CZ299032B6

CZ299032B6 - Konjugátorový systém

Info

Publication number: CZ299032B6
Application number: CZ20023164A
Authority: CZ
Inventors: H. Larsen@Roy; Henriksen@Gjermund
Original assignee: Anticancer Therapeutic Inventions As
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2008-04-09
Also published as: MXPA02008110A; AU2001237827B2; KR100822566B1; AU3782701A; US6592843B2; EP1257299A2; EP1257299B1; ATE300316T1; AU2001237827B8; EA005624B1; ES2247069T3; EA200200793A1; NZ520848A; PL358541A1; WO2001060417A2; PL201398B1; CA2400994C; KR20020092963A; WO2001060417A3; CZ20023164A3

Abstract

Konjugátorový systém obsahující liposomy s ionofory a s roztokem chelátoru a radionuklidem nebo nuklidy emitujícími cástice alfa uvnitr liposomu. Dále se popisuje zpusob prípravy tohoto typu radioaktivních liposomu stejne jako použití tohoto systémupro výrobu farmaceutického roztoku vhodného pro radiofarmaceutickou terapii, zvlášte pak pro lécenírakoviny a kit pro jeho prípravu.

Description

(57) Anotace:

Konjugátorový systém obsahující liposomy s ionofory a s roztokem chelátoru a radionuklidem nebo nuklidy emitujícími částice alfa uvnitř liposomu. Dále se popisuje způsob přípravy tohoto typu radioaktivních liposomů stejně jako použití tohoto systému pro výrobu farmaceutického roztoku vhodného pro radiofarmaceutickou terapii, zvláště pak pro léčení rakoviny a kit pro jeho přípravu.

(O

Z 299032 Β

Konjugátorový systém

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká konjugátorového systému obsahujícího liposomy s ionofory a s chelátorem umístěným uvnitř liposomů, kde liposomy jsou stabilně značené těžkými radionuklidy emitujícími α-částice. Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy konjugátorového systému a použití tohoto systému a kitu pro přípravu konjugátorového systému.

Dosavadní stav techniky

Biomedicínské aplikace radionuklidů při protirakovinné léčbě se dosud soustředily na použití kationtových nebo aniontových sloučenin, například [¹³¹I]jodidu proti rakovině štítné žlázy a ⁸⁹Sr pro paliativní léčbu bolesti způsobené metastázami rakoviny kostí a použití radionuklidů emitujících většinou beta záření navázaných na monoklonální protilátky (DeVita Jr. V. T., Hellman S., Rosenberg S. A., Cancer. Principles & practice of oncology, 5. vydání, Lippincot-Raven, Philadelphia, New York, USA (1997)).

Použití cílené radionuklidové terapie proti rakovině je založené na schopnosti nalézt způsoby pro navázání radionuklidů na nosné sloučeniny specifické pro tumory (Gáze Μ. N. The current status of targeted radiotherapy in clinical practice. Phys. Med. Bol. 41, 1895 - 1903 (1996)). V současnosti nemohou být některé radionuklidy s použitelnými radiačními vlastnostmi využity při cíle25 ném působení na tumory, protože jsou problémy s vytvořením chemicky stabilní vazby mezi radionuklidem a nosnou sloučeninou. Nové nosné systémy však mohou rozšířit jak využití radioizotopů, tak i škálu radionuklidů použitelných pro léčení (Gáze, 1996, výše).

Liposomy s nebo bez skupin s afinitou pro receptory navázaných na povrch byly již pro účely dodávání léčiv testovány, a v současnosti se klinicky používají pro dodávání chemoterapeutik u některých forem rakoviny. V poslední době vedl vývoj ve výzkumu liposomů k novým verzím s farmakokinetickými vlastnostmi, které by mohly vést k využití těchto sloučenin jako nosičů pro radionuklidy pro vnitřní radioterapii proti rakovině (Gabison A. Liposome circulation time and tumor targeting: Implication for cancer chemotherapy, Adv. Drug Delivery Rev. 16, 285 - 294 (1995)). Tento poslední vývoj ve formulaci a výrobě liposomů vedl k vytvoření malých váčků o rozměrech méně než 100 nm s prodlouženou dobou cirkulace, protože velikost liposomů je možno lépe posunovat směrem k malým průměrům použitím technologie extruze přes membrány. Navíc snížilo zavedení liposomů s naroubovaným polyethylenglykolem (PEG) interferenci s plazmatickými proteiny, a tak došlo ke snížení rozpoznávání a vylučování makrofágy retikulo40 endoteliálního systému (Maruyama K., Takizawa T., Takahashi N., Tagawa T., Nagaike K. a Iwatsuru M. Targeting efficienty of PEG-immunoliposome-konjugated antibodies at PEG terminals. Adv. Drug Delivery Rev. 24, 235 - 242 (1997)). Tak bylo dosaženo zvýšené míry příjmu do tumorů v důsledku prodloužené koncentrace v krvi. Dalšího zvýšení příjmu do tumorů bylo dosaženo konjugací molekul s afinitou k receptorům, například monoklonálních protilátek nebo folátu, na povrch liposomů. Několik studií dále ukázalo výhodu použití PEG jako propojovací skupiny mezi liposomem a směrovacím (targeting) ligandem, které může rovněž zlepšit dostupnost receptoru (např. Maruyama a další, 1997, výše; Gabizon R., Horowitz A. T., Goren D., Tzemach D., Mandelbaum-Shavit F., Quasen Μ. M., a Zalipsky S. Targeting Folate receptor with folate linked to extremities of poly(ethylenglycol)-graflted liposomes: In vitro stu50 dies. Biokonjugate Chem. 10, 289 - 298 (1999); Lee R. J. a Low P. S. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 269, 3198 - 3204 (1994)).

Liposomy byly již dříve studovány jako nosiče pro radioizotopy (Groins B., Phillips W. T.

a Klipper R. Repeat injection studies of technetium-99m labeled PEG-liposomes in the same

-1 CZ 299032 B6 animal. J. Liposome Res. 8(2), 265 - 281 (1998); Turner A. F., Presant C. A., Proffitt R. T., Wiliams L. E., Winsor D. W. a Werner J. L. In—111-labeled liposomes: Dosimetry and tumor depiction. Radiology 166(3), 761 - 765 (1988)). Pikul II S. S., Parks N. J„ Schneider P. D. In vitro killing of melanoma by liposome delivered intracellular irradiation. Arch. Surg. 122,

1417- 1420 (1987) zveřejnili studii založenou na pasivně inkorporovaném ²¹²Pb-dextranu (tj. ²¹²Pb-dextran byl přidán během tvorby liposomů a frakce ²¹²Pb-dextranu byla vložena spolu s vodnou fází, která tvoří vnitřek liposomů). Autoři nenavrhovali, že by tyto liposomy byly vhodné pro léčbu rakoviny, ale liposomy byly primárně používány pro studium intracelulámího usmrcování buněk radioisotopy. Nebyly zveřejněny žádné údaje o osudu ^2l2Bi vytvořeného rozpadem ío ²¹²Pb, a velikost těchto liposomů byla řádově 350 až 500 nm, což je značná velikost v porovnání s velikostí (přibližně 100 nm), kteráje v současnosti považována za optimální pro léčbu tumorů in vivo (Forssen E. A., The design a development of DaunoXome® for solid tumor targeting in vivo. Adv. Drug Delivery Rev. 24, 133- 150 (1997)). Uvedené liposomy také neobsahovaly v membráně PEG.

Ogihara-Umeda I., Sasaki T., Kojima S., Nishigori H. Optimal radiolabeled liposomes for tumor imaging. J. Nucl. Med. 37(2), 26- 332 (1996) používali liposomy jako nosiče pro radionuklidy emitující gama-záření ⁶⁷Ga, ⁿⁱIn a ^99mTc, a navrhovali použití radioaktivně značených liposomů pro zobrazování.

V teoretické studii navrhovali Kostarelos K., Emfietzoglou D. a Stamatelou M. Liposomemediated delivery of radionuclides to tumor models for cancer radiotherapy: A quantitative analysis. J. Liposome Res. 9(3), 407 - 424 (1999) použití liposomů značených potenciálně terapeutickými radionuklidy ¹³¹1,⁶⁷Cu, ¹⁸⁸Re a ²¹¹At, ale nebyly navrženy chemické postupy pro přípravu radioaktivně značených liposomů.

