CZ302558B6 - Zpusob produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v kvasinkových bunkách - Google Patents
Zpusob produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v kvasinkových bunkách Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302558B6 CZ302558B6 CZ20012639A CZ20012639A CZ302558B6 CZ 302558 B6 CZ302558 B6 CZ 302558B6 CZ 20012639 A CZ20012639 A CZ 20012639A CZ 20012639 A CZ20012639 A CZ 20012639A CZ 302558 B6 CZ302558 B6 CZ 302558B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- alkaline phosphatase
- vector
- expression
- selection marker
- Prior art date
Links
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 title claims abstract description 60
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 37
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 28
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 56
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 27
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 13
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 12
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 3
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000688206 Bos taurus Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N Leu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 2
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010056929 lyticase Proteins 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000003616 phosphatase activity assay Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 2-[[2-[[2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHOPXCAOTRUGLV-XAMCCFCMSA-N Ala-Ala-Asp-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YHOPXCAOTRUGLV-XAMCCFCMSA-N 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PXKLCFFSVLKOJM-ACZMJKKPSA-N Ala-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PXKLCFFSVLKOJM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UHMQKOBNPRAZGB-CIUDSAMLSA-N Ala-Glu-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N UHMQKOBNPRAZGB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N Ala-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JEPNLGMEZMCFEX-QSFUFRPTSA-N Ala-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C)N JEPNLGMEZMCFEX-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- KMGOBAQSCKTBGD-DLOVCJGASA-N Ala-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CN=CN1 KMGOBAQSCKTBGD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- NJWJSLCQEDMGNC-MBLNEYKQSA-N Ala-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C)N)O NJWJSLCQEDMGNC-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- XKXAZPSREVUCRT-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=C(O)C=C1 XKXAZPSREVUCRT-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 102100025677 Alkaline phosphatase, germ cell type Human genes 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- OCOZPTHLDVSFCZ-BPUTZDHNSA-N Arg-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N OCOZPTHLDVSFCZ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N Arg-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BWMMKQPATDUYKB-IHRRRGAJSA-N Arg-Tyr-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BWMMKQPATDUYKB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PLVAAIPKSGUXDV-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)N PLVAAIPKSGUXDV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QIRJQYQOIKBPBZ-IHRRRGAJSA-N Asn-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QIRJQYQOIKBPBZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RKNIUWSZIAUEPK-PBCZWWQYSA-N Asp-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O RKNIUWSZIAUEPK-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- BPTFNDRZKBFMTH-DCAQKATOSA-N Asp-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N BPTFNDRZKBFMTH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- UPJGYXRAPJWIHD-CIUDSAMLSA-N Cys-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UPJGYXRAPJWIHD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N Cys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N Glu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- QQLBPVKLJBAXBS-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QQLBPVKLJBAXBS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N Glu-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N Glu-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NZAFOTBEULLEQB-WDSKDSINSA-N Gly-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN NZAFOTBEULLEQB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N Gly-Cys Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C([O-])=O MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- HHRODZSXDXMUHS-LURJTMIESA-N Gly-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)NCC([O-])=O HHRODZSXDXMUHS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- UIQGJYUEQDOODF-KWQFWETISA-N Gly-Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 UIQGJYUEQDOODF-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DZMVESFTHXSSPZ-XVYDVKMFSA-N His-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DZMVESFTHXSSPZ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VTMLJMNQHKBPON-QWRGUYRKSA-N His-Gly-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 VTMLJMNQHKBPON-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- DGLAHESNTJWGDO-SRVKXCTJSA-N His-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N DGLAHESNTJWGDO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000574440 Homo sapiens Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 1
- 101001068480 Homo sapiens Guanylyl cyclase-activating protein 1 Proteins 0.000 description 1
- NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N Ile-Ala-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- RWIKBYVJQAJYDP-BJDJZHNGSA-N Ile-Ala-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RWIKBYVJQAJYDP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N Ile-Asn-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N Ile-Leu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- PWUMCBLVWPCKNO-MGHWNKPDSA-N Ile-Leu-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PWUMCBLVWPCKNO-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N Lys-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N Met-Asn Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MYAPQOBHGWJZOM-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C MYAPQOBHGWJZOM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IILAGWCGKJSBGB-IHRRRGAJSA-N Met-Phe-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N IILAGWCGKJSBGB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N Phe-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- NJONQBYLTANINY-IHPCNDPISA-N Phe-Trp-Asn Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJONQBYLTANINY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 101710114878 Phospholipase A-2-activating protein Proteins 0.000 description 1
- 108010003201 RGH 0205 Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241000203615 Streptoalloteichus Species 0.000 description 1
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- AYCQVUUPIJHJTA-IXOXFDKPSA-N Thr-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AYCQVUUPIJHJTA-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- BVWADTBVGZHSLW-IHRRRGAJSA-N Tyr-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N BVWADTBVGZHSLW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FWOVTJKVUCGVND-UFYCRDLUSA-N Tyr-Met-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N FWOVTJKVUCGVND-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N Tyr-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- CCEVJBJLPRNAFH-BVSLBCMMSA-N Tyr-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N CCEVJBJLPRNAFH-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 108010006664 gamma-glutamyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010048994 glycyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010073093 leucyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v kvasinkových bunkách zahrnující kroky: a) klonování genové sekvence eukaryotické alkalické fosfatázy do ruzných vektoru, b) transformace kvasinek vektory, c) exprese a d) purifikace alkalické fosfatázy. Pri tomto zpusobu i) první vektor má gen rezistence pro první selekcní marker, ii) transformanty, které integrovaly gen rezistence a genovou sekvenci do genomu se vybírají rustem na živném médiu obsahujícím nízkou koncentraci prvního selekcního markeru, iii) pocet kopií genu v bunkách se zvýší nekolikanásobnou transformací prvním vektorem, pricemž nekolikanásobné transformanty se vybírají rustem na živném médiu pri zvýšeném selekcním tlaku, iv) pridá se druhý vektor, který má gen rezistence pro druhý selekcní marker, v) pocet kopií genu v bunkách se zvýší nekolikanásobnou transformací, druhým vektorem, pricemž nekolikanásobné transformanty se vybírají rustem na živném médiu pri zvýšeném selekcním tlaku a vi) vyberou se pouze ty klony, které do genomu stabilne integrovaly nekolik kopií genové sekvence a geny rezistence pro selekcní markery.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v kvasinkových buňkách. Tento způsob zahrnuje kroky: a) klonování genové sekvence do různých vektorů, b) transformace kvasinek, c) exprese a d) purifikace alkalické fosfatázy. Získaná fosfatáza má specifickou aktivitu větší než 3000 U/mg.
Dosavadní stav techniky
Alkalické fosfatázy (AP) jsou dimemí, zinek obsahující nespecifické fosfomonoesterázy, které se vyskytují v prokaryotických, a také v eukaryotických organismech, např. v E. coli a savcích (McComb et al., Alkaline Phosphatases, Plenům Press, New York, 1979). Srovnání primárních struktur různých alkalických fosfatáz ukázalo vysoký stupeň homologie (25 až 30 % homologie AP mezi E. coli a savci, Millán, Anticancer Res. 8, 995 až 1004, 1988, Harrís, Clin. Chim, Acta, 186, 133 až 150, 1989).
U lidí a vyšších živočichů obsahuje rodina AP čtyři členy, které jsou lokalizovány v různých genových lokusech (Millán, Anticancer Res., 8, 995 až 1004, 1988, Harrís, Clin. Chim. Acta, 186, 133 až 150, 1989). Rodina alkalické fosfatázy zahrnuje tkáňově specifická AP (placentární AP (PLAP), AP zárodečné linie (GCAP) a intestinální AP (IAP)) a tkáňově nespecifické AP (TnAP), které jsou primárně lokalizovány v játrech, ledvinách a kostech.
Rozhodující vlastnosti doposud známých AP je velká variabilita katalytické aktivity savčí AP, která má 10 až 100 krát vyšší hodnotu Kcats, než AP E. coli. Ze savčích AP projevuje nejvyšší specifickou aktivitu bovinní intestinální AP (blAP), Tato vlastnost činí blAP atraktivní pro biochemické aplikace, jako je například použití odpovídajících enzymových konjugátů jako diagnostické reagencie nebo pro defosforylaci DNA. Je popsán výskyt různých bovinních intestinálních alkalických fosfatáz, které mají různě velikou specifickou aktivitu v EP 0 955 369 a v práci Mánes et al. (J. Biol. Chem., 273, č. 36, 23353 až 23360, 1998). Doposud byla popsána rekombinantní exprese eukaryotických alkalických fosfatáz s nízkou aktivitou (do 3000 U/mg) v různých eukaryotických buněčných liniích, jako jsou například buňky CHO (blAP Í/WO 93/18139, Weissig et al, Biochem. J., 260, 503 až 508, 1993), buňky COS (lidská placentární AP/Berger et al., Biochemistry, 84, 4885 až 4889, 1987) nebo bakulovirové expresní systémy (lidská placentární ΑΡ/Davis et al., Biotechnology, 10, 1149 až 1150, 1992). Byla také popsána exprese aktivnějších bovinních intestinálních AP (specifická aktivita > 3000 U/mg) v buňkách CHO (blAP, II, III a lV/Manes et al., J. Biol, Chem., 273, č. 36, 23353 až 23360, 1998). Ale nevýhodou exprese alkalické fosfatázy v těchto expresních systémech je nízký výtěžek exprese, který činí rekombinantní produkci obzvláště vysoce aktivní AP neekonomickou.
Ačkoliv je v principu možné exprimovat eukaryotické alkalické fosfatázy v prokaryotických expresních hostitelích, jako je například E. coli (lidská placentární AP/Beck a Burtscher, Protein Expression a Purifícation, 5, 192 až 197, 1994), alkalické fosfatázy exprimované v prokaryotech nejsou gly kosy lov ány, což je esenciální zejména pro přípravu enzymových konjugátů.
