ES2247803T3

ES2247803T3 - Compuestos de moraxella catarrhalis.

Info

Publication number: ES2247803T3
Application number: ES99924948T
Authority: ES
Inventors: Joelle SmithKline Beecham Biolog. s.a. THONNARD
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2019-05-07
Also published as: BR9911773A; DK1078064T3; IL139612A0; CN1309706A; ATE303442T1; DE69927017T2; HUP0102853A3; AU737196B2; CA2328502A1; HUP0102853A1; NO330169B1; KR100610448B1; NZ508322A; TR200003345T2; CN100484956C; NO20005697L; GB9810285D0; CN1876679A; CZ298227B6; US7122197B1

Abstract

Un polipéptido aislado útil en una vacuna contra infección por Moraxella catarrhalis que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6 en la longitud completa de SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6 respectivamente.

Description

Compuestos de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos, (denominados en esta memoria descriptiva "polinucleótido(s) BASB020)" polipéptidos codificados por ellos (denominados en esta memoria descriptiva "BASB020" o "polipéptido(s) BASB020"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram - negativa aislada frecuentemente a partir del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías siendo las principales otitis media en lactantes y niños, y neumonía en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad importante de la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Más de 3,5 millones de casos se registran cada caso en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19: 823). Si se deja sin tratar, o convirtiéndose en crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que podrían ser temporal (en el caso de acumulación de fluidos en el oído medio) o permanente (si se daña el nervio auditivo). En lactantes tales pérdidas de audición pueden ser responsables de retraso en el aprendizaje del habla.

Las especies bacterianas se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi), y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 a 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NHTi representan ambos aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Otras bacterias se podrían aislar del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes etc.) pero en mucho menor frecuencia (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior en un requisito absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo también se requieren otros para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col., (1988) J. Infect. Dis. 158: 205, Faden, HL y col., (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Éstos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias en el oído medio a través de la trompa de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso inflamatorio. Estos factores son actualmente desconocidos. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune después de una infección viral, por ejemplo, podría provocar una incapacidad de controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col., (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Una explicación alternativa es que la exposición a los factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente serán susceptibles de desarrollar otitis media debido a la presencia sustancial de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) MIcobiol. Rev. 60: 267).

La respuesta inmune a M. catarrhalis está deficientemente caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente a partir de la nasofaringe de bebés de 0 a 2 años de edad, indica que adquieren y eliminan frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que una respuesta inmune eficaz contra esta bacteria está fifada por los niños colonizados (Faden, HL y col., (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

En la mayoría de los adultos ensayados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col., (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida en suero: en general, aislamientos de individuos enfermos son más resistentes que los que están simplemente colonizados (Hol, C y col., (1993) Lancet 341: 1281, Jordan, KL y col., (1990) Am. J. Med 88 (supl. 5A): 28S). Por lo tanto la resistencia en suero se puede considerar como un factor de virulencia de las bacterias. Una actividad opsonizante se ha observado en los sueros de niños que se recuperan de otitis media.

No se han identificado los antígenos dirigidos por estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro, y que se reconoce por el suero de pacientes con neumonía (Sethi S, y col., (1995) Infect. Immun. 63: 1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col., (1999), Infect. Inmun. 67: 1310).

Unas otras pocas proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado usando un procedimiento biológico, o por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos originados contra alguno de ellos UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva en gran medida entre cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con un porin de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado eficaz contra esta bacteria en modelos de animales.

La frecuencia de infección por Moraxella catarrhalis ha aumentado dramáticamente en las pasadas pocas décadas. Se ha atribuido a la emergencia de múltiples cepas resistentes a antibióticos y un incremento en la población de personas con sistemas inmunes debilitados. Ya no es inusual aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica insatisfecha y demanda nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de antibióticos, y ensayos de diagnósticos para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB020, en particular a polipéptidos y polinucleótidos BASB020, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y afecciones asociadas con tales infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB020.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la lectura de las descripciones siguientes y a partir de la lectura de otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB020 como se describe en más detalle más adelante. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB020 de Moraxella catarrhalis, que se relaciona con la homología de la secuencia de aminoácidos a la proteína hemolisina TlyC de Serpulina hyodysenteriae. La invención se refiere especialmente a BASB020 que tiene las secuencias de aminoácidos y nucleótidos expuesta en la SEQ ID Nº 3 ó 5 y SEQ ID Nº 4 ó 6 respectivamente. Se entiende que las secuencias citadas en la lista de secuencias más adelante como "ADN" representan una ejemplificación de una realización de la invención, ya que los expertos en la técnica reconocerán que tales secuencias se pueden emplear de manera útil en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en esta memoria descriptiva "BASB020" y "polipéptidos BASB020" así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención además proporciona:

(a): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad o identidad exacta a la de la SEQ ID Nº 4 ó 6;

(b): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad o identidad exacta a la de la SEQ ID Nº 3 ó 5 en la longitud entera de la SEQ ID Nº 3 ó 5 respectivamente; o

(c): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad o identidad exacta a la de la SEQ ID Nº 4 ó 6.

Los polipéptidos BASB020 proporcionados en la SEQ ID Nº 2, 4, 6 u 8 son los polipéptidos BASB020 de las cepas de Moraxella catarrhalis MC2931 (ATCC 43617), MC2912, MC2913 y MC2969.

La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB020, es decir, una porción contigua del polipéptido BASB020 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 4 ó 6; es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de originar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB020.

Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB020 que carece de una secuencia guía N - terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C - terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico de BASB020 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todos los dominios extracelulares de un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad a la de la SEQ ID Nº 4 ó 6 en la longitud entera de la SEQ ID Nº 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que parte pero no toda la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB020, los fragmentos pueden estar "aislados" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor de los que forman una parte o región, lo más preferiblemente como una única región continua en un único polipéptido mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 4 ó 6 o de variantes de la misma, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxilo terminal. También se prefieren las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula hospedadora. Se prefieren además fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones hélice alfa y formadoras de hélice alfa, regiones de hoja beta y formadoras de hoja beta, regiones de giro y formadoras de giro, regiones de espiral o formadoras de espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones antipáticas alfa, regiones antipáticas beta, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones de unión a sustrato, y regiones de alto índice antigénico.

Además los fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 4 ó 6, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 4 ó 6.

Los fragmentos del polipéptido de la invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en las que varios, 5 - 10, 1 - 5, 1 - 3, 1 - 2 ó 1 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" o puede ser parte de una proteína mayor tal como un precursor o proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o guía, prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción de recombinantes. Además, también se considera la adición de secuencias de polipéptidos exógenos o de colas de lípidos o de polinucleótidos para incrementar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión soluble solubles modificadas genéticamente que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que tiene lugar fusión en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede retirar simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor Xa de coagulación de sangre.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniaría genética, y al uso de los mismos para seleccionar fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional Números WO 94/29458 y WO 94/22914.

Las proteínas pueden estar químicamente conjugadas, o expresadas como proteínas de fusión recombinantes que permiten que se produzca un incremento de niveles en un sistema de expresión cuando se compara con la proteína no condensada. La pareja de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos de células T auxiliares (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos de células t auxiliares reconocidos por los seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) a niveles mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja potenciadora de expresión.

Las parejas de fusión incluyen la proteína D de haemophilus y la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción terminal C de la molécula. LytA se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa LytA, (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) página 265 - 272}) una autolisina que específicamente degrada ciertos enlaces en la estructura central del peptidoglicano. El dominio C - terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algún análogo de colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C - LytA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C - LytA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795 - 798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula de LytA encontrada en el extremo terminal C que comienza en el residuo 178, por ejemplo los residuos 188 - 305.

La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir polipéptidos que varían entre los referentes en sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las que un residuo se sustituye por otro con características similares. Tales sustituciones típicas son entre otras Ala, Val, Leu e Ile; entre otros Ser y Thr; entre otros los residuos ácidos Asp y Glu; entre otros Asn y Gln; y entre otros los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos de manera sintética, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se comprenden bien en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención se derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, se puede obtener preferiblemente a partir de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención también se puede obtener, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objeto de la invención proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB020, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido denominado en esta memoria descriptiva BASB020.

En una realización particularmente preferida de la invención el polinucleótido comprende una región que codifica BASB020 que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID Nº 3 ó 5 que incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo.

Los polinucleótidos BASB020 proporcionados en la SEQ ID Nº 3 ó 5 son los polinucleótidos BASB020 de las cepas de Moraxella catarrhalis MC2931 (ATCC 43617), MC2912, MC2913 y MC2969.

Como un aspecto adicional de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB020, incluyendo, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB020 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, los ARN no procesados, los ARN de ribozima, los ARNm, los ADNc, los ADN genómicos, los ADN B- y Z. Realizaciones adicionales de la invención incluyen, polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y las variantes de los mismos, y las composiciones que los comprenden.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB020 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID Nº 4 ó 6 y polinucleótidos relacionados estrechamente con ellas y las variantes de las mismas.

En otra realización particularmente preferida de la invención existe un polipéptido BASB020 de Moraxella ca- tarrhalis que comprende o está constituida por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 4 ó 6 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en esta memoria descriptiva, tal como una secuencia de polinucleótidos expuesta la SEQ ID Nº 3 ó 5, un polinucleótido de la invención que codifica el polipéptido BASB020 se puede obtener usando procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómico a partir de bacterias que usan células de Moraxella catarrhalis Catlin como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de polinucleótidos proporcionada en la SEQ ID Nº 3 ó 5, típicamente una genoteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro hospedador adecuado se sonda con un oligonucleótido marcado radiactivamente, preferiblemente un 17 mer o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda se puede después distinguir usando condiciones restrictivas de hibridación. Secuenciando los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñado a partir de la secuencia de polipéptidos o polinucleótidos polipéptido original es posible después extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia de genes de longitud completa. De manera conveniente, tal secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN de doble hebra desnaturalizado preparado a partir de un clon de plásmido. Las técnicas adecuadas las describen Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (Véase en particular, Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denutared Double -Stranded DNA Templates 13.70). La secuenciación directa de ADN genómico también se puede realizar para obtener una secuencia génica de longitud completa. Como ilustración de la invención, cada polinucleótido expuesto en la SEQ ID Nº 3 ó 5 se descubrió en una genoteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, cada secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID Nº 3 ó 5 contiene una fase abierta de lectura que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos expuesto en al SEQ ID Nº 4 ó 6 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando valores de peso molecular de residuos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de referencia de la SEQ ID Nº 1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 841 de la SEQ ID Nº 1, codifica el polipéptido de referencia de la SEQ ID Nº 2.

