΟ.» bez antigenu. Myši se aplikovala dávka 10' CFLI živých bakterií M. caíarrhalis kmen ATCC 43617.

hodiny po aplikaci bakterií se pro každou skupinu stanovily hodnoty loglO průměrného počtu 40 PFU/plíci a standardní odchylky. 4 hodiny po aplikaci bakterií imunizované myši vykazují hodnoty loglOCFU/plíci 5.5 (±0,23).

Přípravek kwc vyvolal podstatné vyčištění plic ve srovnání s kontrolní skupinou (1,74 log rozdílu). BASB020 vakcína vyvolala 0,62 log rozdílu vyčištění plic, jak sc porovnává s kontrolní 45 skupinou, která se podstatné lišila od kontroly.

Westernův přenos za použití čištěného rekombinantního proteinu BASB020 a sebraná séra od myší imunizovaných proteinem BASB020 a shromážděná před aplikací bakterií vykazují přítomnost protilátek proti proteinu BASB020 (obrázek č. 7),

- 34 LZ. ΧνβΖΖ/ B6

Příklad 9: Produkce peptidů BASB020. antiséra a jeho reaktivita

Dva specifické peptidy s malým množstvím aminokyselin BASB020 mají sekvenci CNEEAWSQNRRAELSY (SEQ ID NO: 13) a YTGVAPLVDNDETV (SEQ ÍD NO: 14) se produkovaly v laboratoři za použití obecně známých metod. Tyto peptidy spojené s KLI I se používaly při produkci protilátek u samic novozélandských králíků bez specifického patogenu. které jsou 12 týdnů staré, Králíkům se aplikovaly 4 injekce přibližně v tří týdenních intervalech, které obsahovaly 200 pg peptidu—KLU v úplném (první injekce) nebo v neúplném (druhá, třetí a čtvrtá injekce) Freundově adjuvans. Před první imunizací a jeden měsíc po čtvrté injekci se zvířatům odebrala krev.

Střední hodnota ti tru anti-peptidových protilátek se stanovila testem ELIS A za použití volných peptidů. Střední hodnota litrů anti-peptidových protilátek jeden měsíc po čtvrté imunizaci byla 41 000. Westernový přenosy čištěného rekombinantního proteinu BASB020 za použití protilátek proti peptidu, které se použily jako první protilátky, se připravily způsobem, který se popisuje v příkladu 4 a 6. Výsledky jsou uvedené na obrázku č. 8.

LI ložený materiál

Organizmus Moraxella catarrhalis kmen Catlin sc uložil v instituci Američan Type Cullure Collcction (ATCC) 21. června 1997) a označil se číslem uložení 43617. Preparát sc popsal jako Branhamclla catrrhalis (Frosh and Koile) a jc lyofilizovaný. Knihovna nesoucí inzert o velikosti 1.5 až 2.9 kg konstruovaný z izolátů M. catarrhalis získaného z transtracheálního aspirátu horníka, který trpí chronickou bronchitidou. Uložení se popisuje v publikaci Anlimicrob. Agcnts Chemothcr, 21; 506-508 (1982).

Uložený kmen organizmu Moraxella catarrhalis se zde zmiňuje jako „uložený kmen nebo „DNA uloženého kmene.

Uložený kmen obsahuje gen BASB020 v plné délce.

Depozit vektoru pMC-Hly3 obsahující DNA organizmu Moraxella catarrhalis začleněnou do pQE30 je uložen v instituci Američan Type Culture Collection (ATCC) 12. února 1999 a je označená číslem uložení 207106.

Sekvence póly nukleotidů obsažená v uloženém kmenu/klonu stejně jako aminokyselinová sekvence libovolného polypeptidu jí kódovaná se kontroluje s libovolným popisem sekvencí.

Uložení kmenů se provedeno podle Budapešťské úmluvy lnternational Rccognition of the Deposit of Micro organisms for Purposes of Patent Proceduro. Uložené kmeny budou vydání patentu bez omezení přístupny veřejnosti. Uložené kmeny sc uvolňují podle nařízení 35 U.S.C. § 1 12.

