CZ307995A3 - Ligands for flt3 receptors - Google Patents

Ligands for flt3 receptors Download PDF

Info

Publication number
CZ307995A3
CZ307995A3 CZ953079A CZ307995A CZ307995A3 CZ 307995 A3 CZ307995 A3 CZ 307995A3 CZ 953079 A CZ953079 A CZ 953079A CZ 307995 A CZ307995 A CZ 307995A CZ 307995 A3 CZ307995 A3 CZ 307995A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
flt3
cells
csf
polypeptide
cell
Prior art date
Application number
CZ953079A
Other languages
English (en)
Inventor
Stewart D Lyman
M Patricia Beckmann
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27556997&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ307995(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/243,545 external-priority patent/US5554512A/en
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of CZ307995A3 publication Critical patent/CZ307995A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/202—IL-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2046—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká savčích f1t3-ligandú, nukleových kyselin, kódujících takové ligandy, způsobu produkce rekombinantních f1t3-ligandú, farmaceutických kompozic, obsahujících takové ligandy a jejich použití v různých terapiích.
fa λ
Dosavadní stav techniky
Krevní buňky pocházejí z hematopoietických kmenových 1 buněk, které se dělí do určitých rodin, tj. erythroidy, megakaryoty, granulocyty, monocyty a lymfocyty. Cytokiny, které stimulují proliferaci a maturaci buněčných prekurzoru jsou nazývány kolonie stimulující faktory--(CSF) . Některé-CSF jsou produkovány T-lymfocyty, zahrnujícími inter1eukin-3 (IL-3), graňulocyt-monocyt CSF (GM-CSF), granulocytový CSF (G-CSF) a monocytový CSF (M-CSF). Tyto CSF ovlivňují jak maturované buňky tak kmenové buňky. Dosud nebyly objeveny žádné faktory, které by byly schopny převážně' stimulovat kmenové buňky.
Tyrosin kinásové receptorý (TKR) jsou receptorý růstového faktoru, které regulují proliferaci a diferenciaci mnoha buněk (Yarden Y. a Ullrich A. Annu, Rev, Biochem. 57, 443-478,.1988; a Cadega D.L. a Gill G.N. FASEB J. 6,
2332-2337, 1992). Určité. TKR působí v hematopoietickém systému. Například signalizací přes kolonie-stimulující faktor typu Ί (CSF-T), receptor c-fms reguluje přežívání, růst a diferenciaci monocytů (Stanley a spal., J.Cel 1.Biochem., 21, 1983). Steel faktor (SF, známý také jako růstový faktor obrovských buněk, faktor kmenových buněk nebo kit ligand), působením přes c-kit, stimuluje proiiferaci buněk jak v myeloidovém tak lymfoidním kompartmentu.
Flt3 (Rosner a spol. Oncogene, 6, 1641.-1650, 1991) a flk-2 (Matthews a spol., Cell, 65, 1143-1152, 1992) jsou variantní formy TKR, který je příbuzný c-fms a c-kit receptorúm. Flk-2 genový produkt je exprimován hematopoietickými a progenitorovými buňkami, zatímco flt3 genový produkt má obecnější tkáňovou distribuci. Flt3 a flk-2 receptorové proteiny jsou podobné pokud jde o aminokyselinovou sekvenci a mění se ve dvou aminokyselinových zbytcích v extracelulární doméně a rozcházejí v 31 aminokyselinové segmentu •umístěném bl í zko-C-konce (Lyman-a-spol. , Oncogene, 8, 815-822, 1993).
Flt3-ligand (flt3-L) byl shledán regulujícím růst a diferenciaci progenitorových a kmenových buněk a je pravděpodobně možné jeho klinické použití při léčbě hepatopoietických poruch, zejména aplastické anemie a myelodysplastických syndromů. Dále f1t3-L bude použitelný u allogenických, syngenických-nebo autologních transplantátů kostní dřeně u pacientů, kteří podstoupili cytoreduktivní
A terapie, jakož i buněčnou expanzi. Flt3-L bude také vhodný pro použití v genové terapii a mobilizaci systémů progenitorových a kmenových buněk.
Rakovina je léčena cytoreduktivními terapiemi, kterézahrnují podání ionizujícího záření nebo chemických toxinů, což- usmrcu.j e rychle se .děl. í.c.í. buňky. .Ve.dlejší účinky typicky vyplývají z cytotoxických účinků na normální buňky a může omezit použití cytoreduktivních terapií. Častým vedlejším účinkem je myelosuprese nebo poškození buněk kostní dřeně, které zvyšuje bílé a červené krevní krvinky a destičky. Výsledkem myelosuprese je, že se u pacienta vyvíjí cytopenie nebo deficit krvinek, což zvyšuje nebezpečí infekce a krvácení.
Cytopenie zvyšuje morbiditu, mortalitu a vede k poddávkování v léčbě rakoviny. Mnoho klinických hodnotitelů zkoušelo měnit režimy a průběh dávkování cytoreduktivni terapie pro zvýšení dávkování v terapii rakoviny, aby byloomezeno poškození kostní dřeně. Jeden pokus zahrnuje transplantování kostní dřeně nebo buněk periferní krve, ve kterých kostní dřeň nebo cirkulující hematopoietický progenitor nebo kmenové buňky jsou odstraněny před. cytoreduktivní terapií a pak reinfúzovány po terapii pro obnovu hematopoietické funkce. US patent č. 5199942, uvedený zde jako odkaz, popisuje metodu pro použití GM-CSF, IL-3, GM-CSF/IL-3 fuzních proteinů, erythropoietinu (EPO) a jejich kombinací v autologních transplantačních režimech.
Vysokodávková chemoterapie je terapeutickým přínosem, protože může produkovat zvýšenou četnost objektivní odezvy u pacientů s metastatickými rakovinami, ze jména'rakovinou prsu, v porovnáni se standardní dávkovou terapi í. Toto může vést. k prodloužené choroby prosté remisi i u některých .pacientů...se. — špatnou prognozou. Přesto je vysokodávková chemoterapie toxická a mnoho vzniklých klinických komplikací je spojeno s infekcemi, poruchami krváceni a jinými účinky spojenými s prodlouženými periodami myelosuprese.
Myelodysplastické syndromy jsou poruchy kmenových buněk charakterizované zhoršenou buněčnou maturací, progresivní pancytopenií a funkčními abnormalitami zralých buněk. Byly také charakterizovány různými stupni cytopenie, neúčinné erythropoi es is a myelopoiesis s buňkami kostní dřeně, které i ·~ —. · · -A A «Α «Λ Λ 1 « i Λ TTÍH, , I·/' ň I-) r·, A fV< Γ'ι Λ A Ί* I T
J 2> VJ Li ilUIWGlill iiCUVJ Vt pyx^vu
1/ f ďt· A fTX o i -r m n 1/ r t 1 ! 6 *> Π í Λ U X^· L *- UÍCJ, J x AU i i Cii U 4 morfologii. Benett a spol (Br.J.Haematól. 1982; 51:189-199) dělí tyto poruchy do pěti podtypu: refraktorní anemie, refraktorní anemie s kruhovitými sideroblasty, refraktorní anemie s přebytkem blastů, rekraftorní anemie s přebytkem blastů ve transformaci a chronická mye1ocytomonocytická leukemie. I když seu významného procenta těchto pacientu vyvíjí akutní leukemie, většina umírá na infekční nebo hemorrhagické komplikace. Léčba těchto syndromů s retinoidy, vitaminem D a cytarabinem nebyla úspěšná. Většina těchto pacientů je postarších a nejsou vhodnými kandidáty pro transplantaci kostní dřeně nebo agresivní antileukemickou .chemoterapii.,^....... .. . . _ _ .. , 'Aplas tická anemie je jinou chorobou, která je charakterizována selháním kostní dřené a nebezpečnou . pancytopenií. Na rozdíl od myelodysplastického syndromu je kostní dřeň acelulárni nebo hypocelulární v této chorobě. Současné léčby zahrnují transplantaci kostní dřeně z histokompatibilni ho dárce nebo imunosupresivní léčbu ant i thymocyt globulinem (ATG). Podobně jako. u myelodysplastického syndromu, většina pacientů postižených tímto syndromem je postarších a jsou nevhodní pro transplantaci kostní dřeně nebo pro agresivní antileukemickou chemoterapii. Mortalita u těchto pacientů je zvláště vysoká z důvodů infekčních nebo hemorrhagických komplikaci.
Anemie je běžná u pacientů se syndromem získané imunitní nedostatčnosti (AIDS). Anemie je obvykle nebezpečnější u pacientů se zidovudinovou terapií. Mnoho důležitých, retrovirálních činidel, proti infekčních látek a antineoplastik potlačuje erythropoi es is . Rekombinantní EPO byl zjištěn jako normalúizující pacientovy hematokritové a hemoglobinové hladiny, nicméně obvykle jsou vyžadovány velmi vysoké dávky. Růstový faktor, který stimuluje proliferaci erythroidové skupiny by měl být použit samotný nebo v kombinaci s EPO nebo jinými růstovými faktory pro léčbu takových pacientů a snížení počtu vyžadovaných transfuzí. Růstový faktor,který by také zvyšoval počet T buněk by mohl nalézt použití zejména u pacientů léčených na AIDS. .
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká biologicky aktivního f1t3-ligandu (flt3—L) jako izolovaného nebo homogenního proteinu. Dále je vynález řízen na izolované DNA, kódující flt3—L a na expresivní vektory, obsahující cDNA, kódující f1t3-L. V rozsahu tohoto vynálezu jsou hostitelské buňky, které byly trnsfektovány nebo transformovány s expresivnimi vektory, které obsahuji cDNA, kódující flt3-L a procesy pro produkci f1t3—L kultivací takových hostitelských buněk za podmínek, vedoucích k expresi f1t3-L.
Flt3—L může být použit pro přípravu farmaceutických' ..
’*«· kompozic pro použití v allogenních, syngenních nebo
Ί autologních transplantačních metodách. Farmaceutické kompozice mohou obsahovat řlt3—L samotný nebo v kombinaci s jinými růstovými faktory jako jsou interleukiny, faktory, stimulující kolonie, protein tyrosin kinásy a cytokiny.
Vynález zahrnuje metody použití f1t3-L kompozic v genové terapii a při léčbě pacientů postižených myelodysplastickým syndromem, aplastickou anemii, HIV infekcí (AIDS) a rakovinami jako je rakovina prsu, lymfom, rakovina malých plicnich buněk, násobný myelom, neuroblastom, akutní leukemie, testikulární nádory a rakovina vaječníkú.
Předložený vynález se také týká protilátek a zejména monoklonálních protilátek, které jsou imunoreaktivní s fIt3-L. Fuzní proteiny, obsahující rozpustný podíl flt3—L a konstatní doménu imunoglobu 1 i nového proteinu jsou také zahrnuty ve vynálezu.
Předložený vynález je také řízen na použití f1t3-L v postupech transplantace periferních krevních progenitorových nebo kmenových buněk. Typicky jsou periferní krevní progenitorové buňky nebo kmenové buňky odstraněny z pacienta před myelosupresivni cytoreduktivní terapií a pak znovu podány pacientovy současně, s .nebo^ po_ cy toredukt ývní terapii pro_ paralyzování myelosupresivních účinků takové terapie. Předložený vynález poskytuje použití účinného množství f1t3—L alespoň jedním z následujících způsobů: (i) flt3-L je podán pacientovi před odebráním progenitorových nebo kmenových buněk pro zvýšení nebo imobilizaci počtu takových obíhajících buněk;
(ii) po odebrání pacientových- progenitorových nebo kmenových buněk se f1t3—L použije pro expandování takových buněk ex vivo a (iii) f 113-L je podán pacientovi po transplantaci, odebraných progenitorových nebo kmenových buněk pro usnadnění jejich ujmutí. Transplantační metoda podle vynálezu dále zahrnuje použití účinného množství cytokinu v následné nebo současné kominaci s flt3-L. Takové cytokiny zahrnují, ale nejsou tak omezenyinterl eukiny (IL)IL-1, IL—2, IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7,.IL—8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 nebo IL-15, CSF vybraný ze skupiny, zahrnující G-CSF, GM-CSF, M-CSF nebo GM-CSF/IL-3 fuze nebo jiné růstové faktory jako je CSF-1, SF, EPO, leukémii inhibující faktor (LIF) nebo fibroblastový růstový faktor (FGF). Flt3-L je také vhodný stejným způsobem pro syngenní nebo allogenní transplantace.
Vynález dále zahrnuje expanzní media pro progenitorové nebo kmenové buňky, zahrnující buněčné růstové medium, autologní sérum a f1t3-L samotný nebo v kombinaci s cytokinem ze skupiny uvedené výše.
Vynálezdále zahrnuje použití flt3-L k expanzi progenitorových nebo kmenových buněk oddělených z pupeéníkové krve. Expanze může být provedena s flt3-L samotným nebo postupně nebo současně v kombinaci s cytokinem z výše uvedené skupiny.
Vynález dále zahrnuje použití flt3—L v genové terapii.
Flt3-L umožňuje proliferaci a kultivaci časných hematopoietických progenitorových nebo kmenových buněk, které mají být transfektovány exogenní DNA pro použití v genové terapii. Alternativně cDN.A kódující flt3—L může být y , transfektována do buněk za účelem konečného doručení jejího j , genového produktu do cílových buněk nebo tkáně. r -V
Dále vynález zahrnuje použití f 113-L pro stimulaci · produkce erythroidních buněk in vivo pro léčbu anemie. Takové,-.použití zahrnuje podání flt3-L pacientovi v případě takové - -j potřeby stimulace erythroidových buněk ve spojení nebo pocytoreduktivní terapii. Léčba také. zahrnuje současné .podání . . , . jiného růstového faktoru vybraného z cytokinů z výše uvedené skupiny. Preferované cytokiny pro použití v tomto léčení zahrnují EPO, 1-3, G-CSF a GM-CSF. Takové léčení je zejména . vhodné pro pacienty s AIDS a výhodně pro AIDS pacienty s AZT terapií.
Protože fit3-L stimuluje produkci kmenových buněk, mohou být jiné nehematopoietické kmenové buňky nesoucí flt3-L receptorv ovlivněny pomocí f113—L podle vynálezu. F113-L je, vhodný pro in vitro fertilizační postupy a může být použit in vivo při lečem stavů neplodnosti. Ve střevu je ÍIÍ3-L iigand vhodný pro léčení intestinálních poškození vzniklých z ozařováni nebo chemoterapie. Flt3-L může být také použit pro léčbu pacientů infikovaných virem lidské imunonedostatečnosti (HIV). Takové léčení by mělo zahrnovat podání flt3-L pro stimulaci in vivo produkce, jakož i ex vivo expanze, T buněk a erythroidních buněk .. Takové . ošetření může bránit nedostatku T buněk, zejména CD4-pozitivních T buněk a může zvyšovat pacientovu imunitní odezvu na virus, čímž se zlepšuje kvalita pacientova života. Flt3-L může být použit pro stimulaci kmenových buněk, což vede k vývoji vlasových folikul a napomáhá se tak růstu vlasů.
v
Dále může být f1t3-L navázán k.pevné fázové matrici a použit k afinitnímu čištění nebo dělení buněk, které exprimují flt3-L na svém.buněčném povrchu. Vynález.zahrnu je dělení buněk, majících f1t3—L receptor na svém povrchu ze směsi buněk v roztoku, které zahrnuje kontakt buněk ve směsi s kontaktním povrchem, majícím, na sobě flt3~L vázající molekulu.a oddělení kontaktního povrchu a roztoku.. Jakmile jsou odděleny, mohou být buňky expandovány ex vivo za použití f 113-L a podány pacientovi.
cDNA kódující myší flt3—L byla izolována a je popsána v SEQ ID NO:i. cDNA kódující lidský flt3—L byla také izolována a je popsána v SEQ ID NO:5. Tento objev cDNA, kódujících myší a lidský f1t3-L umožňuje konstrukci expresivních vektorů, obsahujících cDNA, kódující flt3-L; hostitelské buňky transfektované nebo transformované expresivními vektory: biologicky aktivní myší a lidský f1t3—L jako homogenní proteiny a protilátky imunoreaktivní s myším a lidským flt3—L, ’ Flt3-L je vhodný pro posílení, stimulaci, proliferaci buněk, exprimujících flt3—L receptor, zahrnujících ne-hematopoietické buňky. Protože f113'receptor je nacházen v mozku, placentě a tkáních nervového a hematopoietického původu, a jeho distribuce byla zjištěna ve varlatech, vaječnících, lymfatických žlázách, slinivce, thymu a fetálních játrech, je tak možná léčba různých stavů spojených s poškozením tkání. Pokud není uvedeno jinak, výhodná použití flt3-L jsou ta, která byla zde již uvedena!
Jak je zde použit, označuje výraz flt3-L rod polypeptidů, které se vážou a komplexují s flt3-L receptorem nalezeným na progenitorových a kmenových buňkách. Výraz flt3-L zahrnuje aminokyselinové sekvence 1 až 231 ze SEQ ID NO:6 jakož i takové proteiny, které mají vysoký stupeň podobnosti nebo vysoký stupeň identity s aminokyselinovou sekvencí l až 231 ze SEQ ID NO:2 nebo aminokyselinovou t ii-1 sekvencí 1 až 235 ze SEQ.ID NO:6, a tyto proteiny jsou biologicky aktivní a vážou flt3-L receptor. Dále výraz označuje biologicky aktivní genové produkty DNA ze SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID N0:5. Dále zahrnuje výraz flt3-L membránou vázané proteiny (které obsahují intracelulární region, 'F· membránový region a extracelulárni region), a rozpustné nebo zkrácené proteiny, které obsahuji v první řadě extracelulární část proteinu, uchovávají si biologickou aktivitu a jsou schopny být sekretovány. Specifické příklady takových rozpustných proteinů jsou ty, které zahrnují sekvence aminokyselin 28-163 ze SEQ ID NO:2 a aminokyseliny 28-160 z SEQ ID NO:6.
