CZ299915B6 - Rekombinantní nukleová kyselina obsahující negativní regulacní elementy pro nervove specifickou expresi transgenu a její použití - Google Patents
Rekombinantní nukleová kyselina obsahující negativní regulacní elementy pro nervove specifickou expresi transgenu a její použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299915B6 CZ299915B6 CZ20002906A CZ20002906A CZ299915B6 CZ 299915 B6 CZ299915 B6 CZ 299915B6 CZ 20002906 A CZ20002906 A CZ 20002906A CZ 20002906 A CZ20002906 A CZ 20002906A CZ 299915 B6 CZ299915 B6 CZ 299915B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- promoter
- nrse
- cells
- sequences
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 81
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 77
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title abstract description 18
- 239000013642 negative control Substances 0.000 title 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 62
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 44
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 43
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 33
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 9
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 5
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 5
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 claims 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 25
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 24
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 18
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 11
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 11
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 11
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 11
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 8
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108010044266 Dopamine Plasma Membrane Transport Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010015720 Dopamine beta-Hydroxylase Proteins 0.000 description 2
- 102100033156 Dopamine beta-hydroxylase Human genes 0.000 description 2
- 102000006587 Glutathione peroxidase Human genes 0.000 description 2
- 108700016172 Glutathione peroxidases Proteins 0.000 description 2
- 101000697510 Homo sapiens Stathmin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 2
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 2
- -1 NT4-5 Proteins 0.000 description 2
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100033928 Sodium-dependent dopamine transporter Human genes 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108010031944 Tryptophan Hydroxylase Proteins 0.000 description 2
- 102000005506 Tryptophan Hydroxylase Human genes 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002027 Amyotrophy Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 206010068597 Bulbospinal muscular atrophy congenital Diseases 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 1
- 108700005000 Glial Fibrillary Acidic Proteins 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000701168 Murine adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 1
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 235000009233 Stachytarpheta cayennensis Nutrition 0.000 description 1
- 102100028051 Stathmin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 108050005241 Synapsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021905 Synapsin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 108010041776 cardiotrophin 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004889 cervical nerve Anatomy 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000005257 cortical tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;sodium Chemical compound [Na].[H][H] XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000032312 synaptic target recognition Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/32—Vector systems having a special element relevant for transcription being an silencer not forming part of the promoter region
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká nových konstruktu a zpusobu rízeníexprese nukleových kyselin, zejména konstruktu obsahujících sekvence NRSE, kterými lze dosáhnout cílené exprese transgenu v nervových bunkách in vivonebo ex vivo. Rešení je zejména vhodné pro aplikace prenosu genu in vivo, napr. pro úcely genové terapie nebo vedeckého výzkumu.
Description
? Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nově rekombinantní nukleové kyseliny, konstruktů a vektorů, obsahujících tyto konstrukty, které umožňují regulovat expresi nukleových kyselin. Konkrétně se vynález týká nových způsobů, konstruktů a vektorů, které umožňují dosáhnout cílené exprese transgenu v nervových buňkách in vivo nebo ex vivo. Vynález je zejména vhodný pro aplikace, kde se gen přenáší in vivo, např. při léčebném nebo výzkumném použití.
Dosavadní stav techniky (lenová terapie in vivo nebo ex vivo umožňuje lokální a účinný přenos genů {transgenů) kódujících požadované faktory, a to zejména do nervového systému hostitele. V tomto ohledu byla úspěšně použita řada vektorů pro přenos různých transgenů do nervových buněk in vivo nebo cy vivo, Mezi těmito vektory lze uvést zejména virové vektory typu adenoviru. AAV nebo
I (SV, některé nevirové vektory typu kationtových polymerů (např. polyetylenimin). Tyto vektory umožnily účinně a trvale přenést geny do buněk nervového systému in vivo (WO 94/08026, WO 93/09239 a WO 96/02655). Možnost uskutečnit takový přenos genů skýtá široké pole aplikací, zejména v oblasti medicíny. Tyto vektory lze užít pro genovou terapii in vivo nebo e.Y ν/ϊνλ V současné době jsou v běhu klinické studie týkající se přenosu trofíckých faktorů do nervových buněk. Tyto vektory lze také užít pro vytvoření transgenních zvířat, která umožní testování sloučenin, nebo pro různé značící studie nebo studie biologické dostupnosti. Ve všech těchto aplikacích, i když se zdá, žc je dosaženo účinného a trvalého přenosu, je nezbytná potřeba regulovat expresi transgenů. Byly již popsány různé systémy, které se pokoušely omezit expresi transgenu výlučně na určitou tkáň, např, pomocí tzv. „tkáňové specifických'* promotorů nebo so komplexních chimérických systémů, kterc vyžadovaly použití několika konstruktů a/nebo regulačních faktor. Jako příklad tkáňové specifického promotoru lze zmínit konkrétně promotor gliového fibrilárního kyselého proteinu, který je zejména aktivní v gliových nervových buňkách. Avšak regulační systémy, které jsou v současnosti dostupné, trpí některými nevýhodami, zejména tím. že jejich síla a/nebo selektivita nejsou vždy dostatečné. Takže u valné většiny známých systémů jc dobré selektivity dosaženo na úkor síly promotoru a je tudíž obtížné dosáhnout exprese. která je současně dostatečně silná, stálá a specifická.
Předkládaný vynález poskytuje konstrukty a vektory' obsahující tyto konstrukty, které umožňují odstranit nevýhody dosavadního stavu techniky. Předkládaný vynález popisuje chimérický pro•10 motor, který umožňuje neuronově zacílenou expresi. Vynález využívá negativní regulační elementy, které zabraňují expresi genu v jiných buňkách než nervových buňkách. Konstrukty tohoto typu vykazují řadu výhod ve srovnání se systémy dosavadního stavu. Na jedné straně, jelikož represorové sekvence a všudypřítomné (tj. nespecifické) promotory jsou často krátké a dobře charakterizované, je možné je snadno kombinovat s dalšími regulačními elementy. Na druhé straně, tyto regulační elementy lze teoreticky kombinovat s jakýmkoliv všudypřítomným (ubikvitárním) promotorem a tudíž představují vtipný systém, který dovoluje dosáhnout nervově specifické exprese požadovaného transgenu jednoduchým způsobem, dokonce i tehdy, když použitý vektor nemá žádný nebo má jen malý trop ismus pro nervové buňky. Velký počet studií popisuje eis sekvence, které potlačují transkripci neuronových genů v jiných než nervových buňkách.
Jeden typ sekvence s touto vlastností je element NRSE („neurone restrictivc silencer element“, neuronový element restriktivního umlčení), označovaný také RE-ls (represorový element 1). NRSE je krátká sekvence, přibližné velikosti 21 bp, která byla nalezena v poloze proti směru transkripce („upstreatn“) několika neuronových genů: např. genu SCGI0 [I], genu pro sodíkový kanál 11 [2J a synapsin 1 [3J. Kromě toho analogické sekvence byly nalezeny proti směru tran?5 skřipce velkého počtu neuronových genů, i když jejich funkce nebyla dosud vždy prokázána [4].
- 1 CZ 299915 Bó
Tylo sekvence NRSE reprimují (potlačují) expresi genů v jiných než nervových buňkách tím, že váží specifické transkripcní faktory, tj. protein NRSF („neurone restrictive silencer factor, neuronový restriktivní umlčovací faktor), nazývaný také REST (RE-1, „silencing transeríption factor. RE-1 faktor umlčení transkripce), který je přítomen výlučně v jiných buňkách než nervo5 vých [5]. Tento protein patří k rodině transkripčních faktorů se „zinkovými prsty. V průběhu vývoje zasahuje, aby inhiboval represi neuronových genů v ostatních buňkách kromě nervových, a i v dospělosti se podílí na udržovaní teto represe. Výzkumné skupiny, které charakterizovaly přítomnost sekvencí NRSE proti směru transkripce neuronových genů také ověřily schopnost těchto sekvencí snižovat expresi reportcrovcho genu po transfekci jiných buněk než nervových, io Aby se toto ověřilo, kombinovala se sekvence NRSE s minimálním heterologním promotorem, což je promotor, který dovoluje pouze bazální transkripci. Tak např. když byla sekvence NRSE kalciového kanálu II umístěna proti směru transkripce promotoru thymidinkinázy. exprese reportcrovcho genu se snížila na polovinu v buňkách jiných než nervových [9j. A podobně také dvě kopie sekvence NRSE synapsinu I kombinované s minimálním promotorem e fos snížily expresi is v buňkách jiných než nervových o 75 % [3], Kromě toho přítomnost sekvence NRSE také umožnila to, že aktivita promotoru SV 40 byla regulována v buňkách jiných než nervových [10].
Avšak sekvence NRSE nebyly nikdy užity k řízení exprese silného všudypřítomného (nespecifického) promotoru, ani nebyly využity z hlediska genové terapie. Takže dosud nebylo ukázáno, zda tyto sekvence jsou schopny potlačit expresi, která je indukována silným promotorem. Podobně také nebylo dosud nikdy ukázáno, jestli jsou tyto sekvence aktivní in vivo, když jsou umístěny do chimérického prostředí. Obecně řečeno, dosud nebylo prokázáno, zda tyto sekvence jsou aktivní in vivo, když se zkombinují s heterologním promotorem.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká rekombinantních nukleových kyselin, které dovolují nervově specifickou expresi genů. Vynález sc také týká vektorů, které obsahují takové nukleové kyseliny, zejména virového původu, a také buněk, které obsahují tyto nukleové kyseliny a/nebo vektory. Vynález se také týká specifických chimérických promotorů, které jsou schopny exprimovat geny specificky v nervovém systému in vivo. Vynález se dále týká farmaceutických kompozic, kterc obsahují tyto elementy a jejich použití pro přenos genů.
Prvním aspektem předkládaného vynálezu je rekombinantní nukleová kyselina, která obsahuje:
- ubikvitární promotor
- jednu nebo několik sekvencí NRSE, a terapeutický gen.
Konstrukty podle vynálezu tudíž obsahují úsek pro represi, v jiných buňkách než neuronech, aktivní exprese terapeutického genu, který je indukován promotorem. Tento represorový úsek se skládá z.jednoho nebo několika motivů NRSE.
