PL198201B1 - Rekombinowany kwas nukleinowy, wektor, defektywny wektor rekombinowany, komórka, zastosowania konstruktu, kompozycja, chimeryczne promotory - Google Patents

Abstract

1. Rekombinowany kwas nukleinowy, znamienny tym, ze zawiera: - rozpowszechniony promotor eukariotyczny - jedn a lub wi ecej sekwencji NRSE oraz - gen terapeutyczny po laczone w ten sposób, ze gen terapeutyczny jest kontrolowany przez promotor i ze aktyw- nosc promotora jest kontrolowana przez sekwencj e lub sekwencje NRSE. 16. Wektor, znamienny tym, ze zawiera kwas nukleinowy okre slony w zastrz. 1. 18. Defektywny wirus rekombinowany zawieraj acy docelowy kwas nukleinowy pod kontrol a se- kwencji ekspresyjnych, znamienny tym, ze sekwencje ekspresyjne zawieraj a promotor i jedn a lub wi ecej sekwencji NRSE. 30. Zastosowanie wektora zawieraj acego konstrukt w którym: - promotor - jedn a lub wi ecej sekwencji NRSE oraz - wspomniany kwas nukleinowy, po laczone s a w ten sposób, ze kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor i ze aktyw- nosc promotora jest kontrolowana przez sekwencj e lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do leczenia chorób neuronów motorycznych, drog a domi esniow a. 31. Zastosowanie wed lug zastrz. 30, znamienne tym, ze wektor jest wirusem. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany kwas nukleinowy, wektor zawierający rekombinowany kwas nukleinowy, defektywny wektor rekombinowany, komórka zawierająca rekombinowany kwas nukleinowy lub wektor lub defektywny wirus rekombinowany, zastosowania konstruktu, kompozycja zawierająca rekombinowany kwas nukleinowy lub wektor lub defektywny wirus rekombinowany oraz chimeryczne promotory.

Terapia genowa in vivo lub ex vivo umożliwia domiejscowy i wydajny transfer genów kodujących interesujące czynniki (transgeny), w szczególności do układu nerwowego organizmu gospodarza. W tym względzie pomyślnie zastosowano różne typy wektorów do przenoszenia różnych typów transgenów do komórek nerwowych in vivo lub ex vivo. W szczególności można tu zacytować wektory wirusowe typu adenowirusa, AAV lub HSV, lub pewne wektory niewirusowe typu polimerów kationowych (na przykład polietylenoimina). Zatem wektory te umożliwiały stabilny i efektywny transfer transgenów do komórek układu nerwowego in vivo (WO 94/08026, WO 93/09239 oraz WO 96/02655). Możliwość wykonania tego typu transferu oferuje szereg zastosowań, w szczególności w dziedzinie medycyny. A zatem, wektory te mogą być zastosowane do terapii genowej in vivo lub ex vivo. W tym względzie, w chwili obecnej trwa szereg badań przedklinicznych dotyczących transferu czynników wzrostowych do układu nerwowego. Wektory te są stosowane zarówno do tworzenia zwierząt transgenicznych, umożliwiając testowanie związków, jak również do różnych badań znakowania i biodostępności.

We wszystkich tych zastosowaniach, nawet jeśli wydaje się, że osiągnięto wysoką wydajność i stabilno ść transferu, konieczna jest mo ż liwość regulacji transgenów. W tym wzglę dzie opisano szereg systemów umożliwiających utrzymanie ekspresji transgenów tylko w specyficznej tkance, na przykład poprzez zastosowanie tak zwanych „tkankowo-specyficznych” promotorów lub złożonych systemów chimerycznych, które wymagają zastosowania licznych konstruktów i/lub czynników regulatorowych. Jako przykład tkankowo-specyficznego promotora można wspomnieć promotor kwaśnego białka włókien glejowych, który jest aktywny głównie w komórkach glejowych. Jednakże, obecnie dostępne lub opracowywane systemy regulatorowe wykazują szereg wad, zwłaszcza ze względu na ich nie zawsze zadowalającą siłę lub selektywność działania. A zatem, w większości ze znanych systemów selektywność jest generalnie otrzymywana z uszczerbkiem dla siły promotora a zatem trudno jest osiągnąć ekspresję jednocześnie znaczącą, stabilną i specyficzną.

Szereg badań przedstawia sekwencje cis, które hamują transkrypcję genów neuronalnych w komórkach nieneuronalnych. Jedna z sekwencji wyposaż ona w ten typ wł a ś ciwoś ci skł ada się z NRSE („neuronalnie restryktywne elementy wyciszają ce”) nazwanych również RE-1 (element represorowy-1). NRSE jest krótką sekwencją, rozmiaru około 21 pz, obecną powyżej szeregu genów neuronalnych: na przykład SCG10 [1], kanału sodowego II [2] oraz synapsyny I [3]. Co więcej, analogiczne sekwencje zostały odnalezione powyżej szeregu innych genów neuronalnych, nawet jeśli ich rola nie została wykazana do chwili obecnej [4]. Sekwencje NRSE hamują nieneuronalną ekspresję genów poprzez wiązanie specyficznego czynnika transkrypcyjnego, tj. białka NRSF (neurone restrictive silencer factor), nazywanego również REST (RE-1 silencing transcription factor), obecnego jedynie w komórkach nieneuronalnych [5]. Białko to należy do rodziny czynników transkrypcyjnych zawierających palce cynkowe. Działa ono w trakcie rozwoju celem zainicjowania represji genów neuronalnych w komórkach nieneuronalnych i bierze następnie udział w utrzymaniu tej represji w wieku dorosłym.

Grupy badawcze, które scharakteryzowały obecność sekwencji NRSE powyżej genów neuronalnych potwierdziły zdolność tych sekwencji do zmniejszenia ekspresji genów reporterowych po transfekcji komórek nieneuronalnych. Celem osiągnięcia tego połączyli oni ich sekwencje NRSE z minimalnym, heterologicznym promotorem, umożliwiającym jedynie podstawową transkrypcję. A zatem, po umieszczeniu, na przykład, powyżej promotora kinazy tymidynowej kopia sekwencji NRSE kanału wapniowego II redukuje o połowę ekspresję genu reporterowego w komórkach nieneuronalnych [9]. Podobnie, dwie kopie sekwencji NRSE z synapsyny I połączone z minimalnym promotorem c-fos redukują ekspresję w komórkach nieneuronalnych o 75% [3]. Co więcej, obecność sekwencji NRSE umożliwiła również regulację aktywności promotora SV40 w komórkach nieneuronalnych [10].

Jednakże, sekwencje NRSE nie były nigdy stosowane ani do kierowania ekspresją silnego, rozpowszechnionego promotora ani z punktu widzenia terapii genowej. A zatem, nie wykazano nigdy czy sekwencje takie są zdolne do supresji ekspresji indukowanej przez silny promotor. Podobnie, nie wykazano nigdy, czy sekwencje te są wciąż aktywne in vivo jeśli zostaną umieszczone w otoczeniu

PL 198 201 B1 chimery. Ogólnie rzecz biorąc nie wykazano do tej pory czy sekwencje te są aktywne in vivo jeśli zostaną połączone z heterologicznymi promotorami.

Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany kwas nukleinowy charakteryzujący się tym, że zawiera:

- rozpowszechniony promotor eukariotyczny

- jedną lub wię cej sekwencji NRSE oraz

- gen terapeutyczny, połączone w ten sposób, że gen terapeutyczny jest kontrolowany przez promotor i że aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE.

Korzystnie jako promotor zawiera promotor genów konstytutywnie eksprymowanych (housekeeping).

Korzystniej jako promotor zawiera promotor wybrany spośród promotorów genów PGK, ΕΑα,β-aktyny, wimentyny, aldolazy A lub αΐ-antytrypsyny.

Korzystnie jako promotor zawiera silny promotor.

Korzystnie zawiera od 1 do 20, a zwłaszcza od 3 do 15 sekwencji NRSE.

Korzystniej zawiera 3, 6 lub 12 sekwencji NRSE.

Jeszcze korzystniej sekwencja NRSE zawiera całość lub 5 część sekwencji SEQ ID nr 3, w której N oznacza A, G, C lub T.

Najkorzystniej sekwencja NRSE wybrana jest z całości lub części sekwencji SEQ ID nr 1, 2 lub 4-11, bądź wariantów tych sekwencji.

Korzystnie zawiera ten sam motyw lub wariant motywu jak określono powyżej, które to motywy są powtórzone kilka razy.

Korzystnie sekwencję lub sekwencje NRSE są położone powyżej promotora.

Korzystnie jako gen terapeutyczny zawiera kwas nukleinowy zawierający otwartą ramkę odczytu kodującą RNA albo terapeutyczny lub szczepionkowy polipeptyd.

Korzystniej jako gen terapeutyczny zawiera kwas nukleinowy obejmujący otwartą ramkę odczytu kodującą czynnik troficzny.

Korzystniej jako gen terapeutyczny zawiera kwas nukleinowy obejmujący otwartą ramkę odczytu kodującą przeciwutleniacz.

Korzystnie dodatkowo do sekwencji NRSE zawiera elementy regulatorowe.

Korzystniej jako element regulatorowy zawiera system operatora/represora tetracykliny.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera kwas nukleinowy określony powyżej.

Korzystnie stanowi wektor wirusowy.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto defektywny wirus rekombinowany zawierający docelowy kwas nukleinowy pod kontrolą sekwencji ekspresyjnych, charakteryzujący się tym, że sekwencje ekspresyjne zawierają promotor i jedną lub więcej sekwencji NRSE.

Korzystnie stanowi adenowirus.

Korzystnie stanowi AAV.

Korzystnie stanowi retrowirus.

Korzystnie stanowi rhabdowirus.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka, charakteryzująca się tym, że zawiera kwas nukleinowy określony powyżej lub wektor określony powyżej lub wirus określony powyżej.

