ES2283360T3 - Expresion de la fosfatasa alcalina en levadura. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la obtención de una fosfatasa alcalina eucariota en células de levadura que consta de los pasos siguientes: a) clonación de una secuencia genética en diversos vectores, b) transformación de la levadura, c) expresión y d) purificación de la fosfatasa alcalina, caracterizado porque - un primer vector presenta un gen de resistencia contra un primer marcador de selección, - se seleccionan los transformantes, que han integrado el gen de resistencia y la secuencia genética en el genoma, mediante el cultivo en un medio nutritivo que tiene una baja concentración del primer marcador de selección, - se aumenta el número de copias del gen por transformación múltiple, seleccionándose los transformantes múltiples por cultivo en un medio nutritivo de mayor presión de selección, - se añade un segundo vector que, además de la secuencia genética, contiene un gen de resistencia contra un segundo marcador de selección, - se aumenta el número de copias del gen por transformación múltiple conel segundo vector, seleccionándose los transformantes múltiples por cultivo en un medio nutritivo de mayor presión de selección y - se seleccionan los clones que han integrado de forma estable en su genoma las múltiples copias de la secuencia genética y de los genes de resistencia al marcador de selección.

Description

Expresión de la fosfatasa alcalina en levadura.
La invención se refiere a un procedimiento para la obtención o expresión recombinante de fosfatasa alcalina eucariota. Se describe además un DNA de codón optimizado que codifica a una fosfatasa alcalina eucariota muy activa, de una actividad específica superior a 3000 U/mg. Se describe también un procedimiento para la inserción del DNA en un vector para la expresión en células de levadura.
Las fosfatasas alcalinas (AP) son fosfomonoesterasas dímeras, no específicas, que contienen cinc, que están presentes tanto en organismos procariotas como eucariotas, p.ej. en la E. coli y en mamíferos (McComb y col., 1979 Alkaline Phosphatases, editorial Plenum Press, Nueva York). Se han comparado las estructuras primarias de diversas fosfatasas alcalinas, constatándose un alto grado de homología (homología del 25-30% entre la AP de la E. coli y la AP de mamíferos; Millán, Anticancer Res. 8, 995-1004, 1988; Harris, Clin. Chim. Acta 186, 133-150, 1989).
En el hombre y en los animales superiores, el grupo de las AP se compone de cuatro miembros, que están codificados en diversos lugares del gen (Millán, Anticancer Res. 8, 995-1004, 1988; Harris Clin. Chim. Acta 186, 133-150, 1989). Pertenecen al grupo de las fosfatasas alcalinas las AP específicas de tejidos (la AP de placenta (PLAP), la AP de células germinales (GCAP) y la AP del intestino (IAP)) y las AP no específicas de tejidos (TnAP), que se localizan principalmente en el hígado, los riñones y los huesos.
Una propiedad decisiva de las AP conocidas hasta ahora es la gran variabilidad de la actividad catalítica de las AP de mamíferos, que poseen un valor k_{cat}s de 10 a 100 veces mayor que la AP de la E. coli. Entre las AP de mamíferos, las AP del intestino bovino (biAP) son las que presentan las actividades específicas más elevadas. Esta característica hace que las biAP sean atractivas para aplicaciones bioquímicas, p.ej. el uso de los correspondientes derivados enzimáticos como reactivo para el diagnóstico o para la desfosforilación del DNA. La existencia de diversas fosfatasas alcalinas del intestino bovino con diversas actividades específicas se ha descrito en el documento EP 0 955 369 y también en Manes y col., J. Biol. Chem. 273, nº 36, 23353-23360, 1998. Hasta el presente ya se ha descrito la expresión recombinante de fosfatasas alcalinas eucariotas de baja actividad (hasta 3000 U/mg) en diversas líneas celulares eucariotas, p.ej. en células de CHO (bIAP I/WO 93/18139; Weissig y col., Biochem J. 260, 503-508, 1993), en células COS (AP de placenta humana/Berger y col., Biochemistry 84, 4885-4889, 1987) en el sistema de expresión de Baculovirus (AP de placenta humana/Davis y col., Biotechnology 10, 1148-1150, 1992). Se ha descrito también la expresión de las AP de mayor actividad (actividad específica >3000 U/mg) del intestino bovino en células CHO (bIAP II, III y IV/Manes y col., J. Biol. Chem. 273, nº 36, 23353-23360, 1998). Pero, el inconveniente de la expresión de las fosfatasas alcalinas en estos sistemas de expresión es la escasa potencia de expresión, que convierte en inviable económicamente la obtención recombinante sobre todo de una AP muy activa.
La expresión de fosfatasas alcalinas eucariotas en hospedantes de expresión procariotas, p.ej. en E. coli, es posible en principio (AP de placenta humana//Beck y Burtscher, Protein Expression and Purification 5, 192-197, 1994), pero las fosfatasas alcalinas expresas en procariotas no presentan glucosilación alguna, que es esencial sobre todo para la obtención de conjugados enzimáticos.