Podstata vynálezu
V důsledku toho je cílem předkládaného vynálezu vyvinout robustní a stabilní expresní systém pro produkci gly kosy 1 ováných eukaryotických alkalických fosfatáz, které mají vysokou specifickou aktivitu, což díky vysokému výtěžku exprese umožňuje ekonomickou produkci takové alkalické fosfatázy a navíc poskytuje enzym, jehož vlastnosti jsou srovnatelné s nativní alkalickou
- 1 CZ 302558 B6 fosfatázou s vysokou nebo nízkou aktivitou (komerčně dostupná například od firmy Roche Diagnostics GmbH, Biozyme, Oriental Yeast), co se týče například specifické aktivity a tepelné stability.
Předmětem vynálezu je způsob produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v kvasinkových buňkách, jehož podstata spočívá v tom, že se
I) aj genová sekvence eukaryotické alkalické fosfatázy klonuje do prvního vektoru majícího gen rezistence pro první selekční markér;
a3) genová sekvence eukaryotické alkalické fosfatázy se klonuje do druhého vektoru majícího gen rezistence pro druhý selekční markér;
přičemž první selekční markér se liší od druhého selekčního markéru;
b) kvasinkové buňky se transformují prvním vektorem z kroku aj a transformanty, které integrovaly gen rezistence pro první selekční markér a genovou sekvenci eukaryotické alkalické fosfatázy do genomu se vybírají růstem na živném médiu obsahujícím nízkou koncentraci prvního selekčního markéru,
c) počet kopií genu v buňkách získaných v kroku b) se zvýší několikanásobnou transformací prvním vektorem, přičemž několikanásobné transformanty se vybírají růstem na živném médiu při zvýšeném selekčním tlaku,
d) několikanásobné transformanty z kroku c) se transformují druhým vektorem z kroku a3) a transformanty, které integrovaly gen rezistence pro druhý selekční markér a genovou sekvenci eukaryotické alkalické fosfatázy do genomu se vybírají růstem na živném médiu obsahujícím nízkou koncentraci druhého selekčního markéru,
e) počet kopií genu v buňkách získaných v kroku d) se zvýší několikanásobnou transformací druhým vektorem, přičemž několikanásobné transformanty se vybírají růstem na živném médiu při zvýšeném selekčním tlaku,
f) vyberou se ty klony, které do genomu stabilně integrovaly několik kopií genové sekvence eukaryotické alkalické fosfatázy a geny rezistence pro selekční markéry;
II) v klonech z kroku I)f) se exprimuje genová sekvence eukaryotické alkalické fosfatázy; a
III) alkalická fosfatáza získaná z kroku II) se purifikuje.
Ve výhodných provedeních tohoto způsobu
- použitá genová sekvence odpovídá sekv. id. č. 1 nebo sekv. id. č. 5; a
- používá se methy lotrofních kvasinek, zejména kvasinkového kmene Pichia pastořis nebo Hansenula poiymorpha.
Výhodná genová sekvence je DNA sekvence, která kóduje eukaryotickou alkalickou fosfatázu, která má specifickou aktivitu větší než 3000 U/mg a ve speciálních případech větší než 7000 U/mg až přibližně 10 000 U/mg. Například bylo prokázáno, že podle vynálezu je vyhovující DNA sekvence podle sekv.id.č.l. Obzvláště je výhodná DNA sekvence s optimalizovanými kodony, která odpovídá genové sekvenci sekv. id. č. 1 na úrovni aminokyselin. Optimalizace kodonů znamená, že každý kodon například ze sekv. id. č. 1 byl optimalizován umlčenými mutacemi, tj. změnami na úrovni DNA, které ale nemají žádný účinek na aminokyselinové úrovni, aby se zvýšila translace podle požadavků vybraného expresního hostitele, což má za následek například vznik genové sekvence podle sekv. id. č. 5. Ale do vektoru je také možné zavést jiné sek vence než sekv. id. č. 1, které kódují alkalické fosfatázy a jsou volitelně s optimalizovanými kodony, jako je například blAPI, III, IV (DE 198 19 962 a EP 0 955 369). Pro způsob podle vynálezu je obzvláště výhodné použít genovou sekvenci s optimalizovanými kodony podle sekv. id. č. 5. Odpovídající genová sekvence je pak klonována do jednoho vektoru nebo několika vektorů, které pak jsou vybírány v závislosti na transformovaném hostiteli.
Methylotrofické kvasinky, např. Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, a také další kvasinky, jako je například Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica nebo Schizosaccharomyces pombe,\sQ\x obzvláště vhodné jako kvasinkový hostitel. Odborníkovi jsou známy vhodné vektory, jako jsou například pPICTaA, pIIC9K, vektory Yes, pTEFl/Zeo, pYDI (např. Invitrogen). Expresní vektor, který je takto vytvořen, je výhodně transformován do různých kmenů Pichia pastoris a stabilně integrován do genomu. Stabilní integrace do kvasinkového genomu má výhodu, že během následné produkce například eukaryotické vysoce aktivní alkalické fosfatázy ve velkoobjemových fermentech není vyžadován selekční tlak. Stabilní integrace do genomu znamená, že expresní vektor je zaveden do genomu například Pichia pastoris prostřednictvím homologní rekombinace a je tedy dědičně přenášen jako permanentní složka z generace na generaci (Cregg, J. M. et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 až 3385, 1985).
V methylotrofických kvasinkách byl počet kopií genu zvýšen mnohonásobnou transformací za současného zvyšování selekčního tlaku vhodným selekčním markérem, např. antibiotikem, jako je například Zeocin® nebo Genticin (G418) nebo auxotrofním markérem, ve kterém mohou přežít pouze ty klony, které integrovaly stabilně několik kopií expresního vektoru do genomu. Aby byly rezistentní na vyšší koncentrace antibiotika použitého jako selekční markér, je nutné, aby klony produkovaly stoupající množství proteinu. To může být dosaženo například mnohonásobnou integrací expresního vektoru, kteiý obsahuje gen rezistence na antibiotikum použité jako selekční markér navíc k expresní kazetě pro vysoce aktivní alkalickou fosfatázu.
Cíle ekonomické produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v robustním a stabilním expresním systému s vysokým výtěžkem exprese nemůže být dosaženo, dokud nebudou kombinována opatření (a) až (f). Tudíž například transformace kmenu X-33 Pichia pastoris expresním vektorem, který obsahuje gen blAPII podle sekv. id. č. 1, nevede bez těchto opatření k žádoucímu výsledku (viz příklady 1 a 2). Ačkoliv tento proces umožnil významné zvýšení výtěžku exprese ve srovnání s expresí blAPII v buňkách CHO (Mánes et al., J. Biol. Chem., 273, č. 36, 23353 až 23360, 1998), neposkytl ekonomickou produkci rekombinantní alkalické fosfatázy.
Jedno z nezbytných opatření způsobu podle vynálezu je syntéza genové sekvence s optimalizovanými kodony. Kompletní syntéza de novo genu dlouhého přibližně 1,5 kb, který kóduje eukaryotickou vysoce aktivní alkalickou fosfatázu, byla nezbytná, aby se optimalizoval každý kodon pro expresi v kvasinkách. Bylo možné optimalizovat každý kodon, jak bylo vyžadováno, retranslací aminokyselinové sekvence eukaryotické vysoce aktivní alkalické fosfatázy podle sekv. id. č. 4 (blAPII) a s použitím degenerovaného kódu. Za tímto účelem byl gen rozdělen na 28 olígonukleotidů, které byly dlouhé 54 až 82 nukleotidů. Oligonukleotidy byly navrženy jako střídavé sekvence fragmentů 5' a 3' konců sense vlákna a antisense vlákna, které se komplementárně překrývaly se sousedními oligonukleotidy. Překrývající se úsek byl pokaždé vybrán tak, aby bylo velkou měrou zabráněno nespecifické vazbě v průběhu nasedání primérů v následné reakci PCR. Oligonukleotidy na 5' a 3' koncích genu byly opatřeny místy rozpoznávání pro restrikční endonukleázy v protisměru a po směru od kódující oblasti, které mohly být použity pro pozdější inzercí syntetického genu podle sekv. id. Č. 5 do expresních vektorů. Tedy v protisměru bylo zavedeno místo rozpoznávání pro restrikční endonukleázou EcoRI a po směru bylo zavedeno místo rozpoznávání pro restrikční endonukleázu Asp718. Sekvence oligonukleotidů jsou ukázány v sekv. id. č. 6 až 33.
Syntéza genu byla prováděna prostřednictvím reakce PCR. Za tímto účelem byla kódující oblast nejdříve rozdělena na tři segmenty (oligonukleotidy 6 až 15, 16 až 23, 24 až 33) a tyto segmenty byly vytvářeny v oddělených reakcích PCR. Během syntézy genu pomocí reakce PCR s použitím
-3CZ 302558 B6 překrývajících se komplementárních oligonukleotidu je genový fragment po krocích prodlužován za vzniku kompletního produktu, kterýje pak amplifikován v dalších cyklech. Teplota pro nasedání primerů v tomto procesu závisí na překrývajícím se úseku s nejnižší teplotou tání.