Dokument EP 386 146 Bl popisuje prostředek a způsob použití sloučenin zapouzdřených do liposomů pro léčení tumorů záchytem neutronů. Tyto liposomy však obsahovaly stabilní prvky (např. bor), které se staly radioaktivními pouze po aktivaci, a tyto liposomy neobsahovaly ani ionofory, ani chelatační látky.

Utkhede D., Yeh V., Szucs M. a Tilcock C. Uptake of Yttrium-90 into lipid vesicles. Jour. Lip. Res. 4(2). 1049 - 1061 (1994) popisují liposomy s vloženým ⁹⁰Y a DTPA jako chelátorem, což je odlišný chelátor ve srovnání s chelátory popisovanými v předkládaném vynálezu. Navíc se nepo35 pisuje retence mateřských/dceřinných nuklidů a navíc není ⁹⁰Y těžký prvek jako prvky popisované v předkládané přihlášce.

Dosažení dostatečně stabilního radioaktivního značení nosičů těžkými radionuklidy emitujícími záření alfa obvykle vyžaduje specifické chemické postupy vytvořené tak, aby vyhovovaly chemickým vlastnostem každého prvku, a tyto metody nejsou známé. Nelze očekávat, že postupy používané pro radioaktivní značení např. Ga, In, Te, Cu nebo Re mohou být kompatibilní s těžkými radionuklidy (atomová hmotnost vyšší než 150) v kationtové formě emitujícími záření alfa, jako je například ^212/213Bi, ²¹²Pb, ^223/224Ra, ²²⁷Th nebo ²²⁵Ac.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnutí konjugátorového systému radionuklidliposom, s nebo bez skupin s afinitou k receptorům, který (1) zahrnuje v sobě chelátor a těžký radionuklid nebo nuklidy, které emitují záření alfa částic, (2) může zadržet dceřinný nuklid nebo nuklidy, jestliže je v liposomů inkorporován mateřský nuklid nebo nuklidy, a

-2CZ 299032 B6 (3) může být připraven postupem aktivní inkorporace použitelným pro větší počet radionuklidů, stejně jako použití tohoto systému a kit pro přípravu tohoto systému. Tyto předměty byly dosaženy předkládaným vynálezem a jsou charakterizovány přiloženými nároky.

Předkládaný vynález se týká konjugátorového systému obsahujícího liposomy s ionofory, tj. prostředky extrahující kov do liposomů, a s chelátorem a těžkým radionuklidem nebo nuklidy (atomová hmotnost vyšší než 150) umístěnými uvnitř liposomů. Liposomy se připravují použitím aktivní inkorporace radionuklidu, tj. prostřednictvím ionoforů, přičemž se použije způsobů ío poskytujících liposomy s velikostí typicky 100 nm. Získaný produkt má dobrou chemickou stabilitu po dobu několika dnů a může také uvnitř liposomů zachytit dceřinný nuklid nebo nuklidy, například pocházející z přeměny ^2!2Pb na ²¹²Bi. Liposomy mohou být připraveny s nebo bez modifikujících skupin jako polyalkylenoxidy, například PEG, navázanými na membránu. Autoři zde také popisují způsob navázání těchto radioaktivně značených liposomů na proteiny vyhledá15 vající tumory, jako jsou například monoklonální protilátky konjugované s folátem.

Předkládaný vynález bude nyní podrobněji popsán s odkazy na následující obrázky a příklady.

Pro vyvinutí radioaktivně značených liposomů, které jsou vhodné pro léčení rakoviny, studovali autoři předkládaného vynálezu přípravu a použití liposomů s obsahem těžkých radionuklidů (tj. s atomovou hmotností vyšší než 150) emitujících částice alfa, založených na radionuklidech ²¹²Bi, ²¹³Bí, ²²³Ra, ²²⁴Ra, ²²⁵Ac, ²¹²Pb a ²²⁷Th. Použitím liposomů (váčků) s ionofory byly připraveny radioaktivně značené liposomy obsahující s výhodou chelátor (tj. liposomy obsahují ve vnitřním prostoru radionuklid a chelátor) použitím aktivní inkorporace radionuklidu s využitím postupů umožňujících získání liposomů s typickou velikostí 100 nm.

Jednovrstvé (unilamelámí) váčky byly připraveny hydratací tenkého lipidového filmu a extruzí (Olson F., Hunt C. A., Szoka F., Vail W. J. a Papahadjopoulos D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polykarbonate membranes. Bioch. Biophys. Acta

557, 9- 23 (1979), MacDonald R. C., MacDonald R. I., Menco BPhM., TakeshitaK., Subbarao N, K, a Hu Lan-rong. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Bioch. Biophys. Acta 1061, 297- 303 (1991)) následujícím způsobem. DSPC (distearoylfosfatidylcholin) a cholesterol v molámím poměru 2:1, typicky 10, popř. 5 pmol, byly rozpuštěny v chloroformu v kulové baňce. Rozpouštědlo bylo odstraněno na rotační odparce za sníženého tlaku. Suchý lipidový film byl potom hydratován v 0,5 až 1 ml roztoku 150mM kyseliny citrónové, 30 mM DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-N,Ν',N,N'-tetraoctová kyselina), pH 4. Získaná suspenze byla vystavena pěti cyklům zmrazení a tání a následně pětkrát opakované extruzi přes polykarbonátové filtry s velikostí pórů 100 nm a pětkrát přes filtry s velikostí pórů 50 nm s použitím ručního zařízení pro extrudování (Avestin, Ottawa, Kanada).

Koncentrace lipidů v produktu byla přibližně 30 mM. Před vnesením radionuklidu do liposomů byl změněn vnější roztok elucí na koloně PD-10 na pufr 250 mM sacharóza, 20 mM HEPES (N2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina), pH 7,4.

Složky liposomů jsou následující:

a) Vnitřní vodné médium: pH 1 až 14, s výhodou 2 až 9, výhodněji 4 až 5. Složky: voda, prostředky schopné udržet požadované pH vnitřního vodného prostředí po požadovanou dobu, tj. do zahájení inkorporace radioaktivního kovu nebo kovů prostřednictvím ionoforů. Složky vnitřního vodného média také poskytují s výhodou komplexační funkci pro radioaktivní kov nebo kovy.

Tato funkce může být zprostředkována (i) například elektrostatickými donorovými funkčními skupinami nebo prostředky použitými pro nastavení pH, například atomem nebo atomy kyslíku v acetátu, citrátu a příbuzných sloučeninách; (ii) komplexaěním prostředkem přítomným ve vnitřním vodném médiu, jako je například EDTA, DTPA, DOTA, DOTMP a příbuzné sloučeniny.

-3 CZ 299032 B6

b) Ionofor: prostředek schopný transportovat, v podstatě nevratně, radioaktivní kov přes lipidickou dvojvrstvu z extraliposomální fáze dovnitř liposomů. Příklady: ionofory, které prokazatelně fungují požadovaným způsobem: vápníkový ionofor A 23187, dicyklohexyl 18-C6, dibenzo-18C6, 2,3-dimerkapto-l-propanol, Pb-ionofor.

c) Složky lipidické dvojvrstvy: složky lipidické dvojvrstvy poskytnou s výhodou směs schopnou vytvořit váčky, přičemž jejich teplota přechodu z kapalného do pevného stavuje vyšší než fyziologická teplota; například (i) fosfolipidy. Příklady: alkyl-fosfatidylcholiny s dlouhým řetězcem, například l,2-dilauroyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DLPC), l,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosio focholin (DMPC), l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DSPC), l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DOPC), l-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (POPC); (ii) steroly nebo sloučeniny s podobnými vlastnostmi z hlediska ztužení (poklesu tekutosti) lipidické dvojvrstvy. Příklady: sloučeniny ze skupiny sterolů: cholesterol a cholesterol-3-sulfát, a (iii) sloučeniny se stabilizačními účinky (stericky) in vivo pro zlepšení vlastností konstruktu z hlediska směrování na rakovinné buňky a zvýšení doby zdržení v krvi, například polyethery, polyethylenglykoly. Přídavek PEG a/nebo derivátů PEG do prostředku pro tvorbu liposomů poskytne výhody z hlediska sníženého vylučování vstříknutých liposomů z krevního oběhu retikuloendoteliálním systémem. Tyto látky jsou normálně v prostředku přítomny v množství 3 až 10 molámích %, vztaženo na fosfolipid. Množství stabilizátoru nezbytného pro získání požadovaného stabilizačního účinku však závisí na monomeru (elektrostatické vlastnosti a polarita) a na počtu opakujících se jednotek, tj. délce řetězce. Příklady PEG a/nebo derivátů PEG: l,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-N-[poly(ethylenglykol)2000] (PEG2000 DJMPE), l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-N-[poly(ethylenglykol)2000] (PEG2000 DPPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-N-[poly25 (ethylenglykol)2000] (PEG2000 DSPE).