-35C7 298227 Β6

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 843 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A)ORGANIZMUS: bakterie (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

atgcgcggcc	ttaggegttg	gttatccaec	gcacctgaaa	ctcgagatga	tttattaaag	6o
ccggtEcaag	actcccg-ca	gttttcagag	cctgatacgg	trgatacgct	tgaaggggtg	120
ctegatetgc	cageaaeeca	gtgegcgag	actatgaeac	eacgdccgca	ggtgaatgcg	ieo
atcgccagcg	acgatgattt	atccgatatt	ttatcggtgg	tgcttgaaac	agageattet	240
cgctatcctg	tttttgacag	tttagatgac	gatgctgngg	ttgggatett	getgactaag	300
gacccaatae	catacctaaa	agccaaagct	gacggcaaag	ageagedget	caaat tggcc	3S0
gacattgtac	gaaagecgtt	gratacuage	gagaeggcac	gcccagatac	accgctaegc	420
Ecacttcaaa	aagcccaagt	gcatatggcg	attgtggttg	atgaatttgg	ctcggtccct	4EJ0
ggtgtggtga	caatggagga	tttgcttgag	gagattgccg	gtgatattgt	tgacgaacat	540
gatgatattg	acgaggacag	cgacattaat	aacatdatEc	caflaccctga	taaaccaggc	€00
gtttggttgg	tgcaagetjtc	cacactcatc	agtgactgca	atgagatttt	aggeagteac	G60
trtaatgaca	cagacgtcga	tacaatgggc	ggcttggtca	tgcaagcatt	gggetctgtt	720
agccatctte		tgxtcaaacc	gacgaacggc	aaacraeegt	ggttgacgtt	700
gaggcacgat	ttactcatct	gctggagctt	gtgctgatac	caeagcttga	gaatgůtgaa	040
Eaa						843

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 280 aminokyselin (B) TYP: protein (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie

- 36 CZ 298227 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met

Arg

Oly

Leu

Arg

Trp

Leu

Ser

Thr

Ala

Pro

Glu

Thr

Arg

Asp

1

5

10

15

Asp

Leu

Lys

Leu

Val

Glh

Asp

Ser

Arg

Gin

?h*

Leu

Glu

Pro

Asp

20

25

30

Thr

val

Asp

M4t

Leu

G1U

Gly

Val

Leu

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Val

3S

40

45

Arg

Glu

Tle

Met

Thr

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

His

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

so

55

60

Asp

Leu

ser

Asp

Ile

Leu

Ser

Val

Leu

Glu

Thr

Glu

His

Ser

65

70

75

&0

Arg

Tyr

Pro

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Asp

Agp

Asp

Ala

Val

Gly

Ile

es

90

95

Leu

Ile

Lys

Asp

Leu

Ile

Pro

Tyr

Leu

Lva

Ala

Lys

Ala

Asp

Gly

IDO

105

110

Lye

Glu

Glr.

Prc

Leu

Lys

Leu

Ala

Asp

Ile

Val

Arg

Lye

Pro

Leu

Tyr

115

120

125

Ile

Ser

Glu

Thr

Ala

Arg

Ser

Asp

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Lys

130

135

140

Ala

Gin

Val

His

Met

Ala

Ha

Val

Asd

Glu

Phe

Gly

Ser

Val

Ser

14 5

150

155

160

Gly

Val

Thr

Met

Glu

Asp

Leu

Glu

Ile

Val

Gly

Aap

Ile

16Ξ

170

175

Val

Asp

Glu

His

Asp

Afip

Ile

Asp

Glu

ASp

Ser

Asp

Ile

Asn

ASn

Ile

180

185

190

Ile

Pro

His

Pro

Asp

Lys

5er

Gly

Val

Trp

Leu

Val

Gin

Ala

Ser

Thr

195

200

20S

Leu

Ile

Ser

Asp

Cys

Asn

Glu

Ile

Leu

Gly

Ser

His

Phe

Asp

Thr

210

215

220

Asp

Val

ASp

Thr

Met

Gly

Leu

Val

Met

Gin

Ala

Leu

Gly

Phe

val

225

230

23 5

240

Ser

His

Lftu

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

Ile

Asp

Glu

Trp

Gin

Ile

Thr

245

250

2ΞΞ

val

Val

Asp

val

Glu

Ala

Arg

Phe

Ile

His

Leu

Glu

Leu

Val

Leu

260

265

270

Tle

Pro

Gin

Leu

Glu

Asn

Ala

Glu

275

2QC

-37CZ 298227 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 843 párů bází (B) TYP: nuklcová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