Výraz biologicky aktivní, týká—li se flt3-L znamená, že flt3—L je schopen se vázat k flt3. Alternativně biologicky aktivní znamená, že flt3—L je schopen předání stimulačního.
signálu buňce přes membránou váraný flt3.
Izolovaný znamená, Že flt3—L je'prostý spojení s jinými proteiny nebo polypeptidy, například jako produkt čištění rekombinantni hostitelské kultury nebo jako čištěný extrakt.
Flt3-L varianta jak je zde použito, znamená polypetid v podstatě hoologní k nativnímu f1t3-L, ale který má aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence nativního flt3-L (lidského, myšího nebo jiného savčího druhu) pro jednu nebo více deleci, inzercí nebo substitucí. Varianta aminokyselinové sekvence je výhodně alespoň asi z 80 % identická s nativní flt3-L aminokyselinovou sekvencí, ne j výhodně j i_ a 1 es poň z as i '90. ident i cká.. ..Procenta ident i ty - mohou být, například, stanovena porovnáním informace o sekvenci, za použiti GAP poči tácovéhoprogramu, verze 6.0 popsaného Devereuxem a spol. (Nud. Adds Ses. 1-2:387, 1984) a dostupného z University of Wisconsin Genetic.s Group (UWGCG).
GAP program využívá seřazovací metody Needlemana a Wunsche (J.Mol.Biol, 48:443, 1970) revidované. Smithem a Watermanem (Adv.Appl.Math 2:482, 1981). Preferované parametry pro GAP program zahrnují: (l) unary srovnávací' matrici '* (obsahující hodnotu 1 pro shody a 0 pro neshody) pro nukleotidy a hmotnostně srovnávací matrici podle Gribskova a Burgesse, Nud.Acíds Ses. 14:6745, 1986, jak popsali Schwartz a Dayhoff, vyd., Atlas of Protein Sequence and Structure,
National Biomedical Research Foundation, str.353-358, 1979;
(2)trestný bod pro každou mezeru a dalších 0,10 trestného bodu pro každý symbol v každé mezeře a (3) Žádný trestný bod pro konec mezer. Varianty mohou obsahovat konzervativně substituované sekvence, což znamená, že uvedený aminokyselinový zbytek je nahrazen zbytkem, majícím podobné fyziochemické charakteristiky. Příklady konzervativních substitucí zahrnují náhradu jednoho alifatického zbytku druhým jako Ile, Val, Leu nebo Ala vzájemné nebo náhrady jednoho polárního zbytku jiným.
jako mezi Lys a'Arg; Glu a Asp; nebo Gin a Asn. Jiné takové konzervativní substituce, napřík1 ad náhrady celých regionu, majících podobné charakteristiky hydrofóbicity, jsou dobře známé. Přirozeně se vyskytující flt3—L varianty jsou také zahrnuty do vynálezu. Příklady takových variant jsou proteiny, které vznikají z alternativ mRNA stři.hú nebo z proteolytického štěpení flt3—L proteinu, kde flt3—L vazebná vlastnost' je zachována. Alternativní střih mRNA muže vést ke. zkrácenému, ale biologicky aktivnímu fl.t3-L proteinu, jako je například přirozeně se vyskytující rozpustná forma proteinu. Variace,
I které lze přiřadit proteolýze zahrnují, například, rozdíly v
N~ nebo C- konci po expresi v různých typech hostitelských · buněk, způsobené proteolytickým odstraněním jedné nebo více
terminál nich aminokyselin z fXt3—L proteinu (obecně od 1 do 5 íí '·.
koncových aminokyselin).
***· . · * y
Výraz, autologni transplantace je popsán v US patentu č.
5199942, který je zde zahrnut jako odkaz. Stručně, výraz znamená způsob provedení autologni transplantace progenitorových nebo kmenových buněk, zahrnující: (i) oddělení ' ·?Λ.
hematopoietických buněk nebo kmenových buněk od pacienta před cytoreduktivní terapií; (2) expanzi, hematopoiet ických.
progenitorových buněk nebo kmenových buněk ex vivo s flt3-L pro poskytnutí celulárního přípravku, obsahujícího zvýšený I počet hematopoietických progenitorových buněk nebo kmenových buněk a (3) podání buněčného přípravku pacientovi ve spojení s nebo po cytoreduktivní terapií. Progenitorové a kmenové buňky mohou být získány z periferní krve. nebo explantátů kostní dřené. Popřípadě může být jeden nebo více cytokinů, vybraných ze skupiny uvedené výše, kombinován s f1t3—L za účelemproliferace určitých typů hematopoietických buněk nebo pro ovlivnění buněčné funkce výsledné pro 1 iferované hematcpcietické buněčné populace. Vzhledem k uvedenému jsou tedy preferovány SF, IL-1 , IL-3, EPO, G-CSF, GM-CSF a GM-CSF/IL-3 fúze a zejména jsou preferovány G-CSF, GM-CSF a GM-CSF/IL-3 fúze. Výraz alogenní transplantace označuje metodu, ve které se buňky kostní dřeně nebo periferní krevní progenitorové buňky nebo kemnové buňky odstraní ze savce a podají jinému savci téhož druhu. Výraz syngenní transplantace znamená transplantaci mezi geneticky identickými savci.
Transplantační metoda podle vynálezu popsaná výše popřípadě zahrnuje předcházející in vivo postup, zahrnující „podání„f 1 t3-L samotného. nebo..v. následné, či -současné-kombinacv· s recriutmentem růstového faktoru pacientovi pro odvedení hematopoietických buněk do periferní krve před jejich odebráním. Vhodné recruitment faktory jsou uvedeny výše a preferovanými recruitment faktory jsou flt3—L, SF, IL-1 a IL-3.
Metoda podle vynálezu popsaná výše popřípadě zahrnuje následující in vivo postup, zahrnující podání-flt3-L samotného nebo následně nebo v kombinaci s růstovým faktorem transplantátu pacientovi po transplantaci celulárního preparátu pro usnadněni uchycení a rozšíření proliferace transplantovaných hematopoietických progenitorových nebo kmenových buněk z celulárního preparátu. Vhodné transplantátové faktory jsou uvedeny výše a v preferovaném provedení jsou takovými faktory GM-CSF, G-CSF, IL-3, IL-1, EPO a GM-CSF/IL-3 fúze.
Vynález dále zahenuje expanzní media progenitorových nebo kmenových buněk, obsahující buněčné růstové medium, autologní sérum a f1t3-L samotný nebo v kombinaci s cytokinovým růstovým faktorem jak je uveden výše.Preferované růstové faktory jsou SF, GM-CSF, IL-3, IL-1, G-CSF, EPO a GM-CSF/IL-3 fúze.
Zejména může být fit3—L použit pro stimulaci proliferace hematopoietických a nehematopoietických kmenových buněk.
Taková stimulace je přínosem,jestliže se v takové tkáni objevilo specifické poškození. Jako takový může být flt3—L vhodný při léčení neurtologického poškození a může být * růstovým faktorem pro nervové buňky. Je pravděpodobné, že t
j flt3-L by mohl být použit v in vitro oplodňovacích procesech a pravděpodobně použit in vivo v léčbě stavů neplodnosti. Flt3-L by mohl být vhodný při léčbě intestinálních poškození vzniklých následkem ozařování nebo chemoterapie. Protože f1t3-L receptor je distribuován na kmenových buňkách, což vede toto k vývoji vlasových folikulí, mohl by flt3-L být vhodný :fc.
pro promotováni růstu vlasů.'
Protože flt3-L byl zjištěn jako stimulující proliferaci T buněk i erythrocytů (viz příklady, infra). nachází flt3-L použití při léčbě pacientů infikovaných virem lidské imunonedostatečnosti (HIV). Takové léčení by mělo zahrnovat ' iř* podání flt3-L pro stimulaci i.n vivo produkce, jakož i ex vivo t . . expanze. Dále může f1t3—L. bránit .nedostatku CD4 + T buněk.
Taková léčba může zvyšovat nebo udržovat, pacientovu imunitní odezvu proti viru a tím zlepšovat nebo udržovat kva1 itupacientova života. Dále by takové in vivo léčení mohlo stimulovat buňky erythroidové rodiny a tím zlepšovat { pacientovy hematokritové a hemoglobinové hladiny. Flt3-L může
I být podán v tomto způsobu samotný nebo v následné nebo současné kombinaci s cytokiny, vybranými ze skupiny uvedené výše.
Flt3-L je použitelný v genové terapii pro svoji specifitu pro prošenitorové a kmenové buňky. Genová terapie zahrnuje podání exogenní DNA-transfektovaných buněk hostiteli, kde jsou ponechány se ujmout. Viz např. Boggs, International J.Cell Cloning, 8:80-96(1990); Kohn a spol., Cancer Invest. 7(2):179-192 (1989); Lehn, Bone Marrow Transpl.,
5:287-293(1990) a Verma, Scientific American, str.
68-84(1990). Použití metod genové terapie známých v oboru, metoda přeneseni genu do savce, zahrnuje stupně a) kultivace časných hematopoietických buněk v mediu, obsahujícím f1t3L . samotný nebo v následné nebo současné kombinaci s cytokinem vybraným ze skupiny uvedené výše; (b) transfekci kultivovaných buněk ze stupně (a) exogenním genem a (c) podání transfektovaných buněk, savci .· V této-metodě-je-nová metoda·'· transfekce progenitorových nebo kmenovývh buněk genem, zahrnující stupně (a) a (b) výše.· Dále použitím stejných nebo podobných metod muže být cDNA, kódující f1t3—L transfektována do takových buněk pro dodání, které dodají flt3-L genový produkt 1 cílové tkáni.
Příklad.1 popisuje konstrukci nového flt3:Fc fuzního proteinu použitého ve screeningu flt3-L. Jiné· prot i látkové Fc regiony mohou nahradit lidský IgGl Fc region popsaný v příkladu 1. Jiné vhodné Fc regiony jsou ty, které se mohou vázat s vysokou afinitou k proteinu A nebo proteinu G a zahrnují Fc region lidského IgGl nebo fragmentů lidského nebo myšího IgGl Fc regionu, např. fragmenty, obsahující alespoň pantový region takže se budou vytvářet mezi řetězcové disulfidové vazby. flt3Fc fuzní protein má tu výhodu, že je snadno čist itelný. Dále disulfidové vazby tvoří mezi Fc regiony dva oddělené fuzní proteinové řetězce, vytvářející dimery. Dimerni flt3:Fc receptor byl zvolen pro potenciální výhodu vyšší afinity vyzby fIt3—L vzhledem k možnosti, že vyhledávaný ligand by mohl být multimerní.
Jak je popsáno výše, aspektem vynálezu jsou rozpustné flt3—L polypeptidy. Rozpustně f1t3-L polypeptidy zahrnují všechny části extracelulární domény nativního flt3—L, ale postrádají transmembránový region, který by mohl vyvolat retenci poiypeptidu na buněčné membráně. Rozpustné flt3-L polypeptidy výhodně obsahují nativní (nebo heterologní) signální peptid, když jsou na počátku syntetizovány pro prómotování sekrece, ale signální peptid se odštěpí po sekreci flt3-L z buňky. Rozpustné flt3-L polypeptidy zahrnuté vynálezem si zachovávají schopnost vázat f1t3 receptor. Ve skutečnosti rozpustný flt3-L může také obsahovat část transmembránového regionu nebo část cytoplasmické domény nebo jiných sekvencí s tou podmínkou, že rozpustný flt3-L protein může být sekretován.
$
Rozpustný flt3—L může být identifikován (a odlišen od svých nerozpustných na membráně navázaných protějšků) oddělením intaktních buněk, které exprimují požadovaný protein z kultivačního media, např. odstředěním, a vyhodnocením media (supernatantu) na přítomnost požadovaného proteinu, přítomnost’· flt3-L v mediu znamená, že protein byl sekretován z buněk a toto je rozpustná forma požadovaného proteinu.
Rozpustné formy flt3-L vykazují mnoho výhod proti nativnímu vázanému flt3-L proteinu. Čištění proteinů z rekombinantních hostitelských buněk je snadné, protože rozpustné proteiny jsou sekretovány z buněk. Dále jsou rozpustné proteiny obecně mnohem vhodnější pro intravenozní podání.
Príklady’rozpustných f 113-L polypeptidů zahrnují ty, .rp í
ř.
£ které obsahují podstatnou část extracelulární domény nativního o α γ v< -1 zahrnují aminokyseliny 28.až 188 ze SEQ ID N0:2 nebo aminokyseliny 28 až 182 ze SEQ ID N0:6. Navíc, zkrácené rozpustné flt3-L proteiny, obsahující méně než celou extracelulární doménu, jsou zahrnuty ve vynálezu. Takové zkrácené rozpustné proteiny jsou reprezentovány sekvencí aminokyselin 28-163 ze SEQ ID N0:2 a aminokyselin 28-160 ze SEQ ID NO:6. Je-li na počátku exprímován v hostitelské buňce, muže rozpustný f1t3-L dále obsahovat jeden z heterologních signálních peptidu popsaných dále, který je funkční v použitých hostitelských buňkách. Alternativně muže protein obsahovat nativní signální peptid, takže savčí flt3-L obsahuje .aminokyseliny. .L_až„1.88 ,ze„f 1 t3-L2^ne.bo _ami.nokys.el i.ny._l.»a.ž^.l 82^ ze SEQ ID ΝΌ:6. V jednom provedení vynálezu byl rozpustný f 113—L exprímován jako fuzní. protein, obsahující (od N- do' C-konce) kvasinkový a faktor signální peptid, FLAGR peptid popsaný dále a v US patentu č. 5011912 a rozpustný flt3—L, obsahující aminokyseliny 28 až 188 ze SEQ ID N0:2. Tento rekombinantní fuzní protein, je exprimován;v a sekretován z kvas inkových. buněk.. FLAGR pept.id usnadňuje čištění proteinu a následné, může. bý.t štěpen z . rozpustného' flt.S-L-za použití ' mukosální enterokinásy. Izolované DNA sekvence kódující flt3-L proteiny jsou zahrnuty ve vynálezu.
Zkrácený flt3-L, zahrnující rozpustné polypeptidy, může být připraven jakoukoliv z běžných technik. Požadovaná FNA sekvence může být chemicky syntetizována za použití technik známých per se. DNA fragmenty mohou být také produkovány štěpením restrikční endonuk1eásou úplné délky klonované DNA sekvence a izolovány elektroforézou na agarosovém gelu. Linkery, obsahující restrikční endonukleásová místa štěpení (místo) mohou být použity pro inzert požadovaného DNA fragmentu do expresivního vektoru, nebo fragment muže být štěpen v místech štěpení, která jsou v něm přirozeně přítomna. Postup dobře známé polymerásové řetězové reakce může být také použít pro amplifikaci DNA sekvence, kódující požadovaný proteinový fragment. Jako další alternativa mohou být použity známé techniky mutagenese pro inzert stop kodonu na požadované místo, např. bezprostředně po směru kodonu pro poslední aminokyselinu extracelulární domény.
V jiném přiblížení muže být použito enzymatické .zpracování (např. za použití Bal 31 exonukleásy) pro deleci terminálních nukleotidů z DNA fragmentu pro získání fragmentu, majícího výhodný požadovaný konec. Z mnoha komerčně dostupných linkerú jsou to ty, které mohou být ligovány k tupým koncům produkovaným Bal 31 štěpením a které obsahují místo (místa) pro restrikční endonuk1eásové štěpení. Alternativně mohou být„ syntetizovány oligonukleotidy, které rekonstruují N- nebo C-konec DNA fragmentu k požadovanému bodu a mohou být ligovány k DNA fragmentu. Syntetizované o 1 igonukleotidy mohou obsahovat restrikční endonukleásové štěpící místo proti směru požadované kódující sekvence a polohu iniciačního kodonu (ATG) na N-konci kódující sekvence. }i
Jak'je uvedeno výše, vynález poskytuje izolované nebo homogenní f1t3-L polypeptidy, jak rekombinantni tak nerekombinantní. Varianty a deriváty nativních flt3-L proteinů, které si udržují požadovanou biologickou aktivitu (např. schopnost vázat flt3-L) mohou být získány mutacemi nukleotidových sekvencí, kódujících nativní flt3-L polypeptidy. Změny nativní aminokyselinové sekvence mohou být provedeny jakoukoliv z mnoha známých metod. Mutace mohou být l
zavedeny do určitého místa syntézou oligonuk1eotidů, obsahujících mutantní sekvenci, lemovanou restrikčními místy umožňujícími ligaci k fragmentům nativní sekvence. Po ligaci výsledná rekonstruovaná sekvence kóduje analog, mající požadovanou aminokyselinovou inzerci, substituci nebodeleci,
Alternativně postupy o 1igonuk1eotid-místně řízené-specifické mutagenese mohou být použity pro poskytnutí změněného genu, kde předem stanovené kodonv byly změněny substitucí, delecí nebo inzercí. Příklady metod provedení změn uvedených výše, jsou popsány Walderem a spol.(Gene 42:133 , 1986); Bauerem a spol (Gene 37:73, 1985); Craikem (BioTechnigues, leden 1985,' 12-19); Smithem a spol (Genetic. Engineering:PrincÍples and Methods, Plenům Press, 1981); Kunkelem (Proč.Nati.Acad,Sci.USA 82:488, 1985); Konkelem a s.po 1..-. (Me thods. .in. Enzymol ..· 154 : 367 , 1987) a-US· pat enty-č;·· - — 4518584 a 4737462 , které zde jsou popsány jako odkaz..