d) Složky umožňující modifikaci konstruktů tak, aby mohly být zacíleny na tumorové buňky. Volba vhodně aktivovaného lipidu bude záviset na povaze haptenu stejně jako na požadavcích výzkumu. Účinnost reakce bude záviset na odštěpitelné skupině, hydrofilní mezemíkové skupině, materiálových vlastnostech liposomů a koncentraci reakčních složek. Pro testování in vivo, při kterém má zůstat hapten asociován s liposomem, se dosáhne určitých výhod volbou lipidových kotev s dlouhým acylovým řetězcem, čímž dochází k pomalejší výměně mezi membránami. Kovalentní vazba mezi haptenem a lipidovou kotvou by měla být dále stabilní jak vůči chemickému, tak i enzymatickému štěpení. Aktivované lipidy mohou poskytnout například aminové, amidové, thioetherové nebo disulfidické vazby mezi lipidem a modifikující částí. Jestliže jsou v prostředku zahrnuty sterické stabilizátory, například PEG a/nebo deriváty PEG, skupina s vazebnou funkcí je s výhodou přítomna na konci sloučeniny stejné nebo podobné stabilizátoru a s efektivní délkou řetězce stejnou nebo delší než je délka stabilizátoru. Příklady: složky váčků umožňující modifikaci konstruktů tak, aby se mohly zaměřit na tumorové buňky, ze skupiny PEG a/nebo derivátů PEG: N-[w-(2-pyridyldithiopropionylamino)poly(ethylenglykol)2000]-l,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin (PDP-PEG2000-DSPE), N-{w-[4-(p-maleimidofenyl)butanoyl]amino}poly(ethylenglykol)2000]-l,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin (MpB-PEG2000-DSPE).

Oddělení radionuklidu asociovaného s liposomem od neasociovaného radionuklidu bylo prováděno použitím chromatografie typu size-exclusion (Mauk M. R. a Gamble R. C. Preparation of lipid vesicles containing high level of entrapped radioactive cations. Anal. Biochem. 94, 302 307 (1979), Tilcock C. P., Ahkong Q. F. a Parr M. An improved method for the preparation of liposomal gadolinium-DTPA-lonophore-Mediated active entrapment of gadolinium. Invest.

Radiol. 26, 242- 247 1991)). Pro postupy separace po vnesení radionuklidu do liposomů byly používány kolony pro gelovou filtraci PD-10 size exclusion columns. Z objemů 1 ml nebo méně nanášených na kolony PD-10 se liposomy eluovaly v prvních 4,5 ml. Radionuklidy, které nebyly asociovány s liposomy, se eluovaly ve frakci odpovídající sloučeninám s nízkou molekulovou hmotností. Kolony PD-10 byly také použity při studii stability (z hlediska zachycení radionukli55 dů) liposomů s obsahem radionuklidů v pufru PBS.

-4CZ 299032 B6

Separace radionuklidů asociovaných s liposomy od volných radionuklidů v séru byla prováděna chromatografií gelovou filtrací na koloně Sepharose CL—4B (Hwang K. J. a Mauk M. R. Fate of lipid vesicles in vivo: A gamma-ray perturbed angular correlation study. Proč. Nati. Acad. Sci.

USA, 74, 4991 - 4995 (1977)). Tak mohly být připraveny roztoky obsahující radioaktivní liposomy dispergované v kapalném nosiči v podstatě prosté nenavázaných radionuklidů.

Před chromatografickými postupy byla přidávána EDTA (kyselina ethylendiamin-N,N'-tetraoctová) pro stabilizaci volného radionuklidů v takovém stavu, který umožňuje snadnou separaci od frakce asociované s liposomy.

Výtěžek vnášení radionuklidů a latenční doba radionuklidů asociovaných s liposomy byly zjišťovány gama-spektroskopií pro ²²⁸Ac, ²²³Ra, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²⁰⁵Bi a ²⁰⁷Bi.²²⁸Ac a ^205/207bí byly použity • . .... 225 212 · 213 * jako stopovacími prvky pro potenciálně terapeuticky použitelné radionuklidy Ac, Bia Bl.

Autoři předkládaného vynálezu učinili významný a neočekávaný objev, že nedochází k význam91 O 019 němu přemisťování Bi po rozpadu Pb inkorporovaného v tomto typu liposomu. Současný stav využití Pb jako molekulárně vázaného generátoru Bi ukazuje, že obvykle dochází k podstatnému uvolňování (>30 %) z chelátoru (McClure J. J. a Feinendegen, L. E. Alpha-emit20 ters for medical therapy: Second Biannual Workshop, Toronto, Kanada, 4.- 5. červen (1998). Report from Department of Energy, Germantown, MD, USA; Mirzadeh S., Kumar K., Ganzow, O. A. The Chemical fate of 212BÍ-DOTA formed by b-decay of 212Pb(DOTA)2Radiochimica Acta, 60, 1 - 10 (1993)). Zachycením ²¹²Pb ve vysoké koncentraci chelátoru, jak je tomu například uvnitř liposomů, by však bylo možno zabránit uvolňování dceřinného produktu za poskytnutí konjugátorového systému využitelného pro zachycení dceřinného nuklidu po přeměně jádra. Poprvé se zde uvádí konjugátorový systém pro ²¹²Pb, který mohl zachytit téměř kvantitativně dceřinný nuklid ²¹²Bi. Předkládaný vynález se tedy týká liposomů s ionofory, které obsahují radionuklid a chelátor umístěné uvnitř liposomu (konjugátorový systém), přičemž tento konjugátorový systém může nebo nemusí zachytit dceřinný nuklid.

Chelátor podle předkládaného vynálezu může být zvolen ze skupiny zahrnující:

kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctovou (DOTA), kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklotridekan-1,4,7,10-N,N',N'',N'-tetraoctovou (TRITA), kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekan-1,4,7,10-N,N',N'',N'-tetraoetovou (TETA), kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(methylen)fosfonovou (DOTMP), kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklotridekan-1,4,7,10-N,N',N”,N'-tetra(methylen)fosfonovou, kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekan-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(methylen)fosfonovou, kyselinu diethylentriamin-N,N',N-pentaoctovou a její izomemí deriváty, kryptát[2,2,2], kryptát[3,2,2], kryptát[2,2,1 ] a jejich mono- a di-benzoderiváty, přemostěné kalix[4]areny obsahující skupiny bohaté na elektrony (donorové), jako hydroxyl, karboxyl, ester, amid, amin, kyselinu 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxacyklooktadekan-1,10-N,N'-bis-octovou, a

1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxacyklooktadekan-1,10-N,N'-bis-malonát.

Další důležitý a překvapivý objev spočíval v tom, že liposomy podle předkládaného vynálezu mohly účinně inkorporovat a zachycovat ²²³Ra. To je poprvé, kdy se popisuje konjugátorový systém s radiem-223 potenciálně použitelný pro směrování na tumor. Navíc autoři vynálezu

-5CZ 299032 B6 ukázali, že do popisovaného typu liposomů je možno také vložit a v těchto liposomech silně zachytit bizmut a aktinium, což ukazuje, že mohou být připraveny také konjugátorové systémy na bázi ²¹²Bi, ²¹³Bí a ²²⁵Ac.