Korzystniej stanowi ssaczą komórkę nerwową.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie konstruktu zawierającego:

- promotor

- jedną lub więcej sekwencji NRSE oraz

- kwas nukleinowy, połączone w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor, a aktywność wspomnianego promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do przenoszenia docelowego kwasu nukleinowego i jego ekspresji w tkance lub komórce nerwowej.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie konstruktu zawierającego:

- promotor

- jedną lub więcej sekwencji NRSE oraz

- wspomniany kwas nukleinowy,

PL 198 201 B1 połączone w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor, a aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do leczenia chorób neuronów motorycznych, drogą domięśniową, kwasem nukleinowym w tkance lub komórce nerwowej.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie defektywnego wirusa rekombinowanego, zawierającego docelowy kwas nukleinowy pod kontrolą sekwencji ekspresyjnych zawierających promotor i jedną lub więcej sekwencji NRSE do transferu genu docelowego i jego ekspresji w komórkach nerwowych.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie wektora zawierającego konstrukt w którym:

- promotor

- jedną lub wię cej sekwencji NRSE oraz

- wspomniany kwas nukleinowy, połączone są w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor a aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do przenoszenia docelowego kwasu nukleinowego i jego ekspresji w tkance lub komórce nerwowej.

Korzystnie wektor jest wirusem.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie wektora zawierającego konstrukt w którym:

- promotor

- jedną lub wię cej sekwencji NRSE oraz

- wspomniany kwas nukleinowy, połączone są w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor i że aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do leczenia chorób neuronów motorycznych, drogą domięśniową.

Korzystnie wektor jest wirusem.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera kwas nukleinowy określony powyżej lub wektor określony powyżej lub wirus określony powyżej.

Korzystnie ma postać do podawania domięśniowego, korzystnie drogą iniekcji.

Przedmiotem wynalazku jest również chimeryczny promotor, charakteryzujący się tym, że zawiera rozpowszechniony promotor i jedną lub więcej sekwencji NRSE.

Przedmiotem wynalazku jest także chimeryczny promotor xNRSE-PGK, w którym x oznacza liczbę od 1 do 50.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano sposoby, konstrukty i wektory zawierające te konstrukty umożliwiające zlikwidowanie wad poprzednich metod. W szczególności, opracowano chimeryczny promotor umożliwiający docelową ekspresję neuronalną. W związku z tym, wynalazek korzysta z negatywnych elementów regulatorowych, uniemożliwiających ekspresję genów w komórkach nieneuronalnych. Ten typ konstruktu wykazuje szereg zalet w porównaniu do poprzednich systemów. Z jednej strony, sekwencje represorowe i rozpowszechnione promotory są często krótkie i dobrze scharakteryzowane, mogą być zatem łatwo połączone z innymi elementami regulatorowymi. Z drugiej strony, sekwencje regulatorowe mogą być teoretycznie połączone z jakimkolwiek rozpowszechnionym promotorem i stanowić dogodny system umożliwiający w prosty sposób otrzymanie neurospecyficznej ekspresji interesujących transgenów, nawet jeśli zastosowany wektor ekspresyjny ma bardzo niewielki lub żaden tropizm wobec komórek nerwowych.

Rekombinowane kwasy nukleinowe według wynalazku umożliwiają neurospecyficzną ekspresję genów. Zgodnie z wynalazkiem opracowano kwasy nukleinowe, w szczególności pochodzenia wirusowego, jak również komórki zawierające te kwasy nukleinowe i /lub wektory. Zgodnie z wynalazkiem opracowano również specyficzne promotory chimeryczne odpowiednie dla neurospecyficznej ekspresji w układzie nerwowym in vivo, kompozycje zawierające te elementy oraz zastosowania do transferu genów.

Konstrukty według wynalazku zawierają zatem region represji, w komórkach nieneuronalnych, aktywnej ekspresji genu terapeutycznego, indukowanej przez promotor. Region represorowy składa się z jednego lub więcej motywów NRSE.

Zastosowany w kontekście niniejszego wynalazku motyw NRSE korzystnie zawiera całość lub część następującej sekwencji 21 pz:

TTCAGCACCACGGAGAGTGCC (SEQ ID nr 1)

Sekwencja ta odpowiada sekwencji NRSE z genu SCG10 [2]. Niemniej ważne jest zrozumienie, że zastosowany w kontekście tego wynalazku motyw NRSE może zawierać pewne różnice w porównaniu z tą sekwencją, w stopniu zachowującym wspomniane powyżej właściwości represora. A zatem, znajPL 198 201 B1 dywano sekwencje typu NRSE, wykazujące pewien stopień zróżnicowania w różnych genach, jak opisano w artykule Schoenherr i wsp. [4], który jest włączony do niniejszego opisu poprzez odniesienie. W oparciu o obserwowane warianty została zdefiniowana sekwencja konsensusowa NRSE, odpowiadająca najczęściej napotykanej sekwencji. Jest to sekwencja: TTCAGCACCACGGACAGCGCC (SEQ ID Nr 2). W znaczeniu wynalazku preferowane warianty zawierają substytucje dotyczące 1 do 5 par zasad poniższej sekwencji SEQ ID Nr 2. Zaleca się by zawierały one zmiany dotyczące 1 do 3 par zasad. W tym zakresie, zmiany dogodnie dotyczą reszt: 1, 2, 10, 11, 15, 18, 19 i /lub 20 w powyższej sekwencji. Substytucje mogą dotyczyć delecji lub zastąpienia rozpatrywanej zasady inną zasadą. A zatem, motyw NRSE może być reprezentowany bardziej ogólnie przez całość lub część następującej sekwencji: NNCAGCACCNNGGANAGNNNC (SEQ ID Nr 3), w której N oznacza zasadę wybraną z A, T, C i G. Szczególnymi przykł adami motywów NRSE stosowanych w kontekś cie niniejszego wynalazku są:

TTCAGCACCACGGACAGCGCC (SEQ ID Nr 2)

TTCAGCACCACGGAGAGTGCC (SEQ ID Nr 4)

TTCAGCACCGCGGACAGTGCC (SEQ ID Nr 5)

TTCAGCACCTCGGACAGCATC (SEQ ID Nr 6)

TTCAGCACCGCGGAGAGCGTC (SEQ ID Nr 7)

TCCAGCACCGTGGACAGAGCC (SEQ ID Nr 8)

TTCAGCACCGAGGACGGCGGA (SEQ ID Nr 9)

ATCAGCACCACGGACAGCGGC (SEQ ID Nr 10)

TTCAGCACCTAGGACAGAGGC (SEQ ID Nr 11)

Dodatkowo, motywy te mogą zawierać na jednym lub na drugim końcu, bądź też na obu, dodatkowe zasady, które nie wpływają na wspomnianą powyżej aktywność represora. W szczególności, dodatkowe zasady mogą zawierać miejsca restrykcyjne, sekwencje neutralne lub sekwencje pochodzące z etapów klonowania, na przykład regiony plazmidu lub sekwencje flankujące motyw NRSE w oryginalnym genie.

Różne motywy mogą być przygotowane jakąkolwiek znaną fachowcom techniką przygotowywania kwasów nukleinowych. A zatem, motywy mogą być przygotowane technikami automatycznej syntezy kwasów nukleinowych przy użyciu komercyjnych syntetyzerów. Mogą być również otrzymane poprzez przeszukiwanie bibliotek DNA, na przykład poprzez hybrydyzację ze specyficznymi sondami lub poprzez wykonywanie eksperymentów związanych z wiązaniem do czynnika NRSF. Dodatkowo, jakikolwiek inny wariant sekwencji SEQ ID Nr 1 może być zidentyfikowany w bibliotece DNA drogą, na przykład, poszukiwania homologii.

Raz zsyntetyzowany motyw typu NRSE może być następnie testowany funkcjonalnie. Z tego powodu, pierwszy test składa się, w szczególności, z określenia zdolności motywu do wiązania czynnika NRSF. Może to zostać przeprowadzone w różnych warunkach, na przykład poprzez wykonanie testu opóźnienia migracji w żelu zgodnie z techniką opisaną przez Mori i wsp. [2] lub przez Schoenherr i wsp. [5], które to publikacje są włączane do niniejszego opisu poprzez odniesienie. Następnie, zdolność motywu do hamowania ekspresji może być określona poprzez wstawienie tego motywu do plazmidu testowego zawierającego gen reporterowi (acetylotransferazę chloramfenikolu, lucyferazę, lacZ, itp.) pod kontrolą promotora oraz poprzez porównanie poziomów ekspresji wspomnianego genu reporterowego w komórkach nerwowych i nienerwowych. Ten typ metodologii jest opisany w Schoenherr i wsp. [4, 5] oraz na przykładach. Dogodnie, motyw jest uważany za funkcjonalny jeśli powoduje różnice ekspresji w komórkach nerwowych i nienerwowych w co najmniej 40%. Bardziej zalecane jest by różnica wynosiła co najmniej 50%, a szczególnie 60%.

Jak pokazano poprzednio, kwasy nukleinowe według wynalazku mogą zawierać jeden lub więcej zdefiniowanych powyżej motywów NRSE. Jeśli obecnych jest kilka motywów, ten sam motyw może być powtórzony kilka razy lub obecnych może być kilka motywów. W zalecanym wykonaniu, konstrukty według wynalazku zawierają ten sam motyw powtórzony kilka razy. Konstrukty mogą zawierać do 50 motywów. Szczególnie, motyw jest powtórzony 2 do 20 razy, korzystnie 3 do 15 razy. Jak pokazano na przykładach, korzystne wyniki otrzymano jeśli motyw był powtórzony 3, 6 lub 12 razy, ze szczególnie znaczącymi wynikami otrzymanymi z 6 i 12 powtórzeniami.

Motywy NRSE mogą być wstawione do konstruktów według wynalazku do jakiegokolwiek regionu nietranskrybowanego lub nie ulegającego translacji, bądź do intronu. Dogodnie, są one umieszczone w niekodujących regionach 5' lub nawet dogodniej w bliskim rejonie promotora. Co więcej, ponieważ aktywność tych motywów jest zależna od ich orientacji, mogą być wstawione zarówno

PL 198 201 B1 w tranksrypcyjnie sensownej i antysensownej orientacji. Ostatecznie, kiedy zastosowanych jest kilka motywów, są one dogodnie wstawione w postaci tandemu, w jednym i tym samym regionie konstruktu. Jednakże, zrozumiałym jest, że mogą być wstawione do odmiennych rejonów.