Tři segmenty pak byly analyzovány elektroforézou na agarózovém gelu, produkty, které měly očekávanou délku, byly izolovány z gelu pomocí soupravy pro extrakci z gelu QIAquick gel extraction kit (Qiagen) a syntetizovány v další reakci PCR, aby vznikl kompletní genový produkt. V tomto procesu byla reakce PCR prováděna v prvních 5 cyklech bez přidání primerů na 5' konci a na 3' konci celého genu, takže zpočátku bylo z těchto tří segmentů vytvořeno pouze několik fragmentů genového produktu, který měl očekávanou délku. Teplota pro nasedání primerů závisela na překrývajícím se úseku s nejnižší teplotou tání. Pak byly přidány koncové priméry a teplota pro nasedání primerů byla zvýšena tak, aby odpovídala teplotě pro nasedání primerů toho primerů, který měl nejnižší teplotou tání. Genový fragment, který měl očekávanou délku, byl silně amplifikován v dalších 25 cyklech.
PCR směs byla analyzována elektroforézou na agarózovém gelu a byl izolován genový fragment mající očekávanou délku (QIAquick gel extraction kit/Qiagen).
Klonování tohoto PCR fragmentu, transformace do Pichia pastoris a exprese je popsána v příkladu 3.
Gen vysoce aktivní alkalické fosfatázy s optimalizovanými kodony umožnil, že výtěžek exprese byl zvýšen třikrát ve srovnání s prvními experimenty s genem divokého typu.
Avšak tyto klony neposkytly ekonomický způsob produkce vysoce aktivní alkalické fosfatázy.
Jedno opatření, které může zvýšit výtěžek exprese heterologních a homolognich proteinů v Pichia pastoris, je zvýšení počtu kopií genu v buňce mnohonásobnou transformací. Toto opatření může zmnožit transkripění produkt, tj. mRNA cílového genu. Počet kopií genu je zvýšen mnohonásobnou transformací klonu obsahujícího expresní vektor při současně stoupajícím selekčním tlaku během následujícího růstu transformantů na živných miskách obsahujících zvýšené koncentrace antibiotika použitého jako selekční markér. Při tomto postupuje expresní klon, který již přijal alespoň jednu kopii expresního vektoru z prvního transformačního cyklu, opět učiněn kompetentním (viz příklad 1) a je znovu transformován expresním vektorem. Jsou vybírány transformanty, které integrovaly několik kopií expresního vektoru do genomu, nanesením na živné misky s vyšším selekčním tlakem, tj. misky obsahují vyšší koncentraci antibiotika (např. Zeocii/j použitého jako selekční markér během prvního transformačního cyklu. Pro tento účel je zjištěna nejvyšší koncentrace antibiotika použitého jako selekční markér, ve které klon z prvního transformačního cyklu ještě roste, a koncentrace antibiotika použitého jako selekční markér je zvýšena podle výše určené prahové hodnoty pro misky s YPDS agarem pro další transformaci. Zvýšení počtu kopií expresního vektoru také zvyšuje počet kopií genu rezistence, kterýje složkou expresního vektoru, a tedy také zvyšuje rezistenci na vyšší koncentraci antibiotika použitého jako selekční markér. Je také možné vybírat klony obsahující různý počet kopií expresního vektoru v genomu změnami koncentrace antibiotika použitého jako selekční markér na živných miskách (přibližně 100 až 2000 pg/ml/ viz příklad 4).
Další opatření, které může být použito pro zvýšení výtěžku exprese heterologních a homo logn ich proteinů v kvasinkách, jako je například Pichia pas toris, je zvýšení počtu kopií genu mnohonásobnou selekcí. Aby se toho dosáhlo, je expresní klon, který již byl optimalizován mnohonásobnou transformací expresním vektorem obsahujícím expresní kazetu s cílovým genem (např. gen, který kóduje vysoce aktivní alkalickou fosfatázu podle sekv. id. č. 5) a gen rezistence pro první antibiotikum použité jako selekční markér (např. Zeociné®), transformován druhým expresním vektorem, který obsahuje cílový gen (např. gen, který kóduje vysoce aktivní alkalickou fosfatázu podle sekv. id. ě. 5) a gen rezistence pro druhé antibiotikum (např. Genticin (G418) použité jako selekční markér. Když jsou pak transformanty naneseny na živné misky, které obsa-4CZ 302558 B6 hují druhé antibiotikum jako selekční markér, jsou vybrány pouze ty klony, které přijaly také alespoň jednu kopii expresního vektoru obsahujícího gen rezistence pro druhé antibiotikum použitéjako selekční markér navíc ke kopii expresního vektoru obsahujícího gen rezistence pro první antibiotikum použitéjako selekční markér. Tyto expresní klony mohou být nyní dále podrobeny další mnohonásobné transformaci expresním vektorem obsahujícím gen rezistence pro druhé antibiotikum použitéjako selekční markér (viz příklad 5).
Kombinací mnohonásobné transformace a dvojité selekce bylo možné zvýšit výtěžek exprese čtyřikrát ve srovnání s výtěžkem exprese klonů obsahujících gen s optimalizovanými kodony io z prvního transformačního cyklu.
Rekombinantní alkalická fosfatáza může být extrahována z biomasy metodami extrakce, které jsou v principu odborníkovi známy (např. Protein Purification, Springer Verlag, editor Robert Scopes, 1982). Pás s čistým produktem, který má specifickou aktivitu větší než 7000 U/mg je získán metodami chromatografieké separace a zejména metodami používajícími v koloně hydrofobní materiál a výměník kationtů.
Purifikovaný produkt byl podroben N-koncovému sekvencování, aby se charakterizovala rekombinantní vysoce aktivní alkalická fosfatáza.
Byla vymezena dominantní sekvence EAEAEFLIPA (sekv. id. č. 36). Sekvence nepochybně koreluje s N-koncovou sekvencí AP“LIPA“ (sekv. id. Č. 37) a se spojovacím peptidovým konstruktem EAEAEF (sekv. id. ě. 38), který je vytvořen strategií klonování genové sekvence do vektoru a štěpením signálního peptidu α-faktoru signální peptidázou Kex2 (např. Invitrogen).
Byla zkoumána stabilita rekombinantního produktu alkalické fosfatázy ve srovnání s přirozeně se vyskytující alkalickou fosfatázou. Když byly roztoky podrobeny tepelnému stresu (55 °C), poskytly vzorky srovnatelné výsledky.
so Proto předkládaný vynález popisuje poprvé způsob, který umožňuje ekonomickou produkci rekombinantní alkalické fosfatázy ze savčích buněk, jako jsou například bovinní intestinální buňky, která má vlastnosti srovnatelné s nativní vysoce aktivní bovinní intestinální alkalickou fosfatázou a je gly kosy lovaná.
Předkládaný vynález se také týká DNA sekvence podle sekv. id. č. 5 jako genové sekvence s optimalizovanými kodony pro expresi genu pro vysoce aktivní alkalickou fosfatázu v Pichia pastoris.
Dalším předmětem vynálezu je vektor obsahující sekv. id. č. 5 a obzvláště výhodně vektor pHAP10-3 podle obr. 2. pHAP10-3 je vektor pPICZaA, který je komerčně dostupný (Invitrogen), a obsahuje gen podle vynálezu podle sekv. id. ě. 5, který je pod kontrolou promotoru AOX 1.
Dalším předmětem vynálezu je hostitelský kmen, který byl transformován vektory podle vynále45 zu. Obzvláště výhodný je kmen X-33 Pichia pastoris transformovaný vektorem pHAP10-3.
Dalším výhodným vektorem je vektor, který obsahuje celou expresní kazetu z pHAP10-3, která v podstatě obsahuje promotor AOX 1, signální peptid α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae, který je klonován do správného čtecího rámce za signální peptid, cílový gen s optimalizovanými kodony podle sekv. id. ě. 5, který kóduje vysoce aktivní alkalickou fosfatázu, a úsek term i nace transkripce AOX 1 (viz obr. 3). Obzvláště výhodný je vektor pHAP 10-3/9K, který obsahuje komerčně dostupný vektor pPIC9K (Invitrogen) a expresní kazetu z pHAP 10-3 včetně syntetického genu podle sekv. id. č, 5.
- 5 CZ 302558 B6
Vektory pHAP 10-3 a pHAP 1O-3/9K jsou stejně významné, protože výsledný produkční klon obsahuje kopie obou vektorů.
Dalším předmětem vynálezu je hostitelský kmen, který byl transformován vektorem pHAPlO3/9K. Ale v kontextu předkládaného vynálezu jsou také vhodné další vektory a kmeny odborníkovi známé, jako jsou například vektory YES, pYDl, pTEF 1/ZEO (Invitrogen) a Saccharomyces cerevisiae. Schizosaccharomyces pombe. Hansenula polymorfa, Yarrowia lipolytica a obzvláště Pichia pastoris X-33. Kmen X-33 Pichia pastoris transformovaný vektorem pHAP10-3/9K je pro vynález obzvláště výhodný.
Proto dalším předmětem vynálezu je způsob produkce eukaryotické vysoce aktivní alkalické fosfatázy expresí proteinu v hostitelském kmeni, který byl transformován jedním nebo několika vektory podle vynálezu a obzvláště vektorem pHAP 10-3 nebo vektorem pHAP 10/3/9K. Kmeny Pichiapastoris, které byly transformovány vynálezeckými vektory, jsou pro vynálezecký způsob obzvláště výhodné. V této souvislosti je zejména výhodný kmen X-33 Pichia pastoris, který byl transformován vektorem pHAP 10-3 a pHAP 10-3/9K.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1
Plazmidová mapa expresního vektoru pHAP-Ι obsahujícího gen blAPII v pIICZaA (Invitrogen).
Obrázek 2
Plazmidová mapa expresního vektoru pHAP 10-3 obsahujícího syntetický gen v pP!C9K (Invitrogen).
Obrázek 3
Plazmidová mapa expresního vektoru pHAP 10-3/9K obsahující syntetický gen v pPIC9K (Invitrogen).