Motiv NRSE, který se užívá podle předkládaného vynálezu, výhodně obsahuje následující sekvenci velikosti 21 bp nebo alespoň její část:
TTCAGCACCACGGAGAG7GCC (sekvence id. č. 1)
Tato sekvence odpovídá sekvenci NRSE genu SCCilO [2]. Nicméně je jasné, že motiv NRSE použitý podle předkládaného vynálezu může obsahovat i nějaké variace ve srovnání s touto sek50 věnci, pokud si uchovává výše uvedené represorové vlastnosti. Sekvence typu NRSE vykazující určitý stupeň variability byly nalezeny v různých genech, jak bylo popsáno v publikovaném článku Schoenherr el al. [4], který je plně zahrnut formou odkazu. Na základě pozorovaných variant
- 2 CZ 299915 B6 byla identifikována kanonická sekvence NRSE, která odpovídá sekvenci, se kterou se lze nejčastěji setkat. Jde o následující sekvenci:
TTCAGCACCACGGACAGCGCC ísekvence íd. č. 2).
Výhodné varianty sekvence podle předkládaného vynálezu obsahují substituce týkající se 1 až 5 5 párů bází v sekvenci id. č. 2. Výhodněji jsou to varianty týkající se 1 až 3 párů bází. Nej výhodněji se varianty tykají zbytků I, 2, IU. 11, 15, 18, 19 a/nebo 20 výše uvedene sekvence. Substituce mohou odpovídat deleeí nebo nahrazení báze jakoukoliv jinou bází. Takže motiv NRSE je představován obecně celou následující sekvencí nebo její částí:
NNCAGCACCKNGGTíiNAGNNNC (sekvence id. č. 3), κι kde N znamená bázi vybranou ze A. T, C a G. Specifické příklady motivů NRSE, které lze užit podle předkládaného vynálezu, jsou následující:
| TTCAGCACCACGGACAGCGCC | (sekvence | id. | - | 2) |
| TTCAGCACCACGGAGAGTGCC | (sekvence | id. | č. | O |
| TTCAGCACCGCGGACAGTGCC | (sekvence | id. | c. | 5) |
| TTCAGCACCTCGGACAGCATC | (sekvence | id. | č. | |
| TTCAGCACCGCGGAGAGCGTC | (sekvence | id. | * | 7) |
| TCCAGCACCGTGGACAGAGCC | (sekvence | id. | č. | S) |
| TTCAGCACCGAGGACGGCGGA | (sekvence | id. | č. | 9) |
| ATCAGCACCACGGACAGCGGC | (sekvence | id. | č. | i0) |
| TTCAGCACCTAGGACAGAGGC | (sekvence | id. | č. | il) |
Kromě toho tyto motivy mohou obsahovat, na jednom z konců nebo na obou koncích, další báze. které ne interferují $ výše popsanou represorovou aktivitou. Konkrétně tyto další báze mohou obsahovat restrikční místa, neutrální sekvence nebo sekvence pocházející z klonovaeíeh kroků a obsahující např. úseky plazmidu nebo vektoru, nebo sekvence, kterc obklopují motiv NRSE v původním genu.
Tyto různé motivy lze připravit jakýmkoliv způsobem pro přípravu nukleových kyselin odborníku koví známým. Takže je lze např. připravit postupem automatizované syntézy užitím komerčně dostupného automatického syntetizátoru nukleových kyselin. Také je lze získat sereeningem
DNA knihoven, např. hybrid izac í se specifickými sondami nebo vazbou na specifické NRSE faktory. Kromě toho jakákoliv varianta sekvence id. č. 1 může být identifikována v DNA knihovně metodou vyhledávání homologic.
Jakmile je motiv NRSE syntetizován, může být funkčně testován. První test zejména obsahuje stanovení schopnosti daného motivu vázat NRSE faktor. To lze provádět různými způsoby, např. experimenty s retardací migrace v gelu, jak to bylo popsáno v publikacích Moři et al, [2] nebo Sehoenherr et al. [5], které jsou zahrnuty formou odkazu. Pak sc stanoví schopnost motivu repri50 movat expresi, a to tak, že se tento motiv vloží do plazmidu, který obsahuje reportérový gen (chloramfenikolacetyltransferáza, luciferáza, lacZ, atd.) řízený promotorem, a porovnají se hladiny exprese reportérového genu v nervových buňkách a jiných než nervových buňkách. Tento postup je např. popsán v publikaci Sehoenherr et al. [4, 5] a také v příkladech. Výhodně je motiv považován za funkční pokud poskytuje expresi reportérového genu v nervových buňkách ajiných než nervových buňkách lišící se alespoň o 40 %. Výhodněji je rozdíl v expresi alespoň 50%, nejvýhodněji alespoň 60 %.
Jak již bylo uvedeno výše, nukleová kyselina podle vynálezu obsahuje jeden nebo několik motivů NRSE, které byly definovány výše. Pokud je přítomno několik motivů, tentýž stejný motiv se
-3CZ 299915 B6 může opakovat několikrát nebo je přítomno několik variant. Výhodně konstrukty podle vynálezu obsahují jeden motiv, který se opakuje několikrát. Konstrukty mohou obsahovat až 50 motivů.
Výhodně je jeden motiv opakován 2 až 20 x. výhodně 3 až 15 x. Jak je ilustrováno v příkladech, výhodné výsledky byly získány, když byl motiv opakován 3, 6 nebo 12 x, a zvláště významné s výsledky byly získány, když byl motiv opakován 6 a 12x.
Motivy NRSE se vkládají do konstruktů v jakémkoliv neiranskribovaném nebo neiransiaiovanéni úseku nebo v intronu. Výhodně se vkládají do nekódujících úseků 5'- konce a ještě výhodněji do proximálního úseku promotoru. Navíc, jelikož je aktivita těchto motivů nezávislá na jejich orienio taei, je možné je vložit v orientaci souhlasné se směrem transkripce nebo v opačné. A nakonec, když se použije několik motivů, jsou výhodné uspořádány do tandemu, v jednom a témže úseku konstruktu. Avšak je jasné, že mohou být také vloženy do různých úseků.
Druhý element, který je součástí molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, je promotor, který umožňuje, aby byl transgen exprimován v požadované buňce. Výhodným promotorem je promotor, který je aktivní v nervových buňkách nebo tkáních, a zvláště eukaryotický promotor. Promotor může být např. ubikvitární, tj. všudypřítomný, nespecifický promotor. tj. promotor, který je funkční vc většině typů buněk. Výhodnější jc eukaryotický ubikvitární promotor.
Promotor je buďto autologní, tj. promotor, který pochází ze stejného biologického druhu jako buňka, v níž má dojít k expresi, nebo je to promotor xenogenní. který pochází z jiného druhu. K výhodným příkladům všudypřítomného eukaryotického promotoru patří silné promotory' jako je promotor genu fosfoglycerátkinázy 1 (PGK). Tzv. silným promotorem je míněn jakýkoliv pro25 motor, jehož aktivita je srovnatelná s aktivitou virového promotoru. V eukaryotiekýeh organismech je PGK enzym účastnící se glykolýzy. U myši promotor tohoto genu velikosti přibližně 500 bp obsahuje tzv. zesilovací úsek (..enhancer”) (^440/-120) a promotorovy' úsek (-120/+80), který obsahuje několik iniciačních míst transkripce [6]. Účinnost promotoru PGK byla ověřena v předchozích experimentech jak in vitro tak in vivo [7, říj.
V jednom výhodném provedení se vynález týká nukleové kyseliny, která obsahuje promotor PGK a jednu nebo několik sekvencí NRSE. Jak je ilustrováno v příkladech, tento typ konstruktu umožňuje nasměrovat nervově specifickou expresi transgenu. Vynález se dále týká chimérického promotoru, který' obsahuje silný ubikvitární promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE.
Vynález ukazuje, že tyto sekvence NRSE lze užít účinně k represi aktivity silného promotoru, a to í v podmínkách in vivo. To tudíž umožňuje využít tyto nové promotory v celé řade aplikací. Specifický chimérický promotor podle předkládaného vynálezu je představován promotorem xNRSE-PGK, kde x je celé číslo od 1 do 50, výhodně od I do 20.
Příkladem dalších ubik vítám ích eukaryotických promotorů, které lze užít v předkládaném vynálezu, jsou promotory, které řídí expresi genů obligatorního buněčného metabolismu (to jsou geny základního metabolismu zvané „domestic“ nebo „housekeeping“ geny, které kódují proteiny nezbytné pro funkce společné všem buňkám, jako je např. dýchání). Příklady těchto genů jsou geny enzymů zúčastněných v Krebsově cyklu, v buněčném dýchání nebo transkripci a replikaci jiných genu. Specifickým příkladem promotoru, který lze zmínit, je promotor genu α 1-antitrypsinu, p~aktinu. vimentinu, aldolázy A nebo Eflot (elongační faktor).
Promotor, který lze užít podle předkládaného vynálezu může být také eukaryotický promotor neurospecifického typu, což ještě zlepší spccifitu pro nervové buňky. Přikladeni takového promosu toru, který' lze zmínit, je promotor genu NSE (enoláza specifická pro neurony), NE (neuroifilamenta), TU (tyrosin hydroxyláza), DAT (přenašeč dopaminu). CHAT (eholinaeetyllransferáza),
DBH (dopamin-p-hydroxyláza), TPH (tryptofanhvdroxyláza) a GAD (dehydrogenáza kyseliny glutamové), obecněji řečeno všechny promotory genů pro enzymy syntézy nebo transportu nervových přenašečů (neurotransmiterů, neuromediátorů) nebo promotory genů, jejichž exprese je specifická pro dané typy nebo subtypy nervových nebo gliovýeh buněk.
-4CZ 299915 B6
Nakonec vynalez také zahrnuje užití virových promotorů, např. CMV (cytomegalo virus). RSV (virus Rousova sarkomu). TK (thymidinkináza), SV40 (opičí virus) a LTR (dlouhá koncová repetice).
Kromě toho obsahuje nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu terapeutický gen. Terapeutický gen znamená ve smyslu předkládaného vynálezu jakoukoliv nukleovou kyselinu, která obsahuje alespoň jeden otevřený čtecí rámec, který kóduje RNA terapeutického nebo vakcinačního polypeptidu. Nukleová kyselina jc komplementární, genomová, syntetická nebo semisynteio tická DNA. Může být různého původu, ze savců, rostlin, virů nebo může jít o umělou sekvenci.