atgcgtggcc	t^aggcgzcg	gtcatccacc	gcacctgaaa	ztcgagatga	tttattaaag	60
etggttcaag	actctcgcca	gzttttagag	cctgatacgg	ttgacatgce	tgaaggggcg	120
c: tgatctgc	c^gcaaecea	^a3tgcgi:gag	atcatgacae	cacgcccgca	ggtgcatgeg	180
attgccagcg	atgatgattt	atccgatacc	ccatcggtgg	cgctcgaaac	agagcaccct	240
cgctancatg	nttttgacag	tttggatgat	gatgctgtgg	ttgggatctc	gctgatcaag	300
gaectaatac	catacctaaa	agecaaaget	gaeggtaaag	agcagergct	eaaaetggct:	360
gsnattgtaq	gaaagacgtt	gtatatuagc	gagacggcac	gctcagatac	actgstacgc	420
tcacttcaaa	aagcccaagt	aeacatggcg	attgttgttg	atgaact tgg	ctcggtctct	480
ggtgtggcgs	caacggagga	cttgcttgac	gagatcgtcg	gtgacattgc	tgaugaacac	540
gatgatattg	acgaggacag	cgacattaac	aacatcattc	eacaccctga	tfiaatcaggc	ÓDO
gtctggtcgg	tgcaagcotc	cacactcatc	agtgattgca	angagatttt	aggcagecat	£60
tttgatgat.a	cagatgttga	tacaatgggc	ggcttggtca	tgcaagcatt	gggCtttgtt	720
ag c cat CCtC	aaggcgcggt	tgttcaaatc	gatgaatggc	aaattaccgx	ggttgatgtt	780
gaggcacga^	t tatteatct	qttggagctt	gtgergatae	eaeagettga	gaatgccgaa	040
caa						E43

(2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 280 aminokyselin (B) TYP: protein (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie

-38CZ 298227 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met 1

Arg Oly

Leu Arg Arg S

Trp Leu

Ser

Thr Ala 10

Pro

Glu

Thr

A-9 15

Asp

Leu

Lys

Leu

Val

Gin

Asp

Ser

Arg

Gin

Phe

Leu

Glu

Pro

Asp

20

25

30

Thr

v&l

Asp

Met

Leu

Glu

Gly

Val·

Leu

ASp

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

val

35

40

45

Arg

Glu

Ile

Met

Thr

Pro

Arg

Pro

Gin

val

His

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

50

55

60

Asp

Leu

Ser

Asp

Ile

Leu

Ser

Val

val

Leu

Glu

Thr

Glu

His

Ser

65

70

75

eo

Arg

Tyr

Pro

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Asp

Ala

Val

Gly

Ile

B5

90

95

Leu

Ile

Lys

Asp

Let

Ile

Pro

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

Ala

Asp

Gly

100

105

110

Lys

Glu

Gin

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

Asp

Ile

Val

Arg

Lya

Pro

Leu

Tyr

LIS

120

125

ila

Ser

Glu

Thr

Ala

Arg

Ser

AGp

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Lya

13 0

135

140

Ala

Glh

Val

His

Met

Ala

Ile

Val

Asp

Glu

Phe

Gly

Ser

val

Ser

145

1S0

155

160

Gly

Val

Ala

Thr

Met

Glu

Asp

Leu

Glu

Ile

Val

Gly

Asp

Ile

165

170

175

Val

Asp

Glu

Hie

Asp

Ile

Asp

Glu

Asp

Ser

Aap

Ile

Asn

Ile

15C

185

190

ile

Pro

P.L3

Pro

Asp

Lys

Ser

Gly

Val

Trp

Leu

Val

Glr.