Konjugátorový systém podle předkládaného vynálezu může být připraven s nebo bez modifikujících povrchových skupin, například PEG, v liposomové membráně (liposomy roubované PEG/PEGylované). Výhoda použití PEG v membráně se zakládá na poskytnutí některých PEGreaktivních skupin, které umožní konjugaci proteinů jako jsou například protilátky, fragmenty protilátek nebo konstrukty nebo folát, nebo jiné proteiny/molekuly s afinitou k receptorům (vázalo jící se na receptor).

Předkládaný vynález se dále týká nového typu liposomů s proteiny vázajícími se na receptor navázanými na membránu liposomů. Popisují se zde radioaktivně značené liposomy roubované PEG konjugované s protilátkami značenými folátem. Použití folátu a derivátů folátu pro směro15 vání na tumory exprimující proteiny vázající folát (folate binding proteins, FBP), protein buněčné membrány navázaný přes glykosylfosfatidylinositol účastnící se příjmu oxidovaných folátů do buňky prostřednictvím endocytózy, již vzbudilo pozornost výzkumných pracovníků (Kranz, D. M., Roy, E. J. a Patrick, T. A. Konjugates of folate anti-effector cell antibodies, US pat. No. 5,547,668 (20. srpen 1996); Reddy, J. A. a Low, P. S. Folate-mediated targeting of therapeutic and imaging agents to cancers. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15(6): 587 - 627 (1998); Shinoda, T., Takagi A., Maeda A., Kagatani S., Kono Y. a Hashida M. In vivo fate of folate-BSA in non-tumour- a tumour-bearing mice. J. Pharm. Sci. 87(12): 1521 - 1526, 198; Trippett, T. M. a Bertino J. R. Therapeutic strategies targeting proteins that regulate folate and reduced folate transport. J. Chemotherapy 11:3 - 10 (1999)). Protože bylo ukázáno, že FBP je nadměrně exprimován několika typy buněk lidské rakoviny, tento receptor může být možným cílem pro dodávání terapeutických radioizotopů konjugovaných s folátem. Použitím protilátek konjugovaných s folátem by tedy mohlo být dosaženo cílené protirakovinné terapie působením radionuklidů. Jestliže je navíc kombinační místo antigenu protilátky značené folátem zaměřeno proti antigenu asociovanému s tumorem odlišnému od FBP, dosáhne se dvojí vazebné schopnosti (tj. afinity jak pro systém protilátka-antigen, tak pro receptor FBP). Pokud je autorům vynálezu známo, poprvé se popisuje konjugace protilátek značených folátem.

Protilátky značené folátem konjugované s liposomy podle předkládaného vynálezu by mohly být dále značeny radionuklidem nebo směsí různých radionuklidů, aby se dosáhlo zvýšení účinků radiační terapie.

Předkládaný vynález ukazuje, že tato nová kombinace protilátek značených folátem konjugovaných s liposomy může být použita pro směrování radionuklidů nebo radionuklidů do buněk exprimujících folátové receptory. To je zvláště použitelné s atomy emitujícími částice alfa, které mají záření s vysokým lineárním přenosem energie (high linear energy transfer, high—LET), které jsou extrémně cytotoxické pro savčí buňky (Halí E. Radiobiology for the radiologist. 4. vyd., JB Lippincott Company, Philadelphia, USA (1994); Larsen R. H., Akabani G., Welsh P. aZalutskyM. R. The cytotoxicity and microdosimetry of astatine-211-labeled chimeric monoclonal antibodies in human glioma and melanoma cells in vitro. Radiat. Res. 149, 155 - 162 (1998); Ritter M. A., Cleaver J. E. a Tobiáš C. A. High-LET radiations induce a large proportion of non-rejoining DNA-breaks. Nátuře 266, 653 - 655 (1977)). Zdroj záření alfa však může dodávat záření do zvláště malé oblasti ve srovnání s jinými typy záření. Zdroj záření alfa může být tedy zaměřen na cílovou tkáň a je možno snížit expozici normální tkáně.

Konjugátorový systém podle předkládaného vynálezu by mohl být také použit pro zacílení buněk exprimujících například estrogenový receptor nebo testosteronový receptor konjugací protilátek k estrogenů nebo testosteronu.

Značené protilátky používané v rámci předkládaného vynálezu jsou s výhodou ze třídy IgG nebo

IgM a/nebo jejich fragmenty a/nebo konstrukty (například „miniprotilátky“ - minibody). Tyto

-6CZ 299032 B6 protilátky a/nebo fragmenty a/nebo konstrukty by navíc mohly být myší, chimémí nebo úplně humanizované, polyklonální nebo monoklonální.

Předkládaný vynález se také týká použití konjugátorového systému podle předkládaného vyná5 lezu pro přípravu farmaceutického roztoku vhodného pro injekci nebo infuzi savcům včetně člověka prostřednictvím intravenózního a/nebo oblastního a/nebo intratumorového podávání.

Farmaceutický roztok může být používán v kombinaci s radioimunokonjugátorem nebo několika radioimunokonjugáty a/nebo jinými formami radiofarmaceutické terapie, chemoterapie, terapie vnějším zářením nebo chirurgickým léčením maligních stavů.

Předkládaný vynález se také týká použití konjugátorového systému podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva pro dodání terapeutického záření do maligních buněk, jako je například rakovina mozku, plic, děložního hrdla, vaječníků nebo rakovina mléčné žlázy, nebo leukemie, lymfom nebo maligní melanom.

Předkládaný vynález se také týká kitu pro přípravu konjugátorového systému podle předkládaného vynálezu, který obsahuje lahvičku s roztokem liposomů a druhou lahvičku obsahující radionuklid v roztoku, které mohou být smíseny pro dosažení radioaktivního značení. Navíc se může provést smísení se třetí lahvičkou obsahující proteiny a/nebo molekuly s afinitou k určitému receptorů pro získání konjugátorového systému s afinitou k receptorů.

Použité reagencie a zařízení

Gama spektroskopie byla prováděna s použitím germaniového detektoru (Canberra, Meriden, Conn, USA) napojeného na vícekanálový analyzátor (EG&G ORTEC, Oak Ridge, Tenn, USA). Pro kapalné scintilační počítání byl použit přístroj Beckmann LS 6500 (Beckmann, Fullerton, CA, USA). DSPC a cholesterol byly získány od firmy Northern Lipids (Vancouver, Kanada). Pro čištění radioaktivně značených liposomů byly použity kolony Sephadex G-25 PD-10 (Amer30 sham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko). Jako intraliposomální chelátor byl použit makrocyklický chelátor DOTA získaný od firmy Macrocyclics (Richardson, TX, USA). Při studii byly použity ultračistá HNO₃ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) a 6M HC1 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) a kyselina bis(2-ethylhexyl)fosforečná (HDEHP) firmy Fluka (SigmaAldrich AS, Norsko).

Všechny pufry používané pro vnášení kationtů do liposomů prostřednictvím ionoforu byly upraveny na požadované pH použitím argininu jako volné báze. Všechna použitá voda byla získána z čisticího systému Milli-Q water purification systém (Millipore, Bedford, Mass, USA). Iontoměničové pryskyřice byly dodány firmou Bio-Rad (Hercules, CA, USA).

Pryskyřice byly nejprve kondicionovány promytím vodou, potom 6M HC1, acetonem a nakonec vodou. Pryskyřice byly před nanesením do kolony uchovávány ve vodě.

Použitý DMSO byl uskladněn spolu s molekulovými síty 4 L.

²³²Th(NO₃)₄ použitý při práci byl skladován více než dvacet let. Vzorek byl poskytnut oddělením Nuclear Chemistry Group, Department of Chemistry University of Oslo, Oslo, Norsko.

³H-kyselina listová byla zakoupena od firmy Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire,

UK).

Všechny další chemikálie byly od firmy Sigma-Aldrich, Norsko.

Tabulka 1 ukazuje některé fyzikální vlastnosti radionuklidů používaných při experimentech s li55 posomy.

-7CZ 299032 B6

Tabulka 1

Nuklid	Ú/2	Zářeni gama	% pravděpodobnosti*
²²⁸Ac	6,13 h	911,2(26,6)	26,6
²²³Ra	11.43 d	269,4 (13,7) 271,2 (0,108) (^21#Rn)²	13.7 10.8
^2,2Pb	10,6 h	238,6 (43,6)	43,6
20«_T,	3,05 min	583,1 (32,5)	35,2
²⁰⁷Bi	31,55r	569,7 (97,7)	97,7
²⁰⁵bí	15,31 d	703,4 (31,1)	31,1

Pro každý radionuklid je uvedeno pouze nejvíce zastoupené záření gama.