Drugim elementem wchodzącym w skład kwasów nukleinowych według wynalazku jest promotor umożliwiający ekspresję transgenu w docelowej komórce. Zaleca się promotor aktywny w tkankach nerwowych, a zwłaszcza promotor eukariotyczny. Z tego względu promotor może być, na przykład, rozpowszechnionym promotorem to jest promotorem funkcjonującym we wszystkich typach komórek. Jeszcze korzystniej, chodzi tu o rozpowszechniony promotor eukariotyczny. Promotor może być autologiczny, to znaczy jest to promotor otrzymany z tego samego gatunku, co komórka w której poszukuje się ekspresji lub ksenogeniczny (otrzymany z innego gatunku). Korzystnymi przykładami rozpowszechnionych promotorów eukariotycznych, które mogą być wspomniane, są silne promotory, takie jak promotor genu kinazy fosfoglicerolu 1 (PGK). Tak zwane silne promotory są rozumiane jako promotory, których aktywność jest porównywalna do aktywności promotorów wirusowych. W eukariontach, PGK jest enzymem biorącym udział w glikolizie. U myszy promotor tego genu, mający około 500 pz, zawiera tak zwany region wzmacniacza (-440/-120) oraz region promotorowy (-120/+80), zawierający kilka miejsc inicjacji transkrypcji [6]. Wydajność promotora PGK została już przedstawiona w poprzednich eksperymentach na transferze genów in vitro i in vivo [7, 8].

Według jednego z preferowanych wykonań, kwas nukleinowy według wynalazku zawiera promotor PGK i jedną lub więcej sekwencji NRSE. Jak przedstawiono na przykładach, ten typ konstruktu umożliwia kierowanie neurospecyficzną ekspresją transgenu. W jednym wykonaniu chimeryczny promotor według wynalazku zawiera silny rozpowszechniony promotor i jedna lub więcej sekwencji NRSE. A zatem, wynalazek pokazuje, że sekwencje NRSE mogą być stosowane do wydajnego hamowania aktywności silnych promotorów, w tym in vivo. Umożliwia to zatem użycie nowych promotorów do licznych zastosowań. Specyficzny promotor chimeryczny jest pokazany za pomocą oznaczenia xNR -SE-PGK, w którym x oznacza liczbę pomiędzy 1 a 50, korzystnie od 1 do 20.

Przykładami innych rozpowszechnionych eukariotycznych promotorów, które mogą być stosowane w kontekście niniejszego wynalazku są promotory, które kierują ekspresją genów obligatoryjnego metabolizmu komórkowego (geny te są nazywane „domowymi” lub „house-keeping” oraz determinują białka niezbędne dla funkcji wspólnych wszystkim komórkom). Przykładami takich genów są geny biorące udział w cyklu Krebsa, oddychaniu komórkowym lub replikacji bądź transkrypcji innych genów. Specyficznymi przykładami tego typu promotorów, o których można wspomnieć są promotory genów a1-antytrypsyny, β-aktyny, wimentyny, aldolazy A lub Efla (czynnik wydłużania).

Promotor zastosowany w kontekście wynalazku może być również promotorem eukariotycznym typu neurospecyficznego, tym samym zwiększającym swoją neurospecyficzność. Przykładami takich promotorów są geny: NSE (neurono-specyficznej enolazy), NF (neurifilamentu), TH (hydroksylazy tyrozyny), DAT (transportera dopaminy), CHAT (acetylotransferazy cholinowej), DBH (dopamino β-hydroksylazy), TPH (hydroksylazy tryptofanu) i GAD (dehydrogenazy kwasu glutaminowego) oraz, bardziej ogólnie, wszystkie promotory enzymów syntetyzujących neuroprzekaźniki lub transportery neuroprzekaźników, bądź inne promotory genów, których ekspresja jest specyficzna dla danego typu lub podtypu neuronalnego lub glejowego.

Ostatecznie, możliwe jest również wzięcie pod uwagę użycia promotorów wirusowych, na przykład promotorów CMV (cytomegalowirusa), RSV (wirusa mięsaka Rousa), TK (kinazy tymidynowej), SV40 (wirusa szypansiego) oraz LTR (długie końcowe powtórzenie).

Co więcej, kwasy nukleinowe według wynalazku zawierają gen terapeutyczny. W znaczeniu niniejszego wynalazku gen terapeutyczny rozumiany jest jako jakikolwiek kwas nukleinowy zawierający co najmniej jedną otwartą ramkę odczytu, która koduje RNA albo peptyd terapeutyczny lub służący szczepieniu. Kwas nukleinowy może być komplementarnym, genomowym, syntetycznym lub półsyntetycznym DNA. Może mieć pochodzenie ssacze, wirusowe, roślinne lub może być pochodzenia sztucznego itd. Produkt transkrypcji lub translacji wykazuje zatem właściwości terapeutyczne lub służące szczepieniu. Specyficznymi przykładami, które mogą być zacytowane są enzymy, czynniki wzrostowe (w szczególności czynniki troficzne), neuroprzekaźniki lub ich prekursory, czynniki toksyczne (kinaza tymidynowa, na przykład), przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, itd.

Możliwym jest wzięcie pod uwagę użycia konstruktów według wynalazku do kierowania ekspresją jednego lub więcej genów kodujących RNA lub białko dla neuronów pozbawionych tego genu lub genów ulegających ekspresji w komórkach nieneuronalnych, celem stworzenia modeli zwierzęcych bądź zastępczej lub supresyjnej terapii symptomatycznej lub etiologicznej. Geny mogą, na przykład,

PL 198 201 B1 stanowić geny rodziny czynników troficznych, takich jak na przykład, neutrofiny (NGF, BDNF, NT3, NT4-5, GMF, etc.), czynników wzrostowych [rodziny czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) (a i b), rodziny czynnika wzrostu nabłonka naczyniowego (VEGF), rodziny naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) oraz rodziny czynnika wzrostu insuliny (IGF) (I i II)], oraz nadrodziny TGFe, w tym rodzin TGFe i GDNF/neurturyny.

Geny mogą również kodować cytokiny, na przykład CNTF, LIF, onkostatynę M lub kardiotrofinę 1, bądź białka z rodziny interleukin.

Geny mogą również stanowić geny kodujące receptory dla różnych czynników lub czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję rozmaitych czynników. Geny mogą również kodować enzymy syntetyzujące bądź degradujące różne neuroprzekaźniki i neuropeptydy lub ich prekursory, lub kofaktory istotne dla syntezy lub katabolizmu, lub też inne czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję tych białek; geny mogą również stanowić geny kodujące receptory dla neuroprzekaźników/neuropeptydów (lub kodować podjednostki tych receptorów) oraz kodować białka biorące udział w szlakach transdukcji.

Innymi interesującymi genami w kontekście wynalazku są, w szczególności, geny kodujące przeciwutleniacze, na przykład SOD (dysmutazy ponadtlenkowej), GPX (peroksydazy glutationu), katalazy lub enzymu oddychania komórkowego; enzymy biorące udział w cyklu komórkowym takie jak p21, lub inne inhibitory białek zależnych od kinaz, oraz również geny apoptozy, takie jak ICE, Bc12, BAX, itd.

Bardziej ogólnie, jakikolwiek gen, którego zaburzona ekspresja indukuje patologię układu nerwowego może ulegać ekspresji w konstruktach według wynalazku, jako gen, którego mutacja jest bezpośrednio związana z patologią lub gen, którego produkty biorą udział w szlakach metabolicznych. Geny mogą być również toksyczne dla terapii przeciwnowotworowej (na przykład kinaza tymidynowa lub deaminaza cytozyny), genami dla antysensownego RNA lub rybosomów, jak również genami reporterowymi do badania rozwoju, kinetyki, i/lub biodostępności, takimi jak geny β-galaktozydazy, lucyferazy lub GFP (zielone białko fluorescencyjne). Geny mogą również brać udział w warunkowych systemach rekombinacyjnych w układzie nerwowym, celem ustalenia modelów zwierzęcych, w tym warunkowych systemów typu knockout.

Jest zrozumiałym, że fachowiec może z łatwością dopasować typ genu do poszukiwanego zastosowania.

W kwasach nukleinowych według wynalazku różne elementy są umiejscowione w taki sposób, że promotor kontroluje ekspresję genu terapeutycznego, a sekwencja lub sekwencje NRSE kontrolują aktywność promotora. Ogólnie, gen jest zatem umiejscowiony poniżej promotora i w fazie z nim. Co więcej, region regulatorowy jest położony ogólnie powyżej promotora, chociaż, jak pokazano poprzednio, nie jest to wymagane dla aktywności. Odległość pomiędzy regionem regulatorowym (sekwencje NRSE) i promotorem różni się zgodnie z właściwościami zastosowanych sekwencji oraz liczbą powtórzeń motywu NRSE. Zalecane jest aby sekwencje regulatorowe były położone w odległości mniejszej od promotora niż 2 kb, dogodnie w odległości mniejszej niż 1 kb.

Zgodnie ze szczególnym wykonaniem wynalazku, sekwencje NRSE są połączone z systemem regulatorowym celem precyzyjnej kontroli ekspresji kwasów nukleinowych w komórkach.

Szczególnie wartym wspomnienia jest tutaj system regulatorowy, który z jednej strony korzysta z kontrolowanego teracykliną transaktywatora tTA, zaś z drugiej strony promotora wrażliwego na tTA, jak opisano w publikacji FR98/140080, która jest włączana do niniejszego opisu poprzez odniesienie. Krótko, kwasy nukleinowe składają się z pierwszego regionu, zawierającego kwas nukleinowy kodujący transaktywator systemu regulowanego tetracykliną (tTA) pod kontrolą umiarkowanego promotora oraz drugiego regionu składającego się z docelowego kwasu nukleinowego, znajdującego się pod kontrolą promotora wrażliwego na tTA. Wrażliwy promotor może być jakimkolwiek promotorem, nawet silnym promotorem, którego aktywność wzrasta w obecności wspomnianego transaktywatora. Ze strukturalnego punktu widzenia, promotor zawiera w swojej sekwencji lub w funkcjonalnej odległości od sekwencji co najmniej jedno miejsce wiązania czynnika tTA (lub region operatora Op). Zaleca się by dwa poprzednie regiony były rozdzielone. Celem wykonania wynalazku, sekwencje NRSE są położone powyżej promotora wrażliwego na tTA, i chociaż nie jest to konieczne dla aktywności, pomiędzy dwoma opisanymi powyżej regionami.