Flt-L může být modifikován pro vytvořeni flt3—L derivátů tvorbou kovalentnich nebo agregativních konjugátů s jinými chemickými skupinami jsko jsou glvkosylové skupiny, lipidy, fosfáty, acetylové skupiny a podobně. Kovalentní deriváty f1t3-L mohou být připraveny spojením chemických skupin s funkčními skupinami na, flt3-L aminokyselinové postranních1 řetězcích nabo na N-konci nebo C-konci flt3-L polypeptidů nebo jeho extracelulární domény. Jiné deriváty f1t3—L v rozsahu tohoto vynálezu zahrnují kovalentní nebo agregativní konjugáty flt3-L nebo jeho fragmentů s jinými proteiny nebo polypeptidy, jako při syntéze v rekombinantní kultuře jako N-terminální nebo C-terminální fuze. Například konjugát může obsahovat signální nebo leader polypeptidovou sekvencí (např. a-faktor leader sekvenci Saccharotnyc.es} na Nmkonci. f I.t3-L polypeptidů... Signální nebo leader peptid ko-trans1ačně nebo pos t-.trans lačně řídí.transfer konjugátu z místa jeho syntézy do místa uvnitř nebo mimo buněčnou membránu nebo buněčnou stěnu.
Flt3-L polypeptidové fúze mohou obsahovat peptidy přidané pro usnadnění čištění a identifikaci flt3-L. takové peptidy zahrnují, například poly-His nebo antigenní identifikační, peptidy popsané v US patentu č. 5011912 a v práci Hoppa a spol., BiolTechnology 6:1204, 1988.
Vynález dále zahrnuje flt3—L polypeptidy s nebo bez asociovaného nativního typu glykosylace. Flt3-L exprimovaný v savčím expresivním systému (např. COS-7 buňky) může být podobný nebo se muže lišit od nativního .fltl-L polypeptidu molekulovou hmotností a typem glykosylace v závislosti na volbě expresivniho systému. Exprese f1t3—L polypeptidu. v bakteriálních expresivních systémech, jako je E.coli, poskytuje neglykosylované molekuly.
Ekvivalentní DNA konstrukty, které kódují různé adice nebo substituce aminokyselinových zbytků nebo sekvencí, nebo ” delece terminálnich nebo vnitřních zbytků nebo sekvence ne nezbytné pro biologickou aktivitu nebo vazbu, jsou zahrnuty dó vynálezu. Například N-glykosy1ační místa v flt3-L extracelulární doméně mohou být modifikována pro zabránění glykosylace, což umožní expresi redukovaného karbohydrátového analogu vsavčich a kvasinkových expresivních systémech.N-glykosylační místa v eukaryotických polypeptidech jsou charakterizována aminokyselinovým tripletem ASn-X-Y, kde X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Pro a Y je Ser nebo Thr.
Myší a lidské flt3—L proteiny každý mohou obsahovat dva takové triplety, při aminokyselinách 127-129 a 152-154 SEQ ID NO:2 a při aminokyselinách 126-128 a 1.50-152 SEQ ID NO:6. Vhodné substituce, adice nebo delece nukleotidové sekvence, kódující tyto triplety budou vést k ochraně před připojením karbohydrátových zbytků na Asn postranní řetězce. Změna jednotlivého nukleotidu,, zvolená tak, že se Asn nahradí například odlišnou aminokyselinou, je dostačující k inaktivací
N-glykosylačního místa. Známé postupy pro inaktivaci
N-glykosylačních míst zahrnují ty. které jsou popsány v US tatentu č. 5071972 a EP 276846, které zde jsou zahrnuty jako odkazy.
V jiném případě, sekvence, kódující Cys zbytek, které nejsou podstatné pro biologickou aktivitu, mohou být změněny tak, že Cys zbytky budou deletovány nebo nahrazeny jinými ' ' aminokyselinami, což brání tvorbě nesprávných íntramolekulárních disulfidových můstku po renaturaci. Jiné ekvivalenty jsou připraveny modifikací přilehlých dibázických aminokyselinových zbytků pro zvýšení exprese ve kvasinkových systémech, ve kterých je přítomna KEX2 proteásová aktivita,. EP
212914 popisuje použití místně spécifické^mutagenese pr.o . _ inaktivaci KEX2 proteásou pracovávaných míst v proteinu. KEX2 proteásová místa pro úpravu jsou inaktivována delecí, adicí nebo substitucí zbytků pro změnu Arg-Arg, Arg-Lys a Las-Arg
Λ párů pro odstranění výskytu těchto přiléhajících bazických zbytků. Lys-Lys páry jsou považovány za méně náchylné k REX2 štěpení a konverze Arg/Lys nebo Lys/Arg na Lys/Lys představuje konzervativní a preferované přiblížení k inaktivaci KEX2 míst.
Jak myší tak lidský flt3—L obsahuje dvě KEX2 proteásová místa pro úpravu u aminokyselin 216-217 a 217-218 v SEQ ID NO;2 a při aminokyselinách 211-212 a 212-213 v SEQ ID NO:6.
. Nukleokyselinové sekvence v rozsahu vynálezu zahrnují izolované DNA a RNA sekvence, které hybridizují k nativním f1t3-L nukleotidovým sekvencím popsaným zde za mírných nebo i
ostrých podmínek a které kódují biologicky aktivní SEQ ID NO:.
Podmínky mírné hybridizace, jak je definována Sambrookem a spol. .. ./
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vyd.sv.l str.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), zahrnují použití předpromývacího roztoku 5 X SSC, 0,5% SDS,'
1,0 mM EDTA (pH 8,0) a hybridizační podmínky asi 55 °C, 5 X SSC, přes noc. Podmínky přísné hybridizace zahrnují vyšší teploty hybridizace a promývání. Odborníkům v oboru bude zřejmé, že teplota a koncentrace promývacího roztoku mohou být upraveny podle potřeby v závislosti na takových faktorech jako je délka sondy. Diky známé degeneraci genetického kódu, kdy více než jeden kodon muže jodovat stejnou aminokyselinu, může se DNA sekvence lišit od té, která je uvedena v SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:5 a ještě kodovat flt3-L protein, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:6. Taková varianta DNA sekvence může vzniknout z tichých mutací (např. objevujících se během PCR amplifikace), nebo může být produktem uvážené mutagenese nativní sekvence.
Vynález poskytuje ekvivalentní izolované DNA sekvence, kódující biologicky aktivní flt3-L, vybrané z: (a) DNA * odvozené od kódujícího regionu nativního f1t3-L genu; (b) cDNÁ, obsahující nukleotidovou sekvenci přítomnou v SEQ ID N0:l nebo SEQ ID NO:5; (c) DNA schopnou hybridizace k DNA z (a) za mírně přísných podmínek a která kóduje biologicky aktivní flt3—L; a (d) DNA, která je degenerována jako výsledek genetického kódu k DNA definované v (a), (b) nebo (c) a která , i;
kóduje biologicky aktivní flt3—L. Flt3-L proteiny kočované takovými DNA ekvivalentními sekvencemi jsou zahrnuty ve vynálezu.
DNA, které jsou ekvivalentní k DNA sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO:5 budou hybridizovat za mírné přísných podmínek k nativní DNA sekvenci, která kóduje polypeptidy, zahrnující aminokyselinové sekvence 28 až 163 ze SEQ ID N0:2 nebo 28 až 160 ze SEQ ID NO:6. Příklady flt3—L proteinů, kódovaných takovými DNA zahrnují, ale nejsou tak omezeny, flt3—L tragmenty (rozpustné nebo membránově vázané) a f1t3-L proteiny, obsahující inaktivovaná N-glykosylační místo(a), inaktivovaná KEX2 proteásová upravovači místa, nebo konzervativní substituci(e) aminokyselřn, jak jsou popsány' výše. Flt3-L proteiny kódované DNA získanou ze savčích druhů, kde DNA bude hybridizovat k cDNA ze SEQ ID NO;1 nebo SEQ ID N0:5, jsou také zahrnuty do rozsahu vynálezu.
Varianty umožňující potřebnou schopnost vázat flt3—L receptor mohou být identifikovány jakoukoliv vhodnou zkouškou. Biblogická aktivita flt3-L může být stanovena, například, kompeticí o navázání k liganové vazebné doméně flt3-L receptoru (tj. kompetitivní vazebnou zkouškou).
Jeden. typ. kompetitivní vazebné „zkoušky... pro ..fl t3-L. ~ polypeptid využívá radioaktivně značeného, rozpustného lidského fIt3-L a intaktnich buněk exprimují cích buněčné povrchové flt3~L receptorý. Místo intaktnich buněk by mohly být nahrazeny rozpustné flt3-L receptorý (jako je flt;Fc fuzní protein) navázané k pevné fázi přes inerakci.proteinu A, proteinu G nebo protilátek k flt3 nebo Fc částem molekuly, Fc regionem fuzniho. proteinu. Jiný typ kompeptitivní vazebné zkoušky využívá radioaktivně značené rozpustné flt3 receptorý jako je flt3:Fc fuzní protein a i.ntaktní buňky, exprimujicí f1t3-L. Alternativně by mohly být fIt3—L navázány k pevné fázi k pozitivnímu výběru flt3 exprimujících buněk.
Kompetitivní vazebné zkoušky mohou být provedeny za použití následující běžné metodiky. Například může být radioaktivně značený flt3-L použit pro soutěž s domnělým flt3-L homologem pro zkoušku vazebné aktivity proti povrchově navázaným flt3-L receptorům. Kvalitativní výsledky mohou být získány kompetitivní autoradiografickou plotnovou vazebnou zkouškou, nebo mohou být použity Scatchardovy grafy pro generování kvantitativních výsledků.
Alternativně, f 113—L vazebné prote.iny jako je flt3-L a anti-flt3 protilátky, mohou být navázány k pevné fázi jako je matrice ve sloupcové chromátografi i nebo podobný substrát vhodný pro identifikaci, separaci nebo čištěni buněk, které exprimují flt3 receptor na svém povrchu. Navázáni flt3-L vazebných proteinů k pevnému fázovému kontaktnímu povrchu může být provedeno jakýmíkoliv prostředky, například, konstrukcí fl.t3Fc fuzního proteinu a jeho navázáním k pevné fázi pres interakci proteinu A nebo proteinu G. Různé jiné prostředky pro fixaci proteinů k pevné fázi jsou v oboru dobře známé a jsou vhodné pro použití v předloženém vynálezu. Například mohou být magnetické mikrosféry potaženy f1t3-vazebnými proteiny a udržovány v inkubační nádobě v magnetickém poli. Suspenze buněčných směsí, obsahující hematopoietické progeni torové nebo kmenové buňky jsou uvedeny do kontaktu s pevnou fází, která má na sobé flt3-vazebné proteiny. Buňky, mající f1t3 receptor na svém povrchu se· vážou k fixovanému f1t3 vazebnému proteinu a nenavázané buňky se odstraní promytím. Táto afinitni vazebná metoda je vhodná pro čištění, screening nebo separaci takových f 1 t3-exprimujících buněk z ’ roztoku. Způsoby uvolnění pozitivně vybraných buněk z pevné * fáze jsou v oboru známé a zahrnují, například, použití enzymů·.. Takové enzymy jsou výhodně netoxické a nepoškozující buňky a jsou výhodné řízeny na štěpení vazebného partnera buněčného povrchu. V případě flt3:flt3—L interakcí by měl enzym výhodně štěpit f 113 receptor a tím uvolnit výslednou buněčnou suspenzi z ciziho f1t3—L materiálu. Čištěná buněčná populace pak může být expandována ex vivo před transplantací pacientovi v množství dostačujicím.k rekonstituci pacientova hematopoietického a imunitního systému.
Alternativně mohou být směsi buněk, o kterých se předpokládá, že obsahují flt3* buňky , nejprve inkubóvány s biotinylovaným f1t3-vazebným proteinem.- Inkubační periody jsou typicky trvají alespoň jednu’ hodinu pro dosažení dostatečného navázání k f1t3. Výsledná směs pak projde kolonou naplněnou avidinem po-taženými kul řekami, přičemž- vysoká a-f-inita-biotinu k avidinu poskytne navázání buněk ke kuličkám. Použití ; avidinem potažených kuliček je v oboru známé. Viz Berenson a spol. J.Cell.Biochem., IOD:239 (1986). Vymytí nenavázaného materiálu a uvolnění navázaných buněk se provede za použití konvenčních metod.
V metodách popsaných výše jsou vhodné flt3-vazebné proteiny flt3-L, anti-flt3 protilátky a jiné proteiny, které jsou schopné vysoce afinitní vazby flt3. Preferovaným f1t3-vazebným proteinem-je flt3-L.
Jak je popsáno výše, muže být flt3—L podle vynálezu použit k odděleni buněk, exprimujících flt3 rečeptořy. V alternativní metodě mohou být flt3-L nebo jejich extracelulární doména nebo fragment konjugovány k detegovatelné skupině jako je 1251 prodetekci flt3 .. .
exprimujících buněk. Kadioaktivní značení s 1251 může být provedeno jakoukoliv ze známých metod, které poskytnou funkční 125I-flt3-L molekulu značenou k vysoké specifické aktivitě.
Nebo může být použit jodovaná nebo„biotinylovaná protilátka * vůči f1t3 regionu nebo Fc regionu molekuly. Jiná detegovatelná skupina jako je enzym, který může katalyzovat kolorimetrickou nebo fluorometrickou reakci, biotin nebo avidin, může být použit. Buňky, které jsou testovány na flt3 receptorovou expresi mohou být kontaktovány’ se značeným flt3-L, Po inkubaci se nenavázaný f1t3—L odstraní a navázáni se měří použitím detegovatelné skupiny.
Vazebné charakteristiky flt3-L (včetně variant) mohou být také stanoveny za použití konjugovaných, rozpus tných 'f 113 receptorů (například 125I—f1t3:Fc) v kompetični zkoušce podobné té, která je popsána výše. V tomto případě se intaktní buňky, exprimující flt3 receptor, nebo rozpustné flt3 receptory navázané k pevnému substrátu, použijí k měření rozsahu, v jakém vzorek, obsahujici domnělou flt3-L variantu soutěží v navázání s konjugovaným rozpustným flt3 k f1t3-L.
Jiné způsoby zkoušení flt3—L zahrnují použití anti-flt3-L protilátek, buněčných linií, které proliferují v odpovědi na flt3-L, nebo rekombinantních buněčných linií, které exprimují flt3 receptor a proliferují za přítomnosti flt3-L. Například BAF/BO3 buněčná linie postrádá flt3 receptor a je IL-3 závislá (viz Hatakeyama a spol., Cell, 59:837-845 (1989)). BAF/BO3 ►buňky transfektované s expresivním vektorem, obsahujícím flt3. receptor gen proliferují v odpovědi bud na IL-3 nebo flt3-L. Příkladem vhodného expresívního vektoru pro transfekci f 113 je pCAV/NOT plasmid, viz Moosley a spol., Cell, 59:335-348 (1989),.
Flt3-L polypeptidy mohou existovat jako oligomery, to *
jest jako kovalentně navázané nebo nekovalentně navázané dimery nebo trimery. Oligomery mohou být navázány .
disulfidovými vazbami vytvořenými mezi cystei novými zbytky na různých flt3-L pólypeptidech. V jednom provedení vynálezu je fIt3-L dimer vytvořen fúzováním flt3—L k Fc regionu protilátky (např. IgG) způsobem, který neinterferuje s vazbou f1t3-L k f1t3—1igand-vazebné doméně. Fc polypeptid je výhodně fúzován k C-konci rozpustného flt3-L (obsahujícího pouze extracelulárni doménu). Obecná příprava fuzních proteinů, obsahujících heterologní polypeptidy fúzované k různým částem z protilátek odvozených polypeptidú (včetně Fc domény) byla popsána např. Ashkenazim a spol. (f%tS USA 88:10535, 1991) a
Byrnera a spol. (Nátuře 344:677, 1990) - práce je zde uvedena jako odkaz. Genová fuze, kódující flt3-L:Fc fuzní prdtein je inzertována do vhodného expresívního vejktoru. Flt-L:Fc fuzní proteiny jsou- ponechány k vytvoření molekul podobnějších protilátce, přičemž se vytvoří mezi meziřetězcové disulfidové vazby mezi Fc polypeptidy, za vzniku divalentního flt3—L.
Jsou-li fuzní proteiny vyrobeny s oběma těžkými a lehkými řetězci protilátky, je možné vytvořit flt3-L oligomer s až čtyřmi flt3—L extracelulárními regiony. Alternativně je možno spojit dvě rozpustné flt3—L domény s peptidovým linkerem.
. S
Rekombinan.tní expresívní vektory, obsahující DNA, kódující flt3-L mohou být připravený za použití známých metod. |
Expresívní vektory zahrnují flt3-L DNA sekvenci operabilně ' připojenou ke' vhodným' transkripčním nebo 'translačním''· “ *
regulátorovým nukleotidovým sekvencím, jako jsou ty, které jsou odvozeny ze savčích, mikrobiálních, virálních nebo hmyzích genů. Příklady regulátorových sekvenci zahrnují transkripční promotory, operátory nebo enhancery, mRNA ribosomální vazebné místo a vhodné sekvence, které kontrolují transkripční a translační iniciaci a terminaci. Nukleotidové:
sekvence jsou operabilně připojeny, když se regulátorová sekvence funkčně vztahuje k flt3—L DNA sekvenci. Tak je promotorova nukleotidová sekvence operabilně připojena k 4 flt3-L DNA sekvenci, když promotorové nukleotidová sekvence kontroluje transkripci flt3-L DNA sekvence. Schopnost se | replikovat v požadovaných hostitelských buňkách, obvykle | propůjčená počátkem replikace a výběrem genu, kterým jsou s transformanty identifikovány, může být dále inkorporována do * ·: expresívního vektoru. . .