Por consiguiente, el objetivo de la presente invención es desarrollar un procedimiento de expresión resistente y estable para la obtención de fosfatasa alcalina eucariota glucosilada, de elevada actividad específica, que en base a su gran potencia de expresión permita la obtención económica de la fosfatasa alcalina correspondiente y además proporcione una enzima que, en lo tocante a sus propiedades, p.ej. su actividad específica y su termoestabilidad, sea equiparable a las fosfatasas alcalinas nativas muy activas o a las de baja actividad (que son productos comerciales p.ej. de Roche Diagnostics GmbH, Biozyme, levadura oriental).
Este objetivo se alcanza según la invención con un procedimiento de obtención de una fosfatasa alcalina eucariota de alta actividad específica en levaduras, en especial en una levadura metilotrófica, que consta de los pasos siguientes:
a) clonación de una secuencia genética en diversos vectores,
b) transformación de la levadura,
c) expresión y
d) purificación de la fosfatasa alcalina,
caracterizado porque
(i) un primer vector presenta un gen de resistencia contra un primer marcador de selección,
(ii) se seleccionan los transformantes, que han integrado el gen de resistencia y la secuencia genética en el genoma, mediante el cultivo en un medio nutritivo que tiene una baja concentración del primer marcador de selección,
\newpage
(iii) se aumenta el número de copias del gen por transformación múltiple, seleccionándose los transformantes múltiples por cultivo en un medio nutritivo de mayor presión de selección,
(iv) se añade un segundo vector que, además de la secuencia genética, contiene un gen de resistencia contra un segundo marcador de selección,
(v) se aumenta el número de copias del gen por transformación múltiple con el segundo vector, seleccionándose los transformantes múltiples por cultivo en un medio nutritivo de mayor presión de selección y
(vi) se seleccionan los clones que han integrado de forma estable en su genoma las múltiples copias de la secuencia genética y de los genes de resistencia al marcador de selección.
Como secuencia de gen es preferida una secuencia de DNA que codifique a una fosfatasa alcalina eucariota, que tenga una actividad específica superior a 3000 U/mg, en casos especiales entre 7000 U/mg y 10.000 U/mg. Según la invención ha demostrado ser idónea una secuencia de DNA acorde con la SEQ ID NO: 1. Es especialmente preferida una secuencia de DNA de codón optimizado, que corresponde en el plano de aminoácidos a la secuencia de gen SEQ ID NO: 1. La optimización de codón significa que con una mutación roma, es decir cambios en el plano del DNA, que no repercuten en el plano de los aminoácidos, se optimiza cada codón por ejemplo de la SEQ ID NO: 1 para incrementar la traducción según las necesidades del hospedantes de expresión elegido, con lo cual se obtiene por ejemplo la secuencia de gen de la SEQ ID NO: 5. Sin embargo, en el vector pueden integrarse también otras secuencias de gen diferentes de la SEQ ID NO: 1, que codifican a las fosfatasas alcalinas y eventualmente estén optimizadas en el codón, p.ej. la bIAPI, III, IV (DE 198 19 962 y EP 0 955 369). Para el procedimiento de la invención es preferido en especial el uso de una secuencia de gen de codón optimizado de la SEQ ID NO: 5. La secuencia de gen se clona seguidamente en uno o en varios vectores, que se eligen con arreglo al hospedante que se pretende transformar.
Como hospedante de tipo levadura son idóneas las levaduras metilotróficas, p.ej. la levadura Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, pero también otras, p.ej. el Saccharomyces cerevisiae, la Yarrowia lipolytica o el Schizosaccharomyces pombe. Los expertos ya conocen cuáles son los vectores idóneos, por ejemplo el pPICZ\alphaA, pPIC9K, los vectores Yes, pTEF1/Zeo, pYDI (p.ej. Invitrogen). El vector de expresión resultante se transforma con preferencia en diversas cepas de la Pichia pastoris y se integra de modo estable en el genoma. La integración estable en el genoma de la levadura tiene la ventaja de que para la ulterior producción por ejemplo de la fosfatasa alcalina eucariota muy activa en fermentadores de gran volumen no se requiere ninguna presión de selección. La integración estable en el genoma significa que el vector de expresión se integra mediante recombinación homóloga en el genoma p.ej. de la Pichia pastoris y de este modo puede heredarse posteriormente de generación en generación como componente fijo del genoma de la levadura (Cregg, J.M. y col., Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385, 1985).
El aumento del número de copias genéticas en la levadura metilotrófica se consigue por transformación repetida con aumento simultáneo de la presión de selección con un marcador de selección apropiado, p.ej. un antibiótico, por ejemplo la Zeocina® y la geneticina (G418) o un marcador de auxotrofia, con lo cual solamente serán viables los clones que hayan integrado de modo estable varias copias del vector de expresión en el genoma. Para ser resistente a concentraciones altas del antibiótico empleado como marcador de selección es necesario que los clones produzcan en abundancia la proteína de resistencia. Esto puede lograrse por ejemplo mediante una integración múltiple del vector de expresión, que además del cassette de expresión por ejemplo de la fosfatasa alcalina muy activa contenga también el gen de resistencia al antibiótico empleado como marcador de selección.
