CZ300009B6 - Zpusob prípravy baccatinu - Google Patents
Zpusob prípravy baccatinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ300009B6 CZ300009B6 CZ20002723A CZ20002723A CZ300009B6 CZ 300009 B6 CZ300009 B6 CZ 300009B6 CZ 20002723 A CZ20002723 A CZ 20002723A CZ 20002723 A CZ20002723 A CZ 20002723A CZ 300009 B6 CZ300009 B6 CZ 300009B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- enzyme
- baccatin
- desacetylbaccatin
- iii
- acetyl
- Prior art date
Links
- 229930190007 Baccatin Natural products 0.000 title claims abstract description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 39
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims abstract description 22
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims abstract description 22
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims abstract description 22
- YWLXLRUDGLRYDR-ZHPRIASZSA-N 5beta,20-epoxy-1,7beta,10beta,13alpha-tetrahydroxy-9-oxotax-11-ene-2alpha,4alpha-diyl 4-acetate 2-benzoate Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](O)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-ZHPRIASZSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241001149649 Taxus wallichiana var. chinensis Species 0.000 claims abstract description 10
- 150000004579 taxol derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 claims abstract 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 22
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 21
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 20
- YWLXLRUDGLRYDR-SKXCCXORSA-N 10-dab iii Chemical group O([C@H]1C2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](O)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-SKXCCXORSA-N 0.000 claims description 13
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 13
- RAKDXBHPGCOTQG-SFPMZPPXSA-N 10beta-hydroxytaxa-4(20),11-diene-2alpha,5alpha,14beta-triyl triacetate Chemical compound O[C@H]1C[C@]2(C)CC[C@H](OC(C)=O)C(=C)[C@H]2[C@H](OC(C)=O)[C@@H]2[C@@H](OC(=O)C)CC(C)=C1C2(C)C RAKDXBHPGCOTQG-SFPMZPPXSA-N 0.000 claims description 12
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- -1 taxane compound Chemical class 0.000 claims description 7
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 241001116500 Taxus Species 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 claims 1
- YGTAAWZKDDQUQN-ZSJPKINUSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(3r)-4-[[3-(2-ethylsulfanylethylamino)-3-oxopropyl]amino]-3-hydroxy-2,2-dimethyl-4-oxobutyl] hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 YGTAAWZKDDQUQN-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 claims 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 claims 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 abstract 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 33
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 24
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 229930004057 10-desacetyltaxuyunnanin C Natural products 0.000 description 10
- OVMSOCFBDVBLFW-VHLOTGQHSA-N 5beta,20-epoxy-1,7beta,13alpha-trihydroxy-9-oxotax-11-ene-2alpha,4alpha,10beta-triyl 4,10-diacetate 2-benzoate Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@H](O)C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 OVMSOCFBDVBLFW-VHLOTGQHSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 9
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 229930014667 baccatin III Natural products 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical class C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 5
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-WZEPSTEZSA-N S-[2-[3-[[(2R)-4-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] (214C)ethanethioate Chemical compound C([14CH3])(=O)SCCNC(CCNC([C@@H](C(COP(OP(OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC1=2)O)OP(=O)(O)O)(=O)O)(=O)O)(C)C)O)=O)=O ZSLZBFCDCINBPY-WZEPSTEZSA-N 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- KFFHSFCOKCGBBW-VCPDXWRASA-N taxa-4(20),11-diene-2alpha,5alpha,10beta,14beta-tetrayl tetraacetate Chemical compound CC(=O)O[C@H]1C[C@]2(C)CC[C@H](OC(C)=O)C(=C)[C@H]2[C@H](OC(C)=O)[C@@H]2[C@@H](OC(=O)C)CC(C)=C1C2(C)C KFFHSFCOKCGBBW-VCPDXWRASA-N 0.000 description 4
- 229930002202 taxuyunnanin C Natural products 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 3
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 3
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 3
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 3
- TYLVGQKNNUHXIP-MHHARFCSSA-N 10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=4C=CC=CC=4)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 TYLVGQKNNUHXIP-MHHARFCSSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N Jasmonic Acid Methyl Ester Chemical compound CCC=CCC1C(CC(=O)OC)CCC1=O GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001116498 Taxus baccata Species 0.000 description 2
- 235000009065 Taxus cuspidata Nutrition 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- YWLXLRUDGLRYDR-UHFFFAOYSA-N 10-deacetylbaccatin Chemical compound CC(=O)OC12COC1CC(O)C(C(C(O)C1=C(C)C(O)CC3(O)C1(C)C)=O)(C)C2C3OC(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930184023 10-desacetyltaxuyunnanin Natural products 0.000 description 1
- LCWHWEDWAVZBLN-UHFFFAOYSA-N 4-(chloromethyl)-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical compound Cc1ncc(CO)c(CCl)c1O LCWHWEDWAVZBLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWLXLRUDGLRYDR-LUPIKGFISA-N 7-epi-10-deacetylbaccatin iii Chemical group O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](O)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-LUPIKGFISA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N D-sucrose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPTPYQSAVGGMFN-KQYNXXCUSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O YPTPYQSAVGGMFN-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-NJFSPNSNSA-N acetic acid Chemical compound [14CH3]C(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910001412 inorganic anion Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N inositol Chemical compound OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000002456 taxol group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
- C07D305/14—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Epoxy Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Zpusob prípravy baccatinu a/nebo baccatinových derivátu reakcí 10-desacetylbaccatinu nebo jeho derivátu s acetylovým donorem v prítomnosti enzymu, kterým je acetyltransferáza z Taxus chinensis o molekulové hmotnosti od 70 do 72 kD, stanoveno SDS-PAGE, s izoelektrickým bodem pri pH 5,4 až 5,8 a konstantou K.sub.M.n. Michaelise a Mentenové pro acetylkoenzym A 55 až 65 .mi.M. Zpusob izolace a prípravy enzymu, který uvedenou acetylacní reakci katalyzuje. Zpusob prípravy taxolu a/nebo taxolových derivátu acetylací desacetylbaccatinu nebo jeho derivátu a následnou esterifikací vzniklého baccatinu nebo jeho derivátu.
Description
Způsob přípravy baccatinu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy baccatinu a/nebo baccatinových derivátů selektivní acetylací odpovídajících desacetylsloučenin, izolovaného enzymu, který tuto acety lační reakci katalyzuje, jakož i. způsob přípravy tohoto enzymu.
10
Dosavadní stav techniky
Taxol (paclitacei) je slibný prostředek k léčení rakoviny, který vykazuje antileukemickou atumorinbihující aktivitu (viz například: Suffnes et al., in „The Alkaloids, Chemistry and is Pharmacology, A. Brossi, Hrsg. Academie press: Orlando, FL, 1985, Vol XXV, Kap i tel 1).
Původně se taxol získával z kůry určitého druhu (Taxus Taxaceae). Izolování taxolu z kůry je však obtížné i nákladné a získají se jenom velmi malé výtěžky žádaného taxolu z kůry (40 až 165 mg/kg) viz například: R. W. Miller et al,, J. Org. Chem. 46 (1981) 1469-1474; V Sénilh etal., J. nat. Procl. 47 (1984) 131 - 137; N. Magrí et al., J. Org. Chem. 51 (1986) 797 - 802).
Mimo to vede používání kůry k odumírání tisů, které rostou velmi pomalu, takže výchozí materiál je k dispozici jenom ve velmi omezeném rozsahu.
Po objevení vlastností taxolu, pro které se doporučuje jako chemoterapeutický prostředek proti rakovině, byla řada snah připravit ho syntetickým nebo polosyntetickým způsobem. Zkoušelo se tak připravit strukturu taxolu organickou syntézou (viz například. W. F. Berkowitz et al., J, Org.
Chem. 52 (1987) 1119-1124). Na základě složitosti této molekuly se však dodnes nepodařilo připravit taxol v prakticky použitelných množstvích úplnou organickou syntézou. Další cesta, která byla navržena, aby si získal taxol, vychází z částečné syntézy předchozí látky získatelné lehko a ve velkých množstvích. Jeden z těchto přístupů vychází z 10-desacetylbaccatinu III, který lze snadno a ve velkých výtěžcích extrahovat z listu Taxus baccata L (G. Chauviere et ak,
Seances Acad. Sci., Ser. 2, 1981, 293,- 501-503). Při tom je možné izolovat asi 1 g
10-desacetylbaccatinu ΠΊ na kg listů, přičemž listy rychle dorůstají. Tak může být získáno velké množství předchozího 10-desacetylbaccatinu III.
Z této předchozí sloučeniny získané z biologického materiálu se může potom parciální syntézou připravit žádaná účinná látka taxol. Avšak ukázalo se, že jakkoli se zdají struktury 10-desacetylbaccatinu III a taxolu podobné, tato parciální syntéza zahrnuje ještě velké obtíže a může být provedena úspěšně jenom za použití specifických chránících skupin, přičemž žádaný produkt’ taxol se nakonec získá v malých výtěžcích.
Denis et al., (J. Am. Chem. Soc. 110.(1988), 5917-5919) popisuje reakci 10-desacetylbaccatinu III na taxol ve dvou krocích. V prvním kroku se acetyluje 10-desacetylbaccatin III chemicky v poloze 10. Ve druhém kroku se provádí převedení baccatinu na taxol. První krok však není regiospecifický, takže acetylace 10-desacetylbaccatinu III probíhá zejména také do polohy 7. Je tudíž nutné hydroxyskupinu v této poloze pro acetylaci znepřístupni chránící skupinou. Pouze za použití chránící skupiny mohlo být dosaženo acetylování v poloze 10. Použití chránící skupiny však zahrnuje dva další kroky postupu (připojení a odstranění chránící skupiny), což je jednak nákladné a. jednak jsou výtěžky produktů podstatně sníženy. Další nevýhoda při použití chránících skupin spočívá v tom, že zejména aplikace produktu jako farmaceutické účinné látky musí mít dále zařazeny nákladné čisticí a analytické metody, aby byla jistota, že se v produktu již nenachází žádná molekula opatřená chránící skupinou.