El polinucleótido de la SEQ ID Nº 3, entre el codón de inicio y el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 841 de la SEQ ID Nº 3, codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº 4.

El polinucleótido de la SEQ ID Nº 5, entre el codón de inicio y el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 841 de la SEQ ID Nº 5, codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº 6.

El polinucleótido de referencia de la SEQ ID Nº 7, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 841 de la SEQ ID Nº 7, codifica el polipéptido de referencia de la SEQ ID Nº 8.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a): una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad o identidad exacta a la SEQ ID Nº 3 ó 5 en la longitud entera de las SEQ ID Nº 3 ó 5 respectivamente; o

(b): una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad o 100% exacta a la secuencia da aminoácidos de la SEQ ID Nº 4 ó 6, en la longitud entera de las SEQ ID Nº 4 ó 6 respectivamente.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos se especies diferentes de Moraxella catarrhalis, se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar una genoteca apropiada en condiciones restrictivas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo entre 45 - 65ºC y una concentración de SDS entre 0,1 y 1%) con una sonda marcada o detectable que consiste o que comprende la secuencia de la SEQ ID Nº 3 ó 5 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica en su longitud completa a una secuencia codificadora (fase abierta de lectura) en la SEQ ID Nº 3 ó 5. También la invención proporciona una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento en fase de lectura con otra secuencia codificadora, tal como una secuencia que codifica una secuencia guía o secretora, una secuencia de pre-, o pro- o prepro- proteína. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificadora, que incluye por ejemplo, pero no se limita a al menos una secuencia 5' y 3' no codificadora, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependientes de rho o independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones, y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos también puede comprender una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia de marca que facilita la purificación del polipéptido condensado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia con marca es un péptido hexa histidina, como se proporciona en el vector Pqe (Qiagen, Inc) y descrita en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821 - 824 (1989), o un péptido tag de HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), los cuales pueden ser útiles en la purificación de la secuencia de polipéptidos condensados a ellos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB020 de la SEQ ID Nº 4 ó 6 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenido en los nucleótidos 1 a 840 de la SEQ ID Nº 3 ó 5 respectivamente. Como alternativa puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº 4 ó 6.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en esta memoria descriptiva abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polinucleótido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de la Moraxella catarrhalis BASB020 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID Nº 4 ó 6. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a la edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificadoras y/o no codificadoras.

La invención también se refiere a variantes de los polinucleótidos descritas en esta memoria descriptiva que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID Nº 4 ó 6. Los fragmentos de polinucleótidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

Las realizaciones adicionales particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB020, que tienen una secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB020 de al SEQ ID Nº 4 ó 6 en la que varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácido están sustituidos, modificados, suprimidos y/o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre éstas están las sustituciones silenciosas, adiciones y supresiones, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASN020.

Realizaciones preferidas adicionales de la invención son polinucleótidos que son al menos 85% idénticos en su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB020 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID Nº 4 ó 6, polinucleótidos que con complementarios a tales polinucleótidos. Como alternativa, los más preferidos son polinucleótidos que comprenden una región que es al menos 90% idéntica en su longitud entera a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB020 y polinucleótidos complementarios a los mismos. A este respecto, los polinucleótidos al menos 95% idénticos en su longitud completa a los mismos se prefieren particularmente. Además, aquellos con al menos 97% se prefieren en gran medida entre aquellos con al menos 95%, y entre éstos aquellos con al menos 98% y al menos 99% son en gran medida particularmente preferidos, siendo los más preferidos con al menos 99%.

Realizaciones preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que mantienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de la SEQ ID Nº 3 ó 5.

De acuerdo ciertas realizaciones preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan, particularmente en condiciones restrictivas, a secuencias de polinucleótidos de BASB020, tales como los polinucleótidos en la SEQ ID Nº 3 ó 5.

La invención además se refiere a polinucleótidos que se hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionados en esta memoria descriptiva. A este respecto, la invención especialmente se refiere a polinucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas a los polinucleótidos descritos en esta memoria descriptiva. Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "condiciones restrictivas" y "condiciones restrictivas de hibridación" significan hibridación que se produce solamente si existe al menos 95% y preferiblemente al menos 97% de identidad entre secuencias. Un ejemplo específico de condiciones restrictivas de hibridación es la incubación durante toda una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5 x de SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma fragmentado de salmón, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de lavado e hibridación se conocen bien y se ilustran en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), particularmente el capítulo 11 en ese documento. La hibridación en solución también se puede usar con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia de polinucleótidos obtenida mediante selección de una genoteca apropiada que contiene el gen completo de una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID Nº 3 ó 5 en condiciones restrictivas de hibridación con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencias de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID Nº 3 ó 5 o un fragmento de la misma; y selección de dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener tal polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores totalmente descritas en otra parte en esta memoria descriptiva.

Como se describe en otra parte en esta memoria descriptiva con relación a los ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, se pueden usar como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar los ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB020 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una identidad alta, particularmente una alta identidad de secuencia, al gen BASB020. Tales sondas generalmente comprenderán al menos 15 residuos de nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos de nucleótidos o pares de bases y tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases.

Una región codificadora de un gen de BASB020 se puede aislar mediante selección usando una secuencia de ADN proporcionada en la SEQ ID Nº 3 '5 para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención se usa después para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN o ARNm genómico con el fin de determinar qué miembros de la genoteca se hibridan a la sonda.

Existen varios procedimientos disponible y bien conocidos por los expertos en la técnica para obtener los ADN de longitud completa, o los ADN de extensión corta, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998 - 9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ilustradas por ejemplo por la tecnología de Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), han simplificado significativamente la investigación de los ADN más largos. En la tecnología de Marathon™, los ADN se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "de adaptador" ligada a cada extremo. Después la amplificación de ácido nucleico (PCR) se lleva a cabo para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos de genes y específicos de adaptadores. La reacción de PCR se repite después usando cebadores "encajados", es decir, cebadores diseñados para hibridarse dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico de adaptador que hibrida además el extremo 3' en la secuencia de adaptador y un cebador específico del gen que hibrida además el extremo 5' en al secuencia génica seleccionada). Después los productos de esta reacción se pueden analizar mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa construido o bien uniendo el producto directamente al ADN existente proporcionando una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR separada de longitud completa usando la información de la secuencia nueva para el diseño del cebador en 5'.

Se pueden emplear los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos de y diagnosis para enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se describe posteriormente en esta memoria descriptiva con relación a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de las SEQ ID Números 3 - 6 se pueden usar en los procedimientos en esta memoria descriptiva como se ha descrito, pero preferiblemente para PCR, con el fin de determinar si o no los polinucleótidos identificados en esta memoria descriptiva en conjunto o en parte se transcriben en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en diagnosis de la fase de infección y tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino o carboxilo terminal, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica). Tales secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína del precursor a una forma madura, puede permitir transporte de proteínas, puede alargar o acortar la semivida de las proteínas o puede facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar a partir de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para cada y todo polinucleótido de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido con los que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido condensado a uno o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se retiran tales precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias se pueden retirar antes de inactivación. En general, tales precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones A, G, C, T/U convencionales para nucleótidos, el término "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en tal posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando se lee en la fase correcta de lectura, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematura en tal fase de lectura.

En resumen, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia guía (que se puede denominar una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que son las secuencias guía de una preproteína, o una proteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia guía y una o más prosecuencias, que generalmente se retiran durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de distribución adecuado tal como inyección directa de ADN de plásmido en músculos (Wolf y col., Hum. Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), distribución de ADN complejado con vehículos proteicos específicos (Wu y col., J. Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenistry y Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col, PNAS USA, (1984) 81: 5489).

Vectores, células hospedadoras, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción libres de células también se pueden emplear para producir tales proteínas usando ARN derivado de construcciones de ADN de la invención.

Los polinucleótidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, para células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y para la producción de polinucleótidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células hospedadoras se pueden modificar por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula hospedadora se puede efectuar mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), tal como, transfección por fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE - dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por legrado, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de una levadura, Kluiveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de al invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de epitomas y de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmicos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. Genéticamente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un hospedador se puede usar para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas en y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (anteriormente).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación por sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónica o catiónica, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y v lecitina. Los más preferiblemente, cromatografía de afinidad por iones metálicos (IMAC) se emplea para purificación. Las técnicas bien conocidas para replegar proteínas se pueden emplear para regenerar conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, aislamiento y o purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus a bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo de un antígeno e inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este propósito son por ejemplo; poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela de canarios), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque Semiliki, virus de encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus asociado a adeno, picornavirus (virus de la polio, rinovirus), herpesvirus (virus zoster de varicela, etc), Listeria, salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Esos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados de diversas maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipo y mutación

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB020 de la invención para uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB020 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para diagnosis de enfermedad, determinación de la fase de enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB020, se pueden detectar en el nivel de ácidos nucleicos o aminoácidos mediante una diversidad de técnicas bien conocidas así como procedimientos proporcionados en esta memoria descriptiva.