W zalecanym wykonaniu wynalazku możliwe jest jednoczesne osiągnięcie nie tylko regulacji ekspresji kwasów nukleinowych przez tetracyklinę, ale również możliwa jest tkankowa specyficzność ekspresji, szczególnie w komórkach nerwowych, co jest zapewnione dzięki sekwencjom NRSE.

Dodatkowo, ta precyzyjna regulacja promotora zapewnia znaczący stopień wydajności i wierności ekspresji transgenów, jak jest to 5 wymagane w terapii genowej.

PL 198 201 B1

Wektory według wynalazku zawierają zdefiniowane powyżej kwasy nukleinowe. Wektor ten jest dogodnie zdolny do transdukowania ssaczych, w szczególności ludzkich komórek nerwowych, jednak nie jest konieczne aby posiadał tropizm do wspomnianych komórek. A zatem, wynalazek dogodnie umożliwia zastosowanie jakiegokolwiek typu wektora. Wektor może być typu plazmidowego (plazmid, episom, sztuczny chromosom, itp.) lub wirusowego. Z pośród ostatnich, zalecane mogą być wektory otrzymane z adenowirusów, AAV oraz herpeswirusów, które posiadają uprzednio udokumentowany tropizm do komórek i tkanek nerwowych. Inne wirusy, takie jak retrowirusy lub rhabdowirusy, mogą być również wspomniane. Z tego powodu przedstawione poniżej przykłady pokazują, że aktywność sekwencji NRSE wprowadzonej do wektorów wirusowych jest bardzo istotna. A zatem, w nieoczekiwany sposób, w szczególności wprowadzenie 6 i 12 sekwencji do wektora wirusowego(adenowirusowego) powodowało redukcję ekspresji transgenu w komórkach nienerwowych o 91 do 98% in vitro oraz o 90 do 96% in vivo, odpowiednio. Wyniki te pokazują, że możliwa jest ekspresja docelowych kwasów nukleinowych w komórkach nerwowych, bez ekspresji w komórkach nienerwowych, zgodnie z prostym systemem, dzięki sekwencjom regulatorowym. Dodatkowo, zaletą sekwencji NRSE jest ich zmniejszony rozmiar, dogodna regulacja ekspresji genów włączonych do wektorów mających ograniczone miejsce do wstawienia sekwencji regulatorowych. Ponadto, możliwe jest obecnie zastosowanie tych sekwencji z innymi systemami regulatorowymi w jednym i tym samym wektorze.

Ogólnie, rekombinowane wirusy według wynalazku są defektywne, to znaczy niezdolne do autonomicznej replikacji w komórce. Produkcja defektywnych wirusów rekombinowanych znana jest fachowcom, i przedstawiona, na przykład w GRAHAM F. i PREYEC L, (w: Methods in Molecular Biology (1991) MURRAY E.J. (ed), The Human Press Inc., Clifton, NJ, rozdział 11, s. 109-128). W szczególności, każdy z tych wirusów może być przygotowany w enkapsydujących liniach komórkowych, posiadających wspomniane brakujące funkcje. Takie linie komórkowe zostały opisane w literaturze (293 i pochodne, na przykład).

W zalecanym wykonaniu wynalazku, defektywny wirus rekombinowany jest adenowirusem, w szczególności, stanowi różne serotypy tego wirusa, których różniące się struktury i właściwości zostały scharakteryzowane. Spośród tych serotypów, zalecane jest stosowanie w zakresie niniejszego wynalazku ludzkich adenowirusów typu 2 lub 5 (Ad 2 lub Ad 5) bądź adenowirusów pochodzenia zwierzęcego (patrz publikacja W094/26914). Adenowirusami pochodzenia zwierzęcego, które mogą być zastosowane i wspomniane w zakresie niniejszego wynalazku to adenowirusy pochodzenia końskiego, bydlęcego, mysiego (przykład: Mav1, Beard i wsp., Virology 75 (1990) 81), owczego, świńskiego, ptasiego lub szympansiego (przykład: SAV). Zalecanym adenowirusem pochodzenia zwierzęcego jest psi adenowirus, szczególnie adenowirus CAV2 [na przykład, szczep Manhattan lub A26/61 (ATCC VR-800)]. Zalecane w zakresie niniejszego wynalazku jest stosowanie adenowirusów pochodzenia ludzkiego, psiego lub mieszanego.

Zalecany defektywny adenowirus według wynalazku zawiera ITR, sekwencje enkapsydacji i kwas nukleinowy wedł ug wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem dogodniej region E1 jest co najmniej niefunkcjonalny w genomie adenowirusów. Rozważany gen wirusowy może być otrzymywany jako niefunkcjonalny jakąkolwiek techniką znaną fachowcom, w szczególności poprzez całkowitą delecję, zastąpienie lub dodanie jednej lun więcej zasad do rozważanego genu lub genów. Modyfikacje takie mogą być otrzymane in vitro (na wyizolowanym DNA) lub in situ, na przykład stosując techniki inżynierii genetycznej, bądź poprzez stosowanie czynników mutagennych. Inne regiony mogą być również zmodyfikowane, w szczególności regiony E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) oraz L5 (WO95/02697). Zgodnie z preferowanym wykonaniem, adenowirus zawiera delecję w regionach E1 i E4. Według innego preferowanego wykonania, zawiera on delecję w regionie E1, do którego wstawiono region E4 oraz kwas nukleinowy według wynalazku (cf. FR94 13355). Rekombinowany adenowirus może być defektywny, na przykład, w regionach E1 i/lub E2 i/lub E4. W wirusach według wynalazku, delecja w regionie E1 dogodnie rozciąga się od nukleotydu 455 do nukleotydu 3329 w sekwencji adenowirusa Ad5.

Defektywne rekombinowane adenowirusy zgodnie z wynalazkiem mogą być przygotowane dowolnymi technikami znanymi fachowcom (Levrero i wsp., gen 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). W szczególności, mogą być przygotowane poprzez rekombinację homologiczną pomiędzy adenowirusem a plazmidem niosącym, między innymi, kwas nukleinowy według wynalazku lub docelowy kwas nukleinowy pod kontrolą sekwencji ekspresji zawierającej promotor i jedną lub więcej sekwencji NRSE. Rekombinacja homologiczna zachodzi po kotransfekcji wspomnianego adenowirusa i plazmidu do odpowiedniej linii komórkowej. Zastosowana linia komórkowa

PL 198 201 B1 powinna być dogodnie (i) transformowalna wspomnianymi elementami oraz (ii) zawierać sekwencje zdolne do komplementowania części genomu defektywnego adenowirusa, dogodnie w formie zintegrowanej celem uniknięcia ryzyka rekombinacji. Jako przykłady linii komórkowych można wspomnieć ludzką linię zarodkową nerki 293 (Graham i wsp., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), która w szczególności zawiera zintegrowaną do genomu lewostronną część genomu adenowirusa Ad5 (12%), lub linie komórkowe zdolne do uzupełniania funkcji E1 i E4 jak opisano, w szczególności w publikacjach nr WO94/26914 i WO95/02697, lub w: Yeh i wsp., J. Virol. 70 (1996) 559.

Następnie, powielone adenowirusy są odzyskiwane i oczyszczane przy użyciu technik biologii molekularnej.

Według kolejnego szczególnego wykonania wynalazku, defektywnym rekombinowanym adenowirusen jest AAV. Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są wirusami DNA o relatywnie zmniejszonej wielkości, które integrują się stabilnie i miejscowo-specyficznie do zakażanych przez nie komórek. Zdolne są do zakażania szerokiego spektrum komórek, bez wpływania na wzrost, morfologię lub różnicowanie się komórek. Co więcej, nie wydają się brać udziału w ludzkich patologiach. Genom AAV został sklonowany, zsekwencjonowany i scharakteryzowany. Zawiera około 4700 zasad oraz odwrócone powtórzone regiony (ITR) o długości około 145 zasad na każdym końcu, służące jako miejsca inicjacji replikacji. Pozostała część genomu jest podzielona na 2 istotne regiony zawierające funkcje enkapsydujące: lewa część genomu zawiera gen rep, biorący udział w replikacji i ekspresji genów wirusowych; prawa część zawiera gen cap kodujący białka kapsydu wirusa.

Zastosowanie wektorów pochodnych AAV do transferu genów in vitro i in vivo zostało opisane w literaturze (patrz, w szczególności, WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Publikacje te opisują różne konstrukty pochodne od AAV, w których geny rep i/lub cap są wydeletowane i zastąpione docelowym genem oraz ich zastosowanie do przenoszenia wspomnianego genu docelowego in vitro (do hodowanych komórek) lub in vivo (bezpośrednio do organizmu). Defektywne rekombinowane AAV są defektywne w całości bądź częściowo w regionach Rep i/lub Cap. Mogą być przygotowane poprzez kotransfekcję plazmidem zawierającym sekwencje nukleotydową lub kombinację sekwencji nukleotydowych według wynalazku, oflankowane przez dwa powtórzone odwrócone regiony (ITR) z AVV oraz plazmid zawierający geny enkapsydacji AAV (geny rep i cap) do linii komórkowej zakaż onej ludzkim wirusem pomocniczym (na przyk ł ad adenowirusem). Przykładem użytej linii komórkowej może być 293. Opisane zostały inne systemy produkcji, na przykład w publikacjach WO95/14771; WO95/13365; WO95/13392 lub WO95/06743. Wyprodukowane rekorabinanty AAV są następnie oczyszczane przy użyciu standardowych technik.

