NO312708B1 - Radioaktive liposomer til terapi - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler en liposomal sammensetning som omfatter lipsomer og ionoforer der lipsomene inneholder et komplekt av en chelator og en tung radionuklide som er en a- eller P-partikkelemitter, en fremgangsmåte for å fremstille en slik sammensetning, anvendelse av sammensetningen og et sett for å fremstille den.

Biomedisinske anvendelser av radionuklider i antikreftterapi har fokusert på anvendelsen kationiske eller anioniske elementer, for eksempel [<131>I]jodid mot tyroidkreft, og <89>Sr for lindring av smerte fra skjelettkreftmetastaser og anvendelsen av for det meste beta-emitterende radionuklider koblet til monoklonale antistoffer (DeVita et al., 1996). Nye bærersystemer kan øke anvendelsen av radioisotoper, og kan også øke arsenalet av radionuklider som er antatt å være nyttige terapi (Gaze, 1996). Liposomer med eller uten reseptoraffinitetsgrupper koblet til overflaten har blitt evaluert for medikamentavlevering, og er på det nåværende tidspunkt benyttet klinisk for avleveringen av kjemoterapeutika i visse kreftformer. Nylig har utviklinger innen liposomforskning ført til nye versjoner med en farmakokinetikk som kan gjøre disse forbindelsene nyttige som bærere for radionuklider for intern radioterapi mot kreft (Gabinzon, 1995).

Anvendelsen av målrettet radionuklideterapi mot kreft hviler på evnen til å finne måter å koble radionuklider til en tumorspesifikk forbindelse på (Gaze, 1996). Noen av radionuklidene med nyttige strålingskarakteristika kan ikke på det nåværende tidspunkt bli benyttet i tumormålretting, som en følge av problemer med kjemisk stabilitet av koblingen mellom radionukliden og bærerforbindelsen. Heri beskriver vi en fremgangsmåte til å koble slike radionuklider til tumorsøkende molekyler, og har vist god kjemisk stabilitet over flere dager for produktet. Denne fremgangsmåten kan også bli benyttet for å holde tilbake datternukliden, for eksempel fira transformasjonen av <212>Pb til <212>Bi.

Nyere utvikling i formuleringen og fremstillingen av liposomer har resultert i små vesikler på mindre enn 100 [im med forlenget sirkulasjonstid. Størrelsen på liposomene kan bedre tilpasses små diametere ved å benytte ekstrusjon gjennom membraner. Introduksjonen av poly(etylenglykol) (PEG) transplanterte liposomer har redusert interferensen fra plasmaproteiner, og derved redusert gjenkjenningen og fjerningen som utføres av makrofagene i reticuloendotelsystemet (Maruyama, et al., 1997). Økte nivåer av tumoropptak som en følge av forlenget blodkonsentrasjon har derved blitt oppnådd. Videre har tumoropptak blitt oppnådd ved å konjugere molekyler med reseptoraffinitet, for eksempel monoklonale antistoffer og folat, til overflaten av liposomene. Flere studier har indikert fordelen av å benytte PEG som en kobler mellom liposomene og den målrettede liganden, siden dette også kan øke reseptortilgjengeligheten (for eksempel Maruyama et al., 1997; Gabinson et al., 1999; Lee et al., 1994).

Liposomer har tidligere vært studert som bærere for radioisotoper (Goins et al., 1998; Turner et al., 1988). Pikul et al (1987) rapporterte et studium basert på <212>Pb-dekstran inkorporert passivt (det vil si <212>Pb-dekstran ble tilsatt under genereringen av liposomet, og en fraksjon av 2<12>Pb-dekstran ble inkorporert sammen med den vandige fasen som representerer det indre til liposomene). Forfatterne antydet ikke at disse liposomene var passende for kreftterapi, men de ble benyttet primært for å studere intracellulær celledød in vitro med radioisotop. Ingen data på skjebnen til Bi generert fira Bi-nedbrytningen ble presentert, og størrelsen på liposomene var i størrelsesorden 350-500 nm, som er svært mye sammenlignet med størrelsen (< 100 \ tm) som i dag er antatt å være optimalt for in vivo tumorterapi (Forssen, 1997). Liposomene inneholdt heller ikke PEG i membranen. Ogihar-Umeda et al.

(1996) benyttet liposomer som bærere for de gamma-emitterende radionuklidene <67>Ga, <U1>ln og <99m>Tc, og antydet anvendelsen av radiomerkede liposomer for billedfremstilling. I en teoretisk studie antydet Kostarelos et al. (1999) anvendelsen av liposomer merket med de potensielt terapeutiske radionuklidene 111 I, (\ H Cu, 1 fi8Re og <Oll>At, men kjemiske fremgangsmåter for fremstillingen av de radiomerkede liposomene ble ikke antydet. For å oppnå tilstrekkelig stabil merking av bærere med de tunge alfa-emitterende radionuklidene kreves det vanligvis spesifikke kjemiske fremgangsmåter som er skreddersydd for å passe til kjemien til hvert element, og slike fremgangsmåter er ikke kjent. Fremgangsmåter benyttet for Ga, In, Tc, Cu, Re osv. kan ikke bli antatt å være kompatible med de kationiske alfa-212/213t5: 212Dv 223/224t>0 225 A „

emitterne som Bi, ro, Ra, Ac osv.

Det er hensikten med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en liposomal sammensetning som omfatter liposomer og ionoforer som (1) emitterer alfa-og/eller beta-partikkelstråling (2) kan holde tilbake datternuklider når mornukliden er inkorporert i liposomet (3) kan bli fremstilt ved en aktiv inkorporeringsfremgangsmåte som er nyttig for et panel av radionuklider. Denne hensikten er oppnådd ved den foreliggende oppfinnelsen, karakterisert ved de vedlagte patentkravene.