Tran skřípění nebo trans lační produkt vykazuje terapeutické nebo vakcinační vlastnosti. Specifickým příkladem jsou enzymy, růstové faktory (zejména trofické faktory), neurotransmitery nebo jejich prekurzory, toxické faktory (thymidinkináza apod.), protilátky nebo fragmenty protilátek atd.
Vynález se také týká užití konstruktů podle vynálezu k nasměrování exprese jednoho několika genů kódujících RNA nebo protein, který je třeba exprimovat v neuronu, aniž by došlo k jeho expresi v jiných buňkách, k vytvoření zvířecích modelů nebo pro účely substituční nebo supresivní, etioiogieké nebo symptomatické léčby. Mohou to být geny např. z rodiny trofiekýeh fakto20 rů jako neurotrofiny (NGF, BDNF, NT3, NT4-5, GMF atd.), rodiny růstových faktorů (jako fibroblastový růstový faktor, FGFa a FGFb). rodiny vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF). epidermálního růstového faktoru (EGF) a superrodiny TGFp, včetně rodin GDNF/neurturin a TGFp.
Mohou to být také geny, které kódují cytokiny, např. CN 1 F. LIF, onkostatin M nebo kardiotrofin 1, nebo proteiny rodiny interleukinů.
Mohou to být také geny, které kódují receptory těchto mnoha různých faktorů nebo které kódují transkripění faktory, které regulují expresi různých faktoru. Také to mohou být geny, které kódují
5o enzymy syntézy nebo degradace různých neurotransmiterů a neuropeptidů nebo jejich prekurzoru. nebo kofaktory, které jsou nezbytné pro jejich syntézu nebo katabolismus, nebo jiné transkripční faktory, které regulují expresi těchto proteinů, také může jít o geny kódující receptory íieurotransmiterů/neuropcptidů (nebo jejich podjednotky) a nebo proteiny, které se účastní v dráze signální transdukee.
Dalšími zajímavými geny / hlediska předkládaného vynálezu jsou zejména geny kódující antioxidanty. např. SOD (superoxídismutáza). GPX (glutathionperoxidáza), katalázu nebo enzymy buněčného dýchání, enzymy zúčastněné v buněčném cyklu jako je např. p21, nebo jiné proteinové inhibitory dependentníeh kináz, a také geny související s apoptózou jako jsou ICE, Bel2, ίο BAX, atd.
Obecně řečeno, jakýkoliv gen. jeho anomální exprese způsobuje poruchu nervového systému, může být exprimován v konstruktu podle předkládaného vynálezu, jako např. geny, jejichž mutace je přímou příčinou nemoci nebo geny, jejichž produkty se podílejí na stejné metabolické dráze.
Geny mohou také být toxické geny pro protinádorovou terapii (např. thymidinkináza nebo eytosindeamináza), geny pro antisense RNA nebo ribozymy, a nebo reportérové geny pro vývojové studie nebo pro výzkum kinetiky a biologické dostupnosti, jako je gen β--galakatosidázy, luciferázy nebo zeleného fluorescenčního proteinu GFP („green fluorescent protein“). Také to mohou být geny, které jsou součástí systému podmíněné rekombinace v nervovém systému pro vytvořeno ní zvířecího modelu, jako jsou např. transgenní zvířata, včetně systému podmíněného vyřazení genu („knockoul“).
Je zřejmé, že odborník je schopen uzpůsobit požadovaný gen očekávanému použití.
-5CZ 299915 B6
V nukleové kyselině podle předkládaného vynálezu jsou jednotlivé elementy uspořádány tak. že promotor řídí expresi terapeutického genu a sekvence NRSE (jedna nebo několik) řídi aktivitu promotoru. Obecně je tedy gen umístěn po směru transkripce („downstream“) od promotoru a ve shodné fázi s promotorem. Dále regulační úsek je obecně umístěn proti směru transkripce ? („upstream) od promotoru, ačkoliv to není pro aktivitu nezbytné, jak bylo již zmíněno výše. Vzdálenost mezi regulačním úsekem (sekvence NRSE) a promotorem je proměnlivá v závislosti na povaze použité sekvence a počtu opakování motivu NRSE. Výhodné jsou regulační sekvence umístěny ve vzdálenosti menší než 2 kb od promotoru, výhodněji ve vzdálenosti menší než 1 kb od promotoru.
KI
V jednom výhodném provedení vynálezu jsou sekvence NRSE kombinovány s regulačním systémem. aby byla jemně řízena exprese nukleové kyseliny v buňce. Lze uvést zv láště regulační systém užívající na jedná straně tetracyklinem kontrolovaný transaktivátor tTA a na druhé straně promotor senzitivní k tTA. které byly popsány např. v patentové přihlášce FR 98/140080, která je formou odkazu součástí předkládaného přihlášky. Stručně shrnuto, nukleová kyselina se skládá z prvního úseku, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující systém tetracykl i nem-regulo váného transaktivátoru (tTA) řízený promotorem, který je senzitivní ktTA. Tento senzitivní promotor může být jakýkoliv promotor, dokonce i silný promotor, jehož aktivita se zvyšuje v přítomnosti transaktivátoru. Ze strukturního hlediska tento promotor obsahuje ve své sekvenci nebo ve funkč20 ní vzdálenosti od své sekvence alespoň jedno místo pro navázání faktoru tTA (operátorový úsek. Op). Výhodně jsou tyto dva úseky odděleny. Při realizaci vynálezu je možné sekvence NRSE umístit proti směru transkripce od tTA-senzitivního promotoru, ačkoliv to není podmínkou jejich aktivity, včetně polohy mezi dvěma výše popsanými úseky, loto výhodné provedení předkládaného vynálezu umožňuje dosáhnout současně nejen regulace exprese nukleové kyseliny tetra2? eyklinem, ale také tkáňové specifičnosti exprese, zejména pro nervové buňky, což umožňuje sekvence NRSE. Kromě toho tato jemná regulace promotor zajišťuje pozoruhodnou účinnost a spolehlivost exprese transgcnu, jak je to potřebné pro genovou terapii.
Předkládaný vynález sc také týká vektorů, které obsahují nukleové kyseliny definované v před30 cliozím popisu. Jelikož tyto vektor jsou výhodně schopny transdukovat savčí buňky, a konkrétné lidské nervové buňky, není nutné, aby měly zvláštní trop ismus pro uvedené buňky, takže vynález výhodně umožňuje použít jakýkoliv typ vektoru. Může to být plazmidový vektor (plazmid, episom, umělý chromosom atd.) neb virový vektor. Z virových vektorů jsou výhodné např. vektory odvozené z adenovirň, AAV a herpetíekýeh virů, jejichž tropismus pro nervovou tkáň a nervové
3? buňky byl již důkladné dokumentován ve stavu techniky. Lze zmínit i jiné viry, jako jsou např. retro viry nebo rhabdoviry. Příklady uvedené v této přihlášce ukazují, že aktivita sekvencí NRSE, které byly vloženy do virových vektorů, je významná. Takže zcela neočekávaně bylo zjištěno, že když byly sekvence NRSE. a sice 6 a 12 sekvencí, vloženy do virového vektoru (adenovirus), snížily expresi transgenu v buňkách jiných než nervových o 91 a 98 % in vitro a o 90 a 96 % in
4d r/vo. Tyto výsledky demonstrují, že je možné podle tohoto jednoduchého systému díky regulačním sekvencím exprimovat požadované nukleové kyseliny specificky v nervových buňkách, aniž by došlo k expresí v ostatních buňkách. Kromě toho sekvence NRSE vykazují značné výhody, neboť vzhledem ke své malé velikosti jsou zvláště vhodné pro regulaci exprese genů. které jsou vloženy do vektoru, kde je omezený prostor pro vložení regulačních sekvencí. Navíc jc možné kombinovat tyto sekvence sjinými regulačními systémy v jednom a témže vektoru.
Předkládaný vynález se zvláště týká také rekombinantního defektního viru, který obsahuje požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresních sekvencí, přičemž tyto expresní sekvence obsahují promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE.
51)
Obecně rekombinantní virus podle předkládaného vynálezu je defektní, tzn. není schopen autonomní replikace v buňce. Produkce defektu ich rekombinantních virů je odborníkům známa, pro ilustraci lze uvést např. publikace Graham, E. a Prevec. L, (ln: Methods in Molecular Biology (1991) Murray E. J. (ed.). The Human Press lne.. Clifton. NJ, kapitola 11. str. 109-128). Každý
-6CZ 299915 B6 z těchto vírů může byt připraven v enkapsidační buněčné linii, která obsahuje funkci deficitní ve viru. Takové buněčné linie byly popsány v odborné literatuře (např. linie 293 a její deriváty).
V jednom provedení vynálezu je defektní rekombinantní virus adenovirus. Byly charakterizovány různé sérotypy tohoto viru, jejichž struktura a vlastnosti jsou poněkud rozdílné. Podle předkládaného vynálezu je výhodné užití sérotypů 2 nebo 5 lidského adenoviru (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirů zvířecího původu (viz přihláška w 094/269 i 4). Ádenoviry zvířecího původu, které mohou být užity podle předkládaného vynálezu jsou např. psí, hovězí nebo myší ádenoviry (např. Mávl, Beard et al.. Virology 75 (1990) 1981), nebo ádenoviry ovcí. prasat, ptáků nebo opis κι (např. SAV). Výhodné ádenoviry zvířecího původu jsou psí ádenoviry, výhodněji ádenoviry CAV2 (např, kmen Manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)), Podle předkládaného vynálezu jc výhodné užití adenovirů lidského nebo psího původu nebo sníženého původu.
Výhodně adenovirus podle předkládaného vynálezu obsahuje sekvence ITR, enkapsidační sekvenci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. Ještě výhodněji je alespoň úsek El nefunkční v genomu adenovirů podle předkládaného vynálezu. Tento gen je možné učinil nefunkčním kterýmkoli v v oboru známým způsobem, zejména úplnou delecí, nahrazením, částečnou delecí a adicí jedné nebo několika bází. Takové modifikace lze provést in vitro (s izolovanou DNA) nebo in šitu, např. S využitím metod genového inženýrství a nebo pomocí působení mutagenit
Mohou být modifikovány i jiné úseky, zejména E3 {(WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152. WO94/12649, WO95/Ó2697) a E5 (WO95/02697). Vc výhodném provedení vynálezu obsahuje adenovirus podle vynálezu delecí v úseku El a E4. V jiném výhodném provedení obsahuje delecí v úseku El, do které je vložen úsek E4 a požadovaná nukleová kyselina podle vynálezu (viz FR94 13355). Rekombinantní adenovirus může být také adenovirus. který je defektní např. v úseku El a/nebo E2 a/nebo E4. Ve viru podle předkládaného vynálezu je delece v úseku El výhodně v úseku nukleotidu 455 až nukleotidu 3329 v případě sekvence adenovirů Ad5.