Los polipéptidos y polinucleótidos para prognosis, diagnosis u otro análisis se pueden obtener a partir de materiales corporales de individuos supuestamente infectados y/o infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, se pueden usar directamente para detección o se puede amplificar enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes de análisis. El ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico también se puede usar de las mismas maneras. Usando amplificación, caracterización de la especie y cepa de organismo infeccioso o residente presente en un individuo, se puede preparar mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las supresiones e inserciones se pueden detectar mediante un cambio en tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada entre un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden identificar mediante hidridación de ADN amplificado a secuencias de polinucleótidos BASB020 marcados. Secuencias coincidentes perfecta o significativamente se pueden distinguir de dúplex no coincidentes imperfecta o más significativamente mediante digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o mediante la detección de diferencias en temperaturas de fusión o cinética de renaturalización. Las diferencias de secuencias de polinucleótidos también se puede detectar mediante alteraciones en al movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles comparados con una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de polinucleótidos también se pueden detectar mediante secuenciación de ADN o ARN directa. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). Cambios de secuencia en localizaciones específicas también se pueden revelar mediante ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNasa, ensayo de protección de V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397 - 4401
(1985).

En otra realización, una disposición de sondas de oligonucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos BASB020 o fragmentos de la misma se pueden construir para llevar a cabo la selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Procedimientos de tecnología de disposición se conocen bien y tienen aplicabilidad general y se pueden usar para dirigir una diversidad de cuestionasen genética molecular incluyendo expresión génica, unión genética, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996)).

De este modo en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a): un polipéptido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 3 ó 5, o un fragmento de la misma;

(b): una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c): un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEQ ID Nº 4 ó 6 o un fragmento del mismo; o

(d): un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferiblemente para el polipéptido de la SEQ ID Nº 4 ó 6.

Se apreciará que en cualquiera de dichos kits, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Tal kit se usará en diagnosis de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente, la SEQ ID Nº 3 ó 5, que está asociada con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de diagnóstico que se puede añadir a, o definir, una diagnosis de una enfermedad, una prognosis de un curso de enfermedad, una determinación de una fase de enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, que se produce por infraexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en dicho polinucleótido se pueden detectar a nivel de polinucleótido mediante una diversidad de técnicas, tales como las descritas en otra parte en esta memoria descriptiva.

Las células de un organismo que llevan mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención también se puede detectar a nivel del polinucleótido o polipéptido mediante una diversidad de técnicas, que permite, por ejemplo, la formación de serotipos. Por ejemplo, RT - PCR se puede usar para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente, por ejemplo, GeneScan. ARN, ADNc o ADN genómico también se puede usar para el mismo propósito, PCR. Como ejemplo, los cebadores de PCR complementarios a un polipéptido que codifica el polipéptido BASB020 se puede usar para identificar y analizar mutaciones.

La invención además proporciona cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos retirados del extremo 5' y/o el 3'. Estos cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o ARN de BASA020 aislados de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polipéptido aislado de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido se puede después someter a diversas técnicas para elucidación de al secuencia de polinucleótidos. De esta forma, las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos se puede detectar y usar para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o curso, o determinar serotipo y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención además proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones provocadas por Moraxella catarrhalis, que comprende la determinación de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID Nº 1, 3, 5 ó 7. Incremento o disminución de la expresión de un polinucleótido BASB020 se puede medir usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en al técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT - PCR, protección de ARNasa, transferencia de Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión del polipéptido BASB020 comparado con muestras de tejidos de control normales se pueden usar, por ejemplo, para detectar la presencia de una infección. Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar niveles de un polipéptido BASB020, en una muestra derivada de un hospedador, tal como un material corporal, los conocen bien los expertos en al técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen, radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polipéptidos de la invención se pueden usar como componentes de disposiciones de polipéptidos, preferiblemente disposiciones o retículas de alta densidad. Estas disposiciones de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, un conjunto de manchas cada una comprendiendo un gen diferente, y comprendiendo además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, se puede usar para sondar, tal como el uso de hibridación o amplificación de ácidos nucleico, usando una sonda obtenida o derivada a partir de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótidos particular o secuencia relacionada en un individuo, Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede se útil en el diagnóstico y/o pronóstico de un curso de la enfermedad. Se prefiere una retícula que comprende un número de variantes de la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID Nº 3 ó 5. También se prefiere una que comprenda un número de variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID Nº 4 ó 6.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos específicos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB020.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que llevan epítopes de cualquiera o ambos, análogos de cualquiera o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un anima, preferiblemente uno no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las descritas en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495 - 497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pg. 77 - 96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de estados Unidos Nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También, ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para el polipéptido o polipéptidos de la invención.

Como alternativa, la tecnología de exposición de proteínas y péptidos en la cápsida de fagos se puede utilizar para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención bien a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados por poseer anti - BASB020 o de genotecas inactivas (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552 - 554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779 - 783). La afinidad de estos anticuerpos también se puede mejorar mediante, por ejemplo, arrastre de cadenas (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden emplear para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

De este modo, entre otros, los anticuerpos contra polipéptido BASB020 o polinucleótido BASB020 se pueden emplear para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptidos incluyen variantes, antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalente forman un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo de una variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénica en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo puede lo más preferiblemente estar "humanizado", la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se ha transplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como se describe en Jones y col., (1986), Nature 321, 522 - 525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266 - 273.

Ensayos y moléculas de antagonistas y agonistas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también se pueden usar para valorar la unión de sustratos de pequeñas moléculas y ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, genotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Colignan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión mediante medios de una marca directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de selección puede implicar competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de activación se ensayan generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del compuesto candidato. El péptido constitutivamente activo y/o polipéptidos constitutivamente expresados se pueden emplear en procedimientos de selección para agonistas o inhibidores inversos, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclado de un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB020 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB020 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como las realizadas a partir de la porción Fc y polipéptido BASB020, como se ha descrito anteriormente en esta memoria descriptiva, también se pueden usar para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos relacionados filogenético y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8: 52 - 58 (1995); y K. Johanson y col., L Biol Chem, 270 (16): 9459 - 9471 (1995)).

Los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos que se unen y/o interactúan con un polipéptido de la presente invención también se pueden usar para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo ELISA para medir los niveles secretados o asociados a células de polipéptido que usa anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Éste se puede usar para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

La invención también proporciona un procedimiento de selección de compuestos para identificar aquellos que potencian (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de polipéptidos o polinucleótidos ABSB020, particularmente los compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción de síntesis, un compartimiento celular, tal como una membrana, envuelta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos, que comprende el polipéptido BASB020 y un sustrato o ligando marcado de tal polipéptido se incuba en ausencia o presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o antagonista de BASB020. La capacidad de la molécula candidato de agonizar o antagonizar el polipéptido BASB020 se refleja en una disminución de la unión del ligando marcado o disminución de la producción del producto de cada sustrato. Las moléculas que se unen de forma gratuita, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB020 van a ser los más probablemente buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien, y como puede ser el caso, incrementan la velocidad de producción del producto a partir del sustrato, incrementan la transducción de la señal, o incrementan la actividad de los canales químicos son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como puede ser el caso, la producción del producto a partir del sustrato, transducción de señal, o actividad de los canales químicos se puede potenciar usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a colorimétricos, sustrato marcado convertido en producto, un gen indicador que es responsable de cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB020, y ensayos de unión conocidos en al técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas de BASB020 en un ensayo competitivo que combina BASB020 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB020, moléculas de unión a BASB020 recombinantes, sustratos o ligandos naturales, miméticos de sustratos o ligandos, en condiciones apropiados para un ensayo de inhibición competitiva. BASB020 se puede marcar, tal como mediante radiactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas de BASB020 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto se puede determinar exactamente para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y por lo tanto inhiben o suprimen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionada o que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB020, evitando por lo tanto la acción o expresión de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB020 excluyendo los polinucleótidos y/o polipéptidos BASB020 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña molécula que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido evitando por lo tanto la unión a moléculas de unión celular, de manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de pequeñas moléculas incluyen pero no se limitan a pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas de polaridad opuesta (véase Okano, J. Neurochem 56: 560 (1991); OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GEN EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB020.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión modificadas por ingeniería genética que comprende un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede retirar simplemente mediante incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor de coagulación Xa. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniaría genética, y al uso de los mismos para seleccionar fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional Números WO 94/29458 y WO 94/22914.

Cada una de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en esta memoria descriptiva se pueden usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras expresión, se puede usar como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. De manera adicional, las secuencias de polinucleótidos que codifican regiones terminales de la proteína codificada o Shine - Delgarno u otra traducción que facilita las secuencias del ARNm respectivo se pueden usar para construir secuencias de polaridad opuesta para controlar la expresión de la secuencia codificadora de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedador eucariótico, preferiblemente mamífero, responsable de una secuela de infección. En particular, las moléculas de la invención se pueden usar: en la prevención de adhesión de bacterias, en particular bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, a proteínas de matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de mamíferos, o en dispositivos permanentes o a una matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de mamíferos y proteínas BASB020 bacterianas que median el gaño en tejido y/o; bloquear la progresión normal de patogénesis en infecciones iniciadas distintas de la implantación de dispositivos permanentes o mediante otras técnicas quirúrgicas.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BASB020, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención se pueden emplear, por ejemplo, para evitar, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia peptídico, suficientemente similar al péptido nativo (secuencialmente o estructuralmente), que es capaz de ser reconocida por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de originar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un vehículo adecuado.

Los mimotopos de péptidos se pueden diseñar para un propósito particular mediante adición, supresión o sustitución de aminoácidos elegidos. De este modo, los péptidos se pueden modificar para propósitos de fácil conjugación a un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser deseable para péptidos conjugados a un vehículo proteico incluir un terminal hidrófobo distal del terminal conjugado del péptido, de manera que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína del vehículo. Por lo tanto presentando el péptido en una conformación que se parece los más estrechamente posible a la del péptido encontrado en el contexto de la molécula entera nativa. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para que tengan una cisteína N - terminal y una cola amidada hidrófoba C - terminal. Como alternativa, la adición o sustitución de una forma de diastereómero D de uno o más de los aminoácidos se puede realizar para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del
péptido.