Data er presentert som viser at denne type av liposomer kan bli benyttet for å nå kreftceller, spesielt dersom reseptorbindende molekyler er koblet til membranen. Liposomene kan bli fremstilt med eller uten PEG koblet til membranen. De radioaktive liposomene ble fremstilt ved å benytte aktiv inkorporering av radionukliden, det vil si via ionofor og fremstilt i henhold til fremgangsmåter som gir liposomer med størrelse større enn 100 nm.

De foreliggende oppfinnerne har gjort den signifikante og uventede oppdagelsen at 010 Bi ikke translokaliserte signifikant etter nedbrytningen av <010>Pb inkorporert i denne type av liposomer. Nåværende status for anvendelsen av <212>Pb som en molekylær koblet generator for <212>Bi indikerer at en signifikant frigivelse (> 30%) finner sted fra chelatoren (McClure og Feinendegen, 1998; Mirzadeh et al., 1993). Ved å fange <212>Pb i en høy konsentrasjon av chelator, så som for eksempel over på innsiden av liposomet, kan frigivelse av datterproduktet bli unngått, gitt et konjugatorsystem som kan bli benyttet for å fange datternukliden etter nukleær transformasjon. Dette er første gang et konjugatsystem for <212>Pb som kunne holde tilbake <212>Bi datternukliden nesten kvantitativt, er rapportert.

En annen viktig og overraskende oppdagelse var at den nåværende klasse av liposomer kunne inkorporere og holde tilbake <223>Ra effektivt. Dette vil representere det første konjugatsystemet som potensielt er nyttig for tumormålretting med radium-223.1 tillegg er det vist heri at også vismuth, aktinium og yttrium kan bli inkorporert og sterkt tilbakeholdt i den beskrevne type av liposomer, noe som indikerer at versjoner basert på 2<12>Bi, 21<3>Bi, <225>Ac og/eller <90>Y kan bli fremstilt og benyttet.

Den foreliggende søknaden omhandler videre en ny type av liposom, så som radiomerket PEG immunliposom konjugert til folatmerket antistoff. Det vil si antistoffet benyttet som en ytterligere kobler mellom liposomet og folat. Dersom antistoffets antigenkombinerende sete er rettet mot et tumorassosiert antigen, kan dobbel bindingsevne (dual binding ability) være mulig (det vil si affinitet for både antistoff-antigenet og folatreseptoren kan bli oppnådd). Det er vist at denne nye kombinasjonen kan bli benyttet for å målrette radionukliden til celler som uttrykker folatreseptorer. Alfa-partikkel-emittere er høy lineær energioverførings (høy-LET) strålingsemittere som er ekstremt cytotoksiske for pattedyrceller (Hall, 1994; Larsen et al., 1998; Ritter et al., 1977). Dersom en alfastrålingskilde er lokalisert i målvev, kan den avlevere stråling til et spesielt lite område og derved redusere normal vevseksponering sammenlignet med andre typer av stråling.

Den foreliggende oppfinnelsen omhandler videre fremstillingen og anvendelse av alfa-partikkel-emitterende liposomer basert på radionuklidene n * n Bi, Oll Bi, <OTT>Ra, <224>Ra, <225>Ac og <227>Th. Det er også vist at oppfinnelsen omhandler fremstillingen og anvendelsen av de beta-partikkel-emitterende nuklidene som for eksempel 90Y.

I den foreliggende oppfinnelsen blir merkingen av liposomer ved å benytte ionoforer, såvel som ved å benytte en chelator eller et komplekserende agens på innsiden av liposomene (vesikler), demonstrert.

I det etterfølgende er oppfinnelsen beskrevet i ytterligere detalj ved å referere til figurene og eksemplene.

Figur 1 Binding av PEG-liposomer som inneholder enten Fab' eller folat-merket

F ab '-antistoff konjugert til liposommembranen til OVCAR 3-celler.

Figur 2 Binding av folaterte versus ikke-folaterte PEG-liposomer til OVCAR 3-celler.

EKSPERIMENTELT

Forkortelser:

DSPC: distearoylfosfatidylcholin

DOTA: 1,4,7,10 tetraazasyklododecan 1,4,7,10 N, N\ N", N"' tetraeddiksyre DSPE-PEG2000-MPB: N-(4-(p-maleimidofenyl)butyryl)-l,2-distearolyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin (Northern Lipids, VA, Canada)

HEPES: N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre

PBS: fosfatbufret saltløsning

EDTA: etyldiamin N,N'-tetra eddiksyre

HDEHP: bis(2-etylheksyl) fosforsyre

Gamma-spektroskopi ble utført ved å benytte germaniumdetektor (Canberra, Medden, CT, USA) koblet til en multikanalanalyserer (EG&G ORTEC, Oak Ridge, TN, USA). En Beckmann LS 6500 (Beckmann, Fullerton, CA, USA) ble benyttet for væskescintillasjonstelling. DSPC og kolesterol ble skaffet fra Northern Lipids (Vancouver, Canada). Sephadex G-25 PD-10-kolonner (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) ble benyttet for rensingen av radiomerkede liposomer. Den makrosykliske chelatoren DOTA ble benyttet som intra-liposomal chelator, og ble kjøpt fra (Macrocyclics, Richardson, TX, USA). Ultrex kvalitet HN03 (J.T. Baker, Philipsburg, NJ, USA) og 6 M HC1 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA) og bis(2-etylheksyl)fosforsyre (HDEHP) fra Fluka (via Sigma-Aldrich AS, Norge) ble benyttet i studiet.

Alle bufrene som ble benyttet for den ionoformedierte kationlastingen av liposomer ble justert til den ønskede pH ved å benytte arginin (fri base). Alt vannet som ble benyttet ble oppnådd fra et Milli-Q vannrensingssystem (Millipore, Bedford, MA, USA). Ionebytter-resiner ble skaffet til veie fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA).

Resinene ble forbehandlet ved vasking med vann, deretter 6 M HC1 etterfulgt av aceton, og til sist med vann. Resinene ble lagret i vann før kolonnepakking.