Zgodnie z innym szczególnym wykonaniem wynalazku defektywny rekombinowany wirus jest retrowirusem, rhabdowirusem lub HSV. Konstrukcje rekombinowanych wirusów opartych na retrowirusach i herpeswirusach zostały szeroko opisane w literaturze: patrz, w szczególności, Breakfield i wsp., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein i wsp., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, itd. W szczególności, retrowirusy są wirusami integrującymi, które selektywnie zakażają dzielące się komórki. Stanowią zatem docelowe wektory do zastosowań w nowotworach. Genom retrowirusa zawiera zasadniczo dwa LTR, sekwencje enkapsydacji i trzy regiony kodujące (gag, poi i env). W rekombinowanych wirusach otrzymanych z retrowirusów geny gag, poi i env są ogólnie całkowicie lub częściowo wydeletowane i zastąpione heterologiczną sekwencją docelowego kwasu nukleinowego. Wektory te mogą być przygotowane z różnych typów retrowirusów takich jak, w szczególności, MoMuLV (wirus białaczki mysiej Moloney'a, oznaczany również MoMLV), MSV (wirus mięsaka mysiego Moloney'a), HaSV (wirus mięsaka Harvey'a), SNY (wirus martwicy śledziony), RSV (wirus mięsaka Rousa) lub wirus Frienda.

Celem skonstruowania rekombinowanych wirusów zgodnie z wynalazkiem, które zawierają kwas nukleinowy według wynalazku lub docelowy kwas nukleinowy pod kontrolą promotora i jednej lub więcej sekwencji NRSE, skonstruowany został plazmid zawierający w szczególności LTR, sekwencję enkapsydacji i wspomnianą sekwencję kwasu nukleinowego. Następnie został użyty do transfekcji tak zwanej enkapsydacyjnej linii komórkowej zdolnej do zapewnienia w układzie trans funkcji retrowirusa brakujących w plazmidzie. Ogólnie, enkapsydacyjne linie komórkowe są zatem zdolne do ekspresji genów gag, poi i env. Takie linie enkapsydacyjne zostały opisane poprzednio, w szczególności linie komórkowe PA317 (US 4,861,719), PsiCRIP (WO90/02806) oraz GP+envAM-12 (WO89/07150). Dodatkowo, rekombinowane retrowirusy mogą zawierać zmiany w LTR dla supresji aktywności transkrypcyjnej, które obejmują część genu gag (Bender i wsp., J. Virol 61 (1987) 1639).

PL 198 201 B1

Wyprodukowane rekombinowane retrowirusy są następnie oczyszczane przy użyciu standardowych technik.

Niniejszy opis wskazuje na możliwość stosowania sekwencji NRSE do regulacji ekspresji genu in vivo. A zatem, prezentowane w poniższych przykładach wyniki pokazują, że sekwencje są zawsze aktywne in vivo i umożliwiają ekspresję transgenu w komórkach neuronalnych bez ekspresji w komórkach nieneuronalnych.

Opis przedstawia również, że sekwencje NRSE są zdolne, w zależności od ich orientacji (liczba kopii), do wydajnej regulacji silnego promotora i umożliwiają szereg szczególnie zalecanych zastosowań. A zatem, wyniki otrzymane pokazują, że ekspresja w komórkach neuronalnych jest nie tylko specyficzna, ale również porównywalna do tej otrzymanej przy silnych promotorach. Wynalazek pokazuje również w sposób zadziwiający, że aktywność sekwencji NRSE wydaje się być wzmacniana jeśli sekwencje te są wstawione do wektora o pochodzeniu wirusowym. Ostatni typ konstruktu posiada zatem szczególnie atrakcyjne właściwości, takie jak wydajność transferu i selektywność ekspresji.

Kwas nukleinowy, wektor lub wirus według wynalazku, zdefiniowane powyżej mogą być zawarte w dowolnej komórce. Korzystnie, komórka ta jest ssaczą komórką nerwową. Może to być, w szczególności, komórka otrzymana z ustanowionej linii komórkowej lub komórki pochodzącej z hodowli pierwotnej. Komórki te mogą być zastosowane do produkcji, na przykład, polipeptydów lub testowania aktywności genów. Mogą być również stosowane w terapii komórkowej, poprzez implantację lub wstrzyknięcie podmiotowi.

W tym względzie wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej zdefiniowany powyżej kwas nukleinowy lub wektor lub wirus lub komórkę oraz nośniki. Dogodnie, kompozycja może być kompozycją farmaceutyczną. Do zastosowania według wynalazku, kwas nukleinowy, wektor lub komórki są dogodnie połączone z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników celem sformułowania do podawania drogą miejscową, w szczególności stereotaktyczną, doustną, dootrzewnową, donosową, dożylną, domięśniową, podskórną, dooczną, przezskórną, itd. Dogodnie, kwas nukleinowy, wektor lub komórki są stosowane w postaci do iniekcji. Postać do iniekcji może w szczególności być sterylnym, izotonicznym roztworem soli (fosforan mono- lub disodowy, chlorki sodu, wapnia, magnezu, itd., lub mieszaniny tych soli) bądź suchymi, w szczególności liofilizowanymi kompozycjami, które w zależności od sytuacji po dodaniu sterylnej wody lub soli umożliwiają stworzenie roztworów do iniekcji.

Według preferowanego wykonania, kompozycje według wynalazku są podawane drogą domięśniową, korzystnie drogą zastrzyków. Wybranie drogi domięśniowej niespodziewanie umożliwia zasadniczy efekt terapeutyczny dzięki wstecznemu transportowi produktów otrzymanych z terapeutycznych genów w mięśniu. A zatem, produkty te odpowiadające kwasom nukleinowym lub otrzymane z wektorów według wynalazku, są wchłaniane na poziomie połączeń nerwowo-mięśniowych (zakończenia motoryczne) i są przemieszczane w górę do ciał komórek nerwów motorycznych za pomocą wstecznego transportu wzdłuż aksonów nerwów motorycznych. Dodatkowo, ta droga podawania posiada tę zaletę, że umożliwia uniknięcie niepożądanych skutków ektopowej ekspresji genów terapeutycznych w leczeniu chorób neurologicznych. Przy zastosowaniu tej metody, możliwe staje się zatem specyficzne zakażanie komórek neuronalnych bez promowania ekspresji transgenu w mięśniach lub wydzielania ich produktów do krążenia krwi. A zatem, metoda ta bez żadnych wątpliwości pokonuje wszystkie wady, które były często napotykane w terapii z powodu ograniczonego dostępu czynników neurotroficznych do neuronów motorycznych, bardzo krótkiego czasu półtrwania tych białek, oraz efektów delecyjnych pojawiających się po podaniu układowym. Co więcej, łatwy dostęp do miejsca iniekcji, może być dogodnie zastosowany do jakiejkolwiek patologii neuronalnej lub neuromotorycznej.

Ilości różnych elementów mogą być dostosowane poprzez fachowca zgodnie z zastosowaniem oraz zgodnie z różnymi parametrami takimi jak, w szczególności, rozważane miejsce podania, liczba iniekcji, ulegający ekspresji gen, lub czas trwania poszukiwanego leczenia.

Zastosowanie kwasów nukleinowych według wynalazku do przenoszenia genów in vivo lub ex vivo, na przykład w terapii genowej, umożliwia ograniczenie ektopowej ekspresji docelowych transgenów i skierowanie poszukiwanych skutków terapeutycznych na populacje neuronalne. Zapobiega to zatem efektom delecyjnym, które potencjalnie mogą się pojawić na wskutek dyfuzji transgenów w organizmie. Możliwe jest zatem użycie tego systemu w różnych (degeneratywnych i traumatycznych) patologiach rdzenia kręgowego lub innych, neurologicznych patologiach obwodowych lub neuropsychiatrycznych, które specyficznie wpływają na populacje neuronalne. W podstawowej neurologii, system ten powinien umożliwić wyjaśnienie pochodzenia (neuronalnego lub glejowego) skutków obserwowanych in vitro i in vivo.

PL 198 201 B1

Zastosowanie wektorów wirusowych jest oparte na naturalnych własnościach transfekcyjnych wirusów. Wektory te okazały się szczególnie efektywne w zakresie transfekcji.

Możliwe jest zatem zastosowanie wektorów według wynalazku do docelowego transferu genu i jego ekspresji w komórkach neuronalnych, in vivo, in vitro lub ex vivo, w szczególnoś ci dla celów terapii genowej. A zatem, ekspresja docelowego kwasu nukleinowego pod kontrolą, w szczególności jednej lub więcej sekwencji NRSE, jest specyficznie otrzymywana w komórkach nerwowych, podczas gdy ekspresja ektopowa jest ograniczona. Wektory te mogą zatem być użyte do leczenia i/lub zapobiegania różnym ośrodkowym, obwodowym lub neuropsychiatrycznym patologiom neuronalnym, które wpływają na komórki nerwowe, w szczególności chorobom neurodegeneracyjnym i różnym patologiom rdzenia kręgowego. Przykładami patologii, które mogą być w szczególności wspomniane są: choroba Alzheimera, Parkinsona, rdzeniowa ataksja mięśni, choroba Huntingtona.

Wektory te mogą, w szczególności, być stosowane do leczenia i/lub zapobiegania patologiom neuronów notorycznych takich jak, na przykład, rdzeniowy zanik mięśni typu I (choroba WerdnigHoffmanna) oraz typu II lub III (choroba Kugelberg-Welandera), amiotrofia rdzeniowa oraz amiotrofia z poraż eniem opuszki rdzeniowej (taka jak choroba Kennedy'ego).

Wektory te są szczególnie odpowiednie do leczenia i/lub zapobiegania tym patologiom drogą domięśniową. Jak wyjaśniono poprzednio, ta droga terapeutyczna umożliwia osiągnięcie neuronów motorycznych dzięki transportowi wstecznemu.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano sposób regulacji ekspresji genów in vivo, obejmujący wstawienie sekwencji NRSE powyżej wspomnianego genu i podawanie powstającego konstruktu i /lub wektora zawierającego wspomniany konstrukt in vivo.