«Γ
Dále, sekvence, kódující vhodné signální peptidy, které nejsou přirozeně spojené s f1t3-L mohou být inkorporovány do náhradní list specifický k maturovaným B buňkám ; S7 (CD43) markérkterý je markér časných B buněk; antígen-1 kmenových buněk (Stem Cell Antigen-1 - SCA-1) markér, který je markérem aktivovaných T buněk a B buněk; CD4, který je markérem pro hclper T buňky a některé kmenové buňky; a Mac-1 markér, který je specifický k makrofágúm, za použití známých protilátek proti takovým markérům. Následující.tabulka IV ukazuje údaje získané ze screeningu kostní dřeně. Dvě transgenní myši ze stejného vrhu byl-y analyzovány proti normální myši ze stejného vrhu (kontrola) a nepříbuzné normální myši (kontrola).
Tabulka IV
Vliv f'lt3-L nadměrné exrese v transgenní myši
Procenta pozitivních buněk nepríbuzný stejný vrh
markér kontrola kontrola transgenní #1 transgenní
B220 30,64 27,17 45,84 48,78
slgM 3,54 2,41 ' 1,94 1,14
S7(CD43) 54,43 45,44 46,11 50,59
SCA-1 10,92 ' 11,74 19,45 27,..37
CD4 6,94 8,72 .12,21 14,05
Mac-1 36,80 27,15 21,39 18,63
Výše uvedená data indikují, že flt3-L nadměrná exprese v myši vede ke zvýšení počtu B buněk, jak je indikováno zvýšeni B220+ buněk a SCA-1* buněk. Analýza B220* buněk pomocí FACS indikuje zvýšení v proB buňkách (HSA,S7*). Zvýšení v CD4* buňkách představuje přibližné dvojnásobné zvýšení v T buňkách a kmenových buňkách. Sníženi v buňkích, majících slgM markér indikuje, že f1t3—L nestimuluje proliferaci maturovaných B buněk.- Tyto údaje indikují, Ze flt3—L zvyšuje buňky s fenotypem kmenových buněk', T buněk nebo časných B buněk a náhradní list m . i___i i„ . TTT iáuui L·. a A X i
Erythroidová buněčná proliferace v flt3~L nadměrné exprimující
slezině transgenní myši
Myš životaschopné. bílé krvinky červené krvinky·
buňky celkem celkem celkem
i (milion buněk/ml) (milion buněk/ml) (m i 1 i on buněk/ml)
i i i kontr.l 29,7 27 2,7
í kontr. 2- 31 24,6 6,4
trans- ? \ ·
genní 1 44,7 25,6 19,1
·—·- — trans--
genní 2 37,3 28,4 8,9 '
Z tabulky III je zřejmé,.že počty bílých krvinek na mililitr byly přibližně stejné jako u kontrolní myši. Počty červených krvinek ze sleziny dvou .transgennich myší však byly přibližně dva až trojnásobně větší než byly zjištěny u kontrolnímyši. Flt3-L stimuluje zvýš.ení buněkerythroidní linie, možná, přes stimulaci erythroidních progenitorových buněk, stimulaci buněk, které produkuji erythropoietin-nebo blokováním mechanismu, který inhibuje erythropoíesis..
Příklad 11
Flt3-L stimuluje proliferaci T buněk a časných B buněk
Kostní dřen 9 týdnů staré transgenní myši generované p.odle..přikladu. 9 byla screenována na přítomnost různých T a B buněčných fenotypových markérů za použití protilátek, které jsou imunoreaktivní s takovými markéry. Hodnoceny byly následující markéry: B220 markér, který je specifický k B-buněčné rodině, povrchový IgM markér (slg.M) , který je náhradní list den p.c. pseudopregnantní samice. Výhodně se používají první dvě možnosti protože vylučují in vitro kulturu a výhodně přibližně 20-30 mikroinjektovaných vajíček by mělo být transferováno pro vyloučení malých vrhů.
Příklad 10
Flt3-L stimulovaná proliferace erythroidových buněk ve slezině '5»
Tento příklad popisuje vliv flt3-L na produkci /•i erythroidních buněk ve slezině transgenní myši.. Transgenní ... ·. . myši byly generovány podle postupu v příkladu 9. Myši byly usmrceny a každá netknutá slezina byla zpracována na jednu buněčnou suspenzi. Suspendované buňky byly odstředěny a resuspendovány v 10 ml media, obsahujícího PBS + 1 % fetáního bovinního séra. Počty buněk byly pak stanoveny pomocí hemocytometru. Každý buněčný vzorek byl počítán s Trypan Blue ,f r· vybarvením pro získání celkového počtu životaschopných buněk na mililitr media podle následujícího- vzorce: (EBC + WBC)/ml..,
1.1·· kde BBC je počet červených krvinek a WBC znamená počet bílých 'A krvinek. Každý v-zorek pak byl spočítán s Turkovým vybarvením;
. I'í' pro získání celkového počtu bílých krvinek na mililitr media. ’
Celkový počet červených krvinek na mililitr byl vypočten pro každý vzorek odečtením celkového počtu bílých krvinek na mililitr od celkového počtu,žijících buněk na mililitr.
Výsledky jsou uvedeny v následující'tabulce III.
který je řezán Asp7l8-Notl.
Flt3-L:Fc fuzní proteiny jsou syntetizovány v rekombinantní savčí buněčné kultuře. Flt3-L:Fc fúzi obsahující expresivní vektor je pak transfektován do CV-1 buněk (ATCC CCL 70) nebo COS-7 buněk (ATCC CRL 1651). Exprese ve 293 buňkách (transformovaných primárních lidských embryonálních ledvinových buňkách, ATCC CRL 1573)je také proveditelná.
293 buněk transfektovaných s pCAV/NOT/flt3-L:Fc vektorem se kultivuje v otočných nádobách pro umožnění přechodné exprese fuzního proteinu, který je .sekretován do kultivačního media pres flt3-L signální peptid. fuzní protein muže být. čištěn na^protein a sepharose kolonách·, _
Příklad 9
Generování transgenni. mys i, která nadměrně., expr i mu j e.. f l t.3-L .
Tento příklad popisuje postup .použitý.pro získání transgenni myši,, která nadměrně.,exprimuje.. f Lt3-L. fltš-l-nadměrně;exprimující myši. byly studovány pro.'s t3novení. biologických účinků nadměrné, exprese. .Myší (B.16/,1) pronuklea . byla.mikroinjektována s flt3-L Dnapodle metody popsané Gordonem a spol., Science 214:1244-1246 (1986). Obecně oplodněná myší vajíčka mající viditelný pronukleus byla-nejprve umístěna do injekční komůrky a držena na místě malou pipetou. Injekční pipeta pak byla použita pro onjektování genu kódujícího flt3rL (klon #6C) do pronuklea vajíčka. Injektovaná vajíčka byla pak bud (i) transferována do vejcovodu 0,5 den p.c. pseudopregnantní samice; (ii) kultivována in in vitro do dvoubunéčnéhostadia (přes noc) a přenesena do vejcovodu 0,5 den p.c. pseudopregnantní samice, nebo (iii) kultivována in vitro do blastocvtového stadia a transferována do dělohy 2,5 nahracnu χχFc region lidské IgGl protilátky je klonována do Spěl místa pBLUESCRIPT SKR vektoru, který je komerčně dostupný od Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornie. Tento plasmidový vektor je replikovatelný v E.coli a obsahuje polylinkerový segment, který zahrnuje 21 unikátních restrikčních míst. Unikátní BglII místo se pak zavede blízko 5* konce inzertované Ec kódující sekvence, takže BglII místo zahrnuje kodony pro aminokyseliny tři a čtyři Fc polypeptidů.
Kódovaný Fc polypeptid se rozkládá od N-terminální pantové oblasti k nativnímu C-konci, tj. má v. podstatě plnou délku proti látkového Fc regionu. Fragmenty Fc regionů, např. ty., které jsou zkráceny na C-terminálním konci, mohou být také použity. Fragmenty výhodně obsahují násobné cysteinové zbytky (alespoň cysteinové zbytky v pantovém regionu) pro zprostředkování vytvoření meziřetězcových disulfidových vazeb mezi Fc polypeptidovou částí dvou separátních flt3-L:Fc fuzních proteinů za tvorby dimerů.
Asp718-Stul parciální cDNA z flt3-L v pCAV/NQT může být klonována do Asp718-Spel místa pBLUESCRIPT SKR vektoru, obsahujícího Fc cDNA, takže je fit3—L cDNA umí stěna-proti směru Fc cDNA. Sekvence jednořetězcové DNA získané z výsledné genové fúze může být uskutečněna.templáty řízenou mutagenezí popsanou Konkelem (Proč.Nati.Acad.Sci.USA 82:488, 1985) a Kunkelem a spol (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) za účelem perfektní fúze celé extracelulární domény f1t3—L k Fc sekvenci. Výsledná DNA může pak být sekvencována pro potvrzení, že jsou odstraněny správné nukleotidy (tj. transmembránový region a částečně cytoplasmické doménová DNA jsou vypuštěny) a Že flt3-L a Fc sekvence jsou ve stejném Čtecím rámci. Fúzní cDNA se pak vyřízne a inzertuje za použití konvenčních metod do savčího expresního vektoru pCAV/NOT, nanraani iisi
OJ
Tabulka II
Vliv proliiferace flt3—L a IL—3 na proliferaci c-kit+buněk faktor kontrola (samotný vektor) flt3-L IL-3 flt3-L+IL-3 [3H]-thymidinová inkorpo.race 100 1800 3000 9000 (CPM)
Kultivační supernatanty z CV1/EBNÁ buněk transfektovaných s flt3-L cDNA st imuluj í'prol if eraci c-kit+ kmenových buněk. · přibližně lákrát více než ku.l t iv.ační . supernatant CV1/EBNA buněk transfektovaných. se samotným· expresivním vektorem. Přídavek IL-3 k flt3-L obsahujícímu supernatantu vykazuje sanergický účinek s pozorovaným přibližně dvojnásobným stupněm proliferace než.by bylo možno očekávat při aditivních vlivech.
Příklad S
Konstrukce flt3:Fc fuzního proteinu
Tento příklad popisuje způsob konstrukce fuzního proteinu, obsahujícího extracelulární region flt3-L a Fc doménu lidského imunoglobulinu. Způsoby jsou v podstatě stejné jak byly popsány v příkladu 1 pro konstrukci flt3:Fc proteinu.
' Před fúzováním cDNA'kN-konci cDNA kódující'Fc část molekuly lidského IgGl cDNA fragment je inzertován do Asp7l8-Notl místa pCAV/NOT, popsaného v PCT přihlášce WO 90/0513. DNA, kódující jediný řetezec polypeptidu, obsahující náhradní list
Zkouška hematopoiesis
Proliferace c-kit* kmenových buněk-, fetálních jaterních buněk AA4.1* buněk byla zkoušena pomocí [3H]-thymidinové inkorporace v podstatě jak popsal DeVries a spol., J.Exp.Med., 173:1205-1211, 1991. Čištěné c-kit* kmenové buňky byly kultivovány při 37 °C v atmosféře s nasycenou vlhkostí 6/5 K> CO2 a 7 % O2 ve vzduchu po 9.6 hodin. Myší rekombinantní IL-3 byl použit k konečné koncentraci 100 ng/ml. Potom byly buňky pulzovány se 3 pCi na jamku [3H]-thymidinu (81 Ci/mmól; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) a inkubovány dalších 24 hodin. AA4.1 * buňky (přibližně 20000 buněk/jamka) byly inkubovány v IL-7, flt3-L a flt3-LI +IL-7 48 hodin s následujícím [3H]-thymidinovým pulzem po šest hodin. Výsledky flt3-L a IL-7 jsou uvedeny v tabulce I a výsledky flt3-L:aIEr3 jsou uvedeny v tabulce II.
Tabulka I
Vliv flt3—L a IL-7 na proliferaci AA4.1+fetélních jaterních,, buněl t faktor kontrola flt3-L IL-7 flt3-L+IL-7 [3HJ-thymidinová inkorporace 100 1000 100 4200 (CPM)
Kombinace flt3-L a IL-7 produkuje odezvu, která byla přibližně čtyřikrát větší než flt3-L samotného a přibližně 40krát větší než u IL-7 samotného.
t pak promyty intenzivně PBS plus 1 % FBS před použitím. Jediná suspenze jaterních buněk byla přidána v množství 107 buněk/miska v PBS plus 1 % FBS a ponechána adherovat k plotnám po dvě hodiny při 4 °C. Plotny byly intenzivně promyty a
-adherované buňky byly sklizeny seškrábáním pr-σ'analýzu--nebo další použití v hematopoietické zkoušce popsané dále. FACS analýza za použití AA4.1 protilátky demonstruje > 95 % AA4.1+ buněčné populace.
C-kit.+ pluripotentní kmenové buňky byly čištěny z kostní dřeně dospělé myši (de Vries a spol., J.Exp.Med., 176:1503-1509, 1992 a Visser a de Vries, Methods in Cell Biol., 1993). Nízkohustotní buňky (<.1,078 g/cm^) pozitivní
u..-pro^lekt-inOvý· aglutininpšen'iČných klíčků a negativní ,pro antigeny rozpoznávané B220- a 15-1.4.1 (Vissera spol., Meth.in Cell Biol., 33:451-468, 1990) monoklonální protilátky mohly . být rozděleny- do subpopulací buněk které exprimují a neexprimují c-kit za použití biotinylovanéhó Steel faktoru, c-kit* frakce byla zjištěna jako obsahující pluripotentní hematopoietické kmenové buňky (de Vries a spol,, Science 255:989-991, 1992: Visser a de Vries, Methods in Cell Biol,, 1993 a ffare a spol., 1993). - ~ '
AA4.1+fetální jaterní buňky byly kultivovány v rekombinantním.IL-7 (US patent č. 4965195) při 100 ng/ml a rekombinantním flt3-L při 250 ng/ral.. Flt3-L byl použit ve třech různých formách v pokusech:(l) jako přítomný na * fixovaných, flt3-L transfektovaných CV1/EBNA buňkách, (2) jako koncentrované kulturní supernatanty ze stejných flt3-L . transf ektovaných- GV1/EBNA buněk' a' (3) jako Tčištěný a izolovaný polypeptidový přípravek z kvasinkového supernátantu jak je popsán v příkladu 5.
r.anraam uši buněk.
Hybridomové buňky jsou screenovány. ELISA na reaktivitu prúti čištěnému flt3—L adaptací technik popsaných v Engvall a spol. Immunochem, 8:871,1971 a v US patentu 4703004. Preferovanou technikou je technika čepičkování protilátky popsaná Beckmannem a spol- (J. Inununol. 144:4212, 1990). Pozitivní hybridomové buňky mohou být injektovány intraperitoneálně do syngenní BALB/c myši pro produkci asc.itú, obsahujících vysoké koncentrace anti-flt3-L monoklonálních protilátek. Alternativně mohou hybridomové buňky růst in vitro v baňkách nebo rotačních nádobách za různých technik.
F
Monoklonální protilátky produkované v myších ascitech mohou být čištěny srážením síranem amonným s následující gelovou vylučovací chromatografií. Alternativně může být také použita afinitní chromatografie založená na vazbě protilátek k λ proteinu A nebo proteinu G, i afinitní chromatografie založená na vazbě k f1t3-L.
Příklad 7
Použití flt3—L samotného a v kombinaci s IL-7 nebo IL-3 <
Tento příklad demonstruje stimulaci a proiiferaci AA4.1+ fetálních jaterních buněk kompozicemi, obsahujícími flt3-L a IL-7 jakož i stimulaci a proiiferaci c-kit-pozitivních (c—kit*) buněk kompozicemi, obsahujícími, flt3-L a IL-3.
AA4.1-pozitivní (AA4.1+) exprimující buňky byly izolovány z jater čtrnáctý den fetální C57BL/6 myši umístěním buněk v Optilux 100 mm plastových Petriho miskách (Falcon č. 1001, Oxnard, CA). Plotny byly potaženy přes noc při 4 °C v PBS plus 0,1% fetálním hovězím sérem (FBS), obsahujícím 10 pg/ml AA4.1 protilátky (McKearn a spol, J. Inununol. , 132:332-339, 1984) a
-τ J
Příklad 6 monoklonální protilátky 1 flt3—L lento příklad ilustruje způsob přípravy monoklonálních protilátek k flt3-L. Flt3-L je exprimiván v savčích hostitelských buňkách jako jsou COS-7 nebo CV-l/EBNA-1 buňky a čištěn použitím flt3:Fc afinitní chromatografie. Čištěný flt3-L, jeho fragment jako je extracelulární doména, syntetické peptidy nebo buňky, které exprimují flt3-L mohou být použity pro vytvoření monoklonálních protilátek proti flt3-L za použití konvenčních technik, například jak jsou. popsány v US patentu 4411993. Stručně, myši se imunizují f1t3—L jako imunogenem emulgovaným v kompletním Freudově aďjuvans 'a injektovaným v množstvích od 10 do 100 pg subkutánn.ě. nebo, intraperitoneálně. O deset až-dvanáct dní později se zvířatům podá booster dalšího flt3—L emulgovaného v nekopletním Freudově' adjuvans. Myši se periodicky upomínají po jednom až dvou týdnech imunizačního harmonogramu. Vzorky séra se periodicky odebírají retro-orbi.tálním odebíráním krve nebo zářezem na špičce ocasu pro testování na f1t3~L protilátky pomocí' dot-blot zkoušky, ELISA (Enzyme-LInked Immunosorbent Assay) nebo inhibicí flt3 vazby:
PO detekci vhodného proti látkového titru je pozitivním zvířatům podána jedna poslední intravenozní injekce f113—L v salínickém roztoku. Tři až čtyři dny poté jsou zvířata usmrcena, odebrány slezinové buňky a slezinové buňky jsou fúzovány k myší myelomové buněčné linii, např. NS1 nebo výhodně P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Fúze generují hybridomové buňky, které jsou umí stěny na multiple L mikrotitračni plotny v HAT (hypoxanthinaminopterin a thymidin) selektivním mediu pró inhibicí proliferace nefuzovanýéh buněk, myeloma hybridů a hybridů slezinných /
náhr acín í lis:
+ w1 peptidy 26 a 27 aminokyselin); 23 aminokyselinovou transmembránovou doménu a 30 aminokyselinovou cytoplasmickou doménu. Lidský flt3—L vykazuje nad 72 % aminokyselinovou identitu a 78% aminokyselinovou podobnost s myším f1t3-L.
