CZ299452B6 - Monoklonální, pozmenená, humanizovaná a chimerická protilátka a farmaceutický prostredek obsahujícípozmenenou protilátku - Google Patents

Abstract

Jsou popsány monoklonální protilátky, pozmenené protilátky, humanizované protilátky, chimerické protilátky a farmaceutický prostredek, který obsahujepozmenenou protilátku. Tyto monoklonální protilátky jsou úcinné proti koagulacním faktorum a nacházejí použití pro inhibici trombózy.

Description

Monoklonální, pozměněná, humanizovaná a chimérická protilátka a farmaceutický prostředek obsahující pozměněnou protilátku (57) Anotace:

Jsou popsány monoklonální protilátky, pozměněné protilátky, humanizované protilátky, chimérické protilátky a farmaceutický prostředek, který obsahuje pozměněnou protilátku. Tyto monoklonální protilátky jsou účinné proti koagulačním faktorům a nacházejí použití pro inhibicí trombózy.

Monoklonální, pozměněná, humanizovaná a chimérická protilátka a farmaceutický prostředek obsahující pozměněnou protilátku

Oblast techniky

Tento vynález se týká monoklonálních protilátek (mAb), které se váží na lidský koagulační faktor neboli kofaktor ajejich použití jako inhibitorů trombózy s vlastním vymezením. Tento vynález se konkrétně týká monoklonální protilátky, pozměněné protilátky, humanizované protilátky, chime10 rické protilátky a farmaceutického prostředku obsahujícího pozměněnou protilátku.

Dosavadní stav techniky

Za normálních okolností spouští poškození, ať malé, nebo velké, cévních endotelových buněk v cévách hemostatickou odpověď zprostředkovanou sekvencí dějů obecně označovaných jako koagulační „kaskáda“. Kaskáda vrcholí konversí rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin, který spolu s destičkami tvoří lokalizovanou sraženinu neboli trombus, který brání extravasaci složek krve. Potom může proběhnout hojení a po něm rozpuštění sraženiny a obnovení integrity cév a průtoku.

Děje, které probíhají v době od poškození do tvorby sraženiny jsou důkladně regulovány a jsou spojeny sérií reakcí. Stručně uvedeno, mnoho plasmatických koagulačních proteinů v inaktivních proenzymových formách a kofaktorů cirkuluje v plasmě. V místě poškození jsou tvořeny aktivní enzymové komplexy a jsou sekvenčně aktivovány na serinové proteasy, kdy každá následující serinová proteasa katalyzuje následující proteasovou aktivaci proenzymu. Tato enzymatická kaskáda vede v každém dalším kroku k zvýšení účinku v následujícím kroku. Pro přehled o koagulační kaskádě viz první kapitola publikace „Thrombosis and Hemorrhagie“, J. Loscalzo a A. Schafer, vyd., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Anglie (1994)).

když účinné srážení limituje ztrátu krve v místě poškození, nevhodná tvorba trombů v žílách a v tepnách je často příčinou chorobného stavu a smrti. Abnormální srážecí aktivita může vést k patologickým stavům jako je infarkt myokardu, nestabilní angína pectoris, fibrilace síní, mrtvice, renální poškození, a/nebo může vznikat v důsledku léčby jako je perkutánní transluminální koronární angioplastika nebo stavů jako je disseminovaná intravaskulární koagulace, sepse, plicní embolie a trombóza hlubokého žilního systému. Tvorba sraženina na povrchu cizích těles arteficiálních orgánů, zkratů a protéz, jako jsou umělé srdeční chlopně, je také problematická.

Osvědčená antikoagulancia používaná v současné době v léčbě těchto patologií a jiných trombo40 tických a embolických onemocnění zahrnují sulfatovaný heteropolysacharidová heparin a nízkomolekulámí (LMW) heparin. Tato činidla jsou podávána parenterálně a mohou způsobit rychlou a úplnou inhibici srážení aktivací inhibitoru trombinu, antitrombinu III a inaktivaci všech srážlivých faktorů.

Nicméně, díky jejich silné účinnosti mají heparin a LMW nevýhody. Nekontrolovatelné krvácení v důsledku prostých stresových pohybů a souvisejícího kontaktu s fyzikálními objekty nebo místy chirurgického zákroku je hlavní komplikací aje pozorováno u 1 až 7 % pacientů léčených kontinuální infusí a u 8 až 14% pacientů léčených intermitentními bolusovými dávkami. Pro minimalizaci rizika jsou kontinuálně odebírány vzorky krve pro kontinuální testování ex vivo srážecích časů, což způsobuje nákladnost terapie a nepohodlí pro pacienta.

Dále, terapeutické rozmezí pro dosažení požadované účinnosti bez rizika krvácení je úzké. Terapeutický rozsah je od přibližně 1 do méně než 3 mikrogramů heparinu na ml plasmy, což vede k aktivovanému parciálnímu tromboplastinovému času (APTT) od asi 35 až do asi 100 sekund. Zvýšení koncentrace heparinu nad 3 mikrogramy na ml vyvolá překročení požadovaného

-1 CZ 299452 B6 rozmezí a při zvýšení nad 4 mikrogramy na ml není srážlivost detekovatelná. Tak musí být největší pozornost věnována udržení plasmatických koncentrací u pacienta v terapeutickém rozmezí.

Dalším osvědčeným antikoagulačním činidlem s pomalejším a dlouhodobějším účinkem je warfarin, kumarinový derivát. Warfarin působí kompeticí s vitamin K-dependentní posttranslační modifikací protrombinu a dalších srážecích faktorů závislých na vitaminu K.

Společný rys antikoagulačního účinku, při kterém je krev učiněna nesrážlivou při koncentracích pouze o málo vyšších než je terapeutický rozsah, je možné pozorovat jak pro warfarin, tak pro ío heparin a LMW heparin. Je jasné, že existuje potřeba antikogulačního činidla, které by bylo účinné při léčbě trombotických a embolických onemocnění, ale které by nezpůsobovalo nekontrolovatelné krvácení nebo jeho možnost.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je monoklonální protilátka, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 57, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 62, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 74, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminoky25 selinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 78 nebo jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 99.

Předmětem tohoto vynálezu je také pozměněná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde úseky základní struktury uvedeného těžkého a lehkého řetězce jsou odvozeny od alespoň jedné protilátky vybrané z monoklonálních protilátek vymezených svrchu a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících úseků (CDRs) těžkého řetězce jsou dány v SEQ ID NO: 8, 9 a 10 a aminokyselinové sekvence CDRs lehkého řetězce jsou dány v SEQ ID NO: 12, 13 a 14.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je pozměněná protilátka uvedená svrchu, která je humanizovaná.

Dalším výhodným provedením tohoto vynálezu je humanizovaná protilátka zmíněná svrchu,

- jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31, 52 nebo 89,

- jejíž lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 nebo 99,

- jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44,

- jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 57,

- jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 62,

- jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 74,

-jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 78, a

-2CZ 299452 B6

- jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 99.

Předmětem tohoto vynálezu je též chimérická protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, ve které jsou konstantní úseky uvedeného těžkého a lehkého řetězce odvozeny od některé z humanizovaných protilátek uvedených svrchu a aminokyselinové sekvence variabilních úseků těžkého řetězce jsou dané v SEQ ID NO: 7 a aminokyselinové sekvence variabilních úseků lehkého řetězce jsou dané v SEQ ID NO: 11.

ío Výhodným provedením tohoto vynálezu je humanizovaná protilátka popsaná svrchu, ve které jsou konstantní úseky vybrány z lidských imunoglobulinů.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek obsahující pozměněnou protilátku popsanou svrchu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek charakterizovaný výše, který dále obsahuje kyselinu acetylsalicylovou.

Dále se uvádějí podrobnější údaje související s celou šíří předmětného vynálezu. Pro dokreslení a ke srovnávacím účelům jsou uvedeny také další informace, které souvisejí s předmětným vynálezem. Tyto informace jsou charakterizovány formou jednotlivých aspektů.

Jedním aspektem je způsob pro inhibici trombózy u zvířat, který spočívá v podávání účinné dávky monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru, která má neutralizační účinnost s vlastním omezením.

Jiným aspektem vynálezu je monoklonální protilátka proti koagulačnímu faktoru, mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením proti koagulačnímu faktoru.

Jiným aspektem vynálezu je monoklonální protilátka, mající identifikační charakteristiky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732, 9E4(2)F4 nebo 11G4(1)B9.

Jiným aspektem je hybridomní buněčná linie mající identifikační charakteristiky 9E4(2)F4 nebo

11G4(1)B9).

Jiným aspektem je neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment, který je produkován delecí Fe regionu monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu.

Jiným aspektem je neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')₂ fragment, který je produkován výměnou řetězců, kdy je Fd těžký řetězec monoklonálních protilátek exprimován v myší filamentosní fágové Fab zobrazovací knihovně lehkého řetězce.

Jiným aspektem je neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')₂ fragment, který je produkován výměnou řetězců, kdy je lehký řetězec monoklonálních protilátek exprimován v myší filamentosní fágové Fab zobrazovací knihovně těžkého řetězce.

Jiným aspektem je komplementaritu určující region těžkého řetězce imunoglobulinu, mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 8, 9 a 10.

Jiným aspektem je komplementaritu určující region lehkého řetězce imunoglobulinu, mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 12, 13 a 14.

Jiným aspektem vynálezu je alterovaná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde regiony pracovních rámečků uvedených těžkých a lehkých řetězců jsou odvozeny od alespoň

-3CZ 299452 B6 jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů uvedených řetězců jsou odvozeny od monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru, mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením proti koagulačnímu faktoru.

Jiným aspektem vynálezu je chimérická protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde uvedená protilátka je charakterizována inhibicí funkce vnitřní nebo společné dráhy koagulačních faktorů s omezenou účinností, kde protilátka inhibuje trombózu a produkuje limitovanou modulaci koagulace, kde konstantní regiony uvedených těžkých a lehkých řetězců jsou odvozeny od alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence variabilních regionů uvedených řetězců jsou odvozeny od monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením proti koagulačnímu faktoru.

Ještě jiným aspektem vynálezu je farmaceutický prostředek (dále též přípravek), obsahující humanizované protilátky nebo chimérické protilátky popsané výše a farmaceuticky přijatelný nosič.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je graf experimentálních výsledků demonstrujících titraci normální lidské plasmy myšími mAb BC1 a BC2 proti faktoru IX.

Obrázek 2 je graf experimentálních výsledků demonstrujících titraci normální lidské plasmy myšími mAb 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9 proti faktoru IX.

Obrázek 3 je graf experimentálních výsledků demonstrujících titraci normální lidské plasmy myšími mAb HFXHC a HFXLC proti faktoru X a myší mAb HFXI proti faktoru IX.

Obrázek 4 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinnost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) v 60. minutě v krysím modelu trombózy karotidy.

Obrázek 5 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinnost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na protrombinový čas v 60. minutě v krysím modelu trombózy karotidy.

Obrázek 6 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinnost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na uzávěr průtoku arteria carotis v krysím modelu trombózy karotidy.

Obrázek 7 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinnost heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myších mAb proti faktoru IX na hmotnost trombu v krysím modelu trombózy karotidy.

Obrázek 8 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinnost heparinu, myší mAb BC2 proti faktoru IX, chimérické mAb proti faktoru IX a humanizované mAb proti faktoru IX na APTT v 60 minutě v krysím modelu trombózy karotidy.

Obrázek 9 je histogram experimentálních výsledků demonstrujících účinnost heparinu, myší mAb BC2 proti faktoru IX, chimérické mAb proti faktoru IX a humanizované mAb proti faktoru IX na hmotnost trombu v krysím modelu trombózy karotidy.

Předkládaný vynález poskytuje různé protilátky, pozměněné protilátky a jejich fragmenty proti koagulačním faktorům, které jsou charakterizované neutralizační aktivitou s vlastním omezením. Výhodně je koagulační faktor z vnitřní nebo ze společné dráhy. Nejvýhodněji jsou protilátky proti koagulačnímu faktoru anti-faktor IX, anti-faktor IXa, anti-faktor X, anti-faktor Xa, anti-faktor XI, anti-faktor Xla, anti-faktor VIII, anti-faktor Vlila, anti-faktor V, anti-faktor Va, anti-faktor VII, anti-faktor Víla nebo anti—trombinové. Zejména výhodné jsou protilátky proti faktoru IX. Příklady protilátek proti koagulačním faktorům jsou humanizované monoklonální

-4CZ 299452 B6 protilátky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 a SB 257732 namířené proti lidskému faktoru IX, chimérická monoklonální protilátka chaFIX namířená proti lidskému faktoru IX, myší monoklonální protilátky BC1, BC2, 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9, které jsou namířené proti lidskému faktoru IX a/nebo IXa nebo myší monoklonální protilátky HFXLC a HFXI, které jsou namířené proti lidskému faktoru X a XI, v příslušném pořadí. Nejvýhodnější je monoklonální protilátka SB 249417 proti lidskému faktoru IX.

Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny konvenčními hybridomními technikami, fágovými zobrazovacími kombinatoriálními knihovnami, přeskupováním imunoio globulinových řetězců a humanizačními technika pro vývoj nových neutralizačních protilátek s vlastním omezením. Také jsou zde obsaženy plně lidské mAb mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením. Tyto produkty jsou použitelné v terapeutických a farmaceutických přípravcích pro léčbu trombotických a embolických onemocnění asociovaných s infarktem myokardu, nestabilní angínou pectoris, plicní embolií, trombózou hlubokých žil, perkutánní transluminální koronární angioplastikou, disseminovanou intravaskulámí koagulací, sepsí, artificiálními orgány, zkraty nebo protesami.

Jak je zde použit označuje termín „neutralizační aktivita s vlastním omezením“ aktivitu protilátky, která se váže na lidský koagulační faktor, výhodně z vnitřní nebo společné dráhy, včetně faktoru IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/Va, VlI/VIIa a trombin, a inhibuje trombózu takovým způsobem, že koagulace je modulována omezeným způsobem. „Omezená modulace koagulace“ je definována jako zvýšení časů srážení, jak je měřeno prodloužením aktivovaného parciálního tromboplastinového času (APTT), kdy plasma je stále schopná srážení, s APTT dosahujícím maximálních hodnot i přes zvýšení koncentrací monoklonální protilátky. Tato ome25 zená modulace koagulace kontrastuje s nesrážlivostí plasmy a nekonečně dlouhým APTT, jak je způsobeno vyššími koncentracemi heparinu. Výhodně jsou maximální hodnoty APTT způsobů podle předkládaného vynálezu v terapeutickém rozmezí pro heparin. Nejvýhodněji je maximální APTT v rozmezí od asi 35 sekund do asi 100 sekund, což odpovídá asi 1,5-násobku až 3,5 násobku normální kontrolní hodnoty APTT. V jednom provedení vynálezu je APTT prodlouženo bez významného prodloužení protrombinového času (PT).

„Pozměněná protilátka“ označuje protein kódovaný pozměněným imunoglobulin kódujícím regionem, který může být získán expresí ve vybrané hostitelské buňce. Takové pozměněné protilátky jsou zpracované protilátky (např. chimérické nebo humanizované protilátky) nebo fragmenty protilátek bez celého nebo bez části konstantního regionu imunoglobulinu (například Fv, Fab, Fab' nebo F(ab')₂ a podobně).

„Pozměněný imunoglobulinový kódující region“ označuje sekvenci nukleové kyseliny kódující pozměněnou protilátku podle předkládaného vynálezu. Pokud je pozměněná protilátka

CDR-přenesená nebo humanizovaná protilátka, pak jsou sekvence kódující komplementaritu určující regiony (CDR) z non-lidského imunoglobulinu insertovány na první imunoglobulinový partner skládající se ze sekvencí lidských variabilních pracovních rámečků. Volitelně je první imunoglobulinový partner navázán na druhý imunoglobulinový partner.

„První imunoglobulinový partner“ označuje sekvenci nukleové kyseliny kódující lidský pracovní rámeček nebo variabilní region lidského imunoglobulinu, ve kterém jsou nativní (nebo přirozené) CDR-kodující regiony nahrazeny CDR kódujícími regiony dárcovské protilátky. Lidský variabilní region může být z imunoglobulinového těžkého řetězce, lehkého řetězce (nebo z obou), nebo jejich analog nebo funkční fragment. Takové CDR regiony, umístěné ve variabilním regionu protilátek (imunoglobulinů) mohou být určeny metodami známými v oboru. Například Rabat et al., v „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987), popisuje pravidla pro lokalizaci CDR. Kromě toho, jsou známé počítačové programy, které jsou použitelné pro identifikaci CDR region ů/struktur.

-5CZ 299452 B6 „Druhý imunoglobulinový partner“ označuje jinou nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo peptid, se kterým je první imunoglobulinový partner fušován v rámečku nebo pomocí volitelné běžné linkerové sekvence (tj. operativně navázán). Výhodně to je imunoglobulinový gen. Druhý imunoglobulinový partner může obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující celý konstantní region pro stejnou (tj. homologní, kde první a druhá pozměněná protilátka jsou odvozeny ze stejného zdroje), nebo jinou (tj. heterologní) požadovanou protilátku. Může to být těžký nebo lehký řetězec imunoglobulinu (nebo oba řetězce jako součást jednoho polypeptidu). Druhý imunoglobulinový partner není omezen určitou třídou nebo izotypem imunoglobulinu. Kromě toho, druhý imunoglobulinový partner může obsahovat část konstantního regionu imunoglobulinu, jak je tomu u Fab nebo F(ab')₂ (tj. určitou část vhodného lidského konstantního regionu nebo regionu pracovního rámečku). Takový druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvence kódující integrální membránový protein přítomný na zevním povrchu hostitelské buňky, například jako část fágové zobrazovací knihovny, nebo sekvenci kódující protein pro analytickou nebo diagnostickou detekci, například křenovou peroxidasu, β-galaktosidasu, atd.