DMSO som ble benyttet ble lagret med 4 Å sieves.

<232>Th(N03)4 som ble benyttet i dette arbeidet hadde blitt lagret i mer enn 20 år. Prøven ble tilveiebragt av Nukleærkjemigruppen, avdeling for kjemi ved Universitetet i Oslo, Oslo, Norge.

<3>H-folsyre ble skaffet til veie fra Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire,

UK).

Alle andre kjemikaliene ble skaffet til veie fra Sigma-Aldrich, Norge.

Tabell 1 viser noen fysiske egenskaper av radionuklider som er benyttet i eksperimentene med liposomer.

<*>Kun den mest tilgjengelige gamma-strålingen er listet for hver radionuklide. Data fra Nuclear Data Sheets, Academic Press Inc.

Små unilamellerte vesikler (< 100 nm) ble fremstilt ved tynn lipidfilmhydrering og ekstrusjon (Olson et al. 1979, Mac Donald et al. 1991) på følgende måte: DSPC og kolesterol i et 2:1 molart forhold, vanligvis henholdsvis 10 og 5 umol, ble løst opp i kloroform i en rundbunnet flaske. Løsningsmiddelet ble fjernet ved rotasjonsfordamping ved å benytte redusert trykk. Den tørre lipidfilmen ble deretter hydrert i 0,1-1 ml med 150 mM sitronsyre, 30 mM DOTA, pH 4. Den resulterende suspensjonen ble utsatt for fem sykluser med frysing og tining etterfulgt av repetert ekstrusjon gjennom polykarbonatfiltere på 100 nm porestørrelse 5 ganger, og 50 nm porestørrelse 5 ganger ved å benytte en manuell ekstruderingsanordning (Avestin, Ottawa, Canada). Produktet hadde en lipidkonsentrasjon på ~ 30 mM. Før radionuklidlastingen av liposomene ble den eksterne løsningen byttet ut ved eluering på en PD-10-kolonne for 250 mM sukrose, 20 mM HEPES, pH 7,4.

Separering av liposomassosiert radionuklide fra ikke-assosiert radionuklide ble oppnådd ved anvendelsen av størrelseseksklusjonskromatografi (Mauk og Gamble 1979, Tilcock et al. 1991). For separeringene etter liposomlastingsprosedyrene, ble PD-10 størrelseseksklusjonskolonner benyttet. Fra påførte volumer på 1 ml eller mindre på PD-10-kolonnene eluerte liposomene i de første 4,5 ml. Radionuklider som ikke var assosiert med liposomer eluerte i fraksjonen som korresponderte til lav molekylærvekt spesier. PD-10-kolonnene ble også benyttet i studiet for stabilitet (med hensyn til radionuklidretensjon) av de lastede liposomene i PBS.

Separeringen av liposomassosierte radionuklider fra frie radionuklider i serumet ble utført ved størrelseseksklusjonskromatografi på en Sepharose CL-4B-kolonne (Hwang og Mauk, 1977).

EDTA ble tilsatt rett før den kromatografiske fremgangsmåten for å stabilisere den frie radionukliden i en tilstand som enkelt kunne bli separert fra den liposomassosierte fraksjonen.

Radionuklidelastingsutbyttet for, og latenstiden til liposomassosierte radionuklider, ble etablert ved gamma-spektroskopi for <228>Ac, <223>Ra, <212>Pb, <212>Bi, <205>Bi og <207>Bi. Radionuklidelastingsutbyttet for, og latenstiden til den liposomassosierte <90>Y ble etablert ved væskescintillasjonstelling. <228>Ac og <205/207>Bi ble benyttet som en tracer for de potensielt terapeutisk nyttige radionuklidene, henholdsvis 225Ac, 212Bi og 213Bi.

Eksempel 1: Lasting av <223>Ra i liposomer

22<3>Ra ble fremstilt fra en generator basert på <227>Ac som beskrevet (Larsen og Henriksen, 1999). I korthet blir <227>Ac og dens datternuklide <227>Th, holdt tilbake i

en kolonne med et ekstraksjonskromatografisk harpiks som fasiliterer elueringen av Ra, ved å benytte en mineralsyre. For å inkorporere radium inn i liposomene, ble den eluerte løsningen fra generatoren fordampet til tørrhet og <223>Ra ble deretter løst opp i 5 mM citrat, pH 7,4.

Liposomer som korresponderer til en lipidkonsentrasjon på 30-60 mM ble blandet kraftig med en film med ionoforen A23187 (10-13 nmol av den indre overflaten av et glassrør). Deretter ble omkring 50 kBq av <223>Ra tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 75°C i 20 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt til 100 ul med 10 mM EDTA, og eluert på en PD-10-kolonne for å isolere radioaktiviteten assosiert med lipidvesiklene.

Retensjonen av liposomassosiert <223>Ra ble studert ved å inkubere vesiklene ved 37° C i humant serum (Sigma), eller 5 mM EDTA i humant serum ved en liposomkonsentrasjon på 0,3 mg total lipid/ml serum. Resultatet er vist i tabell 2, og demonstrerer at <223>Ra er svært stabilt tilbakeholdt i liposomene.

Eksempel 2: Å bestemme hvorvidt relasting ville bidra i <223>Ra-retens j onseksperimentet

Metoder: Liposomer som korresponderer til 30-60 mM lipid, dannet ved hydrering av lipidfilmer med 150 mM sitronsyre, 30 mM DOTA, ekstern løsning PBS eller serum, ble tilsatt til en film med ionoforen A23187 (10-13 nmol distribuert på den indre overflaten til et glassrør). <223>Ra i 5mM citrat pH 7,4 ble deretter tilsatt, etterfulgt av inkubering ved 37°C. Porsjoner av løsningen ble påført til PD-10-kolonnene, og den kromatografisk oppnådde fraksjonen som korresponderer til liposomene ble studert ved den indre Ge-detektoren.