Zocher et al. (Biochem. Biophys, Res. Commun., 299 (1996), 16-20) popisují biosyntézu taxolu. V mezikroku byla přitom provedena acetylace 10-desacetylbaccatinu III na baccatin III pomocí surových rostlinných extraktů z kořenů Taxus baccata. Nepodařilo se však izolovat substance,
-1CZ 300009 Bó které způsobuji acetylací, neboje charakterizovat. Nevýhodou při použití surového extraktu je skutečnost, že další četné reakce, zejména acetylace do dalších poloh, mohou být vyvolány nebo ovlivněny rovněž látkami existujícími v surovém extraktu. Dále rostlinný extrakt nevykazuje žádné definované a reprodukovatelné složení, takže použiti surových rostlinných extraktů vede k nekontrolovatelným a rozmanitým reakcí, a výtěžkům.
Úkolem předkládaného vynálezu bylo proto dát k dispozici způsob, kterým může být připraven baccatin a baccatinu podobné baccatinové deriváty selektivní acetylací odpovídajících 10-desacetyl sloučenin v poloze 10. Další úloha spočívá v tom, dát k dispozici izolovanou látku, io která tuto reakci specificky katalyzuje.
Podstata vynálezu
Tyto úkoly se podle vynálezu řeší způsobem přípravy baccatinu nebo baccatinových derivátů, vyznačujícím se tím, že 10-desacetylbaccatin nebo 10-desacetylbaccatinový derivát reaguje v přítomnosti izolovaného enzymu a acetylového donoru, přičemž jako enzym se používá acetyltransferáza a molekulové hmotnosti od 70 do 72 kD, stanovené SDS-PAGE (natři um-dodecylsulfát-polyakrylamid-gelovou elektroforézou), která se získá z buněčné kultury Taxus Chnensis.
Bylo zjištěno, že regioselektivní acetylace v poloze 10 je katalyzována izolovaným enzymem, který může být získán z buněčné kultury Taxud cbinensis.
Překvapivě bylo zjištěno, že za použití izolovaného a vyčištěného enzymu může být obdržena vysoká regiospecifíta co se týče acetylace v poloze 10. Tato specifita je preferována > 80 %, více preferována > 90 % a nejvíce preferována > 95 %. Bylo zjištěno, že použitý enzym může získat specifitu > 99 %. Specifita > 80 % přitom znamená, že acetylace se konala na více jak 80 % v poloze 10 a méně než 20% v jiných polohách výchozí sloučeniny. Následkem toho další hydroxylové skupiny, které existují ve výchozí látce, nemůže být blokovány chrániči skupinou, protože acetylace těchto dalších hydroxyskupin při použití enzymu podle vynálezu se nevyskytu30 je, nebo existuje jen ve velmi malém rozsahu,
Překvapivě bylo zjištěno, že enzym použitý podle vynálezu vykazuje vysokou substrátovou specifitu. Tak byly podrobeny reakci jenom 10-desacetylbaccatin respektive deriváty 10-desacetylbaccatinu, které v poloze C 10 a jejím okolí vykazují konfiguraci podobnou 10-desacetyl35 baccatinu III. Zejména nebyly acetylovány deriváty baccatinu, u nichž je blokován přístup k poloze 10 prostorově náročnými substráty, jako možná 10-desacetyltaxol a 10-desacetylcefalomannin. Předpokladem pro to, aby byl derivát baccatinu rozpoznán enzymem podle vynálezu, je tudíž, aby tyto deriváty, které vykazují cyklickou strukturu taxanu, v polohách 7, 8, 9,10, 11, 12 a 13 v podstatě odpovídají 10~desacetylbaccatinu III, to znamená neměly v této poloze žádné jiné substituenty nebo pouze substituenty, které mají malý objem. S výhodou se tento působ hodí pro baccatinové deriváty, které mají v poloze 7 až 13 stejné substituenty jako 10desacetylbaccatinu III nebo alespoň zčásti substituenty s menším objemem než substituenty 10desacetylbaccatinu III, obzvláště vodík. Objemné substituenty v ostatních polohách reakci neruší. Zvláště výhodně se způsob používá kacetylaci 10-desacetylbaccatinu III. Dále se způsob obzvláště používá k selektivní acetylací 14-hydroxy-l 0-desacetylbaccatinu III v poloze 10.
Naproti tomu se deriváty 10-desacetylbaccatinu III, jejichž hydroxylové skupiny jsou v poloze 7 blokovány objemnou skupinou, je třeba 7-TEC-10-DAB-III nebo 7-BOC-l O-DAB-ΙΠ, nejsou enzymem podle vynálezu jako substrát rozeznány. Takové blokování však není nutné, protože regioselektivní acetylace v poloze 10 probíhá také při existenci dalších hydroxyskupin v jiných polohách.
Způsobem podle vynálezu je možné acetylovat taxanové deriváty selektivně v poloze 10, a to takové, které mají stejné, menší nebo méně objemné substituenty v polohách 7 až 13 nebo
10-desacetylbaccatinu III. Takové taxanové deriváty, u nichž jsou substituenty existující
-2CZ 300009 B6 v 1O-desacetylbaccatinu ITI (to je OH v poloze 7, CH3 v poloze 8, =0 v poloze 9, OH v poloze
10, CH3 v poloze 12 a OH v poloze 13) nebo jsou nahrazeny podobně objemným nebo menším zbytkem, zejména vodíkem, spadají pod pojem deriváty 10-desacetylbaccatinu a mohou být rovněž regiospecificky acetylovány, pokud vykazují v poloze 10 skupinu OH, Příklady takových derivátů jsou 10-desacetyltaxuyunnanin-C, 10,14-desacetyltaxuynnanin-C, 2,10,14-desacetyltaxuyannanin-C, 5,10,14-desacetyitaxuyunnanin-C a 2, 5,10,14-desacetyltaxuyunnanin-C.
S výhodou se způsob podle vynálezu připravuje baccatin-III z 10-desacetylbaccatinu III, 14-hydrobaccatin ΪΙΙ z 14-hydroxy-l 0-desacetylbaccatinu III, nebo taxuynnanin C z 10-desi o acetyltaxuynnaninu C.
Způsob podle vynálezu se provádí v přítomnosti acetyldonoru. Jako acetyldonor se v podstatě hodí každá substance, která má při katalytické reakci k dispozici acetylskupinu. S výhodou se provádí reakce v přítomnosti acetylkoenzymu A jako acetyldonoru.
Použití isolovaného enzymu podle vynálezu nabízí technicky mnoho předností. Reakci lze zejména s ohledem na reakční rychlost a reprodukovatelnost při použití izolovaného enzymu snadno kontrolovat.
Výhodný je izoelektrický bod pH 5,4 až 5,8, s výhodou 5,5 až 5,7 a zvláště výhodně pH 5,6. Dále bylo zjištěno, že enzym použitý podle vynálezu vykazuje konstantu Michaelise a Mentenové KM pro acetylkoenzym A 55 až 65 μΜ, š výhodou 59 až 63 μΜ a zvláště výhodně 61 μΜ.
Dalším předmětem vynálezu je izolovaný enzym, vyznačující se tím, že ' '
a) 10-desacetylbaccatin-III acetyluje za přítomnosti acetyldonoru, zejména acetylkoenzymu A v poloze 10 selektivně
b) vykazuje molekulovou hmotnost 70 až 72 kD, stanovenou SPD-PAGE a
c) získá se z buněčné kultury Taxus chinensis.
Enzym podle vynálezu je v čistotě > 50 %, obzvláště > 80 % a výhodněji > 90 % a nejvýhodněji > 95 %. Enzym podle vynálezu se vyznačuje tím, že 10-desacetylbaccatin-III v přítomnosti acetyldonoru, zejména acetyl-CoA selektivně acetyluje v poloze 10. To znamená, že acetylace zbylých hydroxyskupin 10-desacetylbaccatinu III se v polohách 1,7 a 13 prakticky nepozoruje. Acetylaění reakce vykazuje zejména selektivitu > 50 % pokud jde o polohu 10, s výhodou >80%, výhodněji > 90%' a nejvýhodněji > 95%. Izolovaný enzym je dále charakterizován molekulovou hmotností 70 až 72 kD, stanovenou SDS-PAGE. Pro stanovení molekulových hmotností byly chromatografovány 0,3 pg homogenního proteinu v 10% denaturovaném SDS-gelu paralelně s markerovým proteinem o známé molekulové hmotnosti (markér Rainbow). Barvení stříbrem byly proteiny zviditelněny, přičemž molekulová hmotnost byla určena srovnáním hodnot Rf kalibračního proteinu a enzymu podle vynálezu. Gelovou SDS-kalibračního proteinu a enzymu podle vynálezu. Gelovou SDS-elektroforézou stanovená molekulová hmot45 nost byla potvrzena gelovou filtrací na vhodném gelovém filtračním sloupci. Gelová filtrace se prováděla na sloupci Biosilect-SEC 250-5 (Biorad) ekvilibrovaném 50 mM Tris, pH 8,5,20 mM 2-merkaptoethanolu v zařízení FPLD (BioLogic Workstation, Biorad), a sice při průtokové rychlosti 0,2 ml/min. Přitom byl sloupec nejprve kalibrován proteiny o známé molekulové hmotnosti. Za identických podmínek se sloupcem vedlo 50 pg proteinu podle vynálezu. Eluát byl shromážděn ve frakcích po 250 μΐ a byla určována aktivita eluátu, jak je popsáno níže. Molekulová hmotnost byla získána porovnáním s elučními dobami známých standardů.
Enzym podle vynálezu může být izolován z buněčné kultury Taxus chinensis. Vykazuje izoelektrický bod při pH 54 až 5,8, s výhodou při pH 5,5 až 5,7 a zejména pHa 5,4 až 5,8, s výho'-'3CZ 300009 B6 dou při pH 5,5 až 5,7 a zejména pH 5,6. Dále vykazuje konstantu KM Michaelise-Mentenové pro acetylkoenzym A 55 až 65 μΜ, s výhodou 59 až 63 μΜ, a obzvláště 61 μΜ.
U enzymu podle vynálezu se jedná o acetyl transferázu, zejména o acety 1-CoA-i O-hydroxy5 taxan-O-acetyltransferázu.
Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy výše popsaného enzymu, vyznačující se tím, že enzym izoluje ze zdroje obsahujícího enzym, přičemž se používají, známé metody čištění, a po každém čištění se určují frakce, ve kterých se enzym vyskytuje tím, že se přidá 10-desacetylio baccatin nebo derivát 10-desacetylbaecatinu a acetyl-donor a dokazuje se vytvořený produkt acetyl ace.