Termíny Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' nebo F(ab')₂ jsou použity ve standardních významech. Viz například Harlow et al., v „Antibodies A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

Jak je zde použito popisuje „zpracovaná protilátka“ typ pozměněné protilátky, tj. kompletní syntetickou protilátku (například chimérickou nebo humanizovanou protilátku v protikladu k fragmentu protilátky), ve které je část variabilních domén lehkého a/nebo těžkého řetězce vybrané akceptorové protilátky nahrazena analogickou částí z jedné nebo zvíce dárcovských protilátek, které mají specificitu pro vybraný epitop. Například, takové molekuly mohou zahrnovat protilátky charakterizované humanizovaným těžkým řetězcem asociovaným s nemodifikova25 ným lehkým řetězcem (nebo chimérickým lehkým řetězcem), nebo naopak. Zpracované protilátky mohou být také charakterizovány alterací sekvencí nukleových kyselin kódujících pracovní regiony variabilních domén lehkých a/nebo těžkých řetězců akceptorové protilátky, která uchovává vazebnou specificitu dárcovské protilátky. Tyto protilátky mohou obsahovat nahrazení jednoho nebo více CDR (výhodně všech) akceptorové protilátky CDR z dárcovské protilátky zde popsané.

„Chimérická protilátka“ označuje zpracovanou protilátku, která obsahuje přirozené variabilní regiony (lehkého řetězce a těžkého řetězce) odvozené od dárcovské protilátky ve spojení s konstantními regiony lehkého řetězce a těžkého řetězce odvozenými z akceptorové protilátky.

„Humanizovaná protilátka“ označuje typ zpracované protilátky mající své CDR odvozené z non-lidského dárcovského imunoglobulinu a zbývající imunoglobulinové části molekuly jsou odvozeny od jednoho nebo více imunoglobulinů. Kromě toho, zbytky pracovního rámečku mohou být pozměněny tak, aby byla zachována vazebná afinita. Viz například Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029 - 10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology 9: 421 (1991).

Termín „dárcovská protilátka“ označuje monoklonální nebo rekombinantní protilátku, která je kódována sekvencemi nukleové kyseliny pro své variabilní regiony, CDR nebo jejich jiné funkční fragmenty nebo analogy prvního imunoglobulinového partnera, takže je poskytnut pozměněný imunoglobulinový kódující region a výsledná exprivovaná pozměněná protilátka s antigenní specificitou a neutralizační aktivitou charakteristickou pro dárcovskou protilátku. Jednou dárcovskou protilátkou vhodnou pro použití v předkládaném vynálezu je myší monoklonální protilátka s vlastní neutralizační aktivitou označená BC2. Jinými vhodnými dárcovskými protilátkami jsou myší monoklonální protilátky s vlastní neutralizační aktivitou označené BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC a HFX1.

Termín „akceptorová protilátka“ označuje monoklonální nebo rekombinantní protilátku heterologní k dárcovské protilátce, která má všechny, nebo části sekvencí nukleových kyselin kódujících její regiony pracovních rámečků lehkého řetězce a/nebo těžkého řetězce a nebo

-6CZ 299452 B6 konstantní regiony lehkého řetězce a/nebo těžkého řetězce prvního imunoglobulinového partnera. Výhodně je akceptorovou protilátkou lidská protilátka.

„CDR“ jsou definovány jako aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů protilátky, které jsou hypervariabilními regiony lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinu. Viz, například Kabat et al., v „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Ve variabilní části imunoglobulinu jsou tři CDR nebo CDR regiony v těžkém řetězci a tři v lehkém řetězci. Proto, „CDR“, jak je zde použito, označuje všechny tři CDR těžkého řetězce, nebo všechny tři ío CDR lehkého řetězce, nebo všechny CDR lehkého a těžkého řetězce, jak je to vhodné.

CDR obsahuje většinu kontaktních zbytků pro vazbu protilátky na antigen nebo epitop. Požadované CDR v tomto vynálezu jsou odvozeny z variabilních sekvencí lehkých a těžkých řetězců dárcovské protilátky a zahrnují analogy přirozených CDR, kde tyto analogy také mají nebo si uchovávají stejnou antigenní vazebnou specificitu a/nebo neutralizační schopnost jako dárcovská protilátka, ze které jsou odvozeny.

„Vlastnit stejnou antigenní vazebnou specificitu a/nebo neutralizační schopnost“ znamená, například, že ačkoliv mAb BC2 může být charakterizována určitou hladinou neutralizační aktivity s vlastním omezením, může mít CDR kódovaný sekvencí nukleové kyseliny BC2 ve vhodném prostředí nižší nebo vyšší aktivitu. Předpokládá se, že CDR BC2 v takovém prostředí budou nicméně rozpoznávat stejný epitop jako BC2.

„Funkční fragment“ je část variabilní sekvence lehkého nebo těžkého řetězce (např. drobné delece na amino nebo na karboxy konci variabilního regionu imunoglobulinu), která si uchovává stejnou antigenní vazebnou specificitu a/nebo neutralizační schopnost jako protilátka, ze které byl fragment odvozen.

„Analog“ je aminokyselinová sekvence modifikovaná alespoň jednou aminokyselinou, kde uve30 děná modifikace může být chemická nebo substituce nebo přeskupení několika aminokyselin (tj. na více než 10), kde tato modifikace umožňuje zachování biologických charakteristik aminokyselinové sekvence, například antigenní specificity a vysoké afinity, stejných jako u nemodifikované sekvence. Příklady analogů zahrnují silentní mutace, které mohou být konstruovány substitucí, pro vytvoření určitých restrikčních míst pro endonukleasy v nebo v okolí CDR-kodujících regionů.

Analogy mohou také vznikat v důsledku alelických variací. „Alelická variace nebo modifikace“ je alterace v sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinové nebo peptidové sekvence podle předkládaného vynálezu. Takové variace nebo modifikace mohou být způsobeny degenerací genetického kódu nebo mohou být záměrně vytvořeny pro vznik požadovaných charakteristik. Tyto variace nebo modifikace mohou, ale nemusí vést k alteraci v jakékoliv kódované aminokyselinové sekvenci.

Termín „efektorové činidlo“ označuje neproteinové molekulové nosiče, se kterými mohou být pozměněné protilátky a/nebo přirozené nebo syntetické lehké nebo těžké řetězce dárcovské proti45 látky nebo jiné fragmenty dárcovské protilátky asociovány běžnými prostředky. Takové neproteinové nosiče mohou zahrnovat konvenční nosiče používané v oblasti diagnostiky, například polystyrénové nebo jiné plastové korálky, polysacharidy, například jak jsou použity vBIAcore (Pharmacia) systému, nebo jiné neproteinové substance použitelné v oblasti medicíny a bezpečné pro podání lidem a zvířatům. Jiná efektorová činidla mohou obsahovat makrocykly, pro chelaci atomů těžkých kovů nebo radioizotopů. Taková efektorová činidla mohou být také užitečná pro zvýšení poločasu pozměněných protilátek, například jako tomu je u polyetylenglykolu.

Pro použití při konstrukci protilátek, pozměněných protilátek a fragmentů podle předkládaného vynálezu mohou být použity jiné než lidské druhy, jako je hovězí dobytek, ovce, opice, kuřata,

-7CZ 299452 B6 hlodavci (například myši a krysy) pro generování požadované imunoglobulinů za imunizace s lidským koagulačním faktorem, výhodně faktorem IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/Va, Vll/Vlla nebo trombinem nebo peptidovým epitopem z nich odvozeným. Pro získání hybridomních buněčných linií secemujících non-lidské mAb k příslušnému koagulačnímu faktoru jsou použity běžné hybridomní techniky. Takové hybridomy jsou potom vyšetřovány na vazbu za použití faktorem IX/IXa, X/Xa, Xl/Xla, VlII/VIIIa, a V/Va, VII/VIIa nebo trombinem potažených 96-jamkových ploten, jak je popsáno v části Příkladů, nebo alternativně biotinylovaným faktorem IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VIII/VTIIa a V/Va, VII/VIIa nebo trombinem navázaným na plotnu potaženou streptavidinem. Alternativně může být vytvořena plně lidská mAb za použití technik dobře známých v oboru a použitých v tomto vynálezu.

Jedním příkladem mAb s vlastní omezenou neutralizační aktivitou podle předkládaného vynálezu je mAb BC25, myší protilátka, která může být použita pro vývoj chimérické nebo humanizované molekuly. BC2 mAb je charakterizována inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas.

Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek BC2 mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 100 sekund. BC2 mAb se také váže na faktor IXa, inhibuje konversi faktoru IX na IXa a inhibuje aktivitu faktoru Xla. Kofaktory ve formě dvojmocných kovů jsou nutné pro aktivitu, kdy mAb vykazuje vyšší preferenci pro Ca²⁺ než pro Mn²⁺. Pozorovaná IC₅₀ v APTT testu je přibližně 50 nM. BC2 mAb vykazuje mezidruhovou zkříženou reaktivitu s krysami a její izotyp je IgG2a.

Dalšími vhodnými dárcovskými protilátkami jsou myší mAb BC1, 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9. Tyto mAb jsou charakterizovány inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas. Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek těchto mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 90 až 100 sekund pro 9E4(2)F4 a okolo 80 sekund pro 11 G4(l )B9. BC1 mAb se také váže na faktor

IXa, inhibuje aktivitu faktoru IXa, ale neinhibuje konversi faktoru IX na IXa. Kofaktory ve formě dvojmocných kovů nejsou nutné pro její aktivitu. Pozorovaná IC₅₀ v APTT testu je přibližně 35 nM. BC2 mAb je izotyp IgGl.

Ještě jinou vhodnou dárcovskou protilátkou charakterizovanou inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas je myší mAb HFXLC. Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek HFXLC mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 50 až 60 sekund. HFXLC mAb se také váže na lehký řetězec faktoru X a inhibuje aktivitu faktoru X/Xa. Pozorovaná IC₅₀ v APTT testu je přibližně 20 nM.

Ještě jinou vhodnou dárcovskou protilátkou charakterizovanou inhibiční aktivitou s vlastním omezením na srážecí čas je myší mAb HFXI. Jak je měřeno APTT testem způsobuje účinek HFXI mAb na čas srážení maximální hodnoty okolo 100 sekund. HFXI mAb se také váže na faktor XI a inhibuje aktivitu faktoru Xl/XIa. Pozorovaná IC₅₀ v APTT testuje přibližně 30 nM.

Ačkoliv není zamýšlena vazba na jakoukoliv jednotlivou teorii týkající se mechanismu účinku, zdá se, že tyto mAb regulují koagulaci nekompetitivním nebo alosterickým mechanismem, čímž je dosaženo pouze částečné inhibice.

Tento vynález není omezen na použití BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI nebo jejich hypervariabilních (tj. CDR) sekvencí. Jakákoliv jiná vhodná vysokoafinitní protilátka charakterizovaná neutralizační aktivitou s vlastním omezením a odpovídajícími CDR může za ně být substituována. Identifikace dárcovské protilátky v následujícím popisu jako BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC nebo HFXI je provedena pouze pro ilustraci a zjednodušení popisu.

Předkládaný vynález také obsahuje použití Fab fragmentů nebo F(ab')₂ fragmentů odvozených od protilátek proti určitým lidským koagulačním faktorům nebo kofaktorům. Tyto fragmenty jsou použitelné jako činidla mající vlastní omezenou neutralizační aktivitu proti koagulačním faktorům, výhodně proti faktorům IX/IXa, X/Xa, Xl/Xla, VlII/VIIIa, a V/Va, VII/VIIa nebo trombinu Fab fragment obsahuje celý lehký řetězec a amino koncovou část těžkého řetězce. F(ab')₂ je

-8CZ 299452 B6 fragment tvořený Fab fragmenty spojenými disulfidovými vazbami. mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC a HFXI a další podobné protilátky s vysokou afinitou jsou zdroje pro Fab fragmenty a F(ab')₂ fragmenty, které mohou být získány běžnými prostředky, například štěpením mAb vhodnými proteolytickými enzymy, papainem a/nebo pepsinem, nebo rekombinantními metodami. Tyto Fab a F(ab')₂ fragmenty jsou použitelné sami o sobě jako terapeutická, profylaktická nebo diagnostická činidla, ajako dárci sekvencí obsahujících variabilní regiony a CDR sekvence použitelné pro tvorbu rekombinantních nebo humanizovaných protilátek jak je zde popsáno.

Fab a F(ab')₂ fragmenty mohou být konstruovány pomocí kombinatoriálních fágových knihoven ío (viz například Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433 - 455 (1994)) nebo pomocí přeskupování imunoglobulinových řetězců (viz například Marks et al., Bio/Technology, 10: 779- 783 (1992)), kde oba odkazy jsou zde uvedeny ve své úplnosti, kde je imunoglobulinový Fd neo v_H z vybrané protilátky (například BC2) asociován s repertoárem imunoglobulinových lehkých řetězců, v_L (nebo v_K) za vzniku nových Fab. Naopak, imunoglobulinový lehký řetězec z vybrané protilátky může být asociován s repertoárem imunoglobulinových těžkých řetězců, v_H (nebo Fd) za vzniku nových Fab. Fab proti faktoru IX s neutralizační aktivitou s vlastním omezením mohou být získány asociací Fd mAb BC2 s repertoárem imunoglobulinových lehkých řetězců. Proto je možné získat neutralizační Fab s jedinečnou sekvencí (nukleotidovou a aminokyselinovou) technikou přeskupování řetězců.

mAb BC2 a další protilátky popsané výše mohou mít sekvence, jako jsou variabilní peptidové sekvence těžkých a/nebo lehkých řetězců, sekvence pracovních rámečků, CDR sekvence, funkční fragmenty a jejich analogy, a nukleotidové sekvence, které je kódují, použitelné při vývoji a získání různých pozměněných protilátek, které jsou charakterizovány antigenní vazebnou specificitou dárcovské protilátky.

Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující variabilní peptidové sekvence lehkého řetězce a těžkého řetězce, jsou také užitečné pro mutagenní vložení specifických změn do sekvence nukleových kyselin kódujících CDR nebo regiony pracovního rámečku a pro inkorporaci výsledných modifikovaných nebo fúsních sekvencí nukleové kyseliny do plasmidů pro expresi. Například, silentní substituce v nukleotidové sekven30 ei pracovního rámečku a CDR kódujících regionů může být použita pro vytvoření míst pro restrikční enzymy, která usnadní inserci mutovaných CDR a/nebo regionů pracovních rámečků. Tyto CDR kódující regiony mohou být použity při konstrukci humanizovaných protilátek podle předkládaného vynálezu.

Sekvence nukleových kyselin a aminokyselin pro variabilní region těžkého řetězce BC2 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7. CDR sekvence z tohoto regionu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10.

Sekvence nukleových kyselin a aminokyselin pro variabilní region lehkého řetězce BC2 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 11. CDR sekvence z tohoto regionu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 14.

Vzhledem k degeneraci genetického kódu mohou být konstruovány různé kódující sekvence, které kódují variabilní aminokyselinové sekvence lehkého a těžkého řetězce a CDR sekvence podle předkládaného vynálezu, stejně jako jejich funkční fragmenty a analogy, které mají antigenní spcificitu dárcovské protilátky. Izolované sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující variabilní peptidové sekvence řetězců nebo CDR mohou být použity pro produkci pozměněných protilátek, například chimérických nebo humanizovaných protilátek, nebo jinak zpracovaných protilátek podle předkládaného vynálezu, pokud jsou operativně navázány s druhým imunoglobulinovým partnerem.

Mělo by být uvedeno, že kromě izolovaných sekvencí nukleových kyselin kódujících částí pozměněné protilátky a protilátek jak jsou zde popsány obsahuje předkládaný vynález také další

-9CZ 299452 B6 takové sekvence nukleových kyselin, jako jsou sekvence komplementární k přirozeným CDRkodujícím sekvencím nebo sekvence komplementární k modifikovaným lidským regionům pracovních rámečků sousedících s CDR-kodujícími regiony. Použitelné DNA sekvence zahrnují ty sekvence, které hybridizují s DNA sekvencemi za přísných hybridizačních podmínek. Viz T.

Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 - 389. Příkladem takových přísných hybridizačních podmínek je hybridizace při 4xSSC při 65 °C, následovaná promytím v 0,lxSSC při 65 °C po dobu jedné hodiny. Alternativně, přísnými hybridizačními podmínkami je 50% formamid, 4xSSC při 42 °C. Výhodně mají tyto hybridizující DNA sekvence délku alespoň 18 nukleotidů, tj. přibližně délku CDR.

Pozměněné imunoglobulinové molekuly mohou kodovat pozměněné protilátky, kam patří zpracované protilátky jako jsou chimérické protilátky a humanizované protilátky. Požadovaný pozměněný imunoglobulinový kódující region obsahuje CDR-kodující regiony, které kódují peptidy mající antigenní specificitu protilátky proti faktoru IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a

V/Va, VlI/VIIa nebo trombinu, výhodně protilátky s vysokou afinitou, jako jsou ty, které poskytuje předkládaný vynález, insertované do prvního imunoglobulinového partnera, jako je region lidského pracovního rámečku nebo lidský variabilní imunoglobulinový region.

