ES2220501T3 - Conjugados de eritropoyetina con politilenglicol. - Google Patents
Conjugados de eritropoyetina con politilenglicol.Info
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Abstract
Un conjugado, dicho conjugado comprende una glucoproteína eritropoyetina que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presentan la estructura primaria de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación o mediante la nueva disposición de al menos un sitio de glucosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida de forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi-C1-C3 poli(etilen glicol), cada grupo poli(etilen glicol) se encuentra unido covalentemente a la glucoproteína mediante un conector con la fórmula ¿C(O)-X-S-Y-, con el C(O) del conector formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino, X es ¿(CH2)k- ó ¿(CH2(O-CH2-CH2)k-, k se encuentra entre 1 y 10, Y es el valor medio del peso molecular decada porción de poli(etilen glicol) se encuentra entre 20 kilodaltons y 40 kilodaltons y el peso molecular del conjugado se encuentra entre 51 kilodaltons y 175 kilodaltons.
Description
Conjugados de eritropoyetina con
polietilenglicol.
La eritropoyesis es la producción de glóbulos
rojos, que se produce con el objetivo de contrarrestar la
destrucción celular. La eritropoyesis es un mecanismo fisiológico
controlado, que proporciona los suficientes glóbulos rojos
necesarios para una oxigenación tisular adecuada. La eritropoyetina
humana producida de forma natural (hEPO) es una glucoproteína que
contiene 165 aminoácidos que se produce en el riñón y es el factor
plasmático humoral que estimula la producción de glóbulos rojos
(Carnot, P and Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev,
AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson,
LO, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak, LF (1957) Nature 179:
6331-4). La EPO humana estimula la división y
diferenciación de los progenitores eritrocíticos específicos en la
médula ósea. La EPO humana ejerce su actividad biológica mediante la
unión a receptores en los precursores eritrocíticos (Krantz, BS
(1991) Blood 77: 419). La eritropoyetina humana que se produce de
forma natural es una glucoproteína acídica presente en bajas
concentraciones en el plasma, para estimular la sustitución de los
glóbulos rojos que se van perdiendo con el envejecimiento.
La eritropoyetina se ha producido
biosintéticamente mediante el uso de la tecnología del DNA
recombinante (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al.
(1986) Immunobiol. 72: 213-224) y es el producto del
gen EPO humano clonado, insertado y expresado en células de tejido
de ovario de hámster chino (células CHO). La EPO humana que se
produce de forma natural en primer lugar es traducida a una cadena
polipeptídica de 166 aminoácidos con arginina 166. Por una
modificación post-traduccional, la arginina 166 es
escindida por una carboxipeptidasa. La estructura primaria de la EPO
humana (165 aminoácidos) se ilustra en la Figura 1. La estructura
primaria de la EPO humana (166 aminoácidos) se ilustra en la Figura
2. Hay dos puentes disulfuro entre
Cys^{7}-Cys^{161} y
Cys^{29}-Cys^{33}. El peso molecular de la
cadena polipeptídica de la EPO humana sin las porciones de los
azúcares es 18.236 Da. En la molécula intacta de EPO,
aproximadamente el 40% del peso molecular viene dado por los grupos
de carbohidrato (Sasaki, H. Bothner, B, Dell, A and Fukuda, M (1987)
J. Biol. Chem. 262: 12059).
Debido a que la eritropoyetina humana es esencial
en la formación de glóbulos rojos, la hormona es útil en el
tratamiento de los trastornos sanguíneos caracterizados por la baja
o defectiva producción de glóbulos rojos. Clínicamente, la EPO es
utilizada en el tratamiento por ejemplo de anemia en pacientes con
fallo renal crónico (CRF) (Eschbach, JEW, Egri, JC, Downing, MR
et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, JEW,
Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med.
111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T. Adamson, JEW (1988)
Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al.
(1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) y en
pacientes con SIDA y cáncer que han sido tratados con quimioterapia
(Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI In: MB, Garnick, ed.
Erythropoietin in Clinical Applications-An
International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p.
301-324). Sin embargo, la disponibilidad biológica
de agentes terapéuticos basados en proteínas disponibles
comercialmente tales como EPO, se encuentra limitada por su corta
vida media en el plasma y por su susceptibilidad a la degradación
por parte de proteasas. Estos defectos impiden que se pueda alcanzar
una potencia clínica máxima.
Según esto, la presente invención es una nueva
clase de derivados de PEG de EPO. Los conjugados
PEG-EPO fisiológicamente activos de esta invención
comprenden una glucoproteína eritropoyetina que presenta al menos un
grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in
vivo con la que consigue que las células de la médula ósea
incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se
selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la
misma que presentan la estructura primaria de la eritropoyetina
humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de
glucosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida de forma
covalente a de uno a tres grupos alcoxi-inferior
poli(etilenglicol), cada grupo poli(etilenglicol) se
encuentra unido covalentemente a la glucoproteína mediante un
conector con la fórmula
-C(O)-X-S-Y-,
con el C(O) del conector formando un enlace amida con uno de
dichos grupos amino, X es -(CH_{2})_{k}- ó
-(CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
k se encuentra entre 1 y 10, Y es
el valor medio del peso molecular
de cada porción de poli(etilen glicol) se encuentra entre 20
kilodaltons y 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado se
encuentra entre 51 kilodaltons y 175 kilodaltons. Esta invención
también proporciona composiciones que contienen conjugados descritos
aquí, en las cuales el porcentaje de conjugados en la composición en
la que n es 1 es al menos del noventa por
ciento.
Si se comparan con las EPO no modificadas (es
decir, EPO sin un PEG unido) y con los conjugados
EPO-PEG convencionales, los presentes conjugados
tienen tanto una vida media de circulación como un tiempo de
residencia en el plasma mayores, un menor aclaramiento, y una mayor
actividad clínica in vivo. Los conjugados de esta invención
presentan los mismos usos que la EPO. En concreto, los conjugados de
esta invención son útiles para tratar pacientes mediante la
estimulación de la división y diferenciación de los progenitores
eritrocíticos específicos en la médula ósea por la misma vía por la
que se utiliza EPO para el tratamiento de los pacientes.
La presente invención también incluye un método
para el tratamiento de anemia en humanos. La presente invención
también incluye un método para la preparación de productos de la
glucoproteína eritropoyetina que comprende la reacción de forma
covalente de un grupo \varepsilon-amino de un
aminoácido de lisina de una proteína eritropoyetina con un reactivo
bifuncional para formar una intermediario con un enlace amida. El
reactivo bifuncional contiene un grupo reactivo y un grupo tiol
protegido. Entonces el intermediario con un enlace amida reacciona
covalentemente con un derivado de polietilen glicol activado para
formar el producto de glucoproteína eritropoyetina de la presente
invención.
Figura 1: Estructura primaria de la EPO humana
(165 aminoácidos).
Figura 2: Estructura primaria de la EPO humana
(166 aminoácidos).
Figura 3: Actividad in vivo de la EPO pegilada
determinada mediante el ensayo normocitémico de ratón.
Los siguientes términos tendrán las definiciones
mostradas a continuación:
El término "proteína eritropoyetina",
"eritropoyetina", "EPO" o "glucoproteína
eritropoyetina" se refiere a una glucoproteína que presenta la
secuencia mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) ó 2 (SEQ ID NO: 2)
o una proteína o polipéptido substancialmente homólogo a las mismas,
cuyas propiedades biológicas se refieren a la estimulación de la
producción de glóbulos rojos y a la estimulación de la división y
diferenciación de los progenitores eritrocíticos específicos en la
médula ósea. Tal como se emplea aquí, el término proteína EPO
incluye dichas proteínas modificadas de forma deliberada, como por
ejemplo, por mutagénesis dirigida o de forma accidental, por
mutaciones. Estos términos también incluyen análogos que presentan
entre 1 y 6 sitios adicionales para la glucosilación, análogos que
presentan al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxilo
de la proteína, en donde el aminoácido o aminoácidos adicionales
incluyen al menos un sitio de glucosilación y análogos que presentan
una secuencia aminoacídica que incluye una nueva disposición de al
menos un sitio para la glucosilación, tales como por ejemplo los
análogos revelados en la Publicación de Patente Europea No. 640 619.