Jako zdroj obsahující enzym se může použít například rostlinný extrakt. Jako enzym obsahující zdroj se s výhodou používá buněčná kultura, zejména suspenzní buněčná kultura. Použití buněč15 né kultury je výhodné proto, poněvadž mohou být získána velká množství výchozího materiálu.
Ve srovnání s použitím surového extraktu jako zdroje obsahujícího enzym je při použití buněčné kultury na základě velkého množství výchozího materiálu možné vyčistit enzym do vysoké čistoty. Zvláště výhodný je výchozí materiál pocházející zTaxus chinensis, například buněčná kultura z Tonus chinensis. K čištění enzymu z výchozího materiálu mohou být k získání enzymů respektive proteinů použity známé metody čištění. S výhodou se používá srážení síranem amonným ze surového extraktu jakož i chromatografické metody čistění, jako použití sloupce Sephadexu G-25, aniontoměničové chromatografie například na DEAE-Sephacelu, gelové filtrace například na Ultrogelu AcA 44, aniontoměničové chromatografie například na HighQ, sloupcové chromatografie s hydroxyapatitem, barevné afinitní chromatografie například na High
Trap Blue, hydrofobní interakční chromatografie například na Phenylsepharose a/nebo barevné afinitní chromatografie například na Mimetic-Grun 1A6XL. S výhodou zahrnuje čištění alespoň jeden krok za použití aniontoměničové chromatografie na HighQ. Sloupec HighQ je měnič an iontů se skupina -N(CH3)3 jako ligandy. Bylo zjištěno, že zejména tímto krokem čištění lze odstranit látky, které katalyzují acetylaci v jiných polohách než v poloze 10.
30
Při postupu podle vynálezu se po každém kroku čištění stanovuje enzymová aktivita frakcí, aby se zjistilo, ve kterých frakcích se enzym nachází. Ktomu se podrobí reakci s acetyldonorem frakce respektive část frakce s 10-desacetylbaccatinem nebo derivátem 10-desacetylbaccatinu, jak byl výše definován. Ve frakcích, v nichž je žádaný enzym, se může dokazovat produkt acetylovaný v poloze 10. Pro tento důkaz se s výhodou používá 10-desacetyíbaccatin-III nebo 10-desacetyltaxuyunannin-C. Důkaz vytvořeného acetylovaného produktu lze získat použitím vhodných značkovaných skupin ve výchozích substancích. S výhodou se používá značkovaného acetyldonoru.'· Takový označkovaný acetyldoňóř Zahrnuje'značkovanou acetýlóvou skupinu, s jejíž pomocí potom může být určen produkt acetylovaný v poloze 10. S výhodou se používá radioaktivně značkovaný acetýldonor. Vhodné radioaktivní markerové skupiny jsou při tom t3C a 14C. Zvláště výhodně se jako acetýldonor používá acetylkoenzym A, zejména [2-,4C]-acetylkoenzym A.
Důkaz je také možné provést značkováním těžkým izotopem. V tom případě se může reakční produkt určit pomocí hmotnostní spektrometrie.
Způsobem přípravy baccatinu nebo derivátů baccatinu podle vynálezu za použití enzymu podle vynálezu je možné připravit sloučeniny baccatinu respektive taxanu specificky acetylované v poloze 10. O takové sloučeniny je zájem zejména jako o výchozí substance pro parciální synté50 zu taxolu. Dalším předmětem vynálezu je .proto způsob přípravy taxolu a/nebo derivátů taxolu, vyznačující se tím, že baccatin nebo deriváty baccatinu, které byly připraveny shora popsaným způsobem, mohou být známou reakcí převedeny na taxol respektive deriváty taxolu. Praciální reakce baccatinu respektive baccatinových derivátů na taxol, respektive deriváty taxolu je podle stavu techniky známa a popsána a zahrnuje v principu přivedení vhodných substituentů
-4CZ 300009 B6 k hydroxylové skupině v poloze 13 baccatinového derivátu. Vhodným způsobem použité baccatinové deriváty vykazují proto minimálně v poloze 13 volnou skupinu OH.
Reakce přeměny baccatinových derivátů na taxol respektive deriváty taxolu se provádí 5 esterifíkací skupin OH v poloze 13 baccatinového derivátu vhodnou kyselinou. Takové postupy jsou v literatuře podrobně popsány, například v patentu US 4 814 470 (Colin et ai.), v patentu
US Re. 34 277 (Denis et al.), v EP 0 400 971 A2, v patentu US 4 924 011 (Denis et al.), v patentu US 5 476 954 (Bourzat et al.) jakož i Denis et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5917-5919.
io Pro znázornění jsou dále uvedeny strukturní vzorce baccatinu-III a paclitaxel u:
paclitaxel Rt = COC6H3; R2 = CH3CO 15 Vynález bude dále osvětlen následujícími příklady.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kultivace suspenzní buněčné kultury z Taxus chinensis
Byly použity suspenzní buněčné kultury z Taxus chinensis ze sbírky ústavu „Institut fur Pharzazeutischer Biologie der Universtát Můnchen“, které původně pocházejí z jehličí stromu T. chinensis (tis čínský). Kultury se ponechaly růst 14 dní při 24 °C, 100 U/min a 1500 lux. Potom se přeneslo 150 ml buněčné suspenze sterilní 50 ml pipetou do 250 ml média B5+ 1:
-5CZ 300009 B6
Složení média B5+1 (modifikovaného podle Gambora, Millera a Ojimy: Experimental Research,
1968,50, 151-158).
Kyselina naftylová 10 μΜ benzylaminopurin T’ 0,2 μΜ mg/l
NaH2PO4.H2O 150 io CaCl2.2H2O 150 (NH4)2SO4 134
MgSO4.7H2O 250
KNO3 2500
FeSO4.7H2O 25,6
Na2EDTA.2H2O 34,27
KJ ’ 0,75
MnSO4.H2O 10
H3BO3 3
ZnSO4.7H2O 3
Na2MO4,2H2O 0,25
CuSO4.5H2O 0,25
CoC12,6H2O 0,25 kyselina nikotinová 1 thiaminiumchlorid 10 pyridoxylhydrochlorid 1 meso-inosit 1000
D(+)sacharóza 20000 pH 5,6
NZ-aminy 1000
NZ-aminy byly přidávány k médiu po autoklávování a ochlazení za sterilních podmínek jako sterilní zásobní roztok (10 g/l)
Třetí den po tomto preočkování se přidalo 30 μΜ methy ljasmonátu (firmy Serva) a kultura se 35 nechala růst další 4 dny (Grundlach,. H., Muller, M. J., Kutchan, T.M., Zenk, M.H., 1992, Proč.
Nati. Acad. Sci. USA 89, 2389-2393). Potom se buňky oddělily od média vakuovou filtrací a po šokovém vymrazení kapalným dusíkem se použily pro vyloučení enzymu. Při -20 °C mohly být ' ale také skladovány až dó jednoho měsíce, potom aktivita hledaného enzymu silně poklesla.
Příklad 2 40
Enzymový test k určení aktivity acety Itransferázy
Pro to, aby se enzym mohl vyčistit, charakterizovat a dokázat, je nezbytným předpokladem dostupnost přesných a dostatečně citlivých testovacích metod. Zde to bylo zjišťování vytvořeného produktu, například taxuyunnaninu C z 10-desacetyltaxuyunnaninu, pro což byla vyvinuta jednoduše proveditelná a spolehlivá metoda.
Dostatečné množství testovaného roztoku enzymu bylo připipetováno k 50 μΐ pufru Tris (0,8 M, pH 8,5) v nádobkách Eppendorf. Potom se přidalo 30 μΐ vyčištěného acetyl-CoA (5 nmol so neznačeného a a0,02 pCi-[2-,4C]acetylkoenzymu-A) a 15 nmol základního, v DMSO rozpuštěného, 3 mM roztoku 10-desacetyltaxuyunnaninu C, při kontrole místo tohoto taxanu jen odpovídající množství DMSO. Po 3 minutové inkubaci při 35 °C byla usazenina okyselena 20 μΐ 12 %
H2SO4, vytvořený taxuyunnanin C byl vytřepán (10 minut dnem vzhůru na třepačce) s 600 μΐ
-6CZ 300009 B6 tert-butylmethyletherem a usazenina se potom centrifugovala (4 minuty 14000 U/mín, centrifuga
Eppendorf). Ještě existující nerozložený [2- 14C] acetyl-CoA zůstal ve vodné fázi. 500 μΙ organické fáze bylo po probublávání vzduchem zahuštěno dosucha, čímž mohla být rovněž odstraněna eventuálně přítomná [2—14C] kyselina octová, která byla přítomna po předchozím okyselení jako těkavá kyselina. Pomocí scintilačního čítače (Multiple Purpose Scintillation Counter LS 6500, firma Beckniann) nebo řadioscanneru pro tenké vrstvy (Automatic TLC Linear Analyzer, firma Berthold) byl určen druh a množství vytvořeného produktu. Tento první se použil, aby se s načtenými hodnotami cpm zjistila přeměna a tím i aktivita enzymů. Pomocí chromatografie na tenké vrstvě (DC) (LM: chloroform; acetonitril 7:3) a následným vyhodnocením
W radioscannerem se mohlo přezkoušet, zda-li radioaktivita změřená scintilaěním čítačem skutečně také odpovídá píku ve výšce hodnoty Rf očekávaného produktu.