Výhodně je první imunoglobulinový partner operativně navázán na druhý imunoglobulinový partner. Druhý imunoglobulinový partner je definován výše a může obsahovat sekvence kódující druhý požadovaný region protilátky, například Fc region. Druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvence kódující jiný imunoglobulin, se kterým je konstantní region lehkého nebo těžkého řetězce fúsován v rámečku nebo pomocí linkerové sekvence. Zpracované protilátky proti funkčním fragmentům nebo analogům koagulačních faktorů mohou být vyvinuty tak, aby vyvolávaly zvýšenou vazbu se stejnou protilátkou.

Druhý imunoglobulinový partner může být také asociován s efektorovým činidlem definovaným výše, včetně neproteinových nosičových molekul, na které může být druhý imunoglobulinový partner operativně navázán běžnými prostředky.

Fúse nebo vazba mezi druhým imunoglobulinovým partnerem, například protilátkovou sekvencí, a efektorovým činidlem, může být zprostředkována jakýmikoliv vhodnými prostředky, například běžnými kovalentními nebo iontovými vazbami, proteinovou fúsí nebo hetero-bifunkčními zesíťovacími činidly, například karboimidem, glutaraldehydem a podobně. Takové techniky jsou v oboru známé a jsou popsané v běžných chemických a biochemických textech.

Dále, běžné linkerové sekvence, které jednoduše dodávají dostatečný prostor mezi druhým imunoglobulinovým partnerem a efektorovým činidlem mohou také být konstruovány do pozměněného imunoglobulinového kódujícího regionu. Vývoj takových linkerů je v oboru dobře znám.

Kromě toho, pro zvýšení exprese mohou být signální sekvence pro molekuly podle předkládaného vynálezu modifikovány technikami v oboru známými.

Výhodná pozměněná protilátka obsahuje peptidové nebo proteinové sekvence variabilního lehkého a/nebo těžkého řetězce mající antigenní specificitu mAb CB2, například v_H a v_L řetězce. Ještě další výhodná protilátka podle předkládaného vynálezu je charakterizována aminokyselinovou sekvencí obsahující alespoň jeden, a výhodně všechny, CDR variabilního regionu těžkého a/nebo lehkého řetězce molekuly myší protilátky BC2 a zbývající sekvence odvozené z lidského zdroje, nebo jeho funkčního fragmentu nebo analogu.

V ještě dalším provedení může být pozměněná protilátka podle předkládaného vynálezu připojena na další činidlo, například, rekombinantní DNA technologie může být použita pro produkci pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu, ve které je Fc fragment nebo CH2 CH3 doména kompletní molekuly protilátky nahrazena enzymem nebo jinou detekovatelnou molekulou (tj. polypeptidovým efektorem nebo reportérovou molekulou).

-10CZ 299452 B6

Druhý imunoglobulinový partner může být také operativně navázán na neimunoglobulinový peptid, protein nebo jeho fragment heterologní kCDR obsahující sekvenci mající antigenní specificitu pro koagulační faktor, výhodně pro faktor IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, Vin/VIIIa, a V/Va,

VII/VIIa nebo trombin. Vzniklý protein může po expresi vykazovat jak antigenní specificitu, tak charakteristiky non-imunoglobulinu. Tyto charakteristiky fúsního partnera mohou být, například, funkční charakteristiky jako je jiná vazba nebo receptorová doména nebo terapeutické charakteristiky, pokud je fúsní partner sám o sobě terapeutickým proteinem nebo další antigenní charakteristiky.

Další výhodný protein podle předkládaného vynálezu může obsahovat kompletní molekulu protilátky, mající kompletní lehký a těžký řetězec nebo jakýkoliv jejich fragment, jako je Fab nebo F(ab')₂ fragment, dimer těžkých řetězců nebo jejich jakýkoliv minimální rekombinantní fragment, jako je F_v nebo jednořetězcová protilátka (SCA) nebo jakoukoliv jinou molekulu se stejnou specifickou jako má vybraná dárcovská mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC nebo HFXI. Takový protein může být použit ve formě pozměněné protilátky nebo může být použit ve své nefůsované formě.

Pokud je druhý imunoglobulinový partner odvozen od protilátky jiné než od dárcovské proti20 látky, například od pracovního rámečku nebo konstantních regionů jakéhokoliv izotypu nebo třídy imunoglobulinu, vzniklá zpracovaná protilátka. Zpracované protilátky mohou obsahovat imunoglobulinové (Ig) konstantní regiony a variabilní regiony pracovního rámečku z jednoho zdroje, například z akceptorové protilátky, a jeden nebo více (výhodně všechny) CDR z dárcovské protilátky, například z protilátek proti faktoru IX/IXa, X/Xa, Xl/XIa, VlII/VIIIa a V/VA,

VII/VIIa nebo trombinu, které jsou zde popsány. Kromě toho, mohou být provedeny takové alterace, například delece, substituce nebo adice, variabilních domén pracovního rámečku lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové protilátky, nebo CDR regionů dárcovské protilátky, které zachovávají antigenní vazebnou specificitu dárcovské protilátky.

Takové zpracované protilátky jsou navrženy tak, aby využívaly jeden (nebo oba) variabilní lehké a/nebo těžké řetězce mAb proti koagulačnímu faktoru (volitelně modifikované jak je zde popsáno) nebo jeden nebo více CDR lehkého nebo těžkého řetězce. Zpracované protilátky podle předkládaného vynálezu vykazují neutralizační aktivitu s vlastním omezením.

Takové zpracované protilátky mohou obsahovat humanizované protilátky obsahující regiony pracovního rámečku vybraného lidského imunoglobulinu nebo subtypu nebo chimérické protilátky obsahující konstantní region lidských lehkých a těžkých řetězců fúsovaný s funkčními fragmenty protilátky proti koagulačnímu faktoru. Vhodné lidské (nebo jiné zvířecí) akceptorové protilátky mohou být vybrány z konvenční databáze, jako je například KABAT® databáze, Los

Alamos databáze, a Swiss Protein databáze, podle homologie s nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi dárcovské protilátky. Lidská protilátka charakterizovaná homologií s regiony pracovních rámečků dárcovské protilátky (na úrovni aminokyselin) může být vhodná pro dodání variabilního regionu pracovního rámečku těžkého řetězce pro inserci CDR z dárcovské protilátky. Vhodná akceptorová protilátka schopná dodání variabilního regionu pracovního rámečku lehkého řetězce může být vybrána podobným způsobem. Mělo by být uvedeno, že není nutné, aby těžké a lehké řetězce akceptorové protilátky pocházely ze stejné akceptorové protilátky.

Výhodně jsou heterologní pracovní rámečky a konstantní regiony vybrány ze tříd a izotypů lidských protilátek, jako jsou IgG (subtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE. Nicméně, akceptorová protilátka nemusí obsahovat pouze lidské imunoglobulinové proteinové sekvence. Například, může být konstruován gen, ve kterém je DNA sekvence kódující část lidského imunoglobulinového řetězce fúsována na DNA sekvenci kódující neimunoglobulinovou aminokyselinovou sekvenci jako je polypeptidový efektor nebo reporterová molekula.

-11 CZ 299452 B6

Zejména výhodná humanizovaná protilátka obsahuje CDR BC2 insertované do regionů pracovního rámečku vybrané lidské protilátkové sekvence. Pro neutralizační lidské protilátky jsou jeden, dva nebo výhodně tři CDR z variabilních regionů těžkého a/nebo lehkého řetězce protilátky proti faktoru IX insertovány do regionů pracovního rámečku vybrané lidské proti5 látkové sekvence, takže nahrazují přirozené CDR této druhé uvedené protilátky.

Výhodně, u humanizované protilátky, byla variabilní doména v obou lidských těžkých a lehkých řetězcích upravena nahrazením jednoho nebo více CDR. Je možné použít všech šest CDR, nebo je možné použít různé kombinace méně než šesti CDR. Výhodně je nahrazeno všech šest CDR.

Je možné nahradit CDR pouze v lidském těžkém řetězci a použít jako lehký řetězec nemodifikovaný lehký řetězec z lidské akceptorové protilátky. Ještě jako jiná alternativa může být kompatibilní lehký řetězec vybrán z jiné lidské protilátky za použití konvenční databáze protilátek. Zbytek zpracované protilátky může být odvozen od jakéhokoliv vhodného lidského akceptorového imunoglobulinu.

Zpracovaná humanizovaná protilátka tak výhodně má strukturu přirozené lidské protilátky nebo jejího fragmentu a má kombinaci vlastností nutných pro účinné terapeutické použití, například pro léčbu trombotických nebo embolických onemocnění u lidí.

Nejvýhodněji mají humanizované protilátky aminokyselinové sekvence těžkého řetězce uvedené v SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 52 nebo SEQ ID NO: 89. Také nejvýhodnější mají humanizované protilátky aminokyselinové sekvence lehkého řetězce uvedené v SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78 nebo SEQ ID NO: 99. Zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249413, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249415, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 57. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249416, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 62. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 249417, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 74. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 257731, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 78. Také zejména výhodná je humanizovaná protilátka SB 257732, kde těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 99.

Odborníkům v oboru bude jasné, že zpracovaná protilátka může být dále modifikována změnami v aminokyselinových variabilní domény bez nezbytného ovlivnění specificity a vysoké afinity dárcovské protilátky (tj. analog). Předpokládá se, že aminokyseliny těžkého a lehkého řetězce mohou být substituovány jinými aminokyselinami v pracovním rámečku variabilní domény nebo v CDR nebo v obou. Tyto substituce mohou být dodány dárcovskou protilátkou nebo konsensuálními sekvencemi z určité podskupiny.

Kromě toho, konstantní region může být pozměněn tak, aby se zvýšily nebo snížily selektivní vlastnosti molekul podle předkládaného vynálezu. Například, dimerizace, vazba na Fc receptory nebo schopnost vazby a aktivace komplementu (viz například Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105- 108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem. 269: 3469 - 3474 (1994), Winter et al.,

EP-307434-B).

Pozměněná protilátka, která je chimérická protilátka, se liší od humanizovaných protilátek popsaných výše tím, že obsahuje úplné variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce non-lidské dárcovské protilátky, včetně regionů pracovního rámečku, v asociaci s konstantními regiony lidského imunoglobulinu pro oba řetězce. Předpokládá se, že chimérické protilátky, které mají

-12CZ 299452 B6 další non-lidské sekvence vzhledem k humanizovaným protilátkám podle předkládaného vynálezu, mohou vyvolávat signifikantní imunitní odpověď u lidí.

Takové protilátky jsou použitelné pro prevenci a léčbu trombotických a embolických onemocnění, jak je popsáno dále.

Výhodně jsou sekvence variabilních lehkých a/nebo těžkých řetězců a CDR mAb BC2 nebo jiné vhodné dárcovské protilátky, např. BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXCF, HFXI ajejich kódující nukleotidové sekvence, použity při konstrukci pozměněných protilátek, výhodně humaío nizovaných protilátek, podle předkládaného vynálezu v následujícím procesu. Stejné nebo podobné techniky mohou být také použity pro vývoj jiných provedení předkládaného vynálezu.

Hybridom produkující vybranou dárcovskou protilátku, například myší protilátku BC2, je konvenčně klonován a DNA jejích variabilních regionů lehkých a těžkých řetězců je získána technikami známými odborníkům v oboru, například technikami popsanými v Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Faboratory Manual“, 2. vydání, Cold Spring Harbor Faboratory (1989).

Variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce BC2 obsahující alespoň CDR kódující regiony a ty části regionů pracovního rámečku variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové mAb, které jsou nutné pro zachování vazebné specificity dárcovské mAb, stejně jako zbylé od imunoglobulinu-odvozené části protilátkového řetězce odvozené od lidského imunoglobulinu jsou získány za použití polynukleotidového primerů a reversní transkriptasy. CDR kódující regiony jsou identifikovány za použití známé databaze a srovnáním s ostatními protilátkami.

Myší/lidská chimérická protilátka může být potom připravena a může být testována na vazebnou schopnost. Taková chimérická protilátka obsahuje úplné V_H a V_L regiony non-lidské protilátky v asociaci s konstantními regiony lidského Ig pro oba řetězce.

Homologní regiony pracovního rámečku variabilního regionu těžkého řetězce z lidské protilátky jsou identifikovány za použití počítačové databáze, například KABAT® a lidská protilátka mající homologií s BC2 je vybrána jako akceptorová protilátka. Sekvence syntetických variabilních regionů těžkého řetězce obsahující BC2 CDR-kodující regiony v pracovních rámečkách lidské protilátky jsou navrženy s volitelnou nukleotidovou náhradou v regionech pracovního rámečku pro vložení restrikčních míst. Tato navržená sekvence je potom syntetizována za použití dlouhých syntetických oligomerů. Alternativně může být navržená sekvence syntetizována pomocí přesahujících oligonukleotidů, amplifikovaných polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) a s opravenými chybami. Vhodný variabilní region pracovního rámečku lehkého řetězce může být navržen stejným způsobem.

Humanizovaná protilátka může být odvozena od chimérické protilátky, nebo výhodně, může být vyrobena synteticky insercí CDR regionů z lehkých a těžkých řetězců dárcovské mAb do vybraných pracovních rámečků lehkého a těžkého řetězce. Alternativně může být humanizovaná protilátka podle předkládaného vynálezu připravena za použití standardních technik mutagenese. Tak vzniklá humanizovaná protilátka obsahuje lidské regiony pracovního rámečku a CDR kódující regiony dárcovské mAb. Potom může proběhnout následná manipulace se zbytky pracovního rámečku. Vzniklá humanizovaná protilátka může být exprivována v rekombinantní hostitelské buňce, například COS, CHO nebo myelomové buňce. Jiné humanizované protilátky mohou být připraveny za použití této techniky na jiných vhodných non-lidských protilátkách specifických pro faktor IX nebo pro jiný koagulační faktor, s neutralizační aktivitou s vlastním omezením a vysokou afinitou.

Konvenční expresní vektor nebo rekombinantní plasmid je produkován umístěním těchto kódujících sekvencí pro pozměněnou protilátku v operativním spojení s konvenčními regulačními kontrolními sekvencemi schopnými kontroly replikace a exprese v, a/nebo sekrece z, hostitelské buňky. Regulační sekvence zahrnují promotorové sekvence, například CMV promotor, a signální sekvence, které mohou být odvozeny od známých protilátek. Podobně může být produkován

- 13 CZ 299452 B6 druhý expresní vektor mající DNA sekvenci, která kóduje lehký a těžký řetězec komplementární protilátky. Výhodně je tento druhý expresní vektor identický jako ten první, kromě kódujících sekvencí a selektovatelných markérů, aby se co možná nejlépe zajistila funkční exprese každého polypeptidového řetězce. Alternativně mohou být kódující sekvence pro těžký a lehký řetězec pozměněné protilátky umístěny v jednom vektoru.

Vybraná hostitelská buňka je ko-transfektována běžnými technikami první a druhým vektorem (nebo je jednoduše transfektována jediným vektorem) za vzniku transfektované hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu obsahující buď rekombinantní, nebo syntetické lehké a těžké řetězce. Transfektovaná buňka je potom kultivována běžnými technikami za produkce zpracované protilátky podle předkládaného vynálezu. Humanizovaná protilátka, která obsahuje asociaci rekombinantního těžkého a/nebo lehkého řetězce je vyšetřována v kultuře vhodným testem jako je ELISA nebo RIA. Podobné konvenční techniky mohou být použity pro konstrukci jiných pozměněných protilátek a molekul podle předkládaného vynálezu.

Vhodné vektory pro kroky klonování a subklonování použité ve způsobech a v konstrukci přípravků podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkem. Například, může být použita pUC série klonovacích vektorů, jako je pUC19, který je komerčně dostupný od dodavatelských firem, jako je Amersham nebo Pharmacia. Kromě toho, pro klonování může být použit jakýkoliv vektor, který je schopen snadné replikace, má dostatek klonovacích míst a selektovatelných genů (např. pro antibiotickou resistenci) a umožňuje snadnou manipulaci. Proto není výběr klonovacího vektoru limitujícím faktorem v tomto vynálezu.

Podobně, vektory použité pro expresi zpracovaných protilátek podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkem zjakýchkoliv běžných vektorů. Vektory také obsahují vybrané regulační sekvence (jako jsou CMV promotory), které řídí replikaci a expresi heterologních DNA sekvencí ve vybrané hostitelské buňce. Tyto vektory obsahují výše popsané DNA sekvence, které kódují zpracovanou protilátku nebo pozměněný imunoglobulinový kódující region. Kromě toho, vektory mohou obsahovat vybrané imunoglobulinové sekvence modifikované insercí požadova30 ných restrikčních míst pro snadnou manipulaci.

Expresní vektory mohou také být charakterizovány geny vhodnými pro amplifikační expresi heterologních DNA sekvencí, například savčího genu pro dihydrofolat reduktasu (DHFR). Další výhodné vektorové sekvence obsahují póly A signální sekvence, jako je sekvence z hovězího růstového hormonu (BGH) a promotorová sekvence pro betaglobin (betaglopro). Expresní vektory zde použitelné mohou být syntetizovány technikami, které jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Složky takových vektorů, například replikony, selekční geny, enhancery, promotory, signální sekvence a podobně, mohou být získány z komerčních nebo přírodních zdrojů nebo mohou být syntetizovány známými postupy pro použití v řízení exprese a/nebo sekrece produktu rekombinantní DNA ve vybraném hostiteli. Jiné vhodné expresní vektory, kterých je mnoho známo v oboru pro expresi v savčích, hmyzích, bakteriálních, kvasinkových buňkách a houbách, mohou být také vybrány pro tento účel.

