ES2258986T3 - Complejos de administracion a base de acido nucleico-lipido cationico-proteina de nucleo virico. - Google Patents
Complejos de administracion a base de acido nucleico-lipido cationico-proteina de nucleo virico.Info
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Abstract
Vector para la administración de ácido nucleico no vírico que comprende un complejo de polipéptido/ácido nucleico condensado y un lípido catiónico, en el que el complejo comprende (a) una secuencia de ácido nucleico de interés (NOI); y (b) uno o más polipéptidos adenovíricos Mu1 o polipéptidos homólogos con por lo menos 60% de identidad con los mismos, siendo dichos polipéptidos o dichos homólogos de los mismos (i) capaces de unirse a la NOI; y (ii) siendo capaces de condensar la NOI; y en el que la NOI es heteróloga con uno o más polipéptidos.
Description
Complejos de administración a base de ácido
nucleico-lípido catiónico-proteína
de núcleo vírico.
La presente invención se refiere a complejos de
ácido nucleico/proteína/lípido catiónico que comprenden proteínas
de empaquetamiento adenovíricas Mu1 y a su utilización en la
administración eficaz de ácidos nucleicos a células, tales como las
células neuronales.
Se han realizado avances prometedores en la
transferencia génica no vírica como resultado de la producción de
liposomas sintéticos formulados con lípidos catiónicos que son
capaces de transfectar células. Sin embargo, se ha examinado la
capacidad de pocos de estos complejos para transferir de manera
eficaz el ADN a las células del SNC y para obtener la expresión de
un transgén. La capacidad para transfectar neuronas de manera eficaz
y segura podría proporcionar una herramienta potente para el
esclarecimiento de la función neuronal y puede conducir a nuevos
tratamientos para los trastornos neurológicos.
Desgraciadamente, la terapia génica para el SNC
se ha visto obstaculizada por la falta de medios eficaces para
transducir neuronas postmitóticas. La mayoría de los estudios han
utilizado vectores víricos para la administración génica. Sin
embargo, muchos vectores víricos están plagados de problemas de
inmunidad y citotoxicidad y no son manipulados fácilmente por los no
virólogos ^{1-3}. Actualmente están surgiendo
vectores no víricos como un método alternativo de transducción
celular. Los avances más prometedores en la transferencia génica no
vírica han sido en la producción de liposomas sintéticos formulados
con lípidos catiónicos (citofectinas) capaces de transfectar
células. Dichos liposomas catiónicos son relativamente fácil de
utilizar, presentan una amplia aplicabilidad y falta de
citotoxicidad ^{4}.
Las formulaciones de liposomas no catiónicas se
están desarrollando constantemente^{5}. Sin embargo, se ha
examinado la capacidad de pocos de estos complejos para transducir
de forma eficaz las células en el SNC ^{6-9}. Los
liposomas catiónicos actúan mediante interacciones electrostáticas
con el ADN cargado negativamente y posteriormente con las membranas
celulares cuando atraviesan la membrana celular mediante un proceso
lento de endocitosis ^{6, 10, 11}. Se formulan frecuentemente
utilizando el lípido neutro
dioleíl-L-\alpha-fosfatidiletanolamina
(DOPE), que es sumamente eficaz en el tamponamiento endosómico y en
la disgregación ^{8,12}. En el material genético transfectado del
espacio perinuclear se libera del complejo liposómico, se transporta
al núcleo y se expresa. Hasta la fecha se ha demostrado que
solamente los liposomas formulados a partir del cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N
trimetilamonio (DOTMA) y
DOPE, logran mediar la transfección en el SNC ^{13-16}. Para ser útil en terapia génica, se necesitan complejos liposómicos capaces de transfectar las células del SNC con gran eficacia.
DOPE, logran mediar la transfección en el SNC ^{13-16}. Para ser útil en terapia génica, se necesitan complejos liposómicos capaces de transfectar las células del SNC con gran eficacia.
Una limitación principal en la transferencia
génica mediada no vírica consiste en la formación de grandes
moléculas agregadas durante la generación de los complejos
liposoma:ADN ^{5}. Estos grandes agregados pueden reducir la
eficacia de la transfección limitando posiblemente la endocitosis de
los complejos. Un método para soslayar esto consiste en reducir el
tamaño de las moléculas de ADN mediante la condensación de ADN antes
de la formación del complejo. La precondensación del ADN produce
complejos más pequeños y mejores eficacias de transfección
^{17-23}. Se han identificado varios policationes
que son eficaces para mejorar las transfecciones mediadas por
liposomas. De éstos, la
poli-L-lisina y la propamina han
producido los resultados más drásticos permitiendo aumentos de más
de 30 veces en comparación con los complejos sin precondensación en
una variedad de líneas celulares no neurona-
les ^{17, 21}.
les ^{17, 21}.
El sulfato de propamina es particularmente bueno
para aumentar la transfección liposómica. La propamina es un
policatión natural que se encuentra en el corazón de los
espermatozoos. La función de la propamina consiste en condensar el
ADN en el esperma y ayudar a su transferencia al núcleo del huevo.
La propiedad de direccionamiento nuclear de la propamina la hace
particularmente atractiva para la transferencia génica. Además, a
diferencia de la poli-L-lisina
sintética, que presenta un intervalo de pesos moleculares grandes
(18.000 a 19.200 Da), la propamina es natural, más pequeña y de
tamaño más uniforme (4.000 a 4.250 Da). Estas cualidades significan
que hay menos probabilidad de respuestas inmunógenas en el tejido
diana y la condensación es más fácil de controlar. Se han utilizado
otros ADN naturales que condensan proteínas para potenciar la
transferencia de ADN mediada por liposomas catiónicos. Fritz et
al., ^{22} consiguió aumentar aproximadamente 30 veces la
lipofección utilizando una proteína histona H1 recombinante humana
que incorpora una señal de localización nuclear
(nls-H1). Además, la proteína distinta de la histona
del grupo 1,2 de alta movilidad cromosómica se ha demostrado que
mejora la lipofección y se utiliza de manera rutinaria en el método
de HVJ-liposoma ^{20,24}.
Los solicitantes han examinado la capacidad de
las proteínas asociadas al ADN vírico para mejorar la transferencia
génica basada en liposomas. En particular los solicitantes han
comparado el péptido Mu1 sintético codificado por virus y la
proteína Vp1 recombinante del adenovirus y del poliomavirus
respectivamente. Mu1 puede desempeñar una función en la condensación
del cromosoma adenovírico mientras que Vp1 es la única proteína
estructural del poliomavirus que presenta actividad de unión al ADN
^{25-27}. Vp1, pero no Mu1 contiene una señal de
localización nuclear clásica impregnada (NLS) similar a la
encontrada en HMG-1,2 y nls-H1 26.
Los solicitantes descubrieron que Mu1, pero no Vp1, mejoró
significativamente la transferencia génica mediada por el liposoma
catiónico en las células procedentes del sistema nervioso y del
riñón. Los solicitantes descubrieron que el aumento de Mu1 era mayor
en las células diferenciadas, lo que indica la posible utilidad de
este método para las neuronas in vivo.
Estos descubrimientos tienen implicaciones en
utilizaciones experimentales y terapéuticas de la administración
mediada por liposomas de ADN a las células del SNC.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un vector de administración de ácidos nucleicos no
víricos que comprende un complejo de polipéptido/ácido nucleico
condensado y un lípido catiónico, en el que el complejo
comprende
- (a)
- una secuencia de ácido nucleico de interés (NOI); y
- (b)
- uno o más polipéptidos adenovíricos Mu1 o polipéptidos homólogos con por lo menos el 60% de identidad con éstos, siendo dichos polipéptidos o dichos homólogos de éstos (i) capaces de unirse al NOI; y (ii) capaces de condensar el NOI; y en la que el NOI es heterólogo a uno o más polipéptidos.
La expresión "heterólogo con respecto al
polipéptido" significa que los NOI víricos naturales en
combinación con el polipéptido de empaquetamiento vírico están
excluidos.
En una forma de realización preferida, el vector
comprende además un polipéptido que comprende una secuencia de
localización nuclear (NLS). Más preferentemente, el polipéptido que
comprende una secuencia de localización nuclear (NLS) es el pV
adenovírico o un derivado del mismo.
La presente invención proporciona además un
complejo condensado de polipéptido/ácido nucleico que comprende un
lípido catiónico, un componente polipeptídico y un componente de
ácido nucleico, para su utilización en la administración del
componente del ácido nucleico a un núcleo de una célula eucariótica,
en la que
- (i)
- el componente polipeptídico es un polipéptido adenovírico Mu1 o un polipéptido homólogo con por lo menos el 60% de identidad con el mismo;
- (ii)
- el componente polipeptídico de dicho homólogo del mismo es capaz de unirse al NOI; y
- (iii)
- el componente polipeptídico de dicho homólogo del mismo es capaz de condensar el NOI;
y en el que el ácido nucleico es
heterólogo con respecto al
polipéptido.
En una forma de realización preferida, el
complejo comprende además un polipéptido que comprende una secuencia
de localización nuclear (NLS). Más preferentemente, el polipéptido
que comprende una secuencia de localización nuclear (NLS) es el pV
adenovírico o un derivado del mismo.
La presente invención proporciona también un
método de producción de un vector de administración del ácido
nucleico no vírico que comprende un lípido catiónico y un complejo
de polipéptido/ácido nucleico condensado, comprendiendo dicho
método
- (a)
- poner en contacto una secuencia del ácido nucleico de interés (NOI) con un polipéptido adenovírico Mu1 o con un polipéptido homólogo con por lo menos el 60% de identidad con el mismo, siendo capaz dicho homólogo del mismo (i) de unirse al NOI; y (ii) siendo capaz de condensar el NOI; y en el que el NOI es heterólogo al polipéptido; y
- (b)
- poner en contacto el complejo de ácido nucleico/polipéptido formado de este modo con un lípido catióni-co.
La presente invención proporciona además un
método de introducción de una secuencia de ácido nucleico de interés
(NOI) en una célula eucariótica, método que comprende poner en
contacto la célula con un complejo de la invención en la que el
complejo comprende el NOI. Preferentemente la célula es una neurona,
una célula cancerosa o epitelial.
En una forma de realización alternativa, puede
utilizarse un polipéptido de localización/administración nuclear del
ácido nucleico vírico en la adición a un polipéptido adenovírico
Mu1. De hecho, algunos polipéptidos víricos combinan ambas
funciones.
\newpage
Aunque en general las técnicas mencionadas en la
presente memoria son bien conocidas en la materia, se puede hacer
referencia en particular a Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Short Protocols
Molecular Biology (1999) 4ª ed., John Wiley & Sons,
Inc.
La expresión "polipéptidos con empaquetamiento
de ácido nucleico vírico" comprenden típicamente los polipéptidos
codificados por genomas víricos naturales en partículas víricas en
los que su función consiste en empaquetar, en particular condensar y
administrar al núcleo, ácidos nucleicos que constituyen el genoma
vírico en el virión.
El polipéptido con empaquetamiento de ácido
nucleico vírico para su utilización en la presente invención es el
polipéptido adenovírico Mu1 presentado inmediatamente a continuación
como SEC. ID nº: 1.
NH_{2}-Met-Arg-Arg-Ala-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Ser-His-Arg-Arg-Met-Arg-Gly-Gly-OH
(SEC. ID nº: 1)
Para su utilización en la presente invención, un
polipéptido con empaquetamiento de ácido nucleico adenovírico Mu1 es
capaz de unirse a los ácidos nucleicos, típicamente de manera no
específica, produciendo preferentemente la condensación del ácido
nucleico. Se prefiere generalmente que el NOI condensado tenga un
tamaño igual o inferior a 200 nm, como por ejemplo de 50 a 200 nm,
para la eficacia óptima de la administración a una célula diana.
La capacidad de los polipéptidos adenovíricos
Mu1 para unirse a ácidos nucleicos puede determinarse in
vitro utilizando técnicas tal como la electroforesis en gel que
incluyen ensayos de retardo en gel (véase el apartado materiales y
métodos y el apartado resultados) y ensayos de movilidad con
desplazamiento de la banda electroforética, ensayos de exclusión con
bromuro de etidio y cromatografía de afinidad (utilizando por
ejemplo, celulosa con ADN de una sola o doble cadena).
La capacidad de los polipéptidos adenovíricos
Mu1 para condensar ácidos nucleicos puede determinarse, por ejemplo,
por espectroscopía de dicroísmo circular (CD) (véase, por ejemplo,
Sato y Hosokawa, 1984, J. Biol. Chem. 95:
1031-1039).
Generalmente los polipéptidos adenovíricos Mu1,
o sus homólogos con por lo menos el 60% de identidad con éstos,
comprenderán un número de restos de aminoácidos cargados
positivamente a pH fisiológico (tal como pH 7,4). Preferentemente,
la carga neta total en el polipéptido adenovírico Mu1 es positiva al
pH fisiológico. En particular, es preferible que la relación
carga:aminoácido sea por lo menos +0,3, preferentemente por lo menos
+0,4, +0,5
o +0,6.
o +0,6.
Es preferible que los polipéptidos adenovíricos
Mu1 o sus homólogos con por lo menos el 60% de identidad con éstos
comprendan restos de arginina en lugar de restos de lisina o una
mezcla de ambos. Se prefiere particularmente asimismo que los
polipéptidos adenovíricos Mu1 o sus homólogos con al menos el 60% de
identidad con éstos comprendan uno o más restos de histidina,
preferentemente dos o más restos de histidina. Además, los
polipéptidos adenovíricos Mu1 o sus homólogos con por lo menos el
60% de identidad con éstos, comprenderán típicamente un número de
restos muy hidrófobos, tal como alanina, por ejemplo dos o más
restos hidrófobos.
Debe entenderse que, para su utilización en la
invención, las secuencias de aminoácidos no están limitadas a
polipéptidos naturales con empaquetamiento de ácido nucleico
adenovírico Mu1 pero incluyen además secuencias homólogas con por lo
menos el 60% de identidad con éstas obtenidas de cualquier fuente,
por ejemplo proteínas víricas/bacterianas relacionadas, homólogos
celulares y péptidos sintéticos.
En el contexto de la presente invención, una
secuencia homóloga se considera que incluye una secuencia de
aminoácidos que es por lo menos el 60, 70, 80 o 90% idéntica,
preferentemente por lo menos el 95 o el 98% idéntica a la
concentración de aminoácidos más de por lo menos 10, preferentemente
por lo menos 20, 30, 40 ó 50 aminoácidos con la secuencia Mu1
presentada como SEC. ID nº: 1. En particular, típicamente la
homología debería considerarse con respecto a las zonas de la
secuencia conocida que son esenciales para la unión del ácido
nucleico en lugar de las secuencias adyacentes no esenciales. Aunque
la homología puede considerarse también desde el punto de vista de
su similitud (es decir los restos de aminoácidos con propiedades o
funciones químicas similares), en el contexto de la presente
invención es preferible expresar la homología en términos de
identidad de secuencia.
Las comparaciones de homología pueden realizarse
a simple vista, o más frecuentemente, con ayuda de programas de
comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas
informáticos disponibles en el mercado pueden calcular el % de
homología entre dos o más secuencias.
El % de homología puede calcularse en secuencias
contiguas, es decir, una secuencia está alineada con otra secuencia
y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el
aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto cada vez.
Esto se denomina alineación "sin huecos". Típicamente, dichas
alineaciones sin huecos se realizan únicamente en un número
relativamente corto de restos (por ejemplo menos de 50 aminoácidos
conti-
guos).
guos).