Resultater: Mindre enn 0,2% av den tilsatte aktiviteten ble funnet å være assosiert med liposomene i inkuberingstider på opptil 3 dager.

Eksempel 3: Lasting av <212>Pb/<2>1<2>Bi i liposomer

Metoder: 21<2>Pb/<212>Bi ble fremstilt via emanasjon av <220>Rn fra en <228>Th kilde, som beskrevet av Hassfjell og Hoff (1994). Ingen bærer tilsatt 212Pb/212Bi lekket fra det samlede røret når det ble benyttet 0,1 M HNO3, og løsningen ble påført en 2 x 20 mm kolonne med AG 50W-X4 kationutbytterresin. 212Pb/<212>Bi ble deretter eluert i 2 M HC1, og løsningen ble fordampet til tørrhet. <212>Pb/<2>1<2>Bi ble deretter oppløst i 200 \ il 10 mM acetatløsning, pH 5.<212>Pb ble kvantifisert ved målinger av dens 238,6 keV gamma-stråling (tabell 1).212Bi ble kvantifisert ved å måle den 583,1 keV gamma-strålingen til dens datter <208>T1 ved radioaktiv likevekt.

Lipsomer som korresponderer til en lipidkonsentrasjon på 30-60 mM ble kraftig blandet med en film av ionoforen A23187 (10-13 nM). Omkring 1 MBq med <2>i2pb/2i<2>Bi ble deretter tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 75°C i 30 minutter etterfulgt av eluering på en PD-10-kolonne. Fraksjonen som inneholdt mer enn 95% av de lastede vesiklene ble deretter eluert på en annen PD-10-kolonne. Latenstiden til det liposomassosierte 010 Pb/ 010Bi ble studert ved å inkubere vesiklene ved 37°C i humant serum eller PBS. Aktivitetsfordelingen ble fulgt over en 24 timers periode.

Resultater: Lastingseffektivitet av <212>Pb: 34,8% (n = 3).

Retensjon ble målt ved gammaspektroskopi og mer enn 99% av <212>Pb var assosiert med liposomene for inkuberingstider i opptil 24 timer.

Eksempel 4: Retensjon av 21<2>Bi dannet fra nedbrytingen av liposomassosiert 212Pb

Metoder: Liposomer ble lastet med <212>Pb som beskrevet over. Den liposomassosierte radioaktiviteten ble isolert ved å eluere reaksjonsblandingen med 10 mM EDTA i PBS på en PD-10-kolonne preekvilibrert med 10 mM EDTA i PBS.

Etter 3 timer, for å sikre at transient likevekt mellom <212>Pb og 212Bi var etablert, ble porsjoner av løsningen påført PD-10-kolonnene preekvilibrert med 10 mM EDTA i PBS for separasjon av frie radionuklider fra liposomassosierte radionuklider. Aktivitetsfordelingen ble fulgt over en 24 timers periode.

En separat porsjon av de merkede liposomene som ikke hadde undergått separasjonsprosedyren (av identisk geometri til den oppnådd fra kromatografiske prosedyrer) ble målt for anvendelse som en standard. Dette ble utført for å etablere aktivitetsforholdet mellom <2>12Bi/<212>Pb ved radioaktiv likevekt.

Resultater: Ved å sammenligne forholdet mellom <212>Bi/<2>1<2>Pb oppnådd for de kromatografisk separerte liposomene med det til likevektsblandingen, ble det estimert at mer enn 95% av <212>Bi ble vist å være tilbakeholdt i liposomene etter nedbrytingen av liposomassosiert <212>Pb.

I tillegg ble målinger av <212>Bi-aktivitet i de to kromatografisk oppnådde fraksjonene sammenlignet. Mer enn 99% av den totale <212>Bi-aktiviteten eluerte i fraksjonene som korresponderer til liposomene.

Eksempel 5: Å studere mulig Pb og Bi relasting i liposomer

Metoder: Liposomer som korresponderer til 30-60 mM lipid, som inneholder 150 mM sitronsyre, 20 mM DOTA, og ved å benytte en ekstern løsning som inneholder 10 mM EDTA i PBS, ble tilsatt til en film med ionoforen A23187 (20-26 nmol på innsiden av overflaten på et glassrør).21<2>Pb og <212>Bi i PBS ble deretter tilsatt, etterfulgt av inkubering ved 37°C. Porsjoner av løsningen ble eluert gjennom PD-10-kolonner, og de kromatografisk oppnådde fraksjonene som korresponderer til liposomeluatet ble studert ved den innvendige Ge-detektoren.

Resultater: Ingen detekterbar lasting (< 1%) av 21<2>Pb og <212>Bi ble observert over en 24 timers periode.

Eksempel 6: Lasting av <207>Bi i liposomer

Metoder: <203->207Bi ble fremstilt ved (p, ? xn) reaksjoner på naturlig blymål, og renset ved å benytte et blyselektivt ekstraksjonskromatografisk resin (Henriksen og Hoff, 1998).

En isotopisk Bi-blanding som hovedsakelig besto av <205>Bi og <2>0<7>Bi, heretter referert til som <207>Bi, ble benyttet i dette studiet. 50 ul av en løsning med <207>Bi i IO"<4> M HC1 ble tilsatt til liposomene, korresponderende 30-60 mM med lipid, som på forhånd hadde blitt blandet med en film med ionoforen A23187 (10-13 nmol på den indre overflaten av et glassrør) inkubert i 30 minutter ved 75°C. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt 100 med 10 mM EDTA, og eluert på en PD-10-kolonne for å isolere radioaktiviteten assosiert med lipidvesiklene.

Resultater: 32% av det totale <207>Bi ble funnet å være assosiert med liposomene.