Předkládaný vynález také obsahuje buněčné linie transfektované rekombinantním plasmidem obsahujícím kódující sekvence zpracovaných protilátek nebo jejich pozměněných imunoglobulinových molekul. Hostitelské buňky užitečné pro klonování a jiné manipulace s těmito klonovacími vektory jsou také běžné. Nicméně, nejvýhodněji jsou buňky kmenů E. coli použity pro replikaci klonovacích vektorů a v dalších krocích v konstrukci pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu.

Vhodné hostitelské buňky nebo buněčné linie pro expresi zpracovaných protilátek nebo pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu jsou výhodně savčí buňky jako je CHO, COS, fibroblasty (například 3T3) a myleoidní buňky. Mohou být použity lidské buňky, což umožňuje

-14CZ 299452 B6 lidský charakter glykosylace. Alternativně mohou být použity jiné eukaryotické buněčné linie. Výběr vhodných savčích hostitelských buněk a způsoby pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, vyšetřování a produkci produktu a přečištění jsou v oboru dobře známé. Viz například Sambrook et al., výše.

Bakteriální buňky mohou sloužit jako hostitelské buňky vhodné pro expresi rekombinantních Fab podle předkládaného vynálezu (viz například Pluckthun, A. Immunol. Rev. 130: 151-188 (1992)). Nicméně, vzhledem k tendenci proteinů exprivovaných v bakteriálních buňkách být v neskládané nebo nesprávné skládané formě nebo v neglukosylované formě by měl být ío jakýkoliv rekombinantní Fab produkovaný v bakteriálních buňkách vyšetřován na zachování své antigenní vazebné schopnosti. Pokud bude molekula exprivovaná v bakteriální buňce produkována ve správně složené formě, pak bude bakteriální buňka vhodným hostitelem. Například, různé kmeny E. coli použité pro expresi jsou dobře známé jako hostitelské buňky v oblasti biotechnologie. Mohou být také použity různé kmeny B. subtilis, Streptomyces nebo jiných bacilů a podobně.

Pokud je to žádoucí, mohou být také kvasinky použity jako hostitelské buňky, jako je odborníkům známo, stejně jako hmyzí buňky, např. Drosofilové a Lepidopterové a virové expresní systémy. Viz například Miller et al., Genetic Engeneering 8: 277 - 298, Plenům Press (1986) a odkazy zde citované.

Obecné metody, kterými mohou být konstruovány vektory podle předkládaného vynálezu, transfekční metody nutné pro produkci hostitelských buněk podle předkládaného vynálezu a kultivační metody nezbytné pro produkci pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu z takových hostitelských buněk jsou všechno běžné techniky. Podobně, po produkci může být pozmě25 něná protilátka podle předkládaného vynálezu přečištěna z obsahu buněčné kultury standardními technikami, včetně srážení síranem amonným, afinitních kolon, chromatografie na koloně, gelové elektroforesy a podobně. Takové techniky jsou v oboru známé a neomezují tento vynález.

Ještě jiná metoda pro produkci humanizovaných protilátek může využívat expresi v transgenním zvířeti, jak je popsáno v patentu US 4 873 316. Tento patent se týká expresního systému využívajícího zvířecího kaseinového promotoru který, pokud je transgenně inkorporován do savce, umožňuje samicím produkovat požadovaný rekombinantní protein v jejich mléce.

Po expresi vhodnou metodou je zpracovaná protilátka potom vyšetřována na svou in vitro aktivitu za použití vhodného testu. V současnosti jsou běžné ELISA testované formáty použity k hodnocení kvalitativní a kvantitativní vazby zpracované protilátky na faktor IX nebo na jiný vhodný koagulační faktor. Kromě toho, mohou být použity také jiné in vitro testy pro ověření neutralizační účinnosti před následnými klinickými studiemi na lidech, které jsou provedeny pro hodnocení přetrvávání zpracované protilátky v těle při obvyklých mechanismech klírens protilátky.

Podle postupů popsaných pro humanizované protilátky připravené z BC2 může odborník v oboru také konstruovat humanizované protilátky z jiných dárcovských protilátek, sekvencí variabilních regionů a CDR peptidů, které jsou zde popsány. Zpracované protilátky mohou být produkovány s pracovními rámečky variabilních regionů potenciálně rozpoznávanými jako „vlastní“ příjem45 cem zpracované protilátky. Mohou být provedeny drobné modifikace pracovních rámečků variabilního regionu, které způsobí velké zvýšení vazby antigenů bez významného zvýšení imunogenicity pro příjemce. Takové zpracované protilátky mohou být účinně použity při léčbě lidí s nemocemi způsobenými koagulačními faktory. Takové protilátky mohou být také užitečné v diagnostice takových stavů.

Tento vynález se také týká způsobů pro inhibici trombózy u zvířat, zejména u lidí, které obsahují podání účinné dávky monoklonální protilátky proti koagulacnímu faktoru mající neutralizační aktivitu s vlastním omezením. Výhodně je koagulační faktor z vnitřní nebo ze společné koagulační dráhy. Nej výhodněji je monoklonální protilátka proti koagulačnímu faktoru anti-faktor IX,

- 15CZ 299452 B6 anti-faktor IXa, anti-faktor X, anti-faktor Xa, anti-faktor XI, anti-faktor Xla, anti-faktor VIII, anti-faktor Vlila, anti-faktor V, anti-faktor Va, anti-faktor VII, anti-faktor Vila nebo anti trombinová protilátka. mAb může zahrnovat jednu nebo více zpracovaných protilátek nebo pozměněných protilátek zde popsaných nebo jejich fragmentů.

Alternativně může být kyselina acetylsalicylová podána v kombinaci s monoklonální protilátkou proti koagulačnímu faktoru. V některých případech snižuje kombinovaná terapie terapeuticky účinnou dávku monoklonální protilátky proti koagulačnímu faktoru.

Terapeutická odpověď produkovaná použitím molekul podle předkládaného vynálezu je produkována vazbou na příslušný koagulační faktor a následnou inhibicí koagulační kaskády, která má vlastní omezení. Proto jsou molekuly podle předkládaného vynálezu, v přípravcích a formulacích vhodných pro terapeutické použití, vysoce žádoucí pro osoby náchylné k abnormální srážlivá aktivita asociovaná s, ale bez omezení, infarktem myokardu, nestabilní anginou pectoris, fibrilací síní, mrtvicí, poškozením ledvin, plicní embolií, trombózou hlubokých žil a artefíciálními orgány a protesám i.

Pozměněné protilátky, protilátky a jejich fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být také použity spolu s jinými protilátkami, zejména s lidskými mAb reaktivními s jinými markéry (epitopy) odpovědnými za stavy, pro které je zpracovaná protilátka podle předkládaného vynálezu určena.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu by měla být vhodná pro léčbu abnormálních stavů srážení krve od 1 dne do asi 3 týdnů, nebo podle potřeby. Toto představuje významnou výhodu oproti v současnosti používaným antikoagulanciím heparinu a warfarinu. Dávka a trvání léčby souvisí s relativním přetrváváním molekul podle předkládaného vynálezu v lidské cirkulaci a může být upravena odborníkem na základě určitého léčeného stavu a celkového stavu pacienta.

Způsob podání terapeutického činidla podle předkládaného vynálezu může být jakýkoliv způsob vhodný pro podání činidla pacientovi. Pozměněné protilátky, protilátky, zpracované protilátky a jejich fragmenty a farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro parenterální podání, tj. subkutánní, intramuskulámí, intravenosní nebo intranasální podání.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být připravena jako farmaceutické přípravky obsahující účinné množství zpracované (například humanizované) protilátky podle předkládaného vynálezu jako aktivní složky ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Alternativně může farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu také obsahovat kyselinu acetylsalicylovou. V profýlaktickém činidle podle předkládaného vynálezu je preferována vodná suspenze nebo roztok obsahující zpracovanou protilátku, výhodně pufrovaný na fyziologické pH, ve formě připravené pro injekci. Přípravky pro parenterální budou obyčejně obsahovat zpracovanou protilátku podle předkládaného vynálezu nebo jejich směs rozpuštěnou ve farmaceuticky přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Mohou být použity různé vodné nosiče, například 0,4% salinický roztok, 0,3% glycin a podobně. Tyto roztoky musí být sterilní a prosté jakýchkoliv příměsí. Tyto roztoky mohou být sterilizovány jakýmikoliv běžnými, dobře známými sterilizaění45 mi technikami (například filtrací). Přípravky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné substance, které jsou nutné pro přiblížení se fyziologickým podmínkám, jako jsou činidla upravující pH a pufrovací činidla atd. Koncentrace protilátky podle předkládaného vynálezu v takové farmaceutické formulaci se může velmi lišit, tj. od méně než asi 0,5 %, obvykle alespoň 1 %, až do 15 % nebo 20 % hmotnosti a bude určena hlavně na základě objemů kapaliny, viskozity atd., podle určitého vybraného způsobu podání.

Proto, farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu pro intramuskulámí injekci bude připraven tak, aby obsahoval 1 ml sterilní pufrované vody a okolo 1 ng až asi 100 mg, například od asi 50 ng do asi 30 mg nebo, výhodně, od 5 do 25 mg, zpracované protilátky podle předklá55 daného vynálezu. Podobně, farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu pro intra- 16CZ 299452 B6 venosní infusi bude připraven tak, aby obsahoval asi 250 ml sterilního Ringerova roztoku a okolo 1 do asi 30 mg a, výhodně, od 5 do 25 mg, zpracované protilátky podle předkládaného vynálezu. Současné způsoby pro přípravu přípravků pro parenterální podání jsou dobře známé nebo budou známé odborníkům v oboru a jsou podrobněji popsány, například, v „Remington's Pharma5 ceutical Science“, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Je výhodné, aby terapeutické činidlo podle předkládaného vynálezu, pokud je ve farmaceutickém přípravku, bylo v jednotkové dávkové formě. Vhodná terapeuticky účinná dávka může být odborníkem v oboru snadno určena. Pro účinnou léčbu trombotických nebo embolických onemocnění ío u lidí nebo u jiných zvířat by měla být jedna dávka asi 0,1 až asi 20 mg na kg tělesné hmotnosti proteinu nebo protilátky podle předkládaného vynálezu podána parenterálně, výhodně i.v. nebo

i.m. Taková dávka může být, pokud je to nutné, opakována ve vhodných časových intervalech určených ošetřujícím lékařem v průběhu odpovědi na terapii.

Protilátky, pozměněné protilátky nebo jejich fragmenty zde popsané mohou být lyofilizované pro uskladnění a rekonstituované ve vhodném nosiči před použitím. Tato technika byla ukázána jako účinná pro běžné imunoglobuliny a mohou být použity v oboru známé techniky pro lyofilizaci a rekonstituci.

Předkládaný vynález bude nyní popsán s ohledem na následující specifické, nelimitující příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava a vyšetřování monoklonálních protilátek proti faktoru IX

Samicím Balb/c myší byl injekčně podán lidský faktor IX přečištěný jak je popsáno v Jenny, R. et al., Prep. Biochem. 16: 227 - 245 (1986). Typicky dostala každá myš počáteční injekci 100 pg proteinu rozpuštěného v 0,15 ml fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS) ve směsi s 0,15 ml kompletního Freundova adjuvans. Dosycovací imunizace 50 pg proteinu v 0,15 ml PBS s 0,15 ml inkompletního Freundova adjuvans byly podávány přibližně dvakrát týdně v průběhu 2 až 3 měsíců. Po konečné dosycovací dávce bylo myším podáno 50 pg faktoru IX v PBS tři dny před fúsí buněk sleziny/myelomových buněk. Buňky sleziny byly izolovány z imunizovaných myší a fúsovány sNS-1 myelomovými buňkami (Kohler, G. et al., Eur. J. Immunol. 6: 292295, (1976)), za použití polyethylenglykolu jak popisuje Oi, V.T. et al., v „Selected Methods in

Cellular Immunology“, Mishell, Β. B. a Shigii, S. M. vyd., Freeman Press, San Francisco. Po fusi byly buňky resuspendovány v RPMI 1640 médiu obsahujícím 10% fetální telecí sérum a aliquoty byly umístěny do každé jamky 24-jamkové plotny obsahující 0,5 ml kondicionovaného média pro buňky peritoneální laváže. Následující den bylo do každé jamky dodáno 1,0 ml 2 x 10 * M hypoxantinu, 8 x 10 ⁷ M aminopterinu a 3,2 x 10 ⁵ M thymidinu v RPMI 1640 médiu obsahu40 jícím 10% fetální telecí sérum. Buňky byly vyživovány po dobu 3 až 4 dní odstraněním poloviny média a nahrazením této poloviny čerstvým médiem obsahujícím 1 x 10 * M hypoxantinu a 1,6 x 10⁵ M thymidinu.

Přibližně o dva týdny později byl 1,0 ml hybridomního média odebrán z každé jamky a byl testo45 ván na protilátky proti faktoru IX za použití EFISA testu jak je popsán v Jenny, R. J. et al., v Meth. Enzymol. 222: 400- 416 (1993). Stručně, faktor IX je imobilizován v plastových jamkách 96-jamkových mikrotitračních ploten. Hybridomní supematanty nebo ředění přečištěné protilátky jsou potom inkubovány v jamkách. Jamky jsou potom promyty a přítomnost komplexů protilátka/antigen je potom detekována kozí anti-myší imunoglobulinovou druhou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidasou a chromogenním substrátem o-dianisidinem.

Jamky obsahující protilátky proti faktoru IX byly subklonovány limitujícím ředěním a byly kultivovány v 96-jamkových plotnách. Supematant z klonovaných hybridomních buněčných kultur

- 17CZ 299452 B6 byl potom vyšetřován na protilátku k faktoru IX ELISA testem popsaným výše a buňky z pozitivních hybridomů byly expandovány, zmrazený, uskladněny v kapalném dusíku a potom kultivovány v ascitických tumorech na myších.

Příklad 2

Omezený účinek protilátek proti koagulačním faktorům v koagulaci

Účinek zvyšujících se koncentrací protilátek proti koagulačním faktorům na aktivovaný parciální ío tromboplastinový ěas (APTT) lidské plasmy byl určen fibrometrem (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) za použití Baxterova referenčního postupu LIB0293J, revise 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey).

Před začátkem pokusu byly 2 až 3 ml 0,02-M CaCU v 5 ml tubě umístěny do zahřívací komůrky fibrometru. Vzorky lidské plasmy byly buď čerstvě odebrány a uchovávány na ledu, nebo byly rekonstituovány podle návodu výrobce z Homeostasis Reference Plasma (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut).

Nefrakcionovaný heparin z prasečí střevní sliznice (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri), nízkomolekulární heparin z prasečí střevní sliznice (Lovenox®, enoxaparin sodný, Rhone-Poulac Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) nebo mAb antikoagulancia byla připravena jako přibližně 50 μΜ zásobní roztok a byla sériově ředěna přímo do testované plasmy. Prázdná plasma bez antikoagulancia byla vzata jako referenční vzorek.

Dvě fibroTube® fibrometrové zkumavky byly naplněny 100 μΐ testované plasmy nebo 100 μΐ testované plasmy s antikoagulanciem a 125 μΐ aktinem aktivovaného cefaloplastinového činidla (Actin reagens, z králičího mozkového cefalinu v kyselině ellagové, dostupné od Baxter Scientifics), v příslušném pořadí a byly umístěny do jamek fibrometru při 37 °C.

Po jedné minutě bylo 100 μΐ aktinového činidla přeneseno do zkumavky obsahující plasmu a obsah byl několikrát promíchán pipetou. Po třech minutách inkubace bylo přidáno 100 μΐ CaCl₂, předehřátého na 37 °C, do směsi plasma - aktinové činidlo za použití Automatic Pipette/Timertrigger (Becton-Dickinson). Byly zaznamenávány časy srážení a výsledky na obrázku 1 jsou presentovány jako časy srážení jako funkce konečné koncentrace antikoagulancia v celkovém testovaném objemu 300 μΐ. Nominální koncentrace faktoru IX v testuje 30 až 40 nM.

Výsledky na obrázku 1 ukazují účinek zvyšujících se koncentrací myších mAb BC1 a BC2 proti faktoru IX na APTT čas. Obě mAb inhibují srážení prodloužením APTT a obě mAb dosahují konečného saturačního účinku na APTT. IC50 hodnoty jsou podobné při asi 35 nM a asi 50 nM pro BC1 a BC2, v příslušném pořadí, ale rozdíl v maximální odpovědi na tyto dvě protilátky je značný. Saturační koncentrace BC1 zvyšuje APTT o asi 50 % na asi 40 s. BC2, na druhé straně, zvyšuje APTT na 3,5 - násobek na asi 90 s. Terapeutická cílová zóna použita při antikoagulační terapii heparinem je zvýrazněna. Výsledky naznačují, že dvě mAb mají stejné terapeutické APTT rozmezí jako heparin.

Vlastnosti mAb BC1 a BC2 jsou shrnuty v tabulce 1. Obě BC mAb rozpoznávají zymogen, faktor IX, stejně jako aktivní proteasu, faktor IXa, ale pouze BC2 je schopná blokovat aktivaci zymogenu stejně jako aktivitu proteasy. Byla zjištěna zkřížená reaktivita BC1 a BC2 s faktorem IX makaka cynomolgous. Kromě toho, BC2 také zkříženě reaguje s krysím faktorem IX.