Defektní rekombinantní ádenoviry podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmsi) koliv způsobem odborníkům známým (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Mohou být připraveny zejména např. například homologní rekombinací mezi defektnírn virem a plazmidem nesoucím, kromě jiného, sekvenci nukleové kyseliny podle vynálezu nebo požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresní sekvence obsahující promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE. K homologní rekombinací dojde v důsledku kotransfekce uvedeného adenoviru a plazmidu do vhodné buněčné linie. Vhodná buněčná linie, která se může použít, výhodně musí I) být transfomiovatclná uvedenými prvky a 11) obsahovat sekvence, které jsou schopny komplementovat část genomu replikačně deťcktního adenoviru, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo riziku rekombinace. Příkladem buněčné linie, která se může užít, je linie lidských buněk 293 z embryonální ledviny (Graham et al,, •io J. Gen. Virol. 36. 1977, 59), která obsahuje levou část genomu adenoviru Ad5 (12%) integrovanou do svého genomu, nebo buněčná linie schopná komplementovat funkce El a E4, která je popsána např. v patentových přihláškách WO94/26914 a WO95/02697, nebo v publikaci Yeh et al., J. Virol. 70(1996)559.
Viry se poté namnoží, izolují a purifikují běžnými metodami molekulární biologie, které jsou odborníkovi známy.
V jiném výhodném provedení předkládaného vynálezu defektní rekombinantní virus je AAV. Adenoasociované viry (AAV) jsou DNA viry relativně malé velikosti, které se trvale
5o a místně-specificky integrují do genomu bunčk, kleré infikují. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by měly jakýkoliv vliv na růst, morfologii nebo diferenciaci bunčk. Kromě toho se nepodílejí na žádné lidské nemoci. Genom AAV byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje přibližně 4700 bází a na každém konci obsahuje úsek invertované koncové repetice (I I R) velikosti 143 bází, který' slouží jako počátek replikace víru. Zbytek genomu je rozdělen do dvou esenciálních částí, kterc nesou enkapsidační funkce: levá část genomu, obsah u-7CZ 299915 B6 jící gen rep, který se účastní virové replikace a exprese virových genů, a pravá část genomu, která obsahuje gen cap. který kóduje proteiny virové kapsidy.
Použití vektorů odvozených z AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v patentové s literatuře (viz zejména WO 91/18088; WO 93/092939; US 4 797 368, US 5 139 941.
EP488 528), Tyto dokumenty' popisují různé konstrukty odvozené z AAV, ve kterých byly geny řep a/nebo cap deietovány a nahrazeny požadovanými geny, ajejich použití pro přenos požadovaných genů in vitro (do buněk v kulturách) nebo in vivo (přímo do organismu). Defektní rekombinantní AAV podle vynálezu jsou defektní v celém nebo části úseku Rep a/nebo Cap. Lze ío je připravit kotransfekcí plazmidů obsahujících sekvence nukleové kyseliny, nebo kombinaci sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu obklopené úseky invertovaných koncových repetic (ITR) a AAV a plazmídu nesoucího enkapsidační geny AAV (cap a rep) do buněk, které jsou infikovány pomocným lidským virem (helper virus), např. adenovirem. Příkladem buněčné linie, kterou lze použít, je buněčná linie 293. Jiné produkční systémy jsou popsány např. v patentových i? přihláškách WO95/14771. WO95/13365, WO95/13392 a WO95/06743. Rekombinantní AAV takto připravené se pak standardním způsobem puriflkují.
V dalším výhodném provedení vynálezu je defektní rekombinantní virus retrovirus, rhabdovirus nebo US V. Konstrukce rekombinantních vektorů založených na retro virech a herpetických virech byla popsána v odborné literatuře, zejména v Breakfíeld et al„ New Bíologist 3 (1991) 203;
EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Gcnet. Eng. 7 (1985) 235: McCormiek. BioTechnology 3 (1985) 689. Retroviry jsou integrující se viry, které selektivně infikují dělící se buňky. Představují proto zajímavé vektory pro nádorové aplikace. Genom retrovirů nutně obsahuje dva úseky LTR. enkapsidační sekvence a tři kódující úseky, gag, pol a env. V rekombinantních vektorech odvozených z retrovirů jsou geny gag, pol a env buďto z části, nebo zcela deietovány a nahrazeny požadovanou sekvencí heterologní nukleové kyseliny. Tyto vektory lze připravil z retrovirů různých typů, jako je např. zejména MoMuLV („Moloney murine leukaemia virus, Moloncyho myší leukemieký virus, také označovaný MoMLV), MSV („Moloney murine sarcoma virus, Moloneyho myší sarkomový virus). HaSV („Harvey sarcotna virus“, virus
3o Harveyho sarkomu). SNV („spleen neerosis virus, virus nekrózy sleziny), RSV (Rous sarcoma virus, virus Rousova sarkomu) nebo Fricndův virus.
Pro konstrukci rekombinantních retrovirů podle předkládaného vynálezu, které obsahují nukleo* vou kyselinu podle vynálezu nebo požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresní i5 sekvence obsahující promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE, připraví se plazmid obsahující zejména oba úseky LTR, enkapsidační sekvence a požadovanou nukleovou kyselinu, a pak se transťekuje do tzv. enkapsidační buněčné linie, která je schopná v trans doplnit retrovirové funkce. které chybí v plazmídu. Jakové enkapsidační linie byly popsány v dosavadním stavu techniky, zejména např. linie ΡΛ317 (viz US 4 861 719), linie PsiCRlP (viz W090/02806), a linie
GP+envAM-12 (viz W089/07I50). Obecně tyto enkapsidační linie jsou schopny exprimovat geny gag, pol a env. Kromě toho rekombinantní relrovny mohou obsahovat změny v úsecích ETR, kterc vedou k supresi transkripění aktivity a nebo rozšířené enkapsidační sekvence, které obsahují část genu gag (Bender et al., J. Virol 61 (1987) 1639). Takto připravené rekombinantní retroviry se pak purifikují standardními postupy.
Předkládaný vynález demonstruje možnost použít sekvence NRSE pro regulaci genové exprese in vivo. Výsledky pokusů uvedených v příkladech této přihlášky ukázaly, že tyto sekvence jsou in vivo vždy aktivní a umožňují expresi transgenu v nervových buňkách aniž by byla ex pr i mo vány v buňkách jiného typu.
Předkládaný vynález dále ukazuje, že sekvence NRSE jsou také schopny, v závislosti na jejich uspořádání (a počtu kopií) účinně regulovat aktivitu silného promotoru, eož skýtá četné možnosti výhodného použití. Získané výsledky překvapivě ukázaly, že aktivita sekvencí NRSE jc zesílena, když jsou tyto sekvence vloženy do vektoru virového původu. Konstrukt takového typu tedy kombinuje zvláště výhodné vlastnosti jako je účinnost přenosu a selektivita exprese.
-8CZ 299915 B6
Předkládaný vynález sc také týká jakýchkoliv buněk, které obsahují nukleovou kyselinu podle vynálezu, nebo vektor či virus, které byly definovány výše. Výhodně se jedná o lidské nervové buňky. Může to být buňka, která pochází z trvalé buněčné linie nebo buňka pocházející z primár5 ní kultury'. Buňky se mohou užít např. k produkci polypeptidů nebo k testování aktivity genu.
Také je lze využít v buněčné terapií, kdy sc buňky implantují nebo i nj i kují subjektu.
Předkládaný vynález se také týká farmaceutických kompozic nebo farmaceutických přípravků, které obsahují nukleovou kyselinu nebo vektor nebo virus nebo buňku podle předkládaného io vynálezu a excipient. Pro použití podle předkládaného vynálezu jsou výhodně nukleové kyseliny, vektory nebo buňky kombinovány sjedním nebo několika farmaceuticky přijatelnými excipientv. aby mohly být podávány způsobem topickým, zejména stereotaktickým perorálním, parenterálním. intranazálním. intravenózním, intramuskulámím, subkutánním, intraokulárním. transdermálním atd. Nukleové kyseliny, vektory nebo buňky podle vynálezu jsou výhodně užívány v injiko15 vatelné formě. Tato injikovatelná forma je výhodně zejména sterilní ísotonícký solný roztok (dihydrogen- nebo hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, horečnatý, draselný nebo vápenatý, nebo směsi těchto solí), nebojsou to suché, výhodně lyofilízované přípravky, které umožňují po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku rekonstituovat i nj i kováte lny roztok.
Ve výhodném provedení se přípravek podle předkládaného vynálezu podává Íntramuskulárně, výhodně inlramuskulární injekcí. Důvodem je. že intramuskulární injekce zcela překvapivě umožňuje dosáhnout podstatného terapeutického účinku díky zpětnému transportu produktu terapeutického genu tvořeného ve svalech. Takže tyto produkty, které odpovídají nukleovým kyselinám podle vynálezu nebojsou odvozeny z vektorů podle vynálezu, jsou absorbovány na úrovni nervos valové ploténky (motorického zakončení) a zpětným přenosem prostřednictvím axonu se dostávají do buněčného těla motorických neuronů. Tento způsob podávání má navíc výhodu, že zabraňuje nežádoucím důsledkům ektopické exprese terapeutických genů při léčení neurologických nemocí. Pokud se užije tato metoda, je možné okamžitě infikovat specificky nervové buňky, aniž by došlo k expresi v inj i kovaném svalu nebo exkreci produktů do krevního oběhu. Takže tato metoda nepochybně překonává všechny nedostatky dosavadních terapií způsobované zejména nedostatečným přístupem neurotofickýeh faktorů k motorickým neuronům, velmi krátkým poločasem těchto proteinů a škodlivými vedlejšími účinky, ke kterým docházelo při systémovém podávání těchto produktů. Navíc vzhledem ke snadnému přístupu k místu, které má být in j i kováno. lze tuto metodu výhodně užít pro jakoukoliv nemoc neuronů nebo motorických neuronů.
Množství jednotlivých elementů lze nastavil kompetentním odborníkem ve shodě s předpokládanou aplikací a zejména s místem podávání, počtem injekcí, genem, kteý má být exprimován a očekávanou dobou léčení.
Předkládaný vynález se také týká použití, pro přípravu přípravku pro přenos požadované nukleové kyseliny a její expresi v tkáni nebo nervové buňce, konstruktu, který obsahuje:
ubikvitární promotor jednu nebo několik sekvencí NRSE, a
- nukleovou kyselinu uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny jc řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE.
sn Použití nukleové kyseliny podle vynálezu k přenosu genů in vitro a in vivo, např. při genové terapii, umožňuje omezit eklopiekou expresi požadovaných transgenů a zaměřil terapeutický účinek specificky na populaci nervových buněk. Zabrání sc tím škodlivým, ke kterým by mohlo dojít v důsledku difúze transgenů do organismu. Tento systém může být užit při léčení mnohých poškození, degenerativních nebo traumatických, míchy nebo jiných nemocí centrálních nebo
-9CZ 299915 B6 periferních nervů nebo ncuropsyehiatrické nervové nemoci, při kterých je specificky ovlivněna populace neuronů. V základní neurologii lze tento systém využít k objasnění původu (gliového nebo neuronového) příznaků pozorovaných in vivo nebo in vitro.
Předkládaný vynález se dále také týká použití, pro přípravu přípravku pro léčení nemocí motorických neuronů intramuskulárním podáváním požadované nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo nervových buněk, kierý obsahuje konstrukt, který obsahuje:
ubikvitární promotor io - jednu nebo několik sekvencí NRSE. a nukleovou kyselinu uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE.
Předkládaný vynález se dále týká použití výše definovaných vektorů, které obsahují požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresních sekvencí, kdy tyto sekvence obsahují promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE.
Použití virových vektorů je založeno na přirozené transfekční schopnosti virů (tj. schopnosti infikovat buňku). Bylo prokázáno, že tyto vektory jsou zvláště účinné při transfckci. Vektory podle vynálezu se tedy použijí k přenosu požadovaných genů a jejich expresi v nervových buňkách, in vivo, in vitro nebo ex vivo. a to zejména pro účely genové terapie. K expresi požadované nukleové kyseliny, která je zejména pod kontrolou jedné nebo několika sekvencí NRSE, dochází specificky v nervových buňkách, přičemž ektopická exprese je omezena. Tyto vektory'jsou proto vhodné k léčení a/nebo prevenci různých nemocí centrálního nebo periferního nerv štva nebo neuropsychiatrických nervových nemocí, které ovlivňují nervové buňky, zejména neurodegenerativních onemocnění a různých nemocí míchy. Jako příklady takových nemocí lze uvést zejména Alzheimerovou nemoc, Parkinsonovu nemoc, ataxií míchy a Huntíngtonovu nemoc.
Vektory podle vynálezu lze užít zejména k prevenci a/nebo léčení nemocí motorických neuronů jako je např, amyotrofní laterální skleróza, amyotrofie míchy typu I (Werdnig-1 loffmannova nemoc) a typu 11 a lll (Kugclbcrg-Wclanderova nemoc) a amyoirofie míšních uzlin (např. Kennedyho nemoc).
Vektory podle vynálezu jsou zejména vhodné pro léčení a/nebo prevenci těchto nemocí intramuskulárním podáváním. Jak již bylo vysvětleno výše, tento způsob umožňuje dosáhnout motorických neuronů prostřednictvím zpětného transportu.
Přesněji, předkládaný vynález sc týká použití, pro přípravu přípravku pro přenos požadované nukleové kyseliny a její expresi v nervové tkáni nebo nervových buňkách, který obsahuje vektor definovaný výše, který obsahuje konstrukt, kde ubikvitární promotor
4? - jedna nebo několik sekvencí NRSE, a nukleová kyselina jsou uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE.
Dále se předkládaný vynález také týká použití, pro přípravu přípravku k léčení nemocí motorických neuronů intramuskulárním podáváním požadované nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo nervových buněk, který obsahuje vektor definovaný výše, který obsahuje konstrukt, kde
- 10CZ 299915 B6 ubikvitámí promotor
- jedna nebo několik sekvencí NRSE. a nukleová kyselina jsou uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE,
Dále se předkládaný vynález týká způsobu regulace exprese genu in vivo. přičemž tento způsob obsahuje vložení sekvencí NRSE do místa proti směru transkripce („upstrearn“) od požadovaněío ho genu a in vivo podání výsledného konstruktu a/nebo vektoru obsahujícího tento konstrukt.
Předkládaný vynález bude dále podrobněji popsán formou následujících příkladů, které jsou ilustrativní a vynález nijak neomezují. V těchto příkladech se nejdříve popisuje klonování zvětšujícího se počtu sekvencí NRSE do místa „upstrearn“ od promotoru genu PGK v plazmidu obsahují15 eím lucifcrázový reportérový gen a následnou selekci konstruktu, u kterých je exprese luciferázy snížena, když jsou transfekovány jiné buňky než neurony. Pak byly připraveny odpovídající adenovirové konstrukty a testovány in vitro tím. že se infikovaly buněčné linie a primární kultury'. a také in vivo poté, co byly myši intramuskulárnč inj ikovány rekombinantním adenovirem. Uvedené výsledky demonstrují výhody nukleové kyseliny podle vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Schematické znázornění plazmidů, které nesou chimérický promotor podle předkláda25 ného vynálezu.
Obr. 2: Studie funkční kapacity plazmidů, která byla provedena transfekční plazmidů do nervových (PC 12, obr. 2B) a jiných buněk (3T3, obr. 2A) a pak měřením luciferázovc aktivity.
.to Obr. 3: Studie funkční kapacity defektuího rekombinantního viru in vitro, kdy sc měřila lucifcrázová aktivita a po injekcích:
do jiných než nervových buněk (fibroblasty 373 potkana, obr. 2A)
- nervových buněk (fcochromoeylom PC 12 potkana, obr. 3B) primární kultury jiných než nervových buněk, neonatálních ledvinnych buněk potkana (obr. 3B),
- primární kultury' nervových buněk, neonatálních horních krčních nervových ganglií (obr. 3D).
- primární kultury' jiných než nervových buněk, primární kultury aslrocytů pocházejících z embrya potkana (obr. 3E), primární kultury nervových buněk, infekce primární kultury' kortikálníeh neuronů 7 embrya potkana (obr. 3F).
Obr. 4: Studie funkční kapacity defektního rekombinantního viru in vivo, kdy myš byla injiko50 vána intramuskulárně a pak byla měřena lueiferázová aktivita.
Obr. 5: Studie funkční kapacity defektního rekombinantního víru in vivo, kdy myš bvla inj i kována intramuskulárně do svalu jazyka a pak byla měřena lueiferázová aktivita.
-11CZ 299915 B6
Obr. 5A; Měření aktivity luciferázy ve svalu jazyka 8. a 35. den.
Obr. 5B: Měření aktivity luciferázy v buňkách nervového systému (prodloužená mícha) 8 a 35. den.
Příklady provedeni vynalezu
Materiály a metody použité v následujících příkladech io
Buněčné linie a primární kultury
Buňky získané z linie feoehromoeytomu potkana (PC 12) byly kultivovány v médiu RPMI 1640 (Gibeo) obsahujícím 15 % telecího fetálního séra (FCS) (Boehringcr). Buňky získané z linie fíbroblastů 34 3 potkana byly kultivovány v Eaglcho médiu modifikovaném Dulbeceem (DMEM) s přídavkem 10 % telecího fetálního séra. Kultury buněk horních krčních nervových uzlin (SCO) získaných z novorozených potkanů W i stár (lífa-Crcdo) starých 1 až 2 dny, kdy buňky byly disodovány pomocí 3 mg/ml dispázy (Boehringcr) a pak naneseny na destičky, které byly předem potažen} kolagenem získaným z ocasu potkana. Buňky byly kultivovány v 0,5 ml Leibovitzova
2d média [.—15 (Gibeo). které bylo pufrováno bikarbonátem a obsahovalo různé faktory včetně 70 ng/ml NGF (nervový růstový faktor), 5% sérum dospělého potkana a lOgM cytosinarabinofuranosid.
Primární kultury ledvinných buněk byly připraveny tak. že ledvinná tkáň z novorozených potka25 nů Wistar (Iffa-Credo) starých 1 až 2 dny byla disociována trypsinem. Buňky pak byly přeneseny na destičky do 10 % FCS. aby se umožnilo jejich dělení až do okamžiku použití k infekci.
Kultury kortikálních buněk byly získány z embryí potkanů kmene El7 Sprague-Dawley (IffaCredo). Buňky byly získány pitvou a mechanicky disociovány a pak byly kultivovány v médiu
DMEM obsahujícím transfer in 100 gg/ml, inzulín 25 gg/ml, putresein 10 gg/ml. selenit sodný 5 ng/ml, progesteron 6,3 ng/ml a 2mM glutamin (Sigma),
Primární kultury astroeytů byly odvozeny z kortikální tkáně embryí potkanů (El7, SpragueDawley) a kultivovány v médiu DMEM obsahujícím 10 % FCS a v atmosféře 10% CO2/90% vzduch.
Experimenty in vitro
Pro experimenty s přechodnou expresí byl milion buněk transfekován elektroporací pomocí systému firmy Bio-rad, při 960 gF a 190 V v případě buněk PC 12. nebo 250 V v případě buněk 3T3. a sice 6 gg každého z testovaných plazmidu, 7 gg plazmidu Bluescrípt (Stratagene) a 2 gg kontrolního vektoru pCAT (Promega), který' kóduje chloram fen i kol acetyl transferázu (CAT), což umožnilo monitorování transfekce.