Zkratky
YPD: médium s dextrózou a s kvasinkovým peptonem
YPDS: médium s dextrózou, sorbitolem a s kvasinkovým peptonem
BMGY: pufrované komplexní médium s glycerolem
BMMY: pufrované komplexní médium s methanolem
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování genu blAPII
Gen blAPII podle sekv. id. č. 1 (EP 0 955 369, Mánes et al., J. Biol. Chem., 273, č. 36, 23353 až 23360, 1998) byl nejdříve v protisměru a po směru opatřen místy pro štěpení restrikční endonukleázou vhodnými pro klonování do expresních vektorů pro Pichia pastoris pomocí PCR a selekcí vhodných příměrů podle sekv. id. č. 2 a 3. Z tohoto důvodu bylo místo pro štěpení restrikční endonukleázou EcoRI připojeno v protisměru a místo pro štěpení restrikční endonukleázou Aspl78 I bylo připojeno po směru.
-6CZ 302558 B6
PCR fragment byl znovu štěpen EcoRI a Asp718 Ϊ (Roche Diagnostics GmbH), znovu izolován (QIAquick gel extraction kit/Qiagen), a pak ligován do vektorového fragmentu expresního vektoru pPICZotA (Invitrogen), který byl linearizován EcoRI a Asp7I8 I (Roche Diagnostics GmbH) a izolován (QIAquick gel extraction kit/Qiagen). V tomto vektoru je gen blAPII pod kontrolou promotoru AOX 1 (promotor pro alkoholoxidázu 1 z Pichia pastoris a indukovatelný methanolem) a je klonován do správného čtecího rámce za signální peptid α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. Pomocí restrikční analýzy a sekvencováním pak bylo vyšetřováno, zda takto vložený genový fragment byl bez chyb. Expresní vektor takto vytvořený, který obsahuje gen blAPII, který kóduje eukaryotickou vysoce aktivní alkalickou fosfatázu, byl nazván pHAP-1 (viz obr. 1). Transformace pHAP-1 v Pichia pastoris
Pro transformaci pHAP-1 v Pichia pastoris X-33 a následnou integraci do genomu byl vektor nejdříve linearizován Sací (Roche Diagnostics GmbH). Transformace byla prováděna prostřednictvím elektroporace s použitím přístroje Gene Pulser II (Biorad).
Pro tento účel bylo 5 ml média YPD (Invitrogen) inokulováno kolonií kmene divokého typu Pichia pastoris a inkubováno přes noc za třepání ve 30 °C. 20Q ml čerstvého média YPD (Invitrogen) pak bylo inokulováno přenosem v poměru 1:2000 kulturou pěstovanou přes noc a inkubováno přes noc za třepání ve 30 °C, dokud OD60o nedosáhla hodnoty 1,3 až 1,5. Buňky byly stočeny (1500 x g/5 minut) a pelet byl resuspendován ve 200 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C). Buňky byly opět stočeny (1500 x g/5 minut) a resuspendovány ve 100 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C). Buňky byly opět stočeny a resuspendovány v 10 ml ledově chladného (0 °C) 1M sorbitolu (ICN). Buňky byly opět stočeny a resuspendovány v 0,5 ml ledově chladného (0 °C) IM sorbitolu (ICN). Buňky takto získané byly drženy na ledu a okamžitě použity pro transformaci.
Přibližně 1 pg DNA linearízovaného vektoru pHAP-1 bylo přidáno k 80 μΙ buněk a celá směs byla přenesena do ledově chladné (0 °C) elektroporační kyvety a inkubována dalších 5 minut na ledu. Pak byla kyveta přenesena do přístroje Gene Pulser U (Biorad) a byla prováděna transformace při nastavení parametrů 1 kV, 1 kO a 25 pF. Po elektroporaci byl ke směsi přidán 1 ml IM sorbitolu (ICN) a následně bylo naneseno 100 až 150 pl na YPDS misku s agarem (Invitrogen) obsahujícím 100 pg/ml Zeocinu(R) (Invitrogen). Misky pak byly inkubovány při 30 °C po dobu až 4 dnů.
Misky s médiem Raster MD (= minimální dextróza) byly naočkovány klony a byly dále analyzovány. Rostoucí klony byly vybrány, resuspendovány ve 20 pl sterilní vody, lyžovány 17,5 U lytikázy (Roce Diagnostics GmbH) (1 hodina, 37 °C) a přímo vyšetřeny na správnou integraci blAPII expresní kazety pomocí PCR.
Klony, které integrovaly kompletní expresní kazetu během transformace do genomu, pak byly použity v expresních experimentech.
Exprese vysoce aktivní alkalické fosfatázy ml média BMGY (Invitrogen) bylo inokulováno pozitivními klony a inkubováno pres noc za třepání ve 30 °C. Pak byla určována OD v 600 nm a 10 ml média GMMY (Invitrogen) bylo inokulováno přenosem tak, aby byla získána OD60o rovna 1. Médium BMMY (Invitrogen) obsahuje methanol (Mallinckrodt Baker B.V.), který indukuje expresi vysoce aktivní alkalické fosfatázy přes promotor AOX 1.
Třepací láhve byly inkubovány za třepání pře 30 °C, vzorky byly odebírány každých 24 hodin, byla zjišťována OD6oo, byl prováděn test aktivity exprese vysoce aktivní alkalické fosfatázy a byl
-7CZ 302558 B6 přidán 0,5% methanol (Mallinckrodit Baker B.V.) pro další indukci. Expresní experimenty byly prováděny po dobu 96 hodin.
Příklad 2
Test aktivity vysoce aktivní alkalické fosfatázy
Bylo odebráno 500 μΙ expresní kultury z příkladu 1, byla zjištěna 00«» a buňky byly stočeny. Supernatant byl uskladněn a buněčný pelet byl resuspendován pro lýzi v množství Y-PER.TM (50 až 300 μΙ/Pierce) na odpovídající OD600 a třepán po dobu I hodiny při teplotě místnosti. Lyzát pak byl stočen, aby se odstranila buněčná debris (15 000 x g/5 minut) a supernatant byl přenesen do čerstvých reakčních zkumavek. V testu aktivity pak bylo použito 5 μΙ lyzátu.
Princip testu aktivity je tentO.
AP
4-nitrofeny[fosfát + H2O —> 4-nitrofenol + PÍ
Měří se zvýšení absorbance ve 405 nm.
μΙ roztoku 4-n i trofenyl fosfátu (0,67 mol/1 4-nítrofeny (fosfátu. Na sůl (Roche Diagnostics GmbH)), bylo přidáno ke 3 ml diethanolaminového pufru (1 mol/1 diethanolamin (Merck), pH 9,8, 0,5 mmol/1 MgCl· (Riedel de Haenn)) a směs byla inkubována ve 37 °C. Pak byla započata reakce přidáním 5 μΙ lyzátu a byla zjišťována změna absorbance ve 37 °C po dobu 3 minut a byla vypočtena AA/min.
Aktivita pak byla vypočtena podle následujícího vzorce:
3,10 1 aktivita =-x AA/min x-(U/ml roztok vzorku) ε x 0,005 χ 1 faktor x ε - 18,2 [1 x mmol’1 x cm'1] faktor x = faktor koncentrace po buněčné lýzi
Aktivita média supematantu expresních kultur byla určována podobně. Reakce v tomto případě také začínala s 5 μΙ supematantu, ale navíc byl přidán 0,5mM ZnCL. V tomto případě byl výpočet prováděn bez faktoru x.
Příklad 3
Klonování PCR fragmentu ze syntetického genu
PCR fragment byl znovu štěpen EcoRI a Asp718 (Roche Diagnostics GmbH), znovu izolován (QIAquick gel extraction kit/Qiagen), a pak ligován do vektorového fragmentu expresního vektoru pPICZaA (Invitrogen), který byl línearizován s EcoRI a Asp718 (Roche Diagnostics GmbH) a izolován (QIAquick gel extraction kit/Qiagen). V tomto vektoru je syntetický gen pod kontrolou promotoru AOX 1 (promotor pro alkoholoxidázu 1 z Picchia pastoris a indukovatelný methanolem (Mallinckrodt Baker B.V.)) a je klonován do správného čtecího rámce za signální peptid afaktoru z Saccharomyces cerevisiae. Pomocí restrikční analýzy a sekvencováním pak bylo vyšetřováno, zda takto vložený genový fragment byl bez chyb. Expresní vektor takto vytvořený, který
-8CZ 302558 B6 obsahuje syntetický gen, který kóduje eukaryotickou vysoce aktivní alkalickou fosfatázu, byl nazván pHAP10-3 (viz obr. 2).
Transformace pHAP10-3 v Pichia pastoris
Pro transformaci pHAP10-3 a Pichhia pastoris X-33 a následnou integraci do genomu byl vektor nejdříve linearizován Sací (Roche Diagnostics GmbH). Transformace byla prováděna prostřednictvím elektroporace s použitím přístroje Gene Pulser II (Biorad).
Pro tento účel bylo 5 ml média YDP (Invitrogen) inokulováno kolonii Pichia pastoris a inkubováno přes noc za třepání ve 30 °C. 200 ml čerstvého média YPD (Invitrogen) pak bylo přenosem inokulováno v poměru 1:2000 kulturou pěstovanou přes noc a inkubováno přes noc za třepání ve 30 °C, dokud ODňoo nedosáhla hodnoty 1,3 až 1,5. Buňky byly stočeny (1500x g/5 minut) a resuspendovány ve 100 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C). Buňky byly opět stočeny a resuspendovány v 10 ml ledově chladného (0 °C) ÍM sorbitolu (ICN). Buňky byly opět stočeny a resupsendovány v 0,5 ml ledově chladného (0 °C) ÍM sorbitolu (ICN). Buňky takto získané byly drženy na ledu a okamžitě použity pro transformaci.