Como alternativa los mimotopos de péptidos se pueden identificar usando anticuerpos que son capaces ellos mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como tecnología de exposición de proteínas y péptidos en la cápsida de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos peptídicos anti - nativos, pero pueden ellos mismos no compartir homología de secuencias significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende la inoculación del individuo con polinucleótido y/o polipéptido BASB020, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir anticuerpo y/o respuesta inmune de células T para proteger dicho individuo de la infección, particularmente la infección bacteriana y lo más particularmente infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos en los que tal respuesta inmunológica retrasa la replicación bacteriana. Incluso otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de inducción de una respuesta inmunológica en un individuo que comprende la distribución a tal individuo de un vector, secuencia o ribozima de ácido nucleico para dirigir la expresión de polinucleótido y/o polipéptido BASB020, o un fragmento o una variante del mismo in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, de manera que produzca anticuerpo y/o respuesta inmune de células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citoquina o células T citotóxicas, para proteger dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una enfermedad, bien la enfermedad esté ya establecida dentro del individuo o no. Un ejemplo de administrar el gen es acelerándolo en las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo ADN - proteína o un complejo ARN - proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de haber inducido dentro de el una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo a un polipéptido y/o polipéptido BASB020 codificado a partir de ellos, en la que la composición comprende un polipéptido y/o polipéptido BASB020 recombinante codificado a partir de ellos y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polipéptido, polipéptido BASB020 codificado a partir de ellos, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica se puede usar terapéuticamente o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de células CTL o T CD4+.

Un polipéptido BASB020 o un fragmento del mismo se puede condensar con una coproteína o resto químico que puede o no puede producir por él mismo anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína condensada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras De este modo la proteína recombínate condensada, comprende preferiblemente una coproteína antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, Glutation - S - transferasa (GST) o beta - galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína se puede unir a o bien el terminal amino o carboxi de al primera proteína.

Esta invención proporciona composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y procedimientos que comprenden los polinucleótidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. y col., Science 273: 352 (1996).

También, esta invención proporciona procedimientos que usan el polinucleótido o fragmentos particulares de los mismos, que se ha mostrado que codifican regiones no variables de las proteínas de la superficie celular bacteriana, en construcciones de polinucleótidos usados en tales experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este planteamiento permitirá la preparación posterior de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivado del órgano requerido del animal que resiste con éxito o eliminan la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacunas que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ya que los polipéptidos y/o polinucleótidos se pueden descomponer en el estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyecciones estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosificación unitaria o de dosificación múltiple, por ejemplo, ampollas y viales selladas y se pueden almacenar en una condición de secado por congelación solamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de uso.

La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas de adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema de adyuvante origina preferiblemente una respuesta de tipo TH1 inmune.

\newpage

Una respuesta inmune se puede distinguir ampliamente en dos categorías extremas, siendo una humoral o respuestas mediada por células (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos efectores de anticuerpos y celulares de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta se ha denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células), y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas extremas de tipo TH1 se pueden caracterizar por la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, restringido de haplotipo, y respuestas de células asesinas naturales. En ratones las respuestas de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano éstos corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en IgG1, IgA e IgM de ratones.

Se puede considerar que la fuerza de conducción detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son citoquinas. Altos niveles de citoquinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células para el antígeno dado, mientras que altos niveles de citoquinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales para el antígeno.

La distinción de respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe por ser predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de la descrita en clones de células T CD4 +ve de tipo murino por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: diffrent patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p. 145 - 173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 están asociadas a la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas asociadas a menudo directamente a ala inducción de respuestas inmunes de tipoTH1no están producidas por células T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas de tipo TH2 están asociadas a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas o bien de TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 mediante linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medición de la relación IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpo específica de antígeno.

De este modo, un adyuvante de tipo TH1 es uno que preferentemente estimula poblaciones de células T aisladas para producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de tanto linfocitos T citotóxicos CD8+ como respuestas de inmunoglobulina específica de antígeno asociadas a isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de estimulación preferencial de la respuesta celular TH1 se describen en la solicitud de patente internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

El monofosforil lípido A 3 des-O-acilado es uno de tales adyuvantes. Éste se conoce a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y está fabricado por Ribi Immunocehm, Montana. Una forma preferida de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biological SA).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para que se filtren de manera estéril a través de una membrana de 0,22 micrones (patente europea número 0 689 454).

3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug - 100 \mug preferiblemente 25 - 50 \mug por dosis en el que el antígeno estará típicamente presente en un intervalo 2 - 50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de Quillaza Saponaria Molina. Opcionalmente éste se puede mezclar con monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

Las formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 se han descrito previamente (documento WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol se ha mostrado que son adyuvantes estimulantes de TH1 exitosos cuando se formulan junto con un antígeno.

Adyuvantes adicionales que son estimuladores preferenciales de respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se describe en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes adyuvantes estimuladores de TH1, tales como las mencionadas en esta memoria descriptiva anteriormente, también se contemplan por proporcionar un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta de células TH1. Por ejemplo, QS21 se puede formular junto con 3D-MPL. La relación de QS21 : 3D-MPL típicamente será del orden de 1 : 10 a 10 : 1; preferiblemente 1 : 5 a 5 : 1 y a menudo sustancialmente 1 : 1. El intervalo preferido para sinergia óptima es 2,5 : 1 a 1 : 1 de 3D-MPL : QS21.

Preferiblemente un vehículo también está presente en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, tocoferol alfa y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en tal emulsión. Adicionalmente la emulsión aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente para la administración a seres humanos QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo 1 \mug - 200 \mug, tal como 10 - 100 \mug, preferiblemente 10 \mug - 50 \mug por dosis. Típicamente la emulsión aceite en agua comprenderá entre 2 y 10% de escualeno, entre 2 y 10 de tocoferol alfa y entre 0,3 y 3% de Tween 80. Preferiblemente la relación de escualeno : tocoferol alfa es igual o menor que 1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede estar presente a un nivel de 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contendrá además un estabilizador.

Las emulsiones aceite en agua no tóxicas preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas. Tal composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante que induce TH-1 como se ha descrito en esta memoria descriptiva anteriormente.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB02, se ha de entender que ésta cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, supresiones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos y polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB020 y/o un polipéptido BASB020 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden polinucleótido y/o un polipéptido descrito en esta memoria descriptiva o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico para la administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La formulación debe satisfacer el modo de administración. La invención además se refiere a envases y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionados de la invención.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera eficaz, conveniente incluyendo, por ejemplo, la administración mediante las vías tópica, oral, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo en forma de una composición inyectable, por ejemplo en forma de una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o un compuesto de moléculas pequeñas, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La invención además se refiere a envases y kits que comprenden uno o más recipientes llenados con uno o más de los
ingredientes de las composiciones anteriormente mencionadas de la invención. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptarán a la vía de administración, por ejemplo mediante una vía sistémica o una oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de inyección, tales como subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen la administración transmucosal o transdérmica que usa penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención se pueden formular en una formulación entérica o una encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de ungüentos, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo estará entre 0,01 mg/kg y 10 mg/kg, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosificación real que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso medio. Pueden, por supuesto, ser casos individuales donde intervalos de dosificación más altos o más bajos son necesarios, y tales están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la condición del sujeto, y el juicio del facultativo asistente. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1 - 100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en una forma inyectable. Se pueden emplear adyuvantes convencionales para mejorar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para vacunación es 0,5 - 5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente 1 - 3 veces y con un intervalo de 1 - 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observará ningún efecto toxicológico indicado con los compuestos de la invención que impediría su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, se esperaran variaciones amplias en la dosificación necesaria, en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las eficacias diferentes de diversas vías de administración. Por ejemplo, la administración oral se esperaría que requiera dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas habituales para optimización, como se entenderá bien en la técnica.

Bases de datos de las secuencias, secuencias en un medio tangible, y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman una fuente de información valiosa con la que determinar sus estructuras en 2 y 3 dimensiones así como para identificar recuentes adicionales de homología similar. Estos planteamientos se facilitan más fácilmente mediante almacenamiento de la secuencia en un medio legible de ordenador y después usando los datos almacenados en un programa de estructura molecular conocido o buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tal como el paquete de programas GCG.

La invención también proporciona procedimientos para el análisis de secuencias de caracteres o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencias, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, conjunto de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de la fase abierta de lectura, llamada de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recortes de ácidos nucleicos, y análisis de picos de cromatogramas de secuenciación.

Un procedimiento basado en ordenador se proporciona para realizar identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparando dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar homología.

Un procedimiento basado en ordenador también se proporciona para realizar la identificación de homología, dicho procedimiento comprendiendo las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparando dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar homología.

Todas las publicaciones y referencias, que incluyen pero no se limitan a las patentes y las solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad como si cada publicación individual o referencia estuviera indicada específica e individualmente para incorporarse mediante referencia en el presente documento como si se expusiera completamente. Cualquier solicitud de patente para la que esta solicitud reivindica prioridad también se incorpora como referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad de la manera descrita anteriormente para las publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad" como se sabe en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos de dos o más secuencias de polipéptidos, como puede ser el caso, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, como puede ser el caso, como se determina mediante la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" se puede fácilmente calcular mediante procedimientos conocidos, que incluyen pero sin limitación, los descritos en (Computacional Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carrillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP BLASTN (Altschul, S. F. y col., J Molec. BIol. 215: 403 - 410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444 - 2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCBI NLM Bethesda. MD 20894: Altschul, S., y col., J Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). El algoritmo bien conocido de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluye lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970).

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 89: 10915 -
10919 (1992).

Penalización de huecos: 8.

Penalización de longitud de huecos: 2.

Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con no penalización para los huecos extremos).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970).

Matriz de comparación: coincidencias = + 10, no coincidencia = 0 Penalización de huecos: 50.

Penalización de longitud de huecos: 3.

Disponible como: El programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de los ácidos nucleicos.