Buněčné kultury' byly transfekovány tak, že kultivační médium bylo nahrazeno médiem bez séra, které obsahovalo virovou suspenzi s MOI přibližně 200 pfu (plaky tvořící jednotky) a inkubovaly se 45 minut. Pro každý konstrukt (plazmid nebo adenovirus) byty stanoveny 3 hodnoty luciferázové aktivity ze 3 různých jamek. Pro každý virový konstrukt se infekční experimenty opakovaly dvakrát vždy s užitím jiného zásobního roztoku viru.
hodin po elektroporací nebo infekci byly buňky sklizeny do 200 gl lyzovacího pufru následujícího složení: 25 mM Tri s/fosfát, pH 7.8, 0,0 8mM lucifer i n: 0,1 mM ATP, 8mM MgCL, lmM dithiothreitol, lmM EDI A, 15% glycerol a 1% Triton. Eueiferázová aktivita byla měřena luminometrem LU MAT LB9501 (Berthold). V případě transfekovaných buněk byl k lyzovacímu
5? pufru přidán 1% hovězí sérový albumin (BSA) a aktivita byla standardizována na základě aktivi. i? .
C7. 299915 B6 ty CA T. která byla měřena kapalinovou scintilacní metodou. V případě rekombinantních adenovirů byla luciferázová aktivita standardizována pomocí koncentrace proteinu v buněčném extraktu. která byla stanovena pomocí systému Bio-rad (Βίο-Rad Laboratories).
Experimenty in vivo
Samci myši kmene Č5/BÍ6 (Charles River) ve stáři ó měsíců byly podrobeni anesiezi směsí Rompun (Bayer)/Ketamine (UVA) a konstrukt Ad-NRSE PGK Lue byl pomalu inj i kován (2.5 μΐ/ίτιΐ) do jazyku (109 pfu/4x2.5 pl) a do lýtkového svalu v dávce 2.1(f pfu/sval (30 pl).
Myši byly v období od 7. do 35. dne po infekci utraceny pentobarbitalem (Sanofi). Byly vyjmuty prodloužená mícha, jazyk a látkový sval pro měření aktivity luciferázy. Prodloužená mícha byla disoeiována mechanicky ve 200 pl lyzovaciho pufru. Sval a jazyk byly disociovánv pomocí polytronu DIAX 900 (I leidolph) v 1 a 2 ml lyzovaciho pufru (v uvedeném pořadí).
!5
Příklad 1
Konstrukce chimérických promotoru a plazmidovýeh vektorů
Cílem tohoto příkladu je popsat přípravu chimérických promotorů a konstrukci plazmidovýeh vektorů, které obsahují právě tyto promotory'.
Plazmid pPGK-Luc obsahuje gen Lue pod kontrolou všudypřítomného eukaryotického promotoru PGK. Pro získání plazmidu pPGK-Luc byl fragment velikosti 500 bp myšího promotoru PGK vložen do komerčního plazmidu pUT 103 (CAYLA FRANCE), který obsahuje luciťerázový reportérovy gen fúzovaný se zcocincm a polyadeny lační sekvencí SV40 včasné konfiguraci (PolyA).
V dalším kroku byla vložena jedna nebo dvě. tři, šest a dvanáct kopií sekvence NRSE z genu io SCGI0 (TTCAGCACCACGGAGAGTGCC, sekvence id. č. 1) [2] v antiparalelní konfiguraci do polohy proti směru transkripce (upstream) od promotoru PGK. Pro tento účel byl zkonstruován fragment velikosti 26 bp obsahující sekvenci NRSE obklopenou dvěma místy Mlul, a sice hybridizací dvou odpovídajících oligonukleotidů. Tento fragment byl vložen v jedné nebo několika kopiích do Mlul místa pPGK-Luc, čímž vznikly plazmidy obsahující 1. 2 a 3 kopie NRSE sekvence. Plazmid obsahující 6 sekvencí NRSE, byl získán z plazmidu obsahujícího 3 kopie (pNRSE3-PGK-Tuc) následující strategií: fragment Bamlll/Xhol obsahující 3 kopie NRSE, byl vyjmut zpNRSE3 PGK Lue a vložen do místa Xbol v pNRSE3-PGK-Luc, čímž vznikl póNRSlS-PGK-Luc. Podobně byl plazmid obsahující 12 kopií NRSE připraven z plazmidu obsahujícího 6 kopií (p6NRSE-PGK-Luc) tak, že do p6NRSE-PGK-Luc byly vloženy dvě kopie fragmentu BamHl/XhoE
Nakonec expresní kazeta „PGK(s nebo NRSE)-Luc-PolyA“ z různých plazmidů popsaných výše byla vložena do ITR levé části adenovirů (invertovaná terminální repetice, replikační počátek) a sekvenci kódující polypeptid IX (virový kapsidový protein) kyvadlového plazmidu, který' může být užit ke konstrukci defektu ích rekombinantních virů (obr. 1).
Je jasné, že stejný postup lze užít ke konstrukci dalších plazmidů. které obsahují I až 50 kopií motivu NRSE kombinovaných s ubikvitámím promotorem odlišným od PGK. pod jehož kontrolu lze vložil jakýkoliv transgen.
- i ? CZ 299915 B6
Příklad 2
Funkční analýza provedená transfekci buněčných linií
Cílem tohoto příkladu bylo ukázat, že plazmidové konstrukty' obsahující chimérický promotor se sekvencí NRSE jsou funkční a umožňují buněčnou expresi požadovaného genu.
Plazmidové konstrukty popsané v příkladu I byly testovány přechodnou transfekci (elektroporaio cí) linie nervových buněk PC 12 (fcochrornocytom potkana) a 3T3 (fibroblasty potkana). Výsledné hodnoty luciferázové aktivity byly standardizovány vzhledem k aktivitě CAT (chloramfenikoltransferázy). která byla měřena v roztoku obsahujícím 125mM tris—fosfát, pil 7,8. 125μΜ chloramfenikol a 0.12μΜ radioaktivně značený aeetylkoenzym A. l est byl proveden, po inkubaci ve 37 °C po 1 hodinu, po přidání scintilační kapaliny Econofluor pomocí počítače KONT RON. i? Hodnoty luciferázové aktivity byly stanoveny pro každý plazmidový konstrukt, a získané průměrné hodnoty a střední chyby jsou uvedeny na obr. 2.
Získané výsledky ukázaly, že konstrukty obsahující 6 a 12 kopií NRSE byly schopny snížit expresi luciferázy o 66 a 82 % v buňkách jiných než nervových (3T3), což je snížení exprese řádu téměř logaritmu vc srovnání konstruktem pPGK-Luc. Výsledky také ukázaly, že přítomnost motivu NRSE v nervových buňkách PC 12 nesnižuje expresi luciferázy a ve skutečnosti je dokonce schopni jí zvýšit. Statisticky významné zvýšení v rozsahu 25% mezi bylo pozorováno při srovnání pl2NRSE-PGK-Luc a pPGK-Luc.
Výsledky tedy prokázaly. Že plazmidové konstrukty obsahující chimérický promotor se sekvencemi NRSE jsou funkční a dovolují buněčnou expresi požadovaného genu výlučně v nervových buňkách, zatímco exprese genu je v jiných než nervových buňkách významně inhibována.
Příklad 3
Konstrukce defektníeh rekombinantních virů
Cílem tohoto příkladu je popsat přípravu chimérického promotoru a konstrukci virových vektorů, které obsahují konkrétně tyto promotory.
K provedení této studie in vitro a in vivo byly připraveny tři odpovídající adenovirovc konstrukty: Ad-PGK-Luc, Ad-6NRSE-PCK-Euc a AD-12NRSE PGK-Luc. Tyto rekombinantní viry byly zkonstruovány pomocí odborníkovi známých technik, a to tak, že se kotransfekoval kyvadlový plazmid popsaný v příkladu I a defektní genom adenoviru typu 5 do enkapsidační linie (buňky 293). Kyvadlový plazmid byl nejdříve linearizován restrikčním štěpením v místě Fspl a pak byl kotransťekován společně s dlouhým fragmentem adenoviru štěpeného Cla! do buněk 293 metodou kalciumfosfátové precipitace DNA.
Enkapsidované rekombinantní genomy pak byly purifikovány standardními postupy, zejména plakovou purifikační technikou. Integrovaný fragment byl pak ověřen analýzou restrikcních fragmentů a pomocí PCR. Byl připraven virový zásobní roztok namnožením rekombínantního adenoviru na buňkách 293 a pak ultracentrifugací zejména na gradientu chloridu česného, a purifíkaeí na purifikační koloně sc Scphadexem G25M (Pharmacia). Virové titry byly stanoveny měřením optické hustoty a dodatečně byly ověřeny plakovou metodou. Všechny zásobní roztoky viru měly titr přibližně 2 x I08 pfii/μΐ.
- 14CZ 299915 Bó
Příklad 4
Funkční analýza in vitro
Cílem tohoto příkladu bylo ukázat, že virové konstrukty uvedené v příkladu 3. které obsahují chiméricky promotor se sekvencemi NRSE. jsou funkční a umožňují řídit promotor v různých typech buněk.
ío I ři adenoviry zkonstruované v příkladu 3 byly testovány in vitro tak, že byly infikovány buněčné linie a primární kultury dávkami 20 a 200 pfu/buňka. Měření byla provedena s 50 μΐ supernatantu. jak bylo popsáno výše. a standardizována vzhledem k množství celkového proteinu, který byl stanoven pomocí soupravy Bio-rad kc stanovení proteinu (Bio-Rad). Pro každý adenovirus byly stanoveny 3 hodnoty aktivity luciferázy v různých jamkách. Získané průměrné hodnoty a střední chyby jsou uvedeny na obr. 3 pro buněčné linie a na obr. 4 pro primární kultury.
Když byly užity rekombinantní adenoviry' Ad-6NRSE-PGK-Lue a Ad 12NRSE PGK Luc, exprese luciferázového rcportcrovcho genu byla snížena o 97 a 99 %, v uvedeném pořadí, v bunéčné linii jiných než nervových buněk (fibroblasty 3 T3).
V linii nervových buněk PCI2 byla pozorovaná luciferázová aktivita dvou adenoviru obsahujících sekvence NRSE vyšší než u adenoviru Ad-PGK-Luc. Podobně také luciferázová aktivita získaná se 3 adenovirovýrni konstrukty jc podobná po infekci primárních kultur buněk horních krčních ganglií (SCG) z novorozených potkanů (jednofaktorová globální analýza rozptylu
ANO V A neukázala žádný významný rozdíl mezi skupinami). Na druhé straně exprese luciferázy byla snížena o 91 až 98 % po infekci primárních kultur Icdvinných buněk z novorozených potkanů konstrukty rekombinantních adenoviru Ad-6NRSE-PGK-Luc a Ad-12NRSE-PGK-Luc, což je pokles v řádu 2 logaritmů exprese řízenc PGK v přítomnosti 12 kopií NRSE.
so Když byly tří konstrukty užity k infekci astrocytů a nervových buněk získaných z kortexu 17denníeh embryí potkana, ukázalo se, jak se dalo čekat, velmi významné snížení luciferázové aktivity (10 x) u astrocytů v případě konstruktů obsahujících 6 nebo 12 sekvencí NRSE (obr, 3E), což potvrdilo předchozí výsledky. Jak se také očekávalo, luciferázová aktivita všech třech výše zmíněných virových konstruktů byla srovnatelná v buňkách kortexu (obr. 3E).