- 18CZ 299452 B6

Tabulka 1: Shrnutí in vitro vlastností mAb proti faktoru IX

	BCl	BC2
Vazba na faktor IX	ano	ano
Vazba na faktor IXa	ano	ano
Inhibice konverse IX na IXa	ne	ano
Inhibice aktivity IXa v	ano	ano
Xasovém komplexu
Nutnost kofaktoru	ne	dvojmocné kovy Ca3* > Mn3*
APTT max.
γ 1	150	350
aLk/ \S O
APTT norm.
IC Λ, nM 50 1	asi 35	asi 50
Mezidruhová zkřížená reaktivita	opice	opice, krysa
Izotyp	IgGl	IgG2a

Výsledky na obrázku 2 ukazují účinek zvyšujících se koncentrací mAb 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9 proti faktoru IX na APTT čas. Plasma pro test byla ředěna na jednu polovinu normální koncentrace s počátečním APTT 45 sekund. Obě mAb inhibují srážení prodloužením APTT a obě mAb dosahují konečného saturačního účinku na APTT. Saturaění koncentrace 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9 zvyšují APTT na asi 90 až 100 spro 9E4(2)F4 a na asi 80 sekund pro 11G4(1)B9. Výsledky ukazují, že dvě mAb jsou na horní hranici terapeutické rozmezí pro heparin.

ío Výsledky na obrázku 3 ukazují účinek zvyšujících se koncentrací mAb HFXLC (proti epitopů lehkého řetězce), HFXHC (proti epitopů těžkého řetězce) proti faktoru X a mAb HFXI proti faktoru XI na APTT čas. Tyto mAb byly získány od Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). mAb HFXLC a HFXI inhibují srážení prodloužením APTT a obě mAb dosahují konečného saturačního účinku na APTT. IC₅₀ hodnota pro HFXLC je asi 40 nM; saturaění koncentrace zvyšuje APTT na asi 60 sekund. IC₅₀ hodnota pro HFXI je asi 20 nM; saturaění koncentrace zvyšuje APTT na asi 100 sekund. Výsledky ukazují, že HFXLC je v terapeutickém rozmezí pro heparin, zatímco HFXI je při horní hranici terapeutického rozmezí pro heparin.

Omezené prodloužení APTT bylo také pozorováno u protilátek proti faktoru VIII, kofaktoru faktoru IXa. Například, protilátka proti lidskému faktoru VIII, SAF8C-Ig, zakoupená od Affinity Biologicals Inc., zvyšuje APTT na maximum 65 sekund. Polovina maximálního prodloužení APTT byla dosažena při použití asi 100 nM protilátky.

-19CZ 299452 B6

Příklad 3

Účinnost myších mAb proti faktoru IX v krysím modelu trombózy

Pro hodnocení účinnosti protilátek proti faktoru IX v prevenci arteriální trombózy byl adaptován krysí model trombózy arteria carotis, jak jej popisuje Schumacher et al., v J. Cardio Pharm. 22: 526- 533 (1993). Tento model se skládá ze segmentálního poškození endotelu karotidy kyslíkovými radikály generovanými FeCT, roztokem aplikovaným na povrch arteria carotis.

Stručně, krysy jsou uvedeny do anestezie pentobarbitonem sodným, jugulámí véna je kanylována ío pro intravenosní injekci a levá femorální arterie je kanylována pro měření krevního tlaku a pulsu.

Arteria carotis je izolována aseptickou technikou chirurgickou incisí na krku aje zde přiložena magnetická průtoková sonda pro měření průtoku krve. Po stabilizaci jsou stanoveny základní hodnoty pro následující proměnné: průtok arterií carotis, arteriální tlak, puls, aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) a protrombinový čas (PT). Potom je předem změřený Whatmanův filtrační papír namočený v 50% roztoku FeCl₃ umístěn na arteria carotis na dobu 15 minut pro kompletní poškození spodních endotelových buněk. Po odstranění papíru namočeného v FeCl₃ pokračuje pokus po dobu 60 minut. Na konci pokusu se z arteria carotis extrahuje trombus a zváží se.

Všechna činidla byla podána 15 minut před začátkem poškození karotidy. Byly testovány následující léčby a byly srovnávány s mAb BC2 proti faktoru IX.

1. Heparin: 15, 30, 60 nebo 120U/kg bolusově, a potom infuse 0,5, 1, 2 nebo 4 U/kg/min, v příslušném pořadí, po dobu 60 minut.

2. Kyselina acetylsalicylová (ASA, aspirin): 5 mg/kg bolus.

3. mAb CB2 proti faktoru IX: 1, 3 nebo 6 mg/kg bolusově, potom infuse 0,3, 1 nebo

2 pg/kg/min, v příslušném pořadí, po dobu 60 minut.

4. Heparin: 30 U/kg bolus + 1 U/kg/min + ASA 5 mg/kg.

5. mAb BC2 proti faktoru IX: 1 mg/kg + 0,3 pg/kg/min + ASA 5 mg/kg.

Obrázek 4 a 5 ukazuje srovnávací farmakologii antikoagulačních/trombotických režimů ukázá30 ním účinku heparinu, ASA a mAb BC2 proti faktoru IX na APTT (obrázek 4) a PT (obrázek 5).

Klíčový index pro krvácivou diatesu, APTT, byl použit jako primární kriterium pro hodnocení účinnosti oproti riziku krvácení pro antikoagulační/antitrombotická činidla použitá ve studii. Výsledky na obrázku 4 ukazují na dávce závislé na prodloužení APTT heparinem s maximálním prodloužením srážecího času, nad limity testu, při dvou nejvyšších dávkách. ASA samotná nezvyšuje signifikantně APTT, ale v kombinaci s heparinem je pozorován značný synergistický účinek. mAb proti faktoru IX měly mírný účinek na APTT a i při nejvyšších dávkách nepřesáhlo zvýšení času srážení 3-násobek standardního antikoagulačního klinicky používaného limitu. Nejporozuhodnější je, že nízké dávky mAb BC2 proti faktoru IX v kombinaci s ASA neměnily

APTT.

Na obrázku 5 data ukazují, že PT byl také signifikantně prodloužen heparinem, při dvou nejvyšších dávkách, a kombinací ASA + heparinu, ale nikoliv dávkou samotné mAb proti faktoru IX ani její kombinací s ASA.

Účinek heparinu, ASA a mAb proti faktoru IX na oklusy arteria carotis je ukázán na obrázku 6. Výsledky ukazují, že arterie carotis všech myší ošetřených vehikulem se uzavřely v důsledku poškození. Heparin inhiboval oklusy arterie carotis v závislosti na dávce. Při nejvyšší dávce heparin zcela bránil oklusy arterie carotis; nicméně, při této dávce nemohla být žádná koagulace identifikována. ASA samotná měla pouze malý vliv na oklusy karotidy. ASA v kombinaci s heparinem také selhala v úplném zabránění okluse arteria carotis. mAb proti faktoru IX plně blokovala oklusy arteria carotis při dvou nejvyšších dávkách, které neprodlužovaly koagulaci nad

-20CZ 299452 B6 klinicky požadované cílové rozmezí. Nižší dávka mAb proti faktoru IX, která zcela selhávala v zajištění průchodnosti, pokud byla podána samostatně, vykazovala úplnou inhibici okluse arterie carotis při podání v kombinaci s ASA.

Účinek heparinu, ASA a mAb proti faktoru IX na hmotnost trombů je ukázán na obrázku 7. Heparin redukuje hmotu trombů v arteria carotis způsobem závislým na dávce. Nicméně, určitý residuální trombus byl stále nacházen v arteria carotis i přes kompletní blokádu koagulace. ASA samotná nebo v kombinaci s heparinem (režim 30 U/kg) měla pouze částečný účinek na hmotnost trombů. mAb proti faktoru IX redukovala hmotu trombů způsobem závislým na dávce a vyšší ío dávky zcela bránily tvorbě trombů. Kromě toho, kombinace nízké dávky mAb proti faktoru IX a ASA, tj. režim, který zcela bránil oklusi arteria carotis bez nežádoucího ovlivnění koagulačních testů, zcela bránila tvorbě trombů.

Studie provedené na krysím modelu trombózy arteria carotis jasně ukazují účinnost mAb proti faktoru IX v prevenci trombózy v modelu vysoce trombogenního arteriálního poškození. Nejvýznamnější je, že účinnost mAb proti faktoru IX byla prokázána v požadovaném terapeutickém antikoagulačním cílovém rozmezí definovaném APTT. Kromě toho, heparin v současnosti standardní antikoagulans, dosahoval účinnosti srovnatelné s mAb proti faktoru IX pouze v dávkách, které významně narušují koagulaci tím, že produkují nesrážlivou krev. Zajímavé je, že pozorova20 ná potenciace a synergie získaná současnou léčbou ASA a heparinem byla také prokázána tehdy, když byla ASA podána s mAb proti faktoru IX. Nicméně, oproti kombinaci heparinu a ASA, která vede k potenciaci antitrombotických a antikoagulačních účinků vede kombinace ASA a mAb proti faktoru IX k potenciaci antitrombotického účinku bez významného ovlivnění koagulačních parametrů krve ex vivo. Dohromady data ukazují vyšší antitrombotickou kapacitu mAb proti faktoru IX ve srovnání s heparinem, ASA nebo s kombinací heparinu a ASA.

Příklad 4

Skenovací elektronové mikroskopie modelu krysí trombózy

Segmenty krysí arteria carotis byly odebrány od tří skupin (kontrolní, chlorid železitý a chlorid železitý a chlorid železitý + 6 mg/kg protilátky proti faktoru IX), 15 minut po aplikaci chloridu železitého. Arterie byly fixovány perfusí formaldehydem a byla provedena ligace nad a pod poškozenou oblastí. Fixované arterie byly dehydratovány, inkubovány v hexamethyldisilazanu a sušeny v desikátoru. Sušené arterie byly rozříznuty po délce, umístěny do nástavců pro skenovací elektronovou mikroskopii (SEM) potažených zlatém rozprášeným ve vakuu.

SEM kontrolních artérií ukázala v podstatě normální endotel s rozptýlenými destičkami. Bylo zde několik poškození endotelu, pravděpodobně v důsledku mechanického poškození během chirur40 gického zákroku a bazální membrána v těchto oblastech byla pokryta vrstvou destiček. Žádné náznaky tvorby trombů nebyly pozorovány u kontrolních krys.

SEM artérií ošetřených chloridem železitým odhalila rozsáhlé nástěnné tromby, které zabíraly značnou část lumen cévy. Tromby byly složeny z agregovaných destiček, červených krvinek a amorfního a vláknitého proteinového materiálu. Endotel artérií byl téměř zcela pokryt velkými tromby. Tam, kde byl viditelný, byl endotel v oblasti ošetřené chloridem železitým pokryt množstvím adherentních destiček a amorfního proteinového materiálu.

SEM artérií ošetřených chloridem železitým od krys ošetřených také protilátkou proti faktoru IX ukázala lumen cév v podstatě bez trombů. Endotel v oblasti ošetřené chloridem železitým vykazoval rozsáhlé poškození a některé oblasti byly pokryty adherujícími destičkami a agregáty destiček, ale bez nebo s minimálním množstvím proteinového materiálu.

-21 CZ 299452 B6

Příklad 5

Analýza sekvence cDNA lehkého a těžkého řetězce mAb BC2 proti faktoru IX

Celková RNA byla přečištěna za použití TriReagent (Molecular Research Center, lne., Cincin5 nati, OH) podle návodu výrobce. RNA byla vysrážena isopropanolem a rozpuštěna v 0,5% SDS a upravena na 0,5 M NaCl. Póly A⁺ RNA byla izolována za použití Dynabeads Oligo (dT)₂₅ (Dynal A.S., Lake Success, NY) podle návodu výrobce. Póly A⁺ RNA byla eluována z korálků a resuspendována v TE pufru. Dvanáct aliquot 100 ng RNA bylo reversně transkribováno za použití RC-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim katalogové č. 1483-188) za použití dT oligo pro „priming“. Pro těžký řetězec byla PCR amplifikace 6 RNA/DNA hybridů provedena ve 25 cyklech za použití primeru pantové oblasti myšího IgG2a (SEQ ID NO: 1) a primeru signální sekvence těžkého řetězce (SEQ ID NO: 2). Podobně, pro lehký řetězec byla PCR amplifikace 6 RNA/DNA hybridů provedena ve 25 cyklech za použití myšího kappa primeru (SEQ ID NO: 3) a degenerovaného primeru signální sekvence lehkého řetězce (SEQ

ID NO: 4). PCR produkty z každé ze 12 amplifikaci byly ligovány do PCR2000 vektoru (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01). Kolonie rekombinantních klonů byly náhodně seškrábnuty a minipřípravky plasmidové DNA byly připraveny za použití postupu alkalické extrakce jak je popisuje Bimboim a Doly vNucl. Acids Res. 7: 1513 (1979). Izolovaná plasmidová DNA byla trávena EcoRI a byla analyzována na 0,8% agarosovém gelu. Dvouřetězcové

DNA inserty vhodné velikosti, tj. okolo 700 bp pro těžký řetězec a okolo 700 bp pro lehký řetězec, byly sekvencovány modifikací Sangerovi metody. Sekvence všech 12 těžkých a lehkých řetězců byly srovnávány pro vytvoření konsensuální sekvence variabilního regionu těžkého řetězce BC2 (SEQ ID NO: 5) a konsensuální sekvence variabilního regionu lehkého řetězce BC2 (SEQ ID NO: 6).

Analýza sekvence cDNA variabilního regionu těžkého řetězce BC2 ukázala otevřený čtecí rámeček o 363 nukleotidech kódující sekvenci 121 aminokyselin (SEQ ID NO: 7). Sekvence CDR 1, 2 a 3 těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10, v příslušném pořadí.

Analýza sekvence cDNA variabilního regionu lehkého řetězce BC2 ukázala otevřený čtecí rámeček o 321 nukleotidech kódující sekvenci 107 aminokyselin (SEQ ID NO: 11). Sekvence CDR 1, 2 a 3 těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 14, v příslušném pořadí.

Příklad 6

Humanizované protilátky

Šest humanizovaných protilátek označených SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB249417, SB 257731 a SB 257732 bylo navrženo tak, aby obsahovaly myší CDR popsané výše v pracovním rámečku lidské protilátky.

SB 249413

SB 249413 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-0 a lehký řetězec F9HZLC 1-0. Syntetický variabilní region humanizovaného těžkého řetězce F9HZHC 1-0 byl navržen za použití prvních tří regionů pracovních rámečků těžkého řetězce získaného z imunoglobulinu RF-TS3'CL (Capra, J. D. et al., J. Clin. Invest 86: 1320- 1328 (1990), identifikovaného v Kabat databázi jako Kabpro:Hhcl0w) a CDR těžkého řetězce BC2 popsaných dříve. Nebyly provedeny žádné aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které by mohly ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány čtyři syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 18), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region těžkého řetězce včetně CDR (SEQ ID NO: 19 a

-22CZ 299452 B6

SEQ ID NO: 20). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 21 a SEQ ID NO: 22) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Spěl, KpnI restrikčniho trávení. Druhý DNA fragment kódující „campath“ signální sekvenci obsahující prvních pět aminokyselin variabilního regionu (SEQ ID

NO: 23 a SEQ ID NO: 24) byl vyroben PCR amplifíkaci vhodného regionu konstruktu kódujícího humanizovaný těžký řetězec protilátky proti respiračně syncitiálnímu viru (SEQ ID NO: 25) se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27) a trávením restrikčními enzymy EcoRI a Spěl. Dva generované fragmenty byly ligovány do EcoRI, KpnI tráveného pFHZHC26pCD expresního vektoru pro savčí buňky, který obsahoval zbývající lidský konsensuální pralo covní rámeček 4 a konstantní region IgGl. Vektor obsahoval jednu aminokyselinovou mutaci vektoru pFHZHC2-3pCD vektoru popsaného v Mezinárodního patentové přihlášce č. WO 94/05690. Konečný zbytek pracovního rámečku 2 (zbytek 49) byl mutován ze Ser na Ala trávením pFHZHC2-3pCD Xbal a EcoR5 a inserci linkeru generovaného ze dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 28 a SEQ ID NO: 29). Sekvence F9HZHC 1-0 insertu je ukázána v SEQ IDNO: 30 a SEQ ID NO: 31.

Syntetický variabilní region humanizovaného lehkého řetězce F9HZLC 1-0 byl navržen za použití regionů pracovních rámečků lidského lehkého řetězce získaného z imunoglobulinu LS8'CL (Carmack et al., J. Exp. Med. 169: 1631 - 1643 (1989), identifikovaného v Kabat data20 bázi jako Kabpro:Hkl318) a CDR lehkého řetězce BC2 popsaných dříve. Nebyly provedeny žádné aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které by mohly ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány dva syntetické přesahující se oligonukleotidy (SEQ ID NO: 32 a SEQ ID NO: 33), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region lehkého řetězce (SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 35). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 36 a SEQ ID NO: 37) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Seal, Sacll restrikčniho trávení. Druhý DNA fragment kódující „campath“ signální sekvenci obsahující první dvě aminokyseliny variabilního regionu (SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 39) byl vyroben PCR amplifíkaci vhodného regionu konstruktu kódujícího humanizovaný těžký řetězec protilátky proti respiračně syncytiálnímu viru (SEQ ID NO: 25) se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 40) a trávením restrikčními enzymy EcoRI a Seal. Dva generované fragmenty byly ligovány do EcoRI, Sacll tráveného pFHzLCl-2pCN expresního vektoru pro savčí buňky, který obsahoval zbývající lidský konsensuální pracovní rámeček 4 a konstantní region IgGl. Vektor obsahoval jednu aminokyselinovou mutaci vektoru pFHZLCl-lpCN vektoru popsaného v Mezinárodní patentové přihlášce WO 94/05690. Zbytek pracovního rámečku 2 byl mutován ze Ser na Pro trávením pFHZLCl-pCN Smál a KpnI a inserci linkeru generovaného ze dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 42). Sekvence F9HZLC 1-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 43 a SEQ ID NO: 44.