Un significado preferido de "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporcionan en (1) y (2) más adelante.

(1) Las realizaciones de polipéptidos además incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tienen al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión, sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, ó

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

\newpage

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifican el polipéptido de la SEC ID. Nº: 2 puede crear mutaciones sin sentido, sentido erróneo, o de desplazamiento de fase en esta secuencia codificadora y por lo tanto alterar el polipéptido codificado por los polinucleótidos después de tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, es decir puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de ácidos nucleicos que incluye transición, transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las porciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1, o

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID. Nº: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad a la secuencia de polipéptidos de referencia de la SEC ID. Nº: 2, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión, sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución, conservadora o y no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales amino- o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº 2, ó

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y).

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 2, es decir puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de aminoácidos que incluye sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las porciones terminales amino- o carboxi- de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, o

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y).

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2, y es 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85 etc., y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de
x_{a}.

"Individuo(s)" cuando se usa con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitación a metazoano, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido de origen natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en esta memoria descriptiva. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante se "aísla" incluso si todavía está presente en dicho organismo, dicho organismo puede ser vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado incluyendo regiones de una sola o doble hebra.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se diferencia de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en una secuencia de nucleótidos de otro, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante puede o no puede alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe más adelante. Una variante típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos del otro, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante del polipéptido de referencia se puede diferenciar en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no puede estar codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que sea de origen natural. Las variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos se pueden preparar mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad producida por o relacionada con infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño en el nervio auditivo, retraso en el aprendizaje del habla, infección del tracto respiratorio superior e infección del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos más adelante se llevan a cabo usando técnicas habituales, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la técnica, excepto donde se describe de otra manera en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación confirmatoria de ADN del gen BASB020 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

El gen BASB020 de la SEC ID Nº: 1 de referencia se descubrió primero en la base de datos Incyte PathoSeq que contiene secuencias de ADN genómico no terminadas de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis también denominada cepa Mc2931). La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB020, mostrada en la SEC ID Nº: 2 de referencia, mostró similitud significativa (36% de identidad en una superposición de 227 aminoácidos) a la proteína de TlyC hemolisina de Serpulina hyodysenteriae.

La secuencia del gen BASB020 se confirmó además experimentalmente. Con este fin, se extrajo ADN genómico de 10^{10} células de células de M. catarrhalis (cepa ATCC 43617) usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen GMBH), y 1 \mug de este material se sometió a la amplificación de ADN con la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores E475781a (5' - ACT TGA ATA AAA CCG AGT G - 3') [SEQ ID Nº 9] y E475782a
(5' - GAG ATT GGC CGC AAC ATG C - 3') [SEQ ID Nº 10]. Este producto de PCR se purificó en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) y se sometió a secuenciación de ADN usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin -
Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 377/PRISM. La secuenciación de ADN se realizó en ambas hebras con una redundancia de 2 y la secuencia de longitud completa se ensambló usando ell softwarte Sequencher™ (Applied Biosystems). La secuenciación de ADN resultante volvió a ser 100% idéntica a la SEC ID Nº: 1 de referencia.

Ejemplo 2 Análisis de variabilidad del gen BASB020 entre varias cepas de Moraxella catarrhalis 2A: Análisis de longitud del fraga,ento de restricción (RFLP)

Se extrajo ADN genómico de 16 cepas de Moraxella catarrhalis(presentadas en la tabla 1) como se describe más adelante. Moraxella catarrhalis se sembró por estría para detectar colonias individuales sobre placas de agar BHI y se desarrollaron durante toda una noche a 37ºC. Se recogieron 3 ó 4 colonias individuales y se usaron para inocular aproximadamente 1,5 ml de cultivo de siembra en caldo BHI (infusión de cerebro - corazón) que se desarrolló durante toda una noche en un incubador con oscilación, aproximadamente 300 rpm, a 37ºC. Un matraz erlenmeyer de 500 ml que contenía aproximadamente 150 ml de caldo BHI se inoculó con el cultivo de siembra y se desarrolló durante aproximadamente 12 - 16 horas a 37ºC en un incubador con oscilación, aproximadamente 175 rpm, para generar masa celular para aislamiento de ADN. Las células se recogieron mediante centrifugación en un rotor GSA Sorvall a aproximadamente 2000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante y el sedimento celular se suspendió en aproximadamente 5,0 ml de agua estéril. Se añadió un volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20 mM, Tris HCl 40 mM, pH 8,0, SDS al 0,5% (p/v), 2-mercaptoetanol al 0,5% (v/v), y 250 \mug/ml de proteinasa K) y las células se suspendieron mediante agitación suave y trituración. Después la suspensión celular se incubó aproximadamente 12 horas a 50ºC para lisar las bacterias y liberar ADN cromosómico. El material proteínaceo se precipitó mediante la adición de 5,0 ml de NaCl saturado (aproximadamente 6,0 M, en agua estéril) y centrifugación aproximadamente 5.500 x g en un rotor Sorvall SS34 a temperatura ambiente. El ADN cromosómico se precipitó a partir del sobrenadante transparente mediante la adición de dos volúmenes de etanol al 100%. El ADN agregado se recogió y se lavó usando agitación suave en un volumen pequeño de una solución de etanol al 70%. El ADN cromosómico purificado se suspendió en agua estéril y se dejó que se disolviera/desembolsara durante toda una noche a 4ºC mediante balanceo suave. La concentración de ADN disuelto se determinó espectrofotométricamente a 260 nm usando un coeficiente de extinción de 1,0 unidades de O. O. aproximadamente 50 \mug/ml.

Este material se sometió a continuación a amplificación por PCR usando los oligonucleótidos MC-Hly3-BamF
(5' - AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCC ACC G - 3')
[SEQ ID Nº 11] y oligonucleótidos MC-Hly3-SalRC (5' - AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG - 3') [SEQ ID Nº 12]. Después los amplicones del gen BASB020 correspondientes se sometieron independentemente a hidrólisis usando enzimas de restricción (AciI, AluI, HphI, MseI, NlaIII, Tsp 5091) y se separaron los productos de restricción se separaron por gel sobre agarosa o gel de poliacrilamida usando procedimientos de biología molecular habituales como se describe en "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Eds: Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989". Las fotografías de los geles de electroforesis resultantes se muestran en la figura 1. Para cada cepa, se puntuaron patrones de ROLF correspondiente a las 6 enzimas de restricción y se combinaron. Después se definieron grupos de cepas que comparten combinación idéntica de patrones de RFLP. Usando esta metodología, las cepas ensayadas en este estudio caían en 6 grupos genómicos (Grupos 1: Mc2904, Mc 2905, Mc 2906, Mc2969; Grupo 2: Mc2907, Mc2913; Grupo 3: Mc2908, Mc2909, Mc2931, Mc2975; Grupo 4: Mc2910, Mc2912, Mc2956; Grupo 5: Mc2911; Grupo 6: Mc2926). Estos datos soportan que la población de Moraxella catarrhalis usada en este estudio muestra alguna diversidad de secuencia de nucleótidos para el gen BASB020.

2B: Secuenciación de ADN en otras cepas

La cepa ATCC 43617 (Mc2391) usada para determinar la secuencia de BASB020 se clasificó mediante RFLP en el grupo número 3. Usando el procedimiento experimental como se describe en el ejemplo 1, la secuencia del gen BASB020 también se determinó para cepas de Moraxella catarrhalis representativas de de los otros tres grupos genómicos de RPLF (Gr. 1 (Mc2969), Gr. 2 (Mc2913) y Gr. 4 (Mc2912)). Las secuencias de polinucleótidos del gen BASB020 de las cepas Mc2912, Mc2913, y Mc2969 se muestran en la SEQ ID Nº 3, 5 y t de referencia, respectivamente. Estas secuencias de polinucleótidos se tradujeron en secuencias de aminoácidos, que se muestran en la SEQ ID Nº 4, 6 y 8 de referencia, respectivamente. Usando el programa MegAlign del paquete DNASTAR Lasergene, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID Nº 1 de referencia, 2, 3, 5 y 7 de referencia, y se muestra en al figura 2. Una comparación por parejas de identidades se resume en la tabla 2, que muestra que las cuatro secuencias génicas del nucleótido BASB020 son similares al nivel de identidad o mayor que 99%. Usando el mismo programa, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias de polipéptido de la SEQ ID Nº 2 de referencia, 4, 6 y 8 de referencia, y se muestra en la figura 3. Una comparación por parejas de identidades se resume en la tabla 3, mostrando que las cuatro secuencias génicas de la proteína BASB020 son similares al nivel de identidad o mayor que 99%.

TABLA 1 Características de las cepas de Moraxella catarrhalis usadas en este estudio

Cepa	Aislada en:	A partir de:
Mc2904	Estados Unidos	Timpanocentesis
Mc2905	Estados Unidos	Timpanocentesis
Mc2906	Estados Unidos	Timpanocentesis
Mc2907	Estados Unidos	Timpanocentesis
Mc2908	Estados Unidos	Timpanocentesis de otitis aguda
Mc2909	Estados Unidos	Timpanocentesis
Mc2910	Estados Unidos	Timpanocentesis
Mc2911	Estados Unidos	Timpanocentesis de otitis aguda
Mc2912	Estados Unidos	Timpanocentesis de otitis aguda
Mc2913	Estados Unidos	Timpanocentesis de otitis aguda
Mc2926	Estados Unidos	Timpanocentesis
Mc2931/ATCC	Estados Unidos	Aspirado transtraqueal
Mc2956	Finlandia	Fluido de oído medio
Mc2960	Finlandia	Fluido de oído medio
Mc2969	Finlandia	Nasofaringe (faringitis - rinitis)
Mc2975	Finlandia	Nasofaringe (rinitis)

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Identidades por parejas de las secuencias de polinucleótido BASB020 (en %)

	Seq ID Nº 3	Seq ID Nº 5	Seq ID Nº 7 de referencia
Seq ID Nº 1 de referencia	99,5	99,2	99,3
Seq ID Nº 3		99,6	99,3
Seq ID Nº 5			99,4

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Identidades por parejas de las secuencias de polipéptido BASB020 (en %)

	Seq ID Nº 3	Seq ID Nº 5	Seq ID Nº 7 de referencia
Seq ID Nº 2 de referencia	99,6	99,6	100
Seq ID Nº 4		100	99,6
Seq ID Nº 6			99,6

Ejemplo 3 Construcción de plásmido para expresar el BASB020 recombinante A: Clonación de BASB020

Los sitios de restricción BamHI y SalI modificados por ingeniería genética en los cebadores de amplificación ([SEQ ID Nº 11]) delantero y ([SEQ ID Nº 12]) inverso, respectivamente, permitieron la reacción direccional usando columnas giratorias basadas en gel de sílice (QiaGen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Para producir los extremos BamHI y SalI requeridos necesarios para clonar, producto de PCR purificado se digirió secuencialmente hasta finalización con enzimas de restricción BamHI y SalI como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión de restricción, el producto PCR se purificó mediante una columna giratoria como se ha indicado anteriormente para retirar las sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión por enzima. El fragmento de ADN digerido se purificó de nuevo usando columnas giratorias basadas en gel de sílice antes de la ligadura con el plásmido pQE30.