Tyto výsledky jsou zejména překvapující a pozoruhodné, neboť demonstrují, že (I) chimérické promotory podle předkládaného vynálezu jsou funkční v primárních kulturách. (II) promotory jsou funkční ve virovém kontextu a (III) represorová aktivita je vyšší v adenovirovem kontextu než v odpovídajícím plazmidovem vektoru (srovnej obr. 2 a 3).
Takže tento příklad ukázal, že virové konstrukty obsahující chimérický promotor, který obsahuje sekvence NRSE. jsou funkční a umožňují buněčnou expresi požadovaného genu výlučně v nervových buňkách, zatímco v jiných než nervových buňkách jc exprese významně inhibována.
Příklad 5
Funkční analýza in vivo
5o Cílem tohoto příkladu bylo ukázat, že virové konstrukty popsané v příkladu 3 obsahující chimérický promotor, který obsahuje sekvence NRSE, jsou funkční a dovolují kontrolu promotoru in vivo.
- 15 CZ 299915 Bó
Vzhledem k velmi povzbudivým výsledkům v příkladu 4 byta aktivita konstruktů podle předkládaného vynálezu testována in vivo měřením exprese luciferázy po intramuskulámí injekci (lýtkový sval a sval jazyku) těchto .3 rekombinantních adenovirů do myší.
5.1. injekce do lýtkového svalu
Každý adenovirový konstrukt byl injikován ve 3 stadiích do pravého lýtkového svalu ί myši v dávce 2 x KU pfu/sval a objemu .30 μΙ. Injikovaný sval byl vyjmut 7 dnů po injekci a disoeiován v 1 ml pufru. aby bylo možné stanovit lucilérázovou aktivitu, která byla měřena ve 150 μ! ίο supernatantu. Průměrné hodnoty a střední chyby získané ze 7 měření, vztažené k hodnotě celkového proteinu, jsou uvedeny na obr. 5.
Výsledky ukazují, že když byly užity rekombinantní adenoviry Ad 6NRSF-PGK-I.uc a Ad12NRSE-PGK-Uuc, exprese luciferázy byla snížena o 90 a 96 % jeden týden po injekcích.
Exprese luciferázy po intramuskulámí injekci Ad-12NRSE-PGK Lue a Ad-PGK-I.uc byla u myší porovnávána v delším časovém období. Když byl užit konstrukt Ad-12Ni<SE-PGK Luc, aktivita byla vždy snížena jeden měsíc (95 %) a tři měsíce (91 %) po injekcích.
2o 5.2. Injekce do svalu jazyka
Bylo využito zpětného transportu, aby bylo možné srovnat expresi dvou konstruktů Ad-PGKEuc and Ad-12NRSE-PGK-Luc v prodloužené míše a ve svalu jazyka u myší injikovanyeh intrainuskulámě do jazyka.
Srovnatelně s výsledky již získanými, luciferázové aktivity dvou konstruktů v nervovém systému byly podobné jeden týden po podání (obr. 5B), Naopak, luciferázová aktivita byla snížena o 90 % ve svalu injikovancm konstruktem Ad-12NRSE-PGK-Luc ve srovnání se svalem injikovaným konstruktem Ad-PGK-Lue (obr. 5A). Tato represe se udržuje nejméně 35 dní po infekci.
Je zajímavé, že i přes to, že hladina exprese po 35 dnech je nižší než hladina 8 dnů po infekci, rozdíly v expresi mezi uvedenými virovými konstrukty zůstávají velmi významné.
Uvedené výsledky tedy znovu potvrdily, že konstrukty podle předkládaného vynálezu jsou funkční in vivo a demonstrovaly represní účinek, který byl dokonce větší než účinek pozorovaný in vitro po transfekci plazmidu do buněk jiných než nervových.
Výsledky dále prokázaly vysokou účinnost konstruktů podle předkládaného vynálezu in vivo ve směrování exprese požadovaného genu do nervových buněk. Použití vynálezu v genové terapii umožňuje omezit ektopickou expresi požadovaného transgenu a zabránit tak škodlivým vedlejším účinkům, které mohou vznikat v důsledku difúze transgenu v organismu.
CITOVANÁ LITERATURA f 1] Moři N., Stein R., Sigmund O. and Anderson D. J. Neurone, 4; 583-594 (1990) [2] Moři N.. Schoenherr C., Vandenbergh D. J. and Anderson D. J. Neurone, 9: 45—54 (1992) [3] Li L., Suzuki T„ Moři N. and Greencard P. PNAS USA, 90: 1460-1464 (1993) [4] Schoenherr C. J., Paquetle A. J. and Anderson D. J. PNAS USA. 93: 9981-9886 (1996) [5J Schoenherr C. J. and Anderson D. J. Science. 267: 1360-1363 (1995)
-16C7. 299915 B6 [6] McBurney, Sutherland. Adra, leclair. Kudnicki. Jardine Nucleic Acids Research, Vol. 19, No.20:5755-5761(1991) [7] Moullier P., Marcchal V.. DanosO. and Heard J. M, Transplantation. 56: 427-432 (1993) [8J McDonald R. J„ Lukason M. J.. Raabe O. (í.. Canfield D. R„ Burr E. A., Kaplan J. Wadsworth S. C. and St George J. A. Hum. Gene I her., 8: 41 1422 (199/) (9] Mane R. A.. Kraner S. D.. Goodman R. 11. and Mandel G. Neurone, 4: 223-231 (1990)
Γ10J Bessis A.. Champliaux N„ Chatelin E. and Changeux J, P. PNAS USA, 94: 5906-591 I (1997).
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 1: Sekvence motivu NRSE (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 páru bází (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne 50 (iv) ANTI SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: E..21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. I:
TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 2: kanonická sekvence motivu NRSE (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne
- 17 CZ 299915 B6 (iv) ANTI-SENSE: Nc (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:
TTCAGCACCA CGGACAGCGC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. C. 3: Obecná sekvence motivu NRSE (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
b (A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché <D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ; Ne (ív> ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:
NNCAGCACCN NGGANAGNNN C 21 (2) INEORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleotidy io (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Nc
- ix CZ 299915 B6 (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: E..21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:
TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉEKA: 21 párů bází 15 (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: eDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:
TTCAGCACCG CGGACAGTGC C (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 6: 35 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: eDNA (iii) HYPOT ET ICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21
- 19C7 299915 Bó (xi) POPIS SEKVENCE; SEKVENCE S ID. Č. 6:
TTCAGCACCT CGGACAGCAT C 21 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA. 21 párů bází (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY; cDNA (iii) HYPOTETICKÁ; Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE; 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7;
TTCAGCACCG CGGAGAGCGT C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 páru bází (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA; jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:
TCCAGCACCG TGGACAGAGC C 21
-20CZ 299915 B6 ro ) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 9;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (Β) 1 YP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS 20 (B) POZICE: I...2I (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 9:
TTCAGCACCG AGGACGGCGG A 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází jo (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) ΊΎΡ MOLEKULY: cDNA 55 (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne
4o (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE; 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:
ATCAGCACCA CGGACAGCGG C 21
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 1 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 páru bází (Β) I YP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: eDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI -SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:
TTCAGCACCT AGGACAGAGG C 21
Claims (25)
1. Rekombinantní nukleová kyselina, která obsahuje:
ubikvitámí promotor.
- jednu nebo několik sekvencí neuronového elementu restriktivního umlčení (NRSE) a
- terapeutický gen
2(1
2. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku U kde promotor je silný promotor.
3. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 2. kde promotor je promotor z genu základního metabolismu.
3? uspořádané tak, že exprese terapeutického genu je řízena ubikvitamím promotorem a přitom aktivita tohoto promotoru je řízena sekvencí (sekvencemi) NRSE, přičemž sekvence NRSE obsahuje celou nebo část sekvence id. č. 3, ve které N je A. G, C' nebo T, nebo obsahuje část nebo celou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 1, 2 a 4 až 11, nebo varianty těchto sekvencí.
4. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 3, kde promotor jc vybrán ze skupiny obsahující promotory genu PGK. ΕΠα, β-akt i nu, vimcntinu. adolázy A a α 1- an titry psinu.
- 99 .
5 a ct vivo.
5. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 1. která obsahuje 1 až 20. výhodně 3 až 15, sekvence NRSE.
5
5(1
6. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 5, která obsahuje 3, 6 nebo 12 sekvencí
NRSE.
7. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z předchozích nároků, která obsahuje několikrát se opakující sekvenci NRSE. jak je vymezena v nároku 1.
io
8. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde sekvence NRSE je u mí stěn a/j sou umístěny proti směru transkripce od promotoru,
9. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 1, kde terapeutický gen je nukleová kyselila na. která obsahuje otevřený čtceí rámec kódující RNA nebo terapeutický nebo vakcinační polypeptid.
10. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 9. kde terapeutický gen je nukleová kyselina, která obsahuje otevřený čtecí rámec kódující trofický faktor.
11. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 9, kde terapeutický gen je nukleová kyselina. která obsahuje otevřený čtecí rámec kódující antioxidant.
12. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku I. která kromě sekvencí NRSE obsahuje 2? regulační elementy.
13. Regulační element podle nároku 12. kterým je systém tetracyklinového operátoru/represoru.
14. Vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků I až 12.
15. Vektor podle nároku 14, který je virový vektor.
16. Defeklní rekombinantní virus, který obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.
17. Virus podle nároku 16, který je adenovirus.
18. Virus podle nároku 16, který je AAV.
io
19. Virus podle nároku 16, který je relrovírus.
20. Virus podle nároku 16, který je rhabdovirus.
21. Použití vektoru podle nároku Í4 pro výrobu přípravku pro přenos nukleove kyseliny a její expresi v nervové tkáni nebo buňkách.
io 28. Použití vektoru podle nároku 14 pro výrobu přípravku pro léčení nemocí motorických neuronů intramuskulárním podáváním nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo buněk.