Zastosowanie wynalazku zostanie opisane z większymi szczegółami za pomocą następujących przykładów, które powinno się rozpatrywać jako ilustratywne i nieograniczające. Przede wszystkim, przykłady te opisują klonowanie wzrastającej liczby sekwencji NRSE powyżej promotora PGK do plazmidu zawierającego gen reporterowy lucyferazy oraz szeregu konstruktów, prowadzących do spadku ekspresji lucyferazy po transfekcji komórek nieneuronalnych. Następnie, wytworzone zostały odpowiednie konstrukty adenowirusowe i testowane in vitro poprzez zakażanie linii komórkowych i hodowli pierwotnych; są one następnie testowane in vivo po domięśniowej iniekcji rekombinowanego adenowirusa myszom. Przedstawione wyniki pokazują zalety kwasów nukleinowych według wynalazku.

Opis figur

Figura 1: Diagram plazmidu niosącego chimeryczny promotor według wynalazku.

Figura 2: Badanie zdolności funkcjonalnej plazmidów, które zostało przeprowadzone poprzez transfekcję komórek nerwowych (PC12) (Fig. 2B) i nienerwowych (3T3) (fig. 2A), a następnie pomiar aktywności lucyferazy.

Figura 3: Badanie zdolności funkcjonalnej rekombinowanych defektywnych wirusów in vitro, które zostało przeprowadzone poprzez pomiar aktywności lucyferazy po infekcji:

- komórek nienerwowych (szczurze fibroblasty 3T3) (fig. 3A)

- komórek nerwowych (szczurza feochromocytoma PC12) (fig. 3B)

- pierwotnych hodowli komórek nienerwowych, zakaż ania pierwotnej hodowli komórek nerki noworodków szczurzych (fig. 3C)

- pierwotnych hodowli komórek nerwowych, infekcji pierwotnych hodowli neuronów zwoju rdzeniowego z noworodków szczurzych (fig. 3D)

- pierwotnych hodowli nieneuronalnych, zakaż enie pierwotnych hodowli astrocytów otrzymanych z zarodków szczurzych (fig. 3E)

- pierwotnych hodowli komórek nerwowych, zakaż anie hodowli korowych neuronów otrzymanych ze szczurzych zarodków.(fig. 3F).

Figura 4: Badanie funkcjonalnej zdolności defektywnych rekombinowanych wirusów in vivo, które zostały wykonane poprzez wstrzykiwane ich domięśniowo myszom oraz pomiar aktywności lucyferazy.

Figura 5: Badanie funkcjonalnej zdolności defektywnych rekombinowanych wirusów in vivo, które zostały wykonane poprzez wstrzykiwane ich do mięśni języka myszy oraz pomiar aktywności lucyferazy.

Figura 5A: Pomiar aktywności lucyferazy w mięśniach języka w dniach 8 i 35.

Figura 5B: Pomiar aktywności lucyferazy w komórkach układu nerwowego (opuszka) w dniach 8 i 35.

PL 198 201 B1

Materiały i Metody

Linie komórkowe i hodowle pierwotne:

Komórki otrzymane ze szczurzej feochromocytomy (PC12) - są hodowane w podłożu RPMI 1640 (Gibco) zawierającym 15% płodowej surowicy cielęcej (FCS) (Boehringer). Komórki otrzymane ze szczurzych fibroblastów 3T3 są hodowane w podłożu Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej. Hodowle pierwotne górnych zwojów rdzenia kręgowego (SCG) są otrzymane poprzez wycięcie górnych zwojów rdzenia kręgowego z 1-2 dniowych, nowonarodzonych szczurów rasy Wistar (Iffa-Credo) i wymieszanie z 3 mg /ml dispazy (Boehringer); następnie, komórki są przenoszone na płytki uprzednio pokryte kolagenem otrzymanym ze szczurzych ogonów. Komórki hoduje się w 0,5 ml podłoża Leibovitza L-15 (Gibco), zbuforowanego diwęglanem i zawierającego szereg czynników w tym 70 ng/ml NGF (nerwowy czynnik wzrostu), 5% surowicy dorosłych szczurów i 10 μΜ arabinofuranozydu cytozyny.

Pierwotne hodowle nerki są przygotowywane poprzez rozdrobnienie z trypsyną szczurzych nerek z 1-2 dniowych, nowonarodzonych szczurów rasy Wistar (Iffa-Credo). Komórki są następnie przenoszone na płytki z 10% FCS celem umożliwienia komórkom podziału przed zakażeniem.

Szczurze hodowle korowe są otrzymywane z embrionów szczurów rasy E17 Sprague-Dawley (Iffa-Credo). Komórki otrzymuje się poprzez wycięcie i mechaniczne rozdrobnienie oraz hodowlę w podłożu DMEM zawierającym 100 μg/ml transferyny, 25 μg/ml insuliny, 10 μg/ml putrescyny, 5 μg/ml selenianu sodu, 6,3 μg/ml progesteronu i 2 mM glutaminy (Sigma).

Pierwotne hodowle astrocytów są otrzymywane ze szczurzej embrionalnej tkanki korowej (E17, Sprague-Dawley) i hodowane na podłożu DMEM zawierającym 10% FCS w atmosferze 10% CO2/90% powietrza.

Doświadczenia in vitro:

Do doświadczeń przejściowej transfekcji, elektroporowano jeden milion komórek używając systemu Bio-Rad system, przy 960 μF i 190V, w przypadku komórek PC12, lub 250V w przypadku komórek 3T3, 6 μg każdego testowanego plazmidu, 7 μg plazmidu Bluescript (Stratagene) i 2 μg kontrolnego wektora pCAT 3 (Promega), będącego plazmidem kodującym acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT), umożliwiającą monitorowanie wydajności transfekcji.

Komórki zostały zainfekowane poprzez zastąpienie podłoża hodowlanego podłożem bez surowicy i zawierającym zawiesinę wirusa o MOI około 200 pfu, oraz inkubację przez 45 minut. W przypadku każdego konstruktu (plazmidu lub adenowirusa), określano 3 wartości aktywności lucyferazy z 3 różnych dołków. Dla każdego konstruktu wirusowego, eksperymentalne zakażenia były powtarzane dwa razy stosując różne pule wirusa.

godzin po elektroporacji lub infekcji komórki zbierano do 200 μl buforu lizujacego zawierającego 25 mM Tris/fosforan, pH 7,8; 0,08 mM lucyferyny; 0,1 mM ATP; 8 mM MgCl2; 1 mM ditiotreitolu; 1 mM EDTA; 15% glicerolu i 1% Tritonu. Aktywność lucyferazy jest mierzona przy użyciu luminometru LUMAT LB9501 (Berthold). W przypadku ztransfekowanych komórek dodawane jest do buforu lizującego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) a aktywność jest standaryzowana na podstawie aktywności CAT, określanej metodą mierzenia w płynnym scyntylatorze. W przypadku rekombinowanych adenowirusów aktywność lucyferazy jest standaryzowana poprzez określenie zawartości białka w ekstraktach komórkowych, która została określona systemem Bio-Rad (Bio-Rad laboratories).

Doświadczenia in vivo:

Sześciomiesięczny samiec myszy C57B16 (Charles River) jest znieczulany mieszaniną Rompun (Bayer)/Ketamine (UVA), konstrukty Ad-PGK-luc i Ad-NRSE-PGK-luc są powoli wstrzykiwane (2,5 pl/ml) do języka (10⁹ pfu/4 x 2,5 μl i/lub do mięśni golenia w dawce 2.10⁹ pfu/mięsień (30 μ^. Myszy są zabijane pentobarbitalem (Sanofi) od 7 do 35 dnia po zakażeniu. Opuszki, języki i mięśnie usuwa się celem zmierzenia aktywności lucyferazy. Opuszki są rozdrabniane mechanicznie w 200 μl buforu lizującego. Mięśnie i języki są rozdrabniane w systemie politronu DIAX 900 (Heidolph) w 1 i 2 ml buforu lizującego, odpowiednio.

P r z y k ł a d y

1. Konstruowanie chimerycznych promotorów i wektorów plazmidowych

Celem tego przykładu jest opisanie przygotowania chimerycznych promotorów i konstruowanie wektorów plazmidowych, zawierających te poszczególne promotory.

Plazmid pPGK-Luc zawiera gen Luc pod kontrolą rozpowszechnionego promotora eukariotycznego PGK. Celem otrzymania plazmidu pPGK-Luc, 500 pz mysiego promotora PGK zostało wstawionych

PL 198 201 B1 do komercyjnego plazmidu, pUT 103 (CAYLA FRANCE), zawierającego reporterowy gen lucyferazy połączony z zeocyną i sekwencją poliadenylacji SV 40 we wczesnej konfiguracji (PolyA).

Następnie, jedna, dwie, trzy, sześć i dwanaście kopii sekwencji NRSE z genu SCG10 (TTCAGCACCACGGAGAGTGCC, SEQ ID Nr 1) [2] zostało wstawionych w konfiguracji antyrównoległej powyżej promotora PGK. W tym celu fragment 26 pz, zawierający opisaną powyżej sekwencję NRSE oflankowaną 2 miejscami Mlul został skonstruowany poprzez hybrydyzację 2 odpowiednich syntetycznych oligonukleotydów. Fragment ten został wstawiony, w jednej lub więcej kopii do miejsca Mlul z pPGK-Luc otrzymując plazmid zawierający 1, 2 i 3 kopie NRSE. Plazmid zawierający 6 kopii NRSE został otrzymany z plazmidu zawierającego 3 kopie (pNRSE3-PGK-Luc) przy użyciu następującej strategii: fragment BamHI/XhoI zawierający 3 kopie NRSE jest usunięty z pNRSE3-PGK-Luc i wprowadzony do miejsca Xhol z pNRSE3-PGK-Luc, tym samym tworzą c p6NRSE-PGK-Luc. Podobnie, plazmid zwierający 12 kopii NRSE został otrzymany z plazmidu zawierającego 6 kopii (p6NRSE-PGK-Luc) poprzez wprowadzenie dwóch kopii fragmentu BamHI/XhoI do p6NRSE-PGK-Luc.