El cometido de obtener de forma económica la fosfatasa alcalina eucariota en un procedimiento de expresión resistente y estable con gran potencia de expresión solo se pudo lograr con la adopción de las medidas de (i) a (vi). Por ejemplo, la transformación de la cepa X-33 de la Pichia pastoris con un vector de expresión que contiene el gen bIAPII de la SEQ ID NO: 1 no conduce al éxito deseado si no se adoptan estas medidas (ver ejemplos 1 y 2). Con este procedimiento se consigue aumentar de forma notable la potencia de expresión si se compara con la expresión de la bIAPII en células de CHO (Manes y col., J. Biol. Chem. 273, nº 36, 23353-23360, 1998), pero el procedimiento no permite la obtención viable de una fosfatasa alcalina desde el punto de vista económico.
Una de las medidas necesarias para el desarrollo del procedimiento de la invención es la síntesis de una secuencia de gen de codón optimizado. Para optimizar cada codón para la expresión en levaduras es necesaria una síntesis completa "de novo" del gel de una longitud aprox. de 1,5 kbp, que codifica a la fosfatasa alcalina eucariota muy activa. Mediante la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de la fosfatasa alcalina eucariota muy activa de la SEQ ID NO: 4 (bIAP-II) se pudo optimizar cada codón, cuando fue necesario, recurriendo al código degenerado. Para ello se divide el gen en 28 oligonucleótidos de una longitud de 54 a 82 nucleótidos. Se diseñan los oligonucleótidos como sucesión alternante de fragmentos de cadena sentido y de cadena opuesta, que se solapan en cada caso de forma complementaria con sus extremos 5' y 3' con los oligonucleótidos adyacentes. Se elige la zona de solapamiento en cada caso de tal manera que, en la reacción de reasociación de la posterior reacción PCR, se evite en gran manera la unión inespecífica. Los oligonucleótidos de los extremos 5' y 3' del gen se dotan de lugares de reconocimiento para las endonucleasas de restricción en la zona ascendente (upstream) y descendente de la zona de codificación, que pueden utilizarse para la posterior inserción del gen sintético de la SEQ ID NO: 5 en los vectores de expresión. Para ello se incrusta en sentido ascendente (upstream) un lugar de reconocimiento para la endonucleasa de restricción EcoRI y en sentido descendente un lugar de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Asp718. Las secuencias de los oligonucleótidos se reproducen en las SEQ ID NO: 6 hasta 33.
La síntesis del gen se realiza mediante una reacción PCR. Para ello se divide en primer lugar la región codificadora en tres fragmentos parciales (oligonucleótidos de 6 a 15, de 16 a 23 y de 24 a 33) y se generan estos fragmentos parciales por reacciones PCR separadas. Con la síntesis de gen con oligonucleótidos complementarios solapados mediante la reacción PCR tiene lugar una prolongación gradual del fragmento genético hasta el producto de longitud completa, que después se amplifica en ciclos ulteriores. La temperatura de reasociación dependerá de la zona de solapamiento que tenga la temperatura de fusión más baja.
A continuación se analizan los tres fragmentos parciales por electroforesis a través de gel de agarosa, del gel se aíslan los productos que tienen la longitud esperada con un kit de extracción llamado QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) y se sintetizan en una reacción PCR ulterior para obtener el producto genético completo. La reacción PCR se lleva a cabo en los primeros 5 ciclos sin la adición de los cebadores en el extremo 5' ni en el extremo 3' del gen, de modo que en primer lugar se forman pocos fragmentos del producto genético que tengan la longitud esperada a partir de los tres fragmentos parciales. La temperatura de reasociación dependerá de la zona de solapamiento que tenga la temperatura de fusión más baja. En los 25 ciclos siguientes de amplifica en gran manera el fragmento de gen hasta la longitud esperada.
Se analiza el material resultante de la PCR por electroforesis a través de gel de agarosa y se aísla el fragmento de gen del tamaño esperado (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen).
En el ejemplo 3 se describen la clonación del correspondiente fragmento de PCR, la transformación en la Pichia pastoris y la expresión.
Con el gen de codón optimizado para la fosfatasa alcalina muy activa se puede incrementar la potencia de expresión en un factor 3 con respecto a los primeros ensayos realizados con el gen de tipo salvaje.
Pero con estos clones todavía no se consigue un proceso económico para la obtención de fosfatasa alcalina muy activa.
Una medida para aumentar la potencia de la expresión de las proteínas heterólogas y homólogas en la Pichia pastoris consiste en aumentar el número de copias del gen en la célula por transformación repetida. Esta medida puede servir para aumentar el producto de la transcripción, el mRNA del gen diana. Se consigue aumentar el número de copias del gen con la transformación múltiple de un clon con el vector de expresión y al mismo tiempo aumento la presión de selección con el cultivo posterior de los transformantes en placas de cultivo que tengan una concentración elevada del antibiótico empleado como marcador de selección. Para ello se vuelve a hacer competente un clon de expresión, que durante el primer paso de transformación ya haya captado por lo menos una copia del vector de expresión (ver ejemplo 1) y se transforma de nuevo con el vector de expresión. Se seleccionan los transformantes que hayan integrado varias copias del vector de expresión en el genoma, por extensión en placas de cultivo de presión de selección elevada, es decir, placas que tienen una concentración más alta del antibiótico empleado como marcador de selección (p.ej. la Zeocina®) que en el primer paso de la transformación. Para ello se determina en primer lugar la concentración máxima del antibiótico empleado como marcador de selección, en la que los clones del primer paso de la transformación todavía pueden crecer, y se aumenta en consonancia la concentración del antibiótico empleado como marcador de selección en las placas de YPDS-agar después de la transformación adicional por encima del valor umbral determinado. Aumentando el número de copias del vector de expresión se aumenta también el número de copias del gen de resistencia, que forma parte del vector de expresión, y de este modo se consigue también la resistencia contra concentraciones más elevadas del antibiótico empleado como marcador de selección. Variando la concentración del antibiótico empleado como marcador de selección en las placas de cultivo (aprox. de 100 a 2000 \mug/ml) se pueden seleccionar también clones de números de copias de diversas magnitudes del vector de expresión en el genoma (véase el ejemplo 4).