Příklad 3
Čištění acetyltransferázy
3.1. Získávání tkáňové kultury a odsolení na Sephadexu G25
K získávání surového extraktu proteinu byla použita sedm dní stará suspenzní kultura, která byla získána třetího dne po přeočkování s 30 μΜ MeJA. 200 gramů čerstvě odsátých buněk bylo vymraženo kapalným dusíkem. V hmoždíři chlazeném ledem byla potom buňky smíchány s 20 gramy PVPP a s 400 ml standardního pufru A (lOOmM kyseliny borité/NaOH, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-nmerkaptoethanolu) a za míchání ponechány roztát. PVPP váže část fenolů, rušících v dalším kroku čištění, mimo jiné tříslovin obsažených v extraktu. Homogenní buněčná kaše byla potom přes čtyřikrát přeložený mul filtrována a vylisována šťáva centrifugována při 15000 x g (10 minut, rotor SS34). Leden chlazený zůstatek byl smíchán s50m1 kalciumfosfátového gelu suspendovaného ve standardním pufru A (100 mM kyseliny borité/NaOH, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu), Objemový údaj udává množství gelu, které se obdrží po deseti minutové centrifugací při 2500 U/min a odpovídají 1,9 gramům TG Ca3(PO4)2. Tato směs se ponechá 10 minut v ledové chladicí lázni za občasného míchání stát. Během této doby by se měly na gel adsorbovat průvodní látky, jako například třísloviny obsažené ve velkých množství, Acetyltransferáza zůstala v roztoku a mohla být následnou centrifugací (6.000 x g, 5 min, rotor GSA) oddělena od gelového materiálu.
Potom byl jako peleta přítomný gel ještě jednou zachycován v 75 ml standardního pufru A, míchán 5 minut skleněnou tyčinkou a ještě jednou centrifugován 5 minut při 6000 U/min (rotor GSA), aby se část acetyltransferázy adsorbovala na gel a tímto následným zpracováním se dostala do přebytku. Bez použití kalciumfosfátového gelu se vyskytovaly v dalším kroku čištění velké potíže, protože dosud obsažené průvodní látky velmi rychle ucpávaly membránu míchané kyvety a potom zabarvovaly použité sloupce tmavohnědé a tím rychle snižovaly jejich vazební kapacity.
Vyčištěný ledem chlazení zůstatek byl za pomalého míchání po částech podroben reakci s amonium sulfátem až do 70 % nasycení a po úplném přidáním ještě dalších 30 minut pomalu míchán. Potom mohl být vypadnutý protein peíetován při 15.000 U/min (10 min, rotot SS34). Sraženina byla opatrně resuspendována v 30 ml standardního pufru B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu) a roztok byl vysolen za použití tohoto pufru pomocí sloupce Sephadexu G25 (Pharmacia; 2,7 0 x 7 cm), přičemž současně bylo odděleno 60 % cizího pro tejnu.
[G25-eluát: 82 ml, 78 mg protienu]
3.2. Aniontoměničová chromatografie na Sephacelu DEAE
-7CZ 300009 B6
U Sephacelu DEAE se jedná o modifikovanou celulózu, na kterou jsou vázány kladně nabité diethylaminoethylové zbytky. Je-li izoelektrický bod rozpuštěných proteinů kyselejší než použitý pufr, existují jako anionty, a mohou být tudíž vázány na kladně nabitý materiál sloupce.
Přídavkem silnějších an iontů, jako například Cf nebo SO?“, se zeslabuje elektrostatická inter5 akce adsorbovaného proteinu a skupin DEAE. Následkem toho se anionty proteinů vymění za anorganické anionty a enzym se tak eluuje.
Tímto krokem čištění bylo odděleno 24,4 % cizího proteinu jakož i zejména průvodní látky obsahující fenol, mimo jiné třísloviny. Materiál sloupce se barvil už pri prvním použití silně io hnědě, mohl však být čištěn TM NaOH. Znečištění sloupců, které mohou být později použity v čisticím procesu, mohlo být tímto krokem značně redukováno.
Průběh sloupce DEAE (2,5 cm 0 x 5 cm) včetně 30 ml standardního pufru B (50 mM, Tris/HCI, pH 8,5,20 % glycerinu, 20 mM 2-mertkaptoetbanolu), který byl sloupec promýván, byl zahuštěn tlakovou filtrací v míchané kývete (Amicon, 400 ml, membrána PM10) na 5 ml.
[DEAE eluát: 110 ml, 59 mg proteinu]
3.3 Gelová filtrace na Ultrogenu AcA 44
Princip gelové filtrace spočívá v tom, že makromolekuly, jako například proteiny, jsou distribuovány v závislosti na jejich velikosti a tvaru do matrice pórů definované velikosti (nabírací objemy) a do okolního kapalného prostoru. Molekuly, které jsou příliš velké, aby se mohly dostat do pórů gelu, putují okolo částic a jsou tak rychleji eluovány než středně velké proteiny, které jsou nejdříve z pórů retardovány, aniž by se do nich dostaly. Ještě menší molekuly, mimo jiné ionty solí, se dostávají nejprve do pórů, které opouštějí teprve po určité době prodlení, pročež zůstávají na sloupci nejdéle.
Tato technika je velmi šetrná, poněvadž se nevyskytují prakticky žádné interakce mezi mate30 riálem a proteinem a nemusí se užívat žádné speciální pufry. Mimo to se provádí úplné odsolení eluátu, poněvadž menší ionty, v tomto případě sulfátové ionty, setrvávají na sloupci mnohem déle než aktivní protein.
Byl používán polyakrylamid-agarózový gel, pro který se udává frakcionační oblast 10-130 kD (Ultrogel AcA 44 firmy Serva).
Zahuštěný roztok proteinu byl přes noc rozdělen na ekvilibrovaném sloupci (2,8 cm 0 x 100 cm) se standardním pufrem B rychlostí 20 ml/h. 60 frakcí (á 6,5 ml) bylo testováno na obsah proteinu a aktivitu acetyltransferázy. Frakce s hlavní aktivitou byly spojeny a dále čištěny.
S tímto eluátem lze měřit specifickou aktivitu acetyltransferázy. Chromatogram na tenké vrstvě vykazoval kromě významného píku při nižší hodnotě Rf také pík ve výšce hodnoty taxuyunnaninu C. [AcA-eluát: 53 ml, 25,7 mg, celková aktivita 724 pkat byla použita jako 100%]. Touto gelovou filtrací bylo separováno 57 % cizího proteinu.
3.4. Aniontoměničová chromatografie na HighQ Stejně jako sloupec DEAE je také sloupec HighQ, který obsahuje skupinu N+(CH3)3 jako ligandy, aniontoměnič, v protikladu k prvnímu však silnější, to znamená, že se nemění v široké oblasti pH jeho ionizační stav. U slabých iontoměničů při různých hodnotách pH značně kolísá stupeň disociace a tudíž i výměnná kapacita. Protože materiál sloupců HighQ sestává z hustě uložených cca 10 μπι malých částic pryskyřice a z toho vyplývá i vyšší protitlak, musí se provozovat na FPLC-zařízení (firmy Biorad).
-8CZ 300009 B6
Odsolený AcA-eluát (53 ml) byl čerpán průtokovou rychlostí 2 ml/min na připravený sloupec ml HighW ekvilibrovaný standardním pufrem B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 02 % glycerinu, mM 2-merkaptoethanolu) a tento sloupec se také tímto pufrem následně promýval.
V bezbarvém průtoku se nacházela část inaktivního proteinu, s 0,07 M KC1 ve standardním pufru
B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM^ 2-merkaptoethanolu) byl odstraněn další cizí protein a žluté průvodní látky. Při dalším stupni gradientu, 0,14 M KC1 v standardním pufru B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu), byl eluován aktivní protein a vedle toho také žluté průvodní látky. Také eluát získaný s 1 M KC1 ve standardním pufru B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu) byl žlutě io zabarven a obsahoval 1/3 naneseného proteinu, avšak bez aktivity acetyí transferázy. Tímto posledním krokem se sloupec současně regeneroval.
Velká výhoda tohoto kroku čištění spočívala v tom, že velké objemy AcA-eluátu mohly být iychle a šetrně zahuštěny na 4 ml (4 frakce á 1 ml).
Gradient: Doba (min) 1 ml KC1 v standardním pufru B (%)
| 0 | 0 |
| 35 | 0 |
| 35 | 7 |
| 45 | 7 |
| 45 | 14 |
| 55 | 14 |
| 55 | 100 |
| 70 | 100 |
[Eluát High-Q: 4 ml 8,8 mg proteinu, 796 pkat]
3.5 Hydroxyapatit
Byl použit sloupec CHT II (firma Biorad), který byl plněn sférickými částicemi hydroxyapatitu, [Ca5(PO4)3OH]2. Negativně nabité proteiny se mohou v přítomnosti nízkomolámího fosfátového pufru nejprve vázat na kationty Ca2+ a potom mohou být vytěsněny vyššími koncentracemi fosfátů do elučního pufru.
Zásadité proteiny s vysokým pí mají vyšší afinitu k materiálu sloupce než ty s nižším pl. Struktura hydroxyapatitu s Ca2+ ionty v kladně nabitých centrech a PO43- v negativně nabitých, má za následek smíšenou iontoměniěovou separaci. HighQ-eluát byl čerpán rychlostí 0,5 ml/min na sloupec CHT II (5 ml) ekvilibrovaný fosfátovým pufrem (10 mM Na2PO4, pH 6,8, 20% glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu) a promýván 12 ml tohoto pufru. Eluce aktivního proteinu se prováděla se 160 ml fosfátového pufru (20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanoíu). Také při dalším zvýšení koncentrace fosfátu na 400 mM nemohl být eluován další protein.
Gradient: Doba (min) 160 mM fosfátového pufru (%)
0
40 0
100
100
Zachycené frakce 0,5 ml byly zkoušeny na obsah proteinu a aktivitu acety (transferázy.
[CHT II—eluát; 1,5 ml, 0,73 mg proteinu, 578 pkat]
Tímto krokem čištění bylo docíleno faktoru obohacení 8,7 oproti HighQ-eluátu, přičemž při 92 % separací cizího proteinu byla zaznamenána ztráta aktivity 27 %.
-9CZ 300009 B6
3.6. Barevná afinitní chromatografíe na High Trap Blue
HiTrapBlue 1 ml (firma Pharmacia) obsahuje syntetickou polycyklickou barevnou látku Cibacron Blue F3G-A, která je připojena na agarózovou matrici. Tyto ligandy vykazují určitou strukturní podobnost s přirozeně se vyskytujícími molekulami, jako kofaktory NAD+a NADP+, což jim umožňuje vázat pevně a specificky proteiny, kromě jiného enzymy, které potřebují substance obsahující adenylát. Sloupcový materiál se proto označuje za „skupinospecifický“ Specifíta je však relativizována tím, že až dosud katalogizované enzymy potřebují přibližně třetinu koenzymu, který obsahuje nukleotidovou komponentu. Proto se mohou proteiny vázat na aromatické io ligandy také specificky elektrostatickými a/nebo hydrofobními interakcemi.