Estos términos incluyen tanto la eritropoyetina humana producida de
forma natural como la producida de forma recombinante.
El término "substancialmente homólogo"
significa que una secuencia concreta problema, por ejemplo, una
secuencia mutada, varía de una secuencia de referencia en una o más
substituciones, deleciones o adiciones, el efecto neto de lo cual no
resulta en una diferencia funcional adversa entre las secuencias de
referencia y problema. Para los propósitos de la presente invención,
las secuencia con más del 95 por ciento de homología, propiedades
biológicas equivalentes y características de expresión equivalentes
se consideran substancialmente homólogas. Para propósitos de
determinación de la homología, no se deberá considerar el
truncamiento de la secuencia madura. Las secuencias con menores
niveles de homología, comparable bioactividad, y características de
expresión equivalentes son consideradas substancialmente
equivalentes.
El término "fragmento" de la proteína EPO
significa cualquier proteína o polipéptido que presenta la secuencia
aminoacídica de una porción o fragmento de una proteína EPO, y la
cual tiene la actividad biológica de la EPO. Los fragmentos incluyen
proteínas o polipéptidos producidos por la degradación proteolítica
de la proteína EPO o producida por síntesis química mediante métodos
rutinarios del campo. Una proteína EPO o fragmento de la misma es
biológicamente activa cuando la administración de la proteína o
fragmento al hombre produce la estimulación de la producción de
glóbulos rojos y la estimulación de la división y diferenciación de
progenitores eritrocíticos específicos en la médula ósea. La
determinación de dicha actividad biológica de la proteína EPO se
puede llevar a cabo de forma convencional, pruebas bien conocidas
utilizadas para tales propósitos en una o más especies de mamíferos.
Una prueba adecuada que se puede utilizar para demostrar dicha
actividad biológica es la que se describe a continuación.
El término "cantidad terapéuticamente
efectiva" es la cantidad de producto de glucoproteína
eritropoyetina necesario para dar la actividad biológica in
vivo que consigue que las células de la médula ósea incrementen
la producción de reticulocitos y de glóbulos rojos. La cantidad
exacta de producto de glucoproteína eritropoyetina es una cuestión
de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de
trastorno a tratar, el estado del paciente a tratar, así como otros
ingredientes de la composición. Las composiciones farmacéuticas que
contienen los productos de glucoproteína eritropoyetina se pueden
formular con una potencia efectiva para la administración por varios
medios a un paciente humano que experimente trastornos sanguíneos
caracterizados por la baja o defectiva producción de glóbulos rojos.
La media de las cantidades efectivas terapéuticamente del conjugado
pueden variar y en concreto deben estar basadas en las
recomendaciones y prescripción de un médico cualificado.
La presente invención está dirigida a productos
de la glucoproteína eritropoyetina que presentan una actividad
biológica in vivo con la que consigue que las células de la
médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos
rojos representado por la Fórmula 1:
1,P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]
_{n}
en donde X e Y son tal como se han
definido anteriormente, m se encuentra comprendido entre 450 y 900,
n se encuentra comprendido entre 1 y 3, R es alquilo inferior y P es
la glucoproteína eritropoyetina menos el grupo amino o grupos amino
que forman un enlace amida con X. Como se presenta en detalle a
continuación, la preparación y purificación de la EPO son bien
conocidos en el campo. Por EPO se denota la proteína natural o
recombinante, preferiblemente humana, así como la obtenida a partir
de cualquier fuente convencional tal como tejidos, síntesis
protéica, cultivo celular con células naturales o recombinantes. Se
incluye cualquier proteína que presente actividad de EPO, tal como
muteínas o proteínas modificadas de otra manera. La EPO recombinante
se puede preparar mediante su expresión en líneas celulares CHO-,
BHK- o HeLa mediante la tecnología del DNA recombiante o mediante
activación génica endógena. Las especies EPO preferidas para la
preparación de productos de la glucoproteína eritropoyetina son
especies EPO humanas. Más preferiblemente, las especies EPO son la
EPO humana que tiene la secuencia aminoacídica presentada en la
Figura 1 (SEQ ID NO:1) o Figura 2 (SEQ ID NO:2), siendo la más
preferida la EPO humana que tiene la secuencia aminoacídica en la
Figura 1 (SEQ ID
NO:1).
La proteína eritropoyetina humana también se
puede modificar en al menos un sitio para la glucosilación, por
ejemplo entre 1 y 6 sitios de glucosilación adicionales, tales como,
pero no limitadas a, las secuencias aminoacídicas presentadas a
continuación. La siguiente notación significa que la secuencia
expuesta en la Figura 1 se ha modificado mediante la substitución
del aminoácido nativo en la posición numerada con superíndice por el
aminoácido indicado a la izquierda del número en superíndice.
Asn^{30}Thr^{32} Figura 1;
Asn^{51}Thr^{53} Figura 1,
Asn^{57}Thr^{59} Figura 1;
Asn^{69} Figura 1;
Asn^{69}Thr^{7l} Figura 1;
Ser^{68}Asn^{69}Thr^{7l} Figura 1;
Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} Figura 1;
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} Figura 1;
Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90} Figura
1;
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92} Figura
1;
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162} Figura
1;
Asn^{69}Thr^{71}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}
Figura 1;
Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90}
Figura 1;
Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91} Figura 1;
Ser^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{9l} Figura
1;
Asn^{136}Thr^{138} Figura 1;
Asn^{138}Thr^{140} Figura 1;
Thr^{125} Figura 1; y
Pro^{124}Thr^{125} Figura 1.
La proteína eritropoyetina humana también puede
ser un análogo que tenga al menos un aminoácido adicional en el
extremo carboxilo de la glucoproteína, en donde el aminoácido
adicional incluye al menos un sitio de glucosilación, es decir la
glucoproteína tiene una secuencia que comprende la secuencia de la
eritropoyetina humana y una segunda secuencia en el extremo
carboxilo de la secuencia de la eritropoyetina humana, en donde la
segunda secuencia contiene al menos un sitio de glucosilación.
El aminoácido adicional puede comprender un
fragmento peptídico derivado del extremo carboxilo de la
gonadotropina coriónica. Preferiblemente, la glucoproteína es un
análogo seleccionado del grupo que consiste en (a) eritropoyetina
humana que tiene la secuencia aminoacídica Ser Ser Ser Ser Lys Ala
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
Pro IIe Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3), prolongándose desde el extremo
carboxilo; (b) el análogo en (a) también comprende EPO Ser^{87}
Asn^{88} Thr^{90}; y (c) el análogo en (a) también comprende EPO
Asn^{30} Thr^{32} Val^{87} Asn^{88} Thr^{90}.
La proteína eritropoyetina humana también puede
ser un análogo con una secuencia aminoacídica que incluya una nueva
disposición de al menos un sitio para la glucosilación. La nueva
disposición puede comprender una deleción de cualquiera de los
sitios de unión N a carbohidrato en la eritropoyetina humana y una
adición de un sitio de unión N a carbohidrato en la posición 88 de
la secuencia aminoacídica de la eritropoyetina humana.
Preferiblemente, la glucoproteína es un análogo seleccionado del
grupo que consiste en EPO Gln^{24} Ser^{87} Asn^{88}
Thr^{90}; EPO Gln^{38} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; y EPO
Gln^{83} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}.