Ala

Ser

Thr

195

200

205

Leu

Zle

Ssr

Asp

Cyc

Asn

Glu

Ile

Leu

Gly

Ser

His

Phe

Asp

Thr

210

215

22Q

Asp

Val

Asd

Thr

Met

Gly

Leu

Val

Met

Glr.

Ala

Leu

Gly

Phe

val

22S

2 31

235

240

Ser

His

Lču

Glr

Gly

Ala

Val

Gin

Ile

Asp

Glu

Trp

Gin

Tle

Thr

24 5

250

25Š

Val

Vil

ASD

val

Gin

Ala

Ara

Phe

Ile

His

Leu

Glu

Leu

val

Leu

260

265

270

Ile

Pro

Glr.

Leu

Glu

Asn

Ala

Glu

275

280

-39CZ 298227 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 843 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (xi) Popis sekvence. SEQ ID NO: 5:

acgrgtggce	ctaggcgr:tg	erttatecaee	geaectgaaa	CECgigatga	cttattaaag	6C
ccggcreaag	aetetcgeea	gtccttagag	cetgacaegg	ttgacazget	cgaaggggeg	120
cttgatctgc	cagcaaccca	agtgcgtgag	attatgacac	cacgcccaca	ggtgcatgcg	1Θ0
itCgccagcg	atgatgattt	atotgatatn	caatcggtgg	ogcctgaaac	agagcattcc	240
cgctatcctg	tttcegacag	ttEggacgat	gatgctgtgg	ergggatcct	gctgateaag	300
gacttaatic	catacctaaa	agceaaagcc	gacggtaaag	agcagccgct	caaattjgct
gxratogtac	gaaagccgtt	gtatattagc	gagacggcac	gcccagacac	acrgetacgc	420
ccactrcaaa	aagcccaagt	acatatggeg	attgttgttg	atgaatttgg	cteggtCEet	480
	caatggagga	ttcgettgag	gagactgtcg	gcgatattgt	tgacgaacac	540
gacgaeatxg	acgaggacag	cgacatcaaE	aaeaccacce	eacaEeetga	Eaaateaggc	600
gtrtggtegg	tgcaagcttd	eacaeceatc	agrgartgca	atgagatttt	aggcagEcat	660
ctcgacgata	cagaogttga	tacaacgggc	ggcttggtea	tgeaagcatt	gggcEtEgct	720
agccaccttc	aaggcgcggt	tgttcaaatc	gatgaacggc	aaaetaccgt	ggcrgaEgrt	780
gaggcacgat	ttatccatct	gttggagect	gtgctgatac	eacÉtgqittga	gaabgctgaa	04D
taa						S43

(2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 280 aminokyselin (B) TYP: protein (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie

-40CZ 298227 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met 1 X

ΆΤ3

Gly

Leu Arg 5

Arg

Trp

Leu Ser

Thr Ala Pro 10

Glu

Thr

Arg 15

Asp

Leu

Lya

Leu

Val

Gin

Aap

Ser

Are

Gin

Phe

Leu

Glu

Pro

Asp

20

25

30

Thr

Val

Asp

Mez

Leu

Glu

Gly

val

Leu

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Val

3 ±

40

45

Arg

Glu

Ile

Met

Thr

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

His

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

50

55

60

Asp

Leu

Ser

A.Sp

Ile

Leu

Ser

Val

Leu

Glu

Thr

Glu

His

Ser

6 5

70

75

eo

Arg

Tyr

Pra

v=l

Phe

Asp

Sex

Leu

Αερ

Asp

Ala

Val

Gly

Ile

es

90

95

Leu

Ile

Lys

Asp

Leu

Ile

Pra

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lya

Ala

Asp

Gly

100

105

110

Lys

Glu

Gin

Pro

Leu

LVS

Leu

Ala

Asp

Ile

Val

Arg

Lys

Pra

Leu

Tyr

115

120

125

Ile

Ser

Glu

Thr

Ala

Arg

Ser

Asp

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Lys

130

135

140

Ala

Gin

Val

His

Mec

Ala

Ile

Val

Asp

Glu

Phe

Gly

Ser

Val

Ser

145

15 0

133

160

Gly

Val

Ala

Thr

Hec

Glu

Aap

Leu

Glu

Ile

Val

Gly

Asp

Ile

165

170

175

val

ASp

Glu

His

Asp

Arp

Ile

Asp

G1U

Asp

Ser

ABp

Ile

Asn

Ile

íac

185

190

Ile

Pro

His

Pro

AOP

Lys

Ser

Gly

Val

Trp

Leu

Val

Gin

Ala

Ser

Thr

199

200

205

Lftu

11c

Se*

Aap

Cyp

Asn

Glu

Ile

Leu

Gly

Ser

HiS

Phe

ASp

Arp

Thr

210

215

220

Asp

val

Asp

Thr

Mez

Gly

Leu

Val

Met

Glr

Ala

Leu

Glv

Phe

Val

225

230

235

240

Set

Mis

Leu

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

Ile

Asn

Glu

Trp

Gin

Ile

Thr

24S

250

255

Val

Va.1

Asp

Val

Glu

.Ala

Arg

Phe

Ile

His

Leu

Glu

Leu

Val

Leu

200

265

270

Ile

Pro

Gin

Leu

Glu

Ahn

Ala

GlU

275

230

-41 CZ 298227 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 843 párii bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

atgcgrggce	ttaggcgttg	gtcacecacc	gcacctgaa^	ctcgagatga	retatraaag	60
ctggrtcaag	actetcgcca	gcttttagag	ectgaracgg	ctgatatget	rgaaggggtg	120
cr.r.gacctge	cagcaacesa	agtgcgtgag	aetatgacac	cacgcccaca	ggtgcatgcg	100
attgcnagcg	atgatgartt	o-tergatate	ttatcggtgg	tgcttgaaac	agageattet	240
ceccateccg	rtttcgacag	t&tggatgaC	gatgctgvgg	ttgggatccr	getgattaag	300
gacttaaeac	catacctaaa	agecaaager	gacggtaaag	agcagccgct	caaarcggct	360
ganat^grac	gaaagscgtt	gratactage	gagacggcac	geteagatac	acrgctacgc	420
rcaectcaaa	aagcccaagt	gcararggcg	attgtcgttg	atgaattcgg	ctcggtctct	460
ggttgtggtga	caarggagga	tttgcetgag	gSgactgtcg	gcgatattgt	tgatgaacar	540
gatgatattg	aegaggacag	egacateaat	aacatcartc	cacaccctga	taaatcaggc	600
gttrggttgg	rgGaagctcc	cacacrcatc	agrgattgea	argagattet	aggcagtcar	660
tttgargaca	cagargttga	tacaatgggc	ggtrrggcci	tgcaagcatt	aggctctgtt	720
agccatcttc	aaggtgcggr	tgcCCSaarc	gatgaarggc	aaatraccgt	ggttgargct	780
gaggcaegar	teatrcar cr	gttggagctc	gtgctgarac	cacagcttga	gaaegcCga*	840
taa						043

(2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 280 aminokyselin (B) TYP: protein (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie

-42CZ 298227 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8;

net

Arg

Gly

Leu

Arg

AEg

Trp

Leu

Ser

Thr

Ala

Pro

Glu

Thr

Arg

Asp

1

5

10

15

Asp

Leu

Ly&

Leu

Val

Gin

Asp

Ser

Arg

Gin

Phfc

Leu

Glu

Pro

Asp

20

25

30

Thr

Val

Asp

Met.