Vektor pBLUESCRIPT SK(-), obsahující lidský flt3-L cDNA klon #9 byl deponován v American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, USA (ATCC) 6,srpna 1993 a označen přírůstkovým číslem ATCC 69382. Deponování bylo provedeno podle pravidel Budapešťské smlouvy. *
Příklad 1
Exprese fit3-L ve kvasinkách
Pro expresi rozpustného flt3-L ve kvasinkách byly použity syntetické oligonukleotidové primery pro amplifikaci pomocí PCR (Mullis a Faloona, Meth.Enzymol. 155:335-350, 1987) celé extracelulární kódující domény f1t3-L mezi konec signálního peptidu a počátek transmerabránového segmentu. 5' příměr (5 AATTGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGACACCTGACTGTTACTTCAGCCAC-31) SEQ ID NO:7 kódující část alfa . faktor leaderu a antigenního oktapeptidu FLAG sekvenci fúzovanou v rámci s předpovězeným maturovaným N-koncem f Tt,3-L,
------ >·,
3’ oligonukleotid (5’-ATATGGATCCCTACTGCCTGGGCCGAGCTCTGGGAG-3’)SEQ ID NO:8 vytváří.terminační kodon po-Gln-189 právě v domnělém j transmembránovém regionu. PCR-generovaný DNA fragment byl ligován do kvasinkového expresívního vektoru (pro expresi v K.lactis), který řídí sekreci rekombinantního produktu ve „I kvasinkvém mediu (Fleere a spol., Gene, 107:285-195 (1991); a I van den Berg a spol., Bio/Technology 8:135-139 (1990)). .j, I
FLAG:flt3-L fuzní protein byl čištěn ze kvasinkové půdy J afinitní chromatografií jak popsáno dříve (Hopp a spol.,
Biotechnology, 6:1204—1210, 1988).
náhradní list
Příklad 4
Klonování cDNA kódující lidský flt3-L cDNA, kódující lidský flt3-L byla klonována z .lidského . -klonu 22 T- buněk lambdagtlO náhodně primóváné cDNA knihivny jak popsal Sims a spol., PNAS, 86:8946-8950 (1989). Knihovna byla screenována se 413 bp Pie I fragmentem, odpovídajícím extracelulární doméně myšího flť3-L (nukleotidy 103-516 .
SEQ ID NO:1). Fragment byl náhodně primován, hybridizován přes noc ke knihovnovým filtrům při 55 °C v oligo prehybridizačním pufru'. Fragment byl pak promyt-při- 55 °C· 2x SSC/0,1% SDS po 1 hodinu,, potom 1 x SSC/0,1% SDS po 1 hodinu a pak 0,5 x SSC/0,1 % SDS po jednu hodinu. DNA z, požit ivních_f ágoyých.plakú«... byla extrahována a inzerty byly amplifikovány PCR za použití oligonukleotidů specifických pro fágová raménka. DNA pak byla sekvencována a sekvence pro klon #9 je uvedena v SEQ ID NO:5. Další lidská flt3-L cDNA byla izolována ze stejné lambdagtlO náhodně primované cDNA knihivny jak je popsána výše screeningem knihovny s fragmentem'extracelulární domény myči klon #5H cDNA, obsahující cDNA sekvencí v podstatě odpovídající nukleotidům 128 až 541 SEQ ID NO: 1.
Sekvenc.ování 988 bp cDNA klon #9odhaluje otevřený čtecí rámec 705 bp obklopených 29 bp 5' nekódující sekvence a 250 bp 3' nekódující sekvence, 3' nekódující region neobsahuje poly-A konec.V rámci nejsou žádné stop kodony po směru iniciátoru methioninu. Otevřený čzecí rámec kóduje typ I transmembránového proteinu 235 aminokyselin jak je znázorněn aminokyselinami 1-235 SEQ ID NO:6. Protein má N-koncový signální peptid alternativně 26 nebo 27 aminokyselin.Je pravděpodobnější, že N-koncový peptid má 26 aminokyselin spíšenež 27 aminokyselin. Signální peptid je následován 156 nebo 155 aminokyselinovou extracelulární doménou (pro signální náhradní list cDNA inzert byl sekvencován.
Nukleotid a kódovaná aminokyselinová sekvence kódujícího regionu myší flt3.-L cDNA klonu #6C jsou přítomny v SEQ ID NO:1 a 2. cDNA inzert je délky 0,88 kb. Otevřený čtecí rámec v této sekvenci by měl kodovat protein 231 aminokyselin. DNA a kódované aminokyselinové sekvence pro 231-aminokyselinový .. otevřený čtecí rámec- jsou přítomny v SEQ ID NO;1 a 2. Protein SEQ ID NO:2 je typ I transmembránového.proteinu, s
N-terminálním signálním peptidem (aminokyseliny 1 až 27), extracelulární doménou (aminokyseliny 28-188), transmembránovou doménou (aminokyseliny 189-211) a cytoplasmickou doménou (aminokyseliny 212-231). Předpokládaná molekulová hmotnost nativního proteinu po štěpení signální , sekvence je 23,164 daltonú. Zralý protein byl hodnocen pl | 9,372. Je zde 56 bp 5’ nekódující sekvence a 126 bp 3’ r nekódující sekvence lemující kódující region, zahrnující přidané cDNA adaptéry. Výše popsaný klonovací postup také produkuje myší flt3 ligand klon #5H, který je shodný s #6C klonem, začínající u nukleotidu 49 a pokračující do nukleotidu 545 (odpovídá aminokyselinové sekvenci 163) ze SEQ ID NO: 1.
#5H klon se zcela liší v přední části a představuje alternativní střihový konstrukt.
ΐ
Vektor sfHAV-EO410, obsahující flt3—L cDNA v E.coli DH10S buňkách byl uložen v American Type Čulture Collection, 1 Rockville, MD, USA (ATCC) 20.dubna 1993 pod přírůstkovým číslem ATCC 69286. Uložení bylo provedeno podle Budapešťské smlouvy..
náhradní list
Myší ant i-“humánní Fe protilátka byla získána od Jackson Laboratorie. Tato protilátka ukazuje minimální vazbu k Fc proteinů, vázaným k Fcgama receptoru. Protilátka byla značena za použití Chloramin T metody. Stručně, byla připravená kolona Sephadex G-25 podle instrukcívýrobce.. Kolona byla předem zpracována 10 objemy kolony PBS, obsahujícím 1 % hovězího sérového albuminu pro redukci nespecifické adsorpce .protilátky ke koloně a pryskyřici. Nenavázaný hovězí sérový albumin byl pak vymyt z kolony 5 objemy PBS bez hovězího sérového albuminu. V mikroodstredivkové zkumavce bylo 10 pg protilátky (rozpuštěné v 10 μΐ PBŠ) přidáno k 50 pl 50 ΊηΜ pufru ...........
fosforečnanu sodného (pH 7,2) 2,0 mCi nosiče prostého Nal25I x» .bylo přidáno-a'roztok-byl-dobre-promísen;—15‘'μ!'Čerstvě*'““ připraveného roztoku chloraminu-T (2 mg/ml v. 0.1M pufru fosforečnanu sodného (pH 7,2)) pak bylo přidáno a směs byla
- inkubována po '30 minut při teplotě místnosti a směs pak ihned byla aplikována'na kolonu Sephadexu G^-25, Radioaktivně značená protilátka pak byla eluována z kolony za shromaždování 100-150 „ μΐ frakcí eluátu. Hovězí sérový albumin byl přidán k eluovaným frakcím, obsahujícím radioaktivně značenou protilátku na konečnou koncentraci 1 %. Radiojodace poskytla specifické.·', aktivity v rozmezí'5-10 x IQ15 cpm/nmol proteinu.
Pomocí sklíčkové autoradiografie bylo přibližné 1840000 cDNA screenováno v poolech přibližně 1600 cDNA dokud zkouška jednoho transfektantového poolu neukázala mnoho buněk jasně pozitivních pro flt3:Fc vazbu. Tento pool byl pak rozdělen na pooly o 500 a opět screenován sklíčkovou autoradiografii a byl identifikován pozitivní-pool .· Tento pool byl rozdélen-na pooly 100 a opět screenován. Jednotlivé kolonie z tohoto poolu 100 byly screenovány ,až byl identifikován klon (klon #6C), který . řídí syntézu povrchového proteinu s detegovatelnou flt3:Fc vazebnou aktivitou. Tento klon byl izolován a jeho 0,88 kb náhradní list minutách s následujícím nahrazením roztoku čerstvým kompletním mediem. Buňky byly kultivovány 2 až 3 dny pro umožnění přechodné exprese, inzertovaných sekvencí.
Transfektované monovrstvy CV-l/EBNA-1 buněk byly zkoušeny na expresi f1t3-L sklíčkovou autoradiografií v podstatě tak, jak popsal Gearing a spol. (EMBO J. 8:3667, 1989).
Tranfektované CV-l/EBNA buňky (adherované k děleným sklíčkům) byly promyty jednou vazebným mediem s odtučněným sušeným mlékem (BM-NFDM)(PPMI medium 1640, obsahující 25 mg/ml hovězího sérového albuminu (BSA), 2 mg/ml- az-idu sodného ,, 20 mM HEPÉS, pH 7,2 a 50 mg/ml odtučněného sušeného mléka). Buňky pak byly inkubovány s flt3:Fc v BM-NFDM (1 pg/ml) po 1 hodinu při teplotě místnosti. Po inkubaci byly buněčné monovrstvy v
A dělených sklíčkách promyty třikrát BM-NFDM pro odstranění i, nenavázaného flt3:Fc fuzního pro.teinu a pak inkubovány se 40 ng/ml myší anti-humánní Fc protilátky (popsána dále)(ředění 1:50) po 1 hodinu při teplotě místnosti. Buňky byly promyty třikrát s BM-NFDM, potom 2krát promyty fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) pro odstranění nenavázané 125I-myší anti-humánní Fc protilátky. Buňky byly'
......Λ fixovány inkubací po 30 minut při teplotě místnosi ve 2,5% glutaraldehydu v PBS,pH 7,3, promyty dvakrát v PBS a sušeny na vzduchu. Dělená sklíčka, obsahující buňky byla vystavena Photorímageru (Molecular Dynamics) přes noc, potom smočena Kodak GTNB-2 fotografickou emulzí (6x ředění ve vodě) a exponována ve tmě po 3-5 dnů při 4 °C v boxu za nepřístupu světla. Sklíčka pak byla vyvíjena přibližně 4 minuty v Kodak D19 vyvolávacím zařízení (40 g/500 ml vody), promyta vodou a fixována v Agfa G433C fixéru. Sklíčka byla jednotlivě hodnocena mikroskopem při 25-40násobném zvětšení a pozitivní buňky, exprimující flt3-L byly identifikovány přítomností autoradiografických stříbrných zrn na světlém pozadí.
náhradní list byl titrován pro stanovení počtu k ampicilínu rezostšatních kolonií. Výsledná 0,3A4 knihovna měla 1,84 milionu klonů.
E.coli kmen DH10B buňky transfektované cDNA knihovnou vb sfHAV-E0410 byly umístěny na plotně pro poskytnutí přibližně 1600 kolonií na plotně. Kolonie byly seškrábnuty z každé plotny, spojeny a z každého poolu byla připravena plasmidová DNA. Poolovaná DNA, představující asi 1600 kolonií, pak byla použita pro transfekci sub-konfluentni vrstvy CV-l/EBNA-1 buněk za použití DEAE-dextranu s následujícím ošetřením chloroquinem, podobně jako popsal Luthnann a spol?, Nucl.Acids Ses. 11:1295 (1983) a McCutchan a spol., J.Natl .Cancer Inst.
. 41: 351 (1986).. CV-1./EBNA-1. .buněčná .1 inie ..(ATCC CKL1.0478). konstitutivně exprimuje EBV jaderný antigen-1 řízením z CMV bezprostrední-časný enhancer/promotor. CV1-EBNA-1 byl získán z buněčné linie ledvin afrických opic CV-1 (ATCC CCL 70) jak popsal McMahan a spol. (EMBO J. 10:2821, 1991).
Za účelem transfektování CV-l/EBNA-1 buněk cDNA knihovnou byly buňky udržovány v kompletním mediu (Dulbeccovo modifikované Eagl.eovo medium(DMEM), obsahujícím 10 % (obj./obj.) fetálního telecího séra (FCS), 50 j./ml penicilinu, 50 j/ml streptomycinu, 2 mM L-glútaminu) a byly umístěny v hustotě asi 2 x 105 buněk/jamka na jednojamková sklíčka(Lab-Tek). Sklíčka byla předem ošetřena s 1 ml lidského fibronektinu (10 2g/ml v PBS) po 30 minut a pak lx promyta PBS. Media byla z adherentní buněčné vrstvy odstraněna a nahrazena 1,5 ml kompletního media, obsahujícího 66,6 gM chloroquin-sulfátu. Dvě desetiny ml DNA roztoku (2 gg DNA, 0,5 mg/ml DEAE-dextranu v kompletním mediu, obsahujícím chloroquin) pak byly přidány k buňkám a inkubovány 5 hodin. Po inkubaci byla media odstraněna a buňky byly šokovány přídavkem kompletního media, obsahujícího 10 % DMSO-po 2,5 až 20 náhradní list ' Vazba flt3:Fc byla pozorována na myší T-buňky a .lidské T-buňky a proto byla zvolena myší T-linie (0,3A4) pro její snadnost růstu. Myší 0,3A4 cDNA knihovna v sfHAV-EO byla připravena podle McMahana a spol. (EMSO J.,č.lO; 2821—2832 1991). sfHAV-EO je savčí expresívní vektor, který se také replikuje v E.coli. sfHOV-EO obsahuje počátky replikace získané z SV40, Epstein-Barr viru a pBR322. a derivátem HAV-EO popsaného Dowerem a spol., J.Immunol. 142:4314 (1989) sfHAV-EO se. liší od HAV-EO delecí intronu přítomného v adenovirus 2 tripartitní leader sekvenci v HAV-EO. Stručně, myší T-buněčná cDNA byla klonována do Sáli místa sfHOV-ĚO adaptorovou métodou podobnou metodě popsané Haymerlem' a spol. (Nud .Acids Fes. 14:8615, 1986) za použití následujícího oligonukleotidového adaptérového páru:
5' TCGACTGGAACGAGACGACCTGCT 3’ 3' GACCTTGCTCTGCTGGACGA 5’
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4
Dvojřetězcová, tupě zakončená, náhodně primovaná cDNA > byla připravena z 0,3A4 poly(A).+RNA v podstatě jak popsal *
Gubler a Hoffman, Gena, 25:263-269(1983), použitím Pharmacia DNA kitu. Výše uvedené adaptéry byly přidány k cDNA jak popsáno Haymerlem a spol. Materiál s nízkou molekulovou hmotností byl odstraněn pasážováním přes Sephacryl S-1000 při 65 °C a cDNA byla ligována do sfHAV-E0410, který byl předem nařezán s Sáli a ligován ke stejnému oligonukleotidovému páru. Tento vektor byl označen jako sfHAV-E0410. DNA byla elektroporována (Dower a spol., Nucleic Acids Fes., 16:6127.-6145(1988) do E.coli DH10B a po jedné hodině růstu při 37 °C byly transformované buňky zmrazený v jednorai1 i 1 itrových podílech v SOC mediu (Hanahan a spol,, J.Mol.Biol. ,
166:557-580 (1983), obsahujícím 20 %.glycerolu. Jeden..podii.
náhradní list považované za pozitivní na flt3:Fc vazbu.
Příklad 3 ' .
Izolace a klonování flt3-L cDNA z myší T-buněčné cDNA knihovny
Myší T-buněčná' cDNA knihovna buněčné linie P7B-0,3A4 byla ; zvolena jako možný zdroj flt3-L cDNA. P7B-0.3A4 je myší, T fy buněčný kolon, který' je Thyl.2+, CD4*, CD8, TCRab4,. CD44*.
£
I Púyodně byla klonována při buněčné hustotě 0,33 buněk/jamka za fy, přítomnosti rHUIL-7 a imobi1 izována anti-CD3 MAb a pak í * i . ponechána růst v kontinuální kultuře více.než 1 rok pasážováním jednou týdně v mediu, obsahujícím 15 ng/ml rHUIL-7. ' Rodičovská buněčná 1 inie _byl_a získána z buněk , lymfatických uzlin SJL/J myši imunizované 50 nmol PLPi39-151 peptidu a 100 pg Mycobacterium. tuberculosis H37Ra v nekompletním Freudově adjuvans. PLP je- proteolipidová proteinová sl:2ka myelinového pouzdra centrálního nervového systému. Peptid složený z aminokyselin 139-151 bnyl dříve uveden jako encefalogenní peptid v experimentální autoimuriní encefalomyelitis. (EAE), myší model pro roztroušenou sklerózu v SJL/J. myši. (Touhy V.K., Z.Lu, R.A.Sobel, R.A.Laursen a M.B. Lees; 1989.· Identification of an encephalitogenic determinant of myelin proteolipid protein for
- ,· • SJL mice, J.Immonol. 142:1523). Po počátku kultivace za i' ’ ' · přítomnosti antigenu, byla rodičovská buněčná linie, označená PLP7, ponechána v kontinuální kultuře s rHuIL-7 (a bez , antigenu) více než 6 měsíců před klonováním.
P7B-0,3A4 proliferuje pouze v odpovědi na velmi vysoké koncentrace PLP139- 151 peptidu za přítomnosti ozářených syngenních splenocytů a není encefalogenní nebo alloresponživní. Tento klon proliferuje k imobi1 izovanému anti-CD3 MAb, ÍL-2 a IL-7 ne ale k IL-4. ...
náhradní list
70) a COS-7 buněk (ATCC CRL 1651), oboje získány z opičích ledvin. Hladina exprese flt3:Fc byla relativně vysoká jak v CV-1 tak COS-7 buňkách. Byl proveden pokus o expresi ve 293 buňkách (transformované primární lidské embryonální ledvinové buňky, ATCC CRL 1573).
293 buněk transfektovaných sfHAV-EO/f113:Fc .vektorem bylo kultivováno v rotačních lahvích pro umožnění přechodné exprese fuzního proteinu, který je sekretován do kultivačního media přes f 113 signální peptid. Fuzní protein byl čištěn na protein A Sepharose kolonách, eluován a použit pro screening buněk na schopnost vázat flt3:Fc jak je popsáno v příkladech 2 a 3.
Příklad 2
Screening buněk na navázání flt3:Fc *
Přibližně 100 různých primárních buněk a buněčných líní spadajících do následujících obecných kategorií: primární myší fetální mozkové buňky, linie myších fetálních jaternich buněk., linie krysích fetálních mozkových buněk, linie lidského plicního karcinomu (fibroblastoid), linie lidských a myších lymfoidních a myeloidních buněk byly zkoušeny na flt3:Fc vazbu. Buněčné linie byly inkubovány s flt3:Fc, pak biotinylovány anti-humánní Fc protilátkou, a pak streptavidin-phycoerythrin (Becton Dickinson). Biotinylovaná protilátka byla zakoupena od Jackson Immunoresearch Laboratories. Streaptavidin se váže k biotinové molekule připojené k anti-humánní Fc protilátce, která se naopak váže k Fc části flt3:Fc fuzního proteinu. Phycoerythrin je fluorescentní phycobi1iproteih, který slouží jako detegovatelné značení. Hladina fluorescenčního signálu byla měřena pro každý buněčný typ použitím FACScanR tokového cytometru (Becton Dickinson). Byly identifikovány buněčné typy náhradní list pantového regionu k nativnímu C-konci.tj. má v podstatě plnou délku proti látkového Fc regionu. Fragmenty Fc regionů, např. ty, které jsou zkráceny na C-terminálním konci, mohou být také použity. Fragmenty výhodně obsahují více cysteinových zbytku (alespoň cysteinově zbytky v pantovém regionu) pro zprostředkování vytvoření meziřetězcových disulfidových vazeb mezi Fc polypeptidovými částmi dvou separátních flt3:Fc fuzních proteinů, tvořících dimery jak je popsáno výše.
Asp7.18 restrikční endonukleásové místo štěpeni bylo zavedeno proti směru flt3 kódujícího regionu.. Byl'izolován Asp 718-NotI fragment myší flt3 cDNA (obsahující celou extracelulárni doménu.^transmembránoyý^region. a„mal.ou_č.ást^ _____cytoplasmické domény). Výše popsaná Asp718-Notl flt3 částečné cDNA byla. klonována do pBLUESCRIPT SKR vektoru, obsahujícího Fc cDNA.tak, že flt3 cDNA je umístěna proti směru Fc cDNA. Jednořetězcová DNA získaná z výsledné genové fúze byla mutagenizována metodou popsanou Kunkelem (Proč. Na.t 1 .Acad. Sci . USA82:488 , 1985) a Kunkelem .a spol.
(Methods in Enzymol. 154:367, 1987) za účelem dokonalé fúze celé extracelulárni domény flt3. k Fc sekvenci..Mutagenizovaná DNA byla sekvencována pro ověření, .že byly odstraněny, správné nukleotidy (tj. transmembránový region a částečně cytoplasmické doména DNA) a ze f1t3 a Fc sekvence byly ve stejném čtecím rámci. Fúzní cdNA pak byla vyříznuta a inzertována do savčího expresního vektoru označeného sfHAV-EO 409, který byl rozřezán pomocí Sall-Notl a Sáli a Asp7l8 konce ztupeny. sfHAV-EO vektor (známý také jako pDC406) je popsán McMahanem a spol. (EMBO J.,10; č.10:2821-2832 (1991)).
Flt3:Fc fúzní proteiny jsou výhodně syntetizovány v rekombinantní savčí buněčné kultuře. Flt3:Fc fúzi obsahující expresívní vektor byl transfektován do CV-l buněk (ATCC CCL náhradní list
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava fuzního proteinu flt3-L receptor:Fc
Tento příklad popisuje klonování myší f1t3 cDNA a í
j . konstrukci expresivního vektoru, kódujícího rozpustný fuzni , protein myší f1t3-réceptor:Fc pro použití při detekci cDNA '1 kl-onú. kódujících flt3-L. Polymerásová řetězová reakce (PCR) j klonování f1t3 cDNA z myší T-buňky byla provedena použitím oligonukleotidových primerú jak je popsáno Lymanem a spol.-, i Oncogene, 8:815-822 (1993) - práce je zde zahrnuta jako odkaz, í cDNA sekvence a kódující aminokyselinová sekvence pro flt3 receptor je popsána Kosnetem a spol., Oncogene,
6:1641-1650(1991) - práce je zde zahrnuty jako odkaz. Myší/ f lt3 protein má 542 aminokyselinovou extracelulární doménu,- 21 · S aminokyselinovou transmembránovou doménu a 437 aminokyselinovou cytoplasroickou doménu.
Před fúzováním myší f 113 cDNA k N-konci' cDNA kóduj ící s-Fc ' podíl molekuly lidského IgGl byl fragment amplif ikované„. myší , f1t3 cDNA inzertován do Asp718-Notl místa pCAV/NOT, popsaného j v PCT přihlášce WO 90/05183, DNA, kódující jediný'řetězec
I polypeptidu, obsahující Fc region lidské IgGl protilátky, byla i klonována do Spěl místa pBLUESCEIPT SKR vektoru, který je I * komerčně dostupný od Stratágene Cloning Systems, La Jolla, ( Kalifornie. Tento plasmidový vektor je replikovatelný v E.coli .
i ' a obsahuje'póly 1inkerový segment, který zahrnuje 21 unikátních f restrikčních míst. Unikátní Bgll místo bylo zavedeno blízko 5'*; » konce inzertované Fc kódující sekvence, takže Bgll místo zahrnuje kodony pro aminokyselina tři a čtyři Fc polypeptidu.
Kódovaný· Fc polypeptid se rozkládá od- N-koncového > náhradní list erythrocytových přízraků nebo sféroblastů. Takové kompozice budou ovlivňovat fyzický stav, rozpustnost, stabilitu, rychlost in vivo uvolnění a rychlost in vivo clearence f1t3-L. Flt3-L může být také konjugován k protilátkám proti tkáňově specifickým receptorúm, ligandům nebo antigenům, nebo kopulován k ligandům tkáňově specifických receptorů. Jestliže byl flt3 receptor nalezen v neoplastických buňkách muže být flt3-L konjugován k.toxinu,. čímž se flt3-L použije k doručení toxinu ke specifickému místu, nebo může být použit k senzibi1izování takových neoplastických buněk k následně podávaným antineoplastickým činidlům.
. Flt3-L může být podáván topicky, parenterálně nebo____ inhalací. Výraz parenterálně zahrnuje subkutánní injekce, intravenozní, intramuskulární', intracisternální injekce nebo infuzní techniky. Tyto kopozice budou typicky obsahovat účinné množství flt3-L, samotného nebo v kombinaci s účinným množstvím jakéhokoliv účinného materiálu. Takové dávkové a požadované lékové koncentrace obsažené v kompozicích se mohou měnit v závislosti na mnoha faktorech, zahrnujících zamýšlené použití, pacientovu tělesnou hmotnost a věk a způsob podání. Předběžně se dávka stanoví testy na zvířatech a škála’ďávek pro podání člověku se stanoví podle prxe známé v oboru. Jestliže se. vezmou v úvahu výše uvedené poznatky, mohou být typické dávky flt3-L v rozmezí od asi 10 pg na metr čtvereční·. Preferované dávkové rozmezí je řádově asi 100 pg na čtvereční metr až asi 300 pg na čtvereční metr.
Následující příklady slouží k ilustraci výhodných provedení vynálezu a předložený vynález nijak neomezuji.
náhradní list
Antisense nebo sense oligonukleotidy také mohou být zavedeny do buňky, obsahující cílovou nukleotidovou sekvencí tvorbou konjugátu s ligand vázající mohekulou, jak je popsáno ve WO 91/045753. Vhodné ligand vázající molekuly zahrnují, ale nejsou tak omezeny, buněčné povrťchové receptory, růstové faktory, jiné cytokiny nebo jiné ligandy, které se vážou k buněčným povrchovým rceptorúm. Výhodně konjugace ligand vázající molekuly podstatně neinterferuje se schopností ligand. vázající molekuly se vázat k její odpovídající molekule nebo receptoru, nebo blokovat vstup antisense nebo.sense o 1 i gonukl ečt idu nebo ' j eho'kón jugované verze k buňce.
Alternativně antisense nebo sense oligonukleotid může být zaveden do buňky, obsahující nukleokyselinovou sekvenci tvorbou komplexu oligonukleotid-1ipid, jak je popsáno ve WOý 90/10448. Antisense nebo sense o 1igonukleotid-1ipid í % komplex je výhodně disociován v buňce endogenní lipasou.
Flt3-L polypeptidy podle vynálezu mohou být formulovány , 'ki' známými metodami pro přípravu farmaceuticky použitelných kompozic. Flt3-L může být kombinován ve směsi, bud jako^ samotný účinný materiál nebo s jinými známými materiály, s farmaceuticky vhodnými ředidly (např. Tris-HCl., acetát, fosfát), chránícími látkami (např. Thimerosal, benzylalkohol, parabeny), emulgátory, solubilizátory, přísadami a/nebo nosiči. Vhodné nosiče a jejich formulace jsou popsány v
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.vyd.1980, Mack , ta
Publishing Co. Dále takové kompozice mohou obsahovat flt3-L komplexovaný s polyethylenglykolem (PEG) , kovovými ionty, nebo být inkorporovány do polymerních sloučenin jako je kyselina polyoctová, kyselina polyglykolová, hydrogely atd., nebo inkorporovány do liposomú, mikroemulzí, micel, jednolamelárních nebo multilamelárních vesiklů, náhradní list blokování exprese f 113-L proteinů’, Antisense nebo sense o 1igonukleotidý dále zahrnují oligonukleotidy, mající modifikované cukr-fosfodiesterové řetězce (něho jiné cukrové vazby, jako jsou ty, které jsou. popsány ve W091/06629) a kde takové cukrové vazby jsou odolné k endogenním nukleásám.
Takové pl igonukleótidy s rezistentními cukrovými vazbami jsou stabilní in, vivo (tj. schopné odolávat enzymatické degradaci) , ale zachovávají schopnost sekvenční specifity k vazbě k cílovým nukleotidovým .sekvencím. Jiné příklady sense nebo antisense oligonukleotidů zahrnují takové oligonukleotidy, které jsou kovalentně připojeny, k . organickým- skupinám,- jako jsou ty, které jsou popsány ve WO 90/10448 a jiné skupiny, kt^eré zvySuj i a f i n i t u o 1 i g o nuk 1 e o t i du. p r cu .c í. l.o.v.é«____.____________ bukleokvselinové sekvence, jako je poly-(L-lysin). Dále ještě mohou být k sense nebo antisense oligonukleotidům ’ připojena interkalační činidla jako.je ellipticín a alkylační činidla, nebo komplexy kovů pro modifikaci vazebných specifit antisense nebo .sense ol igonukleot idů pro cílovou nukleotidovou sekvenci.
Antisense1’ nebo sense ol igonukleotidy mohou být zavedeny do buňky, obsahující cílovounukleokyselinovou sekvenci jakoukoliv genovo transfer metodou nebo použitím genových transfer vektoru jako je virus Epstein-Barr.
Antisense nebo sense jsou výhodně zavedeny do buňky, obsahující cílovou nukleokyselinovou sekvenci inzercí Antisense” nebo sense oligonukleotidu do vhodného retrovirálního vektoru, potom kontaktem buňky s retrovirus vektorem, obsahujícím inzertovanou sekvenci, bud in vivo .nebo. ex vivo. Vhodné retrovirální vektory zahrnují, ale nejsou tak omezeny myší retrovirus M-MulV, N2 (retrovirus získaný z M-MuLV), nebo dvojkopiové vektory označené DCTSA, DCT5B a DCTC5C (viz PCT přihláška US 90/02656) ..
náhradní list mohou být rozrušeny jakoukoliv běžnou metodou, zahrnující cykly zmražení-tání, sonifikaci, mechanické rozrušení nebo použití buňky lyžujících činidel.
Transformované kvasinkové hostitelské buňky jsou obvykle používány pro expresi f1t3-L jako sekretovaného polypeptidu za účelem zjednodušení čištění. Sekretovaný rekombinantní polypeptid z fermentace kvasinek jako hostitelských buněk může být čištěn metodami analogickými metodám popsaným Urdalem a * spol. (J.Chromatog. 296:171, 1984). Urdal a spol. popisují w, dvapostupné stupně HPLC s reverzní fází pro čištění 7 jů . rekombinantního IL-2 na preparativní HPLC koloně.
Antinsense nebo sense oligonukleotidy, obsahující jednoretězcovou nukleokyselinovou sekvenci (bud PNA nebo DNA) schopné navázáni k cílové flt3—L mRNA sekvenci (za tvorby dvoušroubovice) nebo k flt3-L sekvenci ve dvojřetězcovém DNA helixu (za tvorby trojitého helixu) mohou být připraveny podle vynálezu. Antinsense nebo sense oligonukleotidy podle předloženého vynálezu obsahují fragmenf kódujíčího regionu flt3-L cDNA. Takový fragment obecně obsahuje alespoň asi 14 nukleotidů, výhodně od asi 14 do asi 30 nukleotidů. Schopnost vytvořit antisense nebo sense oligonukleotidy založené na cDNA sekvenci pro daný protein je popsána například Steinem a Cohenem, Cancer J?es.48:2659, 1988 a van der Krolem a spol., BioTechniques 6:958, 1988.
Vazba antisense nebo sense o 1 igonukleotidů k cílovým nukleokyselinovým sekvencím vede ke tvorbě komplexů, které blokují translaci- (RNA) nebo transkripci (DNA) jedním z několika způsobů, zahrnujících.zvýšenou degradaci duplexů, prematurovanou terminaci transkripce nebo translace nebo jiné způsoby. Antisense oligonukleotidy tak mohou být použity ke náhradní list akrylamidového, agarosového, dextranového, celulozového nebo jiného typu obvykle používaného v čištěni proteinu. Alternativně muže být použít stupeň kationtové výměny. Vhodné kationtové měniče zahrnují různé nerozpustné matrice, zahrnující sulfopropylové nebo karboxymethylové skupiny. Preferovány jsou sulfopropylové skupiny. Nakonec je možno pro další čištění f1t3-L použít jednoho nebo více stupňů vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzní fázi (RP-HPLC) za použití RP-HPLC media (např. silikagelu, majícího připojené methylové nebo jiné alifatické skupiny. Některé nebo všechny z uvedených stupňů čištění, v různých kombinacích, jsou dobře známé a mohou být použity pro poskytnutí v podstatě homogenního rekombinantního proteinu..
Je možno použít afinitní kolonu, obsahující Iigand vazebnou doménu flt3 receptorů k afinitnímu čištění exprimovaných flt3-L polypeptidu. Fit—3 polypeptidy mohou být odstraněny z afinitní kolony použitím konvenčních technik, např. elucí vysoce solným pufrem a pak být dialyzovány do nižšího solného pufru pro použití nebo změnou pH nebo jiných složek v závislosti na afinitě použité matrice. Alternativně může afinitní kolona obsahovat protilátku, která váže_f1t3~L, Příklad 6 popisuje postup použití flt3-L podle vynálezu pro generování monoklonálních protilátek řízených proti flt3-L.
Rekombinantní protein produkovaný v bakteriální kultuře je obvykle izolován počátečním rozbitím hostitelských buněk, odstředěním, extrakcí z buněčných pelet, je-li peptid nerozpustný nebo z kapaliny supernatantu je-li polypeptid rozpustný s následuj ícím j edním nebo v-íce- stupni. zahuštění, vysolení, iontové výměny, afinitního čištění nebo chromatografie dělící podle velikosti. Nakonec může být použita RP-HPLC pro konečné stupně čištění. Mikrobiální buňky popsaná Cosmanem a spol., Nátuře 312:768 (1984); IL-4 signální peptid popsaný v EP 367566; typ I IL-l receptorového’ signálního peptidu popsaného v US patentu 4968607 a typ ΪΙ IL-1 receptorového signálního peptidu popsaný v EP 460846,
FIt3—L jako izolovaný nebo homogenní protein-podle vynálezu muže být produkován rekombinantními expresními systémy jak jsou popsány výše nebo čištěn z přirozeně se vyskytujících buněk. Fit—3 může být čištěn v podstatě do homogenity, jak je indikováno jediným proteinovým pruhem při analýze pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE).
Jeden způsob výroby flt3-L zahrnuje kultivaci hostitelské buňky transformované expresním vektorem, obsahujícím DNA sekvenci, která kóduje flt3—L za podmínek, dostačujících k promotování exprese flí3-L. Flt3-L se pak získá z kultivačního media nebo buněčných extraktů, v závislosti na použitém expresním systému. Jak je známo odborníkům v oboru, postupy pro čištění rekombinantního proteinu se budou'měnit podle takových faktorů jako je typ použitých hostitelských buněk a je-li nebo není rekombinantní protein sekretován do . ..· . kultivačního media. *
Například jestliže se použijí expresní systémy, které sekretují rekombinantní protein, musí být kultivační medium nejprve zahuštěno použití komerčně dostupného proteinového koncentračního filtru, například ultrafi 1trační jednotky Amicon nebo Millipore Pellicon. Po stupni zahuštění může být koncentrát aplikován na čistící matrici jako je gelové filtrační medium. Alternativně může být použita aniontovýměnná pryskyřice, například.matrice nebo substrát, mající připojené diethylaminoethylové (DEAE) skupiny. Matrice může být
Transkripční a translační kontrolní sekvence pro expresivní vektory savčích hostitelských buněk mohou být vyříznuty z virových genomú. Obvykle použité promotorově sekvence a enhancerové sekvence j sou .odvozeny od polyoma viru, adenovirů 2, opičího víru 40 CSV40) a lidského cytomegaloviru. DNA sekvence získané ze SV4Q virového genoniu, .např.íanti SV4-0-·· původu, časného a pažního promotoru, enhanceru, spojovací a polyadenylační místa mohou být použita pro poskytnutí genetických elementů pro expresi strukturální genové sekvence v Savčí hostitelské buňce. Virové časné a pozdní promotory jsou zejména vhodné protože oboje jsou snadno získatelné z virového genomu jako fragment, který může také obsahovat vírální počátek replikace (Fiers a spol .,· jVaíure 273:113 , 1978). Menší nebo větší SV4Q fragmenty mohou být také P ouž i ty,. z a _pr e dpo k l-adu, - ž e - z ah r nu j í “ p r i b l'i ž n ě~ 2 5 0 “ b'p~sekvenci . prostírající se od Hind III místa, ke Bgl I. místu umístěnému v SV.40 virálním počátku replikace.
Příklady expresívních vektorů pro použití v savčích hostitelských buňkách mohou být konstruovány jak je popsáno Okayama-ou a Bergera (Mo. Cell .Biol ,3:280, 1983). Vhodný, systémy pro stabilní vysokou hladinu exprese savčích cDNA v C127 epitheliálních. buňkách myší mléčné žlázy mohou být konstruovány v podstatě jak je popsáno Cosmanem a spol.
(Mol.Tmmunol. 23:935, 1986). Vhodný vysoce expresivní vektor, PMLS.V ,Ν.Ι/Ν.4,. „popsaný Cosmanem a spol,, Nátuře 312:768., 1984. byl uložen jako ATCC 39890. Další vhodné savčí expresivní vektory jsou popsány v EP-A-0367566 a v US patentové přihlášce č. 07/701415, podané 16.května 1991, která je zde zahrnuta jakoodkaz. Vektory mohou být získány z retrovírů. Místo nativní. si.gná.Iní sekvence může-, být- přidána heterologní.......
signální sekvence, jako je signální sekvence pro IL-7 popsaná v US patentu 4965195; signální sekvence pro IL—2 receptor nebo více restrikčních míst. Toto bude usnadňovat fúzi leader sekvence ke strukturálnímu genu.
Kvasinkové transformační protokoly jsou známé odborníkům v oboru. Takový protokol je popsán Hinnenem a spol.,
Proč.Nati .Acad.Sci .(JSA 75:1929, 1978. Hinnen a spol. podle protokkolu vybírají Trp* transformanty v selektivním mediu, kde selektivní medium obsahuje 0,67 % kvasnicové dusíkaté báze, 0,5 % casaminokyselin, 2 % glukózy, 10 gg/ml adeninu a
20. pg/ml uracilu.
Kvasinkové hostitelské buňky transformované vektory obsahujícími ADH2 promotor sekvenci mohou růst pro vyvolání exprese v bohatém mediu. Příkladem bohatého media je medium které obsahuje 1 % kvasnicového extraktu, 2 % peptonu a 1 % glukózy, doplněné 80 pg/ml uracilu. Dereprese ADH2 promotoru se objevuje tehdy, když je glukóza vyčerpána z media.
Systémy savčích nebo hmyzích hostitelských buněčných kultur mohou být také použity pro exprimování rekombinantních f1t3-L polypeptičů. Bakulovirové systémy pro produkci heterolognich proteinů ve hmyzích buňkách jsou. popsány .
Luckowem a Summersem, Bio/Technology 6:47 (1988). Mohou být také použityv zavedených buněčných liniích savčího původu. Příklady vhodných savčích hostitelských buněčných liniích zahrnují COS-7 linii buněk opičích ledvin (ATCC CRL
1651)(Gluzman a spol., Cell 23:175, 1981), L-buňky, C127 buňky, 3T3 buňky (ATCC CCL 163), buňky vaječníků čínského křečka (CHO), HeLa buňky a BHK (ATCC CRL 10) buněčná linie a CV-l/EBNA-l buněčná linie získaná z buněčné linie afrických opic CVI (Afričan green monkey) (ATCC CCL 70) jak .je popsána McMahanem a'spol. (EMBO J. 10:2821, 1991 ).
Kvasinkové sektory budou často obsahovat počátek replikaóni sekvence ze 2μ kvasinkového plasmidu, autonomně se replikující sekvenci (ASS), promotor region, sekvence pro polyadenylaci, sekvence pro transkripční terminaci a selektující markér gen. Vhodné promotorové sekvence pro kvasinkové vektory zahrnují, mezi jinými, promotory pro metal lothionein,’ 3-fosfoglýcerá.t kiriásu (Hizeman a spol., J.Biol.Chem. 255:2073, 1980) nebo jiné glykolytické enzymy (Hess á spol., J.Adv.Enzyme Reg 7:149, 1968 a Holland a spol., Biochem. 17:4900, 1978), jako je.enolása, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenása, hexokinása, pyruvát-dekarboxylása, fosfofruktokinása, glukosa- 6-fosfátisotnerása, 3-fosfoglycerát mutása, pyruvát kinása, triosefosfát isomerása, fosfoglukosa isomerása a glukokinása. Jiné vhodné vektory a promotory pro použití ve kvasinkové ^ejcpres i j sou„b.l í že^.p.opsány-v-prác-i-Hi t-zemana';·' ‘EPA-7’36”57ne'b'o. 1
Fleera a spol., Gene, 107:285-195 (1991); a van den B.ergem a spol. Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Jinou alternativou je glukosa-represibilni ADH2 promotor popsaný Russellem a spol., (J.Biol.Che. 258:2674, 1982) a Beierem a spol. (Nátuře 300:724, 1982). Shuttle vektory replikovateIn# jak ve kvasinkách tak v E.coli mohou být konstruovány inzercí DNA sekvenci z pBR322 pro selekci a replikaci v E.coli (Ampr gen a počátek replikace) do výše popsaných kvasinkových vektorů.
Kvasinková α-faktor leader sekvence může být použita.pro přímou sekreci flt3-L polypeptidu. α-faktor leader sekvence je často inzertováná mezi promotor sekvencí a sekvenci strukturálního genu. Viz např. Kurjan a spol, Cell 30:933,
1982; Bitter a spol., Proč. Nati.Acad.Sci., USA 81:5330,1984; US patent 4546082 a EP 324274 . Další Leader sekvence vhodné pro usnadnění sekrece re_kombxnantních polypeptidu ze;kvasinkových hostitelů jsou známé odborníkům v oboru. Leader sekvence může být modifikována blízko svého 3' konce, aby obsahovala jedno markér gen je například gen, kódující protein, který udílí antibiotickou rezistenci nebo který dodává autotrofický požadavek. Příklady vhodných expres ívní.ch vektorů pro. prokaryotické hostitelské buňky zahrnují ty, které jsou získány z komerčně dostupných plasmidů jako je klonovací vektor pBR322 (ATCC 38017). pBR322 obsahuje geny pro ampici1inovou a tetracyklinovou rezistenci a tak poskytuje jednoduché prostředky pro identifikaci transformovaných buněk. Pro konstrukt expresívního vektoru za použití pBR322, se vhodný promotor a flt3-L DNA sekvence inzertují do pBR322 ) vektoru. Jiné komerčně dostupné vektory zahrnují, například, 1 PKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko) a pGEMi j (Promega Biotec, Madison, WI, USA). I
Promotorové sekvence běžně používané pro rekombinantní expresívní vektory pro prokaryotické hostitelské buňky j ‘ zahrnují (3-laktamása(penicilinása) , laktosa promotor systém (Chang a spol. Mateře 275:615, 1978; a Goeddel a spol., Nátuře
281:544, 1979) tr^ptofan (trp) promotor systém (Goeddel a spol., Nucl·.Acids Res.8:4057, 1980; a EP-A-36776) a tac promotor (Maniatis, Molecular Cloning:A Labořatořy Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, str. 412, 1982). Zvláště -vhodný .
ř? 1 >
expresívní systém prokaryotických hostitelských buněk využívá | i
lambda Pl promotor a cI857ts termolabilní represor sekvenci. f
Plasmidové vektory dostupné z American Type Culture Collection, které inkorporují . deriváty lambdaPt promotor zahrnuje plasmid pHUB2 (rezident v E.coli kmenu JMB9 (ATCC 37092)) a pPLc28 (rezident v E.coli RR1 (ATCC 53082)).
' ' 1
Flt3-L polypeptidy.alternativně mohou být exprimovány v I kvasinkových hostitelských buříkách, výhodně rodu Saccharomyces ;
(např. S. cerevisiae) . Jiné rody kvasinek jako je Pichia,
K.lactis nebo Kluyveřomyces, mohou být také použity.
expresívních vektorů. Například DNA sekvence pro signální peptid (sekreční leader) může být fúzována v rámci k'flt3-L sekvenci tak, že f113-L je na počátku trans 1atována jako’ fuzní protein, obsahující signální peptid. Signální peptid, který je funkční v zamýšlených hostitelských buňkách zvyšuje extracelulárni sekreci f113—L polypeptidu. Signální peptid může být odštěpen z flt3-L polypeptidu po sekreci flt3-L z buňky.
Vhodné hostitelské buňky pro expresi f1t3~L polypeptidu zahrnují prokaryoty, kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky. Vhodné klonovací a expresívní vektory pro použití s bakteriálními, fungálními, kvasinkovými a savčími buněčnými hostiteli jsou popsány, například, v práci Pouwelse a spol. Cloning Vectors: .4 Labora tory iWanuaý ^ Elsevier,_. New_York_ (1985). Buněk prosté translační systémy mohou být také využity pro produkci flt3-L polypeptidú za použití PNA získaných ze zde popsaných DNO konstruktů.
Prokaryoty zahrnuji gram-negativní nebo gram-ροζ itivní organismy, například E.coli nebo Bacilli. Vhodné prokaryotické hostitelské buňky pro transformaci zahrnují, například.. E.coli, Bacillus substilis, Saltnonel la typhimuriutn a různé jiné druhy rodů Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus. V prokaryotické hostitelské buňce jako je E.coli, může flt3-L polypeptid obsahovat N-koncový methioninový zbytek pro usnadnění exprese rekombinantního polypeptidu v prokaryotické hostitelské buňce.N-koncový Met může být odštěpen z exprimovaného rekombinantního flt3—L polypeptidu.
Expresívní vektory pro použití v prokaryotických hostitelských buňkách obecně obsahují jeden nebo více fenotypicky selektujících markér genů. Fenotypicky selektující náhradní list nestímuluje proliferaci maturovaných B buněk nebo makrofágů.
Přiklad 12
Analýza thymu z f 113—L natfaérně exprimující myši
Tento příklad popisuje analýzu thymu z transgenni myši připravené postupem podle příkladu 9. Šest dospělých myší, . každá přibližně ve stáří tří měsíců, bylo usmrceno. Thymus kaž.dé myši byl vyňat a připravena jediná buněčná suspenze.
FACS analýza demonstruje, že se neobjevila žádná celková změna v počtu buněk,a že myši nevykazují žádnou změnuv poměrech zrání thymocytů za použití markérů:
CD4 vs. CDS; CD3 vs. αβΤΟΪ T buněčný receptor) a CD3 vs gamaÓTCP (T buněčný receptor). Nicméně se objevila změna v poměrech určitých buněčných typů v CD4* a CDS* kompartmentu (tj. ne j časně j š í ch buňkách vzhfedem k vývoji; které představují •přibližně 2 % až 3 % celkových buněk thymu). Speciálně CD4 a CD8* buňky se v thymu vyvíjejí ve třech stadiích. Stadium 1 představuje buňky, mající Pgp-1++,HSA+ a IL-2 receptor-negativní (IL-2R) markéry. Po 1. stadiu se thymoyé buňky vyvíjejí do stadia 2, zahrnujícího buňky mající Pgp-i+, HSA++ a IL-2R** markéry .a pak do stadia 3 charakterizovaného buňkamimajíčími Pgp~l*/“, HSA++ a IL-2R markéry. Thymové buňky ve stadiu 2 transgenni myši byly redukovány na asi 50 %, zatímco populace buněk ve stadiu 3 byla úměrně zvýšena. Tyto údaje naznačují, že flt3— L posouvá 'thymové buňky ze stadia 2. do stadia 3 vývoje, což znamená, že flt3—L je aktivní v časných T buňkách.
náhradní list ,í
- fa ’¥
V
P^rí«cl3^13 ·
Použití flt3—L v transplantaci periferních kmenových buněk
Tento příklad popisuje metodu použití flt3-L v autologní transplantaci periferních kmenových buněk (PSC) nebo periferních krevních progenitorových buněk (PBPC). Typicky se PBPC a PSC transplantace provede na’ pacientech, jejichž kostní dřeň je nevhodná pro' odebrání například z důvodů dřeňové ·, abnormality nebo malignance.
'íj
Před odebráním buněk může být žádoucí1 mobi1izovat nebo zvýšit počty obíhajících PBPC a PSC. Mobilizace může zlepšit . o d e b r á.n ί _ P.B PC „ a „ P S C . a „ j e. .d o s a ž i t e_l n á. i n t r a ve η o z n ím podáním .. .......' flt'3-L pacientům před odběrem takových buněk. Postupně nebo současně s f l,t3-L v kombinaci mohou být. podány . j i né růstové faktory jako je CSF-1, GM-CSF, SF., G-CSF, EPO, IL-i, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, II>9, IL-10, IL-11, IL-12,
IL—13, IL—14, IL—15, GM-CSF/IL-3 fuzní proteiny, LIF,FGF a jejich kombinace. Mobilizované nebo nemobi1 izované PBPC a PSC jsou odebrány za použití aferézních postupů známýcj v oboru.
Viz například Břshop.a spol., B.lood,.sv .83 ,č .2., s-tr.610-616 -.,.
(1994). Stručně,. PBPC a PSC se odeberou za použití konvenčních zařízení, například Haemonetics Model V50 aferézní zařízení (Haemonetics, Brainture, MA). Čtyřhodinové odběry se provádějí typicky ne více než pětkrát týdně až je shromážděno přibližně
6,5 x IQ8 mononukleárních buněk (MNC)/kg pacienta. Podíly' odebraných.PBPC a PSC jsou zkoumány na obsah granulocyt-makrofág kolonie tvořící jednotky (CFU-GM) ředěním přibližně 1:6 Hankovým vyváženým solným roztokem bez vápníku \ nebo hořčíku (HESS) a navrstevy na lymfocytové separační medium (Organon Teknika, Durham, Severní Karolina). Po odstředění se na styčné ploše MNC oddělí, promyji a resuspendují v HBSS. Jednomi1 i 1itrové podíly, obsahující náhradní list přibližně 300000 MNC, modifikované McCoyovo 5A medium, 0,3 % agaru, 200 j/ml rekombinantního lidského GM-CSF, 200 j/ml rekombinantního lidského IL-3 a 200 j/ml rekombinantního lidského G-CSF se kultivují při 37 °C v 5% CO2 ve vzduchu nasyceném vlhkostí 14 dnu. Popřípadě mohou být ke kulturám přidány flt3-L nebo GM-CSF/IL-3 fuzní molekuly’(PIXY 321).
Tyto kultury se vybarví Wrightovým barvivém a spočtou se CFU-GM kolonie za použití mikroskopu (Ward a spol., Exp.Hematol., 16:358(1988). Alternativně mohou být CFU-GM kolonie zkoušeny použitím CD34/CD33 tokové cytometrické metody podle Sieny.a spol. sv;77,č-. 2 str. 400-409 (1991) nebo jakékoliv jiné metody známé v oboru.
CFU-GM obsahující kultury se vymrazí v mrazničce s řízenou rychlostí mrazení (např. CryoMed, Mt.Clemens, MI), potom se uchovávají v parní fázi kapalného dusíku. Deset procent aimethylsulfoxidu může být použito jako kryoprotektant. Po provedení všech odběrů od pacienta se kultury, obsahující CFU-GM nechají roztát a spojí se. Roztáté odebrané buňky se bud reinfuzují intravenozně pacientovi nebo expandují ex vivo před reinfuzi. Ex vivo expanze spojených F buněk může být provedena použitím f1t3-L jako růstového faktoru samotného, postupně nebo současně v kombinaci s jinými cytokiny uvedenými výše. Způsoby takové ex vivo expanze jsou dobře známé v oboru. Buňky bud expandované nebo neexpandované, jsou reinfuzovány intravenozně pacientovi. Pro usnadnění uchycení transplantovaných buněk se podává flt3-L současně s nebo po reinfuzi. Takové podání flt3-L se provádí se samotným f1t3—L , postupně nebo současně v kombinaci s jinými cytokiny vybranými ze seznamu uvedeného výše.
náhradní list
Příklad 14
Čištění hematopoietických progeni torových a kmenových buněk, použitím flt3-L
Tento příklad popřsuje metodu pro čištění hematopoietických buněk a kmenových buněk ze suspenze, obsahující směs buněk. Buňky z kostní dřeně a buňky periferní krve se odeberou konvenčními postupy. Buňky se suspendují ve standardním mediu a pak se odstředí pro odstranění červených krvinek a neutrofilú. Buňky umístěné na rozhraní mezi dvěma fázemi (také známé jako buffy coat) se odeberou a · resuspenduj:í. Tyto buňky jsou převážně mónonukleární a předs t avuj í pod s tatný podíl Časných hematopoi e t i ckých progenitorových a kmenových buněk. Výsledná buněčná suspenze se. pak inkubuje s biotinylovaným f lt3-L po. dostate.čnou dobu- pro umožněni, podstatné f lt3.: f lt3— L interakce:. Typi.oky js.ou doby inkubace alespoň jedna hodina dostatečné.- Po inkubaci buněčná suspenze projde, gravitační silou, kolonou naplněnou avidinem potaženými . kuličkami.. Takové, kolony, jsou-dobře v oboru známé, viz Berenson a spol., J.Cel 1.Biochem.,
OD:239(1986) . Kolona, je. promyta PBD roztokem.pro odstranění nenavázaného materiálu. Cílové buňky pak mohou být uvolněny z kuliček a z f1t3-L použitím konvenčních metod.
náhradní list
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) přihlašovatel: Lyman, Stewart D.
Beckmann, M. Patricia (ii) Název vynálezu: Ligandy flt3-L receptoru (iii) Počet sekvencí: 8 (iv) příslušná adresa:
(A) Adresa: Stephen L.Malaska, Imrauriex Corporation (B) ulice: 51 University Street (C) město: Seattle (D) stát: Washington (E) země: USA (F) ZIP: 98101 (v) počítačově čitelná forma:
(A) typ media: floppy disk (B) počítač: Apple Macintosh (C) operační systém: Macintosh 7,0.1 (D) software: Microsoft Word. Version #5.1 (vi) současná data přihlášky:
(A) číslo přihlášky: - bude přiděleno(B) datum podání: 7.březen 1994 (C) klasifikace:
ί (vii) data předchozí přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: 08/162407 (B) datum podání: 3.prosinec 1993 (C) klasifikace:
i 1 CA 1 1 Λ UUli i (vii) data předchozí přihlášky:
(A) číslo přihlášky: 08/111758 (B) datum podání: 25.srpen 1993 (C) klasifikace:
(vii). data předchozí přihlášky:
(A) číslo přihlášky: 08/106463 (B) datum podání: 12.srpen 1993 . (C) klasifikace:
(vii) data předchozí přihlášky: .. - , (A) číslo přihlášky: 08/068394 (B) datum podání: 24.květen 1993 . - . „ c j - k j a s i f ..ka c e. r--- ----(viii) Informace, o zástupc.i/agentovi:
(A) jméno: Malaska Stephen L.
(B) registrační číslo: 32655 (C) referenční/číslo povolení: 2813-D (ix): telekomunikační informace:
(A) telefon: '(206)587-0430 (B) telefax: (206). 233-0644 (C) telex: 756822
UůUI dUlU 1 1 $ b (2) Infomace o SEQ ID NO:1 (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 879 bázových párů.
(B) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA k mPNA (iii) hypotetická: ne (i) anti-sense: ne (ix) rysy:
.(A) jméno/klíč: misc_rysy (B) lokace: 1..25 (ix) rysy:
(A) jméno/klíč: misc_rysy (B) lokace: 855..879 (ix) rysy:
(A) jméno/klíč; CDS (B) lokace: 57..752(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:
náhradní list co
GTCGACTGGA ACGAGACGAC CTGCTCTGTC ACAGGCATGA GGGGTCCCCG GCAGAG 56
ATG ACA GTG CTG GCG CCA GCC TGG AGC CCA AAT TCC TCC CTG TTG CTG 104
Met Thr 1 Val Leu Ala 5 Pro Ala T-r Ser Pro 10 Asn Ser Ser Leu Leu 15 Leu
CTG TTG CTG CTG CTG AGT CCT TGC CTG CGG GGG ACA CCT GAC TGT TAC 152
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Aso Cys Tyr
20 25 30*
TTC AGC -CAC AGT CCC ÁTC TCC TCC AAC TTC AAA GTG AAG TTT AGA GAG . 200
Phe Ser His Ser Pro Zle Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
35 40 45
TTG ACT GAC CAC CTG CTT AAA GAT TAC CCA GTC ACT GTG GCC GTC AAT 248
Leu Thr Asp His Leu Leu‘- Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn
.50 55 60
CTT CAG GAC GAG AAG CAC TGC AAG GCC TTG TGG AGC CTC TTC CTA GCC 296
Leu Gin Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala '
65 - 70 75 80
CAG CGC TGG ATA GAG CAA CTG AAG ACT GTG GCA GGG TCT AAG ATG CAA 344
Gin Arg Trp Zle Glu Gin Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser_Lys Met .Gin.
~85~ 90 ‘95 '
ACGCTT CTG' GAG .GAČ 'GTC.AAC ACC GAG' ATA. CAT. TTI. ' GTC. ACC .'TCA TGT 392
Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu.Ile . His Phe Val.Thr Sér Cys
100 105 110
ACC TTC CAG CCC CTA CCA GAA TGT CTG CGA TTC GTC CAG ACC AAC ATC 440
Thr Phe Gin Pro Leu Pro Glu CV5 Leu Arg Phe Val Gin Thr Asn ile
115 120 125
TCC CAC CTC CTG AAG GAC ACC TGC ACA CAG CTG CTT GCT CTG AAG CCC 488
Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gin Leu Leu Ala Leu Lys Pro·
130 135 140 - ·-
TGT ATC GGG AAG GCC TGC CAG AAT TTC TCT CGG TGC CTG GAG GTG CAG 536
Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gin Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gin
145 150 155. 160 .
TGC CAG CCG GAC TCC TCC ACC CTG CTG CCC CCA AGG AGT CCC ATA GCC 534-
Cys Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Zle Ala
165 170 175
CTA GAA GCC ACG GAG CTC CCA GAG CCT CGG CCC AGG CAG CTG TTG CTC 632
Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Ar.g Gin Leu Leu Leu
180 • 185 190
CTG CTG CTG CTG CTG CCT CTC ACA CTG GTG CTG CTG GCA GCC GCC TGG 680
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Trp
195 200 205
GGC'CTT CGC TGG CAA AGG GCA AGA AGG AGG GGG GAG CTC CAC CCT GGG 728
Gly Leu Arg Trp Gin Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly
210 215 220
GTG CCC CTC CCC TCC CAT CCC TAGGATTCGA GCCTTGTGCA TCGTTGACTC 779
Val Pro Leu Pro Ser His Pro
225 230
AGCCAGGGTC TTATCTCGGT TACACCTGTA ATCTCAGCCC TTGGGAGGCC AGAGCAGGAT S3S
TGCTGAATGG TCTGGAGCAG GTCGTCTCGT TCCAGTCGAC
875 (2) Infomace o SEQ ID NO:2 (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 231 aminokyseí irr (B) typ: aminokyselina (D) topol ogie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO:2:
Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser. Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
20 25 30
Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Sér Asn. Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
35 40 45
Leu Thr As? His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn
50 55 60
Leu Gin Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Přvs Leu Ala
65 70 75 8.0
Gin Arg Tr? Ile Glu Gin Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gin
85 90 95
Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
100 • 105 110
Thr Phe Gin Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gin Thr Asn Ile
115 120 125
Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gin Leu Leu Ala Leu Lys Pro
130 135 140
Cys ile Gly Lys Ala* Cys Gin Asn Phe Ser Arg cys Leu Glu Val Gin
145 150 155 ISO
Cys Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala
165 170 175
Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gin Leu Leu Leu
130 185 190
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Trp
195 200 205
Glv Leu Arg Trp Gin Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly
210 215 220
Val Pro Leu Pro Ser His Pro
225 230
náhrsdní list (2) Infomace o SEQ ID NO:3 (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 24 bázových páru (B) typ:, nukl-e.o-vá kyse-lina(c) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: SEQ ID NO:3
TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT (2) Infomace o SEQ ID N0:4 (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 20 bázových párů (B) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jediný ,(D) topologie: lineární (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4
AGCAGGTCGT CTCGTTCCAG *7 (2) Infomace o SEQ ID NO:5 (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 988 bázových párů (B) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (i i) typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (v) rysy:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace : 30..734 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO:5
CGGCCGGAAT TCCGGGGCCC CCGGCCGAA ATG ACA GTG CTG GCG CCA GCC TGG 53
Met 1 Thr Val Leu Ala 5 Pro Ala Trp
AGC CCA ACA ACC TAT CTC CTC CTG CTG CTG CTG CTG AGC TCG GGA CTC 101
Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu
10 15 * 20
AGT GGG ACC CAG GAC TGC TCC TTC CAA CAC AGC CCC ATC TCC TCC GAC 149
Ser Gly Thr Gin Asp Cvs Ser Phe Gin His Ser Pro Ile Ser Ser Asp
25 . 30 35 40
TTC GCT GTC AAA ATC CGT GAG CTG TCT GAC TAC CTG CTT CAA GAT TAC 197
Phe Ala Val Lys Zle Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gin Asp Tyr
45 50 55
CCA GTC ACC GTG GCC TCC AAC CTG CAG GAC- GAG GAG CTC TGC GGG GGC 245
Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gin Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly
60 65 70
CTC TGG CGG CTG GTC CTG GCA CAG CGC TGG ATG GAG CGG CTC AAG ACT 293
Leu Tm Arg Leu Val Leu Ala Gin Arg Tr? Met Glu Arg Leu Lys Thr
75 80 85
GTC GCT GGG TCC AAG ATG CAA GGC TTG CTG GAG CGC GTG AAC ACG GAG 341
val Ala Gly Ser, Lys Met Gin Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu
90 95 100
ATA CAC TTT GTC ACC AAA TGT GCC TTT CAG CCC CCC CCC AGC TGT CTT 389
Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gin Pro Pro Pro Ser Cys Leu
105 110 115 120
c:.
CGG Arg TTC Phe GTC Val CAG ACC Gin Thr 125 AAC ATC TCC CGC CTC CTG CAG GAG ACC TCC GAG 437
Asn Ile Ser Arg Leu 130 Leu Gin Glu Thr Ser 135 Glu
CAG CTG GTG GCG CTG AAG CCC TGG ATC ACT CGC CAG AAC TTC TCC C\J*J 485
Gin Leu val A-d Leu Lvs Pro Ile m U — i.,- * n - * Λ nk* Γλ W C - Arg-
140 145 150
“· Ikík- CTG GAG CTG CAG TGT CAG CCC' GAC TCC Α\-·Λ ACC CTG CCA CCC CCA 533
Cys Leu Glu Leu Gin Cys Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro
155 160 165
TGG AC-T CCC CGG CCC CTG GAG GCC ACA GCC CCG ACA GCC CCG CAG CCC 581
5 .Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gin Pro
170 175 •ISO
CCT CTG CTC CTC CTA CTG· CTG CTG CCC GTG GGC CTC CTG CTG CTG GCC 629
Pro Leu .Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala
185 190 195 200
GCT GCC TGG TGC CTG CAC TGG CAG AGG ACG CGG CGG AGG ACA CCC CGC 677
Ala Ala Trp Cvs Leu Hig Trp Gin Arg Thr Arg Arg Arg •Thr Pro Arg
205 210 215
CCT GGG GAG CAG GTG CCC CCC GTC CCC AGT CCC CAG GAC CTG CTG CTT 725
-Gly-Glu •Gin -Val -Pro- Pro -Val- -Pro· -Ser- -Pro· -Gin- Asp . Leu- -Leu. Leu
220 225 230
GTG'GAG CAC TGACCTGGCC. AAGGCCTCAT'.CCTGCGGAGC: CTTAAACAAC, 774
Val Glu His
235
GCAGTGAGAC AGACATCTAT CATCCCATTT TACAGGGGAG GATACTGAGG CACACAGAGG 634
GGAGTCACCA. GCCAGAGGAT'. GTATAGCCTG, GACACAGAGG AAGTTGGCTA GAGGCCGGTC,894
CCTTCCTT.GG. GCCCCTCTCA;' TTCCCTCCCC AGAATGGAGG CAACGGCAGA. ATCCAGCACC 954 ggccccattt· acccaactct:gaacaaagcc.,cccg; .,588 , (2) Infomace o SEQ ID NO:6 t . . .... .
í (i) charakteristiky sekvence:' (A) délka: 235 bázových, párů (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (i i) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO:6:
Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Prs Thr Thr Tyr Leu Leu Leu
X 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Sér Gly Thr Gin Asp Cys Ser Phe
20 25 30
Gin His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg .Glu Leu
35 40 45
Ser Asp Tyr Leu Leu Gin As? Tyr Pro val Thr Val Ala Ser Asn Leu
50 55 60
Gin Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gin
65 70 75 80
Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gin Gly
85 90 95
Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala
100 105 110
Phe Gin Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gin Asn Ile Ser
115 120 125
Arg Leu Leu Gin Glu Thr· Ser Glu Gin Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp
130 ř 135 140
Ile Thr Arg Gin Asn Phe Se: Arg Cys Leu Glu Leu Gin Cys Gin Pro
145 150 155 160
Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala
165· 170 175
Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gin Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
ISO 185 190
Pro Val Gly' Leu Leu Leu Leu Ala. Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gin
195 200 205
Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gin Val Pro Pro Val
210 215 220
Pro Ser Pro Gin AS? Leu Leu Leu Val ‘clu His
225 230 235
T. 'ÍÍÍSii ' .«rty»· •Á&tt··
IIčaUA
X XX c v < ·“ (2) Infomace o SEQ ID NO:7 (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 71 bázových párů (B) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (ii) tvp molekuly: cDNA k mRNA .
(iii) hvpotetická: ne
Ví (iv) anti-sense: ne ,.:·.· (xi) popis sekvence: SEQ ID NO:7
AATTGGTACC TTTGGATAAA AGAGACTACA AGGACGACGA TGACAAGACA CCTGACTGTT £0 ACTTCAGCCA C *' (2) Infomace o SEQ ID N0:8 (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 37 bázových párů (B) typ: nukleová'kyselina (c) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (i i) typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) hypotetická: ne,.
(iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: SEQ ID N0:8
ATATGGATCC CTACTGCCTG GGCCGAGGCT CTGGGAG

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný flt3-ligand (flt3—L) polypeptid.
  2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kterým je myší flt3-L.
  3. 3. Polypeptid podle nároku 1, kterým.Je lidský flt3-L.
    , li- *
  4. 4. Polypeptid podle nároku 3, obsahující aminokyseliny 1-235 ze SEQ.ID N0:6.
  5. 5. Polypeptid podle nároku 1, kterým je rozpustný flt3—L.
  6. 6. Polypeptid podle nároku 5, obsahující aminokyseliny 28-160 nebo 28-182 ze SEQ ID NO:6.
  7. 7. Polypeptid podle nároku 3, který je kodován cDNA inzertem vektoru SÍHAVE0410 v E.coli DH10B buňkách, majících přírůstkové číslo ATCC 69382.
    S. Izolovaná DNA sekvence, kódující f1t3-L protein.
  8. 9. Izolovaná DNA sekvence podle' nároku 8, kódující myší flt3~L polypeptid.
  9. 10; Izolovaná DNA sekvence podle nároku S, kódující lidský flt3-L polypeptid.
    li. Izolovaná DNA sekvence podle nároku 8, která kóduje /4 aminokyselinovou sekvenci 28-160 nebo 28-182 ze SEQ .ID NQ:6.
  10. 12. DNA sekvence podle nároku 8, zahrnující (a) cDNA získanou z kódujícího regionu fIt3—I. genu, (b) cDNA sekvence vybrané ze- skupiny, zahrnující SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:5, . (c) DNA sekvence, které hybriditu jí za mírně přísných .
    podmínek k cDNA z (a) nebo (b) a kde tyto DNA sekvence kódují flt3—L, (d) DNA sekvence, které pro degeneraci genetického kódu, kódují flt3-L polypeptidy, mající aminokyselinovou sekvenci pol.ypeptidú, kódovaných DNA sekvencemi
    - (a). (b) nebo. (c). . — — 13. Expresívní vektor. , obsahující- DNA sekvenci pod 1 e nároku 8. 14. Expresívní vektor , obsahující DNA sekvenci podle nároku 9. 15. Expresívní vektor , obsahující DNA sekvenci padle nároku 10 16. Expresívní vektor , obsahující DNA s ekvenci podle nároku 11 17. Expres í.vni vektor , obsahující DNA sekvenci podle nároku 12
    18. Hostitelská buňka transfektovaná nebo transformovaná expresívním vektorem podle nároku 13·.
    19. Hostitelská buňka transfektovaná nebo transformovaná expresívním vektorem podle nároku 14.
    20. Hostitelská buňka transfektovaná nebo transformovaná expresívním vektorem podle nároku 15.
    í?
    21. Hostitelská buňka transfektovaná nebo transformovaná expresivním vektorem podle nároku 16.
    22. Hostitelská buňka transfektovaná nebo transformovaná· expresivním vektorem podle nároku 17.
    23. Způsob produkce flt3-L polypeptidú, vyznačuj í c í s e t.í m, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 1S za podmínek, promotujících expresi a získání polypeptidú z kultivačního media.
    24. Způsob produkce flt3-L polypeptidú, vyznačuj ícísetím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 19 za podmínek, promotujících expresi a získání polypeptidú z kultivačního media.
    Λ
    25. Způsob produkce flt3-L polypeptidú, vyznačuj ícísetím, Že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 20 za. podmínek, promotujících expresi a získání polypeptidú z kultivačního- media.
    26. Způsob produkce flť3—L polypeptidú, vyznačuj ícísetím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 21 za podmínek, promotujících expresi a získání polypeptidú z kultivačního media.
    27. Způsob produkce f1t3-L polypeptidu, , vyznačuj ícísetím, že zahrnuje kultivaci ' hostitelské buňky podle nároku 22 za podmínek, promotujících * expresi a získání polypeptidú z kultivačního media.
    28. Protilátka, která je imunoreaktivní s fit3-L polypeptidem.
    ! D
    -e v •o r- X> XJ< > o> </> 3 G -1 m Z ν’ > _ r- G n C a _J < 1 (Tk < X t —« o
    O bJ' