CZ298353B6 - Nevirový vektor - Google Patents

Abstract

Komplex pro dodávání nukleových kyselin, obsahující kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina a kationtový lipid, kde tento komplex obsahuje:(a) zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (b) jeden nebo více virových sbalovacích polypeptidu nukleových kyselin nebo jejich derivátu, kde tyto polypeptidy nebo jejich deriváty jsou schopny (i) vázat se na zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (ii) kondenzovat zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a kde zvolená sekvence nukleové kyseliny je vzhledem k polypeptidu heterologní. Poskytuje se také zpusob zavádení zvolené sekvence nukleové kyselinydo bunky prostrednictvím dodávacího vektoru.

Description

Předkládaný vynález se týká komplexů kationtový lipid/protein/nukleová kyselina, které obsahují virové sbalovací proteiny, a jejich použití při účinném dodávání nukleových kyselin do buněk jako jsou neuronální buňky.

Dosavadní stav techniky

Slibných pokroků při nevirovém přenosu genů bylo dosaženo v důsledku produkce syntetických liposomů formulovaných s kationtovými lipidy, které jsou schopny transfekovat buňky. Málo z těchto komplexů však bylo testováno na schopnost účinně přenášet DNA do buněk CNS za získání exprese transgenu. Schopnost účinně a bezpečně transfekovat neuronální buňky by mohla poskytnout výkonný nástroj pro objasnění funkce neuronů a mohla by vést k novým způsobům léčení nervových poruch.

Genová terapie CNS však nemohla být plně využívána v důsledku nedostatku účinného prostředku pro transdukci postmitotických neuronů. U většiny studií se používalo pro dodávání genů virových vektorů. Nevýhodou mnoha virových vektorů jsou však problémy s imunitou a cytotoxicitou a obtížností manipulace osobami, které nejsou odborníky v oboru virologie (Wood M. J. A. a další, Inflammatory effects of gene-transfer into the CNS with defective HSV-1 vectors. Gene Ther. 1994; 1: 283 - 291; Byrnes A. P. a další, Adenovirus gene-transfer causesinflammation in the brain. Neuroscience 1995; 66: 1015 - 1024; Naldini L. a další, In vivo gene delivery and stable transduction of nondiving celíš by a lentiviral vector [viz poznámky]. Science 1996; 272: 263 - 267). Jako alternativní metoda pro buněčnou transdukci se nyní objevují nevirové vektory. Nejslibnější pokroky při nevirovém přenosu genů byly dosaženy při produkci syntetických liposomů formulovaných s kationtovými lipidy (cytofektiny) schopnými transfekovat buňky. Tyto kationtové liposomy se relativně snadno používají, mají širokou použitelnost a postrádají cytotoxicítu (Miller A. D., Cationic liposomes for gene delivery. Angewandte ChemieInternational Edition 1998; 37: 1769- 1785).

V současnosti se stále vyvíjejí nové formulace kationtových liposomů (Lee R. J., Huang L., Lipidic vector systems for gene transfer. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1997; 14: 173 - 206). Pouze malé množství těchto komplexů však bylo testováno na schopnost účinně transdukovat buňky uvnitř CNS (Gao X., Huang L._} Cationic liposome-mediated genetransfer. Gene Ther. 1995; 2: 710- 722; Felgner P. L. a další, Lipofection - a Highly Efficient, Lipid-Mediated Dna-Transfection Proceduře. Proceedings Og the National Academy Of Sciences Ofthe United States OfAmerica 1987; 84: 7413 -7417; Farhood H., SerbinaN., Huang L., The role of dioleoyl phosphatidylethanolamin in cationic liposome mediated gene transfer. Biochem. Biphys. Acta 1995; 1235: 289 - 295; Caplen N. J. a další, In-vitro liposome-mediated DNA transfection of epithelial-cell lineš using the cationic liposome DC-Chol/DOPE. Gene Ther. 1995; 2: 603 - 613). Kationtové liposomy působí prostřednictvím elektrostatických interakcí s negativně nabitou DNA a následně s buněčnými membránami, přičemž přes buněčnou membránu přecházejí prostřednictvím procesu pomalé endocytózy (Gao X., Huang L., Cationic liposome-mediated gene-transfer. Gene Ther. 1995; 2: 710- 722; Labat-Moleur F. a další, An electron microscopy study into the mechanism of gene transfer with lipopolyamines. Gene Ther. 1996; 3: 1010 - 1017; Zabner J. a další, Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. J. Biol. Chem. 1995; 270: 18997 - 19007). Tyto liposomy jsou často formulovány s použitím neutrálního lipidu dioleoyl-L-a-fosfatidylethanolaminu (DOPE), který je extrémně účinný při pufrování a rozrušování endosomú (Farhood H., Serbina N., Huang L., The role of dioleoyl phosphatidylethanolamin in cationic liposome mediated gene transfer. Biochem. Biophys. Acta 1995; 1235: 289 - 295; Felgner J. H. a další, Enhanced Gene Delivery and Mechanism Studies With a Novel Series of Cationic Lipid Formulations. J. Biol. Chem. 1994; 269: 2550- 2561). Z perinukleámího prostoru je transfekovaný genetický materiál uvolňován

-1 CZ 298353 B6 z liposomového komplexu, transportován do jádra a exprimován. Dosud bylo ukázáno, že úspěšnou transfekci do CNS mohou zprostředkovat pouze liposomy formulované z N-[ 1-(2,3dioleyloxy)propyl]”N,N,NtrimethylamoniumchlorÍdu (DOTMA) a DOPE (Sahenk Z. a další, J

Gene Delivery to Spinal Motor Neurons. Brain Res. 1993: 606: 126 - 129; Iwamoto Y. a další, I

Liposome-Mediated Bdnf Cdna Transfer in Intact and Injured Rat-Brain. Neuroreport 1996; 7: j

609 - 612; Roessler B. J., Davidson B. L., Direct plasmid-mediated transfection of adult murine l brain-cells in-vivo using cationic liposomes. Neurosci Letí. 1994; 167: 5 - 10; Zhou X., Huang *

L., DNA transfection mediated by cationic liposomes containing lipopolylysin: characterization and mechanism of action, Biochim. Biophys. Acta 1994; 1189: 195 - 203). Pro použití pro genovou terapii jsou velmi zapotřebí líposomové komplexy schopné vysoce účinné transfekce buněk CNS.

Hlavním omezením nevirového přenosu genů je tvorba velkých agregovaných molekul při tvorbě komplexů liposom: DNA (Lee R. J., Huang L., Lipidic vector systems for gene transfer. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1997; 14: 173 - 206). Tyto velké agregáty mohou snížit účinnost transfekce pravděpodobně v důsledku omezení endocytózy komplexů. Jeden přístup pro omezení tohoto jevu je snížení velikosti molekul DNA prostřednictvím kondenzace DNA před tvorbou komplexu. Předkondenzace DNA poskytne menší komplexy a zlepšenou účinnost transfekce (Sorgi F. L., Bhattacharya S., Huang L., Protamíne sulfáte enhances lipid— mediated gene transfer. Gene Ther, 1996; 4: 961 - 968; Li S., Huang L., Protamine sulfáte provides enhanced and reproducible intravenous gene transfer by cationic liposome/DNA complex. Joumal of Liposome Research 1997: 7: 207 - 219; Vitiello L. a další, Condensation of plasmid DNA with póly lysině improves liposome-mediated gene transfer into established and primary muscle cells. Gene Ther. 1996; 3: 396 - 404; Namiki Y., Takahashi T,, Ohno T., Gene transduction for disseminated intraperitoneal tumor using cationic liposomes containing non-histoone chromatin proteins: cationic liposomal gene therapy of carcinomatosa. Gene Ther. 1998; 4: 240 246; Gao X., Huang L., Potentiation of cationic liposome-mediated gene delivery by polycations. Biochem. 1996; 35: 9286- 9286; Fritz J. D. a další, Gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA. Hum. Gene Ther. 1996; 7: 1395- 1404; Hagstrom J. E. a další, Complexes of non-cationic liposomes and histone HI mediát efficient transfection of DNA without encapsulation. Biochim. Biophys Acta 1996; 1284: 47 - 55). Byly identifikovány různé polykationty, které jsou účinné při zlepšování transfekci zprostředkovaných liposomy. Z těchto látek poskytly póly- L- lysin a protamin nej významnější výsledky umožňující více než třicetinásobné zvýšení ve srovnání s komplexy bez předkondenzace u řady jiných než neuronálních buněčných linií (Sorgi F. L., Bhattacharya S., Huang L., Protamine sulfáte enhances lipid— mediated gene transfer. Gene Ther. 1997; 4: 961 - 968; GaoX., Huang L., Potentiation of cationic liposome-mediated gene delivery by polycations, Biochem. 1996: 35: 9286 - 9286).

Zvláště dobré výsledky při zvyšování transfekce liposomy má protaminsulfát. Protámin je v přírodě se vyskytující polykationt, který se nalézá ve hlavičce spermatozoí. Úlohou protaminu je kondenzovat DNA ve spermatu a napomáhat jeho přenosu do jádra vajíčka. Vlastnost protaminu z hlediska zaměření na jádro způsobuje jeho zvláštní vhodnost pro přenos genů. Na rozdíl od syntetického poly-L-lysinu, který' má rozsah velkých molekulových hmotností (18 000 až 19 200 Da), se protamin vyskytuje v přírodě, je menší a má menší rozmezí molekulové hmotnosti (4000 až 4250 Da). Tyto vlastnosti znamenají, že existuje menší možnost imunogenních odpovědí v cílové tkáni a je možno snadněji řídit kondenzaci. Pro zvyšování přenosu DNA prostřednictvím liposomů byly také používány jiné proteiny kondenzující DNA vyskytující se v přírodě. Fritz a další (Fritz J. D, a další, Gene transfer into mammalian cells using histoone-condensed plasmid DNA. Hum. Gene Ther. 1996; 7: 1395- 1404) dosáhli přibližně třicetinásobného zvýšení při lipofekci s použitím rekombinantního lidského proteinu H1 histonu nesoucího signál lokalizace do jádra (nls-Hl). Bylo také ukázáno, že lipofekci zvyšuje nehistonový chromosomální protein s vysokou pohyblivostí skupiny 1,2, který se rutinně používá při metodě HVJliposomů (Namiki Y., Takahashi T, Ohno T., Gene transduction for disseminated intraperitoneal tumor using cationic liposomes containing non-histone chromatin proteins: cationic liposomal gene therapy of carcinomatosa. Gene Ther, 1998; 5: 240-246; Isaka Y. a další, The HVJ liposome method. Exp-Nephrol 1998; 6: 144 - 147).

-2CZ 298353 B6

Podstata vynálezu

Autoři vynálezu testovali proteiny asociované s virovou DNA na jejich schopnost zvyšovat přenos genů založený na liposomech. Autoři zvláště porovnávali virově kódovaný syntetický peptid Mul a rekombinantní protein Vpl adenoviru, popřípadě polyomaviru. Peptid Mul může mít úlohu při kondenzaci chromosomu adenoviru, zatímco VP1 je jediný strukturní protein polyomaviru, který vykazuje vazebnou aktivitu k DNA (Gillock E, T. a další, Polyomavirus major capsid protein VP1 is capable of packaging cellular DNA when expressed in the baculovirus systém. J. Virol. 1997; 71: 2857 - 2865 issn: 0022-2538x; Chang D., Cai X., Consigli R, A., Characterization of the DNA binding properties of polyomavirus capsid proteins. Journal of Virology 1993; 67: 6327 - 6331; Anderson C. W., Young Μ. E., Flint S. J., Characterization of the adenovirus 2 virion protein, mu. Virology 1989; 172: 506- 512). Vpl, ale nikoli Mul, obsahuje vložený klasický signál nukleární lokalizace (NLS) podobný signálu, který se nalézá v HMG-1,2 a nls-Hl (Chang D., Cai X., Consigli R. A., Characterization of the DNA binding properties of polyomavirus capsid proteins, Journal of Virology 1993; 67: 6327 - 6331). Autoři vynálezu zjistili, že Mul, ale nikoli Vpl, významně zlepšuje přenos genů zprostředkovaný kationtovými liposomy do buněk odvozených z nervového systému a ledvin. Autoři vynálezu také zjistili, že zvýšení pomocí Mul bylo větší u diferenciovaných buněk, což ukazuje na možnou použitelnost tohoto přístupu v případě neuronálních buněk in vivo.

Tato zjištění jsou základem pro experimentální a terapeutická použití dodávání DNA do buněk CNS zprostředkovaného liposomy.

Předkládaný vynález tedy poskytuje nevirový vektor pro dodávání nukleových kyselin, který obsahuje kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina a kationtový lipid, přičemž tento komplex obsahuje:

(a) zvolenou sekvenci nukleové kyseliny (nucleic acid sequence of interest, NOI); a (b) jeden nebo více virových sbalovacích polypeptidů nukleových kyselin nebo jejich derivátů, kde tyto polypeptidy nebo jejich deriváty jsou schopny (i) vázat se na zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (ii) kondenzovat zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a kde zvolená sekvence nukleové kyseliny je vzhledem k polypeptidů heterologní.

S výhodou je alespoň jeden polypeptid adenovirový sbalovací polypeptid nukleové kyseliny nebo jeho derivát. Výhodněji je adenovirový polypeptid Mul, pV nebo pVII nebo jejich derivát.

Termín „heterologní vzhledem k polypeptidů“ znamená, že jsou vyloučeny virové zvolené sekvence nukleové kyseliny, které se přirozeně vyskytují v kombinaci s virovým sbalovacím polypeptidem.

Ve výhodném provedení vektor dále obsahuje polypeptid obsahující sekvenci nukleární lokalizace (NLS). Výhodněji je polypeptid obsahující sekvenci nukleární lokalizace (NLS) adenovirový pV nebo jeho derivát.

Předkládaný vynález také poskytuje kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina obsahující kationtový lipid, polypeptidovou složku a složku nukleové kyseliny, pro použití při dodávání složky nukleové kyseliny do jádra eukaryotické buňky, přičemž (i) polypeptidovou složkou je virový sbalovací polypeptid nukleové kyseliny nebo jeho derivát;

(ii) polypeptidová složka nebo její derivát je schopna vázat se na zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (iii) polypeptidová složka nebo její derivát je schopna kondenzovat zvolenou sekvenci nukleové kyseliny;

-3CZ 298353 B6 a kde nukleová kyselina je vzhledem k polypeptidu heterologní.

Alespoň jeden polypeptid je s výhodou adenovirový sbalovací polypeptid nukleové kyseliny nebo jeho derivát. Výhodněji je adenovirový polypeptid Mul, pV nebo pVII nebo jejich derivát

Ve výhodném provedení obsahuje komplex dále polypeptid obsahující sekvenci nukleární lokalizace (NLS). Výhodněji je polypeptidem obsahujícím sekvenci nukleární lokalizace (NLS) adenovirový pV nebo jeho derivát.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby nevirového dodávacího vektoru nukleových kyselin obsahujícího kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina a kationtový lipid, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky*.

(a) zvolená sekvence nukleové kyseliny se uvede do styku s virovým sbalovacím polypeptidem nukleové kyseliny nebo jeho derivátem, kde tato polypeptidová složka nebo její derivát je schopna (i) vázat $e na zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (ii) kondenzovat zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a kde zvolená sekvence nukleové kyseliny je vzhledem k polypeptidu heterologní; a (b) takto vytvořený komplex nukleová kyselina/polypeptid se uvede do styku s kationtovým lipidem.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob zavádění zvolené sekvence nukleové kyseliny do eukaryotické buňky, kde tento způsob zahrnuje uvedení buňky do styku s komplexem podle vynálezu, kde tento komplex obsahuje zvolenou sekvenci nukleové kyseliny. Buňka je s výhodou neuronální, rakovinná nebo epitel iální buňka.

V alternativním provedení může být namísto nebo navíc k virovému sbalovacímu polypeptidu nukleové kyseliny použit polypeptid nukleární lokalizace/dodávání virové nukleové kyseliny. Některé virové polypeptidy ovšem kombinují obě tyto funkce.

Podrobný popis vynálezu

Ačkoli jsou obecně zde uváděné techniky dobře známé v oboru, je možno odkázat zvláště na publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) a Ausubel a další, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4. vydání, John Wiley & Sons, lne.

A. Polypeptidové složky

1. Virové sbalovací polypeptidy nukleových kyselin

Termín „virové sbalovací polypeptidy nukleových kyselin“ typicky zahrnuje polypeptidy kódované virovými genomy, které se přirozeně vyskytují ve virových částicích, kde je jejich funkcí sbalit, zvláště kondenzovat, a doručit do jádra nukleové kyseliny za vytvoření virového genomu ve formě virionu. Jsou také zahrnuty jeho homology a deriváty jako jsou fragmenty, jak je uvedeno níže.

Mezi příklady virových sbalovacích polypeptidů nukleových kyselin patří proteiny virového jádra jako je jaderný antigen hepatitidy B a adenovirové jaderné proteiny, Mul, pV a pVII a jejich ekvivalentní proteiny v jiných adenovirech, jako jsou mastadenoviry (savčí adenoviry) a aviadenoviry (ptačí adenoviry). Zvláště výhodným virovým sbalovacím polypeptidem nukleových kyselin pro použití v rámci předkládaného vynálezu je polypeptid Mul ukázaný dále jako SEQ ID No. 1.

NH₂-Met-Arg-Arg-Ala-Hís-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Ser-His-Arg-Arg-Met-ArgGly-Gly-OH (SEQ ID No. 1).

-4CZ 298353 B6

Virový sbalovací polypeptid nukleových kyselin pro použití v předkládaném vynálezu je schopen vazby na nukleové kyseliny, typicky nespecifickým způsobem, a s výhodou způsobí kondenzaci nukleové kyseliny. Obecně je výhodné, jestliže má kondenzovaná zvolená sekvence nukleové '£ kyseliny velikost rovnou nebo menší než 200 nm, jako od 50 do 200 nm, aby bylo dosaženo J optimální účinnosti dodávání do cílové buňky. |

Schopnost virových polypeptidu vázat se na nukleové kyseliny může být zjištěna in vitro použi- ^1 tím technik jako je gelová elektroforéza včetně testů gelové retardace (viz části Materiály a metody a Výsledky) a elektroforetické testy pohyblivosti posunu pruhů, vylučovacích testů v prostředí ethidiumbromidu a afinitní chromatografie (například s použitím celulózy s navázanou jedno- ' řetězcovou nebo dvojřetězcovou DNA.

Schopnost virových polypeptidu kondenzovat nukleové kyseliny může být například zjištěna metodou cirkulámí dichroické (CD) spektroskopie (viz například Sáto a Hosokawa, 1984, J. Biol. Chem. 95: 1031 - 1039).

Virové polypeptidy nebo jejich homology nebo deriváty budou obecně obsahovat při fyziologickém pH (jako je pH 7,4) řadu kladně nabitých aminokyselinových zbytků. S výhodou je celkový čistý náboj virového polypeptidu při fyziologickém pH pozitivní. Je zvláště výhodné, jestliže poměr náboj : aminokyselina je alespoň +0,3, s výhodou alespoň +0,4, +0,5 nebo +0,6.

Je výhodné, jestliže virové polypeptidy nebo jejich homology nebo deriváty obsahují argininové zbytky spíše než lysinové zbytky nebo směs obou. Je také zvláště výhodné, jestliže virové polypeptidy nebo jejich homology nebo deriváty obsahují jeden nebo více histidinových zbytků, s výhodou dva nebo více histidinových zbytků. Navíc budou virové polypeptidy nebo jejich homology nebo deriváty typicky obsahovat řadu vysoce hydrofobních zbytků jako je alanin, například dva nebo více hydrofobních zbytků.

Bude zřejmé, že aminokyselinové sekvence pro použití v předkládaném vynálezu nejsou omezeny na virové sbalovací polypeptidy nukleových kyselin vyskytující se v přírodě, ale zahrnují také homologní sekvence získané z jakéhokoli zdroje, například příbuzné virové/bakteriální proteiny, buněčné homology a syntetické peptidy stejně jako jejich varianty nebo deriváty, jako jsou fragmenty,

V souvislosti předkládaného vynálezu je homologní sekvence definována tak, že zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která je z alespoň 60, 70, 80 nebo 90 % identická, s výhodou alespoň z 95 nebo 98% identická na úrovni aminokyselin podél alespoň 10, s výhodou alespoň 20, 30, 40 nebo 50 aminokyselin, s polypeptidem virového jádra, například sekvenci Mul ukázanou jako .... .. SÉQ ID No. 1. Homologie by měla být typicky srovnávána s ohledem na ty oblasti sekvence, které jsou známé jako nezbytné pro vazbu nukleových kyselin, spíše než s ohledem na okolní postradatelné sekvence. I když homologie může být také srovnávána z hlediska podobnosti (tj. aminokyselinové zbytky s podobnými chemickými vlastnostmi/funkcemi), v souvislosti předkládaného vynálezu je výhodné vyjadřovat homologii z hlediska identity sekvence.

Srovnávání homologie se může provádět pouhým okem, nebo obvykleji za pomoci snadno dostupných programů pro porovnávání sekvencí. Tyto komerčně dostupné počítačové programy mohou vypočítat procento homologie mezi dvěma nebo více sekvencemi.

Procenta homologie mohou být vypočtena podél souvislých sekvencí, tj. jedna sekvence je uspořádána vedle druhé sekvence a každá aminokyselina v jedné sekvenci je přímo porovnávána s odpovídající aminokyselinou ve druhé sekvenci, vždy po jednotlivých zbytcích. To se nazývá „nepřerušované“ (ungapped) srovnání. Taková nepřerušovaná srovnání se typicky provádějí pouze podél relativně malého počtu zbytků (například méně než 50 za sebou následujících aminokyselin).

-5CZ 298353 B6

Ačkoli tato metoda je velmi jednoduchá a spolehlivá, nebere v úvahu, že například v jinak identickém páru sekvencí způsobí jedna inzerce nebo delece nesprávné porovnání následujících aminokyselinových zbytků, což potenciálně vede ke značnému snížení procenta homologie, pokud se provádí celkové srovnání. Většina metod pro porovnávání sekvencí je tedy navržena tak, aby poskytly optimální srovnání, která berou v úvahu možné inzerce a delece, aniž by došlo k neoprávněné penalizaci celkového hodnocení homologie. To se dosáhne vložením „mezer“ (gaps) při porovnávání sekvencí atestováním s cílem dosáhnout maximální lokální homologie.

Tyto komplexnější metody však každé mezeře, která se při srovnání vyskytne, přiřazují určité „trestné body“ (gap penalties), takže při stejném počtu identických aminokyselin se dosáhne lepšího hodnocení u porovnání sekvencí s co nej nižším počtem mezer - což odráží vyšší příbuznost mezi dvěma porovnávanými sekvencemi - než u sekvencí obsahujících velký počet mezer. Typicky se používají „ohodnocení sdružené mezery“ (afftne gap costs), které přiřazují relativně velké ohodnocení existenci mezery a menší trestné body za každý následující zbytek v mezeře. Toto je nejběžněji používaný systém hodnocení mezer. Vysoké trestné body za mezery samozřejmě poskytnou optimalizovaná srovnání s menším počtem mezer. Většina porovnávacích programů umožňuje modifikaci trestných bodů za mezery. Jestliže se však takový software používá pro porovnávání sekvencí, je výhodné používat přednastavené hodnoty. Například jestliže se používá program GCG Wisconsin Bestfit package (viz níže) přednastavené trestné body za mezeru pro aminokyselinové sekvence jsou -12 pro mezeru a -4 pro každé prodloužení.

Výpočet maximálního procenta homologie proto nejprve vyžaduje vytvoření optimální porovnání, přičemž se berou v úvahu trestné body za mezery. Vhodný počítačový program pro provádění takového porovnání je program GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, USA; Devereux a další, 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Příklady dalších programů, které se mohou použít pro porovnávání sekvencí, zahrnují bez omezení program BLAST package (viz Ausubel a další, 1999 tamtéž - kapitola 18), FASTA (Atschul a další, 1990, J. Mol. Biol., 403 410) a soubor porovnávacích nástrojů GENEWORKS. Jak program BLAST, tak i FASTA jsou dostupné pro offline a online prohledávání (viz Ausubel a další, 1999 tamtéž, str. 7 - 58 až 7 - 60). Je však výhodné používat program GCG Bestfit.

I když je možno konečné procento homologie měřit z hlediska identity, proces porovnávání samotný není typicky založen na porovnání párů typu všechno nebo nic. Místo toho se obecně používá určitá matrice hodnocení podobnosti, která přiřazuje hodnocení každému porovnání párů na základě chemické podobnosti nebo evoluční vzdálenosti. Příkladem takové běžně používané matrice je matrice BLOSUM62 - což je přednastavená matrice pro skupinu programů BLAST. Programy GCG Wisconsin obecně používají buď obecně známých přednastavených hodnot, nebo individuální tabulky porovnání symbolů, jestliže je dodána (pro další podrobnosti viz uživatelský manuál). Je výhodné používat pro skupinu programů GCG obecně známé přednastavené hodnoty, nebo v případě jiného softwaru přednastavené matrice, jako je BLOSUM62.

Jakmile vytvořil program optimální uspořádání je možno vypočíst procento homologie, s výhodou procento identity sekvence. Program to typicky provede jako součást porovnání sekvencí a poskytne číselný výsledek.

Termín „derivát“ týkající se aminokyselinových sekvencí používaných v předkládaném vynálezu zahrnuje jakoukoli substituci, variaci, modifikaci, náhradu, deleci nebo adici jedné (nebo více) aminokyseliny z nebo do sekvence za poskytnutí výsledné aminokyselinové sekvence se schopností vázat se na nukleovou kyselinu a s kondenzační aktivitou, s výhodou alespoň se stejnou aktivitou jako nemodifikované polypeptidy.

Virové polypeptidy mohou být modifikovány pro použití v rámci předkládaného vynálezu. Typicky se provádějí modifikace, které zachovávají vazbu nukleových kyselin a kondenzační vlastnosti sekvence. Substituce aminokyselin mohou být tvořeny například 1, 2 nebo 3 až 10, 20 nebo 30 substitucemi za předpokladu, že si modifikovaná sekvence zachová schopnost vazby

-6CZ 298353 B6 nukleové kyseliny a kondenzační vlastnosti. Substituce aminokyselin mohou zahrnovat použití analogů, které se nevyskytují v přírodě, například pro zvýšení poločasu v krevní plazmě terapeuticky podávaného polypeptidu.

Zvláště může být žádoucí vytvořit substituce aminokyselin pro zvýšení celkového pozitivního náboje při fyziologickém pH u virového sbalovacího polypeptidu vyskytujícího se v přírodě. Pozitivně nabité aminokyseliny zahrnují arginin, lysin a histidin. Arginin má nej vyšší kladný náboj z aminokyselin vyskytujících se v přírodě, a je proto zvláště výhodný.

Alifatická aminokyselina	Nepolární	GAP
ILV
Polární - nenabitá	CSTM
NQ
Polární - nabitá	DE
KR
Aromatická aminokyselina		HFWY

Konzervativní substituce mohou být vytvořeny například na základě výše uvedené tabulky. Aminokyseliny ve stejné oblasti ve druhém sloupci a s výhodou ve stejné řádce ve třetím sloupci mohou být vzájemně nahrazeny.

Polypeptidy pro použití v rámci vynálezu mohou být vyráběny rekombinantními způsoby, například jak se popisuje dále. Mohou být však také vyráběny synteticky použitím technologií dobře známých odborníkům v oboru, jako je syntéza na pevné fázi. Polypeptidy pro použití v rámci vynálezu mohou být také produkovány jako fúzní proteiny, například pro usnadnění extrakce a čištění. Příklady partnerských částí fúzního proteinu zahrnují glutathion-S-transferázu (GST), 6 x His, GAL4 (domény vázající DNA a/nebo aktivující transkripci) a β-galaktosidázu. Může být také vhodné přidat mezi partnerskou část fúzního proteinu a zvolenou proteinovou sekvenci štěpící místo proteolytických enzymů, aby bylo umožněno odstranění sekvencí fúzního proteinu. Partnerská část fúzního proteinu s výhodou nebude omezovat biologickou aktivitu sekvence zvoleného proteinu.

Polypeptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu mohou být ve v podstatě izolované formě. Bude zřejmé, že polypeptidy mohou být smíseny s nosiči nebo ředivy, které nebudou interferovat se zamýšleným účelem použití polypeptidu, a stále budou pokládány za v podstatě izolované. Polypeptidy mohou být také ve v podstatě vyčištěné formě, přičemž v tomto případě obecně tvoří polypeptidy pro použití v rámci vynálezu více než 90 %, například 95 %, 98 % nebo 99 % z proteinů v preparátu.

2. Polypeptidy obsahující sekvence nukleární lokalizace

Ve výhodném provedení obsahuje dodávací vektor/komplex podle vynálezu navíc polypeptid obsahující sekvenci nukleární lokalizace (nuclear localisation sequence, NLS). Sekvence nukleární lokalizace jsou obecně v oboru dobře známé (viz například Dingwall a Laskey, 1991, Trends. Biochem. Sci. 16: 478- 481). Zvláště je však výhodné používat sekvence nukleární lokalizace adenovirového jaderného proteinu pV. Sekvence nukleární lokalizace proteinu pV má sekvenci

RPRRRATTRRRTTTGTRRRRRRR (SEQ ID No. 2), která odpovídá aminokyselinám 315-337 (D. Matthews). Další sekvence nukleární lokalizace je přítomná na N-konci (KPRKLKRVKKKKK - SEQ ID No. 3), ačkoli je výhodná C-koncová sekvence nukleární lokalizace.

Sekvence nukleární lokalizace může být přítomna na odlišné molekule polypeptidu než sbalovací polypeptid nebo jako součást stejného polypeptidového řetězce, například ve formě fúzního proteinu.

B. Zvolené sekvence nukleové kyseliny

Zvolené sekvence nukleové kyseliny (nucleic acid sequences of interest, NOI) mají být do buněk dodávány použitím dodávacího vektoru nebo komplexu podle vynálezu a mohou být tvořeny DNA nebo RNA. Mohou být jednořetězcové nebo dvoj řetězcové. Mohou být také polynukleotidy, které obsahují syntetické nebo modifikované nukleotidy. V oboru je známá celá řada různých typů modifikací oligonukleotidů. Patří sem methylfosfonátové a fosforothioátové kostry, přidání akridinových nebo polylysinových řetězců na 3' a/nebo 5' konce molekuly. Pro účely předkládaného vynálezu je zřejmé, že zde popisované polynukleotidy mohou být modifikovány jakýmkoli v oboru dostupným způsobem. Tyto modifikace mohou být prováděny pro zvýšení aktivity in vivo nebo poločasu in vivo zvolených sekvencí nukleových kyselin.

Zvolená sekvence nukleové kyseliny obsahuje typicky heterologní gen. Termín „heterologní gen“ zahrnuje jakýkoli gen. Heterologní gen může být jakákoli alelická varianta genu standardního typu nebo může jít o mutantní gen. Termín „gen“ má zahrnovat sekvence nukleové kyseliny, které jsou schopny alespoň transkripce. V této definici jsou tedy zahrnuty sekvence kódující mRNA, tRNA a rRNA, stejně jako pozitivní (antisense) konstrukty. Nukleovými kyselinami může být například ribonukleová kyselina (RNA) nebo deoxyribonukleová kyselina (DNA) nebo jejich analogy. Sekvence kódující mRNA budou případně obsahovat některé nebo všechny 5' a/nebo 3' přepisované ale nepřekládané obklopující sekvence, které jsou přirozeně nebo jinak asociované s překládanou kódující sekvencí. Mohou popřípadě dále obsahovat asociované sekvence řídicí transkripci, které normálně souvisí s přepisovanými sekvencemi, například signály ukončení transkripce, polyadenylační místa a zesilující prvky ve směru transkripce.

Přepisovaná sekvence heterologního genu je s výhodou operativně navázána na řídicí sekvenci umožňující expresi heterologního genu v savčích buňkách, s výhodou neuronálních buňkách, jako jsou buňky centrálního a periferního nervového systému, rakovinné buňky nebo epiteliální buňky. Termín „operativně navázaný) označuje stav, kdy jsou popisované složky v takovém vzájemném vztahu, který umožňuje jejich fungování zamýšleným způsobem. Řídicí sekvence „operativně navázaná“ na kódující sekvenci je navázaná takovým způsobem, že exprese kódující sekvence se dosahuje za podmínek kompatibilních s řídicí sekvencí.

Řídicí sekvence obsahuje promotor umožňující expresi heterologního genu a signál ukončení transkripce. Promotor je zvolen z promotorů funkčních v savčích, s výhodou lidských buňkách. Promotor může být odvozen z promotorových sekvencí eukaryotických genů. Může jít například o promotor odvozený z genomu buňky, ve které má probíhat exprese heterologního genu, s výhodou buňky savčího centrálního nebo periferního nervového systému. Co se týče eukaryotických promotorů, může jít o promotory fungující všeobecným způsobem (jako jsou promotory β-aktinu, tubulinu) nebo alternativně tkáňově specifickým způsobem (jako jsou promotory genů pro pyruvátkinázu). Může jít také o promotory, které odpovídají na specifické stimuly, například promotory, které se vážou na receptory steroidních hormonů. Mohou být také použity virové promotory, například promotor (MMLV LTR, Moloney murine leukaemia virus long terminál repeat) nebo promotoiy genů herpetického viru.

Může být také výhodné, jestliže jsou promotory indukovatelné, takže v průběhu doby života v buňkách je možno řídit míru exprese heterologního genu. Indukovatelný znamená, zeje možno řídit hladiny exprese probíhající s použitím promotoru.

-8CZ 298353 B6

Jakýkoli z těchto promotorů může být navíc modifikován přidáním dalších řídicích sekvencí, například zesilujících sekvencí. Mohou být také použity chimémí promotory obsahující sekvenční prvky ze dvou nebo více různých výše popisovaných promotorů. Může být také žádoucí použití LCR (locus control regions).

Heterologní gen bude typicky kódovat polypeptid s terapeutickým použitím. Podle předkládaného vynálezu zahrnují vhodné zvolené sekvence nukleových kyselin takové sekvence, které mají terapeutické a/nebo diagnostické použití, jako jsou bez omezení: sekvence kódující cytokiny, chemokiny, hormony, protilátky, molekuly podobné imunoglobulinům získané genetickým inženýrstvím, jednořetězcové protilátky fúzní proteiny, enzymy, pomocné imunitní stimulační molekuly, imunomodulační molekuly, pozitivní (antisense) RNA, transdomínantní negativní mutanta cílového proteinu, toxin, podmínečný toxin, antigen, protein potlačující tumory a růstové faktory, membránové proteiny, proteiny a peptidy působící na cévy, protivírové proteiny a ribozymy a jejich deriváty (například s asociovanou reportérovou skupinou).

Mezi příklady polypeptidu s terapeutickým použitím patří neurotrofní faktory jako je nervový růstový faktor (NGF), ciliámí neurotrofní faktor (CNTF), mozkový neurotrofní faktor (BNTF) a neurotrofiny (jako je NT-3, NT-4/5), které mají potenciál jako terapeutické látky pro léčení neurologických onemocnění jako je Parkinsonova choroba.

Vhodné zvolené sekvence nukleových kyselin pro použití v rámci předkládaného vynálezu při léčení nebo prevenci rakoviny zahrnují zvolené sekvence nukleových kyselin kódující proteiny, které: ničí cílovou buňku (například ribozomální toxin), působí jako: látky potlačující tumory (jako je protein p53 standardního typu); aktivátory antitumorových imunitních mechanizmů (jako jsou cytokiny, pomocné stimulační molekuly a imunoglobuliny); inhibitory angiogeneze; nebo které poskytují zvýšenou citlivost na léčiva (jako jsou enzymy aktivující prekurzory); nepřímo stimulují destrukci cílové buňky přirozenými efektorovými buňkami (například silný antigen pro stimulaci imunitního systému nebo konverzi prekurzorové látky na toxickou látku, která zničí cílovou buňku (například enzym aktivující prekurzor). Kódované proteiny by mohly také ničit buňky přilehlé k tumorovým buňkám (například sekrenovaný fúzní protein antitumorová protilátka - ribozomální toxin), nepřímo stimulovat destrukci přilehlých tumorových buněk (například cytokiny pro stimulaci imunitního systému nebo proteiny podporující koagulaci, které způsobí lokální uzavření cév) nebo převádět prekurzorovou látku na toxickou látku, která ničí přilehlé tumorové buňky (například enzym, který aktivuje prekurzor na léčivo schopné difúze). Zvolené sekvence nukleových kyselin mohou být takové sekvence, které kódují pozitivní (antisense) transkripty nebo ribozymy, které interferují s expresí buněčných nebo patogenních genů, například s expresí buněčných genů pro perzistenci tumoru (například proti odlišným transkriptům myc u Burkittsova lymfomu nebo proti transkriptům bcr-abl u chronické myeloidní leukemie. Je také zahrnuto použití kombinací těchto zvolených sekvencí nukleových kyselin.

Namísto toho nebo stejně jako v případě selektivní exprese v cílových tkáních mohou zvolené sekvence nukleových kyselin kódovat enzym nebo enzymy aktivující prekurzor, které nemají žádný významný účinek nebo žádný nepříznivý účinek, dokud je jedinec léčen jedním nebo více prekurzory, na které enzym nebo enzymy působí. V přítomnosti aktivní zvolené sekvence nukleové kyseliny vede léčení jedince vhodným prekurzorem k zesílenému omezení růstu tumorů nebo přežití.

Enzym aktivující prekurzor může být dodán do místa tumoru pro léčení rakoviny. V každém případě se vhodný prekurzor používá při léčení pacienta v kombinaci s vhodným enzymem aktivujícím prekurzor. Vhodný prekurzor se podává spolu s vektorem. Příklady prekurzorů zahrnují: etoposidfosfát (s alkalickou fosfatázou); 5-fluorcytosin (s cytosindeaminázou); doxorubicin-N-phydroxy-fenoxyacetamid (s penicilin-V-amidázou); para-N-bis(2-chlorethyl)-aminobenzoylglutamát (s karboxypeptidázou G2); karbamáty cefalosporinu s dusíkatým yperitem (s β

-9CZ 298353 B6 laktamázou); SR4233 (s P450 reduktázou); ganciklovir (s HSV thymidinkinázou); prekurzory dusíkatého yperitu s nitroreduktázou a cyklofosfamidem (s P450).

Příklady vhodných enzymů aktivujících prekurzory pro použití v rámci vynálezu zahrnují thymidinfosforylázu, která aktivuje prekurzory 5-fluoruracilu kapcetabin a furtulon; thymidinkinázu z viru herpes simplex, která aktivuje ganciklovir; a cytochrom P450, který aktivuje prekurzor jako je cyklofosfamid na látku poškozující DNA; a cytosindeamináza, která aktivuje 5-fluorcytosin. S výhodou se používá enzym lidského původu,

Zvolené sekvence nukleových kyselin mohou také kódovat antigenní polypeptidy pro použití jako vakcíny. Tyto antigenní polypeptidy jsou s výhodou odvozeny z patogenního organizmu, například bakterií nebo virů. Mezi příklady takových antigenních polypeptidů patří antigeny viru hepatitidy C, povrchové nebo jaderné antigeny viru hepatitidy B, antigeny HIV, toxin černého kašle, choleový toxin nebo záškrtový toxin.

Zvolené sekvence nukleových kyselin mohou také obsahovat markerové geny (například kódující β-galaktosidázu nebo protein zelené fluorescence) nebo geny, jejichž produkty řídí expresi jiných genů (například faktory řídící transkripci).

Jestliže je onemocnění způsobeno defektriím genem, mohou být podávány zvolené sekvence nukleových kyselin, které kódují plně funkční alelu tohoto genu, jako je tomu v případě cystické fibrózy. Dosud byl identifikován molekulární základ pro celou řadu genetických poruch a byly klonovány funkční sekvence standardního typu. Může být vhodné do terapeutického genu zahrnout obklopující sekvence zvolené sekvence nukleové kyseliny, které jsou homologní odpovídajícím obklopujícím sekvencím v genomu, aby byla umožněna náhrada defektního genu homologní rekombinací.

Genová terapie a jiná terapeutická použití mohou také vyžadovat podávání většího počtu genů. Exprese většího počtu genů může být výhodná pro léčení řady stavů. Protože není žádné omezení velikosti zvolené sekvence nukleové kyseliny, která může být vložena do dodávacího vektoru nebo komplexu podle vynálezu, mělo by být možné směrovat do buněk současně větší počet genů.

C. Kationtové lipidy

V oboru je známá celá řada kationtových lipidů, viz například WO 95/02698, jejíž obsah se tímto zařazuje odkazem, z nichž některé jsou reprodukovány dále. Příklady struktur kationtových lipidů použitelných v rámci vynálezu jsou uvedeny v tabulce 1 WO 95/02698. Obecně může být ve vakcínách a při způsobech podle předkládaného vynálezu použit jakýkoli kationtový lipid, buď monovalentní nebo polyvalentní. Obecně jsou výhodné polyvalentní kationtové lipidy. Mezi kationtové lipidy patří nasycené a nenasycené alkylové a alicyklické ethery a estery aminů, amidů nebo jejich deriváty. Alkylové a alkenové skupiny kationtových lipidů s přímým nebo rozvětveným řetězcem mohou obsahovat od 1 do přibližně 25 atomů uhlíku. Výhodné alkylové a alkenové skupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahují 6 nebo více atomů uhlíku. Alicyklické skupiny mohou obsahovat od přibližně 6 do 30 atomů uhlíku. Mezi výhodné alicyklické skupiny patří cholesterol a jiné steroidní skupiny. Kationtové lipidy mohou být připraveny s řadou protiiontů (aniontů) jako je mj. chlorid, bromid, jodid, fluorid, acetát, trifluoracetát, sulfát, nitrit a nitrát.

Dobře známý kationtový lipid je N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N.N-trimethylamoniumchlorid (DOTMA).

DOTMA a analogický diester DOTAP (l,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylamonium)propan), jsou komerčně dostupné. Další kationtové lipidy strukturně příbuzné s DOTMA se popisují v patentu US 4 897 355, který se tímto zařazuje odkazem.

-10CZ 298353 B6

Další použitelná skupina kationtových lipidů příbuzných s DOTMA a DOTAP zahrnuje látky běžně nazývané DORI-ethery a/nebo DORI-estery. Lipidy DORI se liší od DOTMA a DOTAP tím, že je nahrazena pouze jedna z methylových skupin trimethylamoniové skupiny hydroxyethylovou skupinou. Oleoylové skupiny lipidů DORI mohou být nahrazeny jinými alkylovými nebo alkenovými skupinami, jako jsou skupiny palmitoyl nebo stearoyl. Hydroxylová skupina lipidů typu DORI může být použita jako místo pro další funkcionalizaci, například pro esterifikaci na aminy, jako je karboxyspermin.

Další kationtové lipidy, které mohou být použity v dodávacích vektorech nebo komplexech podle tohoto vynálezu zahrnují sloučeniny popsané ve WO 91/15501 jako látky použitelné pro transfekci buněk.

V rámci předkládaného vynálezu mohou být také použity kationtové sterolové deriváty jako je 3p-[N-(N',N^ř-dimethylaminoethan)karbamoyl]cholesterol (DC-Chol), ve kterých je cholesterol navázán na trialkylamoniovou skupinu. DC-Chol má poskytovat u některých buněčných linií účinnější transfekci při nižší toxicitě než liposomy s obsahem DOTMA. Mohou být také použity polyaminové varianty DC-Chol, jako jsou sloučeniny popsané ve WO 97/45442.

V dodávacích vektorech nebo komplexech podle vynálezu je také možno použít polykat iontové lipidy obsahující karboxyspermin. EP-A-304111 popisuje kationtové lipidy s obsahem karboxysperminu včetně 5-karboxyspermylglycindioktadecylamidu (DOGS) a dipalmitoyl-fosfatidylethanolamin-5-karboxyspermylamidu (DPPES). Další kationtové lipidy mohou být získány náhradou oktadecylových a palmitoylových skupin DOGS a DPPES jinými alkylovými nebo alkenovými skupinami.

V dodávacích vektorech nebo komplexech podle vynálezu mohou být kationtové lipidy popřípadě kombinovány s nekationtovými pomocnými lipidy, s výhodou neutrálními lipidy, za vytvoření liposomů nebo lipidových agregátů. Mezi neutrální lipidy použitelné v předkládaném vynálezu patří mezi mnoha jinými: lecithiny; fosfatidylethanolaminy, jako je DOPE (dioleoylfosfatidylethanolamin), POPE (palmitoyloleoylfosfatidylethanolamin) a DSPE (distearoyl-fosfatidylethanolamin); fosfatidylcholin; fosfatidylcholiny, jako je DOPC (dioleoylfosfatidylcholin), DPPC (dipalmitoylfosfatidylcholin) POPC (palmitoyloleoylfosfatidylcholin) a DSPC (distearoylfosfatidylcholin); fosfatidylglycerol; fosfatidylglyceroly, jako je DOPG (dioleoylfosfatidylglycerol), DPPG (dipalmitoylfosfatidylglycerol) a DSPG (distearoylfosfatidylglycerol); fosfatidylseriny jako je dioleoyl- nebo dipalmitoylfosfatidylserin; difosfatidyIglyceroly; estery mastných kyselin; estery glycerolu; sfingolipidy; kardolipin; cerebrosidy; a ceramidy; a jejich směsi. Neutrální lipidy také zahrnují cholesterol a další 3DOH-steroly.

V dodávacích vektorech nebo komplexech podle vynálezu mohou být popřípadě zahrnuty jedna nebo více amfifilních sloučenin pro modifikaci povrchových vlastností. Amfifilní sloučeniny použitelné v předkládaném vynálezu zahrnují mj. neoglykolipidyjako je GLU4 a GLU7 ukázané na obr. 22, polyethylenglykolipidy jako je N-(w-methoxy(polyoxyethylen)oxykarbonyl)fosfatidylethanolamin, N-mono-methoxy(polyoxyethylen)sukcinylfosfatidylethanolamin a polyoxyethylencholesteroylether; neiontové detergenty jako jsou alkylglykosidy, álkylmethylglukamidy, estery sacharózy, alkylpolyglycerolové ethery, alkylpolyoxyethylenové ethery a alkylsorbitanoxyethylenové ethery a steroidní oxyethylenové ethery; blokové kopolymery jako jsou blokové kopoly mery polyoxyethylenpolyoxy propy len.

V jednom provedení je kationtový lipid podle předkládaného vynálezu modifikován cukernou skupinou nebo skupinou polyethylenglykolu (PEG). V dalším provedení obsahuje komplex podle vynálezu dále sloučeninu schopnou působit jako kationtový lipid, kde tato sloučenina obsahuje navázanou cholesterolovou skupinu prostřednictvím aminové skupiny, cukernou skupinu nebo skupinu polyethylenglykolu. Jak je ukázáno v příkladech, autoři vynálezu zjistili, že cukry/PEG modifikované kationtové lipidy jsou zvláště výhodné. Další provedení předkládaného vynálezu

-11 CZ 298353 B6 tedy poskytuje sloučeninu schopnou působit jako kationtovy lipid, kde tato sloučenina obsahuje cholesterolovou skupinu navázanou přes aminovou skupinu, cukernou skupinu nebo skupinu polyethylenglykolu. Sloučenina s výhodou obsahuje od 1 do 7 cukerných skupin nebo skupin polyethylenglykolu. Sloučenina může obsahovat směs cukerných skupin a polyethylenglykolových skupin. Cukerná skupina je s výhodou glukóza nebo D-glukóza nebo od nich odvozená skupina.

D. Komplexy kationtový lipid/zvolená sekvence nukleové kyselíny/sbalovací polypeptid

Dodávací vektor/komplex podle předkládaného vynálezu se typicky připravuje nejprve uvedením do styku sbalovacího polypeptidů a zvolené sekvence nukleové kyseliny ve sterilní zkumavce po dobu přibližně 10 min při teplotě laboratoře, což vede k vytvoření kondenzovaného komplexu polypeptid/zvolená sekvence nukleové kyseliny. Běžný způsob je nanést nukleovou kyselinu a protein vedle sebe do zkumavky tak, aby nebyly v kontaktu, a zahájit míšení přidáním několika set mikrolitrů kapalného nosiče, jako je farmaceuticky přijatelný nosič, pomocná látka nebo ředivo.

Další a výhodný způsob přípravy dodávacího vektoru nebo komplexu podle předkládaného vynálezu je uvedení do styku sbalovacího polypeptidů a zvolené sekvence nukleové kyseliny za trvalého protřepávání.

Poměr zvolené sekvence nukleové kyseliny k polypeptidů je alespoň 1 : 1, s výhodou od 1 : 1 do 2 : 1, výhodněji od 1,4 : 1 do 1,9 : 1, ještě výhodněji 1,5 : 1 až 1,8 : 1. Autoři vynálezu zjistili, že zvláště výhodný je poměr zvolené sekvence nukleové kyseliny k polypeptidů přibližně 1 : 0,6 (~1,7 : 1). V některých provedeních se typicky používá poměr polypeptidů ke zvolené sekvenci nukleové kyseliny od 0,2 do 1,5, s výhodou od 0,3 do 1,2 (hmotn./hmotn.), ještě výhodněji od 0,5 do 0,7. V jiných provedeních je typický poměr polypeptidů ke zvolené sekvenci nukleové kyseliny alespoň 10:1, nebo alespoň 20 : 1 (hmotn./hmotn.). Optimální poměr však může záviset na poměru náboj : aminokyselina ve sbalovacím polypeptidů. Obecně platí, že čím nižší je poměr náboj : aminokyselina, tím vyšší se použije poměr polypeptid : zvolená sekvence nukleové kyseliny.

Do komplexu se dále přidávají kationtové lipidy. Kationtové lipidy mohou být v jednom provedení součástí předem vytvořeného liposomu obsahujícího dvě nebo více lipidových složek, jako je DC-Chol a DOPE. Kationtové lipidy se typicky inkubují s komplexem polypeptid/zvolená sekvence nukleové kyseliny po dobu alespoň 20 min při teplotě laboratoře. Další a výhodný způsob přidávání kationtových lipidů je přidávání ve formě suspenze kationtových liposomu. Tento hotový komplex může být uchováván při teplotě přibližně -80 °C s přídavkem 10% sacharózy (hmotn./obj.) až do použití. Množství liposomu vzhledem k zvolené sekvenci nukleové kyseliny je typicky řádově od 3 : 1 do 20 : 1, s výhodou od 6 : 1 do 15 : 1, výhodněji od 8 : 1 do 14 : 1, Autoři vynálezu zjistili, že zvláště účinný je poměr liposom : zvolená sekvence nukleové kyseliny 12 : 1. V dalších provedeních je poměr liposom : zvolená sekvence nukleové kyseliny typicky řádově 2 : 1 až 10 : 1, nebo od 3 : 1 do 6 : 1. Jestliže se kationtové lipidy používají s neutrálními lipidy, tento poměr je typicky řádově 1:1.

Ve velmi výhodném provedení je poměr liposom :NO1

30-20 :1 s výhodou 8-14 :1 výhodněji ~12 :1 polypeptid

0,5-1

0,5-0,7 —0,6

Dodávací vektor/komplex je nyní připraven k použití. I když je výhodné míchat různé složky ve výše uvedeném pořadí, je možné kombinovat složky v jakémkoli pořadí. Jestliže se mají přidávat další polypeptidové složky, mohou se přidávat v jakémkoli stupni, ale s výhodou společně se sbalovacím polypeptidem.

-12CZ 298353 B6

Může být vhodné přidat do vektorú/komplexů další složky, například ligandy vázající se na receptory buněčného povrchu, aby byly získány vektory/komplexy s určitým stupněm selektivity pro určitý typ buněk. Ligandy zahrnují peptidy, glykoproteiny, oligosacharidy, lektiny a protí5 látky a jej ich fragmenty,

E. Podávání

Dodávací vektor/komplex podle vynálezu se s výhodou kombinuje s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem za vytvoření farmaceutického prostředku (který může být pro humánní 10 nebo veterinární použití). Mezí vhodné nosiče a řediva patří roztoky fyziologického roztoku, například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem. Prostředek podle vynálezu může být podáván přímou injekcí. Prostředek může být formulován pro parenterální, intramuskulámí, intravenozní, subkutánní, intraokulámí nebo transdermální podávání nebo inhalaci. Typicky může být každá zvolená sekvence nukleové kyseliny podávána v dávce od 10 ng do 10 pg/kg tělesné hmotnosti, 15 s výhodou od 0,1 do 10 pg/kg, výhodněji 0,1 až 1 pg/kg tělesné hmotnosti.

Alternativně se může provádět transfekce buněk pacienta ex vivo vyjmutím pacientovy tkáně, transfekcí s použitím dodávacího vektoru/komplexu podle vynálezu a následnou reimplantací transfekované tkáně.

Způsoby podávání a použité dávkování jsou uváděny pouze jako vodítko, protože zkušený odborník v oboru bude schopen snadno určit optimální způsob podávání a dávkování pro kteréhokoli konkrétního pacienta a stav.

F. Použití

Dodávací vektory/komplexy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro účinnou transfekcí eukaryotických buněk, zvláště savčích buněk, zvolenými sekvencemi nukleových kyselin. Bylo ukázáno, že dodávací vektory/komplexy jsou zvláště účinné v porovnání s prostředky podle dosavadního stavu techniky při transfekcí neuronálních buněk. To má konkrétní význam 30 pro (i) výzkum, kde se používají nervové buňky a (ii) klinické aplikace, kde se vyžaduje zavedení zvolených sekvencí nukleových kyselin do buněk centrálního nebo periferního nervového systému člověka nebo zvířete. Obecněji mohou být dodávací vektory/komplexy podle předkládaného vynálezu použity v řadě aplikací při dodávání zvolených sekvencí nukleových kyselin, jako je genová terapie, dodávání DNA vakcín a studie transfekce in vitro.

Příklady onemocnění, která mohou být vhodná pro léčbu použitím komplexů/vektorů podle vynálezu, zahrnují onemocnění periferního nebo centrálního nervového systému, jako jsou neurodegenerativní onemocnění, a poškození nervové tkáně v důsledku úrazu/poškození (včetně mrtvice). Mezi neurodegenerativní onemocnění patří onemocnění motorických neuronů, několik dědičných 40 onemocnění jako je familiární dysautonomie a dětská spinální muskulární atrofie, a neurodegenerativní onemocnění s pozdním nástupem, jako je Parkinsonova a Alzheimerova choroba.

Dodávací vektory/komplexy podle vynálezu mohou být také použity pro podávání terapeutických genů pacientům trpících maligním onemocněním. Příklady maligních onemocnění, která mohou 45 být vhodná pro léčbu, jsou rakovina mléčné žlázy, čípku, tlustého střeva, rekta, endometria, ledviny, plíce, vaječníků, pankreatu, prostaty, kůže, žaludku, močového měchýře, centrální nervové soustavy, jícnu, hlavy nebo krku, jater, varlat, thymu nebo štítné žlázy. Pro léčení mohou být také vhodná maligní onemocnění krevních buněk, buněk kostní dřeně, B-lymfocytů, T-lymfocytů, lymfocytických prekurzorů nebo prekurzorů myeloidních buněk.

Tumorem může být pevný (solidní) tumor nebo jiný než pevný tumor a může jít o primární tumor nebo roztroušený metastatický (sekundární) tumor. Mezi jiné než pevné tumory patří myelom; leukemie (akutní nebo chronická, lymfocytámí nebo myelocytická) jako je akutní myeloblastická, akutní promyelocytická, akutní myelomonocytická, akutní monocytická a eryhtroleukemie;

- 13CZ 298353 B6 a lymfornyjako je Hodgkinův, jiný než Hodgkinův a Burkittův lymfom. Mezi pevné tumory patří karcinom, karcinom tlustého střeva, karcinom malých plicních buněk, karcinom jiných než malých plicních buněk, adenokarcinom, melanom, karcinom bazálních nebo skvamózních buněk, mesotheliom, adenokarcinom, neuroblastom, gliom, astrocytom, medulloblastom, retinoblastom, sarkom, osteosarkom, rhabdomyosarkom, fibrosarkom, osteogenní sarkom, hepatom a seminom.

Další onemocnění zahrnují onemocnění způsobená mutacemi, zděděnými nebo somatickými, v normálních buněčných genech, jako je cystická fibróza, různé thaíasemie apod.

Další oblast zájmu zahrnuje léčení onemocnění spojených s imunitním systémem, jako je odmítnutí transplantovaného orgánu a autoimunitních onemocnění. Spektrum autoimunitních onemocnění se pohybuje od orgánově specifických onemocnění (jako je thyroiditida, insulitida, roztroušená skleróza, irídocyklitida, uveitida, orchitida, hepatitida, Addisonova nemoc, myasthenia gravis) k systémovým onemocněním jako je revmatoidní artritida a jiná revmatická onemocnění nebo lupus erythematosus. Mezi další onemocnění patří nadměrná reaktivita imunitního systému, jako jsou alergické reakce, zvláště reakce související s produkcí histaminu a astma.

Předkládaný vynález bude nyní ilustrován na následujících příkladech, které však nemají být omezující.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje desku;

obr. 2 ukazuje graf;

obr. 3 ukazuje desku;

obr. 4 ukazuje graf;

obr. 5 ukazuje graf;

obr. 6 ukazuje graf;

obr, 7 ukazuje graf;

obr. 8 ukazuje graf;

obr. 9 ukazuje struktury;

obr. 10 ukazuje graf;

obr. 11 ukazuje graf;

obr. .12 ukazuje graf;

obr. 13 ukazuje graf;

obr. 14 ukazuje graf;

obr. 15 ukazuje graf;

obr. 16 ukazuje desku;

obr. 17 ukazuje graf;

obr. 18 ukazuje graf;

obr. 19 ukazuje strukturu;

obr. 20 ukazuje reakční schéma;

obr. 21 ukazuje reakční schéma;

obr. 22 ukazuje struktury;

obr. 23 ukazuje princip inkorporace micel;

obr. 24 ukazuje graf; a obr. 25 ukazuje graf.

-14CZ 298353 B6

Podrobný popis obr, 1 až 6

Obr. 1 - Adenovirový jaderný protein Mul je účinnější při vazbě plazmidové DNA než jaderný protein Vpl polyomaviru

A) BSA nemá žádný vliv na elektroforetickou pohyblivost pDNA, 1 μg pCMVp byl inkubován s 0 μg (dráha 2),’ 5 μg (dráha 3), 10 pg (dráha 4), 15 pg (dráha 5), 20 pg (dráha 6), 25 pg (dráha 7) a 30 pg (dráha 8) BSA 10 min při teplotě laboratoře v pufru 1 x HBS. Vzorky byly potom analyzovány na 1% agarózovém gelu na změněnou pohyblivost. Nebyla detekována žádná změna elektroforetické pohyblivosti způsobená BSA.

B) Na rozdíl od BSA interferoval Mul dramaticky s pohyblivostí pDNA. pCMVp (1 pg) byl inkubován s 0,25 pg (dráha 2), 0,5 pg (dráha 3), 1 pg (dráha 4), 2 pg (dráha 4), 4 pg (dráha 6), 6 pg (dráha 7) a 0 pg (dráha 8) rekombinantního peptidu Mul jako v případě A. Zatímco poměry proteinu k pDNA 0,25 (hmotn./hmotn.) (dráha 2) neovlivnily migraci relaxované formy pCMVp (horní pruh), bylo pozorováno mírné zpomalení nadšroubovicové formy pDNA (nižší pruh). Jestliže byly použity poměry 0,5 (hmotn./hmotn.) nebo vyšší, byla migrace obou forem pDNA výrazně zpomalena.

C) Protein polyomaviru Vpl měl mnohem nižší účinnost při zabránění migraci pDNA. pCMV (1 pg) byl inkubován s 2 pg (dráha 2), 4 pg (dráha 3), 6 pg (dráha 4), 8 pg (dráha), 16 pg (dráha 6), 32 pg (dráha 7) a 0 pg (dráha 8) Vpl. Pouze poměry 6 nebo vyšší (protein : pDNA, hmotn./hmotn.) způsobily podstatné zpomalení nadšroubovicové formy pDNA (dráha 6, nižší pruh). Rovněž až do poměru 32 (hmotn./hmotn.) nebyl pozorován žádný vliv na relaxovanou pDNA (dráha 7, horní pruh). U všech gelů odpovídá dráha 1 markéru 1 kb DNA (BRL).

Obr. 2 - Aktivita β-galaktosidázy v buňkách ND7 transfekovaných komplexy pDNA-Mulkationtový liposom

Buňky ND7 byly zaoěkovány na hustotu 5 x 10⁴ buněk/jamku v 24-jamkových kultivačních miskách 24 hod před transfekcí. Bezprostředně před transfekcí byly buňky promyty bezsérovým médiem. Komplexy byly vytvořeny inkubací pCMVp s Mul před přidáním kationtového liposomu DC-Chol/DOPE. V každém případě byl vytvořen komplex 1 pg pCMVp s 0,6, 6, 12 a 21 pg peptidu Mul. Každá z těchto kombinací byla potom vytvořena pro vytvoření komplexu s 3, 4 a 6 pg DC-Chol/DOPE. Buňky ND7 byly transfekčním komplexům vystaveny 2 hod, potom byly udržovány při 37 °C, 5 % CO₂ dalších 24 hod před sklizením a zpracováním pro provedení enzymatického testu na β-galaktosidázu. Uvedené hodnoty znamenají střední odchylku ±SD, n = 3.

Obr. 3 - Mul zesiluje účinnost transfekce zprostředkované kationtovými liposomy v neuronální buněčné linii ND7

Neurony ND7 byly vysety do 24-jamkových kultivačních misek na hustotu 4 x 10⁴ buněk/jamku a byly ponechány růst 24 hod. Nediferencované neurony ND7 byly potom transfekovány buď samotným pCMVp (A), pCMVp v komplexu s DC-Chol/DOPE (1/3, hmotn./hmotn.), (B) nebo pCMVp v komplexu s Mul a DC-Chol/DOPE (1/12/6) (C). O 48 hod později byly buňky fixovány a zpracovány pro histochemickou detekci X-Gal. Jak je vidět v části C, přidání Mul do komplexu při optimálním poměru významně zvyšuje počet X-Gal pozitivních buněk (modré zbarvení).

Obr. 4 - Mul má mnohem vyšší účinnost při zesilování transfekcí zprostředkovaných kationtovými liposomy v buňkách ND7 než Vpl

Plazmidová DNA pCMVp byla přivedena do komplexu s různými množstvími polykationtového peptidu a potom smíchána s kationtovými liposomy v poměru 1 : 3 (pCMVp : liposomy; hmotn./hmotn.). Po rychlém pro mytí v bezsérovém médiu byly buňky ND7 vystaveny působení

- 15CZ 298353 B6 komplexů liposom-polykation-liposom po dobu 2 hod a potom byly vráceny do média s obsahem séra. O 48 hod později byly buňky sklizeny a zpracovány pro enzymatický test na β-galaktosidázu. Každá konfigurace byla testována trojnásobně a každý experiment byl třikrát opakován. Hodnoty znamenají střední hodnotu +SD.

Obr. 5 - Mul zesilovače transfekci DC-Chol/DOPE v buňkách COS-7

Buňky COS byly zaočkovány na hustotu 60 až 80 % konfluence do 24-jamkových kultivačních misek 24 hod před transfekci. Bezprostředně před transfekci byly buňky promyty v bezsérovém 5 médiu. Inkubace pCMVp s Mul před přidáním komplexů vytvořených z kationtového liposomu |

DC-Chol/DOPE schopných buněčné transfekce. V každém případě byl vytvořen komplex 1 gg pCMVp s 12 μg peptidu Mul, který byl zjištěn jako optimální pro buňky ND7. Komplexy pCMVp : Mul byly potom smíseny s 3, 4 a 6 gg DC-Chol/DOPE. Buňky COS byly vystaveny působení transfekčních komplexů 2 hod a potom byly udržovány při 37 °C, 5 % CO2 dalších 24 hod před sklizením a zpracováním pro enzymatický test na β-galaktosidázu. Číselné hodnoty znamenají střední hodnotu ±SD, n = 3.

Obr. 6 - Účinnost transfekce v diferencovaných buňkách ND7 komplexy pCMVp-Mulkationtový liposom

Buňky ND7 byly vysety do 24-jamkových kultivačních destiček na hustotu 4 x 10⁴ buněk/jamku v normálním růstovém médiu (+ sérum). O 24 hod později bylo médium nahrazeno diferenciačním médiem a buňky byly pěstovány dalších 24 hod. Byla použita tři různá diferenciační média: bezsérové (- sérum), normální růstové médium plus 1 mM cAMP (cAMP), nebo redukované sérum (0,5%) plus 1 mM cAMP a 50 ng/ml nervového růstového faktoru (NGF). Buňky byly potom transfekovány pCMVp v komplexu buď se samotným DC-Chol/DOPE nebo Mul plus DC-Chol/DOPE. O 48 hod později byly buňky fixovány a zpracovány pro histochemické stanovení X-Gal a bylo zjištěno procento pozitivních buněk. Ve všech případech zvýšila přítomnost Mul počet pozitivních buněk. Je zajímavé, že počet transfekovaných buněk byl zvýšen u buněk pěstovaných v přítomnosti cAMP jak s přídavkem, tak i bez přídavku Mul.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Syntéza peptidů

Peptidy Vpl a Mul byly syntetizovány na syntezátoru na pevné fázi Shimadzu PSSM-8 s použitím pětinásobného nadbytku (9-fluorenyl)methoxykarbonyl (Fmoc)-chraněných L-aminokyselin (Novabiochem) a reagencií FastMoc™ 2-(lH-benzoztriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfátu/hydroxybenztriazolu (HBTU/HOBt) (Advanced Chemtech Europe) jako vazebného činidla amidové skupiny. Po odštěpení pryskyřice a odstranění ochranných skupin bylo provedeno odsolení gelovou filtrací na koloně P2 Biogel (2x28 cm; Biorad) připojenou k systému FPLC (Amersham Pharmacia Biotech UK) s 0,1% vodnou TFAjako eluentem při průtoku 0,5 až 0,75 ml/min, Konečné preparativní čištění s reverzními fázemi bylo prováděno na koloně Vydac (Cl8, 5 μιη, 2 x 25 cm; Hichrom) připojené k systému Gilson HPLC (Anachem). Peptidy byly eluovány při 5 ml/min lineárním gradientem acetonitrilu v 0,1% vodné TFA a eluce byla monitorována při 220 až 230 nm.

Peptid Vpl byl připraven použitím pryskyřice labilní v kyselém prostředí £-Pro-2-chlortrityl super acid labile resin (Novabiochem) (100 mg, 1,05 mmol/g, 0,1 mmol). Pro inkorporaci všech aminokyselinových zbytků od šestého (Lys) až k N-koncovému zbytku byly použity prodloužené reakční doby. Po automatickém odstranění N-koncové ochranné skupiny Fmoc piperidinem (20%, obj./obj.) v di methyl formám idu, byla pryskyřice izolována, promyta dimethylformamidem (10 ml) a methanolem (15 ml), a potom usušena ve vakuu. Surový peptid byl odštěpen z pryskyřice ledem chlazenou TFA (8 ml), s obsahem fenolu (7%, hmotn./obj.), ethandithiolu (2%,

-16CZ 298353 B6 obj./obj.), thioanisolu (4%, obj./obj.) a vody (4%, obj./obj.) (činidlo známé jako směs A), a potom vysrážen ledovým methyl-terc-butyletherem (MTBE) (30ml). Vysrážený materiál byl potom odsolen a surová peptidová směs byla čištěna HPLC s reverzními fázemi. Po eluci byly frakce obsahující požadovaný peptid (eluce acetonitrilem 68,5 % obj./obj.) spojeny a lyofilizovány, za získání peptidu jako bílého prášku. Celkový výtěžek: 32 mg (15 pmol, 15 %); MS (MALDITOF) C₈5H_l5]N₂₆O₂₆S3: [M + H]⁺ vypočteno 2049,5, nalezeno 2050,2. Sekvence byla potvrzena analýzou aminokyselinového složení a sekvence. HPLC ukázala na homogenitu > 95 %.

Peptid Mul byl vyroben použitím pryskyřice Gly-Wang (Novabiochem) (40 mg, 0,67 mmol/g, 0,03 mmol). Byly používány normální reakční časy. Po automatizovaném odstranění N-koncové skupiny Fmoc jako výše byla pryskyřice izolována a promyta dichlormethanern (20 ml) a methanolem (20 ml) a potom byla usušena ve vakuu. Surový peptid byl odštěpen od pryskyřice použitím směsi A (8 ml) a vysrážen MTBE (30 ml), vše jako výše. Nakonec byla směs surového peptidu odsolena a čištěna HPLC s reverzními fázemi. Po eluci byly frakce obsahující požadovaný peptid (eluce acetonitrilem 17,2%) spojeny a lyofilizovány, za získání peptidu jako bílého prášku. Celkový výtěžek: 65 mg (26 pmol, 0 %); MS (ES) CgsHno^Ci^: [M + H]⁺ vypočtené 2440,7, nalezeno 2440,6. Analýzou HPLC byla zjištěna homogenita > 95 %.

Analýza vazby DNA

Čištěné peptidy byly rekonstituovány ve sterilní destilované H₂O při koncentraci 3 mg/ml. Peptid a pDNA byly převedeny na komplex ve 20 μΐ fyziologického roztoku s pufrem HEPES (137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0,75 mM Na₂HPO4, 19 mM HEPES, pH 7,4) 20 min při teplotě laboratoře. Komplexy peptid : pDNA byly potom analyzovány elektroforézou na agarózovém gelu (1 %), Kontrolní inkubace pro zjištění obecných makromolekulárních interakcí pDNA byly prováděny s použitím různých množství bovinního sérového albuminu s čistotou pro molekulární biologii (Sigma).

Buněčné kultury

Buňky ND7 jsou dobře charakterizována buněčná linie odvozená z fúze neuroblastomu (NI 87g2) se senzorickými neurony novorozené krysy (Wood J.N. a další, Novel Cell-Lines Display Properties of Nociceptive Sensory Neurons. Procceding of the Royal Society of London series B-Biological sciences 1990; 241; 187-194). Buněčná linie byla udržována v normálním růstovém médiu (NGM) (Leibovitzovo médium L-15 (BRL) obohaceném 10 % fetálního bovinního séra (BRL) 4 g/l glukózy, 4 g/l hydrogenuhličitanu sodného (BRL), 100 lU/ml penicílin/streptomycin (BRL)) při 37 °C a 5 % CO₂. Buňky byly vysety na 24-jamkové destičky (Costar) s hustotou, která po 24 hodinách poskytla konfluenci 70 %.

Diferenciace buněk ND7 byla prováděna pomocí tří výše popsaných metod (Wood J. N. a další, Novel Cell-Lines Display Propertis of Nociceptive Sensory Neurons. Proceeding of the Royal Society of London Series B-Biological Science 1990; 241: 187-194; Budhrammahadeo V., Lillycrop K.A. Latchman D.S., The Levels of the Antagoniscit Pou Family Transcription Factors Bm-3a a Bm-3b in Neuronal Cells Are Regulated in Opposite Directions By Sérum GrowthFactors. Neurosci. Letí. 1995; 185: 48-51). Buňky ND7 byly zaočkovány v NGM na hustotu 4 x 10⁴ buněk/jamku v 24-jamkových kultivačních miskách (Nunc). O 24 hod později byla média nahrazena buď a) NGM doplněným lmM adenosin 3':5'-cyklickým monofosfátem (cAMP; Sigma), nebo b) bezsérovým diferenciačním médiem (50 % Hams F12, 50 % DMEM, 5 pm/ml transferinu, 250 ng/ml inzulínu, 0,3 μΜ seleničitan sodný), nebo c) médium s nervovým růstovým faktorem (NGF) s nízkým obsahem séra (L-l 5 doplněné 2mM glutaminu, 4 g/l glukózy, 4 g/l hydrogenuhličitanu sodného, lOu/ml penicilinu, lOg/ml streptomycinu, 0,5% FCS, lmM cAMP, 50 ng/ml NGF (Alomone Labs)). Diferencované buňky ND7 byly pěstovány ve vhodném médiu 24 hod při 37 ^CC, 5 % CO₂ před transfekcí.

-17CZ 298353 B6

Buňky COS-7 (odvozené z ledviny kočkodana zeleného) byly pěstovány v médiu RPMI 1640 J (BRL) doplněném 10% fetálního bovinního séra (BRL) a 100 lU/ml penicilin/streptomycin j (BRL). I

Plazmidové konstrukty9

Všechny transfekce používaly reporterový plazmid pCMVp (Clontech, Palo Alto, CA) sobsahem úplné sekvence β-galaktosidázy E. coli ve směru transkripce vzhledem k promotoru/enhan-9 ceru brzké rané fáze lidského cytomegaloviru (Clontech). Zásoby plazmidové DNA byly připra-\ vény standardními metodami molekulárního klonování a čištěny systémem Qiagen Endotoxin-$ free plasmid purification systém (Qiagen, Dorking, UK).

Liposomy

Liposomy DC-Chol/DOPE byly připraveny jako bylo uvedeno dříve (Cooper R.G. a další, Polyamine analogues of 3 beta-[N-(N',N'-dimethylaminoethan)karbomoyl]cholesterol (DC-Chol) as agents for gene delivery, Chemistry - a European Journal 1998; 4. 137 - 151; McQuilin A. a další, Optimization of liposome mediated transfection of a neuronal cell line. Neuroreport 1997; 8: 1481-1484), Ve stručnosti, 6 pmol DC-Chol a 4 μηιοΙ DOPE (dodaný v koncentraci 10 mg/ml v CHCh) byly přidány do čerstvě destilované CH₂C12 (5 ml) po dusíkem. Do směsi bylo přidáno 5 ml 20 mM Hepes (pH 7,8) a směs byla sonikována 3 min. Organická rozpouštědla byla odstraněna za sníženého tlaku a získaná suspenze liposomu byla potom sonikována další 3 min. Liposomové preparáty byly uchovávány při 4 °C.

Protokol transfekce

Protože počáteční experimenty ukázaly, že přítomnost fetálního bovinního séra inhibovala transfekci buněk ND7, bylo pro všechny transfekce použito bezsérové diferenciační médium. Různá množství DNA a liposomů byla vložena na dno 7 ml sterilního zásobníku Bijou container (Bibby Sterilin Ltd., Staffordshire, UK), přičemž jednotlivé roztoky nebyly ve vzájemném kontaktu. DNA a liposomy byly spojeny přidáním 400 μΐ bezsérového diferenciačního média a mírným protřepáním. Směs DNA : liposomy byla inkubována při teplotě laboratoře 20 až 30 min před přidáním k buňkám. Směs DNA/liposomy byla potom přidána k buňkám a směs byla inkubována při 37 °C, 5 % CO2 2 hod a potom bylo médium nahrazeno kompletním médiem. O 24 až 48 hod později byly buňky fixovány a histochemieky zpracovány pro analýzu X-gal, jak je popsáno v McQuillin A a další, Optimalization of liposome mediated transfectison of a neuronal cell líne. Neuroreport 1997; 8. 1481 - 1484, nebo sklizeny na enzymatické testy na β-galaktosidázu (Promega Corp.).

Počítání buněk se provádělo při čtyřicetinásobném zvětšení použitím inverzního mikroskopu Nikon Diaphot. Každá transfekce byla opakována alespoň třikrát a pro každou jamku byla provedena alespoň tři oddělená počítání,

Transfekční komplexy obsahující testované peptidy byly vytvořeny následujícím způsobem. Různá množství peptidu byla vložena na dno sterilních polystyrénových nádobek vedle, ale nikoli v přímém kontaktu s 1 pg pCMVp, a oba roztoky byly smíseny přidáním 400 μΐ bezsérového média NGM. Komplexy byly inkubovány při teplotě laboratoře 10 min a potom byla přidána směs DC-Chol/DOPE. Komplex dDNA/peptid/liposomy byl potom inkubován při teplotě laboratoře 20 min a potom přidán k buňkám jako výše.

Příklad 1

Test vazby DNA

Mul je polykationtový peptid složený z 19 aminokyselin asociovaných s jaderným komplexem adenoviru (tabulka 1) (Anderson C.W., Young M.E., Flint S., J., Characterization of the

-18CZ 298353 B6 adenovirus 2 virion protein, mu. Virology 1989; 172: 506 - 512; Hosokawa K., Sung M.T., Isolation and characterization of an extremely basic proteinfrom adenovirus type 5. Journal Of Virology 1976, 17. 924 - 934). Autoři vynálezu porovnávali schopnost vázat DNA peptidů Mul s hlavním kapsidovým proteinem Vpl myšího polyomaviru interakcí s plazmidovou DNA v testu gelové retardace. Vpl je peptid o délce 19 aminokyselin, který obsahuje signál nukleární lokalizace (Chang D., Cai X., Consigli R.A., Characterization of the DNA binding properties of polyomavirus capsid proteins. Journal of Virology 1993; 67: 6327 - 6331) a obsahuje méně pozitivně nabitých aminokyselin než peptid Mul. Bylo proto předpokládáno, že bude mít nižší schopnost vázat DNA.

Tabulka 1: proteinové sekvence Mul a VP1

Polypeptid	Sekvence	Mh	Poměr náboj/AA
Mu1	NH2-Met-Arg-Arg-Ala-His-Hís-Arg-Arg-Arg-Arg- Ala-Ser-His-Arg-Arg-Meť-Arg-Gly-Gly-OH	2440	0,63
VP1	NH?-Met-Ala-Pro-Lvs-Arq-Lvs-Ser-Glv-Val-Ser- Lys-Cys-Glu/rhr-Lys-Cvs-Thr-Pro-Pro-OH	2049	0,26

Sekvence NLS v peptidů VP1 je odtržena.

Různá množství čištěného peptidů byla inkubována při laboratorní teplotě v HBS po dobu přibližně 10 min a potom analyzována elektroforéza na agarózovém gelu. Bez přidání peptidů migrovala nadšroubovicová a relaxovaná cirkulámí plazmidová DNA (pDNA) očekávaným způsobem (obr. 1, dráha 8).

Počínaje poměrem DNA : peptid Mul 1 : 0,25 (hmotn/hmotn.) byla zpomalována migrace plazmidové DNA (obr. 1). Migrace plazmidové DNA byla mírně ovlivňována při poměru 1 : 0,25 (hmotn./hmotn.), ale při poměru 1:0,5 (hmotn./hmotn.) byla migrace plazmidové DNA podstatně zpomalena a pouze velmi málo materiálu se dostalo mimo jamky. Při poměrech 2 : 1 a výše byla pDNA neschopná migrovat do agarózového gelu a byla snížena schopnost ethidiumbromidu vytvářet vnitřní cheláty s plazmidem. Naopak v případě Mul nebyl detekován žádný vliv na elektroforetickou pohyblivost plazmidové DNA $ Vpl při poměrech pDNA : protein až do l : 8 (hmotn./hmotn.) (obr. 1). Přidání 8 pg Vpl k 1 pg plazmidové DNA vedlo k rozšíření pruhu nadšroubovicové pDNA. Nebyl však pozorován žádný vliv na pruh relaxované pDNA s Vpl až do poměru 1 : 32 (hmotn./hmotn.) pDNA : protein. Při tomto poměru byly významně zpomalené pruhy jak nadšroubovicové, tak i relaxované pDNA, a určité množství DNA zůstalo zachyceno v jamce. Žádný vliv na elektroforetickou pohyblivost nebyl detekován v případě, když byla pDNA inkubována s BSA při poměrech až do 1 : 30 (hmotn./hmotn.) pDNA : protein (obr. 1).

Příklad 2

Transfekce nediferenciovaných buněk ND7

Autoři zjišťovali schopnost peptidů Mul a Vpl zesilovat transfekci neuronální buněčné linie kationtovými liposomy pomocí testu β-galaktosidázového reporterového genu. Buňky ND7 byly transfekovány plazmidem pCMVp v komplexu s různými množstvími peptidů s DC-Chol/DOPE. Autoři vynálezu již dříve ukázali, že kationtový liposom DC-Cho/DOPE je schopen účinně transfekovat buněčnou linii ND7 odvozenou z neuronů (McQuillin A. a další, Optimalization of liposome mediated transfection of a neuronal cell line. Neuroreport 1997; 8: 1481

-19CZ 298353 B6

1484). V této studii bylo zjištěno, že optimální účinnost (>40 %) byly získány u této buněčné linie odvozené z neuronů použitím 1 pg piazmidové DNA v komplexu s 3 pg DC-Chol/DOPE (McQuillin A. a další, Optimalization of liposome mediated transfection of aneuronal cell line. Neuroreport 1997; 8: 1481 - 1484). V současnosti se maximální úrovně exprese transferu dosahují mezi 48 až 60 hodinami po transfekci. Proto pro maximalizaci možnosti detekovat zlepšení transfekce se všechny testy prováděly během 12 až 20 hodin od transfekce v době, kdy byly nižší exprese reporterového genu. Již dříve autoři zjistili, že poměr pDNA: liposomy 1 : 3 (hmotn./hmotn.) je optimální pro transfekce v buňkách ND7 (McQuillin A. a další, Optimalization of liposome mediated transfection of a neuronal cell line. Neuroreport 1997; 8; 1.481 - 1484). Proto byl porovnáván vliv různých množství peptidu na transfekce při poměrech 1 : 3, 1 : 4 a 1 : 6 pDNA: CD-Chol/DOPE. Geiová retardační analýza ukázala, že přibližný poměr 1 :0,5 (hmotn./hmotn.), pDNA : Mul byl dostatečný pro vazbu v podstatě veškeré piazmidové DNA (obr. 1). Počáteční experimenty používající tento poměr a liposomy však účinnost transfekce neprokázaly (není ukázáno). Objemy použité pro tvorbu transfekčních komplexů byly mnohem větší než objemy použité pro provádění gelového retardačního testu (400 μΐ proti 20 μΐ). Proto autoři testovali větší množství Mul, který měl v roztoku podobnou koncentraci jako peptid použitý při gelovém retardačním testu. Byl porovnáván vliv 0,6, 6, 12 a 21 μg peptidu Mul na transfekce zprostředkované DC-Chol/DOPE. Bylo zjištěno, že Mul byl schopen zlepšit účinnosti transfekce zprostředkované kationtovými liposomy více než čtyřnásobně. Největší zlepšení účinnosti transfekce bylo dosaženo při relativních poměrech 1/12/6 pCMVp/Mul/(DC-Chol/DOPE) (hmotn./hmotn./hmotn.). Tato kombinace vedla k jedenáctinásobnému zvýšení transfekci ve srovnání se samotnou DNA (obr, 2).