Leu

Glu

Gly

Val

Leu

Αερ

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

val

35

40

45

Arg

Glu

11®

Met

Thr

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

His

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

50

55

60

Asp

Leu

Ser

Asp

Ile

Leu

Ser

Val

Leu

Glu

Thr

Glu

His

Ser

65

70

75

00

Arg

Tyr

PLD

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Asp

Ala

Val

val

Gly

Ile

es

90

9S

Leu

Ile

Lys

ASp

Leu

Ile

Pra

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

Ala

Asp

Gly

100

1Ď5

110

Lys

G1U

Gin

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

Asp

Ile

Val

Arg

Lys

Pro

Leu

Tyr

115

120

125

Ile

Ser

Glu

Thr

Ala

Arg

Sfir

Asp

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Lye

13 0

13S

140

Ala

Gin

Val

His

Met

Ala

ile

Val

ASp

Glu

Phe

Gly

Ser

Val

Ser

145

lSo

155

160

Gly

Val

Val·

Thr

Met

Glu

ASp

Leu

Glu

G1U

Ila

Val

Gly

Asp

Ile

165

170

17S

Val

A9p

Glu

Híb

Asp

ASp

Ile

Asp

Glu

Asp

Ser

Asp

11*

Asn

Ile

130

185

190

Ile

Prs

His

Pro

Asp

Lys

Ser

Gly

Val

Trp

Leu

val

Gin

Ala

Ser

Thr

195

200

205

Leu

Ile

Ser

Άερ

cys

Asn

Glu

Ile

Leu

Gly

Ser

His

Phe

Asp

Anp

Thr

210

215

220

Asp

Val

Asp

Thr

Mer

Gly

Leu

Val

Met

Gin

Ala

Leu

Gly

Phe

val

225

230

23 5

240

Ser

His

Leu

Gin

Gly

Ala

Val·

val

Gin

11*

Asp

Glu

Trp

Gin

Ile

Thr

245

25d

255

Val

ASp

Val

Glu

Ala

Arg

Phe

Ile

His

Leu

Glu

Leu

Val

Leu

250

265

270

Ile

Pra

Gin

Leu

Glu

Asn

Ala

Glu

-43 CZ 298227 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: DNA (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: oligonuklcotid (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (xt) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

(2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: DNA (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: oligonukleotid (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

gacaccgqcc geaacatgc

-44 CZ 298227 Β6 (2) Informace ο SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAK l EKISTIKA SEKVENC E:

(A) DÉLKA: 58 párů bází (B) TYP: DNA (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOUEKUUY: oligonukleotid (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

aagggcccaa rtacgcagag gggatccatg cgrggretta ggcgttggtt atccaccg SB (2) Informace o SEQ ID NO: 12;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 párů bází (B) TYP: DNA (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: oligonukleotid (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12;

uagggcccaa tcacgcagag ggtcgaítta teatteagaa ttetraaget gtggtavcag 60

-45CZ 298227 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP; protein (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

m (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: bakterie (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

cys Asn Glu Glu Ala Trp Ser Gin Aan Arg Arg Ala Glu Leu Ser Tyr

10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: protein (C) DRUH ŘETĚZCE:

w (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: peptid (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS; bakterie (ix) ZNAKY:

kj (D) Jiné informace; umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp Glu Thr Val

10

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

CZ 29X227 B6
2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, vc kterém aminokyselinová sekvence vykazuje alespoň 95 % shodu s aminokyselinovou sekvencí vybranou zc skupiny zahrnující SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6,
3. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny υ zahrnující SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6.
4. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6.

20
5. Izolovaný imunogenní fragment polypeptidu podle libovolného z nároků I až 4. který jc schopen, v případě nutnosti ve spojení s nosičem, vyvolat imunitní odezvu, rozeznávající polypeptid SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6.

5 1. Izolovaný polypeptid, který'je možné použít ve vakcíně proti infekci Moraxella caiarrhalis obsahující aminokyselinou sekvenci, která vykazuje alespoň 85% shody s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO; 6.

io
6. Polypeptid nebo imunogenní fragment podle libovolného z nároků 1 až 5, který jc součástí 25 většího fúzního proteinu.
7. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid nebo imunogenní fragment podle libovolného z nároků 1 až 6,

30
8. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid vykazující alespoň 85% shodu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6, nebo nukleotid, komplementární k tomuto izolovanému polynuklcotidu.