Otra medida que se puede adoptar para incrementar la potencia de expresión de proteínas heterólogas y homólogas en levaduras, por ejemplo en la Pichia pastoris, consiste en aumentar el número de copias del gel por selección múltiple. Esto se consigue por transformación de un clon de expresión, que ya se ha optimizado por transformación múltiple con un vector de expresión, que contiene el cassette de expresión con el gen diana (p.ej. el gen, que codifica a la fosfatasa alcalina muy activa, que corresponde a la SEQ ID NO: 5) y un gen de resistencia al primer antibiótico empleado como marcador de selección (p.ej. la Zeocina®), con un segundo vector de expresión que contiene al gen diana (p.ej. el gen que codifica a la fosfatasa alcalina muy activa y corresponde a la SEQ ID NO: 5) y un gen de resistencia al segundo antibiótico empleado como marcador de selección (p.ej. la geneticina (G418)). Durante la siguiente extensión de los transformantes sobre placas de cultivo, que contienen el segundo antibiótico empleado como marcador de selección, solamente se seleccionan los clones que, además de las copias del vector de expresión con el gen de resistencia al primer antibiótico empleado como marcador de selección, han captado también por lo menos una copia del vector de expresión con el gen de resistencia al segundo antibiótico empleado como marcador de selección (ver ejemplo 5).
Con la adopción de las medidas combinadas de la transformación repetida y de la selección doble se consigue aumentar la potencia de expresión en un factor 4 con respecto a la potencia de expresión de los clones del primer paso de transformación con el gen de codón optimizado.
\newpage
Por métodos de extracción, que los expertos en principio ya conocen, se puede extraer la fosfatasa alcalina recombinante de la biomasa, véase p.ej. "Protein Purification", editorial Springer, coord. Robert Scopes (1982). Por métodos cromatográficos de separación, por ejemplo empleando materiales hidrófobos como relleno de la columna y un intercambiador de cationes, se obtiene un producto de bandas puras, que tiene una actividad específica superior a 7000 U/mg.
Para caracterizar la fosfatasa alcalina recombinantes muy activa se somete el producto purificado a una secuenciación del extremo N.
Se determina de forma dominante la secuencia EAEAEFLIPA (SEQ ID NO: 36). Esta secuencia guarda una relación clara con la secuencia del extremo N de la AP "LIPA" (SEQ ID NO: 37) y el péptido de engarce del constructo EAEAEF (SEQ ID NO: 38), que surge por la estrategia de clonación de la secuencia del gen en el vector y por la rotura del péptido de señal del factor \alpha por acción de una peptidasa de señal Kex2 (p.ej. Invitrogen).
La estabilidad del producto fosfatasa alcalina recombinante se analiza y se compara con la fosfatasa alcalina de origen natural. Las muestras arrojan resultados similares cuando la solución se somete a una carga térmica (55ºC).
Con la presente invención se describe, pues, por primera vez un procedimiento que permite la fabricación económica de fosfatasa alcalina recombinante a partir de células de mamíferos, p.ej. de intestino bovino, que posee características similares a las de la fosfatasa alcalina nativa muy activa de intestino bovino y está glucosilada.
Por lo demás se describe una secuencia de DNA de la SEQ ID NO: 5 como secuencia genética de codón optimizado para la expresión del gen de la fosfatasa alcalina muy activa en la Pichia pastoris.
Se publica también un vector que contiene la secuencia SEQ ID NO: 5, en especial un vector pHAP10-3 de la figura 2. El pHAP10-3 es el vector pPICZ\alphaA, que es un producto comercial (Invitrogen) y que contiene al gen de la SEQ ID NO: 5, que está bajo el control del promotor AOX 1.
Por otro lado se describe una cepa hospedante, que se transforma con los vectores antes mencionados. Cabe mencionar en especial la cepa X-33 de Pichia pastoris transformada con el vector pHAP10-3.
Se describe también un vector que contiene el cassette de expresión completo de la pHAP 10-3, que consta fundamentalmente del promotor AOX 1, del factor \alpha del Saccharomyces cerevisiae, que en un marco de lectura correcto está detrás del gen diana de la SEQ ID NO: 5 de codón optimizado y clonado con el péptido de señal, que codifica a la fosfatasa alcalina muy activa, y de la región AOX 1 de terminación de la transcripción (ver figura 3). Cabe mencionar en especial el vector pHAP 10-3/9K, que está formado por el vector pPIC9K (producto comercial de Invitrogen) y el cassette de expresión del pHAP 10-3, incluido el gen sintético de la SEQ ID NO: 5.