SB 249415

SB 249415 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 a lehký řetězec F9HZLC 1-1. Tyto konstrukty lehkého a těžkého řetězce jsou založeny na F9HZHC 1-0 a F9HZLC 1-0, v příslušném pořadí, nicméně, mají aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci CDR.

F9HZHC 1-1 má tři aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány dva syntetické přesahující se oligonukleotidy (SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 46), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující pozměněnou část variabilního regionu těžkého řetězce (SEQ IDNO: 47 a SEQ ID

NO: 48). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 49 a SEQ ID NO: 50) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze EcoNI, KpnI, restrikčniho trávení. Tento fragment byl ligován do EcoNI, KpnI tráveného F9HZHC 1-0 (SEQ IDNO: 30) vektoru. Sekvence F9HZHC 1-1 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52.

-23 CZ 299452 B6

F9HZLHC 1-1 má čtyři aminokyselinové substituce v pracovním rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci CDR. Byly generovány dva syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 54), které, pokud jsou tepelně zpracovány, mají KpnI a BamHI lepivé konce a kódují aminokyseliny představující pozměněnou část variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 55). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) byl tráven restrikčními enzymy KpnI a BamHI a byl ligován do syntetické cDNA. Sekvence F9HZLC 1-1 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 56 a SEQ ID NO: 57.

ío SB 249416

SB 249416 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (popsaný výše) (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 1-2. Konstrukt lehkého řetězce je založen na F9HZLC 1-1, nicméně, má jednu další aminokyselinovou substituci v pracovním rámečku, která může ovlivňovat presentaci CDR.

Byly generovány dva syntetické přesahující se oligonukleotidy (SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 59), které, pokud jsou tepelně zpracovány, mají BamHI a Xbal lepivé konce a kódují aminokyseliny představující pozměněnou část variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 60). Vektor F9HZLC 1-1 (SEQ ID NO: 56) byl tráven restrikčními enzymy BamHI a Xbal a byl ligován do syntetické DNA. Sekvence F9HZLC 1-2 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 61 a

SEQ ID NO: 62.

SB 2494417

SB 249417 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (popsaný výše) (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 2-0. Syntetický variabilní region humanizovaného lehkého řetězce F9HZLC

2-0 byl navržen za použití regionů pracovních rámečků lehkého řetězce získaného z imunoglobulinu REI (Palm a Hilschmann, Z. Physiol. Chem. 354: 1651 - 1654, (1973), identifikovaného v Kabat databázi jako Kabpro:HKLl 11) a CDR lehkého řetězce BC2 popsaných dříve. Bylo vloženo pět aminokyselinových substitucí v lidské konsensuální sekvenci. Bylo provedeno šest substitucí v aminokyselinách myšího pracovního rámečku, které mohou ovlivňovat presentaci

CDR. Byly generovány dva překrývající se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 63 a SEQ ID NO: 64), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region lehkého řetězce (SEQ ID NO: 65 a SEQ ID NO: 66). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 67 a SEQ ID NO: 68), ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze

Seal, SacII restrikčního trávení. Druhý DNA fragment kódující „campath“ signální sekvenci obsahující prvních pět aminokyselin variabilního regionu (SEQ ID NO: 38) byl vyroben PCR amplifikaci vhodného regionu konstruktu kódujícího humanizovaný těžký řetězec protilátky proti respiračně syncytiálnímu virus (SEQ ID NO: 25) se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27) a tráveném restrikčními enzymy EcoRI a Seal. Třetí DNA fragment kódující zbývající lidský pracovní rámeček 4 (SEQ ID NO: 70) a mající SacII a Narl lepivé konce byl generován tepelným zpracováním dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 71 a SEQ ID NO: 72). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) byl tráven restrikčními enzymy EcoRI a Narl a byl ligován do tří DNA fragmentů Sekvence F9HZLC 2-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 73 a SEQ ID NO: 74.

SB 257731

SB 257731 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 1-3, F9HZLC 1-2 s jednou mutací aminokyseliny (SEQ ID NO: 62), F9HZLC 1-2 byl amplifikován PCR se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 69) a byl tráven restrikčními enzymy

EcoRI a Seal. Byl izolován 64 bp fragment (SEQ ID NO: 75 a SEQ ID NO: 76). Fragment byl ligován do EcoRI, Seal tráveného vektoru F9 HZLC 1-2 za zisku konstruktu lehkého řetězce označeného F9HZLC 1-3. Sekvence F9HZLC 1-3 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 77 a SEQ ID NO: 78.

-24CZ 299452 B6

SB 257732

SB 257732 obsahuje syntetický variabilní region humanizovaného těžkého řetězce F9HZHC 3—0 a lehký řetězec F9HZLC 3-0. Byly generovány čtyři překrývající se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 a SEQ ID NO: 82), které, pokud jsou tepelně zpracovány a extendovány, kódují aminokyseliny představují pozměněný variabilní region těžkého řetězce (SEQ ID NO: 83 a SEQ ID NO: 84). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 85 a SEQ ID NO: 86), ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Stul, KpnI restrikčního trávení.

Izolovaný fragment byl ligován do Stul, KpnI tráveného F9HZHC1-1 (SEQ ID NO: 52) vektoru. Tento vektor byl potom tráven EcoRI, Spěl pro odstranění signální sekvence. DNA fragment kódující „campath“ signální sekvenci (SEQ ID NO: 23) obsahující prvních pět aminokyselin variabilního regionu (SEQ ID NO: 38) byl vyroben PCR amplifikací F9HZHC 1-1 se dvěma primery (SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 87) a trávením restrikčními enzymy EcoRI a Spěl.

Generovaný fragment byl ligován do vektoru. Sekvence F9HZHC 3-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 88 a SEQ ID NO: 89.

Byly generovány čtyři překrývající se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 a SEQ ID NO: 93), které, pokud jsou tepelně zpracovány a exten20 dovány, kódují aminokyseliny představující variabilní region lehkého řetězce (SEQ ID NO: 94 a SEQ ID NO: 95). Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 96 a SEQ ID NO: 97) a byl ligován do vektoru pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, katal. č. K2000-01) a byl izolován ze Seal, Narl restrikčního trávení. Izolovaný fragment byl ligován do Seal, Narl tráveného F9HZLC 1-3 (SEQ ID NO: 77) vektoru. Sekvence F9HZLC 3-0 insertu je ukázána v SEQ ID NO: 98 a SEQ ID NO: 99.

Humanizované mAb proti faktoru IX byly exprivovány v CHO buňkách. DG-447 buněčná linie adaptovaná pro suspenzní kultivaci v médiu bez séra byla kultivována ve 100 ml bezproteinového média obsahujícího lx nukleosidů a 0,05% F68 ve 250 ml sterilních erlenmeyerových baň30 kách najedno použití (Corning) na Innova 2100 deskové třepačce (New Brunswick Scientific) při 150 rpm při 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru s 5% CO₂, 95% vzduchem. Tyto buňky byly pasážovány při 4 x 10⁵ buněk/ml dvakrát týdně. 15 pg každého pCN-Lc-lehký řetězec a pCDHc-těžký řetězec vektorů byl linearizován trávením Notl, byly společně vysráženy za sterilních podmínek a byly resuspendovány v 50 pl IX TE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5).

DNA byla elektroporována za použití Bio-Rad Gene Pulser (Bio Rad Laboratories) do Acc-098 buněk za použití techniky popsané Hensley et al., v J. Biol. Chem. 269: 23949 - 23958 (1994). 1,2 x 10⁷ buněk bylo promyto jedenkrát v 12,5 ml ledově chladného PBSacharosa (PBS, 272 mM sacharosy, 7 mM fosforečnanu sodného, pH 7,4, 1 mM MgCl₂), resuspendováno v 0,8 ml PBS, přidáno k 50 pl DNA roztoku a bylo inkubováno na ledu po dobu 15 minut. Buňky byly podro40 beny pulsům při 380 V a 25 pF, a potom byly inkubovány na ledu po dobu 10 minut. Buňky byly umístěny do 96-jamkových kultivačních ploten při hustotě 5 x 10⁵ buněk na plotnu v udržovacím médiu na dobu 24 hodin před selekcí. Buňky byly selektovány podle resistence na 400 pg/ml G418 (Geneticin, Life Technologies, lne.) v udržovacím médiu. 24 hodin před testem byly buňky vyživovány 150 pl udržovacího média.

Kondicionované médium z jednotlivých kolonií bylo testováno za použití elektrochemoluminiseenční (ECL) detekční metody na Origen analyzátoru (IGEN, lne.) (viz Yang et al., Biotechnology 12: 193-194 (1994).

Všechny roztoky nezbytné pro provedení testů (testovací pufry) a pro provoz analyzátoru (čistič buněk) byly získány od IGEN. Protilátky (anti-lidský IgG (specifické pro g řetězec), Sigma Chemicals a F(ab')₂ fragment k lidskému IgG (H+L), Kirkegaard and Perry Laboratories lne.) byly značeny TAG-NHS-esterem (IGEN, lne.) v molárním poměru TAG:proteinu 7:1, zatímco protein A (Sigma) byl značen Biotin-LC-Sulfo-NHS-esterem (IGEN, lne.) v molámím poměru

-25 CZ 299452 B6

Biotin:protein 20:1, oboje podle doporučení IGEN. Streptavidinem potažené magnetické korálky (M-280) byly získány od Dynal.

Imunotesty byly provedeny za použití následujícího protokolu: na vzorek bylo 50 μΐ Strepto5 vidinem potažených korálků (konečná koncentrace 600 pg/ml v PBS, pH 7,8, s 1,25% Tween) smíseno s 50 pl Biotin-Protein A (konečná koncentrace 1 pg/v PBS, pH 7,8 s 1,25% Tween) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě s třepáním, bylo přidáno 50 pl TAG protilátek (směsi s konečnou koncentrací 1,25 pg/ml F(ab')2 fragmentu k lidskému IgG (H+L) a 0,25 pg/ml anti-lidský IgG (specifické ke g-řetězci) v PBS, pH 7,8, s 1,25% Tween), roztok byl potom ío přidán ke 50 pl kondicionovaného média a byla provedena inkubace střepáním při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Do reakční směsi bylo přidáno 200 pl testovaného pufru a reakční směs a vzorek byly analyzovány na Origen I analyzátoru pro měření ECL. Výsledky ukazují, že přibližně 20 až 37 % testovaných kolonií secernuje více než 15 ng/ml protilátky s průměrnou expresí okolo 150 ng/ml.

Humanizované mAb proti faktoru IX byly přečištěny z kondicionovaného média za použití Procep A pro krok zachycení následovaný iontovou výměnou chromatografií pro redukci nadbytečné DNA. Procep A absorbentní materiál (Bioprocessing Ltd., Durham, England) byl použit pro přípravu s poměrem průměru k výšce 1:1. Projasněné kondicionované médium bylo zavedeno do kolony při asi 150 cm/h. Kolona byla sekvenčně promyta fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS), PBS obsahujícím 1 M NaCl a nakonec PBS. Navázaný materiál byl získán eluci 0,1 M kyselinou octovou. pH eluatu bylo upraveno na 5,5 a eluat byl ředěn vodou (1:4), naředěný roztok byl zaveden na S-Sepharosovou kolonu (2,5 x 13 cm), která byla předem ekvilibrována 20 mM octanu sodného, pH 5,5 při 80 cm/h. Kolona byla promývána acetatovým pufrem, dokud nebylo dosaženo rovnovážného základního stavu a navázaný protein byl eluován 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,4 při 25 cm/h. Eluovaný materiál byl filtrován přes 0,4 mikronovou membránu a byl uskladněn při 4 °C.

Příklad 7

Myší-lidská chimérická protilátka

100 ng BC2 RNA bylo reversně transkribováno za použití RT-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim katalogové č. 1483-188) za použití dT oligo pro „priming“ a byla prove35 děna PCR amplifikace se syntetickými Seal (SEQ ID NO: 100) a Narl (SEQ ID NO: 101) primery pro produkci variabilního regionu lehkého řetězce BC2 se Seal, Narl konci (SEQ ID NO: 102 a SEQ ID NO: 103). Tato DNA byla ligována do Seal, Narl tráveného F9HZHC 1-3 (SEQ ID NO: 77) a byla trávena Seal, Narl za produkce myšího-lidského chimérického lehkého řetězce F9CHLC (SEQ ID NO: 104 a SEQ ID NO: 105).

100 ng BC2 RNA bylo reversně transkribováno za použití RT-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim katalogové č. 1483-188) za použití dT oligo pro „priming“ a byla provedena PCR amplifikace se syntetickými Spěl (SEQ ID NO: 106) a Nhel (SEQ ID NO: 107) primery pro produkci variabilního regionu těžkého řetězce BC2 se Spěl, Nhel konci (SEQ ID

NO: 108 a SEQ ID NO: 109). „Campath“ signální sekvence byla amplifikována PCR z těžkého řetězce RSVZH19 (SEQ ID NO: 25) s EcoRI (SEQ ID NO: 26) a Spěl (SEQ ID NO: 87 primery. Tyto dva DNA fragmenty byly ligovány do EcoRI, Nhel tráveného IL4CHHCpcd vektoru popsaného v publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 95/07301, za nahrazení IL4 variabilního regionu variabilním regionem myší BC2 proti faktoru IX, za produkce myšího50 lidského chimérického těžkého řetězce F9CHHC (SEQ ID NO: 110 a SEQ ID NO: 111).

Současná transfekce a přečištění myší-lidské chimérické protilátky chaFIX bylo provedeno stejně jak je popsáno výše pro humanizované konstrukty.

-26CZ 299452 B6

Příklad 8

Účinnost humanizovaných mAb proti faktoru IX v krysím modelu trombu

Pro hodnocení účinnosti humanizovaných protilátek proti lidskému faktoru IX v prevenci arteriální trombózy byl použit krysí model trombózy arteria carotis jak je popsán výše v příkladu 3. Základní parametry byly stanoveny pro průtok v arteria carotis, arteriální tlak, puls, průchodnost cévy a aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT). Patnáct minut poté bylo po dobu 10 minut provedeno poškození arteria carotis. Parametry byly určovány 60 minut po io začátku poškození arteria carotis. Trombus byl také extrahován z arteria carotis a zvážen.

Všechna činidla byla podána intravenosně 15 minut před začátkem poškozené arteria carotis. Byly testovány následující léčebné protokoly a byly srovnávány s mAb BC2 proti faktoru IX.

1. Vehikulum

2. chaFIX: 3 mg/kg bolus

3. SB 249413: 3 mg/kg bolus

4. SB 249415: 3 mg/kg bolus

5. SB 249416: 3 mg/kg bolus

6. SB 249417: 3 mg/kg bolus

7. SB 257731: 3 mg/kg bolus

8. Heparin: 60 U/kg bolus + 2 U/kg/min infusně

APTT byl použit jako primární kriterium pro hodnocení účinnosti versus riziku krvácení pro anti25 koagulační/antitrombotické činidlo použité ve studii. Výsledky na obrázku 8 ukazují, že humanizované mAb proti faktoru IX SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 a SB 257731 měly mírný účinek na APTT při použití dávky 3,0 mg/kg, kde tento účinek je v klinicky přijatelném rozmezí.

Účinek mAb proti faktoru IX na hmotnost trombu je ukázán na obrázku 9. Výsledky ukazují, že všechny humanizované protilátky jsou stejně účinné v redukci hmoty trombu.

Studie provedené na krysím modelu trombózy arteria carotis jasně ukazují účinnost humanizovaných mAb proti faktoru IX v prevenci trombózy v modelu vysoce trombogenního arteriálního poškození. Nej významnější je, že účinnost všech humanizovaných mAb proti faktoru IX byla demonstrována v požadovaném terapeutickém rozsahu pro antikoagulační terapii definovaném APTT.

Příklad 9

Biochemické a biofyzikální vlastnosti protilátek

Molekulová hmotnost SB 249417 byla určena MALD-MS jako 148000 Da. Analytická ultracentrifugace SB 249417 dávala stejnou hodnotu. Za přítomnost faktoru IX a Ca²⁺ sedimentovala protilátka odvozená od BC2 s hmotností 248000 Da, což odpovídá společné hmotnosti mAb a dvou molekul faktoru IX. Nebyly pozorovány žádné důkazy agregátů vyššího řádu za přítomnosti nebo za absence faktoru IX.

Kinetika vazby faktoru IX na SB 249417 byla testována BIAcore analýzou s protilátkou navázanou na povrch s imobilizovaným proteinem A. Byl použit rekombinantní lidský faktor IX (rhFIX, Genetics Institute) při 49 nM a měření bylo provedeno za přítomnosti 5 mM Ca²⁺.

Interakce byla charakterizována rychlou asociací, k_ass = 2,0 x 10⁵ M“'s ¹ a relativně pomalou disociací, kdiss = 4,1 x 10¹s ¹. Vypočítaná Kd pro vazbu na faktor IX byla 1,9 nM.

Tabulka 1 shrnuje biofyzikální vlastnosti SB 249417.

-27CZ 299452 B6

Tabulka 1 - Shrnutí biofyzikálních vlastností SB 249417

Izotyp

Čistota podle SDS-PAGB

IgGl, kappa >95% (za redukčních podmínek)

Molekulová hmotnost

Hmotností spektrometrie Analytická ultracentrifugace

Stechiometrie vazby na faktor IX

Izotermální titrační kalorimetrie

Vazebná afinita k faktoru IX

Izotermální titrační kalorimetrie Biosensor

Kinetika vazby na faktor IX Biosensor

148000 Da 148000 Da

1,5 molů faktoru

IX: 1 mol mAb

K_a = 4 nM při 25 °C K = 2 nM k = 2,0 x 10⁵ M-^-s“¹ k = 4 x 10^-4 s“¹

O.X a a

Tabulka 2 shrnuje vazebné vlastnosti mAb podle předkládaného vynálezu na faktor IX. Vypočítané disociační konstanty byly v podstatě stejné, v mezích experimentálních chyb.