Los análogos de eritropoyetina con sitios de
glucosilación adicionales se revelan con más detalle en la Solicitud
de Patente Europea No. 640 619. los contenidos de las cuales se
encuentran incorporados aquí por referencia.
En la fórmula I, R puede ser cualquier alquilo
inferior, lo que significa un grupo alquilo lineal o ramificado que
presenta entre uno y seis átomos de carbono tales como metilo,
etilo, isopropilo, etc. Un alquilo preferido es metilo.
En la Fórmula 1, X es -(CH_{2})_{k} ó
-CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
en donde k se encuentra comprendido entre 1 y 10. Preferiblemente k
se encuentra entre 1 y 4, más preferiblemente, k es 1 ó 2. Más
preferiblemente X es -(CH_{2}).
En la Fórmula 1, Y es
Preferiblemente Y es
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferiblemente Y es
En la Fórmula 1, el número m se selecciona de tal
forma que el conjugado resultante de la Fórmula 1 tiene una
actividad fisiológica comparable a la EPO no modificada, cuya
actividad puede representar una o más de una fracción de la
correspondiente actividad de la EPO no modificada. m representa el
número de residuos de óxido de etileno en la unidad de PEG. Una
única subunidad PEG de -(OCH_{2}CH_{2})- tiene un peso molecular
de 44 daltons. Así, el peso molecular del conjugado (excluyendo el
peso molecular de la EPO) depende del número m. m es un número
entero que se encuentra entre 450 y 900 (correspondiendo al peso
molecular de entre 20 y 40 kDa), preferiblemente m se encuentra
entre 550 y 800 (alrededor de 24 a 35 kDa), y más preferiblemente m
se encuentra entre 650 y 700 (29 y 31 kDa).
En la Fórmula 1, el número n es el número de
grupos \varepsilon-amino de un aminoácido de
lisina en una proteína eritropoyetina unida covalentemente a una
unidad de PEG mediante un enlace amida. Un conjugado de esta
invención puede tener uno, dos o tres unidades de PEG por molécula
de EPO. n es un número entero que se encuentra comprendido entre 1 y
3, preferiblemente n es 1 ó 2, y más preferiblemente n es 1.
Los productos de glucoproteína eritropoyetina se
encuentran representados por las fórmulas:
en donde P, R, X, m y n son tal
como se han definido
anteriormente.
Los productos de glucoproteína eritropoyetina más
preferidos se encuentran representados por la fórmula:
en donde P, R, X, M y n son tal
como se han definido
anteriormente.
Otros productos de glucoproteína eritropoyetina
preferidos se encuentran representados mediante las fórmulas:
en donde P y n son como se han
definido
anteriormente.
Los productos de glucoproteína eritropoyetina más
preferidos se encuentran representados por la fórmula:
en donde P y n son como se han
definido
anteriormente.
Los compuestos preferidos son aquéllos en los que
X es -(CH_{2})_{k}-, especialmente aquellos en los que k
se encuentra entre 1 y 4, más preferiblemente aquéllos en los que X
es -CH_{2}.
La invención también se refiere a los conjugados
anteriores en donde m es un entero que se encuentra comprendido
entre 550 y 800, preferiblemente m es un entero entre 650 y 700.
Los compuestos preferidos de la presente
invención son aquéllos en los que n es 1 y/o R es metilo.
Además, la invención se refiere a los compuestos
anteriores en los que el peso molecular medio de cada porción de
poli(etilen glicol) se encuentra entre 24 kilodaltons y 35
kilodaltons, más preferiblemente 30 kilodaltons.
Además, la presente invención se refiere a
compuestos en los que la glucoproteína se encuentra unida
covalentemente a uno o dos porciones de poli(etilen glicol)
cuyo extremo es un alcoxilo inferior, más preferiblemente a una
porción de poli(etilen glicol) cuyo extremo sea un alcoxilo
inferior.
En una realización preferida, las porciones de
poli(etilen glicol) presentan en su extremo un grupo
metoxilo.
En la realización más preferida, la invención se
refiere a los compuestos anteriores en los que X es -CH_{2}-, m es
un entero que se encuentra entre 650 y 700, n es 1, R es metilo, y
en los que el peso molecular medio de cada porción de
poli(etilen glicol) es de 30 kilodaltons.
Todavía en otra realización, la invención se
refiere a un método para el tratamiento de anemia en humanos que
comprende la administración a humanos de una cantidad
terapéuticamente efectiva de un producto de glucoproteína
eritropoyetina representado por la Fórmula 1.
Todavía en otra realización, la invención se
refiere a un método para la preparación de un producto de
glucoproteína eritropoyetina, que presenta una actividad biológica
in vivo que consigue que las células de la médula ósea
incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos, dicho
método comprende los pasos de:
(a) la reacción de forma covalente entre un grupo
\varepsilon-amino de un aminoácido de lisina de
una proteína eritropoyetina representada por la fórmula
P-[NH_{2}]_{n} con un reactivo bifuncional representado
por la fórmula
Z-CO-X-S-Q,
para formar un intermediario que presenta un enlace amida
representado por la fórmula:
P-[NH-CO-X-S-Q]
_{n}
en donde P es una proteína
eritropoyetina menos el grupo amino que forma un enlace amida; n es
un entero que se encuentra comprendido entre 1 y 3; Z es un grupo
reactivo, por ejemplo un éster del ácido
carboxílico-NHS; X es -(CH_{2})_{k}- ó
-CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
en donde k se encuentra comprendido entre 1 y 10; y Q es un grupo
protector, como alcanoílo, por ejemplo
acetilo.
b) la reacción de forma covalente entre el
intermediario que presenta un enlace amida del paso (a) y un
derivado de polietilen glicol activado representado por la fórmula,
W- [OCH_{2}CH_{2}]_{m}-OR, para formar
un producto de glucoproteína eritropoyetina representado por la
fórmula:
en donde W es una forma reactiva
sulfidrila de Y; m es un entero que se encuentra comprendido entre
450 y 900; R es alquilo inferior; e Y
es
En esta realización, el reactivo bifuncional
preferiblemente es
N-succinimidil-S-acetiltiopropionato
o
N-succi-nimidil-S-acetiltioacetato,
Z preferiblemente es
N-hidroxi-succinimida, y el derivado
de polietilen glicol activado
W-[OCH_{2}CH_{2}]_{m}-OR se selecciona
preferiblemente del grupo que consiste en
yodo-acetil-metoxi-PEG,
metoxi-PEG-vinilsulfona y
metoxi-PEG-maleimida.
Otra realización de la presente invención se
refiere a una composición que comprende conjugados, dichos
conjugados comprenden una glucoproteína eritropoyetina que presenta
al menos un grupo amino libre y que presenta una actividad biológica
in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea
incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se
selecciona del grupo que consiste en la eritropoyetina humana y
análogos de la misma que presentan la estructura primaria de la
eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6
sitios de glucosilación o mediante la nueva disposición de al menos
un sitio de glucosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida de
forma covalente a de uno a tres grupos
alcoxi-inferior poli(etilenglicol), cada
grupo poli(etilenglicol) se encuentra unido covalentemente a
la glucoproteína mediante un conector con la fórmula
-C(O)-X-S-Y-,
con el C(O) del conector formando un enlace amida con uno de
dichos grupos amino,
X es -(CH_{2})_{k}- ó
-(CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
k se encuentra entre 1 y 10,
Y es
el valor medio del peso molecular
de cada porción de poli(etilen glicol) se encuentra entre 20
kilodaltons y 40 kilodaltons y el peso molecular del conjugado se
encuentra entre 51 kilodaltons y 175 kilodaltons; y el porcentaje de
conjugados donde n es 1 es al menos del noventa por ciento.