Údaje jsou převzaty z tabulek Nuclear Data Sheets, Academie Press INC.

Nej lepší způsob provedení

Do liposomů připravených výše popsanými postupy bylo vneseno radium-223 nebo olovo-212. Potom byly provedeny reakce protilátek s liposomy pro dosažení přítomnosti molekul protilátky na povrchu liposomů. Pro systémové podání bude vhodná velikost liposomů přibližně 100 gm, ale pro podávání do dutin mohou být použity typické velikosti 200 až 1000 gm, například pro léčení mozkového tumoru, nebo pro léčení intraperitoneální rakoviny vaječníků. (Liposomy větší velikosti zpomalí rychlost vylučování z dutiny, do které se preparát vstříkne, čímž se uchová v oblasti tumoru vyšší koncentrace).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Vazba PEGylovaných liposomů, obsahujících buď protilátku Fab' nebo Fab' značenou folátem konjugovanou k membráně liposomu, na buňky OVCAR 3.

Obr. 2 Vazba folátovaných PEG liposomů na buňky OVCAR 3 srovnání s nefolátovanými.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vnášení ²¹²Pb/²¹²Bi do liposomu

Metody: systém ²¹²Pb/²¹²Bi byl vyráběn zářením ²²⁰Rn ze zdroje ²²⁸Th, jak je popsáno autory Hassfjell S. P. a Hoff P. A. generátor for production of Pb-212 a Bi-212. Appl. Radiat. Isot. 45, 1021 - 1025 (1994). Pb/ Bi bez přidaného nosiče byl z jímací nádobky uvolněn použitím

0,1Μ HNO3 a roztok byl nanesen na kolonu 2 x 20 mm iontoměničové pryskyřice AG 50W-X4,

-8CZ 299032 B6

Systém ²¹²Pb/²¹²Bi byl potom eluován 2M HC1 a roztok byl odpařen do sucha. Systém ²¹²Pb/²¹²Bi byl potom rozpuštěn ve 200 μΐ lOmM roztoku acetátu pH 5.²¹²Pb bylo kvantifikováno měřením příslušného gama záření 238,6 keV (tabulka 1). ²¹²Bi byl kvantifikován měřením gama záření 583,1 keV dceřinného izotopu ²⁰⁸TI při dosažení radioaktivní rovnováhy.

Výsledky: Bylo zjištěno, že pro inkubaění doby až tři dny bylo s liposomy asociováno méně než 0,2 % přidané aktivity.

Liposomy odpovídající koncentraci lipidu 30 až 60 mM byly důkladně smíseny s filmem ionofo10 ru A23187 (10 až 13 nM). Potom byl přidán přibližně 1 MBq systému ²¹²Pb/²¹²Bi a směs byla inkubována při 75 °C 30 min a potom byla provedena eluce na koloně PD-10. Frakce obsahující více než 95 % naplněných váčků byla potom eluována na druhé koloně PD-10. Zadržení

919 919

Pb/ Bi asociovaného s liposomy bylo zjišťováno inkubací váčků při 37 °C v lidském séru nebo PBS. Distribuce aktivity byla sledována po dobu 24 hod.

Výsledky: Účinnost vnášení ²¹²Pb: 34,8 % (n = 3).

Retence byla měřena spektroskopií gama a bylo zjištěno, že pro doby inkubace do 24 hodin bylo s liposomy asociováno více než 99 % ²¹²Pb.

Příklad 2

919 919

Retence Bi vytvořeného rozpadem Pb asociovaného s liposomy

Metody: Do liposomů bylo vneseno ²¹²Pb jak bylo popsáno výše. Radioaktivita asociovaná s liposomy byla izolována elucí reakční směsi 10 mM EDTA v PBS na koloně PD-10 předekvilibrované 10 mM EDTA v PBS.

919 919

Po 3 hod potřebných pro zajištění rovnováhy přechodu mezi Pb a Bi byly naneseny alikvoty roztoku na kolony PD-10 předekvilibrované 10 mM EDTA v PBS pro oddělení volných radionuklidů od radionuklidů asociovaných s liposomy. Distribuce aktivity byla sledována po dobu 24 hod.

Oddělený alikvot značených liposomů, u kterého nebyl proveden separační postup (se stejnou geometrií jako bylo získáno z chromatografických postupů) byl měřen pro použití jako standard. Tento postup byl proveden pro zajištění poměru aktivity ²¹²Bi/²¹²Pb při radioaktivní rovnováze.

919 919

Výsledky: Porovnáním poměru Bi/ Pb získaného pro chromatograficky dělené liposomy s poměrem rovnovážné směsi bylo zjištěno, že v liposomech bylo po rozpadu ²¹²Pb zadrženo více než 95 % izotopu ^2,2Bi.

Dále byla porovnávána měření aktivity ²¹²Bi ve dvou chromatograficky získaných frakcích. Více než 99 % celkové aktivity ²¹²Bi eluované do těchto frakcí odpovídá liposomům.

Příklad 3

Testování možného opakovaného vnášení Pb a Bi do liposomů

Metody: Liposomy odpovídající 30 až 60 mM lipidu s obsahem 150 mM kyseliny citrónové, 30 mM DOTA a s použitím vnějšího roztoku s obsahem 10 mM EDTA v PBS byly přidány k filmu ionoforu A23187 (20 až 26 nmol na vnitřním povrchu skleněné lahvičky). Potom byl přidán ²¹²Pb a ^2!2Bi v PBS a byla provedena inkubace při 37 °C. Alikvoty roztoku byly eluovány přes

-9CZ 299032 B6 kolony PD-10 a chromatograficky získané frakce odpovídající eluátu liposomů byly testovány vlastním Ge-detektorem (tj. P1N).

Výsledky: Po 24 hodinách nebylo pozorováno detekovatelné vnesení (<1 %) Pb a Bi.

Příklad 4

Vnášení ²²³Ra do liposomů ²²³Ra bylo vytvářeno v generátoru na bázi ²²⁷Ac, jak se popisuje v Larsen R. H., Henriksen G. Norská patentová přihláška č. P990001 (1999). Ve stručnosti, ²²⁷Ac a jeho dceřinný nuklid ²²⁷Th jsou zachyceny na koloně extrakční chromatografické pryskyřice umožňující eluci ²²³Ra minerální kyselinou. Pro inkorporací radia do liposomů byl roztok eluovaný z generátoru odpařen do sucha a ²²³Ra bylo potom rozpuštěno v 5 mM citrátu, pH 7,4.

Liposomy odpovídající koncentraci lipidu 30 až 60 mM byly důkladně míchány s filmem ionoforu A23187 (10 až 13 nmol na vnitřním povrchu skleněné lahvičky). Potom bylo přidáno přibližně 50 kBq ²²³Ra a směs byla inkubována při 75 °C 20 min. Reakční směs byla potom přidána do

100 μΐ 10 mM EDTA a eluována na koloně PD-10 pro izolaci radioaktivity asociované s lipidovými váčky.

Retence ²²³Ra asociovaného s liposomy byla zjišťována inkubací váčků při 37 °C v lidském séru (Sigma) nebo 5 mM EDTA v lidském séru při koncentraci liposomů 0,3 mg celkového lipidu/ml séra. Výsledky jsou ukázány v tabulce 2 a ukazují, že ²²³Ra je v liposomech velmi stabilně zachyceno.

Tabulka 2

Doba inkubace (dny)	% celkového ²²³Ra ve frakcí liposomů
1	94,6 ± 1
3	94 ± 2.5
4	94,7 + 0,5
Střední hodnota ± standardní odchylka, n = 4

Příklad 5

Zjišťování, zda opakované vnášení bude mít vliv na experiment s retencí ²²³Ra

Metody: Liposomy odpovídající 30 až 60 mM lipidu vytvořené hydratací lipidických filmů 150 mM kyselinou citrónovou, 30 mM DOTA, vnější roztok PBS nebo sérum, byly přidány k fil40 mu ionoforu A23187 (10 až 13 mmol na vnitřním povrchu skleněné lahvičky). Potom bylo přidáno ²²³Ra v 5 mM citrátu pH 7,4 a byla provedena inkubace při 37 °C. Alikvoty roztoku byly nanášeny na kolony PD-10 a chromatograficky získaná frakce odpovídající liposomům byla testována vlastním Ge-detektorem.