Końcowo, kaseta ekspresyjna PGK (z lub bez NRSE)-Luc-PolyA z różnych plazmidów opisanych powyżej została wprowadzona pomiędzy lewostronną sekwencję adenowirusa ITR (odwrócone powtórzenie końcowe, miejsce inicjacji replikacji) i sekwencję kodującą IX polipeptyd (białko kapsydu wirusa) plazmidu wahadłowego, który może być zastosowany do konstruowania defektywnych wirusów rekombinowanych (figura 1).

Jest zrozumiałym, że ten sam protokół może być zastosowany do skonstruowania innego plazmidu, w którym zawarte jest od 1 do 50 kopii motywu NRSE połączonego z rozpowszechnionym promotorem eukariotycznym innym niż PGK, pod którego kontrolą może być wprowadzony jakikolwiek transgen.

2. Analiza funkcjonalna stansfekowanych linii komórkowych

Celem tego przykładu jest pokazanie, że konstrukty plazmidowe zawierające chimeryczny promotor z sekwencjami NRSE są funkcjonalne i pozwalają na komórkową ekspresję docelowego genu.

Konstrukty plazmidowe opisane w przykładzie 1 były testowane poprzez przejściową transfekcję (elektroporację) neuronalnej linii komórkowej PC12 (szczurza feochromocytoma) oraz nieneuronalnej linii komórkowej 3T3 (szczurze fibroblasty). Otrzymane wartości aktywności lucyferazy są standardyzowane w odniesieniu do aktywności CAT (acetylotransferazy chloramfenikolu), która mierzona jest w roztworze zawierającym 125 mM Tris-fosforanu, pH 7,8, 125 μΜ chloramfenikolu i 0,12 μΜ wyznakowanego radioaktywnie acetylokoenzymu A. Testy są wykonywane po inkubacji w 37°C przez godzinę, w obecności płynu scyntylacyjnego Econofluor oraz przy użyciu licznika KONTRON. Określano trzy aktywności lucyferazy dla każdego konstruktu plazmidowego, otrzymane średnie oraz standardowy błąd pomiaru są przedstawione na fig. 2.

Otrzymane wyniki pokazują, że konstrukty składające się z 6 i 12 kopii NRSE są zdolne do zmniejszania ekspresji lucyferazy o 66 i 82%, odpowiednio, w komórkach nieneuronalnych (3T3), co jest stratą logarytmu ekspresji w porównaniu do konstruktu pPGK-Luc. Wyniki pokazują również, że obecność motywów NRSE w komórkach nerwowych PC12 nie zmniejsza ekspresji lucyferazy i może w istocie ją nawet zwiększać. A zatem, statystycznie istotny wzrost o 25% jest obserwowany pomiędzy p12NRSE-PGK-Luc a pPGK-Luc.

Otrzymane wyniki pokazują zatem, że konstrukty plazmidowe, które zawierają chimeryczny promotor składający się z sekwencji NRSE są funkcjonalne i pozwalają na komórkową ekspresję docelowego genu jedynie w komórkach nerwowych, jednak jednocześnie znacznie hamują ekspresję wspomnianego genu w komórkach nieneuronalnych.

3. Konstrukcja defektywnych wirusów rekombinowanych

Celem tego przykładu jest opisanie przygotowania chimerycznych promotorów i konstrukcji wektorów wirusowych, które zawierają poszczególne promotory.

Celem wykonania tego testu in vitro i in vivo stworzone zostały trzy odpowiednie konstrukty adenowirusowe: Ad-PGK-Luc, Ad-6NRSE-PCK-Luc i AD-12NRSE-PGK-Luc. Zastosowano znane techniki biologiczne do skonstruowania tych rekombinowanych wirusów poprzez kotransfekcję plazmidów wahadłowych opisanych w przykładzie 1 oraz defektywnego adenowirusa typu 5 do linii enkapsydującej (komórki 293). Plazmidy wahadłowe zostały w pierwszej kolejności linearyzowane poprzez enzymatyczne trawienie w miejscu Fspl a następnie kotransfekowane, razem z długim fragmentem adenowirusa ClaI, do linii komórkowej stosując metodę precypitacji DNA fosforanem wapnia.

Enkapsydowane rekombinowane genomy są następnie oczyszczane przy użyciu standardowych technik, w szczególności stosując technikę izolacji z łysinek. Zintegrowany fragment jest następnie

PL 198 201 B1 sprawdzany poprzez analizę fragmentów restrykcyjnych i PGR. Pule wirusa są przygotowywane poprzez propagację rekombinowanego adenowirusa w komórkach 293 a następnie ultrawirowanie, w szczególności w gradiencie chlorku cezu, oraz oczyszczanie na kolumnie Sephadex G25M (Pharmacia). Miana wirusa zostały określone poprzez odczyt gęstości optycznej oraz były dodatkowo sprawdzane metodą łysinek. Wszystkie pule wirusa miały miano około 2.10⁸ pfu/pl.

4. Analiza funkcjonalna in vitro

Celem tego przykładu jest pokazanie, że konstrukty wirusowe opisane w przykładzie 3, które zawierają chimeryczny promotor z sekwencjami NRSE są funkcjonalne i zdolne do kontroli promotora w różnych typach komórek.

Trzy adenowirusy, które zostały skonstruowane w przykładzie 3 powyżej były testowane in vitro poprzez zakażanie linii komórkowych i hodowli pierwotnych dawkami 20 i 200 pfu/komórkę, odpowiednio. Pomiary są wykonywane w 50 μl supernatantów, jak poprzednio opisano, oraz standaryzowane w odniesieniu do całkowitej zawartości białka otrzymanej stosując system zestawu Bio Rad (Bio-Rad). Dla każdego adenowirusa, określane były 3 wartości aktywności lucyferazy w różnych dołkach. Otrzymane wartości średnie i błędy standardowe są pokazane na figurze 3, dla wszystkich linii komórkowych, oraz na figurze 4, w przypadku hodowli pierwotnych.

Kiedy stosowane są rekombinowane adenowirusy Ad-6NRSE-PGK-Luc i Ad-12NRSE-PGK-Luc, ekspresja reporterowego genu lucyferazy spada o 97% i 99%, odpowiednio, w nieneuronalnej linii komórkowej 3T3.

W linii neuronalnej PC12, aktywność lucyferazy dwóch adenowirusów zawierających sekwencje NRSE jest wyższa niż ta obserwowana, jeśli użyty zostanie adenowirus Ad-PGK-Luc. W ten sam sposób, aktywność lucyfearzy otrzymana z użyciem 3 konstruktów adenowirusowych jest podobna po infekcji pierwotnych hodowli ze zwojów rdzeniowych nowonarodzonych szczurów (SCG) (jednoczynnikowa ogólna analiza wariancji ANOVA nie wykazuje żadnej znaczącej różnicy pomiędzy trzema grupami). Z drugiej strony, ekspresja lucyferazy zmniejsza się od 91 do 98% po zakażeniu pierwotnych hodowli komórek nerki nowonarodzonych szczurów rekombinowanymi adenowirusami Ad-6NRSE-PGK-Luc i Ad-12NRSE-PGK-Luc, co oznacza utratę dwóch logarytmów ekspresji PGK w obecności 12 kopii NRSE.

Potwierdzając poprzednie wyniki, zakażenie trzema konstruktami astrocytów i komórek kory mózgowej otrzymanych z 17-dniowych zarodków szczurzych pokazuje, jak się spodziewano, że aktywność lucyferazy jest znacząco obniżona (o współczynnik 10) w komórkach astrocytów w przypadku konstruktów zawierających 6 lub 12 sekwencji NRSE (fig.SE). Oczekiwane jest również, że aktywność lucyferazy z trzech wcześniej wspomnianych konstruktów wirusowych jest porównywalna w komórkach kory (fig. 3F).

Wyniki te są szczególnie zaskakujące i na tyle znaczące, ponieważ pokazują że: (i) chimeryczne promotory według wynalazku są funkcjonalne w hodowlach pierwotnych, (ii) promotory są funkcjonalne w kontekście wirusa oraz (iii) aktywność represora jest większa w kontekście adenowirusa niż odpowiedniego wektora plazmidowego (cf. fig. 2 i 3).

A zatem, przykład ten pokazał, że konstrukty wirusowe zawierające chimeryczny promotor z sekwencją NRSE są funkcjonalne i pozwalają na ekspresję w komórce docelowych genów jedynie w komórkach nerwowych, jednocześnie bardzo znacząco zmniejszając ekspresję wspomnianego genu w komórkach nieneuronalnych.

5. Analiza funkcjonalna in vivo

Celem tego przykładu jest pokazanie, że konstrukty wirusowe, opisane w przykładzie 3, zawierające chimeryczne promotory z sekwencjami NRSE są funkcjonalne i umożliwiają kontrolę promotora in vivo.

W obliczu bardzo zachęcających wyników opisanych w przykładzie 4, aktywność konstruktów według wynalazku była testowana in vivo poprzez pomiar ekspresji lucyferazy po domięśniowej iniekcji (mięśnie języka i golenia) tych trzech rekombinowanych adenowirusów myszom.

5.1 Iniekcje do mięśni goleni

Każdy konstrukt adenowirusowy był wstrzykiwany w trzech etapach do prawego mięśnia goleniowego 7 myszy w dawce 2.10⁹ pfu/mięsień i objętości 30 pl. Zaszczepione mięśnie były usuwane 7 dni po iniekcji i rozdrabniane w 1 ml buforu celem określenia aktywności lucyferazy, wykonywanej w objętości 150 pl supernatantu. Średnie i błędy standardowe 7 otrzymanych wartości aktywności lucyferazy, odniesione do ilości białka są pokazane na figurze 5.

Wyniki te pokazują, że jeśli stosowane są rekombinowane adenowirusy Ad-6NRSE-PGK-Luc i Ad-12NRSE-PGK-Luc, ekspresja lucyferazy spada o 90 i 96% w tydzień po iniekcjach.

PL 198 201 B1

Ekspresja lucyferazy po domięśniowej iniekcji Ad-12NRSE-PGK-Luc i Ad-PGK-Luc była porównywana w myszach przez długi okres. Jeśli używany jest Ad-12NRSE-PGK-Luc aktywność lucyferazy spada w miesiąc (95%) i trzy miesiące (91%) po iniekcjach.