Preferiblemente la composición comprende conjugados como se han
definido anteriormente en donde el porcentaje de conjugados donde n
es 1 es al menos del noventa por ciento, más preferiblemente en
donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del
noventa y dos por ciento, e incluso más preferiblemente en donde el
porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa y seis
por ciento, y siendo la forma más preferida en donde el porcentaje
de conjugados donde n es 1 se encuentra entre noventa y noventa y
seis por
ciento.
Además, la presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un conjugado o una
composición tal como se ha definido anteriormente y un excipiente
farmacéuticamente aceptable y el uso de un conjugado o una
composición tal como se ha definido anteriormente para la
preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de
enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal
crónico (CRF), y para el tratamiento de pacientes con SIDA y cáncer
que han sido sometidos a quimioterapia. Además, la invención se
refiere a un método para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico
de trastornos relacionados con la anemia en pacientes con fallo
renal crónico (CRF), y pacientes con SIDA y cáncer que han sido
sometidos a quimioterapia, comprendiendo el paso de la
administración a un paciente de una composición tal como se ha
descrito anteriormente.
La invención también se refiere a un proceso para
la preparación de conjugados o composiciones tal como se han
definido anteriormente, donde dicho proceso comprende la unión
covalente de grupos tiol a una glucoproteína eritropoyetina y el
acoplamiento de la resultante glucoproteína eritropoyetina activada
con un derivado de poli(etilen glicol) (PEG). Además, la
invención se refiere a conjugados y composiciones tal como se han
definido anteriormente siempre que se preparen mediante los procesos
descritos anteriormente y a conjugados y composiciones tal como se
han definido anteriormente para le tratamiento de enfermedades que
están asociadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico
(CRF) y pacientes con SIDA y cáncer que han sido sometidos a
quimioterapia.
La eritropoyetina (EPO) es una glucoproteína
humana que estimula la formación de eritrocitos. Su preparación y
aplicación terapéutica están descritas en detalle por ejemplo en las
Patentes Estadounidenses Nos. 5.547.933 y 5.621.080,
EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205
564, EP-B 0 209 539 y EPB 0 411 678 así como por
Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986)
3116-3121, y Sasaki, H. et al., J. Biol.
Chem. 262 (1987) 12059-12076. La eritropoyetina para
usos terapéuticos se puede producir de forma recombinante
(EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 y
Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986)
Immunobiol. 72: 213-224). La expresión de proteínas,
incluyendo EPO, mediante activación génica endógena, es bien
conocida en el campo y se revela, por ejemplo en las Patentes
Estadounidenses Nos 5.733.761, 5.641.670 y 5.733.746 y las
publicaciones de patente internacionales Nos. WO 93/09222, WO
94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955, los
contenidos de las cuales están incorporados aquí por referencia.
Los métodos para la expresión y preparación de la
eritropoyetina en medio sin suero están descritas por ejemplo en WO
96/35718, de Burg publicada el 14 de Noviembre de 1996, y en la
Publicación de Patente Europea No. 513 738, de Koch publicada el 12
de Junio de 1992.
En adición a las referencias mencionadas
anteriormente, se sabe que se puede llevar a cabo una fermentación
libre de suero de células CHO recombinantes que contengan un gen
EPO. Tales métodos están descritos por ejemplo en
EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 y de
forma general por Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem.
130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656,
Kowar, J. and Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986)
277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981)
45-51, EP-A 0 481 791,
EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO
88/00967.
En EP-A 0 267 678 se describe una
cromatografía de intercambio iónico en S-Sefarosa,
un HPLC en fase reversa preparativo en una columna C_{8} y una
cromatografía de filtración en gel para la purificación de EPO
producida en cultivo sin suero tras realizar una diálisis. En esta
relación, el paso de cromatografía de filtración en gel se puede
sustituir por cromatografía de intercambio iónico en
S-Sepharose fast flow. También se propone realizar
una cromatografía con pigmento en una columna de Azul de Trisacrilo
de forma previa a la cromatografía de intercambio iónico.
Se describe un proceso para la purificación de la
EPO recombinante en Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990)
352-359. En este proceso, la EPO se trata con una
solución de Tween® 20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo,
etilmaleimida, pestatina A, sulfato de cobre y ácido oxámico de
forma previa a los pasos de purificación.
Múltiples referencias como WO 96/35718, de Burg
publicada el 14 de Noviembre de 1996, revelan un proceso para la
preparación de eritropoyetina en un proceso de fermentación libre de
suero (EPOsf). A continuación se explica a modo de ejemplo un método
para producir EPO como material de partida para la pegilación.
La actividad específica de EPO o conjugados de
EPO de acuerdo con esta invención, se puede determinar mediante
varios ensayos conocidos en el campo. La actividad biológica de las
proteínas EPO purificadas de esta invención es tal que la
administración de la proteína EPO por inyección a pacientes humanos
consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción
de reticulocitos y glóbulos rojos comparado con los sujetos no
inyectados o grupos control. La actividad biológica de las proteínas
EPO, o fragmentos de las mismas, obtenidos y purificados de acuerdo
con esta invención se pueden determinar por métodos de acuerdo con
Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2).
Otro ensayo biológico para determinar la
actividad de la proteína EPO, el ensayo normocitémico de ratón, se
describe en el Ejemplo 4.
Los procesos para la preparación de productos de
glucoproteína eritropoyetina representada por la Fórmula 1 comprende
la unión covalente de grupos tiol a EPO ("activación") y el
acoplamiento de la resultante EPO activada con un derivado de
poli(etilen glicol) (PEG). El primer paso para la preparación
de EPO pegilada de acuerdo con la presente invención comprende la
unión covalente de grupos tiol por grupos NH_{2} de EPO. Esta
activación de EPO se lleva a cabo con reactivos bifuncionales que
llevan un grupo tiol protegido y un grupo reactivo adicional, tal
como ésteres activos (por ejemplo un succinimidiléster), anhídridos,
ésteres de ácido sulfónico, halogenuros de ácidos carboxílicos y
ácidos sulfónicos, respectivamente. El grupo tiol está protegido por
grupos conocidos en el campo, por ejemplo grupos acetilo. Estos
reactivos bifuncionales son capaces de reaccionar con grupos
\xi-amino de aminoácidos de lisina formando un
enlace amida. El primer paso de la reacción se presenta a
continuación:
EPO, n y X son tal como se han definido
anteriormete y Z es un grupo reactivo conocido en el campo, por
ejemplo un substituyente
N-hidroxi-succinimida (NHS) de la
fórmula
En una realización preferida la activación de los
grupos \varepsilon-amino se lleva a cabo por la
reacción con reactivos bifuncionales que tienen una porción de
succinimidilo. Los reactivos bifuncionales pueden llevar diferentes
especies de espaciadores, por ejemplo porciones
-(CH_{2})_{k}- ó
-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}-)_{k}-,
en donde k se encuentra comprendido entre 1 y 10, preferiblemente
entre 1 y 4 y más preferiblemente 1 ó 2, y la forma más preferida
donde es 1. Ejemplos de estos reactivos son
N-succinimidil-S-acetilpropionato
(SATP) y
N-succinimidil-S-acetiltioacetato
(SATA)
Acetiltioalquil-carboxílico-NHS-éster
como
\hskip2cm2-(Acetiltio)-(etoxi)_{k}-ácido acético-NHS-éster
con k como se ha definido
anteriormente.
La preparación de los reactivos bifuncionales es
conocida en el campo. Los precursores de
2-(acetiltio)-(etoxi)_{k}-
ácido acético-NHS-ésteres se describen en DE-3924705, mientras que la derivación al compuesto de acetiltio está descrita por March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA se encuentra disponible comercialmente (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rochford, IL).
ácido acético-NHS-ésteres se describen en DE-3924705, mientras que la derivación al compuesto de acetiltio está descrita por March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA se encuentra disponible comercialmente (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rochford, IL).
El número de grupos tiol que se añaden a una
molécula de EPO se pueden seleccionar mediante el ajuste de los
parámetros de reacción, tales como la concentración de proteína
(EPO) y la relación proteína/reactivo bifuncional. Preferiblemente,
la EPO se activa mediante la unión covalente de entre 1 y 5 grupos
tiol por molécula de EPO, más preferiblemente entre 1,5 y 3 grupos
tiol por molécula de EPO. Estos rangos se refieren a la distribución
estadística del grupo tiol sobre la población de proteína EPO.
La reacción se lleva a cabo, por ejemplo, en una
solución tampón acuosa, pH 6,5-8,0, por ejemplo en
fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,3. El reactivo bifuncional
se puede añadir en DMSO. Tras la finalización de la reacción,
preferiblemente tras 30 minutos, la reacción se para mediante la
adición de lisisna. El exceso de reactivo bifuncional se puede
separar por métodos conocidos en le campo, por ejemplo por diálisis
o filtración en columna. El número medio de grupos tiol añadidos a
la EPO se pueden determinar mediante métodos fotométricos descritos
en, por ejemplo, Grasetti, D.R. and Murray, J.F. en J. Appl.
biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967).
La reacción anterior es seguida por el
acoplamiento covalente de un derivado de polietilen glicol (PEG)
activado. Los derivados de PEG adecuados son moléculas de PEG
activadas con un peso molecular medio de entre alrededor de 20 y
alrededor de 40 kDa, más preferiblemente entre alrededor de 24 y
alrededor de 35 kDa, y siendo la forma más preferida alrededor de 30
kDa.
Los derivados de PEG activados son conocidos en
el campo y están descritos en, por ejemplo, Morpurgo, M. et
al. J. Bioconj. Chem (1966) 7, página 363 ff para
PEG-vinilsulfona. Las especies de PEG de cadena
lineal y de cadena ramificada son adecuadas para la preparación de
los compuestos de la Fórmula 1. Los ejemplos de los reactivos de PEG
reactivos son
yodo-acetil-metoxi-PEG
y metoxi-PEG-vinilsulfona:
El uso de estas substancias activadas por yodo es
conocido en el campo y están descritas por ejemplo por Hermanson,
G.T. en Bioconjugate Techniques, Academic Presss, San Diego (1996)
p. 147-148.
Más preferiblemente, las especies PEG están
activadas por maleimida usando
(alcoxi-PEG-maleimida), tal como
metoxi-PEG-maleimida (Peso
molecular 30000; Shearwater Polymers, Inc.). La estructura de
alcoxi-PEG-maleimida es la
siguiente:
con R y m tal como se han definido
anteriormente.
El derivado más preferido es
en donde R y m son tal como se han
definido
anteriormente.
La reacción de acoplamiento con
alcoxi-PEG-maleimida tiene lugar
tras la escisión in situ del grupo protector tiol en una
solución tampón acuosa, por ejemplo fosfato potásico 10 mM, NaCl 50
mM, EDTA 2 mM, pH 6,2. La escisión del grupo protector se puede
realizar, por ejemplo, con hidroxilamina en DMSO a 25ºC, pH 6,2
durante 90 minutos. Para la modificación del PEG, la relación molar
de EPO activada/alcoxi-PEG-maleimida
deber ser entre 1:3 y 1:6 y preferiblemente 1:4. La reacción se
puede parar mediante la adición de cisteína y haciendo reaccionar
los grupos tiol (-SH) remanentes con
N-metilmaleimida u otros compuestos apropiados
capaces de formar puentes disulfuro. Debido a la reacción de
cualquier grupo tiol activo remanente con un grupo protector tal
como N-metilmaleimida u otro grupo protector
adecuado, las glucoproteínas EPO en los conjugados de esta invención
pueden contener dichos grupos protectores. Generalmente el
procedimiento descrito aquí producirá una mezcla de moléculas con
números variables de tioles protegidos por un número diferente de
grupo protector, dependiendo del número de grupos tioles activados
en la glucoproteína que no se han conjugado con
PEG-maleimida.
Mientras que N-metilmaleimida
forma el mismo tipo de enlace covalente cuando se usa para bloquear
los grupos tiol remanentes en la proteína pegilada, los compuestos
con puentes disulfuro darán lugar a una reacción de intercambio
sulfuro/disulfuro intermolecular a un acoplamiento con puente
disulfuro del reactivo de bloqueo. Los reactivos de bloqueo
preferidos para ese tipo de reacción de bloqueo son glutatión
oxidizado (GSSG), cisteína y cistamina. Mientras que con la cisteína
no se introduce una carga neta adicional en la proteína pegilada, el
uso de los reactivos de bloqueo GSSG o cistamina resulta en una
carga adicional negativa o positiva.
La purificación posterior de los compuestos de la
Fórmula 1, incluyendo la separación de las especies mono-, di- y
tripegiladas, se puede llevar a cabo por métodos conocidos en el
campo, por ejemplo, cromatografía en columna.
Los productos de la glucoproteína eritropoyetina
preparados de acuerdo con esta invención se pueden preparar en
composiciones farmacéuticas adecuadas para la inyección con un
vehículo o portador farmacéuticamente aceptable mediante métodos
conocidos en el campo. Por ejemplo, se han descrito composiciones
adecuadas en W097/09996, W097/40850, W098/58660, y WO99/07401. Entre
los portadores farmacéuticamente aceptables que se prefieren para la
formulación de los productos de la invención se encuentran la
albúmina de suero humano, proteínas de plasma humano, etc. Los
compuestos de la presente invención se podrían formular en tampón de
fosfato de sodio/potasio 10 mM a pH 7 que contiene un agente de
tonicidad, por ejemplo cloruro de sodio 132 mM. De forma opcional la
composición farmacéutica puede contener un conservante. La
composición farmacéutica puede contener diferentes cantidades de
eritropoyetina, por ejemplo 10-1000 \mug/ml, por
ejemplo 50 \mug ó 400 \mug.
La administración de los productos de la
glucoproteína eritropoyetina de la presente invención provoca la
formación de glóbulos rojos en humanos. Por lo tanto, la
administración de los productos de la glucoproteína eritropoyetina
repone esta proteína EPO que es importante en la producción de
glóbulos rojos. Las composiciones farmacéuticas que contienen los
productos de glucoproteína eritropoyetina se pueden formular a una
potencia efectiva para la administración por varios medios a un
paciente humanos que sufra trastornos sanguíneos caracterizados por
la baja o defectiva producción de glóbulos rojos, mostrándose solo o
formando parte de un estado o enfermedad. Las composiciones
farmacéuticas se pueden administrar mediante inyección tal como por
inyección subcutánea o intravenosa. Las cantidades medias de
producto de glucoproteína eritropoyetina pueden variar y en
particular se deben basar en las recomendaciones y prescripciones de
un médico cualificado. La cantidad exacta de conjugado es una
cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto
de estado a tratar, el estado del paciente a tratar, así como otros
ingredientes en la composición. Por ejemplo, entre 0,01 y 10 \mug
por kg de peso corporal, preferiblemente entre 0,1 y 1 \mug por kg
de peso corporal, se pueden administrar por ejemplo una vez a la
semana.
A lo largo de esta solicitud se han referenciado
varias publicaciones. Las revelaciones en estas publicaciones se han
incorporado aquí por referencia para describir más completamente el
estado del campo.
La presente invención también está ilustrada por
los siguientes ejemplos que se han presentado con el propósito de
demostrar, la preparación de los compuestos y composiciones de esta
invención sin la intención de limitarla.
Se tomó un vial del Working Cell Bank, originado
a partir de una línea celular CHO que produce EPO (se puede usar
ATCC CRL8695, revelada en EP 411 678 (Genetics Institute)) a partir
de la fase gas del depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido.
Las células se transfirieron a tubos de centrífuga de vidrio y se
cultivaron en un medio tamponado con hidrógeno carbonato en un
incubador humidificado de CO_{2}. Los típicos medios sin suero
usados para la preparación del inóculo y la fermentación se revelan
en la Solicitud de Patente Europea 513 738, de Koch publicada el 12
Junio de 1992, o WO 96/35718, de Burg publicada el 14 de Noviembre
de 1996, por ejemplo contienen como medio DMEM/F12 (por ejemplo JRH
Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, No. 57736) y de modo
adicional hidrógenocarbonato sódico, L+glutamina, D+glucosa,
insulina recombinante, selenita sódica, diaminobutano,
hidrocortisona, sulfato de hierro (II), asparagina, ácido aspártico,
serina y un estabilizante para células de mamífero tal como por
ejemplo alcohol de polivinilo, metil celulosa, polidextrano,
polietilen glicol, Pluronic F68, expansor de plasma poligelina
(HEMACCEL®) o polivinil pirrolidona (WO 96/35718).
Los cultivos se comprobaron microscópicamente
para detectar la ausencia de microorganismos contaminantes y se
determinaron las densidades celulares. Estos ensayos se realizaron
en cada paso de fraccionamiento.
Tras el período de crecimiento inicial, el
cultivo celular se diluyó con medio fresco hasta conseguir la
densidad celular inicial y se comenzó otro ciclo celular. Este
procedimiento se repitió hasta que se obtuvo un volumen de cultivo
de aproximadamente 2 litros por tubo de centrífuga de vidrio. Tras
aproximadamente 12 duplicaciones, se encontraron disponibles entre 1
y 5 litros de este cultivo, los cuales entonces se usaron como
inóculo para el fermentador de inóculo de 10 litros.
Tras entre 3 y 5 días, el cultivo del fermentador
de 10 litros se pudo usar como inóculo para el fermentador de
inóculo de 100 litros.
Tras otros 3-5 días de cultivo,
el cultivo en los 100 litros de fermentación se puede usar como
inóculo para el fermentador de inóculo de 1000 litros.
Se usó un proceso de realimentación en lote, es
decir cuando se alcanza la densidad celular deseada, se recoge
aproximadamente el 80% del cultivo. El cultivo remanente es
rellenado con medio de cultivo fresco y se hace crecer hasta la
siguiente recogida. Una ronda de producción consiste en un máximo de
10 ciclos de recogida: 9 ciclos de recogidas parciales y 1 ciclo de
recogida completa al final de la fermentación. El ciclo de recogida
tiene lugar cada 3 -
4 días.
4 días.
El determinado volumen recogido es transferido a
un recipiente enfriado. Las células son separadas por centrifugación
o filtración y eliminadas. La EPO que contiene el sobrenadante del
paso de la centrifugación se filtró en línea y se recogió en un
segundo recipiente enfriado. Cada cultivo recogido se procesa de
modo separado durante la purificación.
Un proceso típico para la purificación de la
proteína EPO se revela en WO 96/35718, de Burg publicado el 14 de
Noviembre de 1996. El proceso de purificación se explica de modo
ejemplar a continuación.
La Sefarosa azul (Pharmacia) consiste en bolitas
de Sefarosa, en la superficie de las cuales el colorante Cibacron
azul se encuentra unido covalentemente. Como la EPO se une con más
fuerza a la Sefarosa Azul que muchos de los contaminantes no
protéicos, algunas impurezas protéicas y PVA, la EPO se puede
enriquecer en este paso. La elución de la columna de Sefarosa Azul
se lleva a cabo incrementando la concentración de sales, así como el
pH.
La columna se empaquetó con entre
80-100 litros de Sefarosa Azul, se regeneró con NaOH
y se equilibró con tampón de equilibrado (cloruro de sodio/calcio y
acetato sódico). Se cargó el sobrenadante de la fermentación
acidificado y filtrado. Tras finalizar la carga, la columna se lavó
en primer lugar con un tampón similar al tampón de equilibrado, que
contenía una mayor concentración de cloruro de sodio y
posteriormente con un tampón Tris-base. El producto
se eluyó con un tampón Tris-base y se recogió en una
fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.
El Butil Toyopearl 650 C (Toso Haas) es una
matriz basada en poliestireno a la cual están acoplados residuos
alifáticos de butilo. Como la EPO se une con más fuerza a este gel
que muchas de las impurezas y PVA, se eluyó con un tampón que
contiene isopropanol.
La columna se empaquetó con entre
30-40 litros de Butil toyopearl 650 C, se regeneró
con NaOH, se lavó con un tampón Tris-base y se
equilibró con un tampón Tris-base que contenía
isopropanol.
El eluído de Sefarosa Azul se ajustó a la
concentración de isopropanol en el tampón de equilibrado de la
columna y se cargó en la columna. Entonces la columna se lavó con el
tampón de equilibrado siguiendo una concentración creciente de
isopropanol. El producto se eluyó con el tampón de elución (tampón
Tris-base con un mayor contenido de isopropanol) y
se recogió en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución
patrón.
El Ultrogel Hidroxiapatita (Biosepra) consiste en
Hidroxiapatita que se incorpora en una matriz de agarosa para
mejorar las propiedades mecánicas. La EPO tiene una menor afinidad
por la Hidroxiapatita y se puede eluir por tanto a concentraciones
menores de fosfato que las impurezas protéicas.
La columna se rellenó con entre
30-40 litros de Ultrogel Hidroxiapatita y se
regeneró con un tampón de fosfato potásico/cloruro cálcico y NaOH
seguido por un tampón Tris-base. Entonces se
equilibró con un tampón Tris-base que contiene una
cantidad menor de isopropanol y cloruro sódico.
La EPO contenida en el eluído de la cromatografía
Butil Toyopearl se introduce en la columna. Posteriormente la
columna se lavó con tampón de equilibrado y un tampón
Tris-base sin isopropanol y cloruro sódico. El
producto se eluyó con un tampón Tris-base que
contenía una menor concentración de fosfato potásico y se recogió en
una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.
El material RP-HPLC Vydac C4
(Vydac) consiste en partículas de gel de sílice, las superficies de
las cuales llevan cadenas C4-alquilo. La separación
de EPO de las impurezas protéicas se basa en las diferencias en
cuanto a la fuerza de las interacciones hidrofóbicas. La elución se
lleva a cabo con un gradiente de acetonitrilo en ácido
trifluoroacético diluído.
El HPLC preparativo se realizó mediante una
columna de acero inoxidable (rellenada con entre 2,8 y 3,2 litros de
gel de sílice Vydac C4). El eluído de Hidroxiapatita Ultrogel se
acidificó mediante la adición de ácido trifluoroacético y se
introdujo en la columna Vydac C4. Para el lavado y la elución se
utilizó un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético. Las
fracciones se recogieron e inmediatamente se neutralizaron con
tampón fosfato. Las fracciones EPO que se encontraron dentro de los
límites IPC se combinaron.
El material de Sefarosa DEAE (Pharmacia) consiste
en grupos dietilaminoetil (DEAE) que se encuentran covalentemente
unidos a la superficie de las bolas de Sefarosa. La unión de EPO a
los grupos DEAE está mediada por interacciones iónicas. El
acetonitrilo y el ácido trifluoroacético pasaron a través de la
columna sin ser retenidos. Después de que se lavaron estas
substancias, se eliminaron las trazas de impurezas mediante el
lavado de la columna con tampón acetato a bajo pH. Entonces la
columna se lavó con tampón fosfato neutro y la EPO se eluyó con un
tampón con fuerza iónica creciente.