B. Producción de vector de expresión

Para preparar el plásmido pQE30 de expresión, se digirió de manera similar hasta finalización con tanto BamHI como SalI y después se trató con fosfatasa de intestino de ternera ((CIP, aproximadamente 0,02 unidades/pool del extremo 5', Life Technologies) siguiendo las indicaciones del fabricante para evitar la auto ligadura. Se usó un exceso de aproximadamente 5 veces molar del fragmento digerido para preparar el vector con el fin de programar la reacción de ligadura. Se realizó un patrón de aproximadamente 20 \mul de reacción de ligadura (aproximadamente 16ºC, aproximadamente 16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica usando la T4 ADN ligasa (aproximadamente 2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Una alícuota de la ligadura (aproximadamente 5 \mul) se usó para transformar células M15(pREP4) electrocompetentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en al técnica. Después de un período de crecimiento de aproximadamente 2 - 3 horas de a 37ºC en aproximadamente 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían canamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml). Ambos antibióticos se incluyeron en el medio de selección para asegurar que todas las células transformadas llevaban el plásmido pREP4 (KnR), que lleva el gen lacIq necesario para la represión de la expresión para la expresión inducible por IPTG de proteínas sobre pQE30, y el plásmido pQE30 - BABS020 (ApR). Las placas se incubaron durante toda una noche a 37ºC durante aproximadamente 16 horas. Se recogieron colonias individuales KnR/ApR con mondadientes estériles y se usaron para inocular "parches" placas de KnR/ApR en LB reciente así como aproximadamente 1,0 ml de caldo de cultivo LB KnR/ApR. Tanto las placas de parche como el cultivo en caldo de incubaron durante toda una noche a 37ºC en o bien un incubador habitual (placas) o baño de agua con oscilación.

Un análisis de PCR basado en células enteras se empleó para verificar que los transformantes contenían la inserción de ADN de BASB020. Aquí, aproximadamente 1,0 ml de caldo de cultivo en LB de Kn/Ap durante toda una noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recogieron mediante centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (aproximadamente 3 minutos, temperatura ambiente, aproximadamente 12.000 x g). El sedimento celular se suspendió en aproximadamente 200 \mul de agua estéril y aproximadamente 10 \mul usados para programar una reacción de PCR de aproximadamente 50 \mul de volumen final que contenía cebadores de amplificación tanto directos como inversos de BASB020. Las concentraciones finales Las concentraciones finales de los componentes de reacción de PCR eran esencialmente los mismos que los especificados en el ejemplo 2 excepto que se usaron aproximadamente 5,0 unidades de Taq polimerasa. La etapa de inicial de desnaturalización a 95ºC se incrementó hasta 3 minutos para asegurar el rompimiento térmico de las células bacterianas y la liberación del ADN del plásmido. Un ciclador térmico modelo 9700 de ABI y un perfil de amplificación térmica de tres etapas y 32 ciclos, es decir 95ºC, 45 segundos; 55 -
58ºC, 45 segundos, 72ºC 1 minutos, se usaron para amplificar el fragmento de PCR MC-P6 a partir de las células transformantes lisadas. Después de la amplificación térmica, una alícuota de aproximadamente 20 \mul de la reacción se analizó mediante electroforesis sobre gel de agarosa (agarosa al 0,8% en Tris - acetato - EDTA (tampón TAE). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV después de la electroforesis sobre gel y tinción con bromuro de etidio. Un patrón de tamaño molecular de ADN (escala de 1 Kb, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con muestras de ensayo y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que producían el producto de PCR de 504 pares de bases se identificaron como cepas que contenían una construcción de expresión de BASB020. El plásmido de expresión que contenía cepas se analizaron después para la expresión inducible de BASB020 recombinante.

C. Análisis de expresión de transformantes PCR - positivos

Para cada transformante PCR - positivo anterior, se inocularon aproximadamente 5,0 ml de caldo LB que contenía canamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug / ml) con células de la placa de parches y se desarrollaron durante toda una noche a 37ºC con agitación (aproximadamente 250 rpm). Una alícuota del cultivo de siembra durante toda una noche (aproximadamente 1,0 ml) se inoculó en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía aproximadamente 125 ml de caldo LB de Kn/Ap y se desarrolló a 37ºC con agitación (aproximadamente 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una D. O. a 600 de aproximadamente 0,5, es decir, fase semilogarítmica (usualmente aproximadamente 1,5 - 2,0 horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (aproximadamente 12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y expresión de proteína de BASB020 recombinante se indujo mediante la adición de IPTG (solución 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubación de los cultivos tanto inducidos por IPTG como no inducidos se continuó durante aproximadamente 4 horas adicionales a 37ºC con agitación. Las muestras (aproximadamente 1,0 ml) de cultivos tanto inducidos como no inducidos se retiraron después del período de inducción y las células se recogieron mediante centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se suspendieron en aproximadamente 50 \mul de agua estéril, después se mezclaron con un volumen igual de 2 x de tampón de muestra SDS - PAGE de Lamelli que contenía 2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua en ebullición durante aproximadamente 3 minutos para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (aproximadamente 15 ml) de lisados celulares tanto inducidos por IPTG como no inducidos por duplicado en gel de poliacrilamida Tris al 12%/glicina (minigeles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados inducidos y no inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de desarrollo SDS/Trs/glicina (Bio Rad). Después de electroforesis, se tiño un gel con azul brillante commassie R250 (BioRad) y después se destiñó para visualizar la(s) proteína(s) BASB020 inducible(s) por IPTG. El segundo gel se sometió a electrotransferencia sobre una membrana PVDF (tamaño de poro 0,45 micrones, Novex) durante aproximadamente 2 horas a 4ºC usando un aparato de transferencia Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia de metanol (20%) de Towbin. El bloqueo de las incubaciones de membrana y de anticuerpos se realizó de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo anti - RGS (His)3 monoclonal, seguido de un segundo anticuerpo anti - ratón de conejo se conjugó a HPR (QiaGen), se usó para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB020. La visualización del patrón reactivo anti - His se logró usando o bien un sustrato insoluble en ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

D: Confirmación de secuencia

Para verificar además que la proteína BASB020 recombinante inducible por IPTG que se expresa en la fase abierta de lectura correcta y no una molécula falsa que surge de un artefacto de clonación (es decir, un desplazamiento de fase), se determinó la secuencia de ADN de la inserción clonada. La secuencia de ADN para el gen BASB020 de Moraxella catarrhalis se obtuvo a partir de una hebra usando metodologías convencionales de secuenciación de ciclos de PCR asimétrica (ABI Prism Dye - Terminator Cycle Sequencing, Perkin - Elmer). Las reacciones de secuenciación se programaron con ADN de plásmido de expresión sin digerir (aproximadamente 0,5 \mug/rxn) como molde y cebadores de secuenciación específicos del vector pQE30 y específicos de ORF (aproximadamente 3,5 pmol/rxn). Además del molde y cebador de secuenciación, cada reacción de secuenciación (aproximadamente 20 \mul) contenía los cuatro dNTP diferentes (es decir, A, G, C, y T) y los cuatro nucleótidos terminadores ddNTP correspondientes (es decir, ddA, ddG, ddC, y ddT); estando cada terminador conjugado a uno de los cuatro tintes fluorescentes, Joe, Tam, Rox, o Fam. Los productos de elongación de secuenciación de hebra individual se terminaron en las posiciones aleatorias junto con el molde mediante la incorporación de los terminadores de ddNTP marcados con tinte. Los productos de terminación marcados con tintes fluorescentes se purificaron usando columnas de cromatografía de exclusión por tamaño en microcentrífuga (Princeton Genetics), se secaron a vacío, se suspendieron en un tampón de resuspensión de molde (Perkin - Elmer) para electroforesis capilar o formamida desionizada para PAGE, se desnaturalizaron a 95ºC durante aproximadamente 5 minutos, y se analizaron mediante electroforesis capilar de alta resolución (secuenciador de ADN automático ABI 310, Perkin - Elmer) o PAGE de alta resolución (secuenciador de ADN automático ABI 377, Perkin - Elmer) según recomienda el fabricante. Se recogieron los datos de secuencia de ADN producidos a partir de reacciones individuales y se analizaron las intensidades de los picos fluorescentes relativos automáticamente sobre un ordenador PowerMAC usando el software de análisis de secuencias ABI (Perkin - Elmer). Las secuencias de ADN autoanalizadas individualmente se editaron manualmente para evaluar la exactitud antes de combinarse en una "cuerda" de secuencia de cadena simple consenso usando software AutoAssembler (Perkin - Elmer). La seceunciación determinó que el plásmido de expresión contenía la secuencia correcta en la fase abierta de lectura correcta.