Eluce se provádí specificky s příslušným kofaktorem nebo nespecificky s roztoky solí.
Acetyltransferáza, která váže acetyl-CoA obsahující fosfoadenosyldifosfát, se adsorbovala na modrý sloupcový materiál a byla nespecificky eluována s lineárním KCl-gradientem. K tomu se . nanášel CHT II—eluát na sloupci HigH Trap Blue ekvi libro váném standardním pufrem B zařízením FPLC (firmy Bíorad) průtokovou rychlostí 0,5 ml/min a tímto pufrem se následně promýval. Eluce proteinu vázaného na sloupec se prováděla při 0,5 ml/min s lineárním solným gradientem 0-1 M KCl ve standardním pufru B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% glycerinu,
20 mM 2-merkaptoethanolu) po dobu 30 min.
Gradient: Doba (min) 1 M KCl standardního pufru B (%)
0
0
60 1 00
Veiikost frakce činila 0,5 ml. Získané frakce, které vykazovaly aktivitu, byly spojeny.
[High Trap Blue eluát: 1,5 ml, 0,05 mg proteinu, 168 pkat]
Oproti CHT H-sloupci mohlo být tímto krokem čištění docíleno faktoru obohacení 4,2. Při 93 % separací cizího proteinu byla zaznamenána ztráta celkové aktivity 71 %,
3.7 Hydrofobní interakční chromatografíe na Phenylsepharose
Přidají—li se k proteinům rozpouštěným ve vodném prostředí určité neutrální sole, jako například (NFLiÉSOí. nebo KCl, zvýší se iontová síla roztoku. Za těchto podmínek spolu asociují hydrofobní oblastiJ na povrchu-proteinů. Právě tak se adsorbují také ha' materiálech1 sloupců s hydrofobními ligandy, čímž dochází k hydrofobním interakcím - (HIC = Hydrophobic Inter40 actions Chromatography). Ty se potom mohou opět vymýt, přičemž se používá eluční pufr s nižší koncentrací soli. Tento čisticí princip potom vyžadoval nastavit High Trap Blue eluát na koncentraci 0,5 M síranu amonného. To se provedlo velmi pomalým přidáváním po částech . odpovídajícího množství ledem chlazeného roztoku 1 M síranu amonného ve standardním pufru B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu). Potom se nanesl roztok proteinu na minisloupec (1 cm 0 x 1,3 cm) ekvilibrovaný 0,5 M (NH.J^SO^ve standardním pufru B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu). Po jeho proniknutí do gelového lože (Phenylsepharose firmy Pharmacia) se promývá se 7 ml 0,5 M (NH4)2SO4 ve standardním pufru B (50 mM Tris/HLC, pH 8,5, 20% glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu). K eluei vázaného proteinu se používá 0,1 M (NH4)SO4 ve standardním pufru (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu). Eluát se sbírá ve frakcích po 0,5 ml a určuje se relativní koncentrace proteinu a enzymová aktivita. Nejaktivnější frakce se spojí a testují na aktivitu a obsah proteinu.
[Phenylsepharose-eluát: 2,5 ml 0,001 mg proteinu, 6,3 pka]
- 10CZ 3U0009 B6
Jako faktor obohacení byla oproti HiTrapBlue-eluátu vyčíslena hodnota 1,9 při současné ztrátě aktivity 96 % a oddělení 98 % cizího protienu.
3.8 Barevná afínitní chromatografie na Mimetic-Gríin 1 A-6 XL
Jak bylo vyvozeno u sloupce High Trap Blue, vyskytují se také u tohoto materiálu interakce mezi γιί τ-Γ vazebnými místy kofaktoru enzymu s ligandy barevné látky. Jenom ty vázané enzymy, závislé na kofaktoru, se pak mohou eluovat s kofaktorem, v předkládaném případě acetyl koenzymem A. Nespecificky adsorbované proteiny zůstávají přitom ještě na sloupci.
Dříve než se mohl pipetovat Phenylsepharose-eluát na sloupec Mimetic-Grun (1 mc 0 1,2 cm, Affinity Chromatography Ltd., Feeport, Ballasalla, Isle of Man), musel se nejdříve odsolit, což se stalo opět na sloupci PD10 (firma Pharmacia). Ktomu byl nanesen Phenylsepharoseeluát na sloupec PD10 a ponechán pronikat. Eluce se prováděla standardním pufrem B (50 mM Tris/HCI, is pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu), přičemž prvních 0,5 ml eluátu se vyhodilo a dalších 2,5 ml, které obsahovaly aktivní protein, se shromažďovalo.
Tento roztok enzymu se pipetoval na sloupec Mimetic-Grun (1 cm 0 1,2 cm) promytý standardním pufrem B (50 mM Tris/HCI, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu).
Poté, co pronikl do gelového lože, byl úspěšně bez pumpy eluován následujícími roztoky: 3 ml standardního pufru B (50 mM Tris/HCI, pH 8,5, 20 % glycerinu, 20 mM 2-merkaptoethanolu), ml 0,5 mM acetylkoenzymu ve standardním piifru B, 3 ml 1 M KCl ve standardním, pufru B.
Přitom se jímaly frakce po 1 ml a kontrolovaly se na protein a aktivitu acetylkoenzymu A.
Acetylkoenzym A - eluát obsahoval jako jediná frakce aktivitu acetyItransferázy. Ani v průtoku ani v KCl-eluátu nemohla být aktivita změřena.
Před určením aktivity v acetyl-CoA-eluátu se musel nejprve odstranit kofaktor z roztoku. Velkým spojením dohromady neznačeného acetylkoenzymu A by byla nepatrná část I4C označe30 ného acetyl-CoA tak zředěna, že by radioaktivní substrát prakticky nemohl reagovat.
Téměř úplné odstranění acetylkoenzymu A se podařilo pomocí sloupce PD10, jak bylo výše popsáno. S takto získaným eluátem se mohl provádět obvyklý test na aktivitu. Poněvadž však vPDlO-eluátu existovaly ještě stopy acetylkoenzymu A z elučního pufru, a tedy úplného odstranění nebylo možno dosáhnout, byl v materiálu shromážděném k aktivitnímu testu acetyl-CoA označený 14C zředěn, a tím byla pro aktivitu a čisticí faktor získána příliš malá hodnota.
[Grun-eluát: 2,5 ml, 0,001 mg proteinu, 0,7 pkat]
Tímto krokem čištění byl oddělen cizí protein a při 81 % ztrátě aktivity bylo dosaženo faktoru čištění 1,1.
3.9 Souhrnný popis čištění a dokumentace homogenity
Popsaný způsobem se získala žádaná acetyltransferáza ze surového extraktu vysrážením 70 % síranem amonným a 8 kroky sloupcové chromatografie. Tím se získala preparace acetyltransferázy, jejíž specifická aktivita dosahovala 280-násobné hodnoty AcA-eluátu, přičemž celkový výtěžek obnášel 0,1 %. Velká ztráta aktivity během čištění, i když se AcA-eluát zpracovával v jednom dni, lze vysvětlit velkou nestabilitou enzymu, jakož i jeho citlivostí na hodnoty pH pod pH 8 a vůči iontům solí, mimo jiné síranu amonného.
K překontrolování čistoty enzymové preparace byla použita denaturační disková elektroforéza za přítomnosti SDS. Po rozdělení koncentrovaného eluátu Mimetic-Griin-sloupce s SDS-PAGE a následným barvením stříbrem se objevil jen 1 pás.
'-11'-“
| V-i tí >0): P >tn •P >o | P <d P 24 1 X | 1 | 1 | 1 | 1 | 1—1 | <N ÍO | .cn N’ | 120 | 225 | O 00 | ||||
| 24 Φ ?N | 1 | 1. | t | i | o o i—( | r4 CM r-l | O CO | cn CN | 'ř> co o | i-H o | |||||
| >Q) | oV> | ||||||||||||||
| P | |||||||||||||||
| > | |||||||||||||||
| '(ϋ 24 | ' I | co | in | CN | o LD | o o | o o | ||||||||
| u | f0 | cn | 1 | 1 | i | cn: | o | Ch | ro | ro | o | ||||
| P | £ | cn | čn” | LO | S | ||||||||||
| P | P | ||||||||||||||
| *1—1 | > | P’ | |||||||||||||
| o | -P | rti. | * | ||||||||||||
| 0) | P | /24' | |||||||||||||
| a | 24 | a | |||||||||||||
| cn | f0, | ||||||||||||||
| t—1 | |||||||||||||||
| > 0 | tí •H Φ | 5 | N CO | nr Ch r-t; | co r- | :Čh tO | S iO CN | co *>. co | cn S : O | LD o O | i—l O O < O | o o o | |||
| P | É | O | |||||||||||||
| Γ—1 | 0 P | ||||||||||||||
| Φ | |||||||||||||||
| o | a | ||||||||||||||
| .σι | |||||||||||||||
| '(0 | P | CO | |||||||||||||
| > | -H. | 1 | 1 | nr | AD | Co | ro | S | |||||||
| 0 | > | P | í | í | CN | Ch | •S | AD | Χ- | x | |||||
| r-l· | (ti | S | LO | ΙΟ | o | ||||||||||
| .H- | P | 24 | |||||||||||||
| Φ | 24 | CL, | |||||||||||||
| U | <ti | ||||||||||||||
| fe: ω | CN l> | LO', CO | cN 00 | O r—1 | cn iO. | fe* | to | lf) s | IO | LO | |||||
| 'PV | ,rH· | CN | CN | r-l | ,rH | ;cn | CN | ||||||||
| fe | |||||||||||||||
| O | |||||||||||||||
| P | i :LO | φ; tí: | Φ w | ||||||||||||
| ir4 | 24 | CN | 'r-+ | o | 1 tí | ||||||||||
| iti | O | P | P- | ffe | P | ||||||||||
| tí | P | Nti | P | Nti | (ti | fe | |||||||||
| >0 P | P X | OJ | P '(ti | tí r-í | '(ti fe | tí; rH | ft cti P E-í | fe a | P o | ||||||
| ,)W' | Φ | k ,φ fe | fe | OJ | ř—1 | Φ | φ | I | |||||||
| •H >0 | 'S | f—X -a* o | H Φ | 1 'nT | Φ 1 | 1 W | W Pp p | 0 Ή: | |||||||
| 24 | ··> | pL, | co | P | 1 | fe*' | O'. | w | P | >i '(ti | P | P | |||
| o | í'—1 . | A | '(ti | M | fe | fe | <ti | tí fe | φ: | >íti | |||||
| O | P | cn | a | fe | •rij | rtj | tn | tn | tí | , Φ I—1 | tí | ||||
| P | tí | (ti | φ | ř—1 | tú | ϋ | •H | fe·' | Ή | .--i | fe Φ | -rd | »“d, | ||
| fe | ω | a | w | <u | Q | fe | O | 'fe: | Φ | ÍP 1 | fe | Φ |
12CZ 300009 B6
Příklad 4
Charakterizace acetyltransferázy ze suspenzních kultur Taxus chinensis
4.1 pH Optimum
Hodnota pH má velký účinek na enzymovou aktivitu, protože se mění podle acidity enzymového roztoku náboje funkčních skupin určitých aminokyselin. To má dopad na konformaci aktivního centra enzymu a tím i na jeho aktivitu. Právě tak je model protonace určitého substrátu závislý na io hodnotě pH a může právě tak ovlivňovat enzymovou aktivitu.