Přibližně i pg DNA linearizovaného vektoru pHAP10-3 bylo přidáno k 80 μΐ buněk a celá směs byla přenesena do ledově chladné (0 °C) elektroporační kyvety a inkubována dalších 5 minut na ledu. Pak byla kyveta přenesena do přístroje Gene Pulser II (Biorad) a byla prováděna transformace při 1 kV, I kQ a 25 pF. Po elektroporací byl ke směsi přidán 1 ml ÍM sorbitolu (ICN) a následně bylo naneseno 100 až 150 μΙ na YPDS misku s agarem (Invitrogen) obsahujícím 100 pg/ml ZeocinutR) (Invitrogen). Misky pak byly inkubovány při 30 °C po dobu 2 až 4 dnů.
Misky s médiem Raste MD (= minimální dextróza) byly naočkovány klony a byly dále analyzovány. Rostoucí klony byly vybrány, resuspendovány ve 20 pl sterilní vody, lyžovány 17,5 U lytikázy (Roche Diagnostics GmbH) (1 hodina, 37 °C) a přímo vyšetřeny na správnou integraci syntetické AP expresní kazety pomocí PCR.
Klony, které integrovaly kompletní expresní kazetu během transformace do genomu, pak byly použity v expresních experimentech.
Exprese vysoce aktivní alkalické fosfatázy ml média BMGY (Invitrogen) bylo inokulováno pozitivními klony a inkubováno přes noc za třepání ve 30 °C. Pak byla určována OD v 600 nm a 10 ml média BMMY (Invitrogen) bylo inokulováno přenosem tak, aby byla získána ODůoo rovna 1. Médium BMMY (Invitrogen) obsahuje methanoí (Mallinckrodt Baker B.V.), který indukuje expresi vysoce aktivní alkalické fosfatázy přes promotor AOX1.
Třepací láhve byly inkubovány za třepání při 30 °C, vzorky byly odebírány každých 24 hodin, byla zjišťována OD6oo, byl prováděn test aktivity exprese vysoce aktivní alkalické fosfatázy a byl přidán 0,5% methanoí (Mallinckrodt Baker B.V.) pro další indukci. Expresní experimenty byly prováděny po dobu 96 hodin.
Test aktivity vysoce aktivní alkalické fosfatázy
Bylo odebráno 500 pl expresní kultury, byla zjišťována ODďqo a buňky byly stočeny. Supernatant byl uskladněn a buněčný pelet byl resuspendován pro lýzi v množství Y-PERTM (50 až 300 pl/Pierce) na odpovídající OD600 a třepán po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Lyzát byl pak stočen, aby se odstranila buněčná debris (15000 x g/5 minut) a supernatant byl přenesen do čerstvých reakčních zkumavek. V testu aktivity pak bylo použito 5 pl lyzátu.
Test aktivity byl prováděn tak, jak bylo popsáno výše.
-9 CZ 302558 B6
Příklad 4
Zvýšení výtěžku exprese mnohonásobnou transformací
Nejlepší klony z expresních experimentů byly po řadě připraveny pro exprrapolaci, jak bylo popsáno výše, a opět transformovány 1 gg DNA linearizovaného vektoru pl IAP10-3 a transformační směs byla nanesena na misky s agarem YPDS (Invitrogen) obsahujícím 1000 až 2000 gg/ml Zeocínu(K) (Invitrogen). V důsledku toho byl selekční tlak zvýšen do lakově míry, že mohly růst io pouze klony, které integrovaly několik kopií expresního vektoru pHAPlO—3, a tedy také několik kopií příslušného genu rezistence (v tomto případě na ZeocÍníR}) do genomu. Protein rezistence na Zeocin(R) je produkt bleomycinového genu Streptoalloteichus hinduslamts (Chalmels T. et al.,
Curr. Genet., 20, 309 až 314, 1991, Drocourt, D., et al., Nucleic Acid Research, 18, 4009, 1990), který váže Zeocintk) ve stechiometriekém poměru koncentrací, a tudíž činí buňky rezistentní na
Zeocin(R). Čím vyšší je koncentrace ZeocÍnu(R) na miskách s agarem YPDS, tím více proteinu rezistence musí buňka vytvořit, aby kvantitativně vázala Zeocínllí), a tak mohla růst. Túje možné například tehdy, když byly do genomu integrovány mnohonásobné kopie genu rezistence. Jakje popsáno výše, klony byly transferem naočkovány na s misky médiem Raste MD a analýzou PCR v nich byla opět kontrolována správná integrace haAP expresní kazety, jak je popsáno výše. Pak
2o byly tyto klony po řadě testovány na aktivitu haAP, jak je popsáno výše.
Příklad 5
2? Zvýšení výtěžku exprese použitím druhého selekčního tlaku
Zvýšení koncentrace zeocinu(R) nad 2000 gg/ml nevedlo ke zlepšení výtěžku exprese vysoce aktivní alkalické fosfatázy. Aby se dále zvýšil počet kopií genu v expresních klonech genu podle sekv. id. č. 5, který kóduje vysoce aktivní alkalickou fosfatázu a který má kodony optimalizované pro expresi ve kvasinkách, byla vybírána integrace dalších expresních vektorů do genomu expresního klonu pocházejícího z příkladů 3 a 4, který měl nejvyšší výtěžek exprese, pomocí druhého selekčního tlaku, výhodně G418 (Roche Diagnostics GmbH). Za tímto účelem byla celá expresní kazeta z pHAP10-3 obsahující promotor AOXI, signální peptid cxíáktoru ze Saccharomyces cerevisiae, gen vysoce aktivní alkalické fosfatázy s optimalizovanými kodony podle sekv.
id. č. 5 a úsek terminace transkripce AOX 1, izolovaná pomocí PCR s použitím náležitě vybraných primerů, jak jsou popsány níže, klonována do vektoru plC9K, jehož integrace do genomu Pichia pastoris byla vybírána pomocí G418 (Roche Diagnostics GmbH). Primery jsou ukázány v sekv. id. Č. 34 a 35.
PCR směs byla analyzována elektroforézou na agarózovém gelu, genový fragment mající očekávanou délku byl izolován QIAquíck gel extraction kit/Qiagen), opět štěpen Sací a Notl (Roche Diagnostics GmbH), následně znovu izolován z agarózového gelu (QIAquíck gel extraction kit/Qiagen) a ligován do izolovaného vektorového fragmentu z pIC9K, který byl také 1 inearizován Sacl/Notl (Roche Diagnostics GmbH). To zajistilo, že celá expresní kazeta zpHAP10-3 se vyskytovala v identické formě v pPIC9K. Vložený fragment byl kontrolován pomocí restrikění analýzy sekvencováním s hraničními úseky. Expresní vektor takto vytvořený byl nazván pHAPI0-3/9K (viz obr.3).
Klony s nej vyšším výtěžkem exprese haAP z mnohonásobné transférmace s pHAP10-3 (rezistence na zeocin) byly připraveny pro elektroporaci, jak je popsáno výše, a transformovány, jakje popsáno výše, 1 gg vektorového fragmentu z pHAPI0-3/9K linearizovaného Sací (Roche Diagnostics GmbH). Transformační směs byla pak uskladněna po dobu 1 až 3 dnů ve 4 °C v 1M sorbitolu (ICN) (pro vytvoření rezistence na G418) a 100 až 200 μΙ bylo naneseno na misky YPD (Invitrogen) obsahující I, 2 a 4 mg/ml G418 (Roche Diagnostics GmbH) a misky byly inkubo55 vány po dobu 3 až 5 dnů ve 30 °C. Výsledné klony byly opět vyšetřeny prostřednictvím testů
- 10CZ 302558 B6 aktivity na zvýšenou expresi eukaryotické vysoce aktivní alkalické fosfatázy, jak je popsáno výše.