La columna se empaquetó con Sefarosa DEAE fast
flow. El volumen de la columna se ajustó para asegurar una carga de
EPO en el rango de 3-10 mg EPO/ml gel. La columna se
lavó con agua y tampón de equilibrado (fosfato sódico/potásico). Las
fracciones combinadas del eluído de HPLC se cargaron y la columna se
lavó con tampón de equilibrado. Entonces la columna se lavó con
tampón de lavado (tampón de acetato sódico) y posteriormente con
tampón de equilibrado. Posteriormente, la EPO se eluyó de la columna
con tampón de elución (cloruro sódico, fosfato sódico/potásico) y se
recogió en un fracción única de acuerdo con el perfil de elución
patrón.
El eluído de la columna Sefarosa DEAE se ajustó a
la conductividad especificada. La substancia resultante se filtró
quedando estéril en botellas de Teflon y se conservó a -70ºC.
Este ejemplo revela la determinación de estados
de reacción para la unión covalente de grupos tiol con EPO. Para
determinar estos estados, se añadieron deferentes cantidades de un
reactivo que contenía un grupo tiol bloqueado, aquí SATA o SATP
(disueltos en DMSO hasta 10 mg/ml) a la solución de EPO, aquí a 1 ml
de EPO 5 mg/ml en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,3. La
reacción se agitó durante 30 minutos (25ºC) y se paró por la adición
de una solución de lisina 1M a 10 mM. La cantidades en exceso de
SATA y SATP se eliminaron por diálisis contra fosfato potásico 10
mM, NaCl 50 mM y EDTA 2 mM, pH 6,2. Tras la eliminación del grupo
acetilo protector con hidroxilamina, el número de grupos tiol unidos
covalentemente a EPO se determinó fotométricamente con
ditiodipiridina según el método descrito por Grasetti, D.R. and
Murray, J.F. en J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, página
41-49 (1967).
El número de grupos tiol unidos covalentemente
por molécula EPO se muestra a continuación.
100 mg de EPO producidos según el Ejemplo 1
(190.000 UI/mg determinado según el ensayo normocitémico se
activaron con SATA (relación molar: EPO/SATA= 1/5) según el Ejemplo
2. La EPO resultante ("EPO activada") que lleva unido
covalentemente grupos tiol bloqueados fue separada de los productos
secundarios como
N-hidroxi-succinimida o SATA que no
reaccionó por diálisis como se describe en el Ejemplo 1. Se obtuvo
una solución de EPO activada 4,5 mg/ml en fosfato potásico 10 mM,
NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,2.
380 mg de
metoxi-PEG-maleimida con la
estructura ``más preferida mostrada anteriormente (PM 30.000;
Shearwater Polymers, Inc. Huntsville (Alabama, USA)) se disolvieron
en la solución anterior que contenía 95 mg de EPO activada (4,5
mg/ml en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,2). La
relación molar resultante entre la EPO activada y
metoxi-PEG-maleimida en la solución
fue de 1:4. Mediante la adición de una solución acuosa de
hidroxilamina 1M hasta 30 mM, pH 6,2 a la solución anterior, los
grupos tiol bloqueados unidos covalentemente de la EPO activada se
desbloquearon. La EPO activada resultante en la mezcla de reacción
de la solución contenía grupos tiol (-SH) libres. Inmediatamente
tras el desbloqueo de los grupos tiol, se llevó a cabo la reacción
de acoplamiento entre la EPO activada que ahora contenía grupos tiol
(-SH) libres y metoxi-PEG-maleimida
durante 90 minutos (agitación, 25ºC). La reacción de acoplamiento se
paró mediante la adición de una solución acuosa de cisteína 0,2 M
hasta 2 mM a la mezcla de reacción. Tras 30 minutos, los grupos tiol
libres en exceso de la EPO activada que no reaccionaron con
metoxi-PEG-maleimida se bloquearon
mediante la adición de una solución de
N-metilmaleimida 0,5 M en DMSO para conseguir una
concentración de 5 mM. Tras 30 minutos, la mezcla de reacción
resultante que contenía especies EPO pegiladas se dializó con
fosfato potásico 10 mM, pH 7,5 durante \geq15 horas.
Para la separación de las especies EPO pegiladas
de la mezcla de reacción, se llevó a cabo al siguiente proceso de
purificación: Una columna Q-Sepharose ff de 50 ml se
equilibró con fosfato potásico 10 mM, pH 7,5. La mezcla de reacción
obtenida en el paso B) se introdujo en la columna (tasa del flujo: 3
volúmenes de columna (VC) por hora). Con la finalidad de separar el
reactivo de metoxi-PEG-maleimida que
no había reaccionado, la columna se lavó con 5 VC de fosfato
potásico 10 mM, pH 7,5. Las especies EPO pegiladas se separaron
mediante la elución con un gradiente de sal creciente que consistía
en 5 VC de tampón A (fosfato potásico 10 mM, pH 7,5) y 5 VC de
tampón B (fosfato potásico 10 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) con una tasa
de flujo de 3 VC por hora. Según el gradiente de NaCl, las especies
EPO pegiladas (especies EPO tri-, bi- y
mono-pegiladas) se eluyeron en primer lugar,
seguidas por las especies EPO no pegiladas. La fracción del eluído
que contenía las especies EPO pegiladas (especies EPO tri-, bi- y
mono-pegiladas) se combinó y se filtró (filtración
estéril con un filtro de 0,2 \mum).
El contenido y pureza de las especies EPO tri-,
di- y mono-pegiladas se evaluó en geles
SDS-PAA con tinción de Coomassie (Laemmli, Nature
227, 680-685 (1970)) mientras que la concentración
de proteína se midió a 280 nm según la ley de
Beer-Lambert. Los pesos moleculares aparentes de las
especies EPO determinadas por electroforesis SDS-PAA
se encontraban alrededor de 68 kDa (especies EPO
mono-pegiladas), alrededor de 98 kDa (especies EPO
di-pegiladas) y alrededor de 128 kDa (especies EPO
tri-pegiladas).
La separación posterior de las especies EPO tri-
di- y mono-pegiladas se puede conseguir mediante
cromatografía, por ejemplo mediante cromatografía de exclusión de
tamaño (Superdex, pg 200; Pharmacia).
La determinación de la actividad biológica
in-vivo del eluído que contenía las especies
tri- di- y mono-pegiladas se llevó a cabo por el
método descrito en el Ejemplo 4.
El bioensayo normocitémico de ratón es conocido
en el campo (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio
1997(2)) y se describe un método en la monografía de
eritropoyetina de Ph. Eur. BRP. Las muestras se diluyeron con
BSA-PBS. A ratones sanos de 7-15
semanas de edad, se les administraron s.c. 0,2 ml de la fracción de
EPO que contenía EPO tri-, di- o mono-pegilada tal
como se describe en el ejemplo 2. Durante un período de 4 días,
empezando 72 horas tras la administración, se les extrajo sangre por
punción de la vena de la cola y se diluyó de forma que 1 \mul de
sangre se encontraba presente en 1 ml de una solución de tinción
naranja de acridina 0,15 \mumol. El tiempo de tinción oscila entre
3 y 10 minutos. Los contajes de reticulocito se llevaron a cabo de
forma microfluorométrica en un citómetro de flujo mediante análisis
del histograma de fluorescencia rojo. Los contajes de reticulocito
se dieron en términos de valores absolutos (por 30.000 células
sanguíneas analizadas). Para los datos presentados, cada grupo
consistió en 5 ratones por día, y los ratones fueron sangrados sólo
una vez.