29. Použití podle nároku 27 nebo 28. kdy vektor je virus.
is
30. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1 nebo vektor podle nároku 14 nebo virus podle nároku 16.
31. Přípravek podle nároku 30, vyznačující se tím, že jc formulován pro intramuskulární podávání, výhodně pro podávaní i n tramu skulami injekcí.
32. Chimérický promotor, který obsahuje ubikvitární promotor a jednu nebo několik sekvencí neuronového elementu restriktivního umlčení (NRSE).
33. Chimérický promotor podle nároku 32, kterým je promotor xNRSE-PGK, kde x je celé číslo
21. Buňky, které obsahují nukleovou kyselinu podle nároku 1 nebo vektor podle nároku 14 nebo 45 virus podle nároku 16.
22. Buňky podle nároku 21. které jsou savčí nervové buňky.
23. Použití nukleové kyseliny podle nároku l pro výrobu přípravku pro přenos nuklcových 50 kyselin a jejich expresi v nervových buňkách nebo tkáni,
24. Použití nukleové kyseliny podle nároku 1 pro výrobu přípravku pro léčení nemocí motorických neuronů intramuskulámím podáváním nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo buněk.
C'Z 299915 B6
25. Použití defektního rekombinantního viru podle nároku 16 pro přípravu farmaceutické kompozice pro přenos nukleových kyselin pro nervově specifickou expresi.
26. Použití podle nároku 25 k přenosu genu a jeho expresí v nervových buňkách in vitro
25 od 1 do 50,
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9801715A FR2774698B1 (fr) | 1998-02-12 | 1998-02-12 | Utilisation d'elements de regulation negative pour l'expression neurospecifique de transgenes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20002906A3 CZ20002906A3 (cs) | 2000-11-15 |
| CZ299915B6 true CZ299915B6 (cs) | 2008-12-29 |
Family
ID=9522917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20002906A CZ299915B6 (cs) | 1998-02-12 | 1999-01-14 | Rekombinantní nukleová kyselina obsahující negativní regulacní elementy pro nervove specifickou expresi transgenu a její použití |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060121013A1 (cs) |
| EP (2) | EP1120466A3 (cs) |
| JP (1) | JP2002503476A (cs) |
| KR (2) | KR20070013362A (cs) |
| CN (1) | CN1221665C (cs) |
| AU (1) | AU766153B2 (cs) |
| BR (1) | BR9907759A (cs) |
| CA (1) | CA2321220A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ299915B6 (cs) |
| FR (1) | FR2774698B1 (cs) |
| HU (1) | HUP0100660A3 (cs) |
| IL (1) | IL137609A0 (cs) |
| NO (1) | NO20004025L (cs) |
| PL (1) | PL198201B1 (cs) |
| WO (1) | WO1999041396A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA991070B (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115887655B (zh) * | 2021-09-30 | 2025-06-17 | 上海鲸奇生物科技有限公司 | 直接转分化治疗神经系统疾病 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027665A2 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | California Institute Of Technology | Neuron-restrictive silencer factor proteins |
| WO1997013866A2 (en) * | 1995-10-11 | 1997-04-17 | University Of British Columbia | Recombinant herpes virus vectors for expression in neuronal cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5912411A (en) * | 1993-06-14 | 1999-06-15 | University Of Heidelberg | Mice transgenic for a tetracycline-inducible transcriptional activator |
| TWM447817U (zh) * | 2012-09-21 | 2013-03-01 | Basso Ind Corp | 具有縮頭部的氣動棘輪扳手 |
| TWI555260B (zh) * | 2016-02-05 | 2016-10-21 | 見智科技股份有限公司 | 電池模組及其製造方法 |
-
1998
- 1998-02-12 FR FR9801715A patent/FR2774698B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-01-14 JP JP2000531577A patent/JP2002503476A/ja active Pending
- 1999-01-14 EP EP01106372A patent/EP1120466A3/fr not_active Withdrawn
- 1999-01-14 CZ CZ20002906A patent/CZ299915B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-01-14 WO PCT/FR1999/000061 patent/WO1999041396A1/fr not_active Ceased
- 1999-01-14 CA CA002321220A patent/CA2321220A1/fr not_active Abandoned
- 1999-01-14 PL PL342265A patent/PL198201B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-01-14 BR BR9907759-0A patent/BR9907759A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-01-14 KR KR1020077000848A patent/KR20070013362A/ko not_active Ceased
- 1999-01-14 KR KR1020007008744A patent/KR100720201B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-14 CN CNB998028169A patent/CN1221665C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-14 AU AU20581/99A patent/AU766153B2/en not_active Ceased
- 1999-01-14 EP EP99900923A patent/EP1053341A1/fr not_active Withdrawn
- 1999-01-14 IL IL13760999A patent/IL137609A0/xx unknown
- 1999-01-14 HU HU0100660A patent/HUP0100660A3/hu unknown
- 1999-02-10 ZA ZA9901070A patent/ZA991070B/xx unknown
-
2000
- 2000-08-10 NO NO20004025A patent/NO20004025L/no not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-10-24 US US11/256,112 patent/US20060121013A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027665A2 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | California Institute Of Technology | Neuron-restrictive silencer factor proteins |
| WO1997013866A2 (en) * | 1995-10-11 | 1997-04-17 | University Of British Columbia | Recombinant herpes virus vectors for expression in neuronal cells |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Bessis, A. et al.: "The neuron-restrictive silencer element: A dual enhancer/silencer crucial for patterned expression of a nicotinic receptor gene in the brain", PNAS USA 94, 5906-5911,1997 * |
| Martinou, J.C. et al.: "Overexpression of BCL-2 in transgenic mice protects neurons from naturally occurring cell death and experimental ischemia", Neuron, 13 (4), 1017-1030, 1994 * |
| Nishiyama, S. et al.: "The silencer of mouse Pgk-2 consists of two discrete DNA elements that individually have no effect", Gene 141 (2), 261-266, 1994 * |
| Schoenherr, C.J. and D.J. Anderson: "The neuron-restrictive silencer factor (NRSF): a coordinate repressor of multiple neuron-specific genes", Science, 267(5202), 1360-1363, 1995 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA991070B (en) | 1999-08-11 |
| EP1053341A1 (fr) | 2000-11-22 |
| KR20010072544A (ko) | 2001-07-31 |
| KR20070013362A (ko) | 2007-01-30 |
| CN1290303A (zh) | 2001-04-04 |
| NO20004025D0 (no) | 2000-08-10 |
| KR100720201B1 (ko) | 2007-05-21 |
| CZ20002906A3 (cs) | 2000-11-15 |
| HUP0100660A1 (hu) | 2001-06-28 |
| HUP0100660A3 (en) | 2003-10-28 |
| WO1999041396A1 (fr) | 1999-08-19 |
| AU2058199A (en) | 1999-08-30 |
| PL342265A1 (en) | 2001-06-04 |
| US20060121013A1 (en) | 2006-06-08 |
| PL198201B1 (pl) | 2008-06-30 |
| FR2774698A1 (fr) | 1999-08-13 |
| JP2002503476A (ja) | 2002-02-05 |
| CN1221665C (zh) | 2005-10-05 |
| AU766153B2 (en) | 2003-10-09 |
| IL137609A0 (en) | 2001-07-24 |
| CA2321220A1 (fr) | 1999-08-19 |
| EP1120466A2 (fr) | 2001-08-01 |
| NO20004025L (no) | 2000-10-10 |
| EP1120466A3 (fr) | 2003-01-22 |
| FR2774698B1 (fr) | 2002-03-01 |
| BR9907759A (pt) | 2000-10-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114174520B (zh) | 用于选择性基因调节的组合物和方法 | |
| KR100403708B1 (ko) | 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도 | |
| ES2264123T3 (es) | Adenovirus recombinantes defectivos para la terapia genica de tumores. | |
| KR20210103469A (ko) | 재조합 바이러스 벡터 및 이를 생산하기 위한 핵산 | |
| JPH08510122A (ja) | 動物起源のアデノウイルスベクターおよび遺伝子治療におけるそれらの使用 | |
| JPH11503314A (ja) | ウイルスベクターおよび過増殖性疾患、特に再発性狭窄症を治療するための該ベクターの使用 | |
| JP2003265193A (ja) | 組換えｐ５３アデノウイルス | |
| Duale et al. | Differences in transductional tropism of adenoviral and lentiviral vectors in the rat brainstem | |
| JP2021534814A (ja) | アルファ−シヌクレインに対するバリアントＲＮＡｉ | |
| JP2023542614A (ja) | レット症候群の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター | |
| CN117545842A (zh) | SMN1和miR-23a在治疗脊髓性肌萎缩中的协同效应 | |
| JP2024109708A (ja) | 非症候性感音性聴力喪失の治療方法 | |
| HU226018B1 (en) | Deficien recombinant adenovirus vectors, method for reducing homologous recombination phenomena and method for producing said adenoviruses | |
| CN115803441A (zh) | 用于恢复pah基因功能的腺相关病毒组合物和其使用方法 | |
| JPH11503608A (ja) | グルコースで誘導し得る組換えウイルスベクター | |
| JP2022512831A (ja) | 網膜疾患の遺伝子治療 | |
| US20030100116A1 (en) | Canine adenovirus vectors for the transfer of genes in targeted cells | |
| CZ20002906A3 (cs) | Rekombinantní nukleová kyselina obsahující negativní regulační elementy pro nervově specifickou exresi transgenu a její použití | |
| Jani et al. | Modulation of cell-mediated immunity prolongs adenovirus-mediated transgene expression in sciatic nerve | |
| JP3937446B2 (ja) | 特に神経変性疾患の治療のための医薬組成物およびその使用 | |
| CN115484975A (zh) | 用于ids基因转移的腺相关病毒组合物和其使用方法 | |
| US20020031493A1 (en) | Recombinant adenoviruses coding for glial-derived cell neurotrophic factor (gdnf) | |
| EP1118670A1 (en) | Canine adenovirus vectors for the transfer of genes in targeted cells | |
| RU2839898C2 (ru) | Синергетическое действие SMN1 и miR-23a при лечении спинальной мышечной атрофии | |
| JP2002503086A (ja) | Ｈｓｖ／ａａｖハイブリッドアンプリコンベクター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100114 |