Test na p-galaktosidázový reporterový gen poskytuje měřítko celkové hladiny vytvořené β-galaktosidázy, ale neposkytne žádnou informaci týkající se počtu transfekovaných buněk. Z toho důvodu byly také zjišťovány u transfekovaných buněk ND7 počtu buněk. Buňky byly zaočkovány na hustotu 4 x 10⁴ do 24-jamkových kultivačních destiček. Po 24 hodinách byly destičky krátce promyty bezsérovým médiem a transfekovány pCMVp v komplexu s DOChol/DOPE a peptidem Mul. Jako poměry byly použity optimální poměry zjištěné testem reporterového genu 1:12:6, pCMVp : Mul : DC-Chol/DOPE. Použitím těchto poměrů bylo zjištěno šestinásobné zvýšení počtu buněk pozitivních na β-galaktosidázu (obr. 3 a 6). Při jakékoli z použitých koncentrací nebyly detekovány s komplexem Mul žádné zjevné úbytky buněk. Podobně nekolísala koncentrace proteinu v buněčných lyzátech použitých pro test β-galaktosidázového reporterového genu ve srovnání s netransfekovánými buňkami (údaje nejsou ukázány).

Naopak v případě Vpl nebylo pozorováno žádné zvýšení účinnosti transfekce (obr. 4). Žádné zlepšení účinnosti transfekce ve srovnání se samotnou DNA nebylo také pozorováno s pCMVp v komplexu se samotným Mul.

Pro zjištění, zdaje možno dosáhnout zlepšené transfekce u jiných typů buněk, byly provedeny podobné analýzy na buňkách COS-7. Mul rovněž zlepšit transfekci v buňkách COS-7 zprostředkovanou liposomy (obr. 5). Stejný poměr pDNA : Mul : liposomy byl shledán jako optimální jak v případě buněk ND7, tak i buněk COS-7. Také byl pozorován podobný stupeň zlepšení (3,7 násobný) vzhledem k samotným kationtovým liposomům.

Příklad 3

Transfekce u diferencovaných buněk ND7

Autoři vynálezu také zjišťovali schopnost peptidu Mul zlepšovat transfekci zprostředkovanou kationtovými liposomy v diferencovaných buňkách ND7. Buněčná linie ND7 je odvozena z fúze primárních neuronů krysích ganglií dorsálního kořene (DRG) a myšího neuroblastomu N18Tg2 (Wood J.N. a další, Novel Cell-Lines Display Properties of Nocíceptive Sersory Neurons. Proceedings ofthe Royal Society of London Series B-Biological Sciences 1990; 241: 187-194).

-20CZ 298353 B6

Buňky ND7 lze diferencovat řadou způsobů včetně odebrání séra, podání cAMP nebo vystavení snížené koncentraci séra plus cAMP a nervového růstového faktoru. Diferenciace buněk ND7 vede k expresi buněčných vlastností asociovaných s jiných rodičovskými nociceptivními senzorickými neurony včetně omezení buněčného dělení a zahájení růstu neuritů. Buňky ND7 byly zaočkovány do 24-jamkových kultivačních destiček a diferenciace probíhala o 24 hod. později. 15 až 20 hodin po nástupu diferenciace byla provedena transfekce jako výše. 15 až 20 hodin po transfekci byly buňky fixovány a zpracovány na histochemický test X-gal. V souladu s předchozími pozorováními docházelo ke značnému kolísání účinnosti tranfekce mezi těmito třemi diferencovanými skupinami. Buňky ND7 diferencované odebráním séra vykazovaly nej nižší míry transfekce (1,3 %), zatímco nej vyšší míry bylo možno pozorovat ve skupině cAMP (8%) prostředí hodnoty ve skupině s nízkou koncentrací séra/cAMP/NGF (4,7 %) (obr. 5). Za všech těchto tří podmínek však přidání polypeptidu Mul do transfekčního komplexu zlepšilo transdukci diferencovaných buněk ND7. U buněk ND7 diferencovaných buď samotným cAMP nebo expozici nízké hladiny séra/cAMP/NGF došlo k více než šesti násobnému výšení účinností (obr. 5). Největší zvýšení účinnosti však bylo možno pozorovat ve skupině diferencované zvýšení.

Komplexy peptidu Mul a DNA

Jak je ukázáno v příkladu 1 (analýza vazby DNA) použitím gelové elektroforézy, migrace plazmidové DNA byla výrazně omezena a pouze malé množství DNA migrovalo mimo jamky při poměru Mul : DNA více než 0,5 : 1,0 (hmotn./hrnotn.). To ukazuje, že peptid Mul silně interagoval s DNA a mohl neutralizovat a kondenzovat nukleové kyseliny za vytvoření malých částic vhodných pro podávání genů. Velikost částic Mul : DNA (MD) byla testována při rozmezí koncentrací Mul : DNA uvedeném na obr. 7.

Částice MD byly připraveny míšením. Ve skutečnosti, příslušné alikvoty peptidu Mul v deionizované vodě byly přidány do plazmidové DNA (pCMVp) (konečná koncentrace 220 pg/ml) ve 20 mM pufru Hepes, pH 7,0. Po dobrém promísení byla každá směs inkubována 10 min při 20 °C. Ihned po inkubaci byla každá směs zředěna pufrem Hepes (konečná koncentrace DNA 24 g/ml) a vystavena analýza velikosti částic fotonovou korelační spektroskopií (N4 plus, Coulter). Všechna měření byla prováděna při 20 °C a údaje byly zaznamenávány při úhlu 90°. Pro výpočet střední velikosti částic a standardní distribuce (S.D.) byla použita unimodální analýza.

Je zajímavé, že ačkoliv DNA navázaná na Mul vytvářela komplexy v celém testovaném rozmezí koncentrací, velkosti částic podstatně kolísala v závislosti na poměru Mul : DNA. Stabilní, malé nanočástice se tvořily při poměru Mul: DNA 0,3 až 1,2 (rozmezí L) a vyšší než 5 (rozmezí H). Mezilehlé poměry vedly ke značné agregaci, při které velikost částic komplexu rostla po dobu inkubace za dosažení velikosti více než 2 pm (obr. 7).

Příklad 4

Příprava LMD v rozmezí L

Autoři zjišťovali, zda komplexy liposom-Mul-DNA s nízkým poměrem MD : DNA by mohly tvořit stabilní nanočástice, a zda by měly výsledné částice komplexi dobré transfekční aktivity.

Příprava liposomů: DC-Chol (30 pmol) a DOPE (20 pmol) byly kombinovány v dichloromethanu. Organické rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku s použitím rotační odparky a zbytek byl sušen 3 hod ve vakuu. Potom byl přidán k filmu lipidu 4mM pufr Hepes, pH 7,0 (3 ml), za silného míchání. Po krátké sonikaci (2 až 3 min) byla získaná suspenze kationtových liposomů třikrát extrudována na zařízení Extruder device (Lipex Biomembranes) přes dva na sobě naskládané polykarbonátové filtry (0,2 pm Millipore) a potom desetkrát přes dva na sebe položené polykarbonátové filtry (0,1 pm Millipore) za vytvoření malých liposomů (střední průměr 109 nm při měření PCS) (přibližně 8 až 10 mg/ml v závislostí na preparátu).

-21 CZ 298353 B6

Příprava komplexů liposom : Mul : DNA (LMD): Peptid Mul (0,12 mg v deionizované vodě, koncentrace peptidu 3,5 mg/ml) byl přidán k roztoku plazmidové DNA (pCFl-CAT) (0,2 mg, koncentrace plazmidu typicky 1,0 mg/ml) v 4mM pufru Hepes za trvalého silného míchání. Suspenze kationtových liposomú (celkové množství lipidu 2,4 mg, 4 pmol) byla ke směsi přidána za vytvoření malých částic s úzkou distribucí velikosti (168 nm ± 58 nm) při měření metodou PCS. Tyto LMD (konečná koncentrace DNA 0,14 mg/ml) byly uchovávány při -80 °C s přídavkem 10% sacharózy (hmotn./obj.) až do použití, V průběhu jednoho měsíce nebyla pozorována žádná změna velikosti částic.

Komplexy liposom : DNA (LD) (lipoplexy) byly připraveny pro kontrolní experimenty s použitím poměru liposom : DNA 3 : 1 (hmotn./hmotn.), což je optimální složení pro transfekci buněk ND7.

Transfekce buněk ND7: Buňky ND7 byly zaočkovány do normálního růstového média (NGM) (s 10 % séra) na hustotu přibližně 4 x 10⁴ buněk na jamku, ve 24-jamkové kultivační destičce. Po 24 hod byly buňky promyty krátkým vystavením média NGM (bez séra) a potom byly smíseny s roztoky obsahujícími komplex LMD nebo LD předem zředěnými NGM (bez séra) (ve všech případech byla konečná koncentrace NDA 3,2 pg/ml) po uvedené doby. Buňky byly potom znovu promyty a inkubovány před sklizní dalších 48 hod. Míry transfekce byly zjišťovány enzymatickým testem na chloramfenikoltransferázu (CAT) s použitím ¹⁴C-CAM jako substrátu (Promega). Transfekční aktivita byla vyjádřena jako procento konverze vloženého ¹⁴C-CAM prostřednictvím enzymu.

Autoři vynálezu nalezli mnohem vyšší expresi reporterového genu při transfekci zprostředkované LMD ve srovnání s LD. Transfekce LMD totiž vedla k šestinásobné enzymatické aktivitě CAT po době transfekce 10 min a šestinásobné aktivitě po době transfekce 60 min ve srovnání s transfekci zprostředkovanou LD (obr. 8). Významná transfekce byla pozorována v případě LMD i v případě, kdy byla doba transfekce pouze 10 min. Tyto údaje ukazují, jak rychle jsou schopny částice LMD vstupovat do buněk.

Příklad 5

Změny kationtového lipidu (cytofektinu)

Autoři vynálezu zjišťovali, zda by mohly být komplexy LMD vylepšeny zavedením polykationtových cholesterolových lipidů (WO 97/45442). Pro přípravu kationtových liposomú byly použity lipidy CDAN (Β 198), ACHx (CJE52) a CTAP (B232) (obr. 9) namísto CD-Chol. Každý systém kationtového liposomú byl složen ze 60 molárních procent kationtového lipidu a 40 molárních procent DOPE a připraven podle popisu v příkladu 4. Byly připraveny následující rozdílné systémy komplexu LMD, které byly vzájemně porovnávány: LMD (DC-Chol), LMD (B198), LMD (CJE52) a LMD (B232). Všechny systémy LMD byly připraveny s kationtovými liposomy (celkové množství lipidu 20 pmol) a 0,6 mg peptidu Mul na 1,0 mg DNA (pCMVp), jak bylo popsáno výše. Ukázalo se, že částice mají průměr nižší než 200 nm.

Komplexní směsi liposom : DNA (LD) (lipoproxy) byly připraveny pro kontrolní experimenty s poměrem liposom : DNA 3 : 1 (hmotn./hmotn.), což je optimální složení pro transfekci buněk ND7.

Transfekce buněk ND7: Buňky ND7 byly zaočkovány v médiu NGM (s 10% sérem) na hustotu přibližně 4 x 10⁴ buněk na jamku, ve 24-jamkové kultivační destičce. Po 24 hodinách byly buňky promyty krátkým vystavením médiu NGM (bez séra) a potom smíseny s roztoky s obsahem komplexů LMD nebo LD (předředěným NGm (bezsérovým)) (konečná koncentrace DNA ve všech případech 2,5 pg/ml) a inkubovány 1 hod. Buňky byly potom znovu promyty a inkubovány

-22CZ 298353 B6 dalších 48 hod před zpracováním pro histochemické barvení X-gal. Počet buněk zbarvených modře byl počítán pod inverzním mikroskopem.

Ve všech případech pracovaly formulace LMD lépe než odpovídající systémy LD připravené se stejnými polykationtovými cholesterolovými lipidy (obr. 10). Pořadí účinnost transfekce bylo LMD (B198) > LMD (DC-Chol) > LMD (CJE52) LMD (B232). Stejné pořadí, Β198 > DC-Chol > B232 bylo pozorováno s odpovídajícími systémy LD.

Příklad 6

Množství peptidu Mul v rozmezí L

Autoři vynálezu testovali vliv poměru Mul : DNA (v rozmezí L na obr. 7) na transfekční aktivitu.

Kationtové liposomy složené z kationtového lipidu B198 a DOPE (3 : 2 mol/mol) byly připraveny stejným způsobem jako bylo popsáno v příkladu 4. Byla připravena řada komplexních směsí MD (poměr Mul : DNA od 0,3 do 1,2) a byly vytvořeny komplexy skationtovým liposomem. Získané systémy LMD byly složeny z liposomů : Mul : DNA (pCMVp) v poměrech 12 : 0,3 :1,12: 0,6 : 0,6, 12 : 0,9 : a 12 : 1,2 : 1 hmotn./hmotn./hmotn. Změřené velikosti částic LMD byly přibližně 150 nm.

Transfekční aktivity byly vyhodnoceny in vitro s použitím buněk Panc-1 (lidská buněčná linie rakoviny pankreatu). Buňky byly zaočkovány na přibližnou hustotu 5 x 10⁴ na jamku ve 24-jamkové kultivační destičce v médiu RPMI doplněném 10 % FCS a pěstovány 24 hod v přítomnosti 5 % CO₂ při 37 °C. Buňky byly promyty krátkým vystavení médiu RPMI a potom smíseny s roztoky komplexů LMD předředěným RPMI (konečná koncentrace DNA 5,0 pg/ml ve všech případech) po dobu 30 min. Buňky byly potom znovu promyty a inkubovány dalších 48 hod v médiu RPMI doplněném 10 % FCS před sklizením a testováním enzymatické aktivity β-galaktosidázy použitím standardního testovacího kitu (Promega).

Jakje ukázáno na obr. 11, optimální poměr liposom : Mul : DNA pro transfekci buněk Panc-1 byl nalezen jako 12 : 0,6 : 0,6. Jinak dosahovaly komplexy LMD s těmito nízkými obsahy Mul vynikajících výsledků transfekce.

Příklad 7

Množství a složení lipidů

Pro zjišťování vlivu změny poměru kationtového lipidu k DOPE stejně jako poměru celkového lipidu kMul a DNA byla připravena řada systémů LMD s použitím B198 jako výhodného kationtového lipidu. Byly připraveny kationtové liposomy složené ze 60molárních% B198 a 40 molámích % DOPE (3 : 2 mol/mol), 50 molámích % B198 a 50 molámích % DOPE (1:1 mol/mol) a 33 molámích % B198 a 67 molámích % DOPE (1:2 mol/mol), které byly kombinovány se standardní komplexní směsí MD (Mul : DNA 0,6 : 1 hmotn./hmotn). v poměrech uvedených na obr. 12 způsobem popsaným v příkladu 4.

Pro kontrolní experimenty byly připraveny komplexní směsi liposom ; DNA (LD) (lipoplexy) s poměrem liposom : DNA 3 : 1 (hmotn./hmotn.). Bylo zjištěno, že všechny systémy LMD mají větší průměrnou velikost, jestliže byla do komplexu s komplexy MD přivedena nižší množství kationtových liposomů. Velikost částic LMD složených z více než 12 pmol lipidů/mg DNA však zůstaly nižší než 200 nm, zatímco částice obsahující 12 až 6 pmol lipidů/mg DNA měly velikost větší. V některých případech byla v průběhu přípravy systémů LMD složených ze 6 pmol lipidů/mg DNA pozorována viditelná agregace.