Aunque este método es sencillo y coherente, no
puede tener en consideración, por ejemplo, que en un par de
secuencias de otro modo idénticas, una inserción o deleción dará
lugar a que los restos de aminoácidos siguientes se coloquen fuera
de la alineación, dando como resultado de este modo potencialmente
una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una
alineación global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de
comparación de secuencia se diseñan para producir alineaciones
óptimas que tengan en consideración posibles inserciones y
deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de la
homología. Esto se consigue insertando "huecos" en la
alineación de la secuencia para tratar de maximizar la homología
local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan
"penalizaciones de hueco" a cada hueco que se produce en la
alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos
idénticos, una alineación de la secuencia con tan pocos huecos como
sea posible (refleja mayor relatividad entre las dos secuencias
comparadas) consiga una puntuación mayor que una con muchos huecos.
Típicamente se utilizan "costes de hueco afines" que cargan un
coste relativamente alto a la existencia de un hueco y una
penalización más pequeña para cada resto exterior en el hueco. Éste
es el sistema de puntuación de huecos utilizado más frecuentemente.
Las penalizaciones elevadas de huecos producirán desde luego
alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los
programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por
hueco. Sin embargo, es preferible utilizar los valores por defecto
cuando se utiliza dicho programa informático para las comparaciones
de secuencia. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG
Wisconsin Bestfit (véase a continuación) la penalización por huecos
por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco
y -4 para cada ampliación.
El cálculo del % máximo de homología requiere
por consiguiente en primer lugar la producción de una alineación
óptima, teniendo en consideración las penalizaciones por hueco. Un
programa informático adecuado para realizar dicha alineación es el
paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, U.S.A.;
Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387).
Ejemplos de otro programa informático que puede realizar
comparaciones de secuencia incluyen, pero no se limitan al paquete
BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid-capítulo 18),
FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol.,
403-410) y el GENEWORKS a continuación de las
herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están
disponibles para la búsqueda fuera de línea y en línea (véase
Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7 a 58 a 7 a 60).
Sin embargo es preferible utilizar el programa GCG Bestfit.
Aunque el % de homología final puede medirse en
términos de identidad, el propio procedimiento de alineación no está
basado típicamente en una comparación del par todo o nada. En su
lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación a escala que
asigna puntuaciones a cada comparación de pares basándose en la
similitud química o en la distancia progresiva. Un ejemplo de dicha
matriz utilizada frecuentemente es la matriz BLOSUM62, matriz por
defecto para la continuación BLAST de los programas. Los programas
GCG Wisconsin utilizan generalmente los valores públicos por defecto
o se suministra una tabla de comparación del símbolo habitual (véase
el manual del usuario para mayor detalle). Es preferible utilizar
los valores públicos por defecto para el paquete GCG o en caso de
otro programa, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez el programa informático ha producido una
alineación óptima, es posible calcular el % de homología,
preferentemente el % de identidad de la secuencia. El programa
informático típicamente realiza esta operación como parte de la
comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
La expresión "modificada" en relación con
las secuencias de aminoácidos pV adenovírico utilizadas en la
presente invención incluye cualquier sustitución, variación,
modificación, emplazamiento, eliminación o adición de uno (o más)
aminoácidos desde o hasta la secuencia que proporciona la secuencia
de aminoácidos resultantes tiene actividad de unión y condensación
del ácido nucleico, preferentemente con por lo menos la misma
actividad que los polipéptidos no modificados.
Los polipéptidos adenovíricos Mu1 pueden
modificarse para su utilización en la presente invención.
Típicamente, se realizan modificaciones que mantengan el enlace del
ácido nucleico y las propiedades de condensación de la secuencia.
Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, por ejemplo
desde 1, 2 ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones con la condición de
que la secuencia modificada conserve las propiedades de unión y
condensación del ácido nucleico. Las sustituciones de aminoácidos
pueden comprender la utilización de análogos no naturales, por
ejemplo para aumentar la vida media en el plasma sanguíneo de un
polipéptido administrado terapéuticamen-
te.
te.
En particular, puede ser deseable realizar
sustituciones de aminoácidos para aumentar la carga neta positiva, a
pH fisiológico, de un polipéptido con empaquetamiento adenovírico
Mu1 natural. Los aminoácidos con carga positiva comprenden arginina,
lisina e histidina. La arginina es la que tiene más carga de los
aminoácidos naturales y se prefiere particularmente.
\newpage
| ALIFÁTICO | Apolar | G A P |
| I L V | ||
| Polar sin carga | C S T M | |
| N Q | ||
| Polar con carga | D E | |
| K R | ||
| AROMÁTICO | H F W Y |
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden realizarse sustituciones conservadoras,
por ejemplo según la Tabla anterior. Los aminoácidos en el mismo
bloque de la segunda columna y preferentemente en la misma línea en
la tercera columna pueden sustituirse entre
sí:
sí:
Para su utilización en la invención los
polipéptidos pueden prepararse mediante medios recombinantes, por
ejemplo como los descritos a continuación. Sin embargo pueden
también prepararse mediante medios sintéticos utilizando técnicas
bien conocidas por los expertos tales como la síntesis en fase
sólida. Los polipéptidos para su utilización en la invención pueden
producirse asimismo en forma de proteínas de fusión, por ejemplo
para ayudar a la extracción y purificación. Ejemplos de acompañantes
de la proteína de fusión comprenden la
glutatión-S-transferasa (GST),
6xHis, GAL4 (dominios de unión y activación de la transcripción del
ADN) y \beta-galactosidasa. También puede ser
conveniente incluir una secuencia de escisión proteolítica entre el
acompañante de la proteína de fusión y la secuencia proteica de
interés que permita la eliminación de secuencias de la proteína de
fusión. Preferentemente el acompañante de la proteína de fusión no
impide la actividad biológica de la proteína de la secuencia de
interés.
Para su utilización en la invención los
polipéptidos pueden estar en forma sustancialmente aislada. Debe
entenderse que los polipéptidos pueden mezclarse con portadores o
diluyentes que no interfieran con la finalidad deseada de los
polipéptidos y se considerarán todavía sustancialmente aislados. Los
polipéptidos pueden asimismo estar en forma sustancialmente
purificada, en cuyo caso generalmente más del 90%, p. ej. el 95%,
98% o 99% de la proteína en la preparación comprende polipéptidos
para su utilización en la invención.
En una forma de realización preferida, el
vector/complejo para administración de la invención comprende además
un polipéptido que comprende una secuencia de localización nuclear
(NLS). En general las NLS son bien conocidas en la materia (véase,
por ejemplo, Dingwall y Laskey, 1991, Trends. Biochem. Sci.
16:478-481). Sin embargo, se prefiere
particularmente utilizar la NLS de la proteína pV del núcleo del
adenovirus. La NLS del pV presenta la secuencia
RPRRRATTRRRTTTGTRRRRRRR (SEC. ID nº: 2) correspondiente a los
aminoácidos 315 a 337 (propuesta por D. Matthews). Una NLS adicional
se presenta en el terminal N (KPRKLKRVKKKKK - SEC. ID nº: 3), aunque
es preferible la NLS del terminal C.
La NLS puede estar presente en una molécula de
polipéptido independiente para el polipéptido de empaquetamiento o
como parte de la misma cadena polipeptídica, por ejemplo en una
proteína de fusión.
Las secuencias de ácido nucleico de interés
(NOI) que se desea administrar a las células que utilizan el vector
o complejo para la administración de la invención pueden comprender
ADN o ARN. Estos pueden ser de una sola cadena o de doble cadena.
Pueden ser también polinucleótidos que incluyan en su interior
nucleótidos sintéticos o modificados. Numerosos tipos diferentes de
modificación a oligonucleótidos son conocidos en la materia. Estos
incluyen ejes centrales de metilfosfonato y de fosforotioato,
adición de cadenas de acridina o polilisina y los extremos 3' y/o 5'
de la molécula. Para los objetivos de la presente invención debe
entenderse que los polinucleótidos descritos en la presente
invención pueden modificarse mediante cualquier método disponible en
la materia. Dichas modificaciones pueden realizarse a fin de
aumentar la actividad in vivo o el tiempo de vida de los
NOI.
El NOI comprende típicamente un gen heterólogo.
La expresión "gen heterólogo" comprende cualquier gen. El gen
heterólogo puede ser cualquier variante alélica de un gen natural, o
puede ser un gen mutante. El término "gen" se pretende que
comprenda las secuencias de ácido nucleico que son capaces de ser
transcritas como mínimo. Por lo tanto, las secuencias que codifican
el ARNm, ARNt y ARNr, así como los montajes de la cadena
complementaria, están incluidos en esta definición. Los ácidos
nucleicos pueden ser, por ejemplo, el ácido ribonucleico (ARN) o el
ácido desoxirribonucleico (ADN) o análogos de los mismos. Las
secuencias que codifican el ARNm incluirán opcionalmente alguna o
todas las secuencias 5' y/o 3' transcritas pero adyacentes no
traducidas de forma natural o de otro modo, asociadas a la secuencia
de codificación traducida. Opcionalmente pueden incluir además las
secuencias asociadas de control de la transcripción normalmente
asociadas a las secuencias transcritas, por ejemplo las señales de
terminación de la transcripción, las secuencias de poliadenilación y
los elementos potenciadores corriente abajo.
La secuencia transcrita del gen heterólogo está
con preferencia ligada funcionalmente a una secuencia de control que
permite la expresión del gen heterólogo en las células de mamífero,
preferentemente neuronas, tales como las células del sistema
nervioso central y periférico, células cancerosas o epiteliales. La
expresión "ligado operativamente" se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una
relación que les permite actuar de la manera deseada. Una secuencia
de control "ligada funcionalmente" a una secuencia de
codificación está ligada de tal manera que la expresión de la
secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con
la secuencia de control.
La secuencia de control comprende un activador
que permite la expresión del gen heterólogo y una señal para la
terminación de la transcripción. El activador se selecciona de entre
los activadores que son funcionales en mamíferos, preferentemente
células humanas. El activador puede proceder de secuencias
activadoras de genes eucarióticos. Por ejemplo, puede ser un
activador derivado del genoma de una célula en la que la expresión
del gen heterólogo debe de tener lugar, preferentemente una célula
del sistema nervioso central o periférico del mamífero. Con respecto
a los activadores eucarióticos, pueden ser activadores que funcionan
de manera omnipresente (tales como los activadores de
\beta-actina, tubulina) o, alternativamente, de
manera específica del tejido (tales como los activadores de los
genes para la piruvato cinasa). Pueden además ser activadores que
respondan a estímulos específicos, por ejemplo, activadores que se
unan a receptores de hormonas esteroides. Pueden utilizarse también
activadores víricos, por ejemplo el activador o activadores con
repetición de la terminal larga del virus de la leucemia murina de
Moloney (MMLV LTR) o activadores de los genes del virus del
herpes.
También pueden presentar ventajas los
activadores que sean inducibles de modo que los niveles de expresión
del gen heterólogo puedan regularse durante el tiempo de vida de la
célula. Inducible significa que los niveles de expresión obtenidos
que utiliza el activador pueden ser regulados.
Además, cualquiera de estos activadores puede
ser modificado mediante la adición de más secuencias reguladoras,
por ejemplo secuencias potenciadoras. Pueden utilizarse también
activadores híbridos que contienen elementos de la secuencia de dos
o más activadores diferentes descritos anteriormente. Además, puede
ser deseable la utilización de zonas de control del locus (LCR).
El gen heterólogo codificará de manera típica un
polipéptido de utilización terapéutica. Según la presente invención,
las secuencias del NOI adecuadas incluyen las que son de aplicación
terapéutica y/o en diagnóstico tales como, pero no limitadas a: las
secuencias que codifican citocinas, quimiocinas, hormonas,
anticuerpos, moléculas de tipo inmunoglobulina modificadas
genéticamente, un anticuerpo de cadena única, proteínas de fusión,
enzimas, moléculas coestimulantes inmunitarias, moléculas
inmunomoduladoras, ARN de cadena complementaria, un mutante negativo
transdominante de una proteína diana, una toxina, una toxina
condicional, un antígeno, una proteína supresora del tumor y
factores de crecimiento, proteínas de la membrana, proteínas
vasoactivas y péptidos, proteínas antivíricas y ribozimas, y
derivados de éstos (tales como con un grupo indicador asociado).
Ejemplos de polipéptidos de utilización
terapéutica incluyen los factores neurótrofos tales como el factor
de crecimiento de nervios (NGF), el factor neurótrofo ciliar (CNTF),
el factor neurótrofo derivado del cerebro (BNTF) y neurotrofinas
(tales como NT-3 y NT-4/5) que
presentan potencial como agente terapéutico para el tratamiento de
trastornos neurológicos tal como la enfermedad de Parkinson.
Los NOI adecuados para su utilización en la
presente invención en el tratamiento o profilaxis del cáncer
incluyen los NOI que codifican proteínas las cuales: destruyen la
célula diana (por ejemplo una toxina ribosómica), actúan como:
supresores tumorales (tal como p53 natural); activadores de
mecanismos inmunitarios antitumorales (tales como citocinas,
moléculas coestimulantes e inmunoglobulinas); inhibidores de
angiogénesis; o que proporcionan sensibilidad farmacéutica
aumentada (tales como las enzimas de activación de profármacos);
indirectamente estimulan la destrucción de la célula diana mediante
células efectoras naturales (por ejemplo, antígeno fuerte para
estimular el sistema inmunitario o convertir una sustancia
precursora en una sustancia tóxica que destruye la célula diana (por
ejemplo una enzima que activa el profármaco). Las proteínas
codificadas podrían destruir también células tumorales transitorias
(p. ej. una enzima que activa un profármaco a un fármaco
difusible).
Pueden utilizarse los NOI que codifican
transcritos de cadena complementaria o ribozimas que interfieren con
la expresión de los genes celulares o patógenos, por ejemplo, con
expresión de genes celulares para la coexistencia del tumor (por
ejemplo contra transcritos myc aberrantes en el linfoma de
Burkitts o contra transcritos bcr-abi en la
leucemia mieloide crónica. También está prevista la utilización de
combinaciones de dichos NOI.
En lugar, o además de, estar selectivamente
expresadas en los tejidos diana, el NOI o los NOI puede(n)
codificar una enzima o enzimas para activación del profármaco que no
presentan un efecto significativo ni ningún efecto perjudicial hasta
que el individuo se trate con uno o más profármacos en los que actúa
la enzima o enzimas. En presencia del NOI activo, el tratamiento de
un individuo con el profármaco apropiado conduce al aumento de la
reducción en desarrollo o la supervivencia del tumor.
Puede administrarse una enzima activadora del
profármaco a un punto del tumor para el tratamiento de un cáncer. En
cada caso, se utiliza el profármaco adecuado en el tratamiento del
paciente en combinación con la enzima activadora del profármaco
apropiada. Se administra un profármaco apropiado junto con el
vector. Ejemplos de profármacos incluyen: fosfato de etopósido (con
fosfatasa alcalina); 5-fluorocitosina (con citosina
desaminasa);
doxorrubicin-N-p-hidroxifenoxiacetamida
(con penicilin-V-amidasa); glutamato
de
para-N-bis(2-cloroetil)
aminobenzoílo (con carboxipeptidasa G2); carbamatos de mostaza de
nitrógeno con cefalosporina (con \beta-lactamasa);
SR4233 (con P450 reductasa); ganciclovir (con HSV timidina cinasa);
profármacos de mostaza con nitrorreductasa y ciclofosfamida (con
P450).
Ejemplos de enzimas de activación de profármacos
adecuadas para su utilización en la invención incluyen una timidina
fosforilasa que activa los profármacos de
5-fluoro-uracilo, capcelabina y
fortulón; la timidina cinasa del virus del herpes simple que activa
ganciclovir; un citocromo P450 que activa un profármaco tal como
ciclofosfamida a un agente que causa daño al ADN; y la citosina
desaminasa que activa la 5-fluorocitosina.
Preferentemente se utiliza una enzima de origen humano.
Los NOI pueden codificar asimismo polipéptidos
antigénicos para su utilización como vacunas. Preferentemente dichos
polipéptidos antigénicos proceden de organismos patógenos, por
ejemplo bacterias o virus. Ejemplos de dichos polipéptidos
antigénicos incluyen los antígenos del virus de la hepatitis B,
antígenos de superficie o del núcleo de la hepatitis B, antígenos
del VIH, la toxina de la tos ferina, la toxina del cólera o la
toxina de la difteria.
Los NOI pueden incluir también genes marcadores
(por ejemplo que codifican la \beta-galactosidasa
o la proteína verde fluorescente) o los genes cuyos productos
regulan la expresión de otros genes (por ejemplo, factores
reguladores de la transcripción).
Cuando una enfermedad es producida por un gen
defectuoso, pueden administrarse los NOI que codifiquen un alelo
totalmente operativo del gen, tal como en el caso de la fibrosis
quística. Se han identificado las bases moleculares para una
variedad de trastornos genéticos y se han clonado las secuencias
operativas naturales. Puede ser deseable incluir en el NOI las
secuencias adyacentes al gen terapéutico que son homólogas a las
correspondientes secuencias adyacentes en el genoma para permitir la
sustitución del gen defectuoso mediante recombinación
homó-
loga.
loga.
La terapia génica y otras aplicaciones
terapéuticas pueden requerir bien la administración de genes
múltiples. La expresión de genes múltiples puede ser ventajosa para
el tratamiento de una variedad de enfermedades. Ya que no existe
ninguna limitación en el tamaño del NOI que pueda incorporarse a un
vector o complejo de administración de la invención, sería posible
dirigir las células con genes múltiples simultáneamente.
Una variedad de lípidos catiónicos es conocida
en la materia (véase por ejemplo el documento WO 95/02698, cuya
exposición se incorpora a la presente memoria en su totalidad como
referencia, algunos de los cuales se reproducen a continuación.
Ejemplos de estructuras de lípidos catiónicos útiles en la presente
invención se proporcionan en la Tabla 1 del documento WO 95/02698.
Generalmente, cualquier lípido catiónico, ya sea monovalente o
polivalente, puede utilizarse en las composiciones y métodos de la
presente invención. Generalmente se prefieren lípidos catiónicos
polivalentes. Los lípidos catiónicos incluyen éteres de alquilo y
alicíclicos saturados e insaturados y ésteres de aminas, amidas o
derivados de éstos. Los grupos alquilo y alqueno de cadena lineal y
ramificada de lípidos catiónicos pueden contener de 1 a
aproximadamente 25 átomos de carbono. Los grupos alquilo o alqueno
de cadena lineal o ramificada preferidos tienen seis o más átomos de
carbono. Los grupos alicíclicos pueden contener desde
aproximadamente 6 hasta 30 átomos de carbono. Los grupos alicíclicos
preferidos comprenden colesterol y otros grupos esteroides. Los
lípidos catiónicos pueden prepararse con una variedad de contraiones
(aniones) que comprenden entre otros: cloruro, bromuro, yoduro,
fluoruro, acetato, trifluoroacetato, sulfato, nitrito y nitrato.
Como lípidos catiónicos muy conocidos está el
cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA).
(DOTMA).
El DOTMA y el diéster análogo DOTAP
(1,2-bis(oleiloxi)-3(trimetilamonio)propano),
están disponibles en el mercado. Lípidos catiónicos adicionales
relacionados estructuralmente con DOTMA se describen en la patente
U.S. nº 4.897.355, que se incorpora a la presente memoria como
referencia.
Otro grupo útil de lípidos catiónicos
relacionados con DOTMA y DOTAP se denominan normalmente éteres de
DORI o ésteres de DORI. Los lípidos de DORI se diferencian de DOTMA
y de DOTAP en que uno de los grupos metilo del grupo trimetilamonio
está sustituido por un grupo hidroxietilo. Los grupos oleoílo de los
lípidos DORI pueden sustituirse por otros grupos alquilo o alqueno,
tales como los grupos palmitoílo o estearoílo. El grupo hidroxilo de
los lípidos de tipo DORI puede utilizarse como una secuencia para
funcionalización adicional, por ejemplo para la esterificación a
aminas, como la carboxiespennina.
Los lípidos catiónicos adicionales que pueden
emplearse en los vectores o complejos de administración de la
presente invención incluyen los descritos en el documento WO
91/15501 como útiles para la transfección de células.
Los derivados catiónicos de esterol, como
3\beta[N-(N'-N'-dimetilaminoetano)carbamoíl]-colesterol
(DC-Chol) en los que el colesterol está unido a un
grupo trialquilamonio, pueden utilizarse en la presente invención.
Se informa que DC-Chol proporciona una transfección
más eficaz y menor toxicidad que los liposomas que contienen DOTMA
para algunas líneas celulares. También pueden utilizarse las
variantes de poliamina DC-Chol tales como las
descritas en el documento WO 97/45442.
Los lípidos policatiónicos que contienen
carboxiespermina son también útiles en los vectores o complejos de
administración de la presente invención. El documento
EP-A-304111 describe la
carboxiespermina que contiene lípidos catiónicos que incluye la
5-carboxiespermilglicina
dioctadecil-amida (DOGS) y la
dipalmitoílfosfatidiletanolamina
5-carboxiespermilamida (DPPES). Pueden obtenerse
lípidos catiónicos adicionales sustituyendo los grupos octadecilo y
palmitoílo de la DOGS y DPPES, respectivamente, por otros grupos
alquilo o alqueno.
En los vectores o complejos de administración de
la invención los lípidos catiónicos pueden opcionalmente combinarse
con colípidos no catiónicos, preferentemente lípidos neutros, para
formar liposomas o agregados de lípidos. Los lípidos neutros útiles
en la presente invención comprenden, entre muchos otros: lecitinas;
fosfatidiletanolaminas, tales como DOPE (dioleoil
fosfatidiletanolamina), POPE (palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina)
y DSPE (diasteroilfosfatidiletanolamina); fosfatidilcolina;
fosfatidilcolinas, tales como DOPC (dioleil fosfatidilcolina), DPPC
(dipalmitoilfosfatidilcolina), POPC (palmitoiloleil
fosfatidilcolina) y DSPC (diasteroilfosfatidilcolina);
fosfatidilglicerol; fosfatidilgliceroles, tales como DOPG
(dioleilfosfatidilglicerol), DPPG (dipalmitoilfosfatidilglicerol) y
DSPG(diasteroilfosfatidilglicerol); fosfatidilserinas, tales
como dioleil- o dipalmitoilfosfatidilserina; difosfatidilgliceroles;
ésteres de ácido graso; ésteres de glicerol; esfingolípidos;
carbolipina; cerebrósidos y ceramidas; y mezclas de éstos. Los
lípidos neutros comprenden también colesterol y otros 3DOH
esteroles.
Además en el vector o complejos para
administración de la invención pueden incorporarse opcionalmente uno
o más compuestos anfífilos para modificar su propiedad superficial.
Los compuestos anfífilos útiles en la presente invención comprenden,
entre muchos otros; neoglucolípidos tales como GLU4 y GLU7 mostrados
en la Figura 22, polietilenglucolípidos tales como
N-(\omega-metoxi(polioxietileno)oxicarbonil)fosfatidiletanolamina,
N-monometoxi(polioxietileno)succinilfosfatidiletanolamina
y éter colesterílico de polioxietileno; detergentes no iónicos tales
como alquilglucósidos, alquil metil glucamidas, ésteres de sacarosa,
éteres de alquil poliglicerol, éteres de alquil polioxietileno y
éteres de alquil sorbitán oxietileno y éteres de oxietileno
estereoideos; copolímeros de bloque tal como los copolímeros del
bloque polioxietileno polioxipropileno.
En un aspecto el lípido catiónico de la presente
invención está modificado con un resto de azúcar o con un resto de
polietilenglicol (PEG). En un aspecto adicional el complejo de la
invención comprende además un compuesto capaz de actuar como lípido
catiónico, comprendiendo el compuesto un grupo colesterol que tiene
unido a éste mediante un grupo amino, un grupo azúcar o un resto de
polietilenglicol. Como se demostró en los Ejemplos, los solicitantes
han descubierto dichos lípidos catiónicos modificados con azúcar/PEG
que son particularmente ventajosos. Por lo tanto en un aspecto
adicional la presente invención proporciona un compuesto capaz de
actuar como lípido catiónico, comprendiendo el compuesto un grupo
colesterol que tiene unido a éste mediante un grupo amina, un resto
de azúcar o un resto de polietilenglicol. Preferentemente el
compuesto comprende de 1 a 7 restos de azúcar o grupos de
polietilenglicol. El compuesto puede comprender una mezcla de restos
de azúcar y de restos de polietilenglicol. Preferentemente el resto
de azúcar es o procede de la glucosa o de la
D-glucosa.
El vector/complejo para administración de la
presente invención se prepara típicamente poniendo en contacto en
primer lugar un polipéptido con empaquetamiento adenovírico Mu1 y un
NOI en un tubo esterilizado durante aproximadamente 10 min. a
temperatura ambiente, produciendo un complejo polipéptido/NOI
condensado. Una técnica frecuente consiste en salpicar el ácido
nucleico y la proteína uno al lado del otro en el tubo, pero no en
contacto y empezar a mezclar añadiendo unos pocos cientos de
microlitros de un portador líquido, tal como un portador, excipiente
o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Un método adicional y preferido para la
preparación de un vector/complejo para administración de la presente
invención consiste en poner en contacto un polipéptido de
empaquetamiento adenovírico Mu1 y un NOI durante la agitación
continua.
Se utiliza típicamente una relación de NOI a
polipéptido por lo menos de 1:1, preferentemente de 1:1 a 2:1, más
preferentemente de 1,4:1 a 1,9:1, más preferentemente de 1,5:1 a
1,8:1. Los solicitantes han descubierto una relación de NOI a
polipéptido de aproximadamente 1:0,6 (\sim1,7:1) que es
particularmente eficaz. En algunos aspectos, se utiliza típicamente
una relación de polipéptido a NOI de 0,2 a 1,5, preferentemente de
0,3 a 1,2 (p/p), más preferentemente de 0,5 a 0,7. En otras formas
de realización, típicamente la relación de polipéptido a NOI es de
por lo menos 10:1 o de por lo menos 20:1 (p/p). Sin embargo la
relación óptima puede depender de la relación carga:aminoácido del
polipéptido de empaquetamiento adenovírico Mu1. Generalmente, cuanto
menor es la relación carga:aminoácido, mayor es la relación
polipéptido:NOI utilizada.
A continuación, se añaden al complejo los
lípidos catiónicos. En una forma de realización los lípidos
catiónicos pueden formar parte de un liposoma formado previamente
que comprende dos o más constituyentes lipídicos, tales como
DC-Chol y DOPE. Los lípidos catiónicos se incuban
típicamente con el complejo polipéptido/NOI durante aproximadamente
20 min. a temperatura ambiente. Un método adicional y preferido de
añadir los lípidos catiónicos es en forma de suspensión catiónica de
liposomas. Este complejo final puede almacenarse a aproximadamente
-80ºC con la adición de sacarosa al 10% (p/v) hasta su
utilización.
La cantidad de liposoma a NOI es típicamente del
orden de desde 3:1 hasta 20:1, preferentemente de 6:1 a 15:1, más
preferentemente de 8:1 a 14:1. Los solicitantes han descubierto una
relación de liposomas a NOI de 12:1 que es particularmente eficaz.
En otras formas de realización la cantidad de liposoma a NOI es
típicamente del orden de 2:1 a 10:1 o de 3:1 a 6:1. Cuando se
utilizan lípidos catiónicos con lípidos neutros, la relación es
típicamente del orden de 1:1.
En una forma de realización muy preferida la
relación
| \hskip2cm | liposoma: | NOI: | polipéptido | |
| es | 3-20: | 1: | 0,5-1 | |
| preferentemente | 8-14: | 1: | 0,5-0,7 | |
| más preferentemente | \sim12: | 1: | \sim0,6 |
El vector/complejo para administración es ahora
fácil de utilizar. Aunque se prefiere mezclar los diversos
componentes en el orden descrito anteriormente, es posible combinar
los componentes en cualquier orden. Cuando deban añadirse más
componentes polipeptídicos, pueden añadirse en cualquier fase pero
preferentemente junto con el polipéptido de empaquetamiento
adenovírico Mu1.
Puede ser deseable incluir otros componentes
dentro de los vectores/complejos, por ejemplo los ligandos que se
unen a los receptores de la superficie celular, para proporcionar
vectores/complejos con un grado de selectividad para el tipo de
célula. Los ligandos incluyen péptidos, glucoproteínas,
oligosacáridos, lectinas y anticuerpos y fragmentos de éstos.
El vector/complejo para administración de la
invención está preferentemente combinado con un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica (que puede ser para uso humano o animal). Los
portadores y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas
isotónicas, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato. La
composición de la invención puede administrarse por inyección
directa. La composición puede formularse para administración
parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular o
transdérmica o inhalación. Típicamente, cada NOI puede
administrarse a una dosis de 10 ng a 10 \mug/kg de peso corporal,
preferentemente de 0,1 a 10 \mug/kg, más preferentemente de 0,1 a
1 \mug/kg de peso corporal.
Como alternativa, la transfección de células del
paciente puede realizarse ex vivo mediante la eliminación del
tejido del paciente, la transfección utilizando un vector/complejo
para administración de la invención, seguida de reimplantación del
tejido transfectado.
Las vías de administración y las dosis descritas
pretenden ser solamente una pauta ya que un experto en la materia
será capaz de determinar fácilmente la vía óptima de administración
y la dosis para cualquier paciente y enfermedad concretos.
Los vectores/complejos para la administración en
la presente invención pueden utilizarse para transfectar eficazmente
células eucarióticas, en particular células de mamífero con NOI. Los
vectores/complejos para administración han demostrado ser
particularmente eficaces en comparación con las composiciones de la
técnica anterior en la transfección de las neuronas. Esto tiene
implicaciones específicas para (i) investigar dónde se utilizan las
neuronas y (ii) las aplicaciones en las que se desea introducir los
NOI en las células del sistema nervioso central o periférico de un
hombre o animal. Más generalmente, los vectores/complejos para
administración en la presente invención pueden utilizarse en una
variedad de aplicaciones de administración de NOI tal como en
terapia génica, administración de vacunas de ADN y estudios de
transfección in vitro.
Ejemplos de enfermedades que pueden dirigirse
para su tratamiento utilizando complejos/vectores de la invención
incluyen las enfermedades del sistema nervioso periférico central
tales como las enfermedades neurodegenerativas y la lesión al tejido
nervioso como resultado de heridas/traumatismo (incluyendo el
ictus). En particular, las enfermedades neurodegenerativas incluyen
la enfermedad de las neuronas motrices, varias enfermedades
hereditarias, tales como la disautonomía familiar y la atrofia
muscular vertebral infantil y las enfermedades neurodegenerativas de
comienzo tardío tales como las enfermedades de Parkinson y de
Alzheimer.
Los vectores/complejos para administración de la
invención pueden utilizarse también para administrar genes
terapéuticos a un paciente que padece de cáncer. Ejemplos de
cánceres que pueden ser dirigidos para su tratamiento incluyen el
cáncer de mama, de cuello uterino, de colon, de recto, de
endometrio, de riñón, de pulmón, de ovario, de páncreas, de
próstata, de piel, de estómago, de vejiga, del SNC, del esófago, de
cabeza o cuello, de hígado, de testículos, de timo o de tiroides.
Los cánceres de células sanguíneas, de células de médula ósea,
linfocitos B, linfocitos T, precursores linfocíticos o precursores
de células mieloides pueden también ser dirigidos para su
tratamiento.
El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor no
sólido y puede ser un tumor primario o un tumor metastásico
diseminado (secundario). Los tumores no sólidos incluyen el mieloma,
leucemia (aguda o crónica, linfocítica o mielocítica) tal como la
eritroleucemia mieloblástica aguda, promielocítica aguda,
mielomonocítica aguda, monocítica aguda; y linfomas tales como el de
Hodgkin, no hodgkiniano y de Burkitt. Los tumores sólidos incluyen
el carcinoma, carcinoma de colon, carcinoma microcítico del pulmón,
carcinoma no microcítico de pulmón, adenocarcinoma, melanoma,
carcinoma de células basales o escamosas, mesotelioma,
adenocarcinoma, neuroblastoma, glioma, astrocitoma, meduloblastoma,
retinoblastoma, sarcoma, osteosarcoma, rabdomiosarcoma,
fibrosarcoma, sarcoma osteógeno, hepatoma y seminoma.
Otras enfermedades de interés incluyen las
enfermedades producidas por mutaciones, hereditarias o somáticas, en
los genes celulares normales, tal como la fibrosis quística,
talasemias y similares.
Otras áreas de interés incluyen el tratamiento
de los trastornos inmunorrelacionados tales como el rechazo del
trasplante de órganos y las enfermedades autoinmunitarias. El
espectro de las enfermedades autoinmunitarias va desde las
enfermedades específicas del órgano (tales como la tiroiditis,
insulitis, esclerosis múltiple, iridociclitis, uveítis, orquitis,
hepatitis, enfermedad de Addison, miastenia grave) a las
enfermedades generalizadas tales como la artritis reumatoide y otros
trastornos reumáticos o el lupus eritematoso. Otros trastornos
incluyen la hiperreactividad inmunitaria, tales como las reacciones
alérgicas, en particular la reacción asociada con la producción de
histamina, y el asma.
La presente invención se ilustrará a
continuación mediante de los siguientes ejemplos que son únicamente
ilustrativos y no limitativos.
La Figura 1 representa una placa;
la Figura 2 representa un gráfico;
la Figura 3 representa una placa;
la Figura 4 representa un gráfico;
la Figura 5 representa un gráfico;
la Figura 6 representa un gráfico;
la Figura 7 representa un gráfico;
la Figura 8 representa un gráfico;
la Figura 9 representa estructuras;
la Figura 10 representa un gráfico;
la Figura 11 representa un gráfico;
la Figura 12 representa un gráfico;
la Figura 13 representa un gráfico;
la Figura 14 representa un gráfico;
la Figura 15 representa un gráfico;
la Figura 16 representa una placa;
la Figura 17 representa un gráfico;
la Figura 18 representa un gráfico;
la Figura 19 representa una estructura;
la Figura 20 representa un esquema de
reacción;
la Figura 21 representa un esquema de
reacción;
la Figura 22 representa estructuras;
la Figura 23 representa el principio de
incorporación miscelar;
la Figura 24 representa un gráfico; y
la Figura 25 representa un gráfico.
- A)
- BSA no tiene efecto sobre la movilidad electroforética de pADN. Se incubó un microgramo de pCMV\beta con 0 \mug (banda 2), 5 \mug (banda 3), 10 \mug (banda 4), 15 \mug (banda 5), 20 \mug (banda 6), 25 \mug (banda 7) y 30 \mug (banda 8) de BSA durante 10 minutos a temperatura ambiente en 1\times HBS. Se analizó a continuación la movilidad alterada en muestras en un gel de agarosa al 1%. No se detectó ningún cambio en la movilidad electroforética por BSA.
- B)
- En contraste con BSA, el péptido Mu1 interfirió drásticamente con la movilidad de pADN. Se incubó pCMV\beta (1 \mug) con 0,25 \mug (banda 2), 0,5 \mug (banda 3), 1 \mug (banda 4), 2 \mug (banda 4), 4 \mug (banda 6), 6 \mug (banda 7) y 0 \mug (banda 8) de péptido Mu1 recombinante como en A. Aunque la relaciones de proteína a pADN de 0,25 (p/p) (banda 2) no alteraron la migración de la forma relajada de pCMV\beta (banda superior) se observó un ligero retardo del pADN superenrollado (banda inferior). Cuando se utilizaron relaciones de 0,5 (p/p) o mayores, sin embargo, la migración de ambas formas de pADN se retardó rigurosamente.
- C)
- La proteína Vp1 del poliomavirus fue mucho menos eficaz en la prevención de la migración del pADN. Se incubó pCMV\beta (1 \mug) con 2 \mug (banda 2), 4 \mug (banda 3), 6 \mug (banda 4), 8 \mug (banda 5), 16 \mug (banda 6), 32 \mug (banda 7) y 0 \mug (banda 8) Vp1. Sólo las relaciones de 6 o mayores (proteína:pADN, p/p) produjeron un retardo significativo del pADN superenrollado (banda 6, banda inferior). Además, hasta que se utilizó una relación de 32 (p/p) no existió ningún efecto en el pADN relajado (banda 7, banda superior). En todos los geles la banda 1 corresponde al marcador de ADN de 1 Kb (BRL).
Se sembraron células ND7 a una densidad de 5
\times 10^{4} células/pocillo en placas de cultivo de 24
pocillos 24 h. antes de la transfección. Inmediatamente antes de la
transfección, las células se lavaron en medio exento de suero. Se
formaron complejos incubando pCMV\beta con Mu1 antes de la adición
del liposoma catiónico DC-Chol/DOPE. En cada caso,
se acomplejó 1 \mug de pCMV\beta con 0,6, 6, 12 y 21 \mug de
péptido Mu1. Cada una de estas combinaciones se acomplejó a
continuación con 3, 4 y 6 \mug de DC-Chol/DOPE.
Las células ND7 se expusieron a complejos de transfección durante 2
horas, a continuación se mantuvieron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante
otras 24 h. antes de recogerse y procesarse para el ensayo de la
enzima \beta-galactosidasa. Los números
representan medias \pm SD, n=3.
Se colocaron neuronas ND7 en placas de cultivo
de 24 pocillos a una densidad de 4 \times 10^{4}
células/pocillo y se las dejó desarrollar durante 24 h. Las neuronas
ND7 no diferenciadas se transfectaron a continuación con pCMVb solo
(A), pCMVb acomplejado con DC-Chol/DOPE (1/3, p/p)
(B) o con pCMVb acomplejado con Mu1 y DC-Chol/DOPE
(1/12/6) (C). Cuarenta y ocho horas después las células se fijaron y
se procesaron para la detección histoquímica de
X-Gal. Como se puede apreciar en el panel C la
inclusión de Mu1 en el complejo en una relación óptima aumentó
significativamente el número de células positivas a
X-Gal (azules).
El ADN del plásmido pCMV\beta se acomplejó con
varias cantidades de péptido policatiónico y a continuación se
mezcló con liposoma catiónico a una relación de 1:3
(pCMV\beta:liposoma; p/p). Una vez lavadas brevemente en medio
exento de suero, las células ND7 se expusieron a complejos
liposoma-policatión-liposoma durante
dos horas y a continuación se volvieron al medio que contenía el
suero. Veinticuatro horas después las células se recogieron y se
procesaron para el ensayo de la enzima
\beta-galactosidasa. Cada condición se realizó por
triplicado y cada experimento se repitió tres veces. Los números
representan las medias \pm SD.
Se sembraron células COS a una densidad de 60 a
80% de confluencia en placas de cultivo de 24 pocillos 24 h. antes
de la transfección. La incubación de pCMV\beta con Mu1 antes de la
adicion del liposoma catiónico DC-Chol/DOPE formó
complejos capaces de transfección celular. En cada caso se acomplejó
1 \mug de pCMV\beta con 12 \mug de Multipéptido que se había
descubierto como óptimo para las células ND7. Los complejos
pCMV\beta:Mu1 se mezclaron a continuación con 3, 4 y 6 \mug de
DC-Chol/DOPE. Las células COS se expusieron a
complejos de transfección durante 2 horas, a continuación se
mantuvieron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante otras 24 h. antes de
recogerse y procesarse para el ensayo con enzima
\beta-galactosidasa. Los números representan
medias \pm SD, n=3.
Se colocaron células ND7 en placas de cultivo de
24 pocillos a una densidad de 4 \times 10^{4} células por
pocillo en un medio de cultivo normal (+suero). Veinticuatro horas
después el medio se sustituyó por medio de diferenciación y las
células se cultivaron durante otras 24 h. Se utilizaron tres medios
de diferenciación diferentes; exento de suero
(-suero), medio de crecimiento normal más cAMP 1 mM (cAMP) o suero reducido (0,5%) más cAMP 1 mM y 50 ng/ml de factor de crecimiento de nervios (NGF). Se transfectaron las células a continuación con pCMVb acomplejadas ya sea con DC-Chol/DOPE solo o Mu1 más DC-Chol/DOPE. Cuarenta y ocho horas después las células se fijaron y se procesaron para la histoquímica de X-Gal y se determinó el porcentaje de células positivas. En todos los casos la presencia de Mu1 aumentó el número de células positivas.
(-suero), medio de crecimiento normal más cAMP 1 mM (cAMP) o suero reducido (0,5%) más cAMP 1 mM y 50 ng/ml de factor de crecimiento de nervios (NGF). Se transfectaron las células a continuación con pCMVb acomplejadas ya sea con DC-Chol/DOPE solo o Mu1 más DC-Chol/DOPE. Cuarenta y ocho horas después las células se fijaron y se procesaron para la histoquímica de X-Gal y se determinó el porcentaje de células positivas. En todos los casos la presencia de Mu1 aumentó el número de células positivas.
Es interesante que el número de células
transfectadas fue mayor tanto con como sin Mu1 para las células
cultivadas en cAMP.
Se sintetizaron los péptidos Vp1 y Mu1 en un
sintetizador de péptidos en fase sólida PSSM-8 de
Shimadzu utilizando un exceso de cinco veces de
L-aminoácidos protegidos con
(9-fluorenil)metoxicarbonil (Fmoc)
(Novabiochem) y los reactivos hexafluorofosfato/hidroxibenzotriazol
de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetra-metiluronio
(HBTU/HOBt) de FastMoc^{TM} (Advanced Chemtech Europe) como agente
de acoplamiento de la amida. Después de la escisión de la resina y
de la desprotección, se realizó el desalado por filtración en gel
utilizando una columna de P2 Biogel (2 \times 28 cm; Biorad) unida
a un sistema FPLC (Amersham Pharmacia Biotech UK) con TFA en
solución acuosa al 0,1% como eluyente a un caudal de 0,5 a 0,75
ml/min. La purificación en fase inversa de preparación final se
consiguió con una columna Vydac (C18, 5 \mum, 2 \times 25 cm;
Hichrom) unida a un sistema HPLC de Wilson (Anachem). Se eluyeron
los péptidos a 5 ml/min mediante un gradiente lineal de acetonitrilo
en TFA acuoso al 0,1% y se controló la elución entre 220 y 230
nm.
Se preparó el péptido Vp1 utilizando una resina
lábil superácida
L-Pro-2-clorotritil cargada
previamente (Novabiochem) (100 mg, 1,05 mmoles/g, 0,1 mmoles). Se
utilizaron periodos de acoplamiento prolongados para incorporar
todos los restos de aminoácidos procedentes del sexto (Lys) a todo
el resto N-terminal. Después de la desprotección con Fmoc del
N-terminal automática con piperidina (20%, v/v) en
dimetilformamida, se aisló la resina, se lavó con dimetilformamida
(10 ml) y metanol (15 ml) y a continuación se secó al vacío. El
péptido en bruto se escindió de la resina utilizando TFA enfriado
con hielo (8 ml), que contenía fenol (7%, p/v), etanoditiol (2%,
v/v), tioanisol (4%, v/v) y agua (4%, v/v) (conocida como Mezcla A)
y a continuación se precipitó con éter
metil-terc-butílico (MTBE) enfriado
en hielo (30 ml). El sedimento subsiguiente se desaló a continuación
y la mezcla de péptidos en bruto se purificó por HPLC en fase
inversa. Tras la elución, las fracciones que contenían el péptido
deseado (eluyendo con acetonitrilo al 68,5% v/v) se combinaron y
liofilizaron para dar el péptido en forma de un polvo blanco.
Rendimiento global: 32 mg (15 \mumoles, 15%); MS
(MALDI-TOF)
C_{85}H_{151}N_{26}O_{26}S_{3}: [M+H]^{+}
calculado 2.049,5, obtenido 2.050,2. Se confirmó la secuencia
mediante el análisis de la composición y secuencia de aminoácidos.
La homogeneidad se consideró >95% por análisis HPLC.
Se preparó el péptido Mu1 utilizando resina
Gly-Wang (Novabiochem) (40 mg, 0,67 mmoles/g, 0,03
mmoles). Se utilizaron periodos de acoplamiento normales en todo el
proceso. Después de la desprotección con Fmoc N-terminal
automática como anteriormente, se aisló la resina y se lavó con
diclorometano (20 ml) y metanol (20 ml) tras lo cual se secó la
resina al vacío. Se escindió el péptido en bruto de la resina
utilizando la Mezcla A (8 ml) y se precipitó con MTBE (30 ml), todo
como anteriormente. Por último, la mezcla del péptido en bruto se
desaló y purificó por HPLC en fase inversa. Tras la elución, las
fracciones que contenian el péptido deseado (eluyendo con
acetonitrilo al 17,2%) se combinaron y liofilizaron para dar el
péptido en forma de un polvo blanco. Rendimiento total: 65 mg (26
\mumoles, 80%); MS (ES) C_{95}H_{170}N_{52}O_{21}S_{2}:
[M+H]^{+} calculado 2.440,7, obtenido 2.440,6. La
homogeneidad se estimó >95% por análisis HPLC.
Se reconstituyeron los péptidos purificados en
agua destilada H_{2}O a 3 mg/ml. El péptido y el pADN se
acomplejaron en 20 \mul de solución salina tamponada con HEPES
(NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,75 mM, HEPES 19 mM, pH
7,4) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los complejos
péptido:pADN se analizaron posteriormente mediante electroforesis en
gel de agarosa (1%). Las incubaciones de referencia para las
interacciones del pADN macromolecular generales se realizaron con
cantidades variables de albúmina de suero bovino purificada de
calidad biología molecular (Sigma).
Las ND7 son una línea celular bien caracterizada
procedente de la fusión de un neuroblastoma (N18Tg2) con neuronas
sensitivas de rata recién nacida ^{28}. La línea celular se
mantuvo en medio de cultivo normal (NGM) (medio L-15
de Leibovitz (BRL) enriquecido con suero de bovino fetal al 10%
(BRL), 4 g/l de glucosa, 4 g/l de bicarbonato sódico (BRL), 100
IU/ml de penicilina/estreptomicina (BRL)) a 37ºC y CO_{2} al 5%.
Se colocaron las células en placas de 24 pocillos (Costar) a una
densidad que produjo confluencia del 70% tras 24 horas.
La diferenciación de las células se realizó
utilizando tres métodos descritos anteriormente ^{28,29}. Se
sembraron las células ND7 en NGM a una densidad de 4 \times
10^{4} células por pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos
(Nunc). Veinticuatro horas después se sustituyó el medio con: a) NGM
enriquecido con adenosina 3' 1 mM:monofosfato
5'-cíclico (cAMP; Sigma) o b) medio de
diferenciación exento de suero (Hams F12 al 50%, DMEM al 50%, 5
\mug/ml de transferrina, 250 ng/ml de insulina, 0,3 \muM de
selenito sódico), o c) medio de factor de crecimiento de nervios
bajo en suero (NGF) (L-15 enriquecido con glutamina
2 mM, 4 g/l de glucosa, 4 g/l de bicarbonato sódico, 10 \mu/ml de
penicilina, 10 g/ml de estreptomicina, FCS al 0,5%, AMPc 1 mM, 50
ng/ml de NGF (Alomone Labs)). Se cultivaron células diferenciadas
ND7 en medio apropiado durante 24 h. a 37ºC, CO_{2} al 5% antes de
la transfección.
Se cultivaron células COS-7
(procedentes del riñón del mono verde) en medio RPMI 1640 (BRL)
enriquecido con suero bovino fetal al 10% (BRL) y 100 IU/ml de
penicilina/estreptomicina (BRL).
Todas las transfecciones utilizaron el plásmido
indicador pCMV\beta (Clontech, Palo Alto, CA) que contenían la
secuencia completa de \beta-galactosidasa de E.
coli corriente abajo del activador/potenciador
inmediato-precursor del citomegalovirus humano
(Clontech). Se prepararon soluciones madre del ADN del plásmido
utilizando técnicas de clonación molecular habituales y se
purificaron utilizando el sistema Qiagen de purificación de
plásmidos exento de endotoxina (Qiagen, Dorking, UK).
Se prepararon liposomas
DC-Chol/DOPE como se describió anteriormente
^{30,31}. En resumen, se añadieron 6 \mumoles de
DC-Chol y 4 \mumoles de DOPE (suministrado en 10
mg/ml en CHCl_{3}) a CH_{2}Cl_{2} recién destilado (5 ml) en
nitrógeno. Se añadieron 5 ml de Hepes 20 mM (pH 7,8) a la mezcla y
dicha mezcla se trató con ultrasonidos durante 3 minutos. Se
eliminaron los disolventes orgánicos a presión reducida y la
suspensión de liposomas resultante se trató con ultrasonidos a
continuación durante 3 minutos más. Las preparaciones de liposomas
se almacenaron a
4ºC.
4ºC.
Dado que los experimentos iniciales determinaron
que la presencia de suero bovino fetal inhibía la transfección de
las células ND7 se utilizó medio de diferenciación exento de suero
en todas las transfecciones. Se colocaron varias cantidades de ADN y
liposomas en el fondo de un recipiente Bijou esterilizado de 7 ml
(Bibby Sterilin Ltd., Staffordshire, U.K.), pero no en contacto
entre sí.
Se combinaron el ADN y los liposomas mediante la
adición de 400 \mul de medio de diferenciación exento de suero y
se agitó suavemente. Se incubó la mezcla ADN/liposomas a temperatura
ambiente durante 20 a 30 minutos antes de ser aplicada a las
células. La mezcla ADN/liposomas se aplicó a continuación a las
células y se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 2 horas después
de las cuales este medio se sustituyó por un medio completo.
Veinticuatro a 48 horas después las células se fijaron y procesaron
para la histoquímica de X-gal como se describe
^{31} o se recogieron para el análisis con enzima
\beta-galactosidasa (Promega Corp.).
Se realizaron los recuentos de células a una
ampliación \times40 utilizando un microscopio invertido Nikon
Diaphot. Se repitió cada transfección por lo menos tres veces y se
realizaron por lo menos tres recuentos por separado en cada
pocillo.
Los complejos de transfección incluyendo los
péptidos de la prueba se generaron de la manera siguiente. Se
colocaron varias cantidades de péptido en el fondo de recipientes de
poliestireno esterilizados al lado, pero no en contacto con 1 \mug
de pCMV\beta y se mezclaron añadiendo 400 \mul de medio NGM
exento de suero. Se incubaron los complejos a temperatura ambiente
durante 10 minutos tras los cuales se añadió
DC-Chol/DOPE. El complejo pADN/péptido/liposoma se
incubó más a temperatura ambiente durante 20 minutos y a
continuación se administró a las células como anteriormente.
Mu1 es un péptido policatiónico compuesto de 19
aminoácidos asociados al complejo del núcleo del Adenovirus (Tabla
1) ^{27, 32}. Los solicitantes compararon la capacidad de fijación
al ADN de Mu1 con la proteína Vp1 del cápsido principal del
poliomavirus de ratón por interacción con el ADN del plásmido en un
ensayo de retardo en gel. Vp1 es un péptido de 19 aminoácidos que
contiene una señal de localización nuclear ^{26} y contiene menos
aminoácidos cargados positivamente que Mu1. Se predijo por
consiguiente que tiene una capacidad menor de fijación del ADN.
| Polipéptido | Secuencia | PM | Carga/relación |
| AA | |||
| Mu1 | NH_{2}-Met-Arg-Arg-Ala-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Ser-His-Arg-Arg-Met-Arg-Gly-Gly-OH | 2.440 | 0,63 |
| VP1 | NH_{2}-Met-Ala-Pro-Lys-Arg-Lys-Ser-Gly-Val-Ser-Lys-Cys-Glu-Thr-Lys-Cys-Thr-Pro-Pro-OH | 2.049 | 0,26 |
La secuencia NLS en VP1 está subrayada.
Se incubaron cantidades variables de péptido
purificado a temperatura ambiente en HBS durante aproximadamente 10
minutos y a continuación se analizaron mediante electroforesis en
gel de agarosa. Sin la adición de péptido, el ADN del plásmido
(pADN) circular superenrollado y relajado migró de la manera
esperada (Figura 1, banda 8).
Comenzando en una relación ADN:péptido de Mu1 de
1:0,25 (p/p) se retardó la migración del ADN del plásmido (Figura
1). La migración del ADN del plásmido fue afectada ligeramente en
las relaciones 1:0,25 (p/p), pero a una relación de 1:0,5 (p/p) la
migración del ADN del plásmido se redujo seriamente y se condujo muy
poco para migrar fuera de los pocillos. Para relaciones de 2:1 y por
encima el pADN no pudo migrar en el gel de agarosa y se redujo la
capacidad del bromuro de etidio para interquelarse en el plásmido.
En cambio con Mu1, no se detectó ningún efecto sobre la movilidad
electroforética del ADN del plásmido con Vp1 para relaciones
pADN:proteína mayores de 1:8 (p/p) (Figura 1). La adición de 8
\mug de Vp1 a 1 \mug de ADN del plásmido produjo un
ensanchamiento de la banda del pADN superenrollado. Sin embargo, no
se apreció ningún efecto en la banda del pADN relajado con Vp1 hasta
que se utilizó una relación pADN:proteína de 1:32 (p/p). A esta
relación, las bandas de pADN tanto superenrolladas como relajadas se
retardaron de forma significativa y pudo apreciarse algún ADN
retenido en el pocillo. No se detectó ningún efecto sobre la
movilidad electroforética cuando se incubó pADN con BSA para
relaciones superiores a 1:30 (p/p) de pADN:proteína (Figura 1).
Los solicitantes examinaron la capacidad de Mu1
y Vp1 para aumentar la transfección de una línea celular neuronal
mediante liposomas catiónicos utilizando un análisis con gen
indicador de \beta-galactosidasa. Se transfectaron
las células ND7 con pCMV\beta acomplejado con cantidades variables
de péptido y DC-Chol/DOPE. Los solicitantes han
demostrado previamente que el liposoma catiónico
DC-Chol/DOPE es capaz de transfectar de forma eficaz
la línea celular ND7 derivada neuronalmente ^{31}. En este estudio
los solicitantes descubrieron que se obtenían eficacias óptimas
(>40%) en esta línea celular derivada neuronalmente utilizando 1
\mug de ADN del plásmido acomplejado con 3 \mug de
DC-Chol/DOPE ^{31}. Temporalmente, los niveles
máximos de la expresión transgénica se obtienen entre 48 y 60 horas
después de la transfección. Por consiguiente, para maximizar la
probabilidad de detectar mejoras en la transfección los solicitantes
realizaron todos sus ensayos a las 12 a 20 horas de la transfección
en un momento en que los niveles de la expresión del gen indicador
eran más bajos. Anteriormente los solicitantes han encontrado una
relación pADN:liposoma de 1:3 (p/p) óptima para las transfecciones
en las células ND7 ^{31}. Los solicitantes compararon por
consiguiente el efecto de varias cantidades de péptido sobre las
transfecciones en las proporciones de 1:3, 1:4 y 1:6 de pADN:
DC-Chol/DOPE. El análisis de retardo en gel sugirió
que una relación aproximada de 1:0,5 (p/p), pADN:Mu1 era suficiente
para unir esencialmente todo el ADN del plásmido (Figura 1). Sin
embargo, los experimentos iniciales utilizando esta relación y
liposomas no afectaron las eficacias de transfección (no mostrado).
Los volúmenes utilizados para generar los complejos de transfección
fueron mucho mayores que los utilizados para realizar el ensayo de
retardo en gel (400 \mul frente a 20 \mul). Por consiguiente los
solicitantes han analizado grandes cantidades de Mu1 que eran de
una concentración similar en solución que las utilizadas en el
análisis de retardo en gel. Los solicitantes compararon el efecto
que 0,6, 6, 12 y 21 \mug de péptido Mu1 tendrían sobre las
transfecciones mediadas por DC-Chol/DOPE. Los
solicitantes descubrieron que Mu1 era capaz de mejorar 4 veces las
eficacias de transfección mediadas por liposomas catiónicos. La
mayor mejora de las eficacias de transfección tuvo lugar cuando se
utilizaron relaciones relativas de 1/12/6,
pCMV\beta/Mu1/(DC-Chol/DOPE) (p/p/p). Esta
combinación condujo a un aumento de 11 veces en las transfecciones
en comparación con el ADN solo (Figura 2).
El análisis con el gen indicador de
\beta-galactosidasa proporciona una medición de la
concentración total de \beta-galactosidasa
producida, pero no proporciona ninguna información con respecto al
número de células transfectadas. Por esta razón, los solicitantes
realizaron también recuentos de células en las células ND7
transfectadas. Se sembraron células a una densidad de 4 \times
10^{4} en placas de cultivo de 24 pocillos. Después de 24 horas
las células se lavaron brevemente en medio exento de suero y se
transfectaron con pCMV\beta acomplejado con
DC-Chol/DOPE y péptido Mu1. Las relaciones
utilizadas fueron las que se observaron que eran óptimas en el
análisis del gen indicador, 1:12:6,
pCMV\beta:Mu1:DC-Chol/DOPE. Utilizando estas
relaciones, los solicitantes encontraron un aumento de 6 veces en el
número de células positivas a \beta-galactosidasa
(Figuras 3 y 6). No se detectó ninguna pérdida de células obvia con
el complejo Mu1 a cualquiera de las concentraciones utilizadas.
Asimismo la concentración de proteína en los lisados celulares
utilizada para el análisis del gen indicador de
\beta-galactosidasa no varió de forma
significativa con las células no transfectadas (datos no
mostrados).
En cambio, no pudo encontrarse ninguna mejora en
la eficacia de la transfección con Vp1 (Figura 4). No se observó
ninguna mejora en las eficacias de transfección en el ADN solo con
pCMV\beta acomplejado con Mu1 solo.
A fin de apreciar si podrían conseguirse
transfecciones mejoradas en otros tipos de células los solicitantes
realizaron un análisis similar en células COS-7. Mu1
también mejoró la transfección mediada por liposomas en las células
COS-7 (Figura 5). La misma relación de
pADN:Mu1:liposoma óptima para las células ND7 fue mejor para las
células COS-7. Un grado similar de mejora se observó
también (3,7 veces) en los liposomas catiónicos solos.
Los solicitantes examinaron también la capacidad
de Mu1 para mejorar la transfección mediada por liposomas catiónicos
en las ND7 diferenciadas. La línea celular ND7 procede de una fusión
de las neuronas primarias de los ganglios de la raíz posterior de
rata (DRG) y del neuroblastoma N18Tg2de ratón ^{28}. Las células
ND7 pueden diferenciarse de varias maneras incluyendo la retirada
del suero, la administración de AMPc o la exposición a suero
reducido más AMPc y el factor de crecimiento de nervio. La
diferenciación de ND7 conduce a la expresión de propiedades
celulares asociadas a sus neuronas sensitivas nocirreceptoras
precursoras que incluyen una reducción en la división celular y el
comienzo de la excrecencia de neuritas. Se sembraron células ND7 en
placas de cultivo de 24 pocillos y se diferenciaron 24 horas
después. Quince a 20 horas después del comienzo de la
diferenciación, se transfectaron como anteriormente. Quince a 20
horas después de la transfección, las células se fijaron y se
procesaron para histoquímica de X-gal. Acorde con
las observaciones anteriores, las eficacias de transfección variaron
en gran medida entre los tres grupos diferenciados. Las células ND7
diferenciadas por retirada del suero presentaban los niveles más
bajos de transfección (1,3%) mientras que los niveles más elevados
se observaron en el grupo de AMPc (8%) y los niveles intermedios en
el grupo bajo en suero/AMPc/NGF (4,7%) (Figura 5). En las tres
condiciones, sin embargo, la inclusión del polipéptido Mu1 en el
complejo de transfección mejoró la transducción de las células ND7
diferenciadas. Las ND7 diferenciadas por AMPc solo o exposición a
suero/AMPc/NGF bajo presentaron aumentos de eficacia mayores de 6
veces (Figura 5). La mayor mejora de las eficacias se observó, sin
embargo, en el grupo diferenciado por la retirada del suero. Aquí,
se observaron aumentos mayores de 10 veces.
Como se muestra en el Ejemplo 1 (análisis de
fijación del ADN) utilizando electroforesis en gel, la migración del
ADN del plásmido se retrasó gravemente y poco ADN migró fuera de los
pocillos superior a una Mu1:ADN 0,5:1,0 (p/p). Esto implicaba que el
péptido Mu1 estaba interactuando fuertemente con el ADN y podía
neutralizar y condensar ácidos nucleicos para formar pequeñas
partículas adecuadas para la administración génica. Se examinó el
tamaño de las partículas Mu1:ADN (MD) en el intervalo de la relación
Mu1:ADN indicado en la Figura 7.
Se prepararon partículas de MD mediante
mezclado. En resumen, se añadieron alícuotas apropiadas de péptido
Mu1 en agua desionizada al ADN del plásmido (pCMV\beta)
(concentración final 220 \mug/ml) en tampón Hepes 20 mM, pH 7,0.
Después de mezclar bien, cada mezcla se incubó durante 10 min. a
20ºC. Inmediatamente después de la incubación cada mezcla se dividió
con tampón Hepes (concentración de ADN final de 24 \mug/ml) y se
sometió a análisis de tamaño de partícula mediante espectroscopía de
correlación de fotones (N4 más, Coulter). Todas las mediciones se
realizaron a 20ºC y se recogieron los datos en un ángulo de 90º. Se
utilizó análisis unimodal para calcular el tamaño de partícula medio
y la distribución estándar (S.D.).
Es interesante que aunque Mu1 se unió al ADN y
formó complejos en todo el intervalo completo examinado, el tamaño
de partícula varió considerablemente en respuesta a la relación
Mu1:ADN. Se formaron nanopartículas pequeñas y estables en la
relación Mu1:ADN 0,3 a 1,2 (intervalo L) y más de 5 (intervalo H).
Se produjeron relaciones intermedias en agregación pesada creciendo
el tamaño de las partículas del complejo durante el tiempo de
incubación hasta alcanzar más de 2 \mum de tamaño (Fig. 7).
Los solicitantes determinaron si los complejos
de liposoma-Mu1-ADN con una relación
baja de MD:ADN podrían formar nanopartículas estables y si las
partículas de complejo resultantes podrían tener buenas actividades
de transfección.
Preparación de liposomas: Se combinaron
DC-Chol (30 \mumoles) y DOPE (20 \mumoles) en
diclorometano. Se eliminó el disolvente orgánico a presión reducida
utilizando un evaporador rotativo y el residuo se secó durante 3
horas al vacío. A continuación, se añadió tampón Hepes 4 mM, pH 7,0
(3 ml), a la película de lípido con mezclado por agitación. Después
de un breve tratamiento con ultrasonidos (2 a 3 min.), la suspensión
de liposomas catiónicos resultante se extruyó mediante un extrusor
(Lipex Biomembranes) tres veces a través de dos filtros de
policarbonato uno sobre el otro (0,2 \mum de Millipore) y a
continuación diez veces a través de dos filtros de policarbonato uno
sobre el otro (0,1 \mum de Millipore) para formar pequeños
liposomas (diámetro medio de 109 nm) (aprox. 8 a 10 mg/ml
dependiendo de la preparación).
Preparación de los complejos liposoma:Mu1:ADN
(LMD): Se añadió péptido Mu1 (0,12 mg en agua desionizada,
concentración en péptido 3,5 mg/ml) a una solución de ADN del
plásmido (pCF1-CAT) (0,2 mg, concentración de
plásmido típicamente 1,0 mg/ml) en tampón Hepes 4 mM durante
agitación continua. Se introdujo a continuación la suspensión de
liposomas catiónicos (lípidos totales 2,4 mg, 4 \mumoles)
produciendo la formación de pequeñas partículas con una distribución
de tamaño estrecha (168 nm\pm58 nm) medida por PCS. Este LMD
(concentración de ADN final de 0,14 mg/ml) se almacenó a -80ºC con
adición de sacarosa al 10% (p/v) hasta su utilización. No se observó
ninguna desviación del tamaño de partícula durante un mes.
Se prepararon complejos de liposoma:ADN (LD)
(lipoplexos) para los experimentos de control con una relación
liposoma:ADN de 3:1 (p/p), composición óptima para la transfección
de células ND7.
Transfección en células ND7: Se sembraron
células ND7 en medio de cultivo normal (NGM) (con suero al 10%) a
una densidad de aproximadamente 4 \times 10^{4} células por
pocillo, en una placa de cultivo de 24 pocillos. Después de 24 h.,
se lavaron las células mediante breve exposición a NGM (exento de
suero) y a continuación se trataron con soluciones que contenían
complejos LMD o LD, prediluidas con NGM (exento de suero)
(concentración de ADN final de 3,2 \mug/ml en todos los casos)
para los periodos de tiempo indicados. Se lavaron a continuación las
células de nuevo y se incubaron durante 48 h. más antes de la
recogida. Se determinaron los niveles de transfección mediante el
análisis con la enzima cloranfenicol transferasa (CAT) utilizando
^{14}C-CAM como sustrato (Promega). La actividad
de transfección se expresó en conversión en porcentaje (%) del
^{14}C-CAM imputado por la enzima.
Los solicitantes han encontrado mucha expresión
del gen indicador mayor con LMD en comparación con la transfección
mediada por LD. De hecho, la transfección con LMD produjo 16 veces
más actividad enzimática de CAT después de un tiempo de transfección
de 10 min. y 6 veces a lo sumo después de un periodo de transfección
de 60 min. en comparación con la transfección mediada por LD (Fig.
8). Se observó transfección significativa con LMD aun cuando el
tiempo de transfección fue tan corto como 10 min. Estos datos
ilustran cuán rápidamente las partículas LMD son capaces de
introducirse en las células.
Los solicitantes determinaron si los complejos
de LMD podían mejorarse incorporando lípidos de colesterol
policatiónicos (documento WO 97/45442). Se utilizaron CDAN (B198),
ACHx (CJE52) y CTAP (B232) (Fig. 9) para preparar liposomas
catiónicos en lugar de DC-Chol. Cada sistema de
liposomas catiónicos utilizado se componía de 60% mol de lípido
catiónico y 40% mol de DOPE y se preparó como se describe en el
Ejemplo 4. Se prepararon los siguientes sistemas de complejo LMD
diferentes y se compararon: LMD(DC-Chol),
LMD(B198), LMD(CJE52) y LMD(B232). Todos los
sistemas LMD se prepararon con liposomas catiónicos (20 \mumoles
de lípido total) y 0,6 mg de péptido Mu1 por 1,0 mg de ADN
(pCMV\beta) como se describió anteriormente. Se demostró que las
partículas eran inferiores a 200 nm de diámetro.
Se prepararon mezclas de complejo (lipoplexos)
liposoma:ADN (LD) para los experimentos de control con una relación
de liposoma:ADN de 3:1 (p/p), composición óptima para la
transfección de células ND7.
Transfección en células ND7: Se sembraron
células ND7 en NGM (con suero al 10%) a una densidad de
aproximadamente 4 \times 10^{4} células por pocillo, en una
placa de cultivo de 24 pocillos. Tras 24 horas, se lavaron las
células mediante breve exposición a NGM (exento de suero) y a
continuación se trataron con soluciones que contenían complejos LMD
o LD, se diluyeron previamente con NGM (exento de suero)
(concentración de ADN final de 2,5 \mug/ml en todos los casos)
durante 1 h. Las células se lavaron a continuación otra vez y se
incubaron durante 48 h. más antes de tratamiento para la tinción
histoquímica con X-gal. Se hizo el recuento del
número de células teñidas de azul en un microscopio invertido.
En todos los casos las formulaciones de LMD
actuaron mejor que los sistemas MD correspondientes preparados con
los mismos lípidos de colesterol policatiónico (Fig. 10). El orden
en la eficacia de transfección fue LMD(B198) >
LMD(DC-Chol) > LMD(CJE52) >>
LMD(B232). El mismo orden, B198 > DC-Chol
> B232, se observó con los sistemas LD correspondientes.
Los solicitantes examinaron el efecto de la
relación Mu1:ADN (en el intervalo L en la Fig. 7) sobre la actividad
de la transfección.
Se prepararon liposomas catiónicos compuestos de
lípido catiónico B198 y DOPE (3:2 m/m) de la misma manera descrita
en el Ejemplo 4. Se prepararon una serie de mezclas de complejo MD
(relación Mu1:ADN que varía desde 0,3 a 1,2) y se acomplejaron con
un liposoma catiónico. Los sistemas LMD resultantes estaban
compuestos por liposoma:Mu1:ADN (pCMV\beta) en las relaciones de
12:0,3:1, 12:0,6:0,6, 12:0,9:1 y 12:1,2:1 p/p/p respectivamente. Los
tamaños medidos de las partículas LMD fueron aproximadamente de 150
nm.
Se evaluaron las actividades de transfección
in vitro utilizando células Panc-1 (línea
celular de cáncer pancreático humano). Se sembraron las células a
una densidad aproximadamente de 5 \times 10^{4} por pocillo en
una placa de cultivo de 24 pocillos en RPMI enriquecido con FCS al
10% y se cultivaron durante 24 horas en presencia de CO_{2} al 5%
a 37ºC. Se lavaron las células mediante breve exposición a RPMI y a
continuación se trataron con soluciones de complejos LMD,
previamente diluidos con RPMI (concentración final de ADN de 5,0
\mug/ml en todos los casos), durante 30 min. A continuación se
lavaron las células otra vez y se incubaron durante 48 h. más en
RPMI enriquecido con FCS al 10% antes de la recogida y del análisis
de actividad enzimática de \beta-galactosidasa
utilizando un kit de análisis habitual (Promega).
Como se muestra en la Fig. 11 la relación óptima
de liposoma:Mu1:ADN para la transfección de las células
Panc-1 se observó que era 12:0,6:0,6. De otro modo,
se obtuvieron excelentes resultados de transfección con estos
complejos Mu1 LMD en baja proporción.
Para investigar el efecto de la variación de la
relación de lípido catiónico a DOPE así como la relación de lípido
total a Mu1 y ADN, se prepararon una serie de sistemas LMD
utilizando B198 como lípido catiónico preferible. Se prepararon
liposomas compuestos por 60% mol de B198 y 40% mol de DOPE (3:2
m/m), 50% mol de B198 y 50% mol de DOPE (1:1 m/m) y 33% mol de B198
y 67% mol de DOPE (1:2 m/m) y se combinaron con una mezcla de
complejo MD patrón (Mu1:ADN 0,6:1 p/p) en las relaciones indicadas
en la Fig. 12, según el método del Ejemplo 4.
Se prepararon mezclas de complejo liposoma:ADN
(LD) (lipoplexos) para los experimentos de control con una relación
liposoma:ADN de 3:1 (p/p). Se observó que todos los sistemas LMD
tenían un tamaño medio mayor cuando se acomplejaban cantidades
menores de liposomas catiónicos con complejos MD. Sin embargo, el
tamaño de las partículas de LMD compuesto por más de 12 \mumoles
de lípidos/mg de ADN era inferior a 200 nm, mientras que de 12 a 6
\mumoles de lípidos/mg de ADN aumentaba por encima de este valor.
Ocasionalmente, se observó acumulación visible durante la
preparación de sistemas LMD compuestos por 6 \mumoles de
lípidos/mg de ADN.
Se determinaron las actividades de transfección
con células Panc-1 (Fig. 12). Se sembraron las
células a una densidad de aproximadamente 5 \times 10^{4} por
pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos en DMEM enriquecido
con FCS al 10% y se cultivaron durante 24 horas en presencia de
CO_{2} al 5% a 37ºC. Se lavaron las células mediante breve
exposición a DMEM y a continuación se trataron con soluciones que
contenían complejos LMD o LD, previamente diluidos con DMEM
(concentración final de ADN de 5,0 \mug/ml en todos los casos),
durante 2 h. A continuación se lavaron las células otra vez y se
incubaron durante 48 h. más en DMEM enriquecido con FCS al 10% antes
de la recogida y del análisis de actividad enzimática con
\beta-galactosidasa utilizando un kit de análisis
habitual
(Promega).
(Promega).
La actividad de transfección máxima no fue
significativamente diferente con los tres lípidos catiónicos
diferentes a las formulaciones de DOPE analizadas. En el caso de los
sistemas LMD preparados con B198:DOPE (1:2 m/m) se consiguió la
transfección máxima a una relación de liposoma:ADN de
aproximadamente 12,5 \mumoles de lípido/mg de ADN. Las actividades
de transfección de los sistemas LMD preparados con B198:DOPE (3:2
m/m) y liposomas catiónicos B198:DOPE (2:2 m/m) se alcanzaron en
una meseta a relaciones de liposoma:ADN superiores a 12,5 \mumoles
de lípido/mg de ADN. Todos los sistemas LMD analizados tendían a
presentar bajas actividades de transfección a relaciones bajas de
liposoma:ADN (Fig. 12). Se considera que las formulaciones de LMD
compuestas por bajas cantidades de péptido Mu1 necesitarían
cantidades mayores de liposomas catiónicos en comparación con las
formulaciones preparadas con cantidades mayores de péptido Mu1 para
que los respectivos sistemas LMD presenten una actividad de
transfección completa.
La protamina es un péptido catiónico natural
abundante en el esperma de los peces y es potente en la
neutralización y condensación del ADN. La actividad de transfección
de la protamina se comparó con la del péptido Mu1. El péptido Mu1 o
el sulfato de protamina (Sigma, calidad X de salmón) se acomplejó
con ADN (pCMV\beta) y a continuación liposomas catiónicos
(B198:DOPE en una relación de 3:2 m/m) resultando una relación
liposoma:péptido:ADN de 12:0,6:1 (p/p/p).
Se examinaron las actividades de transfección
con células Swiss 3T3. Se sembraron las células a una densidad
aproximadamente de 2 \times 10^{4} por pocillo en una placa de
cultivo de 24 pocillos en DMEM enriquecido con FCS al 10% y se
cultivaron durante 48 horas hasta confluencia completa en presencia
de CO_{2} al 5% a 37ºC. Se lavaron las células mediante breve
exposición a DMEM y a continuación se trataron con soluciones que
contenían complejos LMD o LD, previamente diluidos con DMEM
(concentración final de ADN de 5,0 \mug/ml en todos los casos),
durante 1 ó 2 h. A continuación se lavaron las células otra vez y se
incubaron durante 48 h. más en DMEM enriquecido con FCS al 10% antes
de la recogida. Se determinó el nivel de actividad enzimática con
\beta-galactosidasa con un kit de análisis
habitual (Promega).
Como se representa en la Fig. 13 los complejos
que comprenden péptido Mu1 presentaban mejor transfección de estas
células confluentes que los que comprendían protamina.
Para examinar los efectos de varios péptidos
catiónicos alternativos sobre las actividades de transfección, se
prepararon una serie de complejos liposoma:péptido catiónico:ADN y
se analizaron sus capacidades de transfección relativa in
vitro. Los péptidos utilizados fueron hidrocloruro de polilisina
(peso molecular medio 3.970, Sigma), hidrocloruro de poliarginina
(peso molecular medio 11.800, Sigma) péptido procedente de la
proteína V, pV (p5, secuencia mostrada a continuación), un péptido
análogo de Mu1 (secuencia V mostrada a continuación) y el propio
péptido Mu1. El péptido p5 y el péptido V se sintetizaron utilizando
la misma metodología de síntesis de péptidos en fase sólida que se
utilizó para preparar el péptido Mu1.
Cada péptido se combinó con liposoma catiónico
(DC-Chol:DOPE 3:2 m/m) y ADN (pCMV\beta) en la
relación liposoma:péptido:ADN de 12:0,6:1 (p/p/p) como se describe
en el Ejemplo 4. Se examinaron las actividades de transfección
utilizando células HeLa (células epiteliales humanas). Se sembraron
las células a una densidad aproximadamente de 5 \times 10^{4}
por pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos en DMEM
enriquecido con FCS al 10% y cultivado durante 24 h. en presencia de
CO_{2} al 5% a 37ºC. Las células se lavaron mediante una breve
exposición a DMEM y a continuación se trataron con soluciones que
contenían complejos de LMD o LD, prediluidos con OPTIMEM (Gibco)
(concentración final de ADN de 1,0 \mug/ml en todos los casos),
durante 30 min. A continuación se lavaron las células otra vez y se
incubaron durante 48 h. más en DMEM enriquecido con FCS al 10% antes
de la recogida. Se determinó el nivel de actividad enzimática con
\beta-galactosidasa con un kit de análisis patrón
(quimioluminiscente, Roche).
Como se representa en la Fig. 14, los péptidos
catiónicos procedentes de adenovirus (Mu1 y p5) y el análogo de Mu1
(V) pusieron de manifiesto una excelente actividad de transfección
en comparación con los complejos preparados utilizando los péptidos
catiónicos sintéticos, polilisina y poliarginina.
Secuencias de aminoácidos de los péptidos p5, V
y Mu1
P5; RPRRRATTRRRTTTGTRRRRRRR
V; VRRVHHRRRRVSHRRVRGG
Mu1; MRRAHHRRRRASHRRMRGG
Se prepararon LMD y LD por el mismo método
descrito en el Ejemplo 4, excepto para la utilización de
pCMV\beta. Se preparó el complejo Transfast de ADN (Promega) según
el protocolo del fabricante.
Se evaluaron las actividades de transfección
in vitro utilizando células Panc-1. Se
sembraron las células a una densidad aproximadamente de 5 \times
10^{4} por pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos en RPMI
enriquecido con FCS al 10% y se cultivaron durante 24 horas en
presencia de CO_{2} al 5% a 37ºC. Se lavaron las células mediante
breve exposición a RPMI y a continuación se trataron con soluciones
de complejos LMD o LD, previamente diluidos con RPMI (concentración
final de ADN de 5,0 \mug/ml en todos los casos), durante los
periodos indicados. A continuación se lavaron las células otra vez y
se incubaron durante 48 h. más en RPMI enriquecido con FCS al 10%
antes de la recogida. Se determinó el nivel de actividad enzimática
con \beta-galactosidasa con un kit de análisis
habitual (Promega). La
transfección con el complejo Transfast:ADN se realizo en medio exento de suero (condiciones óptimas) durante 1 h.
transfección con el complejo Transfast:ADN se realizo en medio exento de suero (condiciones óptimas) durante 1 h.
Como se representa en la Fig. 15, LMD presentó
mejor actividad de transfección que el complejo Transfast:ADN y LD.
Estos resultados son completamente coherentes con los hallados con
las células ND-7.
La actividad de transfección de los complejos
LMD se comparó con la de Lipofectamina (Gibco) acomplejada con ADN
utilizando células HBE (células del epitelio bronquial humano).
Se sembraron las células en una placa de cultivo
de 12 pocillos en DMEM enriquecido con FCS al 10% y se cultivaron
durante 24 horas en presencia de CO_{2} al 5% a 37ºC. Se lavaron
las células mediante una breve exposición a DMEM y a continuación se
trataron con solución que contenían complejos LMD (preparados como
en el Ejemplo 4) o LD (preparados a partir de lipofectamina:ADN 12:1
p/p), diluidos previamente con OPTIMEM (Gibco) (concentración de
ADN final de 5,0 \mug/ml en todos los casos), para los periodos
indicados (véase Fig. 16). Se lavaron a continuación las células
otra vez y se incubaron durante 48 h. más en DMEM enriquecido con
FCS al 10% antes del tratamiento de la tinción histoquímica con
X-gal.
LMD presentaba una actividad de transfección
mejor que la lipofectamina (Fig. 16) y presentó una absorción más
rápida por las células HBE. Se observaron resultados similares con
las células ND7 y Panc-1.
Los solicitantes evaluaron las actividades de
transfección en cultivos organotípicos procedentes del cerebro de
rata utilizando un ADN indicador (pCMV\beta) para simular un
modelo in vivo. Se mantuvieron secciones de cerebro en
membranas porosas transparentes y se observaron para mantener su
conectividad y citoestructura intrínsecas en gran medida.
Se prepararon LMD y LD como se muestra en el
Ejemplo 4. LT1 es un reactivo de transfección de poliamina fabricado
por PanVera Co. Se preparó un complejo que contenía liposoma
catiónico (DC-Chol:DOPE, 3:2 m/m),
LT-1 y plásmido pCMV\beta en relación 3:3,2:1
(p/p/p). Se trataron las secciones de cerebro con soluciones que
contenían LMD, LD o liposoma:LT1:ADN durante 2 h. (Murria et al.,
Gene Ther. 1999, 6, 190-197). En todos los casos
no se observaron cambios morfológicos en las secciones durante el
experimento. Tras 48 h. de incubación después de transfección, se
recogieron las células, se tiñeron con X-gal y se
hizo el recuento del número de células azules en una sección (Fig.
17).
A una dosis de ADN de 5,0 \mug (2 ml de
cultivo), LMD proporcionó un número aparentemente mayor de células
teñidas de azul que LD o el complejo LT1 tras la tinción con
X-gal. A una dosis tan baja como 129 ng, LMD
presentó una actividad de transfección considerable, todavía mayor
que la de LD (DC-Chol:DOPE acomplejado con ADN,
relación 3:1 p/p) (dosis de ADN 5,0 \mug). Los solicitantes
encontraron expresión del gen indicador mucho mayor con LMD en
comparación con la transfección mediada por LD y los complejos de
liposoma:LT1:ADN. De hecho, la transfección mediada por LMD fue más
de 19 veces más eficaz que la de LD y más de 4 veces más eficaz que
la de liposoma:LT1:ADN a dosis comparables.
Los solicitantes evaluaron la actividad de
transfección en pulmón de ratón in vivo de LMD (preparado
como se describe en el Ejemplo 4 utilizando
DC-Chol:liposomas catiónicos de DOPE [3:2, m/m] y
plásmido pCF1-CAT], comparando ésta con la actividad
de transfección de liposomas catiónicos
GL-67:DOPE:DMPE-PEG_{5000}
(1:2:0,05 m/m/m) acomplejados con plásmido pCF1-CAT
(LD) (relación liposoma:ADN 5,4:1 p/p) utilizado para ampliar el
efecto en las pruebas clínicas en pulmones (Alton et al.,
Lancet, 1999, 353, 947-954).
Se instiló LMD (concentración de ADN final de
0,14 mg/ml; 100 \mul de volumen; dosis de ADN de 14 \mug) en
los pulmones de ratones Balb/c. Se acomplejó
GL-67:DOPE:DMPE-PEG_{5000}
(1:2:0,05 m/m/m) con plásmido pCF1-CAT
(concentración final de ADN de 0,8 mg/ml; 100 \mul de volumen;
dosis de ADN de 80 \mug) y este complejo LD se instiló igualmente
en los pulmones de ratones Balb/c. Tras 48 horas, se homogeneizaron
los pulmones y se analizó su actividad de CAT. Las barras de error
indican s.e.m.
Los resultados demuestran (Fig. 18) que LMD y el
GL-67 que contienen el sistema LD proporcionan
niveles esencialmente equivalentes de transfección in vivo
aun cuando se administró al sistema LMD una dosis de ADN cinco veces
menor.
Las interacciones no específicas de LMD con el
medio biológico deberían minimizarse para las aplicaciones in
vivo. Por ejemplo, durante las administraciones intravenosas las
interacciones no deseadas con los componentes de la sangre (sales,
proteínas ...) y con células no diana son obstáculos importantes.
Esta opsonización de partículas extrañas con las proteínas del
plasma presenta una de las primeras etapas en el proceso natural de
la eliminación de partículas extrañas por el sistema inmunitario
innato. Para reducir la fijación de proteínas y los agregados
producidos por sales; pueden acoplarse polisacáridos naturales a
LMD. Esta modificación por carbohidrato de LMD puede ser aplicada
también al direccionamiento de LMD a los receptores de
carbohidrato.
Para obtener el efecto deseado, los solicitantes
diseñaron los neoglucolípidos descritos en la Fig. 19. Estos
compuestos están basados en tres dominios distintos.
- ACHx (CJE 52): Este lípido (véase Fig. 9) se seleccionó como plataforma de lípido genérico para los neoglucolípidos deseados. El sistema de anillo alifático del colesterol representa un área muy hidrófoba que inserta en el interior de la capa lipídica de las partículas de LMD o de LD que actúan como anclaje del neoglucolípido.
- Motivo del carbohidrato: La selección de los oligosacáridos se limitó por la complejidad de cualquier química que implique modificaciones por carbohidrato. Los solicitantes decidieron utilizar los carbohidratos maltotetraosa y maltoheptaosa de cadena larga disponible en el mercado como confirmación del principio.
- Enlazador: La utilización de un enlace quimioselectivo demostró eficacia y flexibilidad, permitiendo a los solicitantes sintetizar un intervalo amplio de neoglucolípidos. Esta técnica quimioselectiva estaba basada en una conversión de CJE52 en un lípido hidroxilamino que era capaz de acoplarse directamente a carbohidratos no protegidos. La síntesis de un hidroxilamino CJE52 típico se presenta en la Figura 20 - Esquema 1 y el acoplamiento del resto carbohidrato en el enlazador está basado en la glucosilación de una hidroxilamina O-sustituida (el principio de la reacción con la glucosa se ilustra en la Figura 21 - Esquema 2). Siguiendo esta estrategia, se acoplaron la maltotetraosa y la maltoheptaosa para obtener los compuestos GLU4 y GLU7 (Estructura en la Fig. 22).
La glucomodificación de LMD se basó en la
capacidad natural de las micelas de neoglucolípido para disociar y
liberar los lípidos que se incorporan en las membranas de LMD. En
primer lugar, se formularon LMD procedentes de liposomas catiónicos
DC-Chol:DOPE, péptido Mu1 y plásmido pCMV\beta
como se describe en el Ejemplo 4. A continuación, se añadió una
suspensión de micelas de neoglucolípido en tampón Hepes, pH 7,0 a
mezclas de LMD y el conjunto se incubó durante 30 min. a 20ºC antes
del almacenamiento a -80ºC (Fig. 23).
Estabilización de neoglucolípidos de LMD: el
efecto de la estabilización del LMD modificado por neoglucolípidos
se evaluó mediante la incorporación de 7,5% mol de GLU4 o GLU7 en
LMD. La capa lipídica de los sistemas LD se sabe que se agrega
después de la exposición a la sal. Por consiguiente, se evaluaron
los tamaños de las partículas de LD (concentración final de ADN de 1
\mug/ml) después de 30 min. a 37ºC en OPTIMEM por espectroscopía
de correlación de fotones (N4 plus, Coulter). Se utilizó análisis
unimodal para evaluar el tamaño de partícula medio. El aumento del
porcentaje medio en el tamaño de las partículas de LD se presenta
(Fig. 24). Se siguió el mismo procedimiento para el sistema LMD
básico, LMD(GLU4) y LMD(GLU7) (concentraciones finales
de ADN de 1 \mug/ml).
Los resultados indican que LMD es más estable
que LD en solución pero también demuestran que la presencia de GLU4
y GLU7 presenta un aumento del efecto de estabilización
antiagregación en las partículas LMD en 7,5% mol.
Eficacia de transfección in vitro: se
determinó la actividad de transfección con células Hela sembradas a
razón de 5 \times 10^{4} células por pocillo en placas de
cultivo de 24 pocillos y se cultivaron hasta aproximadamente el 70%
de confluencia en DMEM enriquecido con FCS a 37ºC y en presencia de
CO_{2} al 5%. Se lavaron las células en PBS y a continuación se
trataron con soluciones que contenían complejos de LMD, se diluyeron
previamente con DMEM que contenía FCS a los porcentajes (%)
indicados (concentración final de ADN de 5,0 \mug/ml en todos los
casos), durante 30 min. Se lavaron más las células y a continuación
se incubaron durante 48 h. más en medio normal (NGM) antes de la
recogida. Se determinó el nivel de expresión de
\beta-galactosidasa con un kit de análisis normal
(quimioluminiscente, Roche).
Los resultados indican un aumento de la eficacia
de transfección debido a la modificación con azúcar en condiciones
de suero tanto del 0% como del 50% (Fig. 25).
Los solicitantes han demostrado anteriormente
que los liposomas de DC-Chol/DOPE son eficaces en la
transfección de la línea celular ND7 derivada neuronalmente ^{31}.
DC-Chol se ha utilizado con éxito fuera del SNC en
una variedad de tejidos y ha experimentado pruebas clínicas para
tratamientos de terapia génica de fibrosis quística ^{33, 34}.
Además, los liposomas de DC-Chol han demostrado que
no presentan efectos secundarios citotóxicos ^{35, 36}. Por estas
razones los solicitantes desean desarrollar formulaciones mejores de
estos liposomas para su utilización en las neuronas.
Los solicitantes describen en la presente
memoria la utilización de una proteína codificada por virus para la
transfección celular. Los solicitantes descubrieron que cuando se
utilizaba Mu1 en combinación con el liposoma catiónico
DC-Chol/DOPE era capaz de mejorar de forma
significativa la transfección celular. Este efecto era más probable
debido a la capacidad de Mu1 para condensar pADN y podría
optimizarse variando las relaciones de polipéptido, pADN y liposoma
catiónico. De manera significativa, el aumento de la eficacia de
transfección fue más acusado en las células diferenciadas. Como se
mencionó anteriormente, las células ND7 procedían de las DRG
primarias. La diferenciación de las células ND7 produce un fenotipo
simular a sus neuronas sensitivas periféricas paternas que comprende
la producción de excrecencia de neuritas, una reducción de la
proliferación general y una reducción de la
transfectabili-
dad ^{28,37}. Un aumento en la eficacia de la transfección en las ND7 diferenciadas puede reflejar un aumento de capacidad para activar las transfecciones en las neuronas primarias o in vivo.
dad ^{28,37}. Un aumento en la eficacia de la transfección en las ND7 diferenciadas puede reflejar un aumento de capacidad para activar las transfecciones en las neuronas primarias o in vivo.
El éxito de los vehículos no víricos de
administración génica como alternativas viables para los sistemas de
virus basados en vectores depende del desarrollo de complejos con
eficacias de transfección de mayor duración o más prolongada. Desde
la identificación inicial de los liposomas catiónicos como vehículos
para la transferencia de material genético en el interior de las
células ha existido un gran impulso para desarrollar mejores
formulaciones de liposomas catiónicos ^{5,7}. La mayoría de los
intentos en la mejora de los liposomas catiónicos se ha basado en
modificaciones estructurales en la propia molécula ^{30}. Se han
desarrollado nuevas formulaciones que han mejorado las eficacias de
transfección ^{30}. Sin embargo, determinados tipos de células se
comportan de forma diferente con respecto a la transfección de
liposomas catiónicos. Por ejemplo, los solicitantes han descubierto
que el polipéptido Mu1 es mejor en la potenciación de la
transfección mediada por liposoma catiónico que Vp1. Esto era debido
probablemente a la mayor relación de carga de Mu1. Aunque ambos
péptidos son aproximadamente del mismo peso molecular, la relación
de carga general de Mu1 fue más de dos veces la del Vp1 (Tabla 1).
Por lo tanto, Mu1 fue capaz de retardar la movilidad electroforética
del ADN del plásmido en menos de 1/60º de la concentración
demostrando cómo ajustadamente Mu1 es capaz de unirse al ADN. Aunque
un pequeño desplazamiento en la movilidad de pADN se detectó cuando
se acomplejó 0,25 \mug de Mu1 con 1 \mug de pCMV\beta, casi
todo el plásmido se mantuvo cerca del pocillo de carga después de la
adición de 0,5 \mug de Mu1 (Figura 1). Una relación 0,5/1,0 (p/p)
de Mu1 a pCMV\beta corresponde a una relación molar 1.000/1. Cada
molécula de Mu1 contiene 12 restos que podrían llevar potencialmente
una carga positiva. La relación de carga teórica de Mu1 a
pCMV\beta sería entonces 1,6 (12.000 cationes de Mu1 a 7.500
aniones de pCMV\beta). Esta relación neutralizaría completamente
las cargas negativas en pCMV\beta retardando completamente de este
modo su migración como se observa.
Una comparación directa entre la cantidad de Mu1
que retardó de manera significativa la migración del ADN del
plásmido y que aumentó óptimamente las transfecciones no pudo
realizarse ya que el método de preparación era diferente. Se
prepararon complejos para transfección
péptido-pADN-liposoma en volúmenes
mayores (véase Materiales y Métodos). Aunque tardó 24 veces la
cantidad de Mu1 (12 \mug/1 \mug de pCMV\beta) para conseguir
el aumento óptimo de las eficacias de transfección realizadas, para
retardar la migración en un gel de agarosa, la concentración en la
solución fue similar (25 ng/ml, retardo del pADN; 30 ng/ml,
transfecciones óptimas). La presencia de Mu1 también alteró las
interacciones de pADN del liposoma catiónico. La relación óptima de
DC-Chol-DOPE a pCMV\beta en
presencia de Mu1 fue 6/1, dos veces la hallada óptima anteriormente
en células neuronales ^{31, 38}. Teóricamente la cantidad de Mu1
utilizado habría neutralizado completamente las cargas positivas en
pCMV\beta, lo que habría evitado más acomplejamiento con
DC-Chol/DOPE. Claramente éste no era el caso dado
que podrían obtenerse muchas eficacias de transfección mejoradas. Es
probable que no todos los aminoácidos cargados posibles estuvieran
protonados en las condiciones del tampón. No está claro por qué se
necesitan más liposomas catiónicos y los solicitantes están
trabajando actualmente para estudiar esta cuestión.
Por último debe hacerse una puntualización con
respecto a la señal de localización nuclear impregnada con Vp1.
Pruebas recientes en el laboratorio de los solicitantes
(observaciones no publicadas) y en otros ^{10, 11, 39, 40} han
sugerido que el transporte nuclear de material transfectado puede
ser ineficaz en la lipofección. Por esta razón se han realizado
intentos para precondensar ADN con secuencias peptídicas que
contienen policationes que se sabe que presentan capacidades de
localización nuclear con ayuda de la absorción nuclear mejor del ADN
transfectado ^{17, 20, 22}. Los solicitantes han descubierto sin
embargo, que las propiedades de condensación del ADN más eficaces de
Mu1 tienen mayor consideración que la capacidad de localización
nuclear de Vp1 desde el punto de vista de la mejora de las eficacias
de transfección. Asimismo, Fritz et al., ^{22} no hallaron
ninguna diferencia en las eficacias de transfección entre la histona
humana recombinante (H1) y una versión modificada que contenía la
secuencia de localización nuclear del antígeno T grande SV40. Otros
estudios han sugerido que la presencia de una NLS mejora la
acumulación nuclear del pADN transfectado mediante la serie de
reacciones intracelulares específicas ^{41, 42}.
1. Wood MJA et al. Inflammatory
effects of gene-transfer into the CNS with defective
HSV-1 vectors. Gene Ther 1994;
1: 283-291.
2. Byrnes AP et al. Adenovirus
gene-transfer causes inflammation in the brain.
Neuroscience 1995; 66:
1015-1024.
3. Naldini L et al. In vivo gene
delivery and stable transduction of nondividing cells by a
lentiviral vector [ver comentarios]. Science 1996;
272: 263-267.
4. Miller AD. Cationic liposomes for gene
delivery. Angewandte Chemie-International Edition
1998; 37: 1769-1785.
5. Lee RJ, Huang L. Lipidic vector
systems for gene transfer. Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems 1997; 14: 173-206.
6. Gao X, Huang L. Cationic
liposome-mediated gene-transfer.
Gene Ther 1995; 2: 710-722.
7. Felgner PL et al. Lipofection -
a Highly Efficient, Lipid-Mediated
Dna-Transfection Procedure. Proceedings Of the
National Academy Of Sciences Of the United States Of America
1987; 84: 7413-7417.
8. Farhood H, Serbina N,
Huang L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in
cationic liposome mediated gene transfer. Biochim Biophys
Acta 1995; 1235: 289-295.
9. Caplen NJ et al.
In-vitro liposome-mediated DNA
transfection of epithelial-cell lines using the
cationic liposome DC-Chol/DOPE. Gene Ther
1995; 2: 603-613.
10. Labat-Moleur F et
al. An electron microscopy study into the mechanism of gene
transfer with lipopolyamines. Gene Ther 1996;
3: 1010-1017.
11. Zabner J et al. Cellular and
molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid J Biol
Chem 1995; 270: 18997-19007.
12. Felgner JH et al. Enhanced
Gene Delivery and Mechanism Studies With a Novel Series Of Cationic
Lipid Formulations. J Biol Chem 1994; 269:
2550-2561.
13. Sahenk Z et al. Gene Delivery
to Spinal Motor Neurons. Brain Res 1993; 606:
126-129.
14. Iwamoto Y et al.
Liposome-Mediated Bdnf Cdna Transfer In Intact and
Injured Rat-Brain. Neuroreport 1996;
7: 609-612.
15. Roessler BJ, Davidson BL. Direct
plasmid-mediated transfection of adult murine
brain-cells in-vivo using
cationic liposomes. Neurosci Lett 1994; 167:
5-10.
16. Zhou X, Huang L. DNA
transfection mediated by cationic liposomes containing
lipopolylysine: characterization and mechanism of action. Biochim
Biophys Acta 1994; 1189:
195-203.
17. Sorgi FL, Bhattacharya S,
Huang L. Protamine sulfate enhances
lipid-mediated gene transfer. Gene Ther
1997; 4: 961-968.
18. Li S, Huang L. Protamine
sulfate provides enhanced and reproducible intravenous gene transfer
by cationic liposome/DNA complex Journal of Liposome Research
1997; 7: 207-219.
19. Vitiello L et al. Condensation
of plasmid DNA with polylysine improves
liposome-mediated gene transfer into established and
primary muscle cells. Gene Ther 1996; 3:
396-404.
20. Namiki Y, Takahashi T,
Ohno T. Gene transduction for disseminated intraperitoneal
tumor using cationic liposomes containing
non-histone chromatin proteins: cationic liposomal
gene therapy of carcinomatosa Gene Ther 1998;
5: 240-246.
21. Gao X, Huang L. Potentiation
of cationic liposome-mediated gene delivery by
polycations. Biochem 1996; 35:
9286-9286.
22. Fritz JD et al. Gene transfer
into mammalian cells using histone-condensed plasmid
DNA. Hum Gene Ther 1996; 7:
1395-1404.
\newpage
23. Hagstrom JE et al. Complexes
of non-cationic liposomes and histone H1 mediate
efficient transfection of DNA without encapsulation. Biochim
Biophys Acta 1996; 1284:
47-55.
24. Isaka Y et al. The HVJ
liposome method Exp-Nephrol 1998; 6:
144-147.
25. Gillock ET et al. Polyomavirus
major capsid protein VP1 is capable of packaging cellular DNA when
expressed in the baculovirus system. J-Virol
1997; 71: 2857-2865 issn:
0022-2538x.
26. Chang D, Cai X,
Consigli RA. Characterization of the DNA binding properties
of polyomavirus capsid proteins. Journal of Virology
1993; 67: 6327-6331.
27. Anderson CW, Young ME,
Flint SJ. Characterization of the adenovirus 2 virion
protein, mu. Virology 1989; 172:
506-512.
28. Wood JN et al. Novel
Cell-Lines Display Properties of Nociceptive Sensory
Neurons. Proceedings of the Royal Society of London Series
B-Biological Sciences 1990; 241:
187-194.
29. Budhrammahadeo V, Lillycrop
KA, Latchman DS. The Levels of the Antagonistic Pou Family
Transcription Factors Brn- 3a and Bm-3b in Neuronal
Cells Are Regulated in Opposite Directions By Serum
Growth-Factors. Neurosci Lett 1995;
185: 48-51.
30. Cooper RG et al. Polyamine
analogues of 3
beta-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbomoyl]cholesterol
(DC-Chol) as agents for gene delivery.
Chemistry-a European Journal 1998; 4:
137-151.
31. McQuillin A et al.
Optimization of liposome mediated transfection of a neuronal cell
line. Neuroreport 1997; 8:
1481-1484.
32. Hosokawa K, Sung MT. Isolation
and characterization of an extremely basic protein from adenovirus
type 5. Journal Of Virology 1976; 17:
924-934..
33. Caplen NJ et al.
Liposome-Mediated Cftr Gene-Transfer
to the Nasal Epithelium of Patients With
Cystic-Fibrosis. Nature Med 1995;
1: 39-46.
34. Nabel G, Chang A, Nabel
E. Clinical, Protocol: Immunotherapy of malignancy by in vivo
gene transfer into tumors. Hum Gene Ther 1992;
3: 399-410.
35. Nabel GJ et al. Direct
gene-transfer with DNA liposome complexes in
melanoma-expession, biological activity, and lack of
toxicity in humans. Proc Natl Acad Sci USA 1993;
90:11307-11311.
36. Stewart MJ et al.
Gene-transfer in vivo with DNA liposome
complexes-safety and acute toxicity in mice. Hum
Gene Ther 1992; 3: 267-275.
37. Murray KD et al.
DC-Chol/DOPE mediated transfections in
differentiated sensory neurons. In preparation
1999.
38. Murray KD et al. Cationic
liposome-mediated transfection in organotypic
explant cultures. Gene Ther 1999; 6:
190-197.
39. Thierry AR et al.
Characterization of liposome-mediated gene delivery:
Expression, stability and pharmacokinetics of plasmid DNA Gene
Ther 1997; 4: 226-237.
40. Coonrod A, Li FQ,
Horwitz M. On the mechanism of DNA transfection: efficient
gene transfer without viruses. Gene Ther 1997;
4: 1313-1321.
41. Sebestyen MG et al. DNA vector
chemistry: the covalent attachment of signal peptides to plasmid DNA
Nat Biotechnol 1998; 16: 80-85.
42. Hagstrom JE et al. Nuclear
import of DNA in digitonin-permeabilized cells.
J Cell Sci 1997; 110 (Pt 18):
2323-2331:
Claims (12)
1. Vector para la administración de ácido
nucleico no vírico que comprende un complejo de polipéptido/ácido
nucleico condensado y un lípido catiónico, en el que el complejo
comprende
- (a)
- una secuencia de ácido nucleico de interés (NOI); y
- (b)
- uno o más polipéptidos adenovíricos Mu1 o polipéptidos homólogos con por lo menos 60% de identidad con los mismos, siendo dichos polipéptidos o dichos homólogos de los mismos (i) capaces de unirse a la NOI; y (ii) siendo capaces de condensar la NOI; y en el que la NOI es heteróloga con uno o más polipéptidos.
2. Vector según la reivindicación 1, que
comprende además un polipéptido que comprende una secuencia de
localización nuclear (NLS).
3. Vector según la reivindicación 2, en el que
el polipéptido que comprende una secuencia de localización nuclear
(NLS) es pV adenovírico o un derivado del mismo.
4. Complejo de polipéptido/ácido nucleico
condensado que comprende un lípido catiónico, un componente
polipeptídico y un componente de ácido nucleico, destinado a ser
utilizado para administrar el componente del ácido nucleico a un
núcleo de una célula eucariótica, en el que
- (a)
- el componente polipeptídico es un polipéptido adenovírico Mu1 o un polipéptido homólogo con por lo menos 60% de identidad con el mismo;
- (b)
- el componente polipeptídico o dicho homólogo del mismo es capaz de unirse al NOI; y
- (c)
- el componente polipeptídico o dicho homólogo del mismo es capaz de condensar el NOI;
y en el que el ácido nucleico es
heterólogo al
polipéptido.
5. Complejo según la reivindicación 4, que
comprende además un polipéptido que comprende una secuencia de
localización nuclear (NLS).
6. Complejo según la reivindicación 5, en el que
el polipéptido que comprende una secuencia de localización nuclear
(NLS) es pV adenovírico o un derivado del mismo.
7. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que la relación
liposoma:NOI:polipéptido es
2-20:1:0,5-1, preferentemente
10-14:1:0,5-0,7, más preferentemente
aproximadamente 12:1:0,6.
8. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, en el que el complejo es inferior a 200 nm
de diámetro.
9. Método de producción de un vector para la
administración de ácido nucleico no vírico que comprende un lípido
catiónico y un complejo de polipéptido/ácido nucleico condensado,
comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
- (a)
- poner en contacto una secuencia de ácido nucleico de interés (NOI) con un polipéptido Mu1 o con un polipéptido homólogo con por lo menos 60% de identidad con el mismo, siendo dicho componente polipeptídico o dicho homólogo del mismo (i) capaz de unirse al NOI; y (ii) capaz de condensar el NOI; y en el que el NOI es heterólogo al polipéptido; y
- (b)
- poner en contacto el complejo de ácido nucleico/polipéptido formado de este modo con un lípido catiónico.
10. Método de introducción de una secuencia de
ácido nucleico de interés (NOI) en una célula eucariótica,
comprendiendo dicho método poner en contacto la célula in
vitro con un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 4
a 8, en el que el complejo comprende la NOI.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
la célula es una célula neuronal, una célula cancerosa o una célula
epitelial.
12. Utilización de un polipéptido adenovírico
Mu1 o de un polipéptido homólogo con por lo menos 60% de identidad
con el mismo para la preparación de un vector para la administración
de ácido nucleico como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
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Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0118517D0 (en) * | 2001-07-30 | 2001-09-19 | Mitsubishi Tokyo Pharm Inc | Compound |
| DE60232258D1 (de) * | 2001-08-29 | 2009-06-18 | Aventis Pharma Sa | Lipid-aminoglykosid konjugate zur transfektion |
| FR2829136B1 (fr) * | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques d'aminoglycosides |
| MXPA05013746A (es) | 2003-06-18 | 2006-06-27 | Yissum Res Dev Co | Conjugados de esfingoide-polialquilamina para vacunacion. |
| US7906122B2 (en) | 2003-06-18 | 2011-03-15 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jersusalem | Sphingoid polyalkylamine conjugates for Hepatitis B virus vaccination |
| GB0418172D0 (en) * | 2004-08-13 | 2004-09-15 | Ic Vec Ltd | Vector |
| WO2007061762A2 (en) * | 2005-11-18 | 2007-05-31 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Healt And Human Services | Non-viral gene delivery complex |
| WO2008052766A2 (en) * | 2006-11-03 | 2008-05-08 | Medigene Ag | Cationic colloidal carriers for delivery of active agents to the blood-brain barrier in the course of neuroinflammatory diseases |
| EP2080767A4 (en) * | 2006-11-09 | 2012-03-28 | Daiichi Sankyo Co Ltd | COMPOSITION FOR INTRODUCING NUCLEIC ACID |
| EP2105145A1 (en) | 2008-03-27 | 2009-09-30 | ETH Zürich | Method for muscle-specific delivery lipid-conjugated oligonucleotides |
| WO2010042751A2 (en) * | 2008-10-08 | 2010-04-15 | Chimeros Inc. | Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same |
| HUE037082T2 (hu) * | 2008-11-10 | 2018-08-28 | Arbutus Biopharma Corp | Új lipidek és készítmények terápiás hatóanyagok szállítására |
| WO2010120874A2 (en) * | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Chimeros, Inc. | Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same |
| CA2847888A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Biomed Realty, L.P. | Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins |
| EP2788006B1 (en) | 2011-12-07 | 2026-01-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Biodegradable lipids for the delivery of active agents |
| SMT202200502T1 (it) | 2014-06-25 | 2023-01-13 | Acuitas Therapeutics Inc | Nuovi lipidi e formulazioni di nanoparticelle lipidiche per l'erogazione di acidi nucleici |
| US20180303925A1 (en) | 2015-04-27 | 2018-10-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleoside-Modified RNA For Inducing an Adaptive Immune Response |
| LT3313829T (lt) | 2015-06-29 | 2024-08-12 | Acuitas Therapeutics Inc. | Lipidai ir lipidų nanodalelių sudėtys, skirtos nukleorūgščių tiekimui |
| JP2018532404A (ja) * | 2015-10-14 | 2018-11-08 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | リボ核タンパク質トランスフェクション薬剤 |
| IL307179A (en) | 2015-10-28 | 2023-11-01 | Acuitas Therapeutics Inc | Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
| WO2017212006A1 (en) * | 2016-06-09 | 2017-12-14 | Curevac Ag | Hybrid carriers for nucleic acid cargo |
| WO2017212009A1 (en) | 2016-06-09 | 2017-12-14 | Curevac Ag | Hybrid carriers for nucleic acid cargo |
| CN115252807A (zh) * | 2016-07-27 | 2022-11-01 | 利兰斯坦福初级大学董事会 | 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物 |
| US12491261B2 (en) | 2016-10-26 | 2025-12-09 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle formulations |
| WO2018132537A1 (en) | 2017-01-11 | 2018-07-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleoside-modified rna for inducing an immune response against zika virus |
| WO2018191657A1 (en) | 2017-04-13 | 2018-10-18 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for delivery of active agents |
| JP7464954B2 (ja) | 2017-04-27 | 2024-04-10 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | Ｃ型肝炎ウイルスに対するヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ－脂質ナノ粒子系統ワクチン |
| WO2018200943A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
| CA3073020A1 (en) | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for use in lipid nanoparticle formulations |
| WO2019036028A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Acuitas Therapeutics, Inc. | LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS |
| US11524932B2 (en) | 2017-08-17 | 2022-12-13 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for use in lipid nanoparticle formulations |
| EP3668834B1 (en) | 2017-08-17 | 2024-10-02 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for use in lipid nanoparticle formulations |
| IL281615B2 (en) | 2018-09-21 | 2026-01-01 | Acuitas Therapeutics Inc | Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes |
| JP7543259B2 (ja) | 2018-10-18 | 2024-09-02 | アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド | 活性剤の脂質ナノ粒子送達のための脂質 |
| MY202837A (en) | 2019-01-11 | 2024-05-24 | Acuitas Therapeutics Inc | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
| JP7630904B2 (ja) * | 2019-07-23 | 2025-02-18 | 株式会社東芝 | 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法 |
| CN110408656A (zh) * | 2019-07-29 | 2019-11-05 | 成都朴名生物科技有限公司 | 脂多聚物体及其制备方法、采用脂多聚物体将基因编辑质粒导入真核细胞的方法 |
| CN110452303B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-03-04 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用 |
| CN111394313A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-07-10 | 河南科技学院 | 一种人造细胞及其制备方法 |
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