5.2 Iniekcja do mięśni języka

Wsteczny transport był używany celem porównania ekspresji dwóch konstruktów Ad-PGK-Luc i Ad-12NRSE-PGK-Luc w opuszce i mięśniach języka po domięśniowej iniekcji do mięśnia języka. W sposób porównywalny do otrzymanych już wyników aktywności lucyferazy dwóch konstruktów w układzie nerwowym są podobne w tydzień po podaniu (fig. 5B). Przeciwnie, aktywność lucyferazy spada o 90% w mięśniach, do których wstrzyknięto konstrukt Ad-12NRSE-PGK-Luc w porównaniu z mięśniami, do których wstrzyknięto konstrukt Ad-PGK-Luc (fig. 5A). Represja ta utrzymuje się na przestrzeni czasu i przez co najmniej 35 dni po zakażeniu. Co ciekawe, nawet jeśli poziom ekspresji jest niższy w 35 dniu niż ten otrzymany w 8 dni po zakażeniu, różnica ekspresji pomiędzy dwoma poprzednimi konstruktami wirusowymi pozostaje bardzo znacząca.

Po raz kolejny, wyniki te potwierdzają, że konstrukty według wynalazku funkcjonują in vivo oraz pokazują współczynnik represji nawet większy niż ten obserwowany in vitro po transfekcji plazmidami komórek nieneuronalnych.

Wyniki dodatkowo pokazują, że wysoki stopień wydajności konstruktów według wynalazku in vivo do kierowania ekspresją genu docelowego w komórkach neuronalnych. Zastosowanie tego podejścia w terapii genowej umożliwia ograniczenie ekspresji ektopowej docelowych transgenów oraz zapobiega efektom delecyjnym, które mogą potencjalnie pojawić się po dyfuzji transgenu w organizmie.

Bibliografia

[1] Mori N., Stein R., Sigmund O. and Anderson D.J. Neurone, 4: 583-594 (1990)

[2] Mori N., Schoenherr C., Vandenbergh D.J. and Anderson D.J. Neurone, 9: 45-54 (1992)

[3] Li L., Suzuki T., Mori N. and Greencard P. PNAS USA, 90: 1460-1464 (1993)

[4] Schoenherr C.J., Paquette A.J. and Anderson D.J. PNAS USA, 93: 9981-9886 (1996)

[5] Schoenherr C.J. and Anderson D.J. Science, 267: 1360-1363 (1995)

[6] McBurney, Sutherland, Adra, Leclair, Rudnicki, Jardine Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 20: 5755-5761 (1991)

[7] Moullier P., Marechal V., Danos O. and Heard J.M. Transplantation, 56: 427-432 (1993)

[8] McDonald R.J., Lukason M.J., Raabe O.G., Canfield D.R., Burr E.A., Kaplan J.M., Wadsworth S.C. and St George J.A. Hum. Gene Ther., 8: 411-422 (1997)

[9] Maue R.A., Kraner S.D.. Goodman R.H. and Mandel G. Neurone, 4: 223-231 (1990)

[10] Bessis A., Champtiaux N., Chatelin L. and Changeux J.P. PNAS USA, 94: 5906-5911 (1997).

LISTA SEKWENCJI (1) GŁÓWNE INFORMACJE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Aventis Pharma S.A.

(B) ULICA: 20 Avenue Raymond Aron (C) MIASTO: Antony (E) PAŃSTWO: Francja (F) KOD POCZTOWY: 92165 (H) TELEFAX: 01.55.71.72.91 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Rekombinowany kwas nukleinowy, wektor, defektywny wektor rekombinowany, komórka, zastosowania konstruktu, kompozycja, chimeryczne promotory (iii) LICZBA SEKWENCJI: 11 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) RODZAJ KOMPUTERA: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln wydanie 1.0, wersja 1.30 (OEB)

PL 198 201 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr 1: sekwencja motywu NRSE (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...261 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 1:

TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C 21 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr 2: sekwencja konsensusowa motywu NRSE (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 2:

TTCAGCACCA CGGACAGCGC C 21 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 3: sekwencja ogólna motywu NRSE (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 3:

NNCAGCACCN NGGANAGNNN C

PL 198 201 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 4:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 4:

TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C 21 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 5:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 5:

TTCAGCACCG CGGACAGTGC C 21 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 6:

TTCAGCACCT CGGACAGCAT C

PL 198 201 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr 7 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 7:

TTCAGCACCG CGGAGAGCGT C 21 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr 8 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 8:

TCCAGCACCG TGGACAGAGC C 21 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 9:

TTCAGCACCG AGGACGGCGG A

PL 198 201 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 10:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 10:

ATCAGCACCA CGGACAGCGG C 21 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 11:

TTCAGCACCT AGGACAGAGG C 21

Claims (35)

1. Rekombinowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że zawiera:

- rozpowszechniony promotor eukariotyczny

- jedną lub więcej sekwencji NRSE oraz

- gen terapeutyczny połączone w ten sposób, że gen terapeutyczny jest kontrolowany przez promotor i że aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE.

2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że jako promotor zawiera promotor genów konstytutywnie eksprymowanych (house-keeping).

3. Kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że jako promotor zawiera promotor wybrany spośród promotorów genów PGK, Efla,e-aktyny, wimentyny, aldolazy A lub a1-antytrypsyny.

4. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że jako promotor zawiera silny promotor.

5. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera od 1 do 20, a zwłaszcza od 3 do 15 sekwencji NRSE.

6. Kwas nukleinowy według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera 3, 6 lub 12 sekwencji NRSE.

7. Kwas nukleinowy według zastrz. 6, znamienny tym, że sekwencja NRSE zawiera całość lub część sekwencji SEQ ID nr 3, w której N oznacza A, G, C lub T.

PL 198 201 B1

8. Kwas nukleinowy według zastrz. 7, znamienny tym, że sekwencja NRSE wybrana jest z całości lub części sekwencji SEQ ID nr 1, 2 lub 4-11, bądź wariantów tych sekwencji.

9. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że zawiera ten sam motyw lub wariant motywu jak określono w zastrz. 9 albo 10, które to motywy są powtórzone kilka razy.

10. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja lub sekwencje NRSE są położone powyżej promotora.

11. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że jako gen terapeutyczny zawiera kwas nukleinowy zawierający otwartą ramkę odczytu kodującą RNA albo terapeutyczny lub szczepionkowy polipeptyd.

12. Kwas nukleinowy według zastrz. 11, znamienny tym, że jako gen terapeutyczny zawiera kwas nukleinowy obejmujący otwartą ramkę odczytu kodującą czynnik troficzny.

13. Kwas nukleinowy według zastrz. 11, znamienny tym, że jako gen terapeutyczny zawiera kwas nukleinowy obejmujący otwartą ramkę odczytu kodującą przeciwutleniacz.

14. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo do sekwencji NRSE zawiera elementy regulatorowe.

15. Kwas nukleinowy według zastrz. 14, znamienny tym, że jako element regulatorowy zawiera system operatora/represora tetracykliny.

16. Wektor, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz. 1.

17. Wektor według zastrz. 16, znamienny tym, że stanowi wektor wirusowy.

18. Defektywny wirus rekombinowany zawierający docelowy kwas nukleinowy pod kontrolą sekwencji ekspresyjnych, znamienny tym, że sekwencje ekspresyjne zawierają promotor i jedną lub więcej sekwencji NRSE.

19. Wirus według zastrz. 18, znamienny tym, że stanowi adenowirus.

20. Wirus według zastrz. 18, znamienny tym, że stanowi AAV.

21. Wirus według zastrz. 18, znamienny tym, że stanowi retrowirus.

22. Wirus według zastrz. 18, znamienny tym, że stanowi rhabdowirus.

23. Komórka, znamienna tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz. 1 lub wektor określony w zastrz. 16 lub wirus określony w zastrz. 18.

24. Komórka według zastrz. 23, znamienna tym, że stanowi ssaczą komórkę nerwową.

25. Zastosowanie konstruktu zawierającego:

- promotor

- jedną lub więcej sekwencji NRSE oraz

- kwas nukleinowy, połączone w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor a aktywność wspomnianego promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do przenoszenia docelowego kwasu nukleinowego i jego ekspresji w tkance lub komórce nerwowej.

26. Zastosowanie konstruktu zawierającego:

- promotor

- jedną lub więcej sekwencji NRSE oraz

- wspomniany kwas nukleinowy, połączone w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor a aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do leczenia chorób neuronów motorycznych, drogą domięśniową, kwasem nukleinowym w tkance lub komórce nerwowej.

27. Zastosowanie defektywnego wirusa rekombinowanego, zawierającego docelowy kwas nukleinowy pod kontrolą sekwencji ekspresyjnych zawierających promotor i jedną lub więcej sekwencji NRSE do transferu genu docelowego i jego ekspresji w komórkach nerwowych.

28. Zastosowanie wektora zawierającego konstrukt w którym:

- promotor

- jedną lub więcej sekwencji NRSE oraz

- wspomniany kwas nukleinowy, połączone są w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor a aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do przenoszenia docelowego kwasu nukleinowego i jego ekspresji w tkance lub komórce nerwowej.

PL 198 201 B1

29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że wektor jest wirusem.

30. Zastosowanie wektora zawierającego konstrukt w którym:

- promotor

- jedną lub wię cej sekwencji NRSE oraz

- wspomniany kwas nukleinowy, połączone są w ten sposób, że kwas nukleinowy jest kontrolowany przez promotor i że aktywność promotora jest kontrolowana przez sekwencję lub sekwencje NRSE, do wytwarzania kompozycji do leczenia chorób neuronów motorycznych, drogą domięśniową.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że wektor jest wirusem.

32. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz. 1 lub wektor określony w zastrz. 16 lub wirus określony w zastrz. 18.

33. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że ma postać do podawania domięśniowego, korzystnie drogą iniekcji.

34. Chimeryczny promotor, znamienny tym, że zawiera rozpowszechniony promotor i jedną lub więcej sekwencji NRSE.

35. Chimeryczny promotor xNRSE-PGK, w którym x oznacza liczbę od 1 do 50.