Eksempel 7: Lasting av <228>Ac i liposomer

Metoder: * yyo Ac ble isolert fra en <OIO>Th(N03)4-<p>reparering ved en kombinasjon med løsningsmiddelekstraksjon og ioneutbytte. <232>Th(N03)4 (4H20 originalt) ble løst opp i 20 ml 0,1 M HN03 og tilsatt til en 500 ml separasjonstrakt og kontaktet med 5 x 100 ml av en 2 M løsning med HDEHP i heptan. Den vandige fasen ble deretter vasket tre ganger med heptan og deretter påført til en 3 x 40 mm kolonne med AG50W-X12 kationutbytterharpiks for isolering av <228>Ac som beskrevet (Cabell, 1959). Fra kolonnen ble 212Pb, 212Bi, 224Ra og <228>Ra eluert i 3 M HN03, og løsningen ble etterlatt i > 20 timer. Løsningen ble deretter fordampet til tørrhet etterfulgt av lekking av radionuklider fra røret, med 1 ml 1 M HNO3. Denne løsningen ble påført til en 3 x 40 mm kolonne av AG50W-X12. Igjen ble 212Pb, <212>Bi, <224>Ra og <228>Ra eluert i 3 M HN03 . <228>Ac ble eluert i 6 M HN03, og eluatet fordampet til tørrhet. <228>Ac ble deretter vasket ut fra beholderen ved å benytte 200 ul 5 mM HNO3. Omkring 6 kBq med <228>Ac ble tilsatt til liposomene som inneholdt ionoforen A23187 som beskrevet over, og inkubert i 60 minutter ved 75°C.

Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt til 100 ul med 10 mM EDTA og eluert på en PD-10-kolonne for å isolere radioaktiviteten assosiert med lipidvesiklene. Fraksjoner som korresponderte til mer enn 95% av de lastede vesiklene ble slått sammen, og deretter eluert på en ny PD-10-kolonne. Den liposomale retensjonen av <00R>Ac ble studert ved å inkubere de radiomerkede vesiklene ved 37°C i humant serum eller PBS. Aktivitetsdistribueringen ble fulgt over en 24 timers periode. Resultater: I lastingseksperimentet var 90-95% av det tilsatte <228>Ac (korrigert for nedbryting i løpet av lasting og rensing) assosiert med liposomene etter lastingsprosedyren. I retensjonseksperimentet var mer enn 98% av <228>Ac funnet å være assosiert med liposomene for inkuberingstider på opptil 24 timer.

Eksempel 8: Lasting av 90Y

Metoder: 90Y og <90>Sr ble målt ved væskescintillasjonstelling i dette studiet.

<90>Y var isolert fra <90>Sr ved hjelp av et strontiumselektivt

ekstraksjonskromatografisk resin som beskrevet av Dietz og Horowitz (1992). Her ble <90>Sr (Amersham, Buckinghamshire, England) i 0,1 M HNO3 fordampet til tørrhet, og resten tilsatt 3 M HNO3. Løsningen ble lastet på en 3 x 20 mm kolonne med Sr-resin (EiChroM, Darien, IL, USA), og kolonnen ble vasket med 5 ml 3 M HNO3.

Denne fremgangsmåten eluerer selektivt <90>Y, mens Sr er tilstrekkelig tilbakeholdt i kolonnen for å senke 90Sr-innholdet av en 90Sr/<90>Y-blanding med en faktor på omkring 10<3> (Dietz og Horwitz, 1992). Etter dette ble <90>Sr strippet fra kolonnen ved å benytte 0,05 M HNO3, og denne løsningen ble etterlatt i en uke for å tillate <90>Y å vokse i den. Deretter ble løsningen fordampet til tørrhet, og resten ble tilsatt 3 M HNO3 før separering av radionuklidene på en andre kolonne med Sr-resin. Eluatet som inneholdt <90>Y ble fordampet til tørrhet, og radionukliden vasket fra beholderen ved å benytte 200 ul 5 mM HNO3. Denne løsningen ble tilsatt til liposomer som inneholdt ionoforen A23187 (som beskrevet tidligere), og inkubert i 60 minutter ved 75°C. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt 50 ul 10 mM EDTA, og eluert på en PD-10-kolonne for å isolere radioaktiviteten assosiert med lipidvesiklene. Fraksjonen som korresponderte til mer enn 95% av vesiklene ble deretter eluert på en andre PD-10-kolonne. Liposomretensjonen til det liposomassosierte <90>Y ble studert ved å inkubere vesiklene ved 37°C i humant serum eller PBS. Aktivitetsdistribueringen ble fulgt over en 4 dagers periode.

Resultater: Mer enn 95% av det tilsatte <90>Y var assosiert med liposomer etter 1 time med lasting og rensing på geleksklusjonskolonne.

I studiet med liposomal retensjon ble de følgende resultatene oppnådd: Etter 5 timer og 1 dag, var mer enn 99% av liposomene assosiert. Etter 4 dager var den liposomassosierte fraksjonen bestemt til å være 98 + 1%.

Som vist i disse eksperimentene kan liposomer bli radiomerket med alfa-partikkel-og/eller beta-partikkel-emitterende radionuklider, og holde tilbake disse nuklidene godt ved fysiologisk temperatur.

Eksempel 9: Fremstilling av yttrium 90 / radium-223 PEG-liposom-folsyre (FA) -antigensbindende del' (Fab').

F(ab')2RØ myelom (subklasse IgGi) 14 mg/ml i PBS ble oppnådd som en gave fra Dr. Terje Michalsen, Statens institutt for folkehelse, Oslo, Norge.

Folsyre«2H20 ble ført oppløst i dimetylsulfoksid (Fluka, H20-innhold mindre enn 0,05%). Løsningen ble deretter kannylert over på aktiverte 4 Å siler (Fluka) og lagret under en argonatmosfære i mørket i 6-10 timer. <3>H-folsyre ble tilsatt som en vandig løsning av kaliumsaltet til <3>H-folsyre (1% med hensyn til sitronsyre). Den spesifikke aktiviteten til <3>H-folsyren benyttet for konjugering til protein var 7-7,5 GBq/mol.