35
9. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85% shodu s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6 po cele délce kódující oblasti, nebo nukleotidovou sekvenci komplementární s izolovaným polynukleotidem.

io
10. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85% shody se sekvencí SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 5 po celé délce SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 5 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární s izolovaným polynukleotidem.
11. Izolovaný polynukleotid podle libovolného z nároků 7 až 10, který vykazuje alespoň 95% 45 shodu se sekvencí SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 5.
12. Izolovaný polynukleotid podle libovolného z nároků 7 až 11. obsahující nukleotidovou sekvenci, klcrá kóduje polypeptid SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6,

50
13. Izolovaný polypeptid podle libovolného z nároků 7 až li, který obsahuje polynukleotid

SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 5.

-47CZ 298227 B6
14. Izolovaný polynukleotid podle libovolného z nároků 7 až 11. obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6. který je možné získat testováním vhodné knihovny za přísných hybrid izačních podmínek se značenou sondou, která má sekvenci SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 5 nebo její fragment.
15. Expresívní vektor, který' obsahuje izolovaný rckombinantní polynukleotid podle libovolného l nároků 7 až 14.
16. Rekombinantní živý mikroorganismus, vyznačující sc tí m . že obsahuje expresívní vektor podle nároku 15.
17. Hostitelská buňka obsahující expresívní vektor podle nároku 15, nebo membrána hostitelské buňky obsahující exprimovaný polypeptid.
18. Způsob produkce polypeptidů nebo imunogenního fragmentu podle nároků I až 6. vyzná č u j í c í se t í m . žc zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 17 za podmínek, které jsou dostatečné pro produkci uvedeného polypeptidů nebo imunogenního fragmentu a jeho získání z kultivačního média.
19. Způsob exprese polynukleotidů podle libovolného z nároků 7 až 14. v y z n a č u j í c í se tím, že zahrnuje transformaci hostitelské buňky expresívním vektorem, který obsahuje alespoň jeden z uvedených polynukleotidů, a kultivaci uvedené hostitelské buňky za podmínek dostatečných pro expresi libovolného z uvedených polynukleotidů.
20. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polypeptidu nebo imunogenního fragmentu podle libovolného z nároků 1 až 6 a farmaceuticky přijatelný nosič.
21. Vakcinační prostředek, vyznaču jící se tím. žc obsahuje účinné množství polynukleotidu podle libovolného z nároků 7 až 14 a farmaceuticky přijatelný nosič.
22. Vakcinační prostředek podle nároku 20 nebo 21, v y z n a č uj í c í se t í m . že obsahuje alespoň jeden jiný antigen Moruxella catarrhalis.
23. Protilátka, která je imunospecifická pro polypeptid. obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85 % shody s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 6 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6. nebo imunogenní fragment, který je schopen, v případě nutnosti ve spojení s nosičem, vyvolat imunitní odezvu, rozeznávající polypeptid SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 6,
24. Protilátka podle nároku 23, která je imunospecifická pro polypeptid nebo imunogenní fragment. který je součástí většího fúzního proteinu.
25. Způsob diagnostikování infekce Moraxella ccikiniuilis, vyznačující se tím, že zahrnuje identifikaci polypeptidů nebo imunogenního fragmentu podle libovolného z nároků 1 až 6 nebo protilátky, které jsou imunospecifické pro uvedený polypeptid a nachází se v biologickém vzorku, jenž pochází zc zvířete, u něhož se předpokládá taková infekce.
26. Použití vakcinační kompozice obsahující imunologicky účinné množství polypeptidů nebo imunogenního fragmentu podle libovolného z nároků I až 6 při přípravě léčiva použitelného při vytvoření imunitní odezvy u zvířete.

-48 CZ 298227 B6
27. Použití vakcinační kompozice obsahující imunologicky účinné množství póly nukleotidu podle libovolného z nároků 7 až 14 při přípravě léčiva použitelného při vytvořeni imunitní odezvy u zvířete.
? 28. Terapeutický prostředek, v y z n a č u j í c í sc t i m . že je použitelný při léčbě lidí s onemocněním způsobeným Moraxella catarrhalis a který obsahuje alespoň jednu protilátku podle nároku 23 a vhodný farmaceutický nosič.