Ejemplo 4 Producción de BASB020 recombinante Cepa bacteriana

Una cepa de expresión recombinante de E. coli M15 (pREP4) que contiene un plásmido (pQE30) que codifica BASB020 de M. catarrhalis, se usó para producir masa celular para purificación de proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó sobre placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de canamicina ("Kn") y 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap'") para asegurar tanto el plásmido control pREP4 lacIq como la construcción de expresión pQE30-BASB020 se mantuvieron ambas. Para la criopreservación a -80ºC, la cepa se propagó en caldo LB que contenía la misma concentración de anticuerpos después se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

Medio

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante estaba constituido por 2X de caldo YT (Disco) que contenía 50 \mug/ml de Kn y 100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio del fermentador a 0,25 ml/l (antiespumante 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB020, se añadió IPTG (Isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido) al fermentador (final, 1 mM).

Fermentación

Un matraz de siembra erlenmeyer de 500 ml, que contenía 50 ml de volumen de trabajo, se inoculó con 0,3 ml de cultivo congelado descongelado rápidamente, o varias colonias de un cultivo en placa de agar selectivo, y se incubó durante aproximadamente 12 horas a 37ºC \pm 1ºC en una plataforma oscilante a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra se usó después para inocular un fermentador de volumen de trabajo de 5 l que contenía 2 X de caldo YT y tanto el antibiótico Kn como Ap. El fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se hizo funcionar a 37 \pm 1ºC, 0,2 - 0,4 de aspersión de aire VVM, 250 rpm en impulsores Rushton. El pH no se controló ni en el cultivo de siembra del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH variaba entre 6,5 y 7,3 en el fermentador. IPTG (solución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) se añadió al fermentador cuando el cultivó alcanzó crecimiento semilogarítmico (aproximadamente 0,7 unidades a 600 de D. O.) Las células se indujeron durante 2 - 4 horas después se recogieron mediante centrifugación usando o bien un Heraeus 28RS (Sepatech) o centrífuga se supervelocidad RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacenó a -20ºC hasta procesamiento.

Purificación Agentes químicos y materiales

Imidazol, clorhidrato de guanidina, Tris (hidroximetilo), y EDTA (ácido etilen diamino tetraacético) grado biotecnología o mejor se obtuvieron todos de Ameresco Chemical, Solon, Ohio, Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxi-etanol), fosfato sódico, monobásico, y urea eran de calidad reactiva o mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St Louis, Missouri. Ácido acético glacial y ácido clorhídrico se obtuvieron de Mallincrodt Baker In., Phillipsburg, New Jersey. Metanol se obtuvo de Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey. Pefabloc® SC (4-(2-aminoetil)bencenosulfonilfluoruro), comprimidos de cóctel de inhibidor de la proteasa completo, y PMSF (fenilmetil - sulfonilfluoruro) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, Indiana, Bestatina, Pepstatina A, e inhibidor de la E-64 proteasa se obtuvieron de Calbiochem, LaJolla, California, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1 x PBS) se obtuvo de Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland. Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10 x PBS) se obtuvo de Bio Whittaker, Walkersville, Maryland. Anticuerpo penta - His, libre de BAS se obtuvo de QiaGen, Valencia, California. IgG anti - ratón de cabra Affini Pure conjugado a peroxidasa se obtuvo de Jackson se obtuvo de Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. Solución simple de AEC se obtuvo de Zymed, Sur de San Francisco, California. Todos los agentes químicos eran de calidad reactiva o mejor.

Resina Ni-NTA Superflow se obtuvo de QiaGen Inc., Valencia, California. Precast Tris-Glicina 4 - 20% y geles de poliacrilamida al 10 - 20%, todos tampones y soluciones de desarrollo. Patrones de See-Bue preteñidos, patrones de MultiMark multicoloreados y membranas de transferencia PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California. Kits de tinte de plata SDS - PAGE se obtuvieron de Daichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. Solución de tinte Coomassie se obtuvo de Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Filtros de jeringa de 0,2 \mu Acrodisc® PF se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Filtros de jeringa desechables GD/X de 25 mm se obtuvieron de Wathman Inc., Clifton, New Jersey. Tuberia de diálisis 8000 MWCO se obtuvo de BioDesign Inc., Nueva York, Carmal Nueva York. Reactivos de ensayo de proteínas BCA y tubería de diálisis de piel de serpiente 3500 MWCO se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

Protocolo de extracción

Pasta celular se descongeló a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Se pesaron 5 a 6 gramos de material en un tubo de centrífuga desechable de 50 ml. A esto se añadieron 5 ml/gramo tampón de clorhidrato de guanidina (Gu-HCl) (clorhidrato de guanidina 6 M, fosfato sódico 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 8,0). Se resuspendió pasta celular usando un homegeneizador Proscientific PRO300D, a ¾ de potencia durante 1 minuto. Después la mezcla de extracción se situó a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 a 90 minutos. Después de 60 a 90 minutos la mezcla de extracción se centrifugó a 15800 x g durante 15 minutos (centrífuga Sorvall RC5C, 11500 rpm). El sobrenadante (S1) se decantó y se guardó para purificación adicional. El sedimento (P1) se guardó para análisis.

Unión de BASB020 a resina níquel - NTA

Se añadieron al S1 tres o cuatro ml de resina Ni - NTA. Después esto se situó a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora el S1/Ni - NTA se introdujo en una columna XK16 de Pharmacia. Después la columna se lavó con tampón Gu-HCl 1 M (clorhidrato de guanidina 1 M, fosfato sódico 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 8,0). A esto después siguió un lavado con tampón fosfato (fosfato sódico 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 6,3). Después la proteína se eluye de la columna son tampón imidazol 250 mM (imidazol 250 mM, fosfato sódico 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 5,9).

Formulación final

BASB020 se formuló mediante diálisis durante toda una noche contra, tres cambios de Triton X-100 al 100% y 1 X PBS, pH 7,4, para retirar Gu-HCl residual e imdazol. La proteína purificada se caracterizó y se usó para producir anticuerpos como se ha descrito más adelante.

Caracterizaciones bioquímicas Análisis SDS - PAGE y transferencia de western

La proteína purificada recombinante se resolvió sobre geles de poliacrilamida al 4 - 20% y se transfirió electroforéticamente a membranas PVDF a 100 V durante 1 hora como se ha descrito previamente (Thebaine y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 - 4354). Después las membranas PVDF se pretrataron con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene leche en polvo no grasa al 5%. Todas las incubaciones posteriores se llevaron a cabo usando este tampón de pretratameinto.

Las membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o suero inmune anti - His de conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas PVDF de lavaron después dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro sódico 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Las membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG anti - conejo de cabra marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas PVDF se lavaron después 4 veces con tampón de lavado, y se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea como se suministra por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno.

Los resultados de un SDS - PAGE (figura 4) muestran una proteína de aproximadamente 32 - 35 kDa purificada mayor que 90% y que es reactiva a un anticuerpo anti - RGS(His) mediante transferencias de Western (figura 5) del SDS - PAGE.

Secuenciación de proteínas

La secuenciación de aminoácidos amino terminal de la proteína purificada se realizó para confirmar la producción de la proteína recombinante correcta usando protocolos químicos bien definidos sobre un secuenciador de Hewlett - Packard modelo G1000A con un modelo 1090 LC y un secuenciador de Hewlett - Packard modelo G1100 LC.

Ejemplo 5 Producción de antisuero para BASB020 recombinante

Antisuero polivalente dirigido contra la proteína BASB020 se generó vacunando dos conejos con la proteína BASB0230 recombinante purificada. A cada animal se le administró un total de tres inmunizaciones por vía intramuscular (i. m.) de aproximadamente 20 \mug de proteína BASB020 por inyección (comenzando con adyuvante de Freund completo y seguido de adyuvante de Freund incompleto) a aproximadamente intervalos de 21 días. Se extrajo sangre de los animales antes de la primera inmunización ("presangrado") y los días 35 y 57.

Los títulos de la proteína anti - BASB020 se midieron mediante un ELISA usando proteína BASB020 recombinante purificada (0,5 \mug/pocillo). El título se define como la dilución más alta igual o mayor que 0,1 calculada con la siguiente ecuación: DO media de dos muestras de ensayo de antisuero - la DO media de dos muestras de ensayo de tampón. Los títulos después de tres inmunizaciones estaban entre 3000 y 8000.

Los antisueros se usaron como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una transferencia de Western como se describe en el ejemplo 4 anteriormente. La transferencia de Western mostró la presencia de anticuerpo anti - BASB020 en el suero de animales inmunizados.

Ejemplo 6 Caracterización inmunológica Análisis de transferencia de Western

Se desarrollaron varias cepas de M. catarrhalis incluyendo ATCC 49413, y ATCC 43617, así como aislamientos clínicos de diversas regiones geográficas en placas de agar chocolate durante 48 horas a 35ºC en CO_{2} al 5%. Se usaron varias colonias para inocular 25 ml de caldo Muller Hinton en un matraz de 250 ml. Los cultivos se desarrollaron durante toda una noche y se recogieron mediante centrifugación. Las células se solubilizaron después suspendiendo 30 \mug de células en 150 \mul de tampón de muestra PAGE (tampón Tris 360 mM, pH 8,8, que contenía dodecilsulfato sódico al 4% y glicerol al 20%), e incubando la suspensión a 100ºC durante 5 minutos. Las células soubilizadas se resolvieron en geles de poliacrilamida al 4 - 20% y las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a membranas PVDF a 100 V durante 1 hora como se ha descrito previamente (Thebaine y col., 1979, Proc Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 - 4354). Las membranas de PVDF se pretrataron después con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía leche en polvo no grasa al 5%. Todas las incubaciones posteriores se llevaron a cabo usando tampón de pretratamiento.

Las membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de suero preinmune o suero inmune de conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas PVDF se lavaron después dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro sódico 150 mM y Tween - 20 al 0,05%). Las membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG anti - conejo de cabra marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas PVDF se lavaron después 4 veces con tampón de lavado, y se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea como se suministra por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno.