<3>H-folsyren ble aktivert for kobling til F(ab')2 myelomantistoff ved å tilsette 10 mol ekvivalenter av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid til folsyreløsningen, og å inkubere i 30 minutter ved omgivelsestemperatur. Deretter ble et 30-40 gangers molart overskudd av den aktiverte folsyren tilsatt til protein, 14 mg/ml i PBS, og tillatt å reagere i 30-60 minutter. Reaksjonen ble undertrykket ved å tilsette 0,2 ml med 0,3 M glycin i PBS/borat, pH 8,5. Folsyren F(ab')2-konjugatet (FA-F(ab')2) ble separert fra ikke-reagert materiale ved å benytte en PD-10-kolonne preekvilibrert i PBS. For å danne FA-Fab', ble FA-F(ab')2 inkubert i 1 mM DTT ved omgivelsestemperatur i 2 timer, etterfulgt av eluering på en NAP-5 størrelseseksklusjonskolonne. Fraksjonen som inneholdt FA-Fab' ble deoksygenert ved å boble argon gjennom løsningen, hvoretter løsningen umiddelbart ble blandet med liposomløsningen.

Graden av folsyre konjugert ble bestemt ved <3>H-innholdet til det rensede proteinet, målt ved væskescintillasjonstelling (Beckmann LS6500) kombinert med spektrofotometriske lesninger ved 280 nm.

For kvantifisering av den liposombundede fraksjonen av FA-Fab', ble en spormengde med iodinert F(ab')2 tilsatt før reaksjonen med DTT. (Proteinet var iodinert via IodoGen i henhold til standard prosedyrer).

DSPE-PEG2000-MPB, natriumsalt ble inkludert ved 5 mol% av total fosfolipid. Liposomer ble på annen måte konstituert, og var også fremstilt for det ionoformedierte kationlastingstrinnet på en identisk måte til den beskrevet for ikke-PEGylerte liposomer.

Etter å ha tillatt reaksjonsblandingen etter lastingstrinnet, å nå romtemperatur, ble liposomsuspensjonen deoksygenert før tilsetting av FA-Fab' for å oppnå en proteinkonsentrasjon på 0,3-0,5 mg/ml. Lipidkonsentrasjon var 1-3 mM, bestemt ved Bartlett fosforassayet (Bartlett, 1958). FA-Fab' og liposomer ble tillatt å reagere i 2 timer ved omgivelsestemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter applisert på en PD-10-kolonne ekvilibrert i PBS. FA-Fab' konjugerte PEG-liposomer ble lagret ved 4°C i 12-15 timer før anvendelse i folat-reseptorbindingsassayer.

Liposombundet radioaktivitet ble målt ved Nal brønntypedetektor, som korrigerer for »spillover» i de respektive kanalene fra de dobbeltmerkede prøvene. Prøver av enkeltnuklid og blandinger av nuklidene ble brukt som referanser.

Fra radioaktivitetsmålingene ble proteinkonsentrasjonen omdannet til antallet med Fab' pr. liposom, ved å anta en liposomstørrelse på 100 nm og 8«10<4 >fosfolipider/vesikler (Kirpotin et al. 1997), og en molekylvekt på Fab' myelomantistoffet tilsvarende til 52 000.

Den cellebundede reaktiviteten ble målt ved en Nal-detektoren (3 høyere konsentrasjoner for Y-90) og væskescintillasjonstelling, etter å ha tilsatt Insta-Gel pluss (Packard) (tabell 3).

Deteksjon av <3>H-FA på liposomer

PEG-liposomer (2,5 mM lipidkonsentrasjon) i 20 mM HEPES/300 mM sukrose ble reagert med 3-FA-konjugert Fab' (0,5 mg/ml i PBS, FA/Fab'-forhold på 2 ± 0,2).

Etter 2 timer ved romtemperatur var de FA-Fab'-koblede liposomene isolert ved eluering på en kolonne av Sepharose CL-4B. Mengden med <3>H-FA-Fab' på liposomene ble kvantifisert ved væskescintillasjonstelling av de kromatografisk oppnådde fraksjonene.

Resultater: FA-FabVliposomforholdet ble bestemt til å være omkring 110.

Bærertilsatt yttriuminkorporering i PEG-liposomer

Liposomer ble konstituert og preparert som beskrevet over (DSPC:Chol 2:1, DSPE-PEG2000-MPB korresponderende til 5 mol% av fosfolipid, lagret i 24 timer ved 4° C i 20 mM HEPES/300 mM sukrose).

Yttrium-løsningen ble fremstilt fra YC13»6H20 (Fluka, laget av > 99,9% Y) ved sekvensiell fortynning.

Liposomer (100 ul, 6 mM total lipid) ble tilsatt til varierende mengder med YCI3 (50 ul) som ble spisset med yttrium-90 (tilsatt 15 ul med 0,5 M HN03). Y hadde på forhånd vært kontaktet med en film med ionoforen A23187 som beskrevet for lastingen av bare liposomer.

Blandingen ble eksponert for en temperatur på 75°C i 1,25 timer, tilsatt 100 ul 5 mM EDTA og påført til en PD-10-kolonne for separering av liposomer og små molekyl vektspesi er.

Resultater:

Referanser:

Bartlett GR. Phosphorus assay in column Chromatography. J. Biol. Chem. 234 (3), 466-468 (1958).

Cabell MJ. The purification, determination and neutron capture cross section of actinium-227. Can. J. Chem. 37, 1094-1101, (1959).

DeVita Jr VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer. Principles & practice of oncology. 5. utgave Lippincot-Raven, Philadelphia, New York, USA (1997). Dietz ML og Horwitz EP. Improved chemistry for the production of Y-90 for medical applications. Appl. Radiat. Isot. 43, 1093-1101 (1992).

Forssen EA. The design and development of DaunoXome® for solid tumour targeting in vivo. Adv. Drug Delivery Rev. 24, 133-150 (1997).