-23CZ 298353 B6

Transfekční aktivity byly zjišťovány použitím Panc-1 (obr. 12). Buňky byly zaočkovány na přibližnou hustotu 5 x 10⁴ na jamku ve 24-jamkové kultivační destičce v médiu DMEM doplněném 10% FCS a pěstovány 24 hod v přítomnosti 5% CO2 při 37 °C. Buňky byly promyty krátkým vystavením médiu DMEM a potom smíšeny s roztoky s obsahem komplexů LMD nebo 5 LD předředěnými médiem DMEM (konečná koncentrace DNA ve všech případech 5,0 pg/ml po dobu 2 hod). Buňky byly potom znovu promyty a inkubovány dalších 48 hod v médiu DMEM doplněném 10% FDS před sklizní a testováním na enzymatickou aktivitu β-galaktosidázy použitím standardního testovacího kitu (Promega),

Maximální transfekční aktivita nebyla významně odlišná u těchto tří testovaných formulací s odlišným poměrem lipidu k DOPE. V případě systémů LMD připravených s poměrem B198 : DOPE (1 : 2 mol/mol) byla dosažena maximální transfekce při poměru liposom ; DNA přibližně 12, 5 pmol lipidu/mg DNA. Transfekční aktivity systémů LMD připravených s poměrem B198 : DOPE (3 : 2 mol/mol) a B198 : DOPE (2 : 2 mol/mol) dosáhly ustálené hladiny při poměrech liposom : DNA vyšších než 123,5 pmol lipidu/mg DNA. Všechny analyzované systémy LMD měly sklon vykazoval nízké transfekční aktivity při nízkých poměrech liposom ; DNA (obr. 12). Předpokládá se, že formulace LMD složené s nízkým množstvím peptidu Mul by měly potřebovat větší množství kationtových liposomů ve srovnání s formulacemi připravenými s použitím vyšších množství peptidu Mul, aby bylo dosaženo pro případné systémy LMD úplné 20 transfekční aktivity.

Příklad 8

Srovnání peptidu Mul s protaminem

Protamin je v případě se vyskytující kationtový peptid, který se nalézá ve velkém množství 25 v rybím spermatu, a má silnou schopnost neutralizovat a kondenzovat DNA. Transfekční aktivita protaminu byla srovnávána s aktivitou peptidu Mul. Peptid Mul nebo protaminsulfát (Sigma, třída X z lososa) byly přivedeny do komplexu s DNA (pCMVp) a potom kationtovými liposomy (B198 : DOPE v poměru 3 : 2 mol/mol) za poskytnutí poměru liposom : peptid : DNA 12 : 0,6 : 1 (hmotn./hmotn./hmotn.).

Transfekční aktivity byly zjišťovány v buňkách Swiss 3T3. Buňky byly zaočkovány na přibližnou hustotu 2 x 10⁴ na jamku ve 24-jamkové kultivační destičce v DMEM doplněném 10% FCS a pěstovány 48 hod pro dosažení konfluence v přítomnosti 5% CO₂ při 37 °C. Buňky byly promyty krátkým vystavením médiu DMEM a potom smíseny s roztoky obsahujícími komplexy 35 LMD nebo LD předředěnými médiem DMEM (konečná koncentrace DNA ve všech případech

5,0gg/ml) po dobu 1 nebo 2 hod. Buňky byly potom znovu promyty a inkubovány dalších 48 hod v médiu DMEM doplněném 10% FCS před sklizní. Míra enzymatické aktivity β-galaktosidázy byla zjišťována standardním testovacím kitem (Promega).

Jak je ukázáno v obr. 13, komplexy s obsahem peptidu Mu 1 prokázaly lepší transfekci těchto konfluentních buněk než komplexy s obsahem proteminu.

Příklad 9

Alternativní katíontové peptidy

Pro zjišťování vlivu různých alternativních kationtových peptidu na transfekční aktivity byla připravena řada komplexů liposom : kationtový peptid : DNA a in vitro byly analyzovány jejich relativní transfekční schopnosti. Peptidy byly polylysinhydrochlorid (průměrná molekulová hmotnost 3970, Sigma), polyargininhydrochlorid (průměrná molekulová hmotnost 11 800, Sigma), peptid odvozený od proteinu V, pV (p5, sekvence ukázána dále) a peptidový analog Mul (V, sekvence ukázána dále) a samotný peptid Mul. Peptid p5 peptid a peptid V byly syntetizovány použitím stejné metody syntézy peptidů na pevné fázi jaká byla použita pro přípravu peptidu Mul.

-24CZ 298353 B6

Každý peptid byl kombinován skationtovým liposomem (DC-Chol : DOPE 3 : 2 mol/mol) a DNA (pCMVp) v poměru liposom : peptid : DNA 12 : 0,6 : 1 (hmotn./hmotn./hmotn.) jak je popsáno v příkladu 4. Transfekční aktivity byly testovány použitím buněk HeLa (lidské epiteliál5 ní buňky). Tyto buňky byly zaočkovány na přibližnou hustotu 5 x 10⁴ na jamku ve 24-jamkové kultivační destičce v médiu DMEM doplněném 10% FCS a pěstovány 24 hod v přítomnosti 5% CO2 při 37 °C. Buňky byly promyty krátkým vystavením médiu DMEM a potom smíseny s roztoky obsahujícími komplexy LMD nebo LD, předředěnými médiem OPTIMEM (Gibco) (konečná koncentrace DNA ve všech případech 1,0 pg/ml) po dobu 30 min. Buňky byly potom 10 znovu promyty a inkubovány dalších 48 hod v médiu DMEM doplněném 10% FCS před sklizní.

Míra enzymatické aktivity β-galaktosidázy byly zjišťována standardním testovacím kitem (chemiluminescence, Roche).

Jak je ukázáno na obr. 14, kationtové peptidy odvozené z adenoviru (Mul a p5) a analog Mul 15 (V) ukázaly vynikající transfekční aktivitu ve srovnání s komplexy připravenými s použitím syntetických kationtových polypeptidu, polylysinu a polyargininu.

Aminokyselinová sekvence peptidu p5, V a Mul.

P5; RPRRRATTRRRTTTGTRRRRRRR

V; VRRVHHRRRRVSHRRVRGG

Mu 1; MRRAHHRRRRASHRRMRGG

Příklad 10

Porovnání s komplexem Transfast použitím Panc-1

LMD a LD byly připraveny stejným způsobem popsaným v příkladu 4 kromě použití pCMVp.

Komplex DNA Transfast (Promega) byl připraven podle protokolu výrobce,

Transfekční aktivity byly vyhodnocovány in vitro použitím buněk Panc-1. Buňky byly zaočková30 ny na přibližnou hustotu 5 x 10⁴ na jamku ve 24-jamkové kultivační destičce v Médiu RPMI doplněném 10% FCS a pěstovány 24 hod v přítomnosti 5% CO₂ při 37 °C. Buňky byly promyty krátkým vystavením médiu RPMI a potom smíseny s roztoky obsahujícími komplexy LMD nebo LD předředěnými médiem RPMI (konečná koncentrace DNA ve všech případech 5,0 μg/ml) po uvedené doby. Buňky byly potom znovu promyty a inkubován dalších 48 hod v médiu RPMI 35 doplněném 10% FCS před sklizní. Hladina enzymatické aktivity β-galaktosidázy byla zjišťována standardním testovacím kitem (Promega). Transfekce komplexem Transfast : DNA byla prováděna v bezsérovém médiu (optimální podmínky) po dobu 1 hod.

Jak je ukázáno na obr. 15, LMD ukázal lepší transfekční aktivitu než komplex Transfast: DNA a 40 LD. Tyto výsledky jsou zcela v souladu s výsledky nalezenými u buněk ND-7.

Příklad 11

Srovnání s Lipofectaminem použitím lidských bronchiálních buněk

Transfekční aktivita komplexů LMD byla srovnávána s aktivitou Lipofectaminu (Gibco) v komplexu s DNA použitím buněk HBE (buňky lidského bronchiálního epitelu).

Buňky byly zaočkovány do 12-jamkové kultivační destičky v médiu DMEM doplněném 10% FCS a pěstovány 24 hod v přítomnosti 5% CO₂ při 37 °C. Buňky byly promyty krátkým 50 vystavením médiu DMEM a potom smíseny s roztoky obsahujícími buď LMD (příprava jako v příkladu 4) nebo LD (příprava z komplexu lipofectamin : DNA 12 : 1 hmotn./hmotn.), předředěnými médiem OPTIMEM (Gibco) (konečná koncentrace DNA ve všech případech

-25CZ 298353 B6

5,0pg/ml) po uvedené doby (viz obr. 16). Buňky byly potom znovu promyty a inkubovány dalších 48 hodin v médiu DMEM doplněném 10% FCS před zpracováním na histochemické barvení X-gal.

LMD ukázal lepší transfekční schopnost než lipofectamin (obr, 16) a rovněž ukázal rychlejší přijímání buňkami HBE. Podobné výsledky byly pozorovány u buněk ND7 a Panc-1.

Příklad 12

Porovnání s činidlem LT1 použitím krysího mozku; expriment ex vivo

Autoři vynálezu testovali transfekční aktivity v organotypických kulturách z krysího mozku s použitím reportérové DNA (pCMVp) s cílem napodobit modle in vivo. Řezy mozku byly udržovány na transparentních porézních membránách a byly sledovány pro udržení jejich vnitřní konektivity a buněčné architektury ve velké míře.

Komplexy LMD a LD byly připraveny jak je ukázáno v příkladu 4. LT1 je polyaminové transfekční činidlo vyráběné firmou PanVera Co. Byl připraven komplex obsahující kationtový liposom (DC Chol : DOPE, 3 : 2 mol/mol), LT-1 a plazmid pCMVp v poměru 3 : 3,2 : 1 (hmotn./hmotn./hmotn.). Řezy mozku byly vystaveny působení těchto roztoků obsahujících LMD, LD nebo liposom : LT1 : DNA po dobu 2 hod (Murray a další, Gene Ther, 1999, 6, 190 - 197). Ve všech případech nebyly pozorovány žádné morfologické změny v řezech v průběhu experimentu. Po 48 hod inkubace po transfekcí byly buňky sklizeny, barveny X-gal a na řezu bylo počítáno množství modrých buněk (obr. 17).

Při dávce DNA 5,0 pg (2 ml kultury), poskytl LMD zřetelně vyšší počet modře zbarvených buněk než komplex LD neb LT1 po barvení X-gal. Již v dávce 129 ng ukázal komplex LMD významnou transfekční aktivitu, ještě vyšší než aktivita komplexu LD (DC Chol : DOPE v komplexu s DNA, poměr 3 : 1 hmotn./hmotn,) (Dávka DNA 5,0 pg). Autoři nalezli mnohem vyšší expresi reporterového genu u komplexu LMD ve srovnání s transfekcí zprostředkovanou komplexy LD a liposom : LT1 : DNA. Transfekce zprostředkovaná LMD byla ve skutečnosti více než devatenáctinásobně účinnější než transfekce zprostředkovaná LT a více než čtyřikrát účinnější než transfekce použitím komplexu liposom : LT1 : DNA při použití srovnatelných dávek.

Příklad 13

Srovnání s kationtovými liposomy GL-67; experiment in vivo v myších plicích

Byla testována transfekční aktivita v myších plicích in vivo komplexu LMD (připraveného podle popisu v příkladu 4 s použitím kationtových liposomů DC-Chol: DOPE [3 :2, mol/mol] a plazmidu pCFl-CAT), která byla porovnávána s transfekční aktivitou kationtových liposomů GL-67 : DOPE i DMPE-PEG₅₀oo (1:2: 0,05 mol/mol/mol) v komplexu s plazmtdem pCFlCAT (LD) poměr liposom : DNA 5,4 : 1 hmotn./hmotn.) používaných pro zvýšení účinku v klinických pokusech na plicích (Alton a další, Lancet, 1999, 353, 947 - 954).

LMD (konečná koncentrace DNA 0,14 mg/ml; objem 100 ml; dávka DNA 14 pg) byl vdechnut do plic myší Balb/c, GL-67 : DOPE : DMPE-PEG5000 (1:2: 0,05 mol/mol/mol) byl uveden do komplexu s plazmidem pCFl-CAT (konečná koncentrace DNA 0,8 mg/ml; objem 100 pl; dávka DNA 80 pg) a tento komplex LD byl podobně vdechnut do plic Balb/c. Po 48 hodinách byly plíce homogenizovány a testovány na aktivitu CAT.

Výsledky ukazují (obr. 18), že LMD a systém LD s obsahem GL-67 poskytly v podstatě ekvivalentním míry transfekce in vivo, i když systém LMD dodával pětinásobně nižší dávku DNA.

-26CZ 298353 B6

Příklad 14

Systémy LMD s modifikovaným cukremj

Pro aplikace in vivo byl měly být minimalizovány nespecifické interakce LMD s biologickýmj prostředím. Například při intravenózním podávání jsou důležité překážky nežádoucí interakce sei složkami krve (soli, proteiny...) a jinými než cílovými buňkami. Tato opsonizace cizích částicj plazmatickými proteiny představuje jeden z prvních kroků v přirozeném procesu odstraňování1 cizích částic vrozených imunitním systéme. Pro snížení vazby proteinů a agregace indukované>

solemi mohou být na LMD navázány v přírodě se vyskytující polysacharidy. Tato modifikace’

LMD uhlohydrátu může být stejně tak použita pro směrování LMD na uhlohydrátové receptory.

Pro dosažení požadovaného účinku byly navrženy neoglykolipidy popsané v obr. 19. Tyto sloučeninyjsou založeny na třech odlišných doménách.

ACHx (CJE 52): Tento lipid (viz obr. 9) byl zvolen jako obecná lipidové platforma pro požadované neoglykolipidy. Cholesterolový alifatický kruhový systém představuje velmi hydrofobní oblast, která se vkládá do lipidového obalu částic LMD nebo LD a působí jako neoglykolipidová kotva.

Uhlohydrátový motiv: Volba oligosacharidů byla omezena komplexností přídavných chemických reakcí týkajících se modifikace uhlohydrátů. Autoři se rozhodli použít komerčně dostupné uhlohydráty s dlouhým řetězcem maltotetraózu a maltoheptaózu, aby mohl být dokázán tento princip.

Propojovací část: Použití propojení s chemickou selektivitou se ukázalo účinné a pružné a umožnilo syntetizovat široké rozmezí neoglykolipidu. Tato chemoselektivní technologie byla založena na konverzi CJE52 na hydroxylaminolipid, který byl schopen přímo se vázat na nechráněné uhlohydráty. Syntéza typické sloučeniny hydroxylamino-CJÉ52 je ukázáno na obr. 20, schéma 1, a vazba uhlohydrátové skupiny na tuto propojovací skupinu je založena na glykosylaci O-substituovaného hydroxy lam inu (princip této reakce s glukózou je ilustrován na obr. 21, schématu 2). Použitím této strategie byla navázána maltotetraóza a maltoheptaóza za získání sloučenin GLU4 a GLU7 (struktura na obr. 22).

Tato glykomodifíkace LMD byla založena na přirozené schopnosti disociace neoglykolipidových micel a inkorporace volných lipidů do membrán LMD. Nejprve byly vytvořeny komplexy LMD z kationtových liposomů DC-Chol : DOPE, peptidů Mul a plazmidu pCMVp, jak je popsáno v příkladu 4. Potom byla ke směsím LMD přidána suspenze neoglykolipidových micel vpufru Hepes, pH 7,0, a celek byl inkubován 30 min při 20 °C před uchováním při -80 °C (obr. 23).

Stabilizace LMD neoglykolipidy: Stabilizační efekt neoglykolipidy modifikovaného LMD byl vyhodnocován zavedením 7,5 molamích % GLU nebo GLU7 do LMD. Lipidová vrstva systémů LD podle dosavadních znalostí po vystavení soli agreguje. Proto byly testovány velikosti části LD (konečná koncentrace DNA 1 pg/ml) po 30 min při 37 °C v médiu OPTIMEM fotonovou korelační spektroskopií (Photon Correlatíon Spectroscopy, N4 plus, Coulter). Pro vyhodnocení střední velikosti částic byla použita unimodální analýza. Průměrné procentní zvýšení velikosti částic LD je ukázáno na obr. 24. Stejného postupu bylo použito pro bazický systém LMD, LMD(GLU4) a LMD(Glu7) (konečná koncentrace DNA 1 μ§/ιη1),

Tyto výsledky ukazují, že LMD je v roztoku stabilnější než LD, ale ukazují takém že přítomnost GLU4 a GLU7 zvýšila antiagregační stabilizující účinek na částice LMD při koncentraci 7,5 molámích %.

Účinnost transfekce in vitro: Transfekční aktivita byla zjišťována pomocí buněk Hela zaočkováných při koncentraci 5 x 10⁴ buněk a jamku ve 24-jamkových kultivačních destičkách a pěstovaných na přibližně 70% konfluenci v médiu DMEM doplněném FCS při 37 °C a v přítomnosti

-27CZ 298353 B6

5% CO₂. Buňky byly promyty v PBS a potom vystaveny působení roztoků obsahujících komplexy LMD předředěných médiem DMEM s obsahem FCS s uvedenými obsahy v procentech (konečná koncentrace DNA ve všech případech 5,0 pg/ml) po dobu 30 min. Buňky byly potom promyty a inkubovány dalších 48 hod v normálním médiu (NGM) před sklizením. Míra exprese β-galaktosidázy byla zjišťována standardním testovacím kitem (chemiluminiscence, Roche).

Výsledky ukazují na zvýšení účinnosti transfekce v důsledku modifikace cukrem za obou koncentrací séra 0 % i 50 % (obr. 25).

Diskuse

Autoři již dříve ukázali, že liposomy DC-Chol/DOPE jsou účinné při transfekcí buněčné linie ND7 odvozené z neuronů (McQuillin A. a další, Optimalization of liposome mediated transfection of a neuronal cell line. Neuroreport 8: 1481 - 1484). Systém DC-Chol byl úspěšně používám mimo CNS v řadě tkání a byly prováděny klinické pokusy pro léčbu cystické ftbrózy genovou terapií (Caplen N. J. a další, Lipsome-Mediated Cftr Gene-transfer to the Nasal Epithelium of Patients With Cystíc-Fibrosis. Nátuře Med. 1995; 1:39 — 46; Nabel G., Chang A., Nabel E., Clinical Protocol: Immunotherapy of malignancy by in vivo gene transfer into tumors. Hum. Gene Ther. 1992 3: 399 - 410). Bylo také ukázáno, že liposomy DC-Chol nemají cytotoxické vedlejší účinky (Nabel G. J. a další, Direct gene-transfer with DNA liposome complexes in melanoma expression, biological activity, a lack of toxicity in humans. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1993; 90: 11307 - 11311; Stewart M. J. a další, Gene-transfer in vivo with DNA liposome complexes - safety and acute toxicity in mice. Hum. Gene Ther. 1992; 3: 267 - 275). Z těchto důvodů bylo cílem autorů vyvinout zlepšené formulace těchto liposomů pro použití v nervových buňkách.

Autoři vynálezu popisují použití virem kódovaného proteinu pro transfekcí buněk. Bylo zjištěno, že Mul, pokud se používá v kombinaci s kationtovým liposomem DC-Chol/DOPE byl schopen významně zlepšit transfekcí buněk. Tento účinek byl nejpravděpodobněji způsoben schopností Mul kondenzovat pDNA a mohl by být optimalizován změnou poměrů polypeptidu, pDNA a kationtového liposomů. Zvýšení transfekční účinnosti bylo signifikantně více vyjádřeno na diferencovaných buňkách. Jak je uvedeno výše, buňky ND7 byly odvozeny z primárních buněk DRG. Diferenciace buněk ND7 indukuje podobný fenotyp jejich rodičovským periferním senzorickým neuronům včetně indukce vyrůstání neuritů, snížení celkové proliferace a snížení schopnosti transfekce (Wood J. N. a další, Novel Cell-Lines Display Properties of Nociceptive Sensory Neurons. Proceedings of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences 1990; 241: 187 - 194; Murray K.D. a další DC-Chol/DOPE mediated transfections in differentiated sensory neurons. Připravuje se. 1999). Zvýšení účinnost transfekce v diferencovaných buňkách ND7 může odrážet zvýšení schopnosti podporovat transfekce u primárních neuronů nebo in vivo.

Úspěch prostředků pro nevirové dodávání genů jako použitelná alternativa k systémům založeným na virových vektorech závisí na vyvinutí komplexů s vyššími a dlouhodobějšími účinnostmi transfekce. Protože se podařila počáteční identifikace kationtových liposomů jako prostředků přenosu genetického materiálu do buněk, byl velký tlak na vyvinutí lepších formulací kationtových liposomů (Lee R.J. Huang L., Lipidic vector systems for gene transfer. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1997; 14: 173 - 206; Felgner P. L. a další, Lipofection - a Highly Efficient, Lipid-Mediated Dna-Transfection Proceduře. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America 1987; 7414 - 7417). Nejvíce pokusů zlepšit kationtové liposomy bylo založeno na strukturních modifikacích samotné molekuly (Cooper R. G. a další, Polyamine analogues of 3 beta-[N^r-(N‘,N'-dimethylaminoethan)karbamoyljcholesterol (DC-Chol) as agents for gene delivery. Chemistry - a European Journal 1998; 4: 137 - 151). Byly vyvinuty nové formulace se zlepšenou účinností transfekce (Cooper R.G. a další, Polyamine analogues of 3 beta-[N-(N^ř,N'-dirnethylaminoethan)karbomoyl]cholesterol (DC-Chol) as agents for gene deliveiy. Chemistry - a European Journal 1998; 4: 137 - 151). Konkrétní typy buněk se však chovají vzhledem ktransfekci kationtovými liposomy

-28CZ 298353 B6 odlišně. Bylo například zjištěno, že polypeptid Mul je lepší při zesilování transfekce zprostředkované kationtovými liposomy než Vpl. To je pravděpodobně způsobeno větším poměrem náboje Mul. Zatímco oba peptidy mají přibližně stejnou molekulovou hmotnost, celkový poměr náboje Mul je více než dvojnásobný než v případě Vpl (tabulka 1). V souladu stím byl polypeptid Mul schopen zpomalovat elektroforetickou pohyblivost plazmidové DNA na méně než 1/60 koncentrace, což ukazuje, jak pevně je Mul schopen vázat DNA. I když byl malý posun v pohyblivosti pDNA detekován při použití komplexu 0,25 gg Mul a 1 μg pCMVp, po přidání 0,5 pg Mul byl téměř veškerý plazmid zachycen v blízkosti nanášení jamky (obr. 1). Poměr 0,5/1,0 (hmotn./hmotn.). Mul k pCMVp odpovídá molámímu poměru 1000/1. Každá molekulová Mul obsahuje 12 zbytků, které byl potenciálně mohly nést pozitivní náboj. Teoretický poměr náboje Mul k pCMVp by měl tedy být 1,6 (12 000 kationtů Mul na 7500 antiontů pMCVP). Tento poměr by měl zcela neutralizovat negativní náboje na pCMVp a tím zcela zastavit jeho migraci, jak bylo pozorováno.

Přímé srovnání mezi množstvím Mul, které významným způsobem zpomalilo migraci plazmidové DNA, a které tedy optimálně zvýší transfekce, nemohlo být provedeno z důvodů odlišného způsobu přípravy. Transfekční komplexy peptid-pDNA-liposom byly připravovány ve velkých objemech (viz ěást Materiály a metody). Ačkoli bylo zapotřebí 24 násobné množství Mul (12 pg/l pg pCMVp) pro dosažení optimálního zesílení účinnosti transfekce než bylo zapotřebí pro zastavení migrace na agarózovém gelu, koncentrace v roztoku byla podobná (25 mg/ml, zastavení pDNA; 30 ng/ml, optimální transfekce). Přítomnosti Mul také , změnila interakce pDNA s kationtovými liposomy. Optimální poměr DC-Chol/DOPE k PCMVP v přítomnosti Mul byl 6/1, což je dvojnásobek než bylo dříve nalezeno jako optimální v nervových buňkách (McQuillín A. a další, Optimalization of liposome mediated transfection of a neuronal cell line. Neuroreport 1997; 8: 1481 - 1484; Murray K.D. a další, Cationic liposomemediated transfection in organotypic explant cultures. Gene ther. 1994; 6: 190 - 197). Teoreticky byl použité množství Mul mělo zcela neutralizovat pozitivní náboje na pCMVp, což by zabránilo vytváření dalších komplexů s DC-Chol/DOPE. Tak tomu zcela zřejmě nebylo, protože bylo možno získat mnohem vyšší účinnosti transfekce. Je pravděpodobné, že za použitých podmínek pufrování nebyly protonovány veškeré možné nabité aminokyseliny. Proč je pro zlepšení transfekce zapotřebí většího množství kationtových liposomů není zřejmé a autoři v současnosti na vyjasnění toto otázky pracují.

Konečně by bylo třeba se zmínit o signálu nukleární lokalizace obsaženému ve Vpl, Nedávné důkazy v laboratoři autorů vynálezu (nepublikovaná pozorování) a u jiných autorů (LabatMoleur F. a další, An electron microscopy study in to the mechanism of gene transfer with lipopolyamines. Gene Ther. 1996; 3: 1010 - 1017; Zabrner J. a další, Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. J. Biol. Chem. 1995; 270: 18997 - 19007; Thierry A. R. a další, Characterization of liposome-mediated gene delivery: Expression, stability and pharmacokinetics of plasmid DNA. Gene Ther. 1997; 4: 226 - 237; Coonrod A., Li F. Q., Horwitz M., On the mechanism of DNA transfection: efficient gene transfer withot viruses. Gene Ther. 1997; 4: 1313 - 1321) ukazují na to, že jaderný transport transfekovaného materiálu může být při lipofekci neúčinný, Z tohoto důvodu byly prováděny pokusy předkondenzovat DNA s polykationty obsahujícími peptidové sekvence, o kterých je známo, že mají schopnost lokalizace v jádře, aby bylo možno zlepšit příjem transfekované DNA do jádra (Sorgi F.L., Bhattacharya S., Huang L., Protamine sulfáte enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Ther. 1997; 4: 961 - 968; Namiki Y., Takahashi T., Ohno T., Gene transduction of disseminated intraperitoneal tumor using cationic liposomes containing non-histone chromation proteins: cationic liposomal gene therapy of carcinomatosa. Gene Ther. 1998; 5: 240 - 246; Fritz J. D, a další, gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA. Hum. Gene Ther. 1996; 7: 1395 - 1404). Autoři vynálezu však zjistili, že účinnější kondenzační vlastnosti Mul na DNA daleko vyvážily nukleární lokalizační schopnost Vpl z hlediska zvýšení účinnosti transfekce. Podobně autoři Fritz a další, Gene transfer into mammalian cells using histonecondensed plasmid DNA. Hum. Gene Ther. 1996; 7: 1395 - 1404, nenalezli žádný rozdíl

-29CZ 298353 B6 v účinnosti transfekce mezi rekombinantním lidským histonem (Hl) a modifikovanou verzí obsahující nukleární lokalizační sekvenci velkého T-antigenu SV40. Další studie ukázaly, že přítomnost NLS zlepšuje hromadění transfekované pDNA v jádře, i když prostřednictvím specifických intracelulámích biochemických cest (Sebestyen M.G. a další, DNA vectory chemistry: the covalent attachments of signál peptid to plasmid DNA. Nta. Biotech. 1998; 16: 80 - 85; Hagstrom J. E. a další, Nuclear import of DNA in digitonin-permeabilized cells. J Cell Sel. 1997; 110 (Pt 18): 2323 - 2331).

Všechny publikace zmíněné v popisu jsou tímto zařazeny odkazem. Různé modifikace a variace popisovaných metod a systému vynálezu budou zřejmé odborníkům v oboru, aniž by se odchýlili od rozsahu a myšlenky vynálezu. I když byl vynález popsán v souvislosti s konkrétními výhodnými provedeními, mělo by být zřejmé, že vynález tak jak je definován v nárocích, by neměl být na tato specifická provedení nepřiměřeně omezen. V rámci rozsahu následujících nároků jsou samozřejmě zahrnuty různé modifikace popsaných způsobů provedení vynálezu, které jsou zřejmé odborníkům v oboru molekulární biologie nebo příbuzných oborů.

VÝPIS SEKVENCÍ <110> Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals lne

Tagawa, Toshiaki

Miller, Andrew

Parouzel, Eric

Murray, Karl

Mathews, David

Russell, Willie

Manvell Michelle

Alton, Eric <120> Nucleid Acid Delivery <130> p6592.wo <140> PCT/GB00/04767 <141> 2000-12-12 <150> GB 9930533.6 <15l> 1999-12-23 <160> 5 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Description of Articial Sequence: Polypeptide <400> 1

Met Ařg Arg Ala His His Arg Arg Arg Arg Ala Ser His Arg Arg Met í 5 10 15

Arg. Gly Gly

-30CZ 298353 B6 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Description of Artificial Sequence: Polypeptide <400> 2

Arg Pro Arg Arg· Arg Ala Thr Thr Arg Arg	Arg	Thr Thr Thr Gly Thr
1	5 10				.15
Arg	Arg Arg Arg Arg Arg Arg
	20
<210>	3
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Artificial
<220>
<223>	Description of Artificial Sequence: Polypeptide
<400>	3
Lys Pro Arg Lys Leu Lys Arg Val Lys Lys	Lys	Lys	Ly.s
1	5 10
<21.0>	4
<211>	19
<212>	PRT
<213>	Artificial
<220>
<223>	Description of Artificial Sequence: Polypeptide
<400>	4
Met	Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser	Lys	Cys	Glu	Thr Lys	Cys
1	5. 10
Thr	Pro Pro
<210>	5
<211>	19
<212>	PRT
<213>	Artifícial
<220>
<223>	Description of Artificial Sequence: Polypeptide
<400>	5
Val	Arg Arg Val His His Árg Árg Arg Arg	Val	Ser	His	Arg Arg	val
1	5 10				15

Arg Gly Gly

Claims (15)

1. Nevirový vektor pro podávání nukleových kyselin, obsahující kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina a kationtový lipid, kde tento komplex obsahuje:

(a) zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (b) jeden nebo více virových spalovacích polypeptidu nukleových kyselin nebo jiných derivátů, kde tyto polypeptidy nebo jejich deriváty jsou schopny (i) vázat se na zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (ii) kondenzovat zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a kde zvolená sekvence nukleové kyseliny je vzhledem k polypeptidu heterologní.

2. Vektor podle nároku 1, kde alespoň jeden polypeptid je adenovirový sbalovací polypeptid nukleové kyseliny nebo jeho derivát.

3. Vektor podle nároku 2, kde adenovirový polypeptid je Mul, pV nebo pVII, nebo jejich derivát.

4. Vektor podle některého z nároků 1 až 3, který dále obsahuje polypeptid obsahující sekvenci nukleární lokalizace.

5. Vektor podle nároku 4, kde polypeptid obsahující sekvenci nukleární lokalizace je adenovirový pV nebo jeho derivát.

6. Kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina obsahující kationtový lipid, polypeptidovou složku a složku nukleové kyseliny, pro použití při dodávání složky nukleové kyseliny do jádra eukaryotické buňky, kde (i) polypeptidovou složkou je virový sbalovací polypeptid nukleové kyseliny nebo jeho derivát;

(ii) polypeptidová složka nebo její derivát je schopna vázat se na zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (iii) polypeptidová složka nebo její derivát je schopna kondenzovat zvolenou sekvenci nukleové kyseliny;

a kde nukleová kyselina je vzhledem k polypeptidu heterologní.

7. Komplex podle nároku 6, kde alespoň jeden polypeptid je adenovirový sbalovací polypeptid nukleové kyseliny nebo jeho derivát.

8. Komplex podle nároku 7, kde adenovirový polyieptid je Mul, pV nebo pVIÍ nebo jejich derivát.

9. Komplex podle některého z nároků 6 až 8, který dále obsahuje polypeptid obsahující sekvenci nukleární lokalizace.

10. Komplex podle nároku 9, kde polypeptidem obsahujícím sekvenci nukleární lokalizace je adenovirový pV nebo jeho derivát.

11. Komplex podle některého z nároků 6 až 10, kde poměr liposom : zvolená sekvence nukleové kyseliny : polypeptid je 2 až 20 : 1 : 0,5 až 1, s výhodou 10 až 14 : 1 : 0,5 až 0,7, výhodněji přibližně 12: 1 : 0,6.

-32CZ 298353 B6

12. Způsob výroby nevirového dodávacího vektoru nukleových kyselin obsahujících kationtový lipid a kondenzovaný komplex polypeptid/nukleová kyselina, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(a) zvolená sekvence nukleové kyseliny se uvede do styku s virovým sbalovacím polypeptidem nukleové kyseliny nebo jeho derivátem, kde tato polypeptidová složka nebo její derivát je schopna (i) vázat se na zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a (ii) kondenzovat zvolenou sekvenci nukleové kyseliny; a kde zvolená sekvence nukleové kyseliny je vzhledem k polypeptidu heterologní; a (b) takto vytvořený komplex nukleová kyselina/polypeptid se uvede do styku s kationtovým lipidem.

13. Způsob zavádění zvolené sekvence nukleové kyseliny do eukaryotické buňky, vyznačující se tím, že se uvede buňka do styku s komplexem podle některého z nároků 6 až 11, kde tento komplex obsahuje zvolenou sekvenci nukleové kyseliny.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že buňka je neuronální buňka, rakovinná buňka nebo epíteliální buňka.

15. Použití virového sbalovacího polypeptidu nukleové kyseliny nebo jeho derivátu pro výrobu dodávacího vektoru nukleové kyseliny podle nároku 1,