CZ301833B6 - Konjugát erytropoetinu s polyethylenglykolem, zpusob jeho prípravy a lécivo pro lécení anemie s jeho obsahem - Google Patents
Konjugát erytropoetinu s polyethylenglykolem, zpusob jeho prípravy a lécivo pro lécení anemie s jeho obsahem Download PDFInfo
- Publication number
- CZ301833B6 CZ301833B6 CZ20014682A CZ20014682A CZ301833B6 CZ 301833 B6 CZ301833 B6 CZ 301833B6 CZ 20014682 A CZ20014682 A CZ 20014682A CZ 20014682 A CZ20014682 A CZ 20014682A CZ 301833 B6 CZ301833 B6 CZ 301833B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- conjugate
- thr
- asn
- glycoprotein
- epo
- Prior art date
Links
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 title claims abstract description 156
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 156
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 141
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims abstract description 52
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 title abstract description 114
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims abstract description 8
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 19
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 16
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000000913 erythropoietic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 2
- IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N Lys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N 0.000 claims description 2
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 claims description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 2
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 claims 2
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 claims 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims 1
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 claims 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 abstract description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 14
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQUWKZJWBCOHQH-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound COCCOCCOCCN1C(=O)C=CC1=O WQUWKZJWBCOHQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108700031620 S-acetylthiorphan Proteins 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 7
- -1 succinimidyl Chemical group 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 6
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 5
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 4
- SEEYREPSKCQBBF-UHFFFAOYSA-N n-methylmaleimide Chemical compound CN1C(=O)C=CC1=O SEEYREPSKCQBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003870 depth resolved spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 208000009743 drug hypersensitivity syndrome Diseases 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 3
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XVAPVJNJGLWGCS-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asn Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XVAPVJNJGLWGCS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- GXHDGYOXPNQCKM-XVSYOHENSA-N Asp-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O GXHDGYOXPNQCKM-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 2
- GRNOCLDFUNCIDW-ACZMJKKPSA-N Cys-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N GRNOCLDFUNCIDW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N Cys-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N)O BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 208000023661 Haematological disease Diseases 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N Ile-Thr-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 2
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N Leu-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- CKSXSQUVEYCDIW-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CKSXSQUVEYCDIW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- RBEATVHTWHTHTJ-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O RBEATVHTWHTHTJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 2
- FBVGQXJIXFZKSQ-GMVOTWDCSA-N Tyr-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N FBVGQXJIXFZKSQ-GMVOTWDCSA-N 0.000 description 2
- SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N oxamic acid Chemical compound NC(=O)C(O)=O SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007745 plasma electrolytic oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ZRTJVRDXVSDKPX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-acetylsulfanylpropanoate Chemical group CC(=O)SCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZRTJVRDXVSDKPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 2-{2-[3,4-bis(2-hydroxyethoxy)oxolan-2-yl]-2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy}ethyl dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCCOCC(OCCO)C1OCC(OCCO)C1OCCO HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- NJPMYXWVWQWCSR-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJPMYXWVWQWCSR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- ZBYLEBZCVKLPCY-FXQIFTODSA-N Asp-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ZBYLEBZCVKLPCY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- NAAAPCLFJPURAM-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O NAAAPCLFJPURAM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AFODTOLGSZQDSL-PEFMBERDSA-N Glu-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N AFODTOLGSZQDSL-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N Gly-Asp-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010065426 Hemaccel Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CTHAJJYOHOBUDY-GHCJXIJMSA-N Ile-Cys-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N CTHAJJYOHOBUDY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N Ile-Thr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WSGXUIQTEZDVHJ-GARJFASQSA-N Leu-Ala-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O WSGXUIQTEZDVHJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ORWTWZXGDBYVCP-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C ORWTWZXGDBYVCP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N Pro-Ile-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- CGSOWZUPLOKYOR-AVGNSLFASA-N Pro-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 CGSOWZUPLOKYOR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N Ser-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N Thr-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- FWDCXHXCVGPQJM-UHFFFAOYSA-N [Se]1CC=CC=C1.[Na] Chemical compound [Se]1CC=CC=C1.[Na] FWDCXHXCVGPQJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diamine Chemical compound CC(N)C(C)N GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960001781 ferrous sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000036186 satiety Effects 0.000 description 1
- 235000019627 satiety Nutrition 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003459 sulfonic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Konjugát obsahující erytropoetinový (EPO) glykoprotein mající alespon jednu volnou aminoskupinu a zvyšující produkci retikulocytu a erytrocytu bunkami kostní drene, kde EPO glykoprotein je vybrán z lidského EPO a jeho analogu, které mají primární strukturu lidského EPO modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylacních míst nebo prestavbou alespon jednoho glykosylacního místa; jež spocívá v deleci kteréhokoliv z míst s N-pripojeným sacharidem v lidském EPO a adici místa s N-pripojeným sacharidem v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského EPO; kde uvedený glykoprotein je kovalentne navázán na jednu až tri (C.sub.1.n.-C.sub.6.n.)alkoxy poly(ethylenglykolové) skupiny, z nichž každá je kovalentne pripojena ke glykoproteinu pres spojovník -C(O)-X-S-Y-, kde C(O) spojovníku tvorí amidovou vazbu s jednou z uvedených aminoskupin, X je -(CH.sub.2.n.).sub.k.n.- nebo -CH.sub.2.n.(O-CH.sub.2.n.-CH.sub.2.n.).sub.k.n.-, k je císlo od 1 do 10, Y je skupina vzorce i, ii, iii nebo iv, prumerná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je 20 až 40 kDa, a molekulová hmotnost konjugátu je 51 až 175 kDa. Zpusob jeho prípravy a lécivo pro lécení anemie s jeho obsahem.
Description
Konjugát erytropoetinu s polyethylenglykolem, způsob jeho přípravy a léčivo pro léčení anemie s jeho obsahem
Oblast techniky
Vynalez se týká konjugátu erytropoetinu s polyethylenglykolem, způsobu jeho přípravy a kompozic a léčiv pro léčení onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým onemocněním léčených chemoterapií.
to
Dosavadní stav techniky
Erythropoesa je produkce erytrocytů, která probíhá za účelem náhrady destruovaných buněk. i5 Erythropoesa je kontrolovaným fyziologickým mechanismem, který produkuje dostatek erytrocytů pro řádné okysličení tkání. Přirozený lidský erytropoetin (HEPO) je glykoprotein obsahující
165 aminokyselin, který je produkován ledvinách a který je humorálním plazmatíckým faktorem, který stimuluje produkci erytrocytů (Camot, P. a Deflandre, C, (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser,
E, Freid, W a Plazak, LF (1957) Nátuře 179: 6331-4). Lidský EPO stimuluje dělení a diferenciací erytroidních progenitorů v kostní dřeni. Lidský EPO projevuje svou biologickou aktivitu vazbou na receptory na erytroidních prekursorech (Kratz, BS (1991) Blod 77: 419). Přirozený lidský erytropoetin je acidícký glykoprotein přítomný v nízkých koncentracích v plazmě, který stimuluje nahrazování erytrocytů, které jsou zkráceny v důsledku stárnutí.
Erytropoetin byl vyroben synteticky za použití technologie re kombi nantní DNA (Egrie, JC, Strickland, TW, Lané, J et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224) a je produktem íonovaného lidského EPO genu insertovaného do a exprimovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO buňkách), Přirozený lidský EPO je nejprve translatován na polypeptid obsahující 166 aminokyselin sargininem 166. Při postranslačních modifikacích je arginin 166 odštěpen karboxypeptidázou. Primární struktura lidského EPO (165 aa) je uvedena na obr. 1. Primární struktura lidského EPO (166 aa) je uvedena na obr. 2. Polypeptid obsahuje dva disulfidové můstky mezi Cys7-Cys'61 a Cys29-Cys33. Molekulová hmotnost polypeptidového řetězce lidského EPO bez sacharidových skupin je 18236 Da. V intaktní EPO molekule je přibližně 40 % moleku35 lové hmotnosti tvořeno karbohydrátovými skupinami (Sasaki, H,, Hothner, B, Dell, A a Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).
Jelikož je erytropoetin zásadní pro tvorbu erytrocytů, je hormon použitelný pro léčbu hematologických onemocnění charakterizován nízkou nebo defektní produkcí erytrocytů. Klinicky je EPO používán například při léčbě anemie u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF) (Eschbach, 1W, Egri, IC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, 1W, Abdulhadi, MH, Browne, JK et aí. (1989) Ann. Intem. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D. et al. (1989) Ann. Intem. Med. 110:108-114) a u pacientů s AIDS a nádorovým onemocněním během chemoterapie (Danna, RP, Rudnick, SA, Abls, Rl, IN: MB, Gamick, Ed. Erytropoetin in Clinical Applications-An International Perspektivě. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: str. 301-324). Nicméně, biologická dostupnost současných proteinových terapeutik, jako je EPO, je omezená jejich krátkým plazmatíckým poločasem a citlivostí na degradací proteasami. Tyto nevýhody brání dosažení maximálního klinického účinku.
Podstata vynálezu
Proto se předpokládaný vynález týká nové třídy PEG derivátů EPO. Konkrétně je předmětem vynálezu konjugát obsahující erytropoetinový glykoprotein mající alespoň jednu vojnou amino-1 CZ 301833 B6 skupinu a vykazující in vivo biologickou aktivitu, kterou je zvýšení produkce retikulocytů a erytrocytů buňkami kostní dřeně, kde erytropoetinový glykoprotein je vybrán ze souboru sestávajícího z lidského erytropoetinu a jeho analogů, které mají primární strukturu lidského erytropoetinu modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylačních míst nebo přestavbu alespoň jednoho glyko5 sylačního místa, jež spočívá v deleci kteréhokoliv z míst s N-připojeným sacharidem v lidském erytropoetinu a adici místa s N-připojeným sacharidem v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského erytropoetinu; kde uvedený glykoprotein je kovalentně navázán na jednu až tři (CjC6)alkoxy poly(ethylengiykolové) skupiny, přičemž každá póly (ethylenglykolová) skupina je kovalentně připojena ke glykoproteinu přes spojovací skupinu vzorce -C(O)-X-S-Y-, kde io zbytek C(O) spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených skupin,
X je 4CH2)k nebo -CH2(O-CH2-CH2)kk je číslo od 1 do 10,
Y je skupina vzorce
průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové skupiny) je od 20 do 40 kilodaltonů, a molekulová hmotnost konjugátu je od 51 do 175 kilodaltonů.
Ve srovnání s nemodifikovaným EPO (tj,, EPO bez navázaného PEG) a běžnými PEG-EPO konjugáty, mají konjugáty podle předkládaného vynálezu delší cirkulační poločas a dobu setrvání v plazmě, nižší klírens a vyšší klinickou aktivitu in vivo. Konjugáty podle předkládaného vynálezu mají stejné použití jako EPO. Konkrétně, konjugáty podle předkládaného vynálezu jsou použili tělně pro stimulaci dělení a diferenciace kmenových erytroidních progenitorů v kostní dřeni stejně jako EPO.
Předmětem vynálezu je také kompozice, která obsahuje konjugát podle vynálezu. Přednostně takové kompozice obsahuje konjugát s alespoň 90% nebo vyšším podílem konjugátu, v nichž n je číslo I.
Předmětem vynálezu je dále také farmaceutická kompozice, která obsahuje konjugát nebo kompozici vynálezu a farmaceuticky přijatelný excípient.
Předkládaný vynález také zahrnuje použití konjugátu nebo kompozice podle vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým onemocněním léčených chemoterapií.
Konečně je předmětem vynálezu také způsob přípravy konjugátu nebo kompozice podle vynálezu, který zahrnuje kovalentní navázání thiolových skupin na erytropoetinový glykoprotein a
-2CZ 301833 B6 kopulaci vzniklého aktivovaného erytropoetinového glykoproteinu s poly(ethylenglykolovým) (PEG) derivátem.
Pri tomto způsobu se konkrétně postupuje tak, že se a-aminoskupina lysinu erytropoetinového proteinu podrobí kovalentní reakci s bifunkčním činidlem za vzniku meziproduktu s amidovou vazbou. Použití bifunkční Činidlo obsahuje reaktivní skupinu a chráněno thiolovou skupinu. Meziprodukt vázaný na amid se potom podrobí kovalentní reakci s aktivovaným polyethylenglykolovým derivátem za vzniku erytropoetinového glykoproteinového produktu podle vynálezu.
io
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1: Primární struktura lidského EPO (165 aminokyselin).