Seznam sekvencí <160> 38 <170> Patentln Ver. 2.1 io <210>l <211> 1476 <212>DNA <213> Bovinní <400> 1 gaattcctca tcccagctga ggaggaaaac cccgccttct ggaaccgcca ggcagcccag 60 gcccttgatg tagccaagaa gttgcagccg atccagacag ctgccaagaa tgtcatcctc 120 ttcttggggg atgggatggg ggtgcctacg gtgacagcca ctcggatcct aaaggggcag 130 atgaatggca aactgggacc tgagacaccc ctggccatgg accagttccc atacgtggct 240 ctgtccaaga catacaacgt ggacagacag gtgccagaca gcgcaggcac tgccactgcc 300 tacctgtgtg gggtcaaggg caactacaga accatcggtg taagtgcagc cgcccgctac 360 aatcagtgca acacgacacg tgggaatgag gtcacgtctg tgatcaaccg ggccaagaaa 420 gcagggaagg ccgtgggagt ggtgaccacc accagggtgc agcatgcctc cccagccggg 4Θ0 gcctacgcgc acacggtgaa ccgaaactgg tactcagacg ccgacctgcc tgctgatgca 540 cagaagaatg gctgccagga catcgccgca cagctggtct acaacatgga tattgacgtg 600 atcctgggtg gaggccgaat gtacatgttt cctgagggga ccccagaccc tgaataccca 660 gatgatgcca gtgtgaatgg agtccggaag gacaagcaga acctggtgca ggaatggcag 720 gccaagcacc agggagccca gtatgtgtgg aaccgcactg cgctccttca ggcggccgat 780 gactccagtg taacacaqct catgggcctc tttgagccgg cagacatgaa gtataatgtt 840 cagcaagacc acaccaagga cccgaccctg gcggagatga cggaggcggc cctgcaagtg 900 ctgagcagga acccccgggg cttctacctc ttcgtggagg gaggccgcat tgaccacggt 960 caccatgacg gcaaagctta tatggcactg actgaggcga tcatgtttga caatgccatc 1020 gccaaggcta acgagctcac tagcgaactg gacacgctga tccttgtcac tgcagaccac 1080 tcccatgtct tctcttttgg tggctacaca ctgcgtggga cctccatttt cggtctggcc 1140 cccggcaagg ccttagacag caagtcctac acctccatcc tctatggcaa tggcccaggc 1200 tatgcgcttg gcgggggctc gaggcccgat gttaatggca gcacaagcga ggaaccctca 1260 taccggcagc aggcggccgt gcccctggct agcgagaccc acgggggcga agacgtggcg 1320 gtgttcgcgc gaggcccgca ggcgcacctg gtgcacggcg tgcaggagga gaccttcgtg 1380 gcgcacatca tggcctttgc gggctgcgtg gagccctaca ccgactgcaa tctgccagcc 1440 cccgccaccg ccaccagcat ccccgactag ggtacc 1476 <21O>2 <211> 40 <212> DNA <213> Syntetické sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: syntetická 1 <400> 2 gcgcgaattc ctcatcccag ctgaggagga aaaccccgcc 4 0 <2103 <211> 36 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: syntetická 5 <4003 cgcgggtacc ctagtcgggg atgctggtgg cggtgg 36 <210>4 o <211>487 <212> PRT <213> Bovinní <400>4
| Leu 1 | Ile | Pro | Ala | Glu 5 | Glu | Glu | Asn | Pro | Ala 10 | Phe | Trp | Asn | Arg | Gin 15 | Ala |
| Ala | Gin | Ala | Leu 20 | Asp | Val | Ala | Lys | Lys 25 | Leu | Gin | Pro | Ile | Gin 30 | Thr | Jda |
| Ala | Lys | Asn 35 | Val | Ile | Leu | Phe | Leu 40 | Gly | Asp | Gly | Met | Gly 45 | Val | Pro | Thr |
| Val | Thr 50 | Ala | Thr | Arg | Ile | Leu 55 | Lys | Gly | Gin | Met | Asn 60 | Gly | Lys | Leu | Gly |
| Pro 65 | Glu | Thr | Pro | Leu | Ala 70 | Met | Asp | Gin | Phe | Pro 75 | Tyr | Val | Ala | Leu | Ser 80 |
| Lys | Thr | Tyr | Asn | Val 85 | Asp | Arg | Gin | Val | Pro 90 | Asp | Ser | Ala | Gly | Thr 55 | Ala |
| Thr | Ala | Tyr | Leu 100 | Cys | Gly | Val | Lys | Gly 105 | Asn | Tyr | Arg | Thr | Ile 110 | Gly | Val |
| Ser | Ala | Ala 115 | Ala | Arg | Tyr | Asn | Gin 120 | Cys | Asn | Thr | Thr | Arg 125 | Gly | Asn | Glu |
| Val | Thr 130 | Ser | Val | Ile | Asn | Arg 135 | Ala | Lys | Lys | Ala | Gly 140 | Lys | Ala | Val | Gly |
| Val 145 | Val | Thr | Thr | Thr | Arg 150 | Val | Gin | His | Ala | Ser 155 | Pro | Ala | Gly | Ala | Tyr 160 |
| Ala | His | Thr | Val | Asn 165 | Arg | Asn | Trp | Tyr | Ser 170 | Asp | Ala | Asp | Leu | Pro 175 | Ala |
| Asp | Ala | Gin | Lys 180 | Asn | Gly | Cys | Gin | Asp 185 | Ile | Ala | Ala | Gin | Leu 190 | Val | Tyr |
| Asn | Met | Asp 195 | Ile | Asp | Val | Ile | Leu 200 | Gly | Gly | Gly Arg | Met 205 | Tyr | Met | Phe | |
| Pro | Glu 210 | Gly | Thr | Pro | Asp | Pro 215 | Glu | Tyr | Pro | Asp | Asp 220 | Ala | Ser | Val | Asn |
| Gly 225 | Val | Arg | Lys | Asp | Lys 230 | Gin | Asn | Leu | Val | Gin 235 | Glu | Trp | Gin | Ala | Lys 240 |
- 12CZ 302558 B6
| His | Gin Gly | Ala | Gin 245 | Tyr Val | Trp | Asn | Arg 250 | Thr | Ala Leu | Leu | Gin 255 | Ala | |||
| Ala | Asp | Asp | Ser | Ser | Val | Thr | His | Leu | Met | Gly | Leu | Phe | Glu | Pro | Ala |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Asp | Met | Lys | Tyr | Asn | Val | Gin | Gin | Asp | His | Thr | Lys | Asp | Pro | Thr | Leu |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Ala | Glu | Met | Thr | Glu | Ala | Ala | Leu | Gin | Val | Leu | Ser | Arg | Asn | Pro | Arg |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Gly | Phe | Tyr | Leu | Phe | Val | Glu | Gly | Gly | Arg | Ile | Asp | His | Gly | His | nis |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Asp | Gly | Lys | Ala | Tyr | Met | Ala | Leu | Thr | Glu | Ala | Ile | Met | Phe | Asp | Asn |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Ala | Ile | Ala | Lys | Ala | Asn | Glu | Leu | Thr | Ser | Glu | Leu | Asp | Thr | Leu | Ile |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Leu | Val | Thr | Ala | Asp | His | Ser | His | Val | Phe | Ser | Phe | Gly | Gly | Tyr | Thr |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Leu | Arg | Gly | Thr | Ser | Ile | Phe | Gly | Leu | Ala | Pro | Gly | Lys | Ala | Leu | Asp |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Ser | Lys | Ser | Tyr | Thr | Ser | Ile | Leu | Tyr | Gly | Asn | Gly | Pro | Gly | Tyr | Ala |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Leu | Gly | Gly | Gly | Ser | Arg | Pro | Asp | Val | Asn | Gly | Ser | Thr | Ser | Glu | Glu |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Pro | Ser | Tyr | Arg | Gin | Gin | Ala | Ala | Val | Pro | Leu | Ala | Ser | Glu | Thr | His |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Gly | Gly | Glu | Asp | Val | Ala | Val | Phe | Ala | Arg | Gly | Pro | Gin | Ala | His | Leu |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Val | His | Gly | Val | Gin | Glu | Glu | Thr | Phe | Val | Ala | His | Ile | Met | Ala | Phe |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Tkla | Gly | Cys | Val | Glu | Pro | Tyr | Thr | Asp | Cys | Asn | Leu | Pro | Ala | Pro | Ala |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Thr | Ala | Thr | Ser | Ile | Pro | Asp |
485 <210>5 <211> 1476 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: syntetická
- 13 CZ 302558 B6 <400 5 gaattcttga ttccagctga agaagaaaat ccagettttt ggaatagaca agctgctcaa 60 gctttggatg ttgctaagaa gttgcaacca attcaaactg ctgctaagaa tgttattttg 120 tttttgggtg atggtatggg tgttccaact gttactgcta ctagaatttt gaagggtcaa 180 atgaatggta agttgggtcc agaaactcca ttggctatgg atcaatttcc atacgttgct 240 ttgtčtaaga cttacaatgt tgatagacaa gttccagatt ctgctggtac tgctactgct 300 tacttgtgtg gtgttaaggg taattacaga actattggtg tttctgctgc tgctagatac 360 aatcaatgta atactactag aggtaatgaa gttacttctg ttautaatag agctaagaag 420 gctggtaagg ctgctggtgt tgttactact actagagttc aacatgcttc tccagctggt 480 gcttacgctc atactgttsa tagaaattgg tactctgatg ctgatttgcc agctgatgct 540 caaaagaatg gttgtcaaga tattgctgct caattggttt acaatatgga tattgatgtt 600 attttgggtg gtggtagaat gtacatgttt ccagaaggta ctccagatcc agaataccca 660 gatgatgctt ctgttaatgg tgttagaaag gataagcaaa atttggttca agaatggcaa 720 gctaagcatc aaggtgctca atatgtttgg aatagaactg ctttgttgca agctgctgat 780 gattctagtg ttactcattt gatgggtttg tttgaaccag ctgatatgaa gtataatgtt 840 caacaagatc atactaagga tccaactttg gctgaaatga ctgaagctgc tttgcaagtt 900 ttgtctagaa atccaagagg tttttacttg tttgttgaag gtggtagaat tgatcatggt 960 catcatgatg gtaaggctta tatggctttg actgaagcta ttatgtttga taatgctatt 1020 gctaaggcta atgaattgac ttctgaattg gatactttga ttttggttac tgctgatcat 1080 agtcatgttt tttcttttgg tggttacact ttgagaggta cttctatttt tggtttggct 1140 ccaggtaagg ctttggatag taagtcttac acttctattt tgtatggtaa tggtccaggt 1200 tatgctttgg gtggtggttc tagaccagat gttaatggta gtactagtga agaaccatct 1260 tacagacaac aagctgctgt tccattggct agtgaaactc atggúggtga agatgttgct 1320 gtttttgcta gaggtccaca agctcatttg gttcatggtg ttcaagaaga aacttttgtt 1380 gctcatatta tggcttttgc tggttgtgtt gaaccataca ctgattgtaa tttgccagct 1440 ccagctactg ctactagtat tccagattaa ggtacc 1476 <210>6 <211> 78 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická io <400> 6 gcgcgaattc ttgattccag ctgaagaaga aaatccagct ttttggaata gacaagctgc 60 tcaagctttg gatgttgc 78 <2IO>7 <211> 70 <2I2>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 7 ccaaaaacaa aataacattc ttagcagcag tttgaattgg ttgcaacttc ttagcaacat 60 ccaaagcttg 70 <210>8 <211> 69 <212>DNA <213> Syntetická sekvence