-10CZ 299032 B6

Příklad 6

Vnášení ²⁰⁷Bi do liposomů

203 207

Metody: ' Bi byly vyráběny (p, xn) reakcemi na terčích z přírodního olova a čištěny použitím extrakce chromatografickou pryskyřicí selektivní pro olovo (Henriksen G. a Hoff P. Isolation of cyklotron produced Bi-205, Bi-206 a Pb-203 using a lead-selective extraction chromatographic resin. Appl. Radiat. Isot. 49, 357 - 359 (1998)).

Při této studii byla použita směs izotopů Bi, která se skládá hlavně z ²⁰⁵Bi a ²⁰⁷Bi, která bude dále označována jako ²⁰⁷Bi. 50 μΐ roztoku ²⁰⁷Bi v 10^-4 M HC1 bylo přidáno k liposomům odpovídajícím 30 až 60 mM lipidu, které byly předtím smíseny s filmem ionoforu A23187 (10 až 13 nmol na vnitřním povrchu skleněné lahvičky) a směs byla inkubována 30 min při 75 °C. K reakční směsi bylo potom přidáno 100 μΐ 10 mM EDTA a byla provedena eluce na koloně PD-10 pro izolaci radioaktivity asociované s lipidickými váčky.

Výsledky: Bylo zjištěno, že 32 % celkového ²⁰⁷Bi je asociováno s liposomy.

Příklad 7

Vnášení ²²⁸Ac do liposomů

Metody: ²²⁸Ac bylo izolováno z preparátu ²³²Th(NO3)4 kombinací extrakce rozpouštědlem a iontové výměny. ²³²Th(NO3)₄ (původně 4H₂O) byl rozpuštěn ve 20 ml 0,1 M HNO₃ a přidán do 500ml dělicí nálevky a směs byla přivedena do styku s 5 x 100 ml 2M roztoku HDEHP v heptanu. Vodná fáze byla potom promyta třikrát heptanem a potom nanesena na kolonu 3 x 40 mm kationtové iontoměničové pryskyřice AG50W-X12 pro izolaci ²²⁸Ac jak bylo popsáno (Cabell

M. J., The purification, determination and neutron capture cross section of actiniuim-227, Can. J. Chem. 37, 1094 - 1101, (1959)). Z této kolony byly eluovány ^2l2Pb, ²¹²Bi, ²²⁴Ra a ²²⁸Ra 3M HNO3 a roztok byl ponechán stát více než 20 hod. Roztok byl potom odpařen do sucha a radionuklidy byly uvolněny z nádoby 1 ml 1M HNO3. Tento roztok byl nanesen na kolonu 3 x 40 mm AG50W-X12. Znovu byly eluovány ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²²⁴Ra a ²²⁸Ra 3M HNO3. ²²⁸Ac bylo zředěno 6M

HNO₃ a eluát byl odpařen do sucha. ²²⁸Ac bylo potom uvolněno z nádoby 200 μΐ 5 mM HNO₃. Přibližně 6 kBq ²²⁸Ac bylo přidáno k liposomům s obsahem ionoforu A23187, jak bylo popsáno výše, a směs byla inkubována 60 min při 75 °C. Do reakční směsi bylo potom přidáno 100 μΐ lOmM EDTA a byla provedena eluce na koloně PD-10 pro izolaci radioaktivity asociované s lipidickými váčky. Frakce odpovídající více než 95 % naplněných váčků byly spojeny a potom eluovány na druhé koloně PD-10. Retence ²²⁸Ac v liposomech byla testována inkubací radioaktivně značených váčků při 37 °C v lidském séru nebo PBS. Distribuce aktivity byla sledována po dobu 24 hod.

Výsledky: Při testování vnášení bylo s liposomy po provedení popsaného postupu asociováno 90 až 95 % přidaného ²²⁸Ac (byla provedena korekce na rozpad v průběhu značení a čištění). Bylo zjištěno, že při sledování retence bylo pro doby inkubace až do 24 hodin s liposomy asociováno více než 98 % ²²⁸Ac.

-11 CZ 299032 B6

Příklad 8

Vnášení ⁹⁰Y

Metody: ⁹⁰Y bylo použito v tomto příkladu jako stopovací látka pro studium chování radioaktivně značených liposomů. Při této studii byly ⁹⁰Y a ⁹⁰Sr měřeny kapalným scintilačním čítáním.

⁹⁰Y bylo izolováno od ⁹⁰Sr pomocí chromatografické pryskyřice pro selektivní extrakci stroncia jak je popsáno autory Dietz a Horwitz (1992). Při tomto experimentu bylo ⁹⁰Sr (Amersham, io Buckinghamshire, Anglie) v Ο,ΙΜ HNO3 odpařeno do sucha a ke zbytku byla přidána 3M HNO3.

Roztok byl nanesen na kolonu 3 x 20 mm Sr-pryskyřice (EiChroM, Darien, IL, USA) a kolona byla promyta 5 ml 3M HNO3. Tento postup selektivně eluuje ⁹⁰Y, zatímco Sr se na koloně dostatečně zadrží pro snížení obsahu ⁹⁰Sr ve směsi ⁹⁰Sr/⁹⁰Y s faktorem přibližně 10³ (Dietz M.L. a Horwitz E. P., Improved chemistry for the production of Y-90 for medical applications. Appl.

Radiat. Isot. 43, 1093- 1101 (1992)). Potom bylo ⁹⁰Sr z kolony vytěsněno použitím 0,05M

HNO3 a tento roztok byl ponechán jeden týden pro umožnění zvýšení množství ⁹⁰Y. Potom byl roztok odpařen do sucha a ke zbytku byla přidána 3M HNO3 před separací radionuklidů na druhé koloně Sr-pryskyřice. Eluát obsahující ⁹⁰Y byl odpařen do sucha a radionuklid byl uvolněn z nádoby použitím 200 μΐ 5mM HNO3. Tento roztok byl přidán k liposomům obsahujícím ionofor

A23187 (jak bylo popsáno výše) a inkubován 60 min při 75 °C. K reakční směsi bylo potom, přidáno 50 μΐ lOmM EDTA a směs byla eluována na koloně PD-10 pro izolaci radioaktivity asociované s lipidickými váčky. Frakce odpovídající více než 95 % váčků byla potom eluována na druhé koloně PD-10. Retence ⁹⁰Y asociovaného s liposomy byla testována inkubací váčků při 37 °C v lidském séru nebo PBS. Distribuce aktivity byla sledována po dobu čtyř dnů.

Výsledky: Po jedné hodině nanesení a čištění na gelové filtrační koloně bylo s liposomy asociováno více než 95 % přidaného ⁹⁰Y.

Při studiu retence v liposomech byly získány následující výsledky: Po 5 hod a 1 dnu bylo asocio30 váno s liposomy více než 99 %. Po 4 dnech bylo zjištěno, že frakce asociovaná s liposomy je 98 ± 1 %.

Jako bylo v těchto experimentech ukázáno, liposomy mohou být radioaktivně značeny radionuklidy emitujícími částice alfa a/nebo beta, a tyto nukleotidy jsou dobře zadržovány při fyziolo35 gické teplotě.

Příklad 9

Příprava systému yttrium-90/radium-223 PEGylovaný liposom-folát-Fab'

Při tomto experimentu byl použit F(ab')₂R0 myelom (podtřída IgG]) v koncentraci 14 mg/ml v PBS (Michalsen, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norsko).

Konjugace kyseliny listové k protilátkám

Kyselina listová.2H₂O byla nejprve rozpuštěna v dimethylsulfoxidu (Fluka, obsah H₂O nižší než 0,05 %). Roztok byl potom jehlou nanesen na aktivovaná molekulová síta 4 Á (Fluka) a uchován v atmosféře argonu v temnu 6 až 10 hod. Folát značený tritiem (³H-folát) byl přidán jako vodný roztok draselné soli ³H-folátu (1% vzhledem ke kyselině citrónové). Specifická aktivita ³Hfolátu použitého pro konjugaci k proteinu byla 7 až 7,5 GBq/mol.