Gabizon R, Horowitz AT, Goren D, Tzemach D, Mandelbaum-Shavit F, Quasen MM og Zalipsky S. Targeting Folate receptor with folate linked to extremities of poly(ethylene glycol)-grafted liposomes: In vitro studies. Bioconjugate Chem. 10, 289-298 (1999).

Gabison A. Liposome circulation time and tumor targeting: Implication for cancer chemotherapy. Adv. Drug Delivery Rev. 16, 285-294 (1995).

Gaze MN. The current status of targeted radiotherapy in clinical practice. Phys. Med. Bol. 41, 1895-1903 (1996).

Goins B, Phillips WT og Klipper R. Repeat injection studies of technetium-99m labelled PEG-liposomes in the same animal. J. Liposome Res. 8(2), 265-281

(1998).

Hall E. Radiobiology for the radiologist. 4. utgave. JB Lippincott Company, Philadelphia, USA (1994).

Hassfjell SP og Hoff P. A generator for production of Pb-212 and Bi-212. Appl. Radiat. Isot. 45, 1021-1025 (1994).

Henriksen G og Hoff P. Isolation of cyclotron produced Bi-205, Bi-206 and Pb-203 using a lead-selective extraction chromatographic resin. Appl. Radiat. Isot. 49, 357-359 (1998).

Hwang KJ og Mauk MR. Fate of lipid vesicles in vivo: A gamma-ray perturbed angular correlation study. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 4991-4995 (1977).

Kirpotin D, Park JW, Hong K, Zalipsky S, Wen-Lu L, Carter P, Benz CC og Papahadjopoulos D. Sterically stabilised Anti-HER2 Immunoliposomes: Design and targeting to human breast cancer cells in Vitro. Biochemistry, 36, 66-75, 1997.

Kostarelos K, Emfietzoglou D og Stamatelou M. Liposome-mediated delivery of radionuclides to tumor models for cancer radiotherapy: A quantitative analysis. J. Liposome Res. 9(3), 407-424 (1999).

Larsen RH, Akabani G, Welsh P og Zalutsky MR. The cytotoxicity and microdosimetry of astatine-211-labeled chimeric monoclonal antibodies in human glioma and melanoma cells in vitro. Radiat. Res. 149, 155-162 (1998).

Larsen RH, Henriksen G. Norsk patentsøknad nr. P990001 (1999).

Lee RJ og Low PS. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 269, 3198-3204 (1994).

MacDonald RC, MacDonald RI, Menco BPhM., Takeshita K, Subbarao NK og Hu Lan-rong. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Bioch. Biophys. Acta 1061, 297-303 (1991).

Maruyama K, Takizawa T, Takahashi N, Tagawa T, Nagaike K og Iwatsuru M. Targeting efficiency of PEG-immunoliposome-conjugated antibodies at PEG terminals. Adv. Drug Delivery Rev. 24, 235-242 (1997).

Mauk MR og Gamble RC. Preparation of lipid vesicles containing high level of entrapped radioactive cations. Anal. Biochem. 94, 302-307 (1979).

McClure JJ og Feinendegen, LE. Alpha-emitters for medical therapy: Second Bi-annual Workshop, Toronto, Canada, June 4-5, 1998. Rapport fra Department of Energy, Germantown, MD, USA.

Mirzadeh S, Kumar K, Ganzow, OA. The chemical fate of 212Bi-DOTA formed by b-decay of 212Pb(DOTA)2-. Radiochimica Acta, 60, 1-10 (1993).

Ogihara-Umeda I, Sasaki T, Kojima S, Nishigori H. Optimal radiolabeled liposomes for tumor imaging. J. Nucl. Med. 37 (2), 326-332 (1996).

Olson F, Hunt CA, Szoka F, Vail WJ og Papahadjopoulos D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Bioch. Biophys. Acta 557, 9-23 (1979).

Pikul II SS, Parks NJ, Schneider PD. In vitro killing og melanoma by liposome delivered intracellular irradiation. Arch. Surg. 122, 1417-1420 (1987).

Ritter MA, Cleaver JE og Tobias CA. High-LET radiations induce a large proportion of non-rejoining DNA-breaks. Nature 266, 653-655 (1977).

Tilcock CP, Ahkong QF og Parr M. An improved method for the preparation of liposomal gadolinium-DTPA-Ionophore-Mediated active entrapment of gadolinium. Invest. Radiol. 26, 242-247 (1991).

Turner AF, Presant CA, Proffitt RT, Williams LE, Winsor DW og Werner JL. In-111-labeled liposomes: Dosimetry and tumor depiction. Radiology 166(3), 761-765

(1988).

Claims (29)

1. Liposomal sammensetning, karakterisert ved at den omfatter liposomer og ionoforer hvor nevnte liposomer inneholder et kompleks av en chelator og en tung radionuklide, hvor nevnte radionuklide er en a- eller P -partikkelemitter.

2. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte chelator er i stand til å kompleksere et datternuklide av nevnte radionuklide.

3. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte liposomer inneholder nevnte chelatorer i en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å holde tilbake nevnte datternuklide.