K zjištění optimální oblasti pH, byt měřen přenos acetylkoenzymu A na 10-desacetyttaxuyunnanín C při různých hodnotách pH, od pH 5 do pH 11, Ktomu byly použity 5,6 pkat (1,7 pg, 50 μΐ) 120 krát obohacené acetyltransferázy (High TrapBlue eluát) v následujících vsád15 kách:
Vsádky: 50 pl 0,8 M Tris, pH 8,ř μΐ acetyltransferázy (5,6 pkat 1,7 pg proteinu, obohaceno 120 krát) pl acetylkoenzymu A (5 nmol, včetně 0,02 pCi [2—14C]acetylkoenzymu A
5 pl 3 mM 10-desacetyltaxuynnaninu C (15 nmol) pl vody Millipore
Inkubace: 25 min při 35 °C
Vsádky byly přitom 5 minut předinkubovány bez acetylkoenzymu A, potom byla nastartována reakce přidáním kofaktoru. Po inkubační době 25 minut při 35 °C byla reakce zastavena okyselením a vytřepáním s terc.-butylmethyletherem. Radioaktivita obsažená v extraktu byla vyhodnocena scintilačním čítačem.
Aktivita acetyltransferázy se rozprostírá přes relativně úzkou oblast pH 8,5 až 9, přičemž opti30 mum pH leží u pH 9. Poloviční maximální rychlosti konverze se nalézají při pH 6,8 a pH 10,8.
Čištění se provádělo při pH 8,5, protože se potom u afinitních sloupců nacházelo v proteklém materiálu méně aktivního proteinu než při pH 9.
4.2 Teplotní optimum
Vedle zřejmého účinku, který má hodnota pH na enzymovou aktivitu, ukazuje se také silná závislost éhžýmové aktivity na inkubační teplotě. Nejprve enzymatická aktivita vzrůstá se stoupající teplotou, od určité - pro každý enzym specifické - teploty však rychle klesá. Při těchto vysokých hodnotách teplot dochází k denaturaci a inaktivaci enzymu. Aby se stanovilo optimum teploty pro acetyltransferázu, bylo inkubováno 1,7 pg (5,6 pkat) 120—krát čištěného enzymu při teplotách od 0 do 50 °C nejprve 10 minut bez acetylkoenzymu A, potom dalších 25 minut po přidání kofaktoru. Zastavení reakce se provádělo přidáním 20.pl 12 % H2SO4. Potom byl vytvořený taxuyunnanin C vytřepán se 600 pl etheru. Vyhodnocení vytvořeného množství produktu bylo provedeno prostřednictvím scintilačního čítače.
Vsádky: 50 pl 0,8 M Tris, pH 8,5 pl acetyltransferázy (5,6 pkat, 1,7 pg proteinu, obohacováno 120 krát) pí acetylkoenzymu A (5 nmol, včetně 0,02 pCi [2-14C]acetyl-CoA)
5 pl 3 mM 10-desacetyltaxuyunnaninu C (15 nmol) pl vody Millipore
Inkubace: 25 min při příslušné teplotě Teplotní optimum acetyltransferázy leží u 35 °C.
-13CZ 300009 B6
4.3 Izoelektrický bod
Izoelektrický bod byl získán pomocí chromatofokusování. K. tomu se použije speciální anionto5 měnič, například Mono P HR 5/20 (firmy Pharmacia), na který se nanese žádaný enzym při hodnotě pH, při které existuje jako aniont. Za těchto startovacích podmínek se enzym váže na materiálu sloupce a potom se může eluovat pufrovací směsí obsahující amfolyt (Polybuffer 94 firmy Pharmacia), vytvářející gradienty pH přes sloupec. Enzym se odloučí od aniontoměniče právě tehdy, když hodnota pH poklesne natolik, aby enzym přešel z aniontového do formálně io nenabitého stavu. Tato hodnota pH odpovídá izoelekrickému bodu (IEP).
Pro acetyltransferázu byl určen pomocí BioLogic FPLC Workstation (firmy Biorad) na sloupci Mono P HR 5/20 (0^5 cm 0 x 20 cm, firma Pharmacia) při průtoku 0,7 ml/min. Tento sloupec byl ekvilibrován pufrem 25 mM imidazolu/HCl pH 7,4 a nabíjen eluátem HighQ. K tomu byl
1 ml HighQ-eluátu zahušťován na 100 μΐ Centriprep-koncentrátory (30 kD) a zředěn shora zmíněným ímidazolovým pufrem na 6 ml. Byl zde použit protein tohoto stupně čistoty, poněvadž se počítalo s vysokou ztrátou aktivity chromatofokusování, a v HighQ-eluátu byla nejvyšší aktivita (pkat/ml). Sloupec se promyl 10 ml startovacího pufru a se 40 ml pufru Polybuffer 74 (zředěným 1:8 vodou Millipore, pH 4) se protein eluoval ze sloupce. Byly zachycovány frakce
1 ml, přičemž k zachování aktivity pří nízkých hodnotách pH bylo do každé druhé frakce předloženo 100 μί 0,8 M Tris pH 8,5. Ve frakcích mezi nimi byla měřena hodnota pH.
Aby se zjistila aktivní frakce, byla alikvotní část každé 2. frakce inkubována 30 min v následující vsádce:
Vsádky: 200 μί roztoku enzymu (pufrováno na pH 8,5) μί acetylkoenzymu A (5 nmol, v něm obsaženého 0,02 μ(2ί[2-Ι40]Αο<3οΑ) μί 3 mM 10-desacetyltaxuynnanínu C (15 nmol)
Inkubace: 30 min při 35 °C
Vyhodnocení bylo provedeno pomocí seintilačního čítače po vytřepání s terc.-butylmethyletherem.
Hlavní aktivita se eluovala v oblasti pH od 5,7 a 5,47, takže izoelektrický bod acetyltranseferázy mohl být určen u pH 5,6.
4.4 Stanovení molekulové hmotnosti
K určení molekulové hmotnosti acetyltransferázy byly použity dvě různé metody: gelová filtrace na kalibrovaném gelovém filtračním sloupci a SDS-gelový elektroforéza.
První se prováděla na ekvilibrovaném (50 mM Tris, pH 8,5, 10 mM 2-merkaptoethanol) sloupci Biosilect-SEC 250-5 (Biorad) v zařízení FPLC (Biologie Workstation, Biorad), průtokovou rychlostí 0,2 ml/min. Nejprve byl sloupec kalibrován proteiny, jejichž molekulová hmotnost byla známa. Za identických podmínek bylo potom 1,5 ml HighTrapBlue-eluátu, zahuštěného Centriprep-koncetrátory (2 ml, membrána 10 kD) na 100 μΐ (3360 pkat, 50 μg proteinu), eluováno přes sloupec. Velikost frakce obnášela 250 μΐ a byla zjišťována aktivita eluátu inkubací následujících vsádek (celkový objem 185 μί).
Vsádky; 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5 100 μί eluátu μΐ acetyM3oA (5 nmol, v něm navíc obsaženého 0,02 pCi [2-14C]acetyl-CoA
-‘14CZ 300009 B6 μΐ mM 10-desacetyltaxuynnaninu C (15 nmot)
Inkubace: 30 min při 35 °C
Vyhodnocení radioaktivity bylo provedeno pomocí scintilačního čítače pro vytřepání sterc5 butylmethyletherem.
Pro acetyltransferázu byla touto metodou vypočtena molekulová hmotnost 72 kD.
Ke kontrole této hodnoty byla použita denaturující SDS gelová elektroforéza. K tomu se chroma10 tografovalo 0,3 gg homogenního proteinu v 10 % SDS-gelu paralelně s markerovým proteinem o známé molekulové hmotnosti (Rainbowmarker). Barvením stříbrem se proteiny zviditelnily, takže porovnáním hodnot Rf kalibračních proteinů a acetyltransferázy se pro ni mohla určit molekulová hmotnost 70,8 kD.
4.5 Stanovení hodnoty KM
Stanovení hodnoty KM pro 10-desacetyltaxuyunnanin C
Aby se dosáhlo informace a afinitě acetyltransferázy k 10-desacetyltaxuyunnaninu C, byla urče20 na hodnota KM s Phenylsepharose-eluátem.
Vsádky: 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5
100 μΐ acetyltransferázy (0,25 pkat, 40 ng proteinu, obohacováno 225 krát) μΐ acetyl koenzymu A (5 nmol, v něm navíc 0,02 gCi[2-14C]acetyl-CoA)
10 μΐ 1,0-desacetyltaxuyunnaninu C (konečná koncentrace: 0,1 /0,3/1/3/5710/30/50/100/200/300/500 μΜ)
Inkubace: 30 min při 35 °C, vyhodnocení radioaktivity bylo provedeno pomocí scintilačního čítače po extrakci s terc-butylmethyletherem.
Dvojím reciprokým vynášením naměřených hodnot podle LINEWEAVER a BURK mohla být graficky zjištěna hodnota KM pro 10-desacetyltaxuynnanin C 23 μΜ.