³H-folát byl aktivován pro vazbu na protilátku F(ab')₂ proti myelomu přidáním 10 mol ekvivalentů l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu k roztoku folátu a inkubaci 30 min při teplotě laboratoře. Potom byl k proteinu přidán 30 až 40 násobný molámí nadbytek aktivovaného

-12CZ 299032 B6 folátu s koncentrací 14 mg/ml v PBS a směs byla ponechána reagovat 30 až 60 min. Reakce byla ukončena přidáním 0,2 ml 0,3M glycinu ve směsi PBS/borát, pH 8,5. Konjugát folát F(ab')₂(folát-F(ab')₂) byl oddělen od nezreagovaného materiálu pomocí kolony PD-10 předekvilibrované v PBS. Pro vytvoření konjugátu folát-Fab' byl folát-F(ab')₂ inkubován v 1 mM dithiotreitolu (DTT) při teplotě laboratoře 2 hod a potom byla provedena eluce na koloně NAP-5 typu size exclusion. Frakce obsahující folát-Fab' byly zbaveny kyslíku probubláváním argonu roztokem a potom byl roztok ihned smíchán s roztokem liposomů.

Míra konjugace kyseliny listové byla zjištěna obsahem ³H v čištěném proteinu při použití měření ío kapalnou scintilací (Beckmann LS6500) v kombinaci se spektrofotometrickým odečítáním při

280 nm.

Pro kvantifikaci frakce folát-Fab' navázané na liposomy bylo před reakcí s DTT přidáno stopové množství jodovaného F(ab')₂ (protein byl jodován standardním postupem s použitím systému lodoGen).

Konjugace značených protilátek k liposomům

DSPE-PEC2000-MPB (Northern Lipids, VA, Kanada) ve formě sodné soli byl přidán v množ20 ství 5 molámích % celkového fosfolipidu. Liposomy byly jinak vytvořeny a byly také připraveny pro krok vnášení kationtů prostřednictvím ionoforu identickým způsobem jak bylo popsáno pro nePEGylované liposomy.

Po ponechání reakční směsi po kroku nanášení ohřát na teplotu laboratoře byla suspenze liposo25 mů zbavena kyslíku a potom byl přidán folát-Fab' pro získání koncentrace proteinu 0,3 až 0,5 mg/ml. Koncentrace lipidu byla 1 až 3 mM při zjišťování testem Bartlett phosphorous assay (Bartlett G. R,, Phosphorous assay in column Chromatography. J. Biol. Chem. 234 (3), 466 - 468 (1958)). Konjugát folát-Fab' a liposomy byly ponechány reagovat 2 hod při teplotě laboratoře. Reakční směs byla potom nanesena na kolonu PD-10 ekvilibrovanou v PBS. PEG-liposomy konjugované s folátem-Fab' byly uchovávány při 4 °C 12 až 15 hod před použitím při testech vazby na folátový receptor.

Radioaktivita navázaná na liposomy byla měřena detektorem Nal studnicového typu s korekcí na přetečení v příslušných kanálech z dvojitě značených vzorků. Jako referenční byly použity vzor35 ky jednoho nuklidu a směsí nuklidů.

Na základě měření radioaktivity byla koncentrace proteinu převedena na počet Fab' na liposom za předpokladu velikosti liposomů 100 nm a 8.10⁴ fosfolipidů/váček (Kirpotin D., Park J. W., Hong K., Zalipsky S., Wen-Lu L., Carter P., Benz C. C. a Papahadjopoulos D. Sterically stabilised Anti-HER2 Immunoliposomes: Design and targeting to human breast cancer cells in vitro. Biochemistry, 36, 66-75, (1997)) a molekulové hmotnosti Fab' myelomové protilátky 52 000.

Radioaktivita navázaná na buňky byla měřena detektorem Nal (trojnásobné koncentrace pro Y—

90) a čítáním kapalné scintilace po přidání scintilátoru Insta-Gel plus (Packard) (tabulka 3).

- 13CZ 299032 B6

Tabulka 3

Vazba ⁹⁰Y-liposomů konjugovaných s protilátkami s nebo bez folátu na buňky OVCAR

Přidaný liposom/buňku	% folát-negatívních liposomů navázaných na buňky	% folát-pozítivních liposomů navázaných na buňky
1.10®	<0,5	10±3
1.10⁴	1 ± 0,5	9 ± 3
1.10³	4 ± 2	11 +-2
1.10²	5± 1	16 ±2
10	8±3	46 ±8

Detekce ³H-folátu na liposomech

PEG liposomy (koncentrace lipidu 2,5 mM) v pufru 20 mM HEPES/300 mM sacharóza reagovalo ly s Fab' konjugovaným s ³H-folátem (0,5 mg/ml v PBS, poměr folát/Fab' 2 ± 0,2). Po 2 hod při teplotě laboratoře byly liposomy s navázaným systémem folát-Fab' izolovány elucí na koloně materiálu Sepharose CL-AB. Množství konjugátu ³H-folát-Fab' na liposomech bylo kvantifikováno kapalným scintilačním čítáním chromatografícky získaných frakcí a bylo zjištěno, že poměr folát-FabVliposom je přibližně 110.

Zkratky

	DSPC:	distearoylfosfatidylcholin
20	DOTA:	kyselina 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-l ,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctová
	DSPE-PEG2000-MPB: N-(4-(p-maleimidofenyl)butyryl)-l,2-distearoyl-s«-glycero-3-fosfo· ethanolamin (Northern Lipids, VA, Kanada)
25	HEPES:	kyselina N—2—hydroxyethylpiperazin—Ν'—2—ethansulfonová
	PBS:	fyziologický roztok s fosfátovým pufrem
	EDTA:	kyselina ethylendiamin-N,N'-tetraoctová
3 v	HDEHP:	kyselina bis(2-ethylhexyl)fosforečná
	PEG:	polyethylenglykol
35	DTT:	dithiotreitol

-14CZ 299032 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Konjugátorový systém, vyznačující se tím, že obsahuje liposomy s ionofory

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Konjugátorový systém, vyznačující se tím, že obsahuje liposomy s ionofory a s chelátorem umístěným uvnitř liposomů, kde liposomy dále uvnitř obsahují těžký radionuklid

212 212 nebo těžké radionuklidy emitující částice alfa nebo Pb jako generátor Bi emitujícího částice alfa, kde těžké radionuklidy mají atomovou hmotnost vyšší než 150.

ío 2. Konjugátorový systém podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se t í m , že koncentrace chelátoru uvnitř liposomů je vhodná pro zachycení dceřinných nuklidů.

3. Konjugátorový systém podle některého z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že chelátor je zvolený ze skupiny zahrnující kyselinu l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,1015 N,N',N,N'-tetraoctovou, DOTA; kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklotridekan-1,4,7,10-N,Ν',N,N'-tetraoctovou, TRITA; kyselinu l,4,7,10-tetraazacyklotetradekan-l,4,7,10-N,N',N,N'tetraoctovou, TETA; kyselinu l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(methyl)-fosfonovou, DOTMP; kyselinu l,4,7,10-tetraazacyklotridekan-l,4,7,10-N,N',N,N'tetra(methylen)fosfonovou; kyselinu 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekan-1,4,7,10-N,N',N,N'20 tetra-(methylen)fosfonovou; kyselinu diethylentriamin-N,N',N-pentaoctovou a její izomemí deriváty; kryptát[2,2,2], kryptát[3,2,2], kryptát[2,2,1 ] a jejich mono- a dibenzoderiváty; přemostěné kalix[4]areny obsahující skupiny bohaté na elektrony - donory, jako hydroxyl, karboxyl, ester, amid, amin; kyselinu l,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxacyklooktadekan-l,10-N,N'bis-octovou; a 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxacyklooktadekan-l, 10-N,N'-bis-malonát.

4. Konjugátorový systém podle některého z nároků laž3, vyznačující se tím, že liposomy obsahují v membráně aktivované skupiny umožňující konjugaci proteinů nebo jiných molekul s afinitou k receptorům k těmto aktivovaným skupinám.