Tabulka 2 - Kinetika vazby faktoru IX na mAb proti faktoru IX

mAb	k aee			(s 1)	vypočítaná	KD (nM)
SB 249417	2,0 x	10s	4,1 X	10-4	1,9
BC2	4,8 x	10s	9,1 x	10’4	1,9
Chf9	2,4 x	10s	3,0 x	10-4	1,3
SB 249413	6,5 x	10s	2,8 x	10* 3	3,7	- 5,1
SB 249415	7,5 x	105	1,8 x	10~4	1,1	- 2,3
SB 249416	5,2 X	105	4,1 x	104	0,8
SB 257731	9,2 x	105	9,9 x	104	1,1
SB 257732	1,1 X	10 s	1,2 x	10’3	1, 5

Interakce mezi rhFIX a SB249417, BC2 a jinými humanizovanými konstrukty byly charakterizovány titrační mikrokalorimetrií, která měří vazebné interakce v roztoku z vnitřního tepla ío vazby. Bylo provedeno devět injekcí 106 μΜ FIX do kalorimetru obsahujícího 2 μΜ mAb SB

249417. Vazba byla detekována v prvních čtyřech injekcích jako exotermická tepelná energie. Při posledních 5 injekcích byla vazebná místa mAb saturována FIX a bylo pozorováno pouze základní teplo směsi. Výsledky ukazují, že rovnováha nastává při molámím vazebném poměru okolo 2 FIX na mAb, jak bylo očekáváno. Nelineární analýzou nejmenších čtverců se získá vazebná afinita.

rhFIX afinity mAb byly měřeny v rozmezí teplot od 34 do 44 °C v lOmM HEPES, lOmM CaCfi, 150 mM NaCl, pH 7,4. Tato data umožňují přímé určení afinity při 37 °C a při 25 °C

-28CZ 299452 B6 výpočtem z van't Hoffovi rovnice. Data v tabulce 3 ukazují, že afinity SB 249417, BC2 ajejich dalších humanizovaných konstruktů jsou v mezích stejné chyby (faktor 2).

Tabulka 3 - Výsledky titrační kalorimetrie pro anti-FIX mAb

mAb	Kd, nM při 25 °C	Kd, nM při 37 °C	Molámí vazebný poměr PIX/mAb
BC2	10	20	1,4
SB 249413	6	12	1,9
SB 249415	3	7	1,7
SB 249417	4	12	1,5
SB 257732	4	9	1,8

mAb SB 249413, SB 249415, SB 249417 a SB 257732 všechny vykazovaly velmi podobné termální stability podle diferenciální scanning kalorimetrie. Jejich rozkladná Tms v rozmezí od 70 do 75 °C naznačují vysokou stabilitu proti termálně indukované denaturaci.

Příklad 10

Mechanismus inhibice faktoru IX způsobené protilátkou

Byla konstruována knihovna chimérických konstruktů složených ze sekvencí faktoru IX sestřižených do pracovního rámečku homologního proteinu faktoru VII a byla použita pro mapování epitopu pro mAb BC2 proti faktoru IX. Viz Cheung et al., Thromb. Res. 80: 419 - 427 (1995). Vazba byla měřena za použití BiaCore 2000 přístroje pro povrchovou plasmonovou resonanci. BC2 protilátka byla navázána přímo na čip za použití NHS/EDC reakce. Vazba byla měřena 2 minutovým kontaktním časem při 20 μΐ/min s 200 nM každého z daných konstruktů v 25 mM MOPS, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl₂. Disociace byla monitorována po dobu 3 minut za použití stejného pufru bez proteinu. Žádná vazba nebyla detekována na přirozený konstrukt za přítomnosti 50 mM EDTA. Data jsou předložena v tabulce 4.

Tabulka 4 - Shrnutí vazby konstruktů faktoru IX na protilátku BC2

Konstrukt	Stupeň vazby
Plasmatický IXa	vazba
r-IX	vazba
Plasmatický VII	bez vazby
IX LC/VII HC	vazba
IX-A/VII	vazba
VII gla/IX	bez vazby
VII-A/IX	bez vazby
VII gla (IX 3-11)/IX	vazba
VII gla (IX 3-6)/IX	velmi slabá vazba
VII gla (IX 9-11)/IX	velmi slabá vazba
IX K5A	vazba

-29CZ 299452 B6

Tyto data ukazují, že konstrukt obsahující lehký řetězec faktoru IX a těžký řetězec faktoru VII (IX LC/VII HC); gla faktoru IX a aromatické šachtové domény (IX-A/VII); zbytky 3 - 11 gla domény faktoru IX v gla doméně faktoru VII (VII gla (IX 3-11 )/IX); a faktor IX mající substituci lysinu na alanin ve zbytku 5 (IX K5A) vykazují vazbu na BC2. VII gla (IX 3-11 )/IX konstrukt vykazoval vazbu s BC2 stejnou jako přirozený faktor IX (plasmatický OXa a r-IX). Proto, BC2 protilátka se váže na epitop obsažený ve zbytkách 3-11 gla domény faktoru IX.

Předkládaný vynález může být prováděn v jiných specifických formách, bez odchýlení se od rozsahu vynálezu nebo od jeho základních rysů, a v souladu s tím by měly být odkazy prováděny ío spíše na připojené nároky, než na uvedený popis, protože ty ukazují rozsah vynálezu.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Blackbum, Michael

Church, William Gross, Mitchell

Feuerstein, Giora

Nichols, Andrew Padlan, Eduardo Patel, Arunbhai Sylvester, Daniel (ii) Název vynálezu: Antikoagulační činidla použitelná pro léčbu trombózy (iii) Počet sekvencí: 111 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: SmithKline Beecham Corporation (B) Ulice: 709 Swedeland Road (C) Město: Ring of Prussia (D) Stát: PA (E) Země: USA (F) ZIP:19406 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ média: Disketa (B) Počítač: IBM kompatibilní (C) Operační systém: DOS (D) Software: FastSEQ verse 1.5 (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání: 16. 1. 1997 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí data přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: 60/029119 (B) Datum podání: 24. 10. 1996 (viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Baumeister, Kirk (B) Registrační číslo: 33833

-30CZ 299452 B6 (C) Reference/číslo rejstříku: P50438 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 610-270-5096 (B) Telefax:

(C) Telex:

(2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 1: CATCCTAGAG TCACCGAGGA (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 2:

AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 36 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý

-31 CZ 299452 B6 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 3:

_]0 CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 4:

GATTTTCARG TGCAGATTTT C 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 363 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 5:

-32CZ 299452 B6

CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60 TCCTGGAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120 CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 180 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT 240 TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG 300 AAŤATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT 3 60 GCA 363 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 321 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 6:

CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60 ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA 120 TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC 180 TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA 240 GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC 300 ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 121 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 7:

-33CZ 299452 B6

Gin

Ile

Gin

Leu

val

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Glu

1

5

10

15

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

05

90

95

TíiT

Are

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 8:

Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne

-34CZ 299452 B6 (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 9:

Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence: ío (A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 10:

Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr 15 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 11:

-35CZ 299452 B6

Gin

Ile

Val

Leu

Ser Gin

Ser

Pro

Ala

Ile

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Lys

Val

Thr

Mec Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn.

Leu Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Al?

Ala

Thr

Tvr Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Piie

Gly

Gly

Gly

Thr Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 12:

Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His

5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

-36CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 13: Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 14:

Gin Gin Trp Ser lle Asn Pro Arg Thr 20 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 104 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 15:

CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 108 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina

104

-37CZ 299452 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA 5 (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 16:

TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 107 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 17:

GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 91 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

so

108

107

-38CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 18:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 377 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence 20 (B) Umístění: 2...337 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 19:

A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG 49

Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

10 15

GTT Val

TCC TGC AAG GCC

TCT Ser

GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC

97

Ser Cys

Lys Ala 20

Gly Tyr Thr 25

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly 30

Met

Asn

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

145

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

35

40

45

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGG

CGG

193

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

ASP

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

50

55

60

TTT

GTC

TTC

TCC

TTG

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

241

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Xle

70 75 80

-39CZ 299452 B6

289

AGC

AGC

CTA

AAG

GCT

GAC

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TAC TGT

GCG

AGA

GAA

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr Cys

Ala

Arg

Glu

85

90

95

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG GGC

CAG

GGT

ACC

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp Gly

Gin

Gly

Thr

100 105 110

337 (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 112 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 20:

Leu

Val

Gin.

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

5

10

15

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

20

25

30

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

35

40

45

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

50

55

60

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ile

65

70

75

80

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

85

90

95

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

(2) Informace pro SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

-40CZ 299452 B6 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 21:

GCTAC7AGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC ío (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 22:

TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 97 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...95 (C) Další informace

-41 CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 23:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Hec Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA GGT

GTC

CAC

TCC

CAG

GTC

CAA

CTA GT

97

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr Gly

Val

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

10

15

20

(2) Informace pro SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý io (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 24:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Val Gin Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 110 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 25:

-42CZ 299452 B6

GGAGACGCCA TCGAATTCTG AGCACACAGG ACCTCACCAT GGGATGGAGC TGTATCATCC TCTTCTTGGT AGCAACAGCT ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG

SO

110 (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 26:

GGAGACGCCA TCGAATTCTG A _2l (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 27:

GATTGCACTA GTTGGACCTG GGAGTGGACA (2) Informace pro SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 77 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA

-43 CZ 299452 B6 (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 28:

CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG ACGGGCCGGT TCACGAT (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 73 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 29:

ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC TCTGCGACCC ACT (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 363 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...363 (C) Další informace: F9HZHC 1-0

-44CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 30:

CAG Gin

GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT

GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC

48

Val

Gin Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly Ser

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

96

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

TCC

TTG

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

55

70

75

80

CTA Leu

CAG Gin

ATC Ile

AGC Ser

AGC CTA AAG GCT

GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT

288

Ser Leu 85

Lys Ala

Asp

Asp 90

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

GCG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Ala

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAG

GGT

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

3 63

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 121 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 31:

-45CZ 299452 B6

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly.

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Vax

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

(2) Informace pro SEQ ID NO: 32:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 165 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 32:

AGTACTGACA CAGTCTCCAG CCACCCTGTC TTTGTCTCCA GGGGAAAGAG CCACCCTCTC S0

CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAACAGAGAC CTGGCCAGGC 120

TCCCAGGCTC CTCATCTATG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGCAT 165 (2) Informace pro SEQ ID NO: 33:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 146 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne

-46CZ 299452 B6 (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 33:

CCGCGGGTTA

GCTGATGGTG

AGAAGCCAGG

ATACTCCACT

AGAGTGAAAT

TTACTAGTGG

GCTGACAGTA

CTGTCCCAGA

CATAGA

ATAAACCGCA AAATCTTCAG CCCGGATCCA CTGAACCTGG

GCTCTAGACT

CTGGGATGCC

120

146 (2) Informace pro SEQ ID NO: 34:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 280 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 2...280 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 34:

A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

10 15

GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp

25 30

-47CZ 299452 B6

TAC Tyr

CAA Glu

CAG Gin 35

AGA CCT GGC CAG

GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GCC ACT

145

Arg Pro Gly

Gin

Ala 40

Pro Arg

Leu Leu

Ile 45

Tyr

Ala

Thr

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

193

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

241

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG 280

Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg

90 (2) Informace pro SEQ ID NO: 35:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 93 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 35:

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

1

5

10

15

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Thr

35

40

45

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

85

90

(2) Informace pro SEQ ID NO: 36:

-48CZ 299452 B6 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne ío (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 36:

_lr TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC 27 (2) Informace pro SEQ ID NO: 37:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 37:

GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA (2) Informace pro SEQ ID NO: 38:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 94 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 40 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

-49CZ 299452 B6 (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...92 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 38:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG GTA GCA ACA GCT AGA GGT GTC CAC TCC GAG ATA GTA CT 94

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Glu Ile Val 10 IS 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 39:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 39:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly ¹ 5 10 15

Val His Ser Glu Ile Val 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 40:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

-50CZ 299452 B6 (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 40:

3ACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA (2) Informace pro SEQ ID NO: 41:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 55 párů bází ίο (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 41:

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC 55 (2) Informace pro SEQ ID NO: 42:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 51 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 30 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 42:

CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C (2) Informace pro SEQ ID NO: 43:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 321 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina

-51 CZ 299452 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíě: kódující sekvence 10 (B) Umístění: 1...321 (C) Další informace: F9HZLC 1-0 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 43:

GAA ATA Glu Ile 1

GTA CTG ACA CAG TCT

CCA GCC ACC CTG TCT TTG

TCT Ser

CCA Pro 15

GGG Gly

48

Val Leu Thr 5

Gin Ser

Pro Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AGG

CTC

CTC

ATC

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACT

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

S5

70

75

80

GAT

TTT

GCG

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG-

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Piie

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

ATC

AAA

CGA

321

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 44:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý

-52CZ 299452 B6 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 44:

Glu Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tvr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp	Phe	Ala	Val	Tyr	Tyr	Cys	Gin	Gin	Trp	Ser Ile Asn Pro Arg Thr
				85					90	95
Phe	Gly	Gly	Gly	Thr	Lys	Val	Glu	Ile	Lys	Arg
			100					105

ío (2) Informace pro SEQ ID NO: 45:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 134 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 45:

CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 60

GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATAT 120

CTACAGATCA GCAG 134 (2) Informace pro SEQ ID NO: 46:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 134 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina

-53 CZ 299452 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 46:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATG CCGTGCTGAC AGAGGAGTCT AGAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 47:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 225 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...225 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 47:

120 13 4

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

AAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

Pxo 1

Gly

Gin

Gly

Leu 5

Lys

Trp

Met

Gly

Trp 10

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn 15

Gly

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

TCT

CTA

lys

Ser

Thr

Tyr 20

Val

Asp

Asp

Phe

Lys 25

Gly

Axg

Phe

Val

Phe 30

Ser

Leu

GAC

TCC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

AAG

GCT

Asp

Sex

Sex 35

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr 40

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser 45

Leu

Lys

Ala

144

-54CZ 299452 B6

GAC Asp

GAC ACT Asp Thr 50

GCA GTG TAT TAC

TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT

192

Ala

Val Tyr

Tyr 55

cys

Thr Arg Glu

Gly Asn Met Asp Gly 50

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CAG

GGT

ACC

225

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

55

70

75

(2) Informace pro SEQ ID NO: 48:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 75 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 48:

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

Gly

Trp

Xle

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

1

5

10

15

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

20

25

30

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

35

40

45

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn.

Met

Asp

Gly

50

55

60

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

65

70

75

(2) Informace pro SEQ ID NO: 49:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

-55CZ 299452 B6 (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 49:

TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG (2) Informace pro SEQ ID NO: 50:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází ίο (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 50:

TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 51:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 363 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...363 (D) Další informace: F9HZHC 1-1 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 51:

-56CZ 299452 B6

CAG Gin 1

GTG CAA CTA

GTG CAA Val Gin 5

TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT

GGG Gly 15

GCC Ala

48

Val

Gin Leu

Ser Gly

Ser

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

96

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

AAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Lys

Trp

Mec

35

40

45

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Tfar

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

TCT

CTA

GAC

TCC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

AAG

GCT

GAC

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

ACG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Thr

Arg

C-lu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAG

GGT

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

363

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 52:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 121 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 52:

-57CZ 299452 B6

Gin 1

Val

Gin Leu Val 5

Gin

Ser

Gly

Ser Glu 10

Leu Lys Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

val

Thr

Val

Ser

Ser

115

12.0

(2) Informace pro SEQ ID NO: 53:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 82 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 53:

CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG (2) Informace pro SEQ ID NO: 54:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne

-58CZ 299452 B6 (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 54:

GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC 60 TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC 90 (2) Informace pro SEQ ID NO: 55:

ío (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 15 (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 55:

Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser 15 10 15

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 20 25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 56:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 321 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...321 (D) Další informace: F9HZLC 1-1

-59CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 56:

GAA

ATA GTA

CTG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

CCA

GGG

48

Glu

Ile Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

GAA

AGA GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Arg Ala

JT* L*

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG TAC

CAA

CAG

AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

144

His

Tro Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACG AGT

AAC

CTG

GCT

AGC

GGC

GTC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

192

Ala

Thr Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

30

55

60

GGG

TCT GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

240

Gly

Ser Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

30

GAT

TTT GCG

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Phe Ala

Val

Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGC GGA

/·*/-«/*»

ACC

AAG

GTG

GAG

ATC

AAA

CGA

321

Phe

Gly Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) Informace pro SEQ ID NO: 57:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 107 aminokyselin ίο (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 57:

-60CZ 299452 B6

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

10

15

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lle

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp

o. ^{85 90}

Phe Gly Gly _Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys ^Ser He Asn Pro Arg Th-r 95

Arg (2) Informace pro SEQ ID NO: 58:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 41 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 58:

GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T (2) Informace pro SEQ ID NO: 59:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 41 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

-61 CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 59:

CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G (2) Informace pro SEQ ID NO: 60:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 60:

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser (2) Informace pro SEQ ID NO: 61:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 321 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...321 (C) Další informace: F9HZLC 1-2 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 61:

-62CZ 299452 B6

GAA Glu n

ATA GTA CTG ACA CAG TCT

CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG

48

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin Ser

Pro Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACG

AGT

AAC

CTG

GCT

AGC

GGC

GTC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

240

GTy

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

GAT

TTT

GCG

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

ATC

AAA

CGA

321

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) Informace pro SEQ ID NO: 62:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 62:

-63CZ 299452 B6

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

Kis

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Lys Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) Informace pro SEQ ID NO: 63:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 165 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 63:

AGTACTCACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCCAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC 60

CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGG7AC CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC 120

TCCAAAGCCT TGGATCTACG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGTGT 165 (2) Informace pro SEQ ID NO: 64 (i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 161 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

-64CZ 299452 B6 (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 64:

CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGGCAGTA GTAGGTGGCG ATATCCTCTG GCTGGAGGCT 60

GCTGATGGTG AAGGTGTAGT CTGTACCGCT ACCGGATCCG CTGAATCTGC TTGGCACACC 120

AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CGTAGATCCA AGGCTTTGGA G 161 (2) Informace pro SEQ ID NO: 65:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 280 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina io (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 2...280 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 65:

A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

10 15

GTG Val

ACC ATC

ACC TGC Thr Cys 20

AGG Arg

GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC

TGG Trp

97

Thr

Ile

Ala

Ser

Ser Ser 25

Val Asn

Tyr

Met 30

His

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGT

AAG

GCT

CCA

AAG

CCT

TGG

ATC

TAC

GCC

ACT

145

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGT

GTG

CCA

AGC

AGA

TTC

AGC

GGA

TCC

GGT

AGC

193

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGT

ACA

GAC

TAC

ACC

TTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTC

CAG

CCA

GAG

GAT

ATC

241

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Xle

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

65

70

75

80

GCC

ACC

TAC

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

280

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

90

-65CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 66:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 93 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 66:

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

35

40

45

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

65

70

75

80

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

85

90

(2) Informace pro SEQ ID NO: 67:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 67:

TTTAGTACTC ACCCAGAGCC CAAGCAG

-66CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 68:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 68:

TTCCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 69:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 69:

CTCGAGCAGT ACTATCTGGG AGTGGACACC TGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 70:

(i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne

-67CZ 299452 B6 (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 70:

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 15 10 15

Ala (2) Informace pro SEQ ID NO: 71:

ío (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 15 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 71:

GGACGTTCGG CCAAGGGACC AAGGTGGAAA TCAAACGGAC TGTGGCGG 48 (2) Informace pro SEQ ID NO: 72:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 52 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 72:

CGCCGCCACA GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC

-68CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 73:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 321 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...321 (D) Další informace: F9HZLC 2-0 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 73:

CAG ATA GTA

CTC Leu

ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC

GCC AGC GTG

GGT Gly

48

Gin 1

Ile

Val

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu Ser

Ala

Ser

Val 15

GAC

AGA

GTG

ACC

ATC

ACC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGT

AAG

GCT

CCA

AAG

CCT

TGG

ATC

TAC

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACT

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGT

GTG

CCA

AGC

AGA

TTC

AGC

GGA

TCC

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGT

AGC

GGT

ACA

GAC

TAC

ACC

TTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTC

CAG

CCA

GAG

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

€5

70

75

80

GAT ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr

90 95

TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG 321

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

-69CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 74:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 74:

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Axg

100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 75:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 94 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódují sekvence (B) Umístění: 24...94 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 75:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA GGT GTC

CAC

TCC

CAG

ATA

GTA

CT

9

Leu

Val

Ais

Thr

Ala

Thr Gly Val

His

Ser

Gin

Ile

Val

Leu

10

15

20

(2) Informace pro SEQ ID NO: 76:

ío (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 15 (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 76:

Met Glv Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Glu Ile Val Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 77:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 401 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

-71 CZ 299452 B6 (vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...401 (D) Další informace: F9HZLC 1-3 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 77:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

S

TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG 101

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Ile Val Leu Thr Gin

15 20 25

TCT Ser

CCA GCC ACC Pro Ala Thr

CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC

149

Leu Ser Leu 30

Ser

Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

35

40

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AGA

197

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

45

50

55

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

GCC

ACG

AGT

AAC

CTG

GCT

245

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

60

65

70

AGC

GGC

GTC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

293

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

75

30

85

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

GCG

GTT

TAT

TAC

341

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

90

95

100

105

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

TTC

GGC

GGA

GC-G

ACC

AAG

389

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

110 115 120

GTG GAG ATC AAA Val Glu Ile Lys

125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 78:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 125 aminokyselin

-72CZ 299452 B6 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 78:

Met 1

Gly

Trp Ser Cys 5

Ile

Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr

Gly

10

15

Val

His

Ser

Gin

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

20

25

30

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

35

40

45

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Lys

Pro

50

55

60

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

55

70

75

80

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

85

90

95

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

100

105

110

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115

120

125

(2) Informace pro SEQ ID NO: 79:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 81 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 79:

-73CZ 299452 B6

AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC 50

AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T 81 (2) Informace pro SEQ ID NO: 80:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 99 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 80:

TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC 50

TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99 (2) Informace pro SEQ ID NO: 81:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 87 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 81:

GGTTTGTCTT ctctctagac acctctgtca gcacggcata TCTACAGATC AGCAGCCTAA 60 AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT 87 (2) Informace pro SEQ ID NO: 82:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 86 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

-74CZ 299452 B6 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 82:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT io (2) Informace pro SEQ ID NO: 83:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 278 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíě: kódující sekvence (B) Umístění: 3....278 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 83:

AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg ¹⁵ 10 15

CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp lir Asn Thr Arg

2C 25 30

-75CZ 299452 B6

AAT GGA AAG

TCA Ser 35

ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT

GTC Val

TTC Phe

143

Asn

Gly

Lys

Thr

Tyr

Val

Asp Asp 40

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe 45

CTA

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

191

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

50

55

60

AAG

GCT

GAG

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TTC

TGT

ACG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

239

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

65

70

75

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CAG

GGT

ACC

278

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

80

85

90

(2) Informace pro SEQ ID NO: 84:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 92 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ IDNO: 84:

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

1

5

10

15

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

20

25

30

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

35

40

45

Iren

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

50

55

60

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

65

70

75

80

Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 85 90

-76CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 85:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 85:

AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG 30 (2) Informace pro SEQ ID NO: 86:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 86:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 87:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 37 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne

-77CZ 299452 B6 (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 87:

CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG 37 (2) Informace pro SEQ ID NO: 88:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 446 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...446 (D) Další informace: F9HZHC 3-0 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 88:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC CAG

ATC

CAA

CTA

GTG

CAA

101

Leu 10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr 15

Gly

Val

His

Ser Gin 20

Zle

Gin

Leu

Val

Gin 25

TCT

GGG

TCT

GAG

TTG

AAG

AAG

CCT

GGG

GCC TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

149

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu 30

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala Ser 35

Val

Lys

Val

Ser 40

Cys

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

197

Lys

Ala

Ser

Giy 45

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn 50

Tyr Gly

Met

Asn

Trp 55

Val

Arg

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

245

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Met Gly

Trp

Ile 70

Asn

Thr

Arg

-78CZ 299452 B6

AAT GGA AAG TCA

ACA TAT GTT GAT

GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC

293

Asn Gly Lys

Ser

Thr Tyr Val 80

Asp

Asp Phe Lys

Gly 85

Arg Phe Val Phe

75

TCT

CTA

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

341

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

90

95

100

105

AAG

GCT

GAG

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TTC

TGT

ACG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

389

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

110 115 120

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

«píjím

ACT TAC

TGG

GGC

CAG

GGT ACC

CTG

GTC

ACC

437

Asp

Gly

Tyx

Phe

Pro

Phe

Thr Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly Thr

Leu

Val

Thr

125

130

135

GTC TCC TCT 446

Val Ser Ser

140 (2) Informace pro SEQ ID NO: 89:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 89:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly ¹ 5 10 15

Val His Ser Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

-79CZ 299452 B6

Thr Asn

Tyr

Gly

Met Asn Trp 55

Val Arg Gin Ala

Pro Gly Gin Gly Leu 60

50

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

65

70

75

80

Asp

Asp

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130 135 140 (2) Informace pro SEQ ID NO: 90:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 90:

AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT (2) Informace pro SEQ ID NO: 91:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 108 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

-80CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 91:

CTTGATGGGA CGCCGCTAGC CAGGTTACTC GTGGCATAGA TCCAGGGCTT GGGAGCTTTG CCAGGTTTCT GTTGGTACCA GTGCATGTAA TTTACACTTG AGCTGGCC (2) Informace pro SEQ ID NO: 92:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 108 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina ío (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 92:

TAACCTGGCT AGCGGCGTCC CATCAAGGTT CAGTGGATCC GGGTCTGGGA CAGATTACAC TCTCACGATA TCCAGTCTAC AACCTGAAGA TTTTGCGACT TATTACTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 93:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 102 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 93:

GGCGCCGCCA CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC CGCCGAACGT CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG GT (2) Informace pro SEQ ID NO: 94:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 330 párů bází

108

108

102

-81 CZ 299452 B6 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 2...328 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 94:

A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA 49

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

10 15

GTC Val

ACC ATC

ACT Thr 20

TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC

TGG Trp

97

Thr

Ile

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser 25

Ser

Val

Asn Tyr Met 30

His

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

GGC

AAA

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG ATC TAT

GCC

ACG

145

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp Ile Tyr

Ala

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GCT

AGC

GGC

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT GGA TCC

GGG

TCT

193

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser Gly Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

ACA

GAT

TAC

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

CAA CCT GAA

GAT

TTT

241

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin Pro Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

GCG

ACT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG CGG ACG

TTC

GGC

289

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro Arg Thr

Phe

Gly

85

90

95

GGA

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

ATC

AAA

CGA

ACT

GTG

GCG GCG CC

330

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala Ala

100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 95:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 109 aminokyselin

-82CZ 299452 B6 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

o (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 95:

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1

5

10

15

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ar a

Thr

35

40

45

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

85

90

95

Gly Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

100

105

(2) Informace pro SEQ ID NO: 96:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 96:

CAAGTACTGA CACAGTCTCC ATCCTC

-83CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 97:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA ío (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 97:

AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC (2) Informace pro SEQ ID NO: 98:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 412 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 25 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 27...412 (D) Další informace: F9HZC 3-0 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 98:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Ile Val Leu Thr Gin

15 20 25

101

-84CZ 299452 B6

TCT Ser

CCA Pro

TCC Ser

TCC CTG Ser Leu 30

TCT GCA TCT GTT

GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT

149

Ser Ala

Ser

Val

Gly 35

Asp

Arg

Val

Thr

Ile 40

Thr

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

197

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

45

50

55

CCT

GGC

AAA

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

GCC

ACG

AGT

AAC

CTG

GCT

245

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

60

65

70

AGC

GGC

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

293

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

75

80

85

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

CAA

CCT

GAA

GAT

TTT

GCG

ACT

TAT

TAC

341

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

90

95

100

105

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

389

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

110

115

120

CTG

GAG

ATC

AAA

CGA

ACT

GTG

GC

412

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Val

125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 99:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 129 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 99:

-85CZ 299452 B6

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Val

His

Ser

Gin

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

20

25

30

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

35

40

45

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Pro

50

55

60

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

65

70

75

80

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

85

90

95

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

100

105

110

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

115 120 125

Val (2) Informace pro SEQ ID NO: 100:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 100:

CAAATAGTAC TCTCCCAGTC TCCAGC (2) Informace pro SEQ ID NO: 101:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 41 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA

-86CZ 299452 B6 (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 101:

GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T (2) Informace pro SEQ ID NO: 102:

ío (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 335 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...335 (D) Další informace:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 102:

CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT

GCA TCT CCA GGG

48

Gin Ile Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile

Leu Ser

Ala

Ser

Pro 15

Gly

1

5

10

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

ACT

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGA

TCC

TCC

CCC

AAA

CCC

TGG

ATT

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Xle

Tyr

35

40

45

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

<31y

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

-87CZ 299452 B6

GGG TCT GGG ACC TCT

TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA

Gly Ser Gly 65

Thr

Ser

Tyr 70

Ser

Leu

Thr

Xle

Ser Arg Val 75

Glu

Ala

Glu 80

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCA

CGG

ACG

ASp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Xle

Asn

Pro

Arg

Thr

85

•

90

95

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

ACT

GTT

GCG

GCG

CC

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Xle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

(2) Informace pro SEQ ID NO: 103:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 112 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 103:

Gin. 1

Ile

Val

Leu

Ser 5

Gin

Ser Pro

Ala

Ile Leu Ser Ala Ser Pro

Gly

10

15

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

cly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

-88CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 104:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 318 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární io (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...318 (D) Další informace (xi) Popis frekvence: SEQ ÍD NO: 104:

CAG Gin 1

ATA GTA Ile Val

CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT

CCA Pro 15

GGG Gly

48

Leu

Ser Gin 5

Ser Pro

Ala Ile 10

Leu

Ser

Ala

Ser

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

ACT

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGA

TCC

TCC

CCC

AAA

CCC

TGG

ATT

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

192

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAA

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

65

70

75

80

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCA

CGG

ACG

288

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

318

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

-89CZ 299452 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 105:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 106 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 105:

Gin Zle Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala

Ser

Pro 15

Gly

1

5

10

Glu.

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pra

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

(2) Informace pro SEQ ID NO: 106:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 106:

-90CZ 299452 B6

CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 3 0 (2) Informace pro SEQ ID NO: 107:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 107:

TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG (2) Informace pro SEQ ID NO: 108:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 369 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence (B) Umístění: 1...369 (D) Další informace:

-91 CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 108:

CAG Gin 1

ATC τ

CAA CTA

GTG CAG TCT GGA

CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG

48

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

ACA

GTC

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGG

TAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TAT

96

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCA

GGA

AAG

GGT

ΤΊΆ

AAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

GGC

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GCC

TTC

TCT

TTG

GAA

AGC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

AAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

65

70

75

80

TTG

CAG

ATC

GAC

AAC

CTC

AAA

GAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

288

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

ACA

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAA

GGG

ACT

CTG

GTC

ACT

GTC

TCT

GCA

GCT

AGC

369

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ala

Ser

115

120

(2) Informace pro SEQ ID NO: 109:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 123 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

-92CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 109:

Gin Ile Gin Leu Val

Gin Ser Gly Pro

Glu Leu Lys 10

Lys

Pro

Gly 15

Glu

í

5

Thr

Val

Lys

ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly» Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ala

Ser

115

120

(2) Informace pro SEQ ID NO: 110:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 363 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina ío (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu:

(vi) Původní zdroj:

(ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: kódující sekvence 20 (B) Umístění: 1...363 (D) Další informace:

-93CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 110:

CAG ATC

CAA CTA Gin Leu

GTG Val 5

CAG.. TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG

48

Gin 1

Ile

Gin

Ser Gly

Pro

Glu 10

Leu Lys

Lys

Pro

Gly Glu 15

ACA

GTC

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGG

TAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TAT

96

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCA

GGA

AAG

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

GGC

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

S5

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GCC

TTC

TCT

TTG

GAA

AGC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

AAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

55

70

75

80

TTG

CAG

ATC

GAC

AAC

CTC

AAA

GAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

288

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

ACA

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAA

GGG

ACT

CTG

GTC

ACT

GTC

TCT

GCA

3 63

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

115 120 (2) Informace pro SEQ ID NO: 111:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 121 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

-94CZ 299452 B6 (xi) Popis frekvence: SEQ ID NO: 111:

Gin

Ile

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Glu

1

5

10

15

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

115

120

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (15)

1. ίο 1. Monoklonální protilátka, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 57, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID

   15 NO: 62, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 74, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 78 nebo jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 99.
2. 2. Pozměněná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde úseky základní struktury uvedeného těžkého a lehkého řetězce jsou odvozeny od alespoň jedné protilátky vybrané z monoklonálních protilátek podle nároku 1 a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících úseků (CDRs) těžkého řetězce jsou dány v SEQ ID NO: 8, 9 a 10 a aminokyselinové sekvence

   25 CDRs lehkého řetězce jsou dány v SEQ ID NO: 12, 13 a 14.
3. 3. Pozměněná protilátka podle nároku 2, která je humanizovaná.
4. 4. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci

   30 danou v SEQ ID NO: 31, 52 nebo 89.
5. 5. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 nebo 99.

   -95CZ 299452 B6
6. 6. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 44.

   5
7. 7. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 57.
8. 8. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci ío danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID

   NO: 62.
9. 9. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID

   15 NO: 74.
10. 10. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 78.
11. 11. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, jejíž těžký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec má aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 99.

    25
12. 12. Chimérická protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, ve které jsou konstantní úseky uvedeného těžkého a lehkého řetězce odvozeny od protilátky podle jakéhokoli z nároků 6 až 11 a aminokyselinové sekvence variabilních úseků těžkého řetězce jsou dané v SEQ ID NO: 7 a aminokyselinové sekvence variabilních úseků lehkého řetězce jsou dané v SEQ ID NO: 11.

    30
13. 13. Protilátka podle nároku 11, ve které jsou konstantní úseky vybrány z lidských imunoglobulinů.
14. 14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje pozměněnou protilátku podle nároku 3 nebo 12 a farmaceuticky přijatelný nosič.
15. 15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahuje kyselinu acetylsalicylovou.

    9 výkresů

    -96CZ 299452 B6 ra α

    ω >N '(tí ω

    ω (tí >O

    O o

    T-f

    Cí

    01234567 mAb/IX, mol/mol

    Obr. 1

    -97CZ 299452 B6 co

    Čas srážení,

    100

    0 10 20 30 40 50

    Hybridomní medium, μΐ

    Obr. 2

    -98CZ 299452 B6

    Cas srážení,