- 14CZ 302558 B6 <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400>8 . gaatgttatt ttgtttttgg gtgatggtat gggtgttcca actgttactg ctactagaat 60 tttgaaggg 69 <210>9 <211> 70 <212>DNA io <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400>9 ggaaattgat ccatagccaa tggagtttct ggacccaact taccattcat ttgacccttc 60 aaaattctag 70 <21O> 10 <211> 71 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popís syntetické sekvence: syntetická <400> 10 gctatggatc aatttccata cgttgctttg tctaagactt acaatgttga tagacaagtt 60 ccagattctg c 71 <210>ll <211> 71 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 11 ccaatagttc tgtaattacc cttaacacca cacaagtaag cagtagcagt accagcagaa 60 tctggaactt g 71 <210>12 <211> 72 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 12 gtaattacag aactattggt gtttctgctg ctgctagata gaggtaatga ag caatcaatgt aatactacta 60
- 15 CZ 302558 B6 <210>13 <21 l> 74 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence; syntetická <4()0> 13 <1 CJ t cl í2lC dd C tl OC7H acagcct taccagccLt. cttagctcta ttaataacag attacctcta gtag <21 ()> 14 <211> 74 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 14 gcLgttggtg ttgttactac tactagagtt caacatgctt ctccagctgg catactgtta atag <210>l5 <211> 68 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 15 caaccattct tttgagcatc agctggcaaa tcagcatcag agtaccaatt gtatgagc <210>16 <211> 55 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 16 gatgctcaaa agaatggttg tcaagatatt gctgctcaat tggtttacaa <210>l7 <211> 72 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická aagtaacťtc 60 tgcttacgct 60 74 tctattaaca 60 68 tatgg 55
- 16CZ 302558 B6 <400> 17 ccttctggaa acatgtacat tctaccacca cccaaaataa catcaatatc catattgtaa 60 accaattgag ca 72 <210>18 5 <21l>71 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
io <223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 18 gtacatgttt ccagaaggta ctccagatcc agaataccca gatgatgctt ctgttaatgg 60 tgttagaaag g 71 <210>19 15 <211>73 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
2o <223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 19 catattgagc accttgatgc ttagcttgcc attcttgaac caaattttgc ttatcctttc 60 taacaccatt aac 73 <210>20 25 <211>7I <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 20 gcatcaaggt gctcaatatg tttggaatag aactgctttg ttgcaagctg ctgatgattc 60 tagtgttact c 71 <210>21 35 <211>54 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 21 cttcatatca gctggttcaa acaaacccat caaatgagta acactagaat catc 54
- 17CZ 302558 Ró <21022 <211> 59 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220 <223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 22 gísaccagctq atatgaagta taatgttcaa caagatcřita ctaaggafccc aactLtggc 5 9 <210>23 <211> 67 <212> DNA <213> Syntetická sekvence 15 <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 23 cctcttggat ttctagacaa aacttgcaaa gcagcttcag tcatttcaqc caaagttgga 60 2(t teettag 67 <210> 24 <211> 69 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220 <223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400 24 gtctegaaat ccaagaggtt tttacttgtt tgttgaaggt ggtagaattg atcatggtea 60 w tcatgatgg 69 <210> 25 <21l> 73 <212> DNA <213> Syntetická sekvence 35 <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 25 cchlagcaat ageattatea aacataatag ctxcagtcaa agccatataa gccttaccat 60 4Q catgatgacc atg 73 <210> 26 <211> 74 <212> DNA <213> Syntetická sekvence 45 <220>
<223> Popis syntetické sekvence: syntetická
- 18CZ 302558 Β6 <400 26 gataatgcta ttgctaaggc taatgaattg acttctgaat tggatacttt gattttggtt 60 actgctgatc atag 74 <2l0> 27 <211> 73 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 27 ccaaaccaaa aatagaagta cctctcaaag tgtaaccacc aaaagaaaaa acatgactat 60 gatcagcagt aac 73 <210>28 <211> 73 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220 <223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400 28 cttctatttt tggtttggct ccaggtaagg ctttggatag taagtcttac acttctattt 60 tgtatggtaa tgg 73 <210> 29 <211> 76 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400 29 ctagtactac cattaacatc tggtctagaa ccaccaccca aagcataacc tggaccatta 60 ccatacaaaa tagaag 76 <210> 30 <211> 77 <212>DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400> 30 gatgttaatg gtagtactag tgaagaacca tcttacagac aacaagctgc tgttccattg 60 gctagtgaaa ctcatgg 77 <210> 31 <211> 73 <212>DNA
- 19 CZ 302558 B6 <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická S <400> 31 caccaLgaac caaatgaqct tgtggacctu tagcaaaaac agcaacatct tcaccaccat 60 gagtttcact. agc 73 <210 32 <21l> 74 id <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220 <223>Popis syntetické sekvence: syntetická 15 <400> 32 gctcatttgg ttcatggtgt tcaagaagaa acttttgltg ctcatattat ggcttttgct 60 ggttgtgttg aacc 74 <210> 33 <211> 82 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220 <223>Popis syntetické sekvence: syntetická <400 33 gcgcgqtacc ttaatctgga atactagtag cagtagctgg agctggcaaa ttacaatcag 60 tgtatggttc aacacaacca gc 32 <210> 34 <211>31 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická .35 <400 34 gcgcgcctag gagatctaac atccaaagac g 31 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223>Popis syntetické sekvence: syntetická 45
-20CZ 302558 B6 <400> 35 cgcgcgctag cggatccgca caaacgaag 29 <210> 36 <211> 10 <212>PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 36
Glu Ala Glu Ala Glu Phe Leu Ile Pro Ala 15 10 ío <210>37 <211> 4 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae t5 <400 37
Leu Ile Pro Ala 1 <210> 38 <21l> 6 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 38
Glu Ala Glu Ala Glu Phe
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v kvasinkových buňkách, vyznačující se t í m , že seI) a,) genová sekvence eukaryotické alkalické fosfatázy klonuje do prvního vektoru majícího gen 35 rezistence pro první selekční markér;a2) genová sekvence eukaryotické alkalické fosfatázy se klonuje do druhého vektoru majícího gen rezistence pro druhý selekční markér;přičemž první selekční markér se liší od druhého selekčního markéru;b) kvasinkové buňky se transformují prvním vektorem z kroku a transformanty, které 40 integrovaly gen rezistence pro první selekční markér a genovou sekvenci eukaryotické alkalické fosfatázy do genomu se vybírají růstem na živném médiu obsahujícím nízkou koncentraci prvního selekčního markéru,c) počet kopií genu v buňkách získaných v kroku b) se zvýší několikanásobnou transformací prvním vektorem, přičemž několikanásobné transformanty se vybírají růstem na živném médiu45 při zvýšeném selekčním tlaku,-21 CZ 302558 B6d) několikanásobné transformanty l kroku e) se transformují druhým vektorem z kroku a2) a transformanty, které integrovaly gen rezistence pro druhý selekční markér a genovou sekvenci eukaryotieké alkalické fosfatázy do genomu se vybírají růstem na živném médiu obsahujícím nízkou koncentraci druhého selekčního markéru,e) počet kopií genu v buňkách získaných v kroku d) se zvýší několikanásobnou transformací druhým vektorem, přičemž několikanásobné transformanty se vybírají růstem na živném médiu pří zvýšeném selekčním tlaku,0 vyberou se ty klony, které do genomu stabilně integrovaly několik kopií genové sekvence eukaryotieké alkalické fosfatázy a geny rezistence pro selekční markéry; ll) v klonech z kroku I) f) se exprimuje genová sekvence eukaryotieké alkalické fosfatázy; a lil) alkalická fosfatáza získaná z kroku II) se puriUkuje.
- 2. Způsob podle nároku I, vyznačující se tím, že genová sekvence odpovídá sekv. id. Č. 1.
- 3. Způsob podle nároku I, vyznačující se tím, že genová sekvence odpovídá sekv. id. č. 5.