Obr. 2: Primární struktura lidského EPO (166 aminokyselin).
Obr. 3: In vivo aktivita pegylovaného EPO určená testem na normocytemických myších. Následuje podrobný popis vynálezu.
Používané termíny mají významy definované dále.
Termín „erytropoetinový protein“, „erytropoietin“, „EPO“, nebo „erytropoetinový glykoprotein“ označuje glykoprotein mající sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO:2), nebo protein nebo polypeptid v podstatě homologní k uvedenému proteinu, jehož biologické vlastnosti souvisí se stimulací produkce erytrocytů a stimulací dělení a diferenciace kmenových erytroidních progenitorů v kostní dřeni. Termín „EPO protein“ zahrnuje takové proteiny libovolně modifikované, například místně cíleno mutagenezí nebo náhodnými mutacemi. Tyto termíny také zahrnují analogy obsahující od 1 do 6 dalších glykosylačních míst, analogy obsahující ales30 ροή jednu další aminokyselinu na karboxylovém konci proteinu, kde tato další ekvivalentní obsahuje alespoň jedno glykosylační místo, a analogy obsahující sekvence, které obsahují přestavbu alespoň jednoho v Evropské patentové přihlášce a. 640619. Tyto termín zahrnují jak přirozený, tak rekombinantně produkovaný lidský erytropoetin,
Termín „v podstatě homologní“ označuje konkrétní sekvence, například mutantní sekvence, které se liší referenční sekvence jednou nebo více dalšími substitucemi, delecemi nebo adicemi, které nezpůsobují nežádoucí funkční odlišnosti od referenční sekvence. Pro účely předkládaného vynálezu jsou sekvence mající vyšší než 95% homologii, ekvivalentní biologické vlastnosti a ekvivalentní expresní charakteristiky považovány za v podstatě homologní. Pro stanovení homologie nesmí být zkrácení zralé sekvence bráno v úvahu. Sekvence mající menší stupně homologie, srovnatelnou bioaktivitu a ekvivalentní charakteristiky exprese jsou považovány za v podstatě ekvivalentní.
Termín „fragment“ EPO proteinu označuje jakýkoliv protein nebo póly peptide mající amino45 kyselinovou sekvenci části nebo fragmentu EPO proteinu, a biologickou aktivitu EPO. Fragmenty zahrnující proteiny nebo polypeptidy produkované proteolytickou degradací EPO proteinu nebo produkované chemickou syntézou způsobenou běžným v oboru. EPO protein nebo jeho fragment je biologicky aktivní, když podání proteinu nebo jeho fragmentu člověku vede ke stimulaci produkce erytrocytů a stimulaci dělení a diferenciace kmenových erytroidních proge50 nitorů v kostní dření. Stanovení takové biologické aktivity EPO proteinu může být provedeno běžnými, dobře zavedenými tedy používanými pro tento účel, které jsou prováděny na jednom nebo více druzích savců. Vhodný test, který může být použit pro stanovení biologické aktivity, je zde popsán.
-3CZ 301833 B6
Termín „terapeuticky účinné množství“ označuje množství erytropoetinového glykoproteinu nutné pro in vivo biologickou aktivitu spočívající ve stimulaci buněk kostní dřeně k produkci retikulocytů a erytrocytů. Přesné množství erytropoetinového glykoproteinu závisí na faktorech jako je konkrétní léčení onemocnění, stav léčeného pacienta a složení prostředku. Farmaceutické prostředky obsahující erytropoetinový glykoprotein mohou být připraveny v síle účinné při podání různými způsoby lidskému jedinci s onemocněním krve charakterizovaným nízkou nebo defektní produkcí erytrocytů. Průměrné terapeuticky účinné množství erytropoetinového glykoproteinového produktu může být různé a mělo by být určeno kvalifikovaným lékařem podle uvedených doporučení.
Předkládaný vynález se týká erytropoetinových glykoproteinových produktů majících biologickou aktivitu in vivo, která stimuluje buňky kostní dřeně v produkci retikulocytů a erytrocytů, které mají vzorec 1:
P-[NH^O-X-S-Y4OCH2CH3)mOR]n i, kde X a Y jsou stejné, jak jsou definovány výše, m je od 450 do 900, n je od 1 do 3, R je nižší alkyl a P je erytropoetinový glykoprotein bez amino skupiny nebo amino skupin, které tvoří amidovou vazbu s Y. Jak je podrobněji uvedeno dále, je příprava a přečištění EPO dobře známá v oboru. Termínem EPO je označován přirozený nebo rekombinantní protein, výhodně lidský, který' je získaný z jakéhokoliv zdroje, jako je tkáň, buněčná kultura pro syntézu proteinů s přirozenými nebo rekombinantními buňkami. Jakýkoliv protein mající aktivitu EPO, jako například mutein nebo jinak modifikovaný protein, spadá do tohoto rozsahu. Rekombinantní EPO může být připraven expresí v CHO-, BHK- nebo HeLa buněčných liniích, rekombinantní DNA techno25 logií nebo aktivace endogenních genů, tj. expresí erytropoetinového glykoproteinu po aktivaci endogenního genu. Výhodné druhy EPO pro přípravu erytropoeti n-glykoprote i nových produktů jsou lidské druhy EPO. Výhodněji jsou EPO lidské EPO mající aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo obr. 2 (SEQ ID NO: 2), a nejvýhodnější je lidský EPO mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO: I).
Lidský erytropoetinový protein může být také modifikován tak, aby obsahoval alespoň jednou další místo pro glykosylaci, například 1 až 6 dalších glykosylačních míst, jak je tomu, například, v aminokyselinových sekvencích, uvedených dále. Výrazy uvedené dále znamenají, že sekvence uvedená na obr. 1 byla modifikována substitucí přirozené aminokyseliny v pozici označené číslem v horním indexu za aminokyselinu uvedenou vlevo od horního indexu.
Asn30Thr32 Obr. 1;
Asn51Thr53 Obr. 1;
-4CZ 301833 B6
| Asn57Thr59 Obr. | 1; |
| Asn69 Obr. 1; | |
| Asn69Thr71 Obr. | , i; |
| Ser68Asn69Thr71 | Obr. 1; |
| Val87Asn88Thr90 | Obr. 1; |
| Ser81Asn88Thrso | Obr. 1; |
Ser87Asn88Gly90Thr92 Obr. 1, Ser87Asn88Thr90Thr92 Obr. 1 Ser87Asn88Thr92Ala162 Obr. 1, Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 Obr. 1; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 Obr. 1; Asn89lle90Thr91 Obr. 1;
Ser87Asn89Ile98Thr91 Obr. Asn136Thr138 Obr. 1; Asn138Thr140 Obr. 1; Thr122 Obr. 1; a Pro124Thr125 Obr. 1.
1;
Lidský erytropoetinový protein může být také analog obsahující alespoň jednu další aminokyselinu na karboxylovém konci glykoproteinu, kde další aminokyselina obsahuje alespoň jedno glykosylační místo, tj. glykoprotein má sekvenci obsahující sekvenci lidského erytropoetinu a druhou sekvenci na karboxylovém konci sekvence lidského erytropoetinu, kde druhá sekvence obsahuje alespoň jedno glykosylační místo.
Další aminokyselina může obsahovat peptidový fragment získaný z karboxylového konce lidského choriogonadotropinu. Výhodně je glykoprotein analog vybraný ze skupiny zahrnující (a) ío lidský erytropoetín mající aminokyselinovou sekvenci Ser Ser Ser Ser Lys Ala pro Pro Pro Ser
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID NO:3), která je navázána na karboxylový konec; (b) analog podle (a) dále obsahující Ser Asn Thr EPO; a (c) analog podle (a) dále obsahující Asn30 Thr3 Val87 Asn88 Thr90 EPO.
Lidský erytropoetín protein může být také analog obsahující aminokyselinové sekvence, které mají přestavbu alespoň jednoho místa pro glykosylaci. Přestavba může obsahovat deleci jakéhokoliv N-vázaného uhlovodíkového místa v lidském erytropoetinu a adici N-vázaného uhlovodíkového místa v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského erytropoetinu. Výhodně je glykoprotein analog vybrán ze skupiny zahrnující Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90
EPO; a Gin83 Ser87 Asn83 Th/° EPO.
Erytropoetinové analogy s dalšími glykosylačními místy jsou popsány v Evropské patentové přihlášce 640619, Elliot, publikované 1.3,1995, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz.
Ve vzorci 1 může R znamenat jakékoliv nižší alkyl, to znamená lineární nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující od 1 do 6 atomů uhlíku, jako je methyl, ethyl, isopropyl atd. Výhodným alkylem je methyl.
-5CZ 301833 B6
Ve vzorci 1 X znamená 4CH2\- nebo -CH2(O-CH2-CH2)i<- kde kje od 1 do přibližně 10. Výhodně je k od 1 do přibližně 4, výhodněji je k 1 nebo 2. Nej výhodněji je X - (CH2).
Ve vzorci 1 Y znamená
Nejvýhodněji je Y
io Ve vzorci 1 je m vybrán tak, že výsledný konjugát vzorce I má fyziologickou aktivitu srovnatelnou s EPO, kde tato aktivita může být stejná, větší nebo menší než aktivita nemodifikovaného EPO. m. označuje počet ethylenoxidovýcb zbytků v PEG jednotce. Jedna PEG podjednotka -(CH2CH2)- má molekulovou hmotnost přibližně 44 daltonů. Proto závisí molekulová hmotnost konjugátu (bez molekulové hmotnosti EPO) na číslu m. Molekulová hmotnost „přibližná“ určitému číslu znamená, že je v rozumném rozmezí od daného čísla, jak je určeno běžnými analytickými technikami, m je celé číslo v rozmezí od přibližně 450 do přibližně 900 (což odpovídá molekulové hmotnosti od 20 do 40 kDa) výhodně je m od přibližně 550 do přibližně 800 (přibližně 24 až 35 kDa), a nejvýhodněji je m od přibližně 650 do přibližně 700 (přibližně 29 až přibližně 31 kDa).
Ve vzorci 1 je číslo n počet amino-skupin lysínů v erytropoetinovém proteinu kovalentně navázaných na PEG jednotku amidovou vazbou. Konjugát podle předkládaného vynálezu může obsahovat jednu, dvě nebo tři PEG jednotky na molekulu EPO. n je celé číslo od 1 do 3, výhodně je n 1 nebo 2, a ještě lépe je n“l.
-6CZ 3U1833 B6
Výhodné erytropoetin-glykoproteinové produkty mají vzorec:
-H
Yx's 0
OR ar
>
kde P, R, X, m a n jsou stejné, jak jsou definovány výše.
Nej výhodnější erytropoetin-glykoproteinové produkty mají vzorec:
O
H
kde P, R, X, M a n jsou stejné, jak jsou definovány výše.
Další výhodné erytropoetin-glykoproteinové produkty mají vzorec:
kde Pje na jsou stejné, jak jsou definovány výše.
Výhodné sloučeniny jsou ty, kde X znamená -(ίΤ-ύΧ-, zejména ty, kde k je od 1 do 4, nejvýhodněji ty, kde X je -CH2-.
Vynález také zahrnuje konjugáty, kde m je celé číslo do 550 do 800, výhodně je m celé číslo od 650 do 700.
-7CZ 301833 B6
Výhodné sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou ty, kde n je 1 a/nebo Rje methyl.
Dále se předkládaný vynález týká výše uvedených sloučenin, kde průměrná molekulová hmot5 nost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od přibližně 24 kilodaltonů do přibližně 35 kilodaltonů, výhodněji od přibližně 30 kilodaltonů.
Dále se předkládaný vynález týká výše uvedených sloučenin, kde glykoprotein je kovalentně navázán na jednu nebo dvě poly(ethylenglykolové skupiny) s navázanou nižší alkoxy skupinou, io výhodněji na jednu poly(ethylenglykolovou) skupinu s navázanou nižší alkoxy skupinou.
Ve výhodném provedení jsou poly(ethylenglykolové) skupiny navázané na methoxy skupinu.
V nej výhodnějším provedení se vynález týká sloučenin uvedených výše, kde X je -CH3- mje celé číslo od 650 do 700, n je 1, Rje methyl a průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je přibližně 30 kilodaltonů.
V ještě jiném provedení se vynález týká způsobu léčby anemie u člověka, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství erytropoetin-glykoproteinového produktu vzorce 1.