4.6 Stanovení hodnoty KM pro acetylkoenzym A
Afinitu acetylfransferázy kacetylkoenzymu A lze popsat hodnotou KM, která se zjistí $ Phenylsepharose-eluátem.
Vsádky: 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5
100 μΙ acetyltransferázy (0,25 pkat, 40 ng proteinu, obohacováno 225 krát)
30 μΐ acetylkoenzymu A a H2O (konečná koncentrace 2,1/2,3/3/5/12/32/52/102/152/202/302/502 μΜ, přičemž každé byly obsaženy 2 μΜ (40 000 cpm) [2-14C]AcCoA) μΐ 3 mM 10-desacetyltaxuyunnaninu C (15 nmol) inkubace: 30 min při 35 °C, potom bylo provedeno vyhodnocení vytřepáním s terc-butytmethyletherem a scintilačním čítačem.
Dvojím reciprokým vynášením naměřených hodnot podle LINEWEAVER a BURK mohla být graficky zjištěna hodnota KM pro acetylkoenzym A 61 μΜ.
50
4.7 Číslo přeměny kCil,
Číslo přeměny („turnover“) popisuje reakční rychlost enzymatické reakce, v níž se udává, kolik molekul substrátu se přemění za sekundu jednou molekulou enzymu.
-15CZ 300009 B6
Ke stanovení „tumover“ se používal Phenylsepharose-eluát. V němž obsažená koncentrace acetyltransferázy byla určena pro rozdělení eluátu pomocí SDS-polytransferázy byla určena po rozdělení eluátu pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy a následným barvením stříbrem. Do sousedních proudů gelu se nanášela známá množství albuminu z hovězího séra jako srovnávací koncentrace.
S 300 μί roztoku enzymu, odpovídající 18 ng acetyltransferázy, 10-desacetyltaxuyunnaninem C a acetyl koenzymem A byla zaznamenávána kinetika reakce, která probíhala lineárně v oblasti od io 5 až do 30 min.
Vsádky: 50 μί 0,8 M Tris, pH 8,5,
300 μ! acetyltransferázy (18 ng acetyltransferázy, 0,76 pkat) μί acetylkoenzymu A (5 nmol., v něm 0,02 gCi[2-I4C]AcCoA)
5 μΐ 3 mM 10-desacetyltaxuynnanninu C (15 nmol)
Inkubace: 30 min při 35 °C
Inkubační vsádky byly potom vytřepány s terc-butyl methyl etherem a vyhodnoceny scinti lačním čítačem. Z naměřených hodnot mohla být vypočítána přeměna (pmol). Vydělením molekulové hmotnosti (72 kD) množství enzymu (18 ng) se obdrží koncentrace enzymu 0,25 pmol ve vsádce.
Enzymová aktivita se vypočítá tak, že se zjistí přeměna za jednotku času (sec.). Kvocient enzymové aktivity (0,05 pmol/sec) a enzymové koncentrace (0,25 pmol) dává pro „tumover“ acetyltransferázy hodnotu 0,2 kat/mol homogenního enzymu (mol/sec/mol enzymu).
turnover = číslo přeměny k^:
0,05 pmol/sec : 0,25 pmol = 0,2 kat/mol
To odpovídá přeměně 0,2 mol substrátu za sekundu na mol (72 kg) enzymu při 35 °C, pH 8,5 30 a optimálních množstvích substrátu (60 mol 10-desacetyltaxuynnaninu C, 20 mol acetyl-CoA).
4.8 Kinetické optimum
Za fyziologických podmínek je koncentrace substrátu v poměru ke koncentraci enzymu velmi 35 malá. Jenom malá část aktivních center enzymu je obsazena, takže množství enzymy neobsazených substrátů [E] přibližně odpovídá celkovému množství enzymu [Eo],
Je-li koncentrace substrátu [S] daleko pod KM, tj. pod koncentrací, při které je počáteční rychlost reakce polovinou maximální rychlosti, probíhá enzymatická reakce značně pomaleji, než vyjad40 řuje číslo přeměny kca(.
K charakterizaci enzymu za těchto podmínek se používá kvocient Κ31/ΚΜ. Násobí-li se tato hodnota koncentrací substrátu [S] a celkovým množstvím enzymu [EJ, obdrží se reakční rychlost.
V = (keat / KM [S] [EJ
Přitom je třeba dbát, aby rychlost difúze molekul rozpuštěných ve vodném prostředí mohla obnášet maximálně 108 až 109. Také u velmi rychlých enzymů je tím omezena reakční rychlost, protože substrát nemůže rychleji dospět k enzymu.
Pro acetyltransferázu se vypočítá kinetické optimum následovně:
KM(10-desacetyltaxuyunnannin C) = 23 μΜ, = 0,2 kat/mol K^/Km = 0,2 mol s_1 mor'/23.10^ [M] - 8,7 s^M“1
- 16CZ 300009 Bó
Příklad 5
Specifita substrátu
Pro přezkoušení specifíty substrátu vyčištěnou acetyltransferázou byly použity různé sloučeniny se základním skeletem taxanu jako substrátu:
10-desacety ltaxuyunnanin C
14-desacety ltaxuyunnanin C
10.14- desacetyltaxuyunnanín C
2.10.14- desacetyltaxuyunnanin C
5.10.14- desacety ltaxuyunnanin C
2.5.10.14- desacetyltaxuyunnanin C
2,14-desacetyltaxuyunnanin C
5.14- desacetyltaxuyunnanin C
2,5-desacety 1-10,14-desacetyltaxuyunnanin C 10-desacetyIbaccatin III (=10-DAB III
10-desacetyltacol
1O-desacetylceťalomanin
10—epi—10—DAB—III 19-hydroxy-lO-DAB-III 14-hydroxy-10-DAB-IIl 7-TES-10-DAB-III
7-BOC-10-DAB-III
Ukázalo se, že z používaných substrátů mohou reagovat jenom taxany s hydroxylovou skupinou v poloze C-10. Taxonové deriváty s acetylovanou polohou C-10 však nebyly volnými hydroxylovými skupinami najiných atomech uhlíku akceptovány jako substrát vyčištěné acetyltransferá30 zy. Je-li však přístup kC-10 blokován objemnými substituenty, jako v případě 10-desacetyltaxolu a 10-desacetylcefalomanninu, k acetylaci nedochází.
Při výpočtu míry konverze, vztaženo na míru konverze 10-desacetyltaxuyunnaninu C, se ukázalo, že deriváty taxanuyunnaninu C reagovaly s volnými skupinami ve stejném rozsahu,
10-DAB reagoval s konverzí 85 % ve srovnání s 10-desacetyltaxuyunnaninem C k baccatinu III.
Konverze různých substrátů, vztažená na konverzi desacetyltaxuyunnaninu C je znázorněna v následující tabulce:
Konverze různých substrátů, vztažená na konverzi 10-desacetyltaxuyunnaninu C
10-desacetyltaxuyunnanin C
Enzym: Phenylsepharose-eluát (225 krát čištěný) . 17 CZ 300009 B6
| Substrát | Konverze {%) | pkat |
| 10-desacetyítaxuyunnanin C | 100 | 1/12 |
| 1.0-desacetylbaccatin III | 80 | 0,9 |
| 10,14-desacetyltaxuyunnanin C | 102 | 1,14 |
| 2,10,14-desace.tyltaxuyunnanin C | 81 | 0,91 |
| 5,10,14-desacetyltaxuyunnanin C | 8.8 | 0,99 |
| 2,5,10,1.4-desacetyltaxuyunnanin Č | 53 | 0, 59 |
| ÍÓ-epi-10-DAB III | 0 | 0 |
| 19-hydroxy-ÍO-BAB ITI | 38 | 0,43 |
| 1.4-hydroxy-DAB. III | 97: | 1,09 |
| 7-TES-10-DAB III | 0 | 0 |
| .7-BOC-10-DAB III | 2 | 2 |
Claims (12)
- to 1. Způsob přípravy baccatinu a/nebo baccatinových derivátů, vyznačený tím, že reaguje 10-desacetylbaccatin nebo jeho derivát, tvořený taxonovou sloučeninou, která nese stejné substituenty jako 10-desacetylbaccatin-Ill v polohách 7 až 13 nebo nese alespoň některé substituenty mající menší objem než substituenty 10-desacetylbaccatinu-III, v přítomnosti izolovaného enzymu a acetylového donoru, přičemž jako enzym se používá acetyItransferáza15 o molekulové hmotnosti od 70 do 72 kD, stanovené SDS-PAGE, s isoelektrickým bodem pH 5,4 až 5,8 a konstantou KM Michaelise.a Menteňové pro acetyIkoenzym A 55 až 65 μΜ, která se získá z Taxus chittensis.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se baccatin-ΠΙ připravuje z 10-des20 acety lbaccat inu. —
- 3. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se 14-hydroxybaccatin připravuje z 14hydroxy-10-desacetylbaccatinu-III.25
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se taxuyuannin C připravuje z 10-desacety Itaxuyunnaninu C.
- 5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že se reakce provádí za přítomnosti acetyl koenzymu A jako acety ldonoru.
- 6. Enzym, kterýa) acetyluje 10-desacetylbaccatin-III za přítomnosti acetyldonoru, zejména acety lkoenzymu A, selektivně v poloze 10,b) vykazuje molekulovou hmotnost 70 až 72 kD, stanovenou SDS-PAGE a-18CZ 300009 B6c) vykazuje izoelektrický bod při pH 5,4 až 5,8,d) vykazuje konstantu KM Michaelise a Mentenové pro aeetylkoenzym A 55 až 65 μΜ,5 e) je to 10-hydroxytaxa-O-acetyltransferáza af) získá se z buněčné kultury Taxus chinensis.
- 7. Způsob přípravy enzymu podle nároku 6, vyznačený tím, že se enzym izoluje z io Taxus chinensis čištěním a po každém čištění se určují frakce, ve kterých se enzym vyskytuje, tím, že se přidá 10-desacetylbaccatin nebo derivát 10-desacetylbaccatinu, tvořený taxanovou sloučeninou, která nese stejné substituenty jako 10-desacetylbaccatin-IU v polohách 7 až 13 nebo nese alespoň některé substituenty mající menší objem než substituenty 10-desacetylbaccatinu-IIÍ, a acetyldonor a dokazuje se vytvořený produkt acetylace.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že metoda čištění zahrnuje použití High-Q.