A los ratones se les administró
metoxi-PEG-maleimida acoplada a EPO
según el Ejemplo 3, EPO no modificada y solución tampón. Los
resultados se muestran en la Figura 3. Los resultados muestran la
mayor actividad y vida media prolongada de las especies EPO
pegiladas, indicado por las cantidades significativamente crecientes
de reticulocitos y el cambio del valor máximo de reticulocitos
suministrando la misma dosis por ratón.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: F.Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 124 Grenzacherstrasse
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (61) 688 11 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: (61) 688 13 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 962 292 hlr ch
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Conjugados de Eritropoyetina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE OPERACIÓN: WORD
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
Ile Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Pro Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (38)
1. Un conjugado, dicho conjugado comprende una
glucoproteína eritropoyetina que presenta al menos un grupo amino
libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la
que consigue que las células de la médula ósea incrementen la
producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del
grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que
presentan la estructura primaria de la eritropoyetina humana
modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de
glucosilación o mediante la nueva disposición de al menos un sitio
de glucosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida de forma
covalente a de uno a tres grupos
alcoxi-C_{1}-C_{3}
poli(etilen glicol), cada grupo poli(etilen glicol) se
encuentra unido covalentemente a la glucoproteína mediante un
conector con la fórmula
-C(O)-X-S-Y-,
con el C(O) del conector formando un enlace amida con uno de
dichos grupos amino,
X es -(CH_{2})_{k}- ó
-(CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
k se encuentra entre 1 y 10,
Y es
el valor medio del peso molecular
de cada porción de poli(etilen glicol) se encuentra entre 20
kilodaltons y 40 kilodaltons y el peso molecular del conjugado se
encuentra entre 51 kilodaltons y 175
kilodaltons.
2. El conjugado de la reivindicación 1, de la
fórmula
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]
_{n}
en donde X e Y son tal como se han
definido en la reivindicación 1, m se encuentra comprendido entre
450 y 900, n se encuentra comprendido entre 1 y 3, R es alquilo
C_{1}-C_{6} y P es la glucoproteína
eritropoyetina menos el grupo amino o grupos amino que forman un
enlace amida con
X.
3. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, de la fórmula
en donde P, R, X, m y n son tal y
como se han definido en la reivindicación
2.
4. El conjugado de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, de la fórmula
en donde P, R, X, m y n son tal y
como se han definido en la reivindicación
2.
5. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde X es
-(CH_{2})_{k}-.
6. El conjugado de acuerdo con la reivindicación
5, en donde k está comprendido entre 1 y 4.
7. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde X es -(CH_{2})-.
8. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde m es un número entero que se encuentra
comprendido entre 550 y 800.
9. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde m es un número entero que se encuentra
comprendido entre 650 y 700.
10. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde n es 1.
11. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde R es metilo.
12. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde el peso molecular medio de cada
porción de poli(etilen glicol) se encuentra comprendido entre
alrededor de 24 kilodaltons y alrededor de 35 kilodaltons.
13. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde el peso molecular medio de cada
porción de poli(etilen glicol) es de alrededor de 30
kilodaltons.
14. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde la glucoproteína se encuentra
unida covalentemente a una o dos porciones de poli(etilen
glicol) cuyo extremo es alcoxilo inferior.
15. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde las porciones de
poli(etilen glicol) presentan en su extremo un grupo
metoxilo.
16. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde X es -CH_{2}-, m es un número entero
comprendido entre 650 y 700, n es 1, R es metilo, y en donde el peso
molecular medio de cada porción de poli(etilen glicol) es de
alrededor de 30 kilodaltons.
17. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde la glucoproteína eritropoyetina
es una eritropoyetina humana.
18. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde la glucoproteína eritropoyetina
se expresa mediante activación génica endógena.
19. El conjugado de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde la glucoproteína eritropoyetina
tiene la secuencia SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
20. El conjugado de acuerdo con la reivindicación
19, en donde la glucoproteína eritropoyetina tiene la secuencia
mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1).
21. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en donde la glucoproteína tiene la
secuencia de la eritropoyetina humana modificada por la adición de
entre 1 y 6 sitios de glucosilación.
22. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10, en donde la glucoproteína tiene la
secuencia de la eritropoyetina humana modificada por una
modificación seleccionada del grupo que consiste en:
Asn^{30}Thr^{32};
Asn^{51}Thr^{53},
Asn^{57}Thr^{59};
Asn^{69};
Asn^{69}Thr^{7l};
Ser^{68}Asn^{69}Thr^{7l};
Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162};
Asn^{69}Thr^{71}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91};
Ser^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{9l};
Asn^{136}Thr^{138};
Asn^{138}Thr^{140};
Thr^{125}; y
Pro^{124}Thr^{125}.
23. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la glucoproteína tiene una
secuencia que comprende la secuencia de la eritropoyetina humana y
una segunda secuencia en el extremo carboxilo de la secuencia de la
eritropoyetina humana, en donde la segunda secuencia contiene al
menos un sitio de glucosilación.
24. El conjugado de acuerdo con la reivindicación
23, en donde la segunda secuencia comprende una secuencia derivada
de la secuencia del extremo carboxilo de la gonadotropina coriónica
humana.
25. El conjugado de la reivindicación 24, en
donde la glucoproteína tiene una secuencia seleccionada del grupo
que consiste en:
(a) eritropoyetina humana que tiene la secuencia
aminoacídica Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln (SEQ ID
NO:3), prolongándose desde el extremo carboxilo;
(b) la secuencia en (a) modificado por Ser^{87}
Asn^{88} Thr^{90}; y
(c) la secuencia en (a) modificado por Asn^{30}
Thr^{32} Val^{87} Asn^{88} Thr^{90}.
26. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en donde la glucoproteína tiene la
secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante una nueva
disposición de al menos un sitio de glucosilación.
27. El conjugado de acuerdo con la reivindicación
25, en donde la nueva disposición comprende la deleción de
cualquiera de los sitios de unión N a carbohidrato en la
eritropoyetina humana y la adición de un sitio de unión N a
carbohidrato en la posición 88 de la secuencia de la eritropoyetina
humana.
28. El conjugado de la reivindicación 14, en
donde la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina
humana modificada por una modificación seleccionada del grupo que
consiste en:
EPO Gln^{24} Ser^{87} Asn^{88}
Thr^{90};
EPO Gln^{38} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90};
y
EPO Gln^{83} Ser^{87} Asn^{88}
Thr^{90}.
29. Una composición que comprende un conjugado de
acuerdo como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 28.
30. La composición que comprende conjugados tal
como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 27,
en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del
noventa por ciento.
31. La composición de acuerdo con las
reivindicaciones 28 ó 30, en donde el porcentaje de conjugados donde
n es 1 es al menos del noventa y dos por ciento.
32. La composición de la reivindicación 30 en
donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del
noventa y seis por ciento.
33. La composición de la reivindicación 29 ó 32,
en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 está comprendido
entre el noventa por ciento y el noventa y seis por ciento.
34. Una composición farmacéutica que comprende un
conjugado o una composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 33 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
35. El uso de un conjugado o una composición de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 para la
preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de
enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal
crónico (CRF), SIDA y para el tratamiento de pacientes de cáncer que
han sido tratados con quimioterapia.
36. Un proceso para la preparación de un
conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33,
dicho proceso comprende la unión covalente de grupos tiol a una
glucoproteína eritropoyetina y el acoplamiento de la glucoproteína
eritropoyetina activada resultante con un derivado de
poli(etilen glicol) (PEG).
37. Los conjugados y las composiciones de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, siempre que se
preparen mediante el proceso de la reivindicación 36.
38. Los conjugados y las composiciones de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, para el tratamiento
de enfermedades que están asociadas con la anemia en pacientes con
fallo renal crónico (CRF), y pacientes con SIDA y cáncer que han
sido sometidos a quimioterapia.
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