Una proteína de aproximadamente 32 - 35 kDa (correspondiente a peso molecular esperado de BASB020) que es reactiva con el antisuero se detecta en todas las cepas de Moraxella.

Ejemplo 7 Presencia de anticuerpo de BASB020 en suero de convalecientes humanos

Se realizó análisis de transferencia de Western de BASB020 recombinante purificada como se ha descrito en el ejemplo 4 y 6 anterior, excepto que una combinación de suero humano de niños infectados por M. catarrhalis se usa como la preparación del primer anticuerpo. Los resultados muestran que antisueros de individuos infectados naturalmente reaccionan con la proteína recombinante purificada, como se muestra en la figura 6.

Ejemplo 8 Eficacia de vacuna de BASB020: potenciación de eliminación del pulmón de Moraxella catarrhalis en ratones

La capacidad protectora de BASB020 recombinante humana se ensayó en un modelo de ratón. El modelo de ratón se basa en el análisis de invasión de pulmón por M. catarrhalis siguiendo una exposición intranasal convencional para ratones vacunados.

Grupos de 6 ratones BALB/c (hembras, de 6 semanas de edad) se inmunizaron por vía subcutánea con 100 \mul de vacuna correspondiente a 10 \mug de dosis y se reinmunizaron 2 semanas después. Una semana después del refuerzo, los ratones reexpusieron mediante instilación de 50 \mul de suspensión bacteriana (+/- 10^{6} UFC/50 \mul) en el orificio nasal izquierdo bajo anestesia (los ratones se anestesiaron con una combinación de anestésicos cetamina y xilazina, 0,24 mg de xilazina (Rompun) y 0,8 mg de cetamina (Imalgene)/100 \mul). Los ratones se sacrifican 4 horas después de la exposición y los pulmones se retiran asépticamente y se homogeneizan individualmente. El log10 del número medio ponderado de UFC/pulmón se determina contando las colonias desarrolladas en placas de agar de Mueller - Hinton después de sembrar 20 \mul de diluciones en serie del homogenato. Se calcularon la media aritmética del log10 del número medio ponderado de UFC/pulmón y las desviaciones estándar para cada grupo.

Los resultados se analizan estadísticamente aplicando ANOVA de una vía después de asumir igualdad de varianza (comprobada por la prueba de Brown y Fosythe) y normalidad (comprobada usando la prueba de Shapiro - Wilk). Las diferencias entre grupos se analizaron usando la prueba de Dunnet, prueba de intervalo de student de Tukey (HSD) y prueba de Student - Newman - Keuls. En este experimento grupos de ratones se inmunizaron o bien con BASB020 adsorbido en AIPO_{4} (10 \mug de BSASB020 en 100 \mug AIPO_{4}) o con una preparación de células completas matadas (kwc) de la cepa ATCC 43617 de M. catarrhalis adsorbida en AIPO_{4} (5 10^{8} células en 100 \mug de AIPO_{4}) o con 100 \mug de AIPO_{4} sin antígeno. Los ratones se expusieron con 10^{6} UFC de la cepa ATCC 43617 de bacterias M. catarrhalis.

Se calcularon para cada grupo el log10 del número medio ponderado de UFC/pulmón y la desviación estándar 4 horas después de exposición. Los ratones inmunizados en falso tenían 5,5 (+/- 0,23) log10 de UFC/pulmón 4 horas después de exposición.

La preparación kwc indujo eliminación significativa en pulmones comparada con el grupo control (diferencia 1,74 log). La vacuna de BASB020 indujo una diferencia 0,62 log en la eliminación en pulmones comparada con el grupo control, que era significativamente diferente del control.

Una transferencia de Western usando proteína BASB020 recombinante purificada y suero combinado de ratones se inmunizaron con proteína BASB020 y recogido antes de exposición muestra la presencia de anticuerpo para la proteína BASB020 (figura 7).

Ejemplo 9 Producción de péptidos BASB020, antisuero y reactividad de los mismos

Dos péptidos específicos de v de aminoácidos cortos, que tienen las secuencias de CNEEAWSQNRRAELSY (SEQ ID Nº 13) e YTGVAPLVDNDETV (SEQ ID Nº 14) se produjeron en el laboratorio usando procedimientos bien conocidos. Estos péptidos acoplados a KLH se usaron para producir anticuerpos en hembras de conejo New - Zealand libres de patógenos específicos de 12 semanas de edad. Los conejos recibieron 4 inyecciones a aproximadamente intervalos de 3 semanas de 200 \mug de péptido - KLH en adyuvante de Freund completo (1ª inyección) o incompleto (2ª, 3ª y 4ª inyecciones). Se extrajo sangre de los animales antes de la primera inmunización y un mes después de la 4ª inyección.

Los títulos de punto medio de anti - péptido se midieron mediante un ELISA usando péptidos libres. Los títulos del punto medio de anti - péptido un mes después de la 4ª inmunización eran superiores a 4100. Las transferencias de Western de BASB020 recombinante purificada, usando anticuerpos anti - péptido como primer anticuerpo, se prepararon como se ha descrito en el ejemplo 4 y 6. Los resultados se presentan en la figura 8.

Materiales depositados

Un depósito que contiene una cepa Catlin de Moraxella catarrhalis se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos tipo (en esta memoria descriptiva "ATCC") el 21 de junio de 1997 y número de depósito asignado 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una genoteca insertada de 1,5 - 2,9 kb secada por congelación, construida a partir de aislamiento de M. catarrhalis obtenido a partir de un aspirado transtraqueal de un minero de carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506 - 508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se denomina en esta memoria descriptiva como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB020 de longitud completa.

Un depósito del vector pMC-Hly3 constituido por ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 de ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y número de depósito asignado 207106.

La secuencia de polinucleótidos contenida en la cepa/clon depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado en ellos, se controla en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias en esta memoria descriptiva.

El depósito de las cepas depositadas se ha hecho bajo los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente. Las cepas depositadas se liberarán irrevocablemente y sin restricción o condición al público tras la expedición de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no son una admisión que requiere un depósito para habilitación, tal como la requerida bajo 35 U. S. C. \NAK 112.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Formulario pasa a página siguiente)

1

<110> SmithKline Beecham Biologicals S. A.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Compuestos novedosos

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BM45320

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para la versión 3,0 de Windows

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacterias

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acttgaataa aaccgagtg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacattggcc gcaacatgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag gggatccatg cgtggtctta ggcgttggtt atccaccg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttattcagca ttctcaagct gtggtatcag

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asn Glu Glu Ala Trp Ser Gln Asn Arg Arg Ala Glu Leu Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp Glu Thr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

INFORMACIÓN DE SECUENCIA

Secuencias de polinucleótido y polipéptido BASB020

SEQ ID Nº 1

Secuencia del polinucleótido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2931

13

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 2

Secuencia del polipéptido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2931

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 3

Secuencia del polinucleótido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2912

15

16

\newpage

SEQ ID Nº 4

Secuencia del polipéptido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2912

17

SEQ ID Nº 5

Secuencia de polinucleótido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2913

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 6

Secuencia de polipéptido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2913

19

SEQ ID Nº 7

Secuencia de polinucleótido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2969

20

\newpage

SEQ ID Nº 8

Secuencia de polipéptido BASB020 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2969

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACT TGA ATA AAA CCG AGT G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAC ATT GGC CGC AAC ATG C

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCC

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACC G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAT CAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CNEEAWSQNRRAELSY

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID Nº 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YTGVAPLVDNDETV

\hfill

Claims

1. Un polipéptido aislado útil en una vacuna contra infección por Moraxella catarrhalis que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6 en la longitud completa de SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6 respectivamente.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6 en la longitud completa de SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6 respectivamente.

3. El polipéptido aislado según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6.

4. Un polipéptido aislado útil en una vacuna contra infección por Moraxella catarrhalis constituido por la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6.

5. Un fragmento inmunogénico aislado del polipéptido según una cualquiera de las la reivindicaciones 1 a 4, en el que el fragmento inmunogénico es capaz de inducir una respuesta inmune, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, que reconoce el polipéptido de las SEQ ID Nº 4 o SEC ID Nº 6.

6. Un polinucleótido o un fragmento inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico es parte de una proteína de fusión mayor.

7. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido o un fragmento inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, útil en una vacuna contra infección por Moraxella catarrhalis, que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6 en la longitud entera de la SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6, útil en una vacuna contra infección por Moraxella catarrhalis, en la región codificadora entera; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad a la de la SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5 en la longitud entera de la SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

11. El polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en el que la identidad es al menos 95% con la SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6, o el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5 ó 6.

13. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de las SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5.

14. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptidos de las SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6; útil en una vacuna contra una infección por Moraxella catarrhalis, obtenible mediante la selección de una genoteca apropiada en condiciones de hibridación restrictivas con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5 o un fragmento de las mismas.

15. Un vector de expresión que comprende un polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14.

16. Un vector de expresión según la reivindicación 15 en la forma de un microorganismo vivo recombinante.

17. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15, o una membrana de la célula hospedadora que contiene el polipéptido expresado.

18. Un procedimiento para producir un polipéptido o un fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 17 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido o el fragmento inmunogénico del medio de cultivo.

19. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 - 14 que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

20. Una composición de vacunas que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o el fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición de vacunas que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. La composición de vacunas según una cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

23. Un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6 en la longitud entera de la SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6 respectivamente o un fragmento inmunogénico de las mismas en el que el fragmento inmunogénico es capaz de originar una respuesta inmune, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, que reconoce el polipéptido de las SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 6.

24. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 23 en el que dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico es parte de una proteína de fusión mayor.

25. Un procedimiento de diagnosis de una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende la identificación de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido, presentes dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

26. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 en la preparación de un medicamento para uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

27. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 - 14 en la preparación de un medicamento para uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

28. Una composición terapéutica útil en el tratamiento de seres humanos con enfermedad de Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 23 ó 24 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.