V ještě jiném provedení se vynález týká způsobu přípravy erytropoetin-glykoproteinového produktu majícího biologickou aktivitu in vivo, která stimuluje buňky kostní dřeně k zvýšení produkce retikulocytů a erytrocytů, kde uvedený způsob zahrnuje kroky:
(a) kovalentní reakce s ε-amino skupinou lysinu erytropoetinového proteinu vzorce P-fNPTE, s bi-funkčním činidlem vzorce Z-CO-X-S-Q, za zisku meziproduktu s amidovou vazbou vzorce:
P-[NH-CO-X-S“Q]n kde P je erytropoeti nový protein bez amino skupiny, která tvoří amidovou vazbu; n je celé číslo do 1 do 3; Z je reaktivní skupina, například karboxyl-NHS ester; X je -(CH2)-r- nebo -CH^O-CH^-Chl·))—. kde kje od 1 do přibližně lé; a Q je chránící skupina, jako je alkanoyl, například acetyl.
(b) kovalentní reakci meziproduktu s amidovou vazbou z kroku (a) s aktivovaným polyethylenglykolovým derivátem vzorce W-[OCH2CH2]m-OR, za zisku erytropoetin-glykoproteinového produktu vzorce:
-8CZ 301833 B6 kde W je sulfhydrylová reakce forma Y; m je celé číslo od přibližně 450 do přibližně 900; R je nižší alkyl; a Y je
nebo
V tomto provedení je bifunkčním činidlem výhodně N-sukcínimidyl-S-acetylthiopropionat nebo 5 N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát, Z je výhodně N-hydroxysukcinimid a aktivovaný polyethylenglykolový derivát W-[OCH2CH2]m-OR je výhodně vybrán ze skupiny zahrnující jod-acetyl-methoxy-PEG, methoxy-PEG-vinylsulfon a methoxy-PEG-maleimid.
Další provedení předkládaného vynálezu se týká prostředku obsahujícího konjugáty, kde každý io z uvedených konjugátu obsahuje erytropoetin-glykoprotein obsahující alespoň jednu volnou amino skupinu a mající biologickou aktivitu in vivo stimulující buňky kostní dřeně ke zvýšené produkci retikulocytů a erytrocytů, které je vybrán ze skupiny zahrnující lidský erytropoetin a jeho analogy, které mají primární strukturu lidského erytropoetinu modifikovanou adicí od 1 do glykosylačních míst nebo přestavbou alespoň jednoho glykosylačního místa; kde uvedený 15 glykoprotein je kovalentně navázán na jednu až tři nižší-alkoxy-poly(ethylenglykolové) skupiny, kde každá poly(ethylenglykolová) skupina je kovalentně navázaná na glykoprotein prostřednictvím spojovací skupiny vzorce -C(0)-X-S-Y- kde C(O) spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených amino skupin,
X je 4CHA- nebo -CH2(O-CH2-CH2\-; k je od 1 do 10,
Y je nebo
průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od přibližně 20 kilodalton do přibližně 40 kilodaltonů, a molekulová hmotnost konjugátu je od přibližně 51 kilodaltonů do přibližně 175 kilodaltonů; a procento konjugátů, kde n je 1, je alespoň 90%. Výhodně obsahují prostředky konjugátu definované výše, kde n je 1 v alespoň 90%, výhodněji takové konjugáty, kde n je 1 v alespoň 92%, ještě výhodněji takové konjugáty, kde n je 1 v alespoň 96% a nej výhodněji takové konjugáty, kde n je 1 v alespoň 90% až 96%.
-9CZ 301833 B6
Dále předkládaný vynález zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující konjugát nebo přípravek definovaný výše a farmaceuticky přijatelné přísady a použití konjugátu nebo prostředků definovaných výše pro přípravu léčiv pro léčbu nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF), AIDS a pro léčbu pacientů s nádorovým onemocněním během chemoterapie. Dále vynález zahrnuje způsob léčby nebo profylaxe onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF), AIDS a léčby pacientů s nádorovým onemocněním během chemoterapie, který zahrnuje krok podání prostředků definovaných výše pacientům.
Vynález se také týká způsobu přípravy konjugátu nebo prostředků definovaných výše, které zahrnuje kovalentní navázání thiolových skupin na erytropoetin-glykoprotein a navázání výsledného aktivovaného erytropoetin-glykoproteinu na derivát poly(ethylengykolu) (PEG). Dále vynález poskytuje konjugáty a prostředky definované výše připravené způsobem popsaným výše, a konjugáty a prostředky definované výše pro léčbu nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF), AIDS a pro léčbu pacientů s nádorovým onemocněním během chemoterapie.
Způsob exprese EPO proteinů
Erytropoetin (EPO) je lidský glukoprotein, který stimuluje tvorbu erytrocytů. Jeho příprava a terapeutické aplikace jsou popsány podrobně například v U.S. patentech 5,547,933 a 5,621,080, EP-B 0148605, Huang, S.L., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0205564, EP-B 0209539 a EP-B 0411678, stejně jako v Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986)
3116-3121, Sasaki, H. Et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. Erytropoetin pro terapeutické použití může být produkován rekombinantně (EP-B 0148605, EP-B 0209539 a Egrit, J.C. Strickland, T.W., Lané, J. et al (1986) Immunobiol. 72: 213-224). Exprese proteinů, včetně EPO, aktivací endogenního genu, je dobře známá v oboru a je popsána v, například, U.S. Patentech 5,733,761, 5,641,670 a 5,733,746, a Mezinárodní patentové přihlášce WO 93/09222,
3() WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 a WO 91/09955, jejichž obsah je zde uveden jako odkaz.
Způsoby pro expresi a přípravu erytropoetinu v bezsérovém mediu jsou popsány například ve WO 96/35718, Burg, publikované 14.11. 1996, a v Evropské patentové přihlášce 53738, Koch, publikované 12.6.1992.
Způsoby pro přečištění lidského EPO proteinu
Kromě výše uvedených odkazů je známo, že může být provedena bezsérová fermentace rekombinantntch CHO buněk, které obsahují EPO gen. Takové způsoby jsou popsány například EP-A 0513738, EP-A 0267678 a obecněji v Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. a Franěk, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0481 791, EP-A 0307247, EP-A 0343635, WO 88/00967.
V EP-A 0267678 je popsána iontoměničová chromatografie na S-Sepharose, preparativní HPLC s reverzní fází na C8 koloně a gelová filtrační chromatografie pro čištění EPO produkovaného v bezsérové kultuře po dialýze. V této souvislosti může být krok gelové filtrační chromatografie nahrazen iontoměničovou chromatografíí na S-Sepharose s rychlým průtokem. Také může být před iontoměničovou chromatografíí provedena chromatografíí na Blue Trisacryl koloně.
Způsob pro přečištění rekombinantního EPO je popsán v Nobuo, L et al, J. Biochem. 107 (1990) 352-359. V tomto způsobu je EPO zpracován roztokem TweenÍR) 20, fenylmethylsulfonylfluoridem, ethyl maleimidern, pepstatinem A, síranem měďnatým a kyselinou oxamovou před stupni přečišťování.
- 10CZ 301833 B6
Různé odkazy, jako například WO 96/35718, Burg, publikovaná 14.11. 1996, popisuji způsob přípravy erytropoetinu v bezsérovém fermentačním procesu (EPOsf). Jeden způsob přípravy EPO jako výchozího materiálu pro pegylaci je popsán dále.
Biologický test pro stanovení specifické aktivity EPO a EPO konjugátů
Specifická aktivita EPO nebo EPO konjugátů podle předkládaného vynálezu může být stanovena různými testy známými v oboru. Biologická aktivita přečištěných EPO proteinů podle předkláío daného vynálezu je taková, že po podání EPO proteinu injekcí člověku dojde je stimulaci buněk kostní dřeně k produkci retikulocytů a erytrocytů ve srovnání s netečenou nebo kontrolní skupinou jedinců. Biologická aktivita EPO proteinů nebo jejich fragmentů, získaných a přečištěných způsobem podle předkládaného vynálezu, může být testována způsobem podle Pharm. Europa
Spec. Issue Erytropoetin BRP Bio 1997 (2). Další biologický test pro určení aktivity EPO proteinu, test na normocytemických myších, je popsán v příkladu 4.
Způsoby přípravy pegylovaného EPO
Způsoby přípravy erytropoetin-glykoprote i nových produktů vzorce I zahrnují kovalentní navázá20 ní thiolových skupin na EPO („aktivace“) a kondenzace získaného aktivovaného EPO s polyethylen gly kolovým) (PEG) derivátem. Prvním stupněm při přípravě pegylovaného EPO podle předkládaného vynálezu zahrnuje navázání thiolových skupin pres NEL-skupinu EPO. Tato aktivace EPO je provedena za použití bi-funkčních Činidel, které obsahují aktivovanou chráněnou thiolovou skupinu a další reaktivní skupiny, jako jsou aktivní estery (například sukcinimidyl25 ester), anhydridy, estery kyseliny sulfonové, halogenidy karboxylových a sulfonových kyselin, v příslušném pořadí. Thiolova skupina je chráněna skupina známými v oboru, například acetylovými skupinami. Tato bifunkční činidla jsou schopna reagovat s amino skupinami lysinu za vzniku amidové vazby. První stupeň reakce je uvedena dále:
EP0fNHj + YX-SY
OZ CH,
kde EPO, n a X jsou stejné, jako jsou definovány výše a Z je reaktivní skupina známá v oboru, například N-hydroxysukcinimidový (NHS) substituent vzorce
O
Ve výhodném provedení je aktivace ε-amino skupiny lysinu provedena reakcí s bifunkční činidlem obsahujícím sukcinimidylovou skupinu. Bifunkční činidla mohou obsahovat různé oddělovací skupiny, například -(CHiX- nebo -CH2-(O-CH2-CH2-), kde k je od 1 do přibližně 10, výhodně od 1 do přibližně 4, a výhodněji 1 nebo 2, s nejvýhodněji 1. Příklady takových činidel jsou N-sukcinimidyl-S-acetylthioproipionat (SATP) a N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát (ŠATA)
O
O
- II CZ 301833 B6 acetylthioalkyl-karboxylová kyselina-NHS-ester
2-(acetylthio)~ethoxy)k-kyselina octová-NHS-ester kde k je stejný, jakje definován výše.
Příprava bifunkčního činidla je známá v oboru. Prekursory 2-(acetylthio)-(ethoxy)k-kyselína octová-NHS-esterů jsou popsány v DE-3 924705, a derivatizace na acetyl thio- sloučeninu je popsána v March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill 1977, 375-376. ŠATA je dostupná komerčně (Molecular Probes, Eurogene, OR, USA a Pierce, Rockford, IL).
ío Počet thiolových skupin, které mají být přidány k EPO molekule, může být vybrán pomocí úpravy reakčních parametrů, tj, koncentrace EPO proteinů (EPO) a poměru protein/bifimkční činidlo. Výhodně je EPO aktivován kovalentním navázáním od 1 do 5 thiolových skupin na EPO molekulu, výhodněji od 1,5 do 3 thiolových skupin a EPO molekulu. Tyto rozmezí označují statistickou distribuci thiolových skupin v populaci EPO proteinů.
Reakce se provede, například, ve vodném pufrovacím roztoku, pH 6,5 až 8,0, například v 10 mM fosforečnanu draselném, 50 mM NaCl, pH 7,3. Bifunkční činidlo může být přidáno v DMSO. Po dokončení reakce, výhodně po 30 minutách, se reakce ukončí přidáním lysinu. Nadbytek bifunkčního činidla může být separován způsoby známými v oboru, například dialýzou nebo filtrací na koloně. Průměrný počet thiolových skupin přidaných na EPO může být stanoven fotometrickou metodou, která je popsána například v Grasetti, D.R. a Murray, J.F., vj. Apl. Biochem. Biotechnol. 199,41-49 (1967).
Po výše uvedené reakci následuje kovalentní navázání aktivovaného polyethylenglykolového 25 (PEG) derivátu. Vhodné PEG deriváty jsou aktivované PEG molekuly s průměrnou molekulovou hmotností od přibližně 20 do přibližně 40 kDA, výhodněji od přibližně 24 do přibližně 35 kDA a nejvýhodněji přibližně 30 kDa.
Aktivované PEG deriváty jsou známé v oboru a jsou popsány, například, v Morpurgo, M. et al. 30 J. Bioconj. Chem. (1996) 7, str. 363 ff pro PEG-vinylsulfon. PEG s lineárním a rozvětveným řetězcem jsou vhodné pro přípravu sloučeniny vzorce 1.
Příklady reaktivních PEG činidel jsou jod-acetyl-methoxy-PEG a methoxy-PEG-vinylsulfon:
nebo
Použití jodem-aktivovaných substancí je známé v oboru a je popsané například v Hermanson, G. T. v Biokonjugát Techniquess Academie Press, San Diego (1996) p. 147-148.
- 12CZ 301833 B6
Nejvýhodněji jsou PEG aktivovaném maleimidem za použití (Alkoxy-PEG-maleímidu), jako je methoxy-PEG-maleimid (MW 30000; Shearwater Polymers, lne.). Struktura alkoxy-PEGmaleimidu je následující:
ncbo
í H m kde Ra m jsou stejné, jak jsou definovány výše.
Nejvýhodnějším derivátem je
kde R a m jsou stejné, jak jsou definovány výše.
OR
Kondenzační reakce s alkoxy-PEG-maleimidem probíhá po in šitu štěpení skupiny chránící thiol ve vodném pufrovacím roztoku, například v 10 mM fosforečnanu draselném, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6,2. Štěpení chránící skupiny může být provedeno, například, za použití hydroxylaminu v DMSO při teplotě 25 °C, pH 6,2 po dobu přibližně 90 minut. Pro modifikaci PEG by měl být molámí poměr aktivovaného EPO/alkoxy-PEG-maleimidu od přibližně 1:3 do přibližně 1:6, a výhodně 1:4. Reakce může být ukončena přidáním cysteinu a reakcí zbývajících thiol (-SH) skupin s N-methylmaleimidem nebo jinou vhodnou sloučeninou schopnou tvořit disulfidové vazby. Z důvodu reakce jakékoliv zbývající aktivní thiolové skupiny s chránící skupinou, jako je N-methylmaleimid nebo jiná chránící skupina, mohou EPO glykoproteiny v konjugátech podle předkládaného vynálezu může obsahovat takové chránící skupiny. Zde popsaný obecný postup bude produkovat směs molekul majících různý počet thiolů chráněných různým počtem chránících skupin, v závislosti na počtu aktivovaných thiolových skupin na glykoproteinu, které nebyly konjugovány na PEG-maleimid.
Zatímco N-methylmaleimid tvoří stejný typ kovalentní vazby, když je použit pro blokování zbývajících thiolových skupin nebo pegylovaném proteinu, disulfidové sloučeniny způsobují intermolekulovou sulfid/disulfid výměnou reakci vedoucí ke kondenzaci blokovacího činidla prostřednictvím disulfidových můstků. Výhodné blokovací činidla pro tento typ blokací reakce jsou oxidovaný glutathion (GSSG), cystein a cystamin. Zatímco cystein nepřidává pegylovanému proteinu žádný další náboj, použití blokovacího činidla GSSG nebo cystaminu vede k přidání dalšího negativního nebo pozitivního náboje.
Další přečištění sloučeniny vzorce I, včetně separace mono-, di- a tri-pegylovaných EPO, může 35 být provedeno způsoby známými v oboru, například, chromatografií na koloně.
- 13 CZ 301833 B6
Farmaceutické produkty
Eritropoetín-glykoproteinové produkty připravené podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny ve farmaceutických prostředcích nebo vehikulem za použití způsobů známých v oboru. Vhodné prostředky jsou popsány například ve WO97/09996, W097/40850, WO98/58660 a W 99/07401. Mezi výhodné farmaceuticky přijatelné nosiče pro přípravu produktů podle předkládaného vynálezu patří lidský sérový albumin, lidské plazmatické proteiny, atd. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny v 10 mM fosforečnan sodný/draselný pufru při pH 7 obsahujícím činidlo upravující tonicitu, například 132 mM chlorid sodný, io Volitelně mohou farmaceutické prostředky obsahovat konzervační činidlo. Farmaceutické prostředky mohou obsahovat různá množství erytropoetinu, například 10-1000 gg/ml, například μg nebo 400 μg.
Léčba hematologie kých onemocnění charakterizovaných nízkou nebo defektní produkcí erytro15 cytů
Podávání erytropoetin-glykoproteinových produktů podle předkládaného vynálezu vede u člověka k tvorbě erytrocytů. Tak nahrazuje podávání erytropoetin-glykoproteinových produktů tento EPO protein, který je významný pro produkci erytrocytů. Farmaceutické prostředky obsahující erytropoetin-glykoproteinové produkty mohou být připraveny v dávce účinné pro podávání různými způsoby lidskému pacientovi s hematologickým onemocněním charakterizovaným nízkou nebo defektní produkcí erytrocytů, samostatným nebo jako součást jiného onemocnění. Farmaceutické prostředky mohou být podávány injekcí, jako je podkožní nebo nitrožilní injekce. Průměrné množství erytropoetin-glykoproteinových produktů mohou být různá a závisí na doporučení ošetřujícího lékaře, Přesné množství konjugátu závisí na faktorech jako je přesný typ léčeného onemocnění, stav léčeného pacienta, a další složky v prostředku. Například může být 0,01 až 10 μg na kg tělesné hmotnosti, výhodně 0,1 až 1 μg na kg tělesné hmotnosti, podáváno například jednou týdně.
jo V uvedeném popisu byly citovány různé odkazy. Tyto odkazy jsou zde uvedeny ve své úplnosti pro podrobnější popis stavu oboru.
Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které ilustrují, ale neomezují, přípravu sloučenin a prostředků podle předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Fermentace a přečištění lidského EPO a) Příprava inokula a fermentace
Jedna zkumavek Working Cell Bank, pocházející z CHO buněčné linie produkující EPO (ATCC
CRL8696, popsaná v EP 411678 (Genetics Instritute)) se vezme z plynné fáze skladovacího zásobníku s tekutým dusíkem. Buňky se přenesou do skleněných odstřeďovacích zkumavek a kultivují se v mediu pufrovaném hydrogenuhličitanem ve zvlhčovaném CO2 inkubátoru, typické bezsérové médium použití pro přípravu inokula a fermentace je popsáno v Evropské patentové přihlášce 513738, Koch, publikované 12.6.1992, nebo WO 96/35718, Burg, publikované 14.11.
1 996, které například obsahuje jako médium DMEM/F12 (například JRH Biosciences/Hazleton
Biologics, Denver, US, pořadové č. 57-736) a dále hydrogenuhličitan sodný, L+glutamin, D+glukózu, rekombinantní insulin, selenin sodný, diaminobutan, hydrokortison, síran železnatý, asparagin, kyselinu asparagovou, serin a stabilizační činidlo pro savčí buňky, jako je například polyvinylalkohol, methy lcelulóza, polydextran, polethylenglykol, Pluronic F68, plasmatický expander polygelin (HEMACCEL(R)) nebo polyvinylpyrrolidon (WO 96/35718).
-14CZ 301833 B6
V kulturách se mikroskopicky ověří nepřítomnost kontaminujících mikroorganismů a stanoví se buněčné density. Tyto testy se provedou při každém dělení kultury.
Po iniciální růstové periodě se buněčná kultura naředí Čerstvým mediem na výchozí buněčnou hustotu a nechá se proběhnout další růstový cyklus. Tento postup se opakuje do té doby, než se získají přibližně 2 1 na skleněnou odstřeďovací zkumavku. Po přibližně 12 děleních se získá 1 až 5 litrů této kultury, která se použije jako inokulum pro 10 l fermentační tank.
io Po 3-5 dnech může být kultura v 10 1 fermentačním tanku použita jako inokulum pro 100 1 fermentační tank.
Po dalších 3-5 dnech kultivace může být kultura v 1001 fermentačním tanku použita jako inokulum pro 1000 1 produkční fermentační tank.
b) Odběr a separace buněk
Použije se proces s obnovenou vsádkou, tj. když se dosáhne požadovaná densita buněk, odebere se přibližně 80 % kultury. Zbývající kultura se doplní čerstvým kultivačním mediem a kultivuje se do dalšího odběru. Jedno kolo produkce se skládá z maximálně 10 následujících odběrů; 9 částečných odběrů a 1 celkového odběru na konci fermentace. Odběry se provádí každé 3 až 4 dny.
Daný odebraný objem se přenese do chladné zkumavky. Buňky se odstraní odstředěním nebo filtrací. Supematant obsahující EPO získaný při odstředění se přímo filtruje a odebírá do druhé chladné zkumavky. Každý odběr se přečišťuje samostatně.
Typický proces pro přečištění EPO-proteinu je popsán ve WO 96/357 18, Burg, publikované 14.11. 1996, Přečištění se provede následovně.
a) Chromatografie na Blue Sepharose
Blue Sepharosa (Pharmacia) se skládá ze Sepharosových korálků, na jejichž povrch je kovalentně navázáno Cibacron modré barvivo. Protože se EPO váže silněji na Blue Sepharosu než na většinu neprote i nových kontaminujících složek, některé proteinové nečistoty a PVA, může být EPO v tomto stupni přečištěn. Eluce Blue Sepharosové kolony se provede zvýšení koncentrace solí a pH.
Kolona se naplní 80 ž 100 1 Blue Sepharosy, regeneruje se NaOH a uvede se do rovnováhy pomocí ekvilibračního pufru (chlorid sodný/vápenatý a octan sodný). Kolona se naplní okysele40 ným a přefiltrovaným supematantem z fermentace. Po naplnění se kolona nejprve promyje pufrem podobným ekvilibračnímu pufru obsahujícím vyšší koncentraci chloridu sodného, a potom pufrem na bázi Tris. Produkt se eluuje pufrem na bázi Tris a odebírá se v jedné frakci podle daného elučního profilu.
b) Chromatografie na Butyl-Toyopearl
Butyl Toyopearl 650 C (TosHaas) je matrice na bází polystyrenu, na kterou jsou kovalentně navázané alifatické butylové zbytky. Protože se EPO váže na tento geo silněji než většina nečistot a PVA, byl gel eluován pufrem obsahujícím isopropanol.
Kolona se naplní 30 až 40 1 Butyl Toyopearl 650 C, regeneruje se NaOH, promyje se pufrem na bázi Tris a uvede se do rovnováhy pufrem na bázi Tris obsahujícím isopropanol.
Eluát z Blue Sepharosy se zpracuje pro koncentrování isopropanolu v koloně naplněné ekviiib55 račním pufrem a plní se do kolony. Potom se kolona promyje ekvilibračním pufrem se stoupající
-15CZ 301833 B6 koncentrací isopropanolu. Produkt se eluuje elučním pufrem (pufr na bázi Tris s vysokým obsahem isopropanolu) a odebere se v jedné frakci podle vzorového elučního profilu.
c) Chromatografie na hydroxyapatitovém ultragelu
Hydroxyapatitový Ultrogel (Biosepra) se skládá z hydroxyapatitu, který je inkorporován do agarózové matrice pro zlepšení mechanických vlastností. EPO má nízkou afinitu k hydroxyapatitu a může být proto eluován při nižší koncentraci fosfátu než proteinové nečistoty.
ío Kolona se naplní 30 až 40 1 hydroxyapatitového ultragelu a regeneruje se fosforečnane draselný/chlorid sodný pufrem a NaOH a potom pufrem na bázi Tris. Potom se kolona uvede do rovnováhy pufrem na bázi Tris obsahujícím nízké množství isopropanolu a chloridu sodného.
Eluát obsahující EPO z Butyl Toyopearl-chromatografie se naplní do kolony. Potom se kolona promyje ekvilibračním pufrem a pufrem na bází Tris bez isopropanolu a chloridu sodného. Produkt se eluuje pufrem na bázi Tris obsahující a nízkou koncentraci fosforečnanu sodného a odebere se v jedné frakci podle vzorového elučního profitu,
d) HPLC s reverzní fází na Vydac C4
RP-HPLC materiál Vydac C4 (Vydac) se skládá ze silikagelových částic, které obsahují na svém povrchu C4-alkylové řetězce. Separatin EPO od proteinových nečistot je založena na různé síle hydrofobních interakcí. Eluce se provede za použití acetonitrilového gradientu v ředěné kyselině trifluoroctové.
Preparatívní HPLC se provede za použití ocelové kolony (naplněné 2,8 až 3,2 litry Vydac C4 silikagelu). Eluát z hydroxyapatitového ultragelu se okyselí přidání kyseliny trifluoroctové a naplní se do Vydac C4 kolony. Po promytí a eluci se použije aceton itr i lovy gradient v ředěné kyseliny trifluoroctové. Frakce se odeberou a ihned se neutralizují fosfátovým pufrem. Frakce obsahující PO spadající do IPC se kombinují,
e) DEAE sepharosová chromatografie
DEAE Sepharosa (Pharmacia) se skládá z diethylaminoethylových (DEAE) skupin, které jsou kovalentně navázané na povrch Sepharosových korálků. Vazba EPO a DEAE skupin je zprostředkována iontovými interakcemi. Acetonitril a kyselina trifluoroctová procházejí kolonou bez toho, že by byly zachyceny. Po vymytí těchto substancí se stopové nečistoty odstraní promytím kolony acetátovým pufrem pri nízkém pH. Kolona se promyje neutrálním fosfátovým pufrem a EPO se eluuje pufrem se stoupající iontovou koncentrací.
Kolona se naplní DEAE Sepharose fast flow. Objem kolony se upraví tak, aby bylo dosaženo náplně EPO v rozmezí 3 až 10 mg EPG/ml gelu. Kolona se promyje vodou a ekvilibračním pufrem (fosforečnan sodný/draselný). Kombinované frakce HPLC eluátu se vnesou do kolony a kolona se promyje ekvilibračním pufrem. Potom se kolona promyje promývacím pufrem (pufr tvořený octanem sodným) a potom ekvilibračním pufrem. Potom se EPO eluuje z kolony elučním pufrem (chlorid sodný, fosforečnan sodný/draselný) a odebere se v jedné frakci podle vzorového elučního profilu.
Eluát z DEAE Sepharosové kolony se upraví na určitou specifikovanou vodivost. Získané léčivo se sterilně přefiltruje do Teflonových zkumavek a uskladní se při teplotě 70 °C.
- 16CZ 301833 B6
Příklad 2: Kovalentní navázání thiolových skupin na EPO
Tento příklad popisuje určení reakčních podmínek pro kovalentní navázání thiolových skupin na EPO. Po stanovení podmínek se různá množství činidel obsahujících blokovanou thiolovou skupinu, zde ŠATA nebo SATP (rozpuštěné v DMSO v koncentraci 10 mg/ml) přidají k roztoku EPO, zde k 1 ml 5 mg/ml EPO v 10 mM fosforečnanu draselného, 50 mM NaCl, pH 7,3. Reakční směs se mísí po dobu přibližně 3 minut (25 °C) a reakce se ukončí přidáním 1 M roztoku lysinu v koncentraci 10 mM. Nadbytečné množství ŠATA a SATP se odstraní dialýzou proti 10 mM fosforečnanu draselného, 50 mM NaCl a 2 mM EDTA, pH 6,2. Po odstranění chránící acetylové io skupiny hydroxylaminem se počet thiolových skupin kovalentně navázaných na EPO určí fotometricky za použití dithiodipyridinu způsobem podle Grasetti, D.R. a Murray, J.F. v J. Appl.
Biochem. Bitechnol. 119, str. 41-49 (1967).
Počet thiolových skupin kovalentně navázaných na molekulu EPO je uveden dále.
| Molární poměr EPO:ŠATA nebo SATP | Mol thiolových skupin / mol EPO |
| EPO:SATA - 1;3 | 1,5 |
| EPO:ŠATA = 1:5 | 2,4 |
| EPO:SATA = 1:6 | 3,2 |
| EPO:SATP =1:3 | 1,3 |
| EPO:SATP = 1:4 | 2,5 |
| EPO:SATP = 1:6 | 3,7 |
—--—
Příklad 3: Modifikace aktivovaného EPO methoxy-PEG-maleimidem
A) Aktivace EPO:
100 mg EPO připraveného podle příkladu 1 (190,00 IU/mg jak se stanoví testem na normocytemických myších) se aktivuje ŠATA (molámí poměr EPO/SATA = 1/5) podle příkladu 2. Získaný EPO („aktivovaný EPO“) obsahující kovalentně navázané blokované thiolové skupiny se separuje od vedlejších produktů jako je N-hydroxy-sukcinimid nebo nereagovaný ŠATA dialýzou, jak je popsáno v příkladu 1. Získá se roztok 4,5 mg/ml aktivovaného EPO v 10 mM fosforečnanu draselného, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2.
B) Pegylace aktivovaného EPO:
380 mg methoxy-PEG-maleimidu s nejvýhodnější strukturou, jak je ilustrována výše, (Mol.
hmot. 3000; Shearwater Polymers, lne., Huntsville (Alabama, USA)) se rozpustí ve výše uvedeném roztoku obsahujícím 95 mg aktivovaného EPO (4,5 mg/ml v 10 mM fosforečnanu draselném, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2). Získaný molámí poměr mezi aktivovaným EPO a methoxy-PEG-maleimidem v roztoku je 1:4. Přidáním 1 M vodného roztoku, se odblokují kovalentně navázané blokové thiolové skupiny aktivovaného EPO. Získaný aktivovaný EPO v reakční směsi obsahuje volné thiolové (-SH) skupiny. Deblokování thiolových skupin se provede ihned po kondenzační reakci mezi aktivovaným EPO nyní obsahujícím volné thiolové (-SH) skupiny a methoxy-PEG-maleimidem trvající 90 minut (míšení, 25 °C). Kondenzační reakce se ukončí přidáním 0,2 M vodného roztoku cysteinu v koncentraci 2 mM do reakční směsi. Po 30 minutách se nadbytek volných thiolových skupin aktivovaného EPO, které nereagovaly s methoxy-PEG-maleimidem, blokuje přidáním 0,5 M roztoku N-methylmaleimidu
- 17CZ 301833 B6 v DMSO za dosažení koncentrace 5 mM. Po 30 minutách se získaná reakční směs nyní obsahující pegylovaný EPO dialyzuje proti 10 mM fosforečnanu draselného, pH 7,5, po dobu 15 hodin. C) Přečištění pegylovaného EPO:
Pro separaci pegy lovaného EPO od reakční směsi se provede následující přečištění: 50 ml Q-Sepharosová ff kolona se uvede do rovnováhy 10 mM fosforečnanem draselným, pH 7,5. Reakční směs získaná ve stupni B) se naplní do kolony (průtok: 3 objemy kolony (CV) za hodinu). Pro odseparování nezreago váného methoxy-PEG-rnaleimidového činidla se kolona io promyje 5 CV 10 mM fosforečnanu draselného, pH 7,5. Pegylovaný EPO se separuje elucí roztokem se stoupajícím gradientem solí obsahujícím, 5 CV pufru A (10 mM fosforečnan draselný, pH 7,5) a 5 CV pufru B (10 mM fosforečnan draselný, 500 mM NaCl, pH 7,5) s průtokem 3 CV za hodinu. Podle gradientu NaCL se pegylovaný EPO (tri- bi- a monopegylovaný EPO) eluuje nejdříve a po něm se eluuje nepegylovaný EPO. Frakce eluátu obsahu15 jící pegylovaný EPO (tri, di- a mono-pegylovaný EPO) se odeberou a přefiltrují se (sterilní filtrace přes 0,2 ptm filtr).
Obsah a čistota tri- di- a mono-pegylovaného EPO se hodnotí na Coomassie-barvených SDS-PAA gelech (Laemmli, Nátuře 227, 680-685 (1970)), zatímco koncentrace protein se měří při 280 nm podle Beer-Lambertova pravidla. Zřetelná molekulová hmotnost EPO se určí SDS-PAA elektroforesou a je přibližně 68 kDA (mono-pegylovaný EPO), přibližně 98 kDa (di-pegylovaný EPO) a přibližně 128 kDa (tri-pegyl ováný EPO).
Další separace tri-, di a mono-pegylovaného EPO může být provedena za použití chromát o25 grafíe, například chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (Superdex, pg 200; Pharmacia).
Stanovení biologické aktivity eluátu obsahujícího tri-, di- a mono-pegylované EPO in vivo se provede způsobem popsaným v příkladu 4.
Příklad 4: Určení tn-vivo aktivity pegylovaného EPO testem na normocytemických myších
Test na normocytemických myších je známý v oboru (Pharm. Europa Spec. Issue Erytropoetin
BRP Bio 1997(2)) a monografie erytropoeti nu Ph. Eur. BRP. Vzorky se naředí BSA-PBS. Normálním zdravým myším věku 7 až 15 týdnů se podá s.c. 0,2 ml EPO-frakce obsahující tri-, di- a monopegylované EPO, jak jsou popsány v příkladu 2 během 4 denního období začínajícího 72 hodin po podání se odebírá krev punkcí ocasní žíly a naředí se tak, že 1 μΐ krve je přítomen v 1 ml barvicího roztoku obsahujícího 0,15 μηιοΙ akridinového oranže. Doba barvení je 3 až
10 minut. Recticulocyty se počítají mikrofluorometrícky v průtokové cytometru analýzou histogramu červené fluorescence. Počty retikulocytů jsou uvedeny jako absolutní čísla (na 30 000 analyzovaných erytrocytů). Pro prezentovaná data se každá skupina skládá z 5 myší na den a myším byla odebírána krev pouze jednou.
Myším se podá methoxy-PEG-maleimid navázaný na EPO podle příkladu 3, nemodifikovaný EPO a pufrovaný roztok, Výsledky jsou uvedené na obr. 3. Výsledky ukazují lepší aktivitu a prodloužený poločas pegylovaného EPO, což ukazuje signifikantně zvýšené množství retikulocytů a posuv maximálního počtu retikulocytů za použití stejné dávky na myš.
-18CZ 301833 B6
Seznam sekvencí (l) Obecné informace (i) Přihlašovatel (A) Jméno: F. Hoffmann - La Roche AG (B) Ulice: 124 Greazacherstrasse (C) Město: Basel (E) Stát: Switzerland io (F) Poštovní kok (ZIP): CH-W70 (G) Telefon: (61)6881111 (H) Telefax: (61)6881395 (I) Telex: 962292 hlrch (ii) Název vynálezu: Konjugáty erytropoetinu s polyethylenglykolem (iii) Počet sekvencí: 3 (iv) Počítačové čtecí médium:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: WORD (D) Software: PatenIN Release 2.0 <170> Patentln ver. 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo Sapiens
| <400> 1 | Leu 5 | Ile Cys Asp | Ser Arg Val 10 | Leu Glu Arg Tyr 15 | Leu | ||||||||||
| Ala Pro 1 | Pro | Arg | |||||||||||||
| Leu | Glu | Ala | Lys | Glu | Ala | Glu | Asn | Ile | Thr | Thr | Giy | Cys | Ala | Glu | His |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Cys | Ser | Leu | Asn | Glu | Asn | Ile | Thr | Val | Pro | Asp | Thr | Lys | Val | Asn | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Tyr | Ala | Trp | Lys | Arg | Met | Glu | Val | Gly | Gin | Gin | Ala | Val | Glu | Val | Trp |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Gin | Gly | Leu | Ala | Leu | Leu | Ser | Glu | Ala | Val | Leu | Arg | Gly | Gin | Ala | Leu |
| 65 | 70 | 75 | SO | ||||||||||||
| Leu | Val | Asn | Ser | Ser | Gin | Pro | Trp | Glu | Pro | Leu | Gin | Leu | Kís | Val | Asp |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Lys | Ala | Val | Ser | Gly | Leu | Arg | Ser | Leu | Thr | Thr | Leu | Leu | Arg | Ala | Lsu |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Gly | Ala | Gin | Lys | Glu | Ala | Tle | Ser | Pro | Pro | Asp | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Arg | Thr | Ile | Thr | Ala | Asp | Thr | Phe | Arg | Lys | Leu | Phe | Arg | Val |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Tyr | Ser | Asn | Pne | Leu | Arg | Gly | Lys | Leu | Lys | Leu | Tyr | Thr | Gly | Glu | Ala |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Cys | Arg | Thr Gly Asp |
165
-19CZ 301833 B6 <210>2 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens
| <400> 2 | |||||||||||||||
| Ala | Pro | Pro | Arg | Leu | Ile | Cys | Asp | Ser | Arg | Val | Leu | Glu | Arg | Tyr | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | Glu | Ala | Lys | Glu | Ala | Glu | Asn | Ile | Thr | Thr | Gly | cys | Ala | Glu | His |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Cys | Ser | Leu | Asn | Glu | Asn | Ile | Thr | Val | Pro | Asp | Thr | Lys | Val | Asn | Phe |
40 <5
| Tyr Ala 50 | Trp Lys | Arg | Met | Glu Val 55 | Gly Gin Gin | Ala 60 | Val Glu | Val Trp | |||||||
| Gin | Gly | Leu | Ala | Leu | Leu | Ser | Glu | Ala | Val | Leu | Arg | Gly | Gin | Ala | Leu |
| 6S | 70 | 7S | 80 | ||||||||||||
| Leu | Val | Asn | Ser | Ser | Gin | Pro | Trp | Glu | Pro | Leu | Gin | Leu | His | Val | Asp |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Lys | Ala | Val | Ser | Gly | Leu | Arg | Ser | Leu | Thr | Thr | Leu | Leu | Arg | Ala | Leu |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Gly | Ala | Gin | Lys | Glu | Ala | Ile | Ser | Pro | Pro | Asp | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Arg | Thr | Ile | Thr | Ala | Asp | Thr | Phe | Are | Lys | Leu | Phe | Arg | Val |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Tyr | Ser | Asn | Phe | Leu | Arg | Gly | Lys | Leu | Lys | Leu | Tyr | Thr | Gly | Glu | Ala |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Cys | Arg | Thr | Gly Asp Arg | ||||||||||||
| 155 |
<210>3 <21)> 28 io <212>PRT <213> Homo sapiens <400>3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg I 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin 20 25
-20CZ 301833 B6
Claims (16)
- PATENTOVÉ NÁROKY5 1. Konjugát obsahující erytropoetinový glykoprotein mající alespoň jednu volnou aminoskupinu a vykazující in vivo biologickou aktivitu, kterou je zvýšení produkce retikulocytů a erytrocytů buňkami kostní dřeně, kde erytropoetinový glykoprotein je vybrán ze souboru sestávající z lidského erytropoetinu a jeho analogů, které mají primární strukturu lidského erytropoetinu modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylačních míst nebo přestavbou alespoň jednoho glykoío sylačního místa, jež spočívá v deleci kteréhokoliv z míst s N-připojeným sacharidem v lidském erytropoetinu a adici místa s N-připojeným sacharidem v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského erytropoetinu; kde uvedený glykoprotein je kovalentně navázán na jednu až tri (C|C6)alkoxy poly(ethylenglykolové) skupiny, přičemž každá poly(ethylenglykolová) skupina je kovalentně připojena ke glykoproteinu přes spojovací skupinu vzorce -C(O)~X-S-Y-, kde15 zbytek C(O) spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených aminoskupin,X je 4CH2)k- nebo -€Η2(Ο-€Η2-ΰΗ2χk je Číslo od 1 do 10,Y je skupina vzorce průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od 20 do 40 kilodaltonů, a molekulová hmotnost konjugátu je od 51 do 175 kilodaltonů.
- 2. Konjugát podle nároku 1 obecného vzorceP-[NH-CO-X-S~Y-<OCH2CH2)m-OR]n30 kde X a Y mají stejný význam jako v nároku 1, m je číslo od 450 do 900, n je číslo od 1 do 3, R je (C|-C6)alkyl a P je erytropoetinový glykoprotein bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s X.
- 3. Konjugát podle nároku l nebo 2 obecného vzorce-21 CZ 301833 B6 kde P,R,X,man mají stejný význam jako v nároku 2.
- 4. Konjugát podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce
- 5 kde P, R, X, m a n mají stejný význam jako v nároku 2.5. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde X, je skupina --(C H2)k“
- 6. Konjugát podle nároku 5, kde k je číslo od 1 do 4.
- 7. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde X je skupina -CHr-.
- 8. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde m je celé číslo od 550 do 800.15
- 9. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde m je celé číslo od 650 do 700.
- 10. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde n je číslo 1.
- 11. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde R je methyl.
- 12. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od 24 do 35 kilodaltonů.
- 13. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde průměrná molekulová hmotnost 25 každé poly(ethylenglykol) skupiny je 30 kilodaltonů.
- 14. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde glykoprotein je kovalentně navázán najednu nebo dvě poly(ethylenglykolové) skupiny blokové (C|-C6)alkoxyskupinou.30 15. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde poly(ethylenglykolové) skupiny jsou blokovány methoxyskupínu.16. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde X je skupina -CHr-, m je celé číslo od 650 do 700, n je číslo 1, R je methyl, a průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylen35 glykolové) skupiny je 30 kilodaltonů.17. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde erytropoetí novým glykoproteinem je lidský erytropoetín.40 18. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde erytropoetinový glykoprotein je exprimován aktivací endogenního genu.19. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde erytropoetinový glykoporotein má sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo na obr. 2 (SEQ ID NO: 2).20. Konjugát podle nároku 19, kde erytropoetinový glykoprotein má sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO; 1).-22CZ 3U1&U B621. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků I až 16, kde glykoprotein má sekvenci lidského erytropoetinu modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylačních míst.22. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků I až 6, 8 a 10, kde glykoprotein má modifikovanou 5 sekvenci lidského erytropoetinu, přičemž modifikace je vybrána ze souboru sestávajícího zAsr?°Thr32 ;Asn91Thr53 ;Asn51Thr59 ;Asn59 ;Asn69?hr73 ;Ser68Asn69Thr71 ;Val37Asn88Thr90 ;Ssr87Asn88Thrso ;Ser87Asn88Gly90Thr90 Ser3,Asn88Thr90Thr92 Sers7Asn88Thr92Ala3G2 ; AsnG9Thr71Ser87Asn88Thr90 ; Asn3cThr32Val97Asn8SThr90 ;Asn89lle90Thr91 ;Ser87Asn89Ile90Thr91 ;Asn136Thr138 ;Asn13BThr140 ;Thr125 ; a Pro124Thr125 .23. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde glykoprotein má sekvenci obsahující sekvenci lidského erytropoetinu a druhou sekvenci na karboxylovém konci sekvence lidského io erytropoetinu, kde druhá sekvence obsahuje alespoň jedno giykosylační místo.24. Konjugát podle nároku 23, kde druhá sekvence obsahuje sekvenci získanou zkarboxyterminální sekvence lidského choriogonadotropinu.
- 15 25. Konjugát podle nároku 24, vyznačující se tím, že glykoprotein obsahuje sekvenci vybranou ze souboru sestávajícího za) lidského erytropoetinu mající aminokyselinovou sekvenci Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lle Leu pro Gin (SEQ ID
- 20 NO: 3), umístěnou na karboxylovém konci;b) sekvence uvedenou v odstavci a) modifikované Ser87Asn88Thr90; ac) sekvence uvedenou v odstavci a) modifikované Asn30Thr32Val87Asn88Thr90.-23CZ 301833 B626. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16, kde glykoprotein má sekvencí lidského erytropoetinu modifikovanou přestavbou alespoň jednoho glykosylačního místa definovanou v nároku 1.5 27. Konjugát podle nároku 14, kde glykoprotein má sekvenci lidského erytropoetinu modifikovanou modifikací vybranou ze souboru sestávajícího zGin24 Ser87 Asn Thr90 EPO;Gin39 Ser97 Asn99 Thr90 EPO; aGin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.28. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27.“ io29. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s alespoň 90% podílem konjugátu, v nichž n je číslo 1.30. Kompozice podle nároku, 29 vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle15 kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s alespoň 92% podílem konjugátu, v nichž n je číslo 1.31. Kompozice podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s alespoň 96% podílem konjugátu, v nichž n je číslo 1.20 32. Kompozice podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s 90 až 96% podílem konjugátu, v nichž je Číslo 1.33. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozici podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32 a farmaceu25 ticky přijatelný excipient.34. Použití konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32 pro výrobu léčiva pro léčení nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým30 onemocněním léčených chemoterapií.35. Způsob přípravy konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32, vyznačující se tím, že zahrnuje kovalentní navázání thiolových skupin na erytropoeti nový glykoprotein a kopulaci vzniklého aktivovaného erytro35 poetinového glykoproteinu s poly(ethylenglykolovým) (PEG) derivátem.36. Konjugáty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32 připravené způsobem podle nároku 35.40 37. Konjugáty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků28 až 32 pro použití pro léčení onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým onemocněním léčených chemoterapií.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14224399P | 1999-07-02 | 1999-07-02 | |
| US14745299P | 1999-08-05 | 1999-08-05 | |
| US15145499P | 1999-08-30 | 1999-08-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20014682A3 CZ20014682A3 (cs) | 2002-11-13 |
| CZ301833B6 true CZ301833B6 (cs) | 2010-07-07 |
Family
ID=27385779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20014682A CZ301833B6 (cs) | 1999-07-02 | 2000-06-28 | Konjugát erytropoetinu s polyethylenglykolem, zpusob jeho prípravy a lécivo pro lécení anemie s jeho obsahem |
Country Status (33)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6340742B1 (cs) |
| EP (1) | EP1196443B1 (cs) |
| JP (1) | JP4190184B2 (cs) |
| KR (1) | KR100510624B1 (cs) |
| CN (1) | CN1194014C (cs) |
| AR (1) | AR024879A1 (cs) |
| AT (1) | ATE267840T1 (cs) |
| AU (1) | AU768452B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI0012138B8 (cs) |
| CA (1) | CA2378533C (cs) |
| CO (1) | CO5180621A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ301833B6 (cs) |
| DE (1) | DE60011087T2 (cs) |
| DK (1) | DK1196443T3 (cs) |
| ES (1) | ES2220501T3 (cs) |
| GC (1) | GC0000196A (cs) |
| HK (1) | HK1047597B (cs) |
| HR (1) | HRP20010966B1 (cs) |
| HU (1) | HU228478B1 (cs) |
| IL (2) | IL146956A0 (cs) |
| JO (1) | JO2291B1 (cs) |
| MA (1) | MA26806A1 (cs) |
| MX (1) | MXPA01012974A (cs) |
| MY (1) | MY126776A (cs) |
| NO (1) | NO20016304L (cs) |
| NZ (1) | NZ516170A (cs) |
| PE (1) | PE20010288A1 (cs) |
| PL (1) | PL201754B1 (cs) |
| PT (1) | PT1196443E (cs) |
| RS (1) | RS50117B (cs) |
| TR (1) | TR200103782T2 (cs) |
| TW (1) | TWI266637B (cs) |
| WO (1) | WO2001002017A2 (cs) |
Families Citing this family (216)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| PT1037927E (pt) * | 1997-12-08 | 2004-10-29 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Proteinas de fusao heterodimericas uteis para imunoterapia de abordagem selectiva e estimulacao imunologica geral |
| US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| ATE329622T1 (de) * | 1998-04-15 | 2006-07-15 | Lexigen Pharm Corp | Steigerung der antikörper-zytokin- fusionsproteinmediierten immunantwort durch mitverabreichung mit einem angiogeneseinhibitor |
| US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| CA2359318C (en) | 1999-02-01 | 2009-06-30 | Universitat Zurich | Biomaterials formed by nucleophilic addition reaction to conjugated unsaturated groups |
| US6958212B1 (en) | 1999-02-01 | 2005-10-25 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds |
| US7345019B1 (en) * | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
| CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| BR0013231A (pt) * | 1999-08-09 | 2002-07-23 | Lexigen Pharm Corp | Complexos citocina-anticorpo múltiplos |
| EP1228214A2 (en) | 1999-11-12 | 2002-08-07 | MERCK PATENT GmbH | Erythropoietin forms with improved properties |
| US20050202538A1 (en) * | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
| JP5179689B2 (ja) | 2000-02-11 | 2013-04-10 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強 |
| US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| EP1274720A4 (en) * | 2000-04-12 | 2004-08-18 | Human Genome Sciences Inc | FUSION PROTEINS CONTAINING ALBUMIN |
| JP3967594B2 (ja) * | 2000-05-15 | 2007-08-29 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 新しい薬剤組成物 |
| AU7522601A (en) * | 2000-06-02 | 2001-12-11 | Eidgenoess Tech Hochschule | Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds |
| US7291673B2 (en) | 2000-06-02 | 2007-11-06 | Eidgenossiche Technische Hochschule Zurich | Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds |
| JP5390055B2 (ja) * | 2000-06-29 | 2014-01-15 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 免疫サイトカインの取り込み増強剤との併用治療による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介免疫応答の増強 |
| ATE421535T1 (de) | 2000-10-16 | 2009-02-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Peg-modifiziertes erythropoietin |
| EP1355965B1 (en) | 2000-10-19 | 2012-09-19 | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) | Method of synthesizing block copolymers for multifunctional self-assembled systems |
| KR101229995B1 (ko) * | 2000-12-11 | 2013-02-06 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| ATE320449T1 (de) * | 2000-12-11 | 2006-04-15 | Cheil Jedang Corp | Fusionsprotein mit verbesserter in vivo erythropoietinwirkung |
| DE60144439D1 (de) * | 2000-12-20 | 2011-05-26 | Hoffmann La Roche | Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg) |
| CA2431964C (en) * | 2000-12-20 | 2013-09-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg) |
| US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| US20030072737A1 (en) * | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
| EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| HUP0303428A2 (hu) * | 2001-03-07 | 2004-01-28 | Merck Patent Gmbh. | Expressziós eljárás hibrid izotípusú antitestcsoportot tartalmazó fehérjékhez |
| WO2002079415A2 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| KR100900166B1 (ko) | 2001-05-03 | 2009-06-02 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 재조합 종양 특이적 항체 및 이들의 용도 |
| WO2002097038A2 (en) * | 2001-05-25 | 2002-12-05 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine beta-1 fusion proteins |
| US6930086B2 (en) * | 2001-09-25 | 2005-08-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Diglycosylated erythropoietin |
| US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
| US7214660B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| EP2042196B1 (en) * | 2001-10-10 | 2016-07-13 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) |
| US7795210B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
| US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| KR100467751B1 (ko) * | 2001-12-03 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| KR100480423B1 (ko) * | 2001-12-04 | 2005-04-06 | 선바이오(주) | 에리트로포이에틴과 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체 |
| ATE542137T1 (de) * | 2001-12-04 | 2012-02-15 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokine mit modulierter selektivität |
| CN102526045A (zh) * | 2001-12-06 | 2012-07-04 | 法布罗根股份有限公司 | 提高内源性红细胞生成素(epo)的方法 |
| PT1463751E (pt) | 2001-12-21 | 2013-08-26 | Human Genome Sciences Inc | Proteínas de fusão de albumina |
| EP1463752A4 (en) * | 2001-12-21 | 2005-07-13 | Human Genome Sciences Inc | ALBUM INFUSION PROTEINS |
| AU2002351746A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-15 | Maxygen Aps | Erythropoietin conjugates |
| US7300915B2 (en) | 2002-06-05 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Use of erythropoietin and erythropoietin mimetics for the treatment of neuropathic pain |
| KR100630176B1 (ko) * | 2002-07-24 | 2006-10-02 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 페길화 ｔ1249 폴리펩타이드 |
| MXPA05000799A (es) * | 2002-07-24 | 2005-04-19 | Hoffmann La Roche | Derivados de aldehidos de polietilenglicol. |
| AU2003257467B2 (en) * | 2002-07-24 | 2008-02-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Pegylated T20 polypeptide |
| US7459435B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| WO2005025606A1 (en) * | 2003-09-09 | 2005-03-24 | Warren Pharmaceuticals, Inc. | Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin |
| CN101371920A (zh) * | 2002-09-09 | 2009-02-25 | 沃伦药品公司 | 保持内源性促红细胞生成素组织保护活性的长效促红细胞生成素 |
| US7459436B2 (en) * | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| CN100432105C (zh) * | 2002-12-17 | 2008-11-12 | 默克专利有限公司 | 与gd2结合的小鼠14.18抗体的人源化抗体(h14.18)以及其与il-2的融合 |
| CN102319437B (zh) * | 2002-12-26 | 2017-10-13 | 山景医药公司 | 具有增强的生物学效用的干扰素‑β的聚合物缀合物 |
| AU2003303636B2 (en) * | 2002-12-26 | 2010-08-05 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
| WO2004061094A1 (en) * | 2002-12-30 | 2004-07-22 | Gryphon Therapeutics, Inc. | Water-soluble thioester and selenoester compounds and methods for making and using the same |
| WO2004060966A2 (en) * | 2002-12-31 | 2004-07-22 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates |
| CA2513213C (en) | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7871607B2 (en) * | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
| US20060104968A1 (en) | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
| US7767429B2 (en) * | 2003-03-05 | 2010-08-03 | Halozyme, Inc. | Soluble hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof |
| US20090123367A1 (en) * | 2003-03-05 | 2009-05-14 | Delfmems | Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases |
| US20040180054A1 (en) * | 2003-03-13 | 2004-09-16 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life |
| US20050176108A1 (en) * | 2003-03-13 | 2005-08-11 | Young-Min Kim | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life |
| JP2006523211A (ja) | 2003-03-14 | 2006-10-12 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 分岐水溶性ポリマーとその複合物 |
| US7642340B2 (en) | 2003-03-31 | 2010-01-05 | Xencor, Inc. | PEGylated TNF-α variant proteins |
| US7610156B2 (en) * | 2003-03-31 | 2009-10-27 | Xencor, Inc. | Methods for rational pegylation of proteins |
| EP1610825A2 (en) * | 2003-03-31 | 2006-01-04 | Xencor, Inc. | Methods for rational pegylation of proteins |
| WO2006127896A2 (en) | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor ix |
| US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| NZ542586A (en) | 2003-04-09 | 2009-11-27 | Biogenerix Ag | Method of forming a covalent conjugate between a G-CSF peptide and PEG |
| AU2004240553A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-12-02 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants |
| EP1626983B8 (en) * | 2003-05-12 | 2010-12-22 | Affymax, Inc. | Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof |
| JP2007500218A (ja) * | 2003-05-12 | 2007-01-11 | アフィーマックス・インコーポレイテッド | ポリ（エチレングリコール）修飾ペプチド系化合物の新規スペーサー部分 |
| DE602004020610D1 (de) * | 2003-05-12 | 2009-05-28 | Affymax Inc | Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide |
| ES2395413T3 (es) * | 2003-05-12 | 2013-02-12 | Affymax, Inc. | Péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina |
| US7074755B2 (en) | 2003-05-17 | 2006-07-11 | Centocor, Inc. | Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives |
| EP1641481A4 (en) * | 2003-05-30 | 2008-10-15 | Centocor Inc | TRAINING OF NEW ERYTHROPOIETIN CONJUGATES USING TRANSGLUTAMINASE |
| EP1491554A1 (en) * | 2003-06-23 | 2004-12-29 | CONARIS research institute AG | PEGylated soluble gp130-dimers useful as a medicament |
| US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
| JP2007517769A (ja) * | 2003-09-29 | 2007-07-05 | ウォーレン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 敗血症および癒着形成の治療および予防のための組織保護性サイトカイン |
| CA2542353A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Xencor, Inc. | Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders |
| WO2005047337A1 (en) * | 2003-11-13 | 2005-05-26 | Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier |
| US8110665B2 (en) | 2003-11-13 | 2012-02-07 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier |
| US7405198B2 (en) * | 2003-11-24 | 2008-07-29 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
| AU2004298996A1 (en) | 2003-12-10 | 2005-06-30 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates |
| JP2007514673A (ja) | 2003-12-19 | 2007-06-07 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 慢性炎症性腸疾患の際の鉄分布障害の処置におけるエリスロポエチンの使用 |
| DK1699915T3 (da) | 2003-12-30 | 2010-09-13 | Augustinus Bader | Anvendelse af erythropoietin til levervævsregenerering |
| BRPI0417916A (pt) * | 2003-12-31 | 2007-04-10 | Merck Patent Gmbh | proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada |
| US7338933B2 (en) | 2004-01-08 | 2008-03-04 | Neose Technologies, Inc. | O-linked glycosylation of peptides |
| ZA200606216B (en) * | 2004-02-02 | 2007-11-28 | Ambrx Inc | Modified human interferon polypeptides and their uses |
| US7588745B2 (en) * | 2004-04-13 | 2009-09-15 | Si Options, Llc | Silicon-containing products |
| CA2563874A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Cambridge Antibody Technology Limited | Erythropoietin protein variants |
| WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
| EP1799249A2 (en) | 2004-09-10 | 2007-06-27 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
| EP3061461A1 (en) | 2004-10-29 | 2016-08-31 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
| US7589063B2 (en) * | 2004-12-14 | 2009-09-15 | Aplagen Gmbh | Molecules which promote hematopoiesis |
| MX2007005640A (es) * | 2004-11-10 | 2007-08-14 | Aplagen Gmbh | Moleculas que promueven la hematopoyesis. |
| WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| WO2006060148A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-08 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US9029331B2 (en) | 2005-01-10 | 2015-05-12 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| EP1848461A2 (en) * | 2005-02-16 | 2007-10-31 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of an epo moiety and a polymer |
| EP1871795A4 (en) * | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
| EP1888629B1 (en) | 2005-05-10 | 2013-04-24 | Neoloch Aps | Neuritogenic peptides |
| US9988427B2 (en) | 2005-05-13 | 2018-06-05 | Charite Universitaetsmedizen-Berlin | Erythropoietin variants |
| WO2006127910A2 (en) | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin formulations |
| JP5329949B2 (ja) | 2005-05-31 | 2013-10-30 | エコーレ ポリテクニーク フェデラーレ デ ローザンヌ | 遺伝子に基づいた薬物の細胞質送達のためのトリブロックコポリマー |
| US7550433B2 (en) * | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| EA200800109A1 (ru) * | 2005-06-23 | 2008-06-30 | Аплаген Гмбх | Суправалентные соединения |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| JP5198747B2 (ja) * | 2005-08-31 | 2013-05-15 | 株式会社カネカ | ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類およびその作製法 |
| WO2007026772A1 (ja) * | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Kaneka Corporation | ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類およびその作製法 |
| US20080171696A1 (en) * | 2005-10-21 | 2008-07-17 | Avigenics, Inc. | Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins |
| AU2006304856A1 (en) * | 2005-10-21 | 2007-04-26 | Synageva Biopharma Corp. | Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| US8759292B2 (en) | 2006-02-03 | 2014-06-24 | Prolor Biotech, Llc | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US8946155B2 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-03 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US10351615B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-07-16 | Opko Biologics Ltd. | Methods of treatment with long-acting growth hormone |
| US8304386B2 (en) * | 2006-02-03 | 2012-11-06 | Prolor Biotech, Inc. | Long-acting growth hormone and methods of producing same |
| US8048849B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Modigene, Inc. | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US8048848B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof |
| US20150038413A1 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US8476234B2 (en) * | 2006-02-03 | 2013-07-02 | Prolor Biotech Inc. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US8450269B2 (en) | 2006-02-03 | 2013-05-28 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting growth hormone and methods of producing same |
| US9458444B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-10-04 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US10221228B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-03-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| WO2007092252A2 (en) | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Modigene Inc | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US20140113860A1 (en) | 2006-02-03 | 2014-04-24 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| CN101062407A (zh) | 2006-04-29 | 2007-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途 |
| US20080242607A1 (en) | 2006-07-21 | 2008-10-02 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| WO2008019214A1 (en) | 2006-08-04 | 2008-02-14 | Prolong Pharmaceuticals, Inc. | Modified erythropoietin |
| US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| BRPI0717505B8 (pt) * | 2006-10-04 | 2021-05-25 | Novo Nordisk As | conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica |
| US20080083154A1 (en) * | 2006-10-05 | 2008-04-10 | Timothy M Gregory | Bait retention fish hook |
| WO2008057537A2 (en) * | 2006-11-08 | 2008-05-15 | Maine Medical Center Research | System and method for identifying erythropoietin-responsive genes |
| EP2081956B1 (en) | 2006-11-13 | 2013-03-20 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Method of cell culture and method of treatment comprising a vepo protein variant |
| CN101796063B (zh) | 2007-04-03 | 2017-03-22 | 拉蒂奥法姆有限责任公司 | 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法 |
| US9493499B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-11-15 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography |
| EP2018835B1 (de) | 2007-07-09 | 2014-03-05 | Augustinus Bader | Wirkstoff abgebendes Pflaster |
| CL2008002054A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-05-29 | Hoffmann La Roche | Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico. |
| CL2008002053A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-05-22 | Hoffmann La Roche | Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion. |
| US20090022720A1 (en) | 2007-07-20 | 2009-01-22 | Stephan Fischer | Conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides |
| US8207112B2 (en) | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
| CN101381412B (zh) * | 2007-09-30 | 2012-02-22 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 聚合物/重组人促红素偶联物 |
| CN101455844B (zh) * | 2007-12-10 | 2011-09-14 | 江苏豪森药业股份有限公司 | 聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物和其制备方法与用途 |
| JP5647899B2 (ja) * | 2008-01-08 | 2015-01-07 | ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ | オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化 |
| US8101706B2 (en) * | 2008-01-11 | 2012-01-24 | Serina Therapeutics, Inc. | Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same |
| US8110651B2 (en) | 2008-01-11 | 2012-02-07 | Serina Therapeutics, Inc. | Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same |
| NZ602170A (en) | 2008-02-08 | 2014-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| DK2257311T3 (da) | 2008-02-27 | 2014-06-30 | Novo Nordisk As | Konjugerede Faktor VIII-Molekyler |
| TWI395593B (zh) | 2008-03-06 | 2013-05-11 | Halozyme Inc | 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制 |
| EP2662090A1 (en) | 2008-04-14 | 2013-11-13 | Halozyme, Inc. | Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions |
| TWI394580B (zh) | 2008-04-28 | 2013-05-01 | Halozyme Inc | 超快起作用胰島素組成物 |
| HUE054585T2 (hu) | 2008-04-29 | 2021-09-28 | Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S | Pegilezett rekombináns humán növekedési hormon vegyületek |
| EP2161031A1 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-10 | SuppreMol GmbH | Fc gamma receptor for the treatment of B cell mediated multiple sclerosis |
| PL2342223T3 (pl) | 2008-09-26 | 2017-09-29 | Ambrx, Inc. | Zmodyfikowane polipeptydy zwierzęcej erytropoetyny i ich zastosowania |
| WO2010068432A1 (en) | 2008-11-25 | 2010-06-17 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Block copolymers and uses thereof |
| EA036569B1 (ru) | 2008-12-09 | 2020-11-24 | Галозим, Инк. | Способ получения полипептида гиалуронидазы ph20 |
| GB0922354D0 (en) | 2009-12-21 | 2010-02-03 | Polytherics Ltd | Novel polymer conjugates |
| EP3385279B1 (en) | 2009-03-20 | 2020-02-26 | Amgen Inc. | Carrier immunoglobulins and uses thereof |
| US12203113B2 (en) | 2009-07-09 | 2025-01-21 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| CN102655853B (zh) | 2009-09-17 | 2015-07-29 | 巴克斯特卫生保健有限公司 | 透明质酸酶和免疫球蛋白的稳定的复合制剂及其使用方法 |
| CA2783296C (en) | 2009-12-15 | 2019-01-15 | Ascendis Pharma As | Growth hormone composition |
| ES2632164T3 (es) | 2010-07-06 | 2017-09-11 | Augustinus Bader | Aplicación tópica de eritropoyetina para uso en el tratamiento de lesiones de la córnea |
| MX348420B (es) | 2010-07-20 | 2017-06-12 | Halozyme Inc | Efectos secundarios adversos asociados con la administracion de agentes anti-hialuronano y metodos para mejorar o prevenir los efectos secundarios. |
| RU2566267C2 (ru) | 2010-09-14 | 2015-10-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ очистки пегилированного эритропоэтина |
| EP2619226B1 (en) | 2010-09-22 | 2018-09-12 | Amgen Inc. | Carrier immunoglobulins and uses thereof |
| CN102453087B (zh) * | 2010-10-22 | 2013-12-25 | 广东赛保尔生物医药技术有限公司 | 一种单取代peg-epo的纯化及制备方法 |
| ES2634669T3 (es) | 2011-02-08 | 2017-09-28 | Halozyme, Inc. | Composición y formulación lipídica de una enzima de degradación de hialuronano y uso de la misma para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata |
| US9993529B2 (en) | 2011-06-17 | 2018-06-12 | Halozyme, Inc. | Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme |
| MX341448B (es) | 2011-06-17 | 2016-08-19 | Halozyme Inc | Metodos de infusion de insulina subcutanea continua con una enzima que degrada a hialuronano. |
| WO2013040501A1 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Pharmathene, Inc. | Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and uses thereof |
| AU2012328880B2 (en) | 2011-10-24 | 2017-02-23 | Halozyme, Inc. | Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof |
| WO2013102144A2 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Halozyme, Inc. | Ph20 polypeptede variants, formulations and uses thereof |
| NZ700073A (en) | 2012-04-04 | 2016-08-26 | Halozyme Inc | Combination therapy with an anti - hyaluronan agent and a tumor - targeted taxane |
| US9522945B2 (en) | 2012-04-19 | 2016-12-20 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same |
| US9278124B2 (en) | 2012-10-16 | 2016-03-08 | Halozyme, Inc. | Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods |
| SG10202010383YA (en) | 2012-11-20 | 2020-11-27 | Opko Biologics Ltd | Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides |
| EP2740805B1 (en) | 2012-12-07 | 2019-02-20 | SuppreMol GmbH | Stratification and treatment of patients suffering from idiopathic thrombocytopenic purpura |
| TW201534726A (zh) | 2013-07-03 | 2015-09-16 | Halozyme Inc | 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途 |
| US10711106B2 (en) | 2013-07-25 | 2020-07-14 | The University Of Chicago | High aspect ratio nanofibril materials |
| US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| EP3186281B1 (en) | 2014-08-28 | 2019-04-10 | Halozyme, Inc. | Combination therapy with a hyaluronan-degrading enzyme and an immune checkpoint inhibitor |
| BR112017007765B1 (pt) | 2014-10-14 | 2023-10-03 | Halozyme, Inc | Composições de adenosina deaminase-2 (ada2), variantes do mesmo e métodos de usar o mesmo |
| ES2947818T3 (es) | 2014-11-18 | 2023-08-21 | Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S | Nuevos profármacos poliméricos de la HCh |
| ES2896971T3 (es) | 2014-11-21 | 2022-02-28 | Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S | Formas de administración de hormona del crecimiento de acción prolongada |
| EA201791275A1 (ru) | 2014-12-10 | 2017-12-29 | Опко Байолоджикс Лтд. | Способы получения ctp-модифицированных полипептидов длительного действия |
| IL301728A (en) | 2015-06-19 | 2023-05-01 | Opko Biologics Ltd | Long-term coagulation factors and methods for their preparation |
| JP6937773B2 (ja) * | 2016-03-07 | 2021-09-22 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | ポリエチレングリコール誘導体及びその用途 |
| CN105820232B (zh) * | 2016-04-08 | 2019-05-17 | 昂德生物药业有限公司 | 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用 |
| HUE064463T2 (hu) | 2016-07-11 | 2024-03-28 | Opko Biologics Ltd | Hosszantartó hatású VII. koagulációs faktor és az elõállítására vonatkozó eljárások |
| AU2017295037B2 (en) | 2016-07-15 | 2021-07-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for purifying PEGylated erythropoietin |
| WO2018132768A1 (en) | 2017-01-13 | 2018-07-19 | Sanna Pietro P | Methods and compositions for treating hpa hyperactivity |
| KR102268647B1 (ko) | 2017-06-12 | 2021-06-23 | 한국코러스 주식회사 | 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법 |
| AU2018290281B2 (en) | 2017-06-22 | 2021-12-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Modified membrane type serine protease 1 (MTSP-1) polypeptides and methods of use |
| HRP20220388T1 (hr) * | 2017-12-29 | 2022-05-27 | F. Hoffmann - La Roche Ag | Postupak za dobivanje pegiliranog proteinskog pripravka |
| US20190351031A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Halozyme, Inc. | Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20 |
| US11613744B2 (en) | 2018-12-28 | 2023-03-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use |
| WO2020140101A1 (en) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use |
| CN111375068B (zh) * | 2018-12-29 | 2024-04-16 | 江苏豪森药业集团有限公司 | 聚乙二醇化多肽药物的制备方法 |
| EP3934625A1 (en) | 2019-03-04 | 2022-01-12 | Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S | Long-acting growth hormone dosage forms with superior efficacy to daily somatropin |
| CA3135351A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Nof Corporation | Branched degradable polyethylene glycol binder |
| US20230331798A1 (en) * | 2020-09-22 | 2023-10-19 | Jecho Laboratories, Inc. | Glycosylation-modified erythopoietin and use thereof |
| WO2025227129A2 (en) | 2024-04-25 | 2025-10-30 | Starrock Pharma Llc | Delivery vehicles comprising proglucagon derived polypeptides and anabolic polypeptides and uses thereof |
| US20250341516A1 (en) | 2024-05-01 | 2025-11-06 | BioLegend, Inc. | Compositions for use with multiple fluorophores and methods of using |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0605963A2 (en) * | 1992-12-09 | 1994-07-13 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof |
| WO1994028024A1 (en) * | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
| EP0640619A1 (en) * | 1993-08-17 | 1995-03-01 | Amgen Inc. | Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR850004274A (ko) | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
| US4677195A (en) | 1985-01-11 | 1987-06-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions |
| EP0318487B1 (en) | 1986-08-04 | 1993-10-13 | The University Of New South Wales | Serum free tissue culture medium containing polymeric cell-protective agent |
| US4954437A (en) | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| DE68917642T2 (de) | 1988-05-25 | 1995-02-09 | Teijin Ltd | Verfahren zur kontinuierlichen Züchtung von haftenden tierischen Zellen. |
| US6225449B1 (en) * | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
| DE3924705A1 (de) | 1989-07-26 | 1991-01-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | Heterobifunktionelle verbindungen |
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| US5674534A (en) | 1992-06-11 | 1997-10-07 | Alkermes, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| US5382657A (en) | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| US5359030A (en) | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| DE69430251T2 (de) | 1993-11-10 | 2002-11-07 | Enzon, Inc. | Verbesserte interferon-polymerkonjugate |
| DE69521880T2 (de) | 1994-02-08 | 2002-01-03 | Amgen Inc., Thousand Oaks | Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf |
| US5919758A (en) * | 1994-03-22 | 1999-07-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Modified polypeptides with altered biological activity |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| DE741187T1 (de) | 1995-05-05 | 1997-04-30 | Hoffmann La Roche | Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine |
| IL118201A (en) | 1995-05-11 | 2004-12-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof |
| US6025324A (en) | 1996-05-15 | 2000-02-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Pegylated obese (ob) protein compositions |
-
2000
- 2000-06-27 JO JO200094A patent/JO2291B1/en active
- 2000-06-27 PE PE2000000642A patent/PE20010288A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-06-28 HR HR20010966A patent/HRP20010966B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 DE DE60011087T patent/DE60011087T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 CN CNB008098956A patent/CN1194014C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 PT PT00951312T patent/PT1196443E/pt unknown
- 2000-06-28 BR BRPI0012138A patent/BRPI0012138B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 CA CA002378533A patent/CA2378533C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 RS YUP-899/01A patent/RS50117B/sr unknown
- 2000-06-28 NZ NZ516170A patent/NZ516170A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 US US09/604,871 patent/US6340742B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 TR TR2001/03782T patent/TR200103782T2/xx unknown
- 2000-06-28 WO PCT/EP2000/006009 patent/WO2001002017A2/en not_active Ceased
- 2000-06-28 JP JP2001507507A patent/JP4190184B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 MX MXPA01012974A patent/MXPA01012974A/es active IP Right Grant
- 2000-06-28 HU HU0201971A patent/HU228478B1/hu unknown
- 2000-06-28 AT AT00951312T patent/ATE267840T1/de active
- 2000-06-28 CZ CZ20014682A patent/CZ301833B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 CO CO00048531A patent/CO5180621A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-06-28 IL IL14695600A patent/IL146956A0/xx active IP Right Grant
- 2000-06-28 AU AU64299/00A patent/AU768452B2/en not_active Expired
- 2000-06-28 EP EP00951312A patent/EP1196443B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 PL PL356065A patent/PL201754B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 KR KR10-2002-7000029A patent/KR100510624B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 HK HK02109179.2A patent/HK1047597B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 DK DK00951312T patent/DK1196443T3/da active
- 2000-06-28 ES ES00951312T patent/ES2220501T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 AR ARP000103319A patent/AR024879A1/es active IP Right Grant
- 2000-06-29 MY MYPI20002955 patent/MY126776A/en unknown
- 2000-06-30 TW TW089112989A patent/TWI266637B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-07-02 GC GCP2000748 patent/GC0000196A/en active
-
2001
- 2001-12-06 IL IL146956A patent/IL146956A/en unknown
- 2001-12-21 NO NO20016304A patent/NO20016304L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-01-02 MA MA26464A patent/MA26806A1/fr unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0605963A2 (en) * | 1992-12-09 | 1994-07-13 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof |
| WO1994028024A1 (en) * | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
| EP0640619A1 (en) * | 1993-08-17 | 1995-03-01 | Amgen Inc. | Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4190184B2 (ja) | ポリエチレングリコールを有するエリスロポエチン接合体 | |
| US6583272B1 (en) | Erythropoietin conjugates | |
| CN100365117C (zh) | 聚乙二醇化和双糖基化的红细胞生成素 | |
| CZ20024005A3 (cs) | Nová farmaceutická kompozice | |
| RU2232163C2 (ru) | Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110628 |