- 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se používá methylotrofních kvasinek.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků I až 4, vyznačující se tím, že se jako kvasinkového kmene používá kmene Pichia pastoris nebo Hansenula polymorpha.3 výkresy
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10036491A DE10036491A1 (de) | 2000-07-25 | 2000-07-25 | Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20012639A3 CZ20012639A3 (cs) | 2002-03-13 |
| CZ302558B6 true CZ302558B6 (cs) | 2011-07-13 |
Family
ID=7650333
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20012639A CZ302558B6 (cs) | 2000-07-25 | 2001-07-19 | Zpusob produkce eukaryotické alkalické fosfatázy v kvasinkových bunkách |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6884602B2 (cs) |
| EP (2) | EP1176205B1 (cs) |
| JP (1) | JP3657895B2 (cs) |
| CN (1) | CN1161461C (cs) |
| AT (2) | ATE356881T1 (cs) |
| CA (1) | CA2352609C (cs) |
| CZ (1) | CZ302558B6 (cs) |
| DE (2) | DE10036491A1 (cs) |
| DK (2) | DK1792982T3 (cs) |
| ES (2) | ES2283360T3 (cs) |
| IL (1) | IL144467A (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10036491A1 (de) * | 2000-07-25 | 2002-02-07 | Roche Diagnostics Gmbh | Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe |
| DE10213201A1 (de) * | 2002-03-25 | 2003-10-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Erzeugung von schwach aktiven oder inaktiven Mutanten von Alkalischer Phosphatase und deren Expression in Hefe |
| EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| JP2008005734A (ja) * | 2006-06-28 | 2008-01-17 | Kikkoman Corp | アルカリホスファターゼ |
| ES2695999T3 (es) * | 2007-10-12 | 2019-01-11 | Hoffmann La Roche | Expresión de proteínas a partir de múltiples ácidos nucleicos |
| EP2401378B1 (en) | 2009-02-25 | 2013-08-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Metabolic engineering of a galactose assimilation pathway in the glycoengineered yeast pichia pastoris |
| CA2753814C (en) * | 2009-02-27 | 2018-07-31 | Novartis Ag | Novel selection vectors and methods of selecting eukaryotic host cells |
| EP2764017B1 (en) * | 2011-10-05 | 2018-01-10 | Ben Gurion University of The Negev Research and Development Authority | Compositions and methods for conferring herbicide resistance |
| CA2864887C (en) | 2012-02-16 | 2017-04-25 | Eli Lilly And Company | Methods and compositions for reducing the environmental impact of animal waste |
| JP6732368B2 (ja) * | 2016-01-12 | 2020-07-29 | 東ソー株式会社 | アルカリホスファターゼ及びその製造方法 |
| CN105802979B (zh) * | 2016-04-01 | 2019-09-06 | 郑州科蒂亚生物技术有限公司 | 一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法 |
| RU2750721C2 (ru) | 2017-03-10 | 2021-07-01 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ получения мультиспецифических антител |
| CA3057089A1 (en) | 2017-03-21 | 2018-09-27 | Synthetic Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase formulations |
| US11932860B2 (en) | 2017-10-03 | 2024-03-19 | Kikkoman Corporation | Method for producing alkaline phosphatase, alkaline phosphatase obtained using said method, and vector and transformant for production thereof |
| EP3737750B1 (en) | 2018-01-09 | 2024-06-05 | Theriva Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders |
| WO2019183209A1 (en) | 2018-03-20 | 2019-09-26 | Synthetic Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders |
| ES3032290T3 (en) | 2018-03-20 | 2025-07-16 | Theriva Biologics Inc | Intestinal alkaline phosphatase formulations |
| KR20220005560A (ko) * | 2019-05-06 | 2022-01-13 | 신세틱 바이오로직스, 인코퍼레이티드 | 알칼리성 포스페이트-기반 종양학 치료제 |
| CA3146738A1 (en) * | 2019-07-18 | 2021-01-21 | Synthetic Biologics, Inc. | Intestinal alkaline phosphatase-based treatments of metabolic disorders |
| JP7510787B2 (ja) | 2020-05-28 | 2024-07-04 | シスメックス株式会社 | アルカリフォスファターゼ融合抗体及びその製造方法、並びに免疫測定用試薬及び免疫測定方法 |
| CN113564185B (zh) * | 2021-09-07 | 2023-06-06 | 金标优尼科(无锡)生物科技有限公司 | 一种碱性磷酸酶基因及其cho稳定细胞株和alp制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0586892A1 (en) * | 1992-08-07 | 1994-03-16 | Research Corporation Technologies, Inc. | Production of Bacillus Entomotoxins in Methylotrophic Yeast |
| EP0955369A2 (de) * | 1998-05-05 | 1999-11-10 | Roche Diagnostics GmbH | Hochaktive alkalische Phosphatase |
| EP1176205A2 (de) * | 2000-07-25 | 2002-01-30 | Roche Diagnostics GmbH | Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2200118A (en) * | 1987-01-23 | 1988-07-27 | Allelix Inc | Synthetic chymosin-and prochymosin-encoding DNA segments |
| NZ233642A (en) * | 1989-05-10 | 1992-12-23 | Somatogenetics Int | Linked hemoglobin subunits, preparation by genetic engineering and linker assay |
| CA2017176A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin |
| IL133931A0 (en) * | 1997-07-21 | 2001-04-30 | Du Pont | Transformed yeast strains and their use for the production of monoterminal and diterminal aliphatic carboxylates |
| CN1940067A (zh) * | 1999-03-22 | 2007-04-04 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 用于在真菌细胞中表达基因的启动子 |
| WO2001066693A1 (en) * | 2000-03-10 | 2001-09-13 | Novozymes A/S | Compositions and methods for producing high yields of heterologous polypeptides in a pichia cell |
-
2000
- 2000-07-25 DE DE10036491A patent/DE10036491A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-07-19 IL IL144467A patent/IL144467A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-07-19 CZ CZ20012639A patent/CZ302558B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-07-20 CN CNB011232463A patent/CN1161461C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-21 AT AT01117822T patent/ATE356881T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-07-21 EP EP01117822A patent/EP1176205B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-21 ES ES01117822T patent/ES2283360T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-21 DE DE50112186T patent/DE50112186D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-21 AT AT06021699T patent/ATE553191T1/de active
- 2001-07-21 DK DK06021699.1T patent/DK1792982T3/da active
- 2001-07-21 DK DK01117822T patent/DK1176205T3/da active
- 2001-07-21 ES ES06021699T patent/ES2384108T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-21 EP EP06021699A patent/EP1792982B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 JP JP2001222153A patent/JP3657895B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 US US09/911,132 patent/US6884602B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 CA CA002352609A patent/CA2352609C/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0586892A1 (en) * | 1992-08-07 | 1994-03-16 | Research Corporation Technologies, Inc. | Production of Bacillus Entomotoxins in Methylotrophic Yeast |
| EP0955369A2 (de) * | 1998-05-05 | 1999-11-10 | Roche Diagnostics GmbH | Hochaktive alkalische Phosphatase |
| EP1176205A2 (de) * | 2000-07-25 | 2002-01-30 | Roche Diagnostics GmbH | Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Batard a kol. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 379, 161-9 * |
| Manes a kol. (1998) J. Biol. Chem. 273, 23353-60 * |
| Sreekrishna a kol. (1997) Gene 190, 55-62 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1792982T3 (da) | 2012-07-23 |
| CN1334341A (zh) | 2002-02-06 |
| CA2352609A1 (en) | 2002-01-25 |
| US20030096341A1 (en) | 2003-05-22 |
| EP1176205B1 (de) | 2007-03-14 |
| DK1176205T3 (da) | 2007-07-16 |
| EP1792982A3 (de) | 2007-06-13 |
| CN1161461C (zh) | 2004-08-11 |
| IL144467A (en) | 2010-05-31 |
| DE50112186D1 (de) | 2007-04-26 |
| CZ20012639A3 (cs) | 2002-03-13 |
| EP1176205A3 (de) | 2002-05-22 |
| CA2352609C (en) | 2008-02-12 |
| JP3657895B2 (ja) | 2005-06-08 |
| EP1792982B1 (de) | 2012-04-11 |
| ATE553191T1 (de) | 2012-04-15 |
| ES2283360T3 (es) | 2007-11-01 |
| IL144467A0 (en) | 2002-05-23 |
| ES2384108T3 (es) | 2012-06-29 |
| ATE356881T1 (de) | 2007-04-15 |
| US6884602B2 (en) | 2005-04-26 |
| EP1176205A2 (de) | 2002-01-30 |
| JP2002253269A (ja) | 2002-09-10 |
| DE10036491A1 (de) | 2002-02-07 |
| EP1792982A2 (de) | 2007-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6884602B2 (en) | Expression of alkaline phosphatase in yeast | |
| JP7430189B2 (ja) | 外来遺伝子を発現させるためのピキア・パストリス変異株 | |
| JP3258635B2 (ja) | 相補性によるクローニングおよび関連方法 | |
| US8440456B2 (en) | Nucleic acids of Pichia pastoris and use thereof for recombinant production of proteins | |
| Pidoux et al. | Analysis of the BiP gene and identification of an ER retention signal in Schizosaccharomyces pombe. | |
| Iino et al. | S. pombe pac1+, whose overexpression inhibits sexual development, encodes a ribonuclease III‐like RNase. | |
| KR20200110469A (ko) | 메틸영양성 효모를 유전적으로 조작하는 발현 구축물 및 방법 | |
| KR20120107936A (ko) | 만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 포스포-6-만노스로의 가수분해 | |
| CZ20021701A3 (cs) | Místně řízená mutageneze fytázy z Escherichia coli | |
| JP2005515749A (ja) | 酵母中での異種たんぱく質の高効率生産のための方法および組成物 | |
| EP4424698A2 (en) | Methods and compositions for protein synthesis and secretion | |
| CN117802067A (zh) | 一种磷脂酶d突变体及其制备方法、应用和磷脂酰丝氨酸的制备方法 | |
| Minet et al. | Cloning and sequencing of a human cDNA coding for dihydroorotate dehydrogenase by complementation of the corresponding yeast mutant | |
| US7303903B2 (en) | Production of weakly active or inactive mutants of alkaline phosphatase and their expression in yeast | |
| CA2170611A1 (en) | Glycerin-3-phosphate-dehydrogenase (gpdh) | |
| Nosek et al. | Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis | |
| CN106459940B (zh) | 新型过氧化氢酶信号序列及利用其的过氧化氢酶表达方法 | |
| KR101243903B1 (ko) | 에탄올―저항성 효모 균주 및 이의 유전자 | |
| Jung et al. | Identification of putative phosphoinositide-specific phospholipase C genes in filamentous fungi | |
| JP2018533932A (ja) | 新規エピソームプラスミドベクター | |
| KR101713885B1 (ko) | sn-1 위치 특이적 리파아제 및 그 생산방법 | |
| HK40110200A (en) | Methods and compositions for protein synthesis and secretion | |
| Szczepanek et al. | In vivo analysis of the relationships between the splicing and homing activities of a group I intron-encoded I-Sca I/bi2-maturase of Saccharomyces capensis produced in the yeast cytoplasm | |
| KR20160134619A (ko) | 신규 리파제 신호서열 및 이를 이용한 리파제 발현방법 | |
| KR20160134618A (ko) | 신규 리파제 신호서열 및 이를 이용한 리파제 발현방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210719 |