- 9. Způsob podle některého z nároku 7 nebo 8, v y z n a č e n ý tím, že se používá 10-desacetylbaccatin nebo 10-desacetyltaxuyunnanin C pro důkaz frakcí obsahujících enzym.
- 10. Způsob podle některého z nároků 7 až 9, vyznačený tím, že se aeetylkoenzym A používá jako acetyldonor.
- 11. Způsob podle některého z nároků 7 až 10, vyznačený tím, že důkaz vytvořeného25 produktu acetylace se provede radioaktivním značkováním.
- 12. Způsob podle některého z nároků 7 až 9, vyznačený tím, že důkaz vytvořeného produktu acetylace se provádí radioaktivním značkováním těžkým izotopem.30 13. Způsob přípravy taxolu a/nebo taxolových derivátů, vyznačený tím, že se nejdříve připravuje baccatin nebo baccatinový derivát podle některého z nároků 1 až 5 a ten esterifikací skupin OH v poloze 13 baccatinového derivátu s vhodnou kyselinou reaguje na taxol nebo taxolový derivát.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19804815A DE19804815C1 (de) | 1998-02-06 | 1998-02-06 | Verfahren zur Herstellung von Baccatin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20002723A3 CZ20002723A3 (cs) | 2001-01-17 |
| CZ300009B6 true CZ300009B6 (cs) | 2009-01-14 |
Family
ID=7856891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20002723A CZ300009B6 (cs) | 1998-02-06 | 1999-01-29 | Zpusob prípravy baccatinu |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6514732B1 (cs) |
| EP (1) | EP1053345B1 (cs) |
| JP (1) | JP4278864B2 (cs) |
| KR (1) | KR100575488B1 (cs) |
| CN (1) | CN1226416C (cs) |
| AT (1) | ATE260985T1 (cs) |
| AU (1) | AU760122B2 (cs) |
| CA (1) | CA2319136C (cs) |
| CZ (1) | CZ300009B6 (cs) |
| DE (2) | DE19804815C1 (cs) |
| DK (1) | DK1053345T3 (cs) |
| ES (1) | ES2217777T3 (cs) |
| HU (1) | HU228677B1 (cs) |
| NO (1) | NO320104B1 (cs) |
| PL (1) | PL197703B1 (cs) |
| PT (1) | PT1053345E (cs) |
| RU (1) | RU2219242C2 (cs) |
| SI (1) | SI1053345T1 (cs) |
| SK (1) | SK284676B6 (cs) |
| WO (1) | WO1999040216A1 (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6287835B1 (en) | 1999-09-30 | 2001-09-11 | Washington State University Research Foundation | Transacylases of the paclitaxel biosynthetic pathway |
| DE10013942B4 (de) * | 2000-03-21 | 2010-01-14 | Air Liquide Deutschland Gmbh | Verfahren zum Herstellen von Arzneimitteln aus Ausgangsstoffen der traditionellen chinesischen Medizin |
| US20080053911A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Qiagen Gmbh | Separation of an organic phase from a mixture comprising organic and aqueous phases by solid phase systems |
| CN103808854A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中巴卡亭ⅲ的薄层色谱检测方法 |
| CN103808850A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中10-去乙酰基巴卡亭ⅲ的薄层色谱检测方法 |
| CN103808853A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的薄层色谱检测方法 |
| CN103808851A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中10-去乙酰基紫杉醇的薄层色谱检测方法 |
-
1998
- 1998-02-06 DE DE19804815A patent/DE19804815C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-01-29 RU RU2000123174/13A patent/RU2219242C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 EP EP99934214A patent/EP1053345B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 WO PCT/EP1999/000599 patent/WO1999040216A1/de not_active Ceased
- 1999-01-29 ES ES99934214T patent/ES2217777T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 US US09/582,223 patent/US6514732B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 CA CA002319136A patent/CA2319136C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-29 DE DE59908741T patent/DE59908741D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 CN CNB998027057A patent/CN1226416C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-29 AU AU32519/99A patent/AU760122B2/en not_active Ceased
- 1999-01-29 SI SI9930568T patent/SI1053345T1/xx unknown
- 1999-01-29 DK DK99934214T patent/DK1053345T3/da active
- 1999-01-29 SK SK1124-2000A patent/SK284676B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 PL PL342711A patent/PL197703B1/pl unknown
- 1999-01-29 KR KR1020007008519A patent/KR100575488B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 JP JP2000530627A patent/JP4278864B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 CZ CZ20002723A patent/CZ300009B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 HU HU0100724A patent/HU228677B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 PT PT99934214T patent/PT1053345E/pt unknown
- 1999-01-29 AT AT99934214T patent/ATE260985T1/de active
-
2000
- 2000-07-24 NO NO20003787A patent/NO320104B1/no not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Zocher a kol. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229, 16-20 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1290305A (zh) | 2001-04-04 |
| SK284676B6 (sk) | 2005-09-08 |
| PT1053345E (pt) | 2004-07-30 |
| NO20003787D0 (no) | 2000-07-24 |
| NO20003787L (no) | 2000-07-24 |
| DE59908741D1 (de) | 2004-04-08 |
| HUP0100724A3 (en) | 2002-04-29 |
| DK1053345T3 (da) | 2004-06-21 |
| US6514732B1 (en) | 2003-02-04 |
| NO320104B1 (no) | 2005-10-24 |
| DE19804815C1 (de) | 1999-04-15 |
| RU2219242C2 (ru) | 2003-12-20 |
| ATE260985T1 (de) | 2004-03-15 |
| PL342711A1 (en) | 2001-07-02 |
| PL197703B1 (pl) | 2008-04-30 |
| CZ20002723A3 (cs) | 2001-01-17 |
| WO1999040216A1 (de) | 1999-08-12 |
| HU228677B1 (en) | 2013-05-28 |
| CA2319136C (en) | 2008-09-09 |
| AU3251999A (en) | 1999-08-23 |
| ES2217777T3 (es) | 2004-11-01 |
| CN1226416C (zh) | 2005-11-09 |
| KR100575488B1 (ko) | 2006-05-03 |
| CA2319136A1 (en) | 1999-08-12 |
| JP2002502613A (ja) | 2002-01-29 |
| SI1053345T1 (en) | 2004-08-31 |
| KR20010040647A (ko) | 2001-05-15 |
| JP4278864B2 (ja) | 2009-06-17 |
| SK11242000A3 (sk) | 2001-09-11 |
| EP1053345A1 (de) | 2000-11-22 |
| AU760122B2 (en) | 2003-05-08 |
| HUP0100724A2 (hu) | 2001-12-28 |
| EP1053345B1 (de) | 2004-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Levac et al. | Application of carborundum abrasion for investigating the leaf epidermis: molecular cloning of Catharanthus roseus 16‐hydroxytabersonine‐16‐O‐methyltransferase | |
| Kreuzaler et al. | Enzymic Synthesis of an Aromatic Ring from Acetate Units: Partial Purification and Some Properties of Flavanone Synthase from Cell‐Suspension Cultures of Petroselinum hortense | |
| Kaminek et al. | Genotypic variation in cytokinin oxidase from Phaseolus callus cultures | |
| Labrou et al. | Biomimetic‐dye affinity adsorbents for enzyme purification: Application to the one‐step purification of Candida boidinii formate dehydrogenase | |
| Hampp et al. | Homogeneous strictosidine synthase from cell suspension cultures of Rauvolfia serpentina | |
| Turner et al. | Isolation and partial purification of an enzyme catalyzing the formation of O-xylosylzeatin in Phaseolus vulgaris embryos | |
| Chatfield et al. | Cytokinin oxidase from Phaseolus vulgaris callus tissues: enhanced in vitro activity of the enzyme in the presence of copper-imidazole complexes | |
| Goldberg et al. | Fatty acid synthetases in Euglena gracilis | |
| Frenzel et al. | Purification and characterization of three isoforms of S-adenosyl-L-methionine:(R, S)-tetrahydrobenzylisoquinoline-N-methyltransferase from Berberis koetineana cell cultures | |
| AU760122B2 (en) | Method for producing baccatin | |
| Menhard et al. | Special publication Purification and characterization of acetyl coenzyme a: 10-hydroxytaxane O-acetyltransferase from cell suspension cultures of Taxus chinensis | |
| Turner | Scope and applications of dye-ligand chromatography | |
| De Carolis et al. | Purification and kinetics of phenylpropanoid O-methyltransferase activities from Brassica oleracea | |
| Corcoran et al. | Accumulation of 6-deoxyerythronolide B in a normal strain of Streptomyces erythreus and hydroxylation at C-6 of the erythranolide ring system by a soluble noninduced cell-free enzyme system | |
| Ikegami et al. | Purification of IMP dehydrogenase from rat hepatoma 3924A | |
| CN113383777A (zh) | 麦黄酮-5-o-葡萄糖糖苷在调控植物对杂草抗性中的应用 | |
| SEELERT et al. | Dye-ligand chromatographic purification of intact multisubunit membrane protein complexes: application to the chloroplast H+-F0F1-ATP synthase | |
| Madry et al. | Selective synthesis of depsipeptides by the immobilized multienzyme enniatin synthetase | |
| Ishikura et al. | Conversion of (+)-dihydroquercetin to 3, 4-cis-leucocyanidin by a reductase extracted from cell suspension cultures of Cryptomeria japonica | |
| Sharma et al. | Partial purification and characterization of cyclic AMP phosphodiesterases from Funaria hygrometrica | |
| Murakoshi et al. | Biosynthesis of β-(6-benzylaminopurin-9-yl) alanine, a metabolite of cytokinin 6-benzylaminopurine in higher plants | |
| Moschny | Microcystins as Lead Structures for Anticancer Agents | |
| Yang et al. | Isoaccepting transfer ribonucleic acids during chilling stress in soybean seedling hypocotyls | |
| Zapf et al. | A rapid, reliable, and convenient method for the purification of thymidylate synthase from amethopterin-resistant Lactobacillus casei | |
| JPS6034556B2 (ja) | 抗生物質ｃ−１５００３ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180129 |