4. Sammensetning som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte liposomer inneholder nevnte chelator i en konsentrasjon på minst 0,5 mM

5. Sammensetning som angitt i kravene 1-4, karakterisert ved at chelatoren er valgt fra gruppen som omfatter 1,4,7,10 tetraazasyklododekan-1,4,7,10 N,N',N",N'"-tetraeddiksyre (DOTA), 1,4,7,10 tetraazasyklotridekan-1,4,7,10 N,N',N'\N'''-tetraeddiksyre (TRITA), 1,4,8,11 tetraazasyklotetradekan-1,4,8,11 N,N\N",N"'-tetraeddiksyre (TETA), 1,4,7,10 tetraazasyklododekan-1,4,7,10 N,N',N",N"'-tetra(metylen)fosforsyre (DOTMP), 1,4,7,10 tetraazasyklotridekan-1,4,7,10 N,N',N",N" '-tetra(metylen)fosforsyre, 1,4,7,10 tetraazasyklotetradekan-1,4,7,10 N,N',N",N'"-tetra(metylen)fosforsyre, dietyletriamin N,N',N" pentaeddiksyre og isomere derivater derav, cryptat[2,2,2], cryptat[3,2,2], cryptat[2,2,l] og mono og di-benzoderivater derav, brobundede caliks[4]arener som inneholder elektronrike (donor) grupper (hydroksyl, karboksyl, ester, amid, amin), 1,10 diaza-4,7,13,16-tetraoksasyklooktadekan-l,10 N,N' bis-eddiksyre, og 1,10 diaza-4,7,13,16-tetraoksasyklooktadekan-l,10 N,N' bis-malonat.

6. Sammensetning som angitt i krav 5, karakterisert ved at nevnte elektrondonorgrupper er valgt fra hydroksyl, karboksyl, ester, amid og amingrupper.

7. Sammensetning som angitt i et av kravene 1-6, karakterisert ved at nevnte radionuklide er en a-emitter.

8. Sammensetning som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte radionuklide er valgt fra gruppen som omfatter 211 At, 212Bi <213> Bi, <2,>2Pb, 225Ac, <223>Ra, <224>Ra og <227>Th.

9. Sammensetning som angitt i krav 8 karakterisert ved at nevnte radionuklide er <212>Pb.

10. Sammensetning som angitt i et av kravene 1-6, karakterisert ved at nevnte radionuklide er en P-emitter.

11. Sammensetning som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte radionuklide er valgt fra <131>I og <153>Sm.

12. Sammensetning som angitt i et av kravene 1-11, karakterisert ved at nevnte radionuklide er et tungmetall radionuklide.

13. Sammensetning som angitt i et av kravene 1-12, karakterisert ved at nevnte liposomer har konjugert dertil grupper som er konjugerbare til proteiner eller andre reseptoraffinitetsmolekyler.

14. Sammensetning som angitt i krav 13, karakterisert ved at nevnte liposomer har transplantert dertil polyetylenglykolkjeder som bærer grupper som er konjugerbare til proteiner eller andre reseptoraffinitetsmolekyler.

15. Sammensetning som angitt i et av kravene 1 - 14, karakterisert ved at nevnte liposomer har konjugert dertil et IgM eller IgG antistoff eller et fragment eller konstrukt derav.

16. Sammensetning som angitt i krav 15, karakterisert ved at nevnte antistoff, fragment eller konstrukt er folat - og radionuklidemerket.

17. Sammensetning som angitt i et av kravene 1-15, karakterisert ved at nevnte liposomer har konjugert til sin overflate et reseptorbindende molekyl valgt fra gruppen som omfatter folatenheter, og monoklonale antistoffer og fragmenter eller konstrukter derav.

18. Sammensetning som angitt i et av kravene 15-17, karakterisert ved at nevnte antistoff, fragment eller konstrukt er valgt fra gruppen som består av murin, chimeriske og humane monoklonale og polyklonale antistoffer og fragmenter og konstrukter derav.

19. Sammensetning som angitt i et av kravene 15-18, karakterisert ved at nevnte antistoff, fragment eller konstrukt er valgt fra gruppen som består av folatmerket murine, chimeriske og fullt humaniserte monoklonale og polyklonale antistoffer og fragmenter og konstrukter derav.

20. Sammensetning som angitt i et av kravene 15 - 19, karakterisert ved nevnte antistoff, fragment eller konstrukt har bindingsaffinitet for et antigen utover det folatbindende protein.

21. Fremgangsmåte til å fremstille en liposomal sammensetning i henhold til et av kravene 1 - 20, karakterisert ved at den omfatter å blande i oppløsning et a- eller partikkelemitter tungt radionuklide, en ionofor og liposomer som inneholder en chelator, og inkubere ved en temperatur over den fysiologiske temperatur, hvorved det oppnås transport av nevnte radionuklide inn i nevnte liposomer.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, karakterisert ved at påfølgende nevnte inkubasjon blir liposomene separert fra oppløsningen hvori de ble inkubert.

23. Anvendelse av en liposomal sammensetning i henhold til et av kravene 1 - 20, for fremstilling av en farmasøytisk oppløsning for injeksjon eller infusjon inn i pattedyr for behandling derav.

24. Anvendelse som angitt i krav 23 for fremstilling av nevnte oppløsning for intravenøs, regional eller intratumoral injeksjon eller infusjon.

25. Anvendelse som angitt i et av kravene 23 og 24 for fremstilling av en oppløsning for anvendelse i en kombinasjonsterapi, hvori nevnte pattedyr også blir behandlet med et radioimmunokonjugat, et terapeutisk radiofarmasøytisk middel, kjemoterapi, ytre stråleterapi eller kirurgi for å behandle maligniteter deri.

26. Anvendelse som angitt i et av kravene 23- 25 for fremstilling av nevnte oppløsning for injeksjon eller infusjon inn i mennesker.

27. Sett for fremstilling av en sammensetning i henhold til et av kravene 1 -20, karakterisert ved at nevnte sett omfatter en ampulle som inneholder liposomer i en oppløsning og en ampulle som inneholder en radioisotop i oppløsning, hvor innholdene i ampullene kan blandes for å utføre radiomerking av nevnte liposomer.

28. Sett som angitt i krav 27, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en tredje ampulle som inneholder et molekyl med reseptoraffinitet, hvorved innholdene av nevnte første, andre og tredje ampulle kan blandes for å utføre radiomerking og reseptoraffinitets molekylmerkning av nevnte liposomer.

29. Sett som angitt i et av kravene 27 og 28, karakterisert ved at nevnte liposomer inneholder en chelator og ved at en ampulle i nevnte sett inneholder en ionofor.