Los vectores pHAP 10-3 y pHAP 10-3/9K son relevantes por igual, ya que el clon resultante de la producción contiene copias de ambos vectores.
Se describe también una cepa hospedante, que se transforma con el vector pHAP10-3/9K. Sin embargo, en el sentido de la invención son también apropiados otros vectores y cepas, que los expertos ya conocen, por ejemplo los vectores YES, pYD1, pTEF 1/ZEO (Invitrogen) y las cepas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica y en especial la Pichia pastoris X-33. Se transforma en particular la cepa X-33 de la Pichia pastoris con el vector pHAP10-3/9K.
Se describe además un procedimiento para la obtención de una fosfatasa alcalina eucariota muy activa por expresión de la proteína en una cepa hospedante, que se ha transformado con uno o varios vectores de la invención, en especial con el vector pHAP10-3 o con el vector pHAP10-3/9K. Las cepas de Pichia pastoris, transformadas con los vectores publicados, son especialmente preferidas para el procedimiento de la invención. Es especialmente preferida la cepa X-33 de la Pichia pastoris, que se haya transformado con un vector pHAP 10-3 y un vector pHAP 10-3/9K.
Figuras
Figura 1
Mapa de plásmidos del vector de expresión pHAP-1 con el gen de bIAPII en el pICZ\alphaA (Invitrogen).
Figura 2
Mapa de plásmidos del vector de expresión pHAP10-3 con el gen sintético en el pPIC9K (Invitrogen).
Figura 3
Mapa de plásmidos del vector de expresión pHAP10-3/9K con el gen sintético en pPIC9K (Invitrogen).
Abreviaturas
YPD: peptona-dextrosa de levadura
YPDS: peptona-dextrosa-sorbita de levadura
BMGY: medio tamponado de complejo de glicerina
BMMY: medio tamponado de complejo de metanol.
Ejemplo 1
Clonación del gen bIAPII
En primer lugar se dota al gen bIAPII correspondiente a la SEQ ID NO: 1 (EP 0 955 369; Manes y col., J. Biol. Chem. 273, nº 36, 23353-23360, 1998) mediante una reacción PCR y la elección de un cebador adecuado de la SEQ ID NO: 2 y 3 en sentido ascendente (upstream) y descendente de los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción idóneas para la Pichia pastoris para la clonación en los vectores de expresión. Por tanto, en sentido ascendente se inserta el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción para la EcoRI y en sentido descendente (downstream) el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción Asp718 I.
Después se corta el fragmento de la PCR con EcoRI y con Asp718 I (Roche Diagnostics GmbH), se aísla de nuevo (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen) y a continuación se liga a un fragmento linealizado con EcoRI y Asp718 I (Roche Diagnostics GmbH) y aislado (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen) del vector de expresión pPICZ\alphaA (Invitrogen). En este vector, el gen bIAPII está bajo el control del promotor AOX 1 (promotor de la alcoholoxidasa I de la Pichia pastoris, inducible con metanol) y se clona en un marco de lectura correcto detrás del péptido de señal del factor alfa del Saccharomyces cerevisiae. A continuación se analiza el fragmento de gen así insertado mediante un análisis de restricción y secuenciación, para determinar si existe una secuencia de bases impecable. El vector de expresión así formado, que contiene al gen bIAPII, que codifica a la fosfatasa alcalina eucariota muy activa, se llama pHAP-1 (ver figura 1).
Transformación del pHAP-1 en la Pichia pastoris
Para la transformación del pHAP-1 en la cepa X-33 de la Pichia pastoris y posterior integración en el genoma se linealiza en primer lugar el vector con SacI. La transformación se realiza mediante electroporación en el aparato Gen Pulser II (Biorad).
Para ello se inocula una colonia de la cepa de tipo salvaje de Pichia pastoris en 5 ml del medio YPD (Invitrogen) y se incuba a 30ºC durante una noche, con agitación. Seguidamente se inocula el cultivo de la noche en proporción 1:2000 en 200 ml de medio YPD fresco (Invitrogen) y se incuba a 30ºC durante una noche con agitación, hasta alcanzar una densidad óptica OD_{600} de 1,3-1,5. Se centrifugan las células (1500 rpm/5 minutos) y se suspende de nuevo el culote en 200 ml de agua estéril, enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células (1500 rpm/5 minutos) y se suspenden de nuevo en 100 ml de agua estéril, enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células, se suspenden de nuevo en 10 ml de sorbita 1M (ICN) enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células, se suspenden de nuevo en 0,5 ml de sorbita 1M (ICN) enfriada con hielo (0ºC). Se mantienen las células así obtenidas sobre hielo y se utilizan de inmediato para la transformación.
Se tratan 80 \mul de las células con 1 \mug del DNA del vector pHAP-1 linealizado y se transfiere la totalidad de la mezcla a una cubeta de electroporación enfriada con hielo (0ºC) y se incuba sobre hielo durante 5 minutos más. A continuación se transfiere la cubeta al aparato Gen Pulser II (Biorad) y se realiza la transformación a 1 kV, 1 k\Omega y 25 \muF. Después de la electroporación se trata la mezcla con 1 ml de sorbita 1 M (ICN) y después se extienden de 100 a 150 \mul sobre una placa de YPDS-agar (Invitrogen) con 100 \mug/ml de Zeocina® (Invitrogen). Luego se incuban las placas a 30ºC durante 2-4 días.
Se inoculan los clones en placas con retícula de MD (= minimal dextrose) y se siguen analizando. Se sacan los clones que han crecido, se suspenden de nuevo en 20 \mul de agua estéril, se disgregan con 17,5 U de Lyticase (Roche Diagnostics GmbH) (37ºC, 1 hora) y mediante la PCR se analiza directamente si ha sido correcta la integración del bIAPII - cassette de expresión.
Los clones que, durante la transformación, han integrado el cassette de expresión completo en el genoma se utilizan seguidamente para los ensayos de expresión.
Expresión de la fosfatasa alcalina muy activa
Se inoculan los clones positivos en 3 ml de medio BMGY (Invitrogen) y se incuban a 30ºC durante una noche con agitación. A continuación se determinan las OD a 600 nm y después se inoculan en 10 ml de medio BMMY (Invitrogen), hasta que se obtiene una OD_{600} de 1. El medio BMMY (Invitrogen) contiene metanol (Mallinckrodt Baker B.V.), que induce la expresión de la fosfatasa alcalina muy activa a través del promotor AOX 1.
Los matraces de agitación se incuban a 30ºC con agitación, se sacan muestras cada 24 horas, se determina la OD_{600}, se realiza un ensayo de actividad con la expresión de la fosfatasa alcalina muy activa y se realimenta en cada caso con metanol del 0,5% (Mallinckrodt Baker B.V.) para la inducción posterior. Los ensayos de expresión duran 96 horas.
Ejemplo 2
Ensayo de la actividad de la fosfatasa alcalina muy activa
Del cultivo de expresión del ejemplo 1 se toman en cada caso 500 \mul, se determina la OD_{600} y se centrifugan las células. Se guarda el líquido sobrenadante y el culote de las células se suspende de nuevo en una cantidad de Y-PER™ (de 50 a 300 \mul, Pierce), que depende de la OD_{600}, para efectuar la lisis y se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se centrifuga (15000 rpm/5 minutos) el lisado para separar los fragmentos (cascotes) celulares y se trasvasa el líquido sobrenadante a un reactor limpio. Para el ensayo de actividad se emplean 5 \mul del lisado.
El ensayo de actividad se basa en el principio siguiente:
fosfato de 4-nitrofenilo + H_{2}O \xrightarrow{AP} 4-nitrofenol + P_{i}
Se mide el aumento de absorción a 405 nm.
Se tratan 3 ml de tampón de dietanolamina (1 mol/l de dietanolamina (Merck), de pH 9,8, 0,5 mmoles/l de MgCl_{2} (Riedel de Haen) con 50 \mul de una solución de fosfato de 4-nitrofenilo (0,67 moles/l de fosfato de 4-nitrofenilo, sal Na (Roche Diagnostics GmbH)) y se mantiene la mezcla a 37ºC, constante. A continuación se inicia la reacción con la adición de 5 \mul de lisado y se determina el cambio de absorción a 37ºC durante 3 minutos y a partir de él se calcula el valor \DeltaE/min.
La actividad se calcula con arreglo a la fórmula siguiente:
actividad = \frac{3,10}{\varepsilon \ x \ 0,005 \ x \ l} \ x \ \Delta \ E/min \ x \ \frac{1}{factor \ x} [U/ml \ de \ solución \ de \ muestra]
\varepsilon = 18,2 [l x mmol^{-1} x cm^{-1}]
factor x = factor de concentración después de la disgregación celular.
De modo similar se determina la actividad del líquido sobrenandante del medio de los cultivos de expresión. También en este caso se inicia la reacción con 5 \mul del líquido sobrenadante, pero se añade además en cada caso ZnCl_{2} 0,5 mM. El cálculo se realiza en tal caso sin el factor x.
Ejemplo 3
Clonación del fragmento de la PCR de la síntesis del gen
Se corta el fragmento de la PCR con EcoRI y Asp718 (Roche Diagnostics GmbH), se aísla de nuevo (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen) y después se liga a un fragmento linealizado con EcoRI y Asp718 (Roche Diagnostics GmbH) y aislado (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen) del vector de expresión pPICZ\alphaA (Invitrogen). En este vector, el gen sintético se halla bajo el control del promotor AOX 1 (promotor de la alcoholoxidasa 1 de la Pichia pastoris, inducible con metanol (Mallinckrodt Baker B.V.)) y se clona en el marco de lectura correcto detrás del péptido de señal del factor \alpha del Saccharomyces cerevisiae. A continuación se investiga el fragmento de gen así insertado mediante análisis de restricción y secuenciación para comprobar si la secuencia de bases es impecable. El vector de expresión resultante, que contiene un gen sintético que codifica a la fosfatasa alcalina eucariota muy activa, se llama pHAP10-3 (ver figura 2).
Transformación del pHAP10-3 en la Pichia pastoris
Para la transformación del pHAP10-3 en la cepa X-33 de la Pichia pastoris y posterior integración en el genoma se linealiza en primer lugar el vector con SacI (Roche Diagnostics GmbH). La transformación se realiza mediante electroporación en el Gen Pulser II (Biorad). Para ello se inocula una colonia de Pichia pastoris en 5 ml del medio YPD (Invitrogen) y se incuba a 30ºC durante una noche con agitación. Seguidamente se inocula el cultivo de la noche en proporción 1:2000 en 200 ml de medio YPD fresco (Invitrogen) y se incuba a 30ºC con agitación durante una noche, hasta alcanzar una OD_{600} de 1,3 a 1,5. Se centrifugan las células (1500 rpm/5 minutos) y se suspende de nuevo el culote en 200 ml de agua estéril, enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células (1500 rpm/5 minutos) y se suspenden de nuevo en 100 ml de agua estéril, enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células, se suspenden de nuevo en 10 ml de sorbita 1M (ICN) enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células, se suspenden de nuevo en 0,5 ml de sorbita 1M (ICN) enfriada con hielo (0ºC). Se mantienen las células así obtenidas sobre hielo y se utilizan de inmediato para la transformación.
Se tratan 80 \mul de las células con 1 \mug del DNA del vector pHAP10-3 linealizado y se transfiere la totalidad de la mezcla a una cubeta de electroporación enfriada con hielo (0ºC) y se incuba sobre hielo durante 5 minutos más. A continuación se transfiere la cubeta al aparato Gen Pulser II (Biorad) y se realiza la transformación a 1 kV, 1 k\Omega y 25 \muF. Después de la electroporación se trata la mezcla con 1 ml de sorbita 1 M (ICN) y después se extienden de 100 a 150 \mul sobre una placa de YPDS-agar (Invitrogen) con 100 \mug/ml de Zeocina® (Invitrogen). Luego se incuban las placas a 30ºC durante 2-4 días.
Se inoculan los clones en placas con retícula de MD (= minimal dextrose) y se siguen analizando. Se sacan los clones que han crecido, se suspenden de nuevo en 20 \mul de agua estéril, se disgregan con 17,5 U de Lyticase (Roche Diagnostics GmbH) (37ºC, 1 hora) y mediante la PCR se analiza directamente si ha sido correcta la integración del AP - cassette de expresión.
Los clones que, durante la transformación, han integrado el cassette de expresión completo en el genoma se utilizan seguidamente para los ensayos de expresión.
Expresión de la fosfatasa alcalina muy activa
Se inoculan los clones positivos en 3 ml de medio BMGY (Invitrogen) y se incuban a 30ºC durante una noche con agitación. A continuación se determinan las OD a 600 nm y después se inoculan en 10 ml de medio BMMY (Invitrogen), hasta que se obtiene una OD_{600} de 1. El medio BMMY (Invitrogen) contiene metanol (Mallinckrodt Baker B.V.), que induce la expresión de la fosfatasa alcalina muy activa a través del promotor AOX 1.
Los matraces de agitación se incuban a 30ºC con agitación, se sacan muestras cada 24 horas, se determina la OD_{600}, se realiza un ensayo de actividad con la expresión de la fosfatasa alcalina muy activa y se realimenta en cada caso con metanol del 0,5% (Mallinckrodt Baker B.V.) para la inducción posterior. Los ensayos de expresión duran 96 horas.
Ensayo de la actividad de la fosfatasa alcalina muy activa
Del cultivo de expresión se toman en cada caso 500 \mul, se determina la OD_{600} y se centrifugan las células. Se guarda el líquido sobrenadante y el culote de las células se suspende de nuevo en una cantidad de Y-PER™ (de 50 a 300 \mul, Pierce), que depende de la OD_{600}, para efectuar la lisis y se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se centrifuga (15000 rpm/5 minutos) el lisado para separar los fragmentos (cascotes) celulares y se trasvasa el líquido sobrenadante a un reactor limpio. Para el ensayo de actividad se emplean 5 \mul del lisado.
El ensayo de actividad se realiza del modo descrito antes.
Ejemplo 4
Incremento de la potencia de expresión mediante la transformación múltiple
Los mejores clones de los ensayos de expresión de preparan de nuevo para la electroporación, tal como se ha descrito antes, y se transforman de nuevo con 1 \mug de DNA del vector pHAP 10-3 linealizado y se extiende la mezcla de la transformación en placas de agar-YPDS (Invitrogen) con 1000 - 2000 \mug/ml de Zeocina® (Invitrogen). De este modo se eleva de tal manera la presión de selección que solamente pueden crecer los clones que hayan integrado en el genoma varias copias del vector de expresión pHAP10-3 y por tanto también varias copias del gen de resistencia correspondiente (en este caso a la Zeocina®). La proteína de resistencia a la Zeocina® es el producto del gen de la bleomicina del Streptoalloteichus hindusstanus (Chalmels, T. y col., Curr. Genet. 20, 309-314, 1991; Drocourt, D. y col., Nucleic Acid Research 18, 4009, 1990), que fija a la Zeocina en una proporción estequiométrica y, de este modo, confiere a las células la resistencia a la Zeocina®. Cuanto mayor es la concentración de Zeocina® en las placas de agar-YPDS, tanta más proteína de resistencia tendrá que generar la célula para fijar cuantitativamente la Zeocina® y de este modo permitir el crecimiento. Esto es posible entre otros cuando se integran múltiples copias del gen de resistencia en el genoma. Se inoculan los clones del modo descrito antes en placas de retícula-MD y se comprueban de nuevo del modo antes descrito mediante análisis de PCR si ha sido correcta la integración del cassette de expresión-haAP. A continuación se ensaya la actividad de la haAP de estos clones del modo antes descrito.
Ejemplo 5
Incremento de la potencia de expresión con el uso de una segunda presión de selección
Un aumento de la concentración de la Zeocina® por encima de 2000 \mug/ml no conduce a una mejor potencia de expresión de la fosfatasa alcalina muy activa. Para seguir elevando en los clones de expresión el número de copias del gen de la SEQ ID NO: 5, que codifica a la fosfatasa alcalina muy activa y se ha optimizado en el codón para la expresión en levaduras, se selecciona la integración de vectores adicionales de expresión en el genoma de los clones de expresión obtenidos en los ejemplos 3 y 4 con la máxima potencia de expresión mediante una segunda presión de selección, con preferencia con el G418 (Roche Diagnostics GmbH). A tal fin se aísla la totalidad del cassette de expresión de pHAP10-3, que consta del promotor AOX 1, el péptido de señal del factor alfa del Saccharomyces cerevisiae, el gen de codón optimizado para la fosfatasa alcalina muy activa de la SEQ ID NO: 5 y la región AOX 1 de terminación de la transcripción, mediante una reacción PCR con el cebador elegido oportunamente y se clona en el vector pPIC9K del modo ya descrito antes, seleccionándose su integración en el genoma de la Pichia pastoris a través del G418 (Roche Diagnostics GmbH). Los cebadores se representan en las secuencias SEQ ID NO: 34 y 35.
Se analiza la mezcla de la PCR por electroforesis a través de gel de agarosa, se aísla el fragmento de gen del tamaño esperado (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen), se corta después con SacI y NotI (Roche Diagnostics GmbH), seguidamente se aísla de nuevo del gel de agarosa (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen) y se liga a un fragmento de vector de pPIC9K también linealizado con SacI/NotI (Roche Diagnostics GmbH) y aislado. De este modo se garantiza que se dispone en el pPIC9K de un cassette de expresión de pHAP10-3 que en su conjunto es idéntico. Se analiza el fragmento insertado por análisis de restricción y secuenciación con las regiones adyacentes. El vector de expresión obtenido se llama pHAP10-3/9K (ver figura 3).
Se preparan los clones de la mayor potencia de expresión de la haAP por transformación múltiple con pHAP10-3 (resistencia a la Zeocina) del modo antes descrito para la electroporación y se transforman del modo antes descrito con 1 \mug del fragmento del vector pHAP10-3/9K linealizado con SacI (Roche Diagnostics GmbH). Después se guarda la mezcla de la transformación de 1 a 3 días a 4ºC en sorbita 1 M (ICN) (para que se forme la resistencia al G418), se extienden de 100 a 200 \mul en placas YPD (Invitrogen) con 1, 2 o bien 4 mg/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH) y se incuban de 3 a 5 a 30ºC. Se investigan los clones resultantes del modo ya descrito antes mediante el ensayo de actividad para determinar si existe una mayor expresión de la fosfatasa alcalina eucariota muy activa.
<110> Roche Diagnostics GmbH
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<120> Expresión de fosfatasa alcalina en levadura
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<130> 5387/00/
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<140>
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<141>
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<160> 38
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<170> PatentIn ver. 2.1
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<211> 1476
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<212> DNA
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<213> bovino
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1
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36 
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gcgcgcctag gagatctaac atccaaagac g 
\hfill
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cgcgcgctag cggatccgca caaacgaag 
\hfill
29 
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<212> PRT
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<213> Saccharomyces cerevisiae 
\newpage
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<400> 36
\hskip0.5cm
31 
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Saccharomyces cerevisiae 
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\sa{Leu Ile Pro Ala}
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Saccharomyces cerevisiae 
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<400> 38
\hskip0.4cm
32

Claims (5)

1. Procedimiento para la obtención de una fosfatasa alcalina eucariota en células de levadura que consta de los pasos siguientes: a) clonación de una secuencia genética en diversos vectores, b) transformación de la levadura, c) expresión y d) purificación de la fosfatasa alcalina, caracterizado porque
- un primer vector presenta un gen de resistencia contra un primer marcador de selección,
- se seleccionan los transformantes, que han integrado el gen de resistencia y la secuencia genética en el genoma, mediante el cultivo en un medio nutritivo que tiene una baja concentración del primer marcador de selección,
- se aumenta el número de copias del gen por transformación múltiple, seleccionándose los transformantes múltiples por cultivo en un medio nutritivo de mayor presión de selección,
- se añade un segundo vector que, además de la secuencia genética, contiene un gen de resistencia contra un segundo marcador de selección,
- se aumenta el número de copias del gen por transformación múltiple con el segundo vector, seleccionándose los transformantes múltiples por cultivo en un medio nutritivo de mayor presión de selección y
- se seleccionan los clones que han integrado de forma estable en su genoma las múltiples copias de la secuencia genética y de los genes de resistencia al marcador de selección.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la secuencia de gen corresponde a la SEQ ID NO: 1.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la secuencia de gen corresponde a la SEQ ID NO: 5.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que se emplean células de levadura metilotrófica.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que como cepa de la levadura se emplea la Pichia pastoris o la Hansenula polymorpha.
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