30 5. Konjugátorový systém podle nároku 4, vyznačující se tím, že těmito aktivovanými skupinami je polyethylenglykol.

6. Konjugátorový systém podle některého z nároků laž5, vyznačující se tím, že liposomy jsou konjugovány k proteinům vázajícím se na receptor.

7. Konjugátorový systém podle nároku 6, vyznačující se tím, že proteiny vázající se na receptor jsou monoklonální nebo polyklonální protilátky, nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek, nebo folát.

40 8. Konjugátorový systém podle nároku 6, vyznačující se tím, že liposomy jsou konjugovány s protilátkami třídy IgM nebo IgG nebo fragmenty nebo konstrukty z těchto tříd protilátek.

9. Konjugátorový systém podle nároku 6, vyznačující se tím, že liposomy jsou

45 konjugovány s protilátkami třídy IgM nebo IgG nebo fragmenty nebo konstrukty z těchto tříd protilátek, přičemž protilátky, fragmenty nebo konstrukty jsou značeny folátem a radionuklidem nebo směsí různých radionuklidů.

10. Konjugátorový systém podle některého z nároků laž9, vyznačující se tím, že

50 protilátky nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek konjugované s liposomy jsou myší, chimérní nebo lidské, monoklonální nebo polyklonální.

- 15CZ 299032 B6

11. Konjugátorový systém podle nároku 10, vyznačující se tím, že protilátky nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek jsou značeny folátem, přičemž vazebné místo antigenů je zaměřeno na protein vázající folát FBP.

5 12. Konjugátorový systém podle nároku 10, vyznačující se tím, že protilátky nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek jsou značeny folátem, přičemž vazebné místo antigenů je zaměřeno na antigen různý od FBP.

13. Konjugátorový systém podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že ío radionuklidem je těžký emitor alfa částic a/nebo ^2I2Pb jako generátor alfa-emitoru ²¹²Bi zvolený ze skupiny^{20 21} *At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²³Ra a ²²⁷Th.

14. Konjugátorový systém podle některého z nároků lažl3, vyznačující se tím, že dceřinný nuklid je ²¹²Bi a mateřský nuklid je ²¹²Pb.

15. Způsob výroby radioaktivně značeného konjugátorového systému podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že liposomy s ionofory a chelátorem vhodné koncentrace se stabilně radioaktivně značí těžkými emitory částic alfa míšením roztoku obsahujícího radionuklid nebo směs radionuklidů emitujících záření částic alfa nebo ²¹²Pb jako generátor alfa20 emitoru ²¹²Bi, kde těžké emitory částic alfa mají atomovou hmotnost vyšší než 150, s roztokem obsahujícím liposomy, a směs se inkubuje při zvýšené teplotě vzhledem k fyziologické teplotě pro dosažení transportu radionuklidů nebo radionuklidů do liposomů.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že chelátor se volí ze skupiny obsa25 hující kyselinu l,4,7,10-tetraazacyklododekan-l,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctovou, DOTA;

kyselinu l,4,7,10-tetraazacyklotridekan-l,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctovou, TRITA; kyselinu

1.4.7.10- tetraazacyklotetradekan-l,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctovou, TETA; kyselinu 1,4,7,10tetraazacyklododekan-1,4,7,10-N,N',N'',N'-tetra(methylen)fosfonovou, DOTMP; kyselinu

1.4.7.10- tetraazacyklotridekan-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(methylen)fosfonovou; kyselinu

30 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekan-l ,4,7,10-N,N',N,N'-tetra-(methylen)fosfonovou; kyselinu diethylentriamin-N,N',N-pentaoctovou a její izomemí deriváty; kryptát[2,2,2], kryptát[3,2,2], kryptát[2,2,1 ] a jejich mono- a dibenzoderiváty; přemostěné kalix[4]areny obsahující skupiny bohaté na elektrony - donory, jako hydroxyl, karboxyl, ester, amid, amin; kyselinu 1,10-diaza4,7,13,16-tetraoxacyklooktadekan-l, 10-N,N'-bis-octovou; a 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxa35 cyklo-oktadekan-1,10-N,N'-bis-malonát.

17. Způsob podle některého z nároků 15 a 16, vyznačující se tím, že liposomy obsahují v membráně aktivované skupiny umožňující konjugaci proteinů nebo jiných molekul s afinitou k receptorům.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že těmito aktivovanými skupinami je polyethylenglykol.

19. Způsob podle některého z nároků 15 až 18, vyznačující se tím, že liposomy jsou

45 konjugovány k proteinům vázajícím se na receptor.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že proteiny vázající se na receptor jsou monoklonální nebo polyklonální protilátky, nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek, nebo folát.

21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že liposomy jsou konjugovány s protilátkami třídy IgM nebo IgG nebo fragmenty nebo konstrukty z těchto tříd protilátek.

-16CZ 299032 B6

22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že liposomy jsou konjugo vány s protilátkami třídy IgM nebo IgG nebo fragmenty nebo konstrukty z těchto tříd protilátek, přičemž protilátky, fragmenty nebo konstrukty jsou značeny folátem a radionuklidem nebo směsí různých radionuklidů, přičemž se použije standardních postupů pro značení protilátek folátem

5 a radionuklidem.

23. Způsob podle některého z nároků 15 až 22, vyznačující se tím, že protilátky nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek konjugované s liposomy jsou myší, chimémí nebo lidské, monoklonální nebo polyklonální.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že protilátky nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek jsou značeny folátem, přičemž vazebné místo antigenu je zaměřeno na protein vázající folát, FBP.

15 25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že protilátky nebo fragmenty nebo konstrukty protilátek jsou značeny folátem, přičemž vazebné místo antigenu je zaměřeno na antigen různý od FBP.

26. Způsob podle některého z nároků 15 až 25, vy z n a č uj í c í se t í m , že radionuklidem
2j o 212

20 je těžký emitor alfa částic a/nebo Pb jako generátor alfa-emitoru Bi, zvolený ze skupiny ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²³Ra a ²²⁷Th.

27. Způsob podle některého z nároků 15 až 26, vyznačující se tím, že dceřinný

919· · 919 nuklidje Bi a mateřský nuklid je Pb.

28. Použití konjugátorového systému podle některého z nároků 1 až 14 pro výrobu farmaceutického roztoku vhodného pro injekci nebo infuzi savcům včetně člověka v kombinaci s radioimunokonjugátem nebo několika radioimunokonjugáty a/nebo jinými formami radiofarmaceutické terapie, chemoterapie, léčení vnějším ozářením nebo chirurgickým zákrokem pro léčení

30 maligních stavů.

29. Použití konjugátorového systému podle některého z nároků 1 až 14 pro výrobu farmaceutického prostředku pro injekční podání pacientům, pro dodání potenciálně terapeutického záření do maligních buněk exprimujících receptory zvolené ze skupiny protein vázající folát, receptor

35 estrogenů a receptor testosteronu.

30. Použití podle nároku 29 kde maligní buňky jsou odvozené z maligní tkáně zvolené z rakoviny mozku, plic, děložního hrdla, vaječníků nebo rakoviny mléčné žlázy, leukemie, lymfomu nebo maligního melanomu.

31. Kit pro přípravu konjugátorového systému podle některého z nároků lažl4, vyznačující se t í m , že obsahuje lahvičku s obsahem roztoku liposomů a lahvičku s obsahem radionuklidu v roztoku, které mohou být smíchány pro dosažení radioaktivního značení.

45 32. Kit pro přípravu konjugátorového systému podle některého z nároků lažl4, vyznačující se tím, že obsahuje lahvičku s obsahem roztoku liposomů a druhou lahvičku s obsahem radionuklidů v roztoku a třetí lahvičku s obsahem molekuly s afinitou k receptoru, které mohou být smíchány pro dosažení radioaktivního značení a značení molekulou s afinitou k receptoru.

2 výkresy 55

- 17CZ 299032 B6

Obr.

-Q <0

O

O o

o o

o o

o o

Poměr přidaného množství liposomů vzhledem k buňkám

I o

Tt

Ί-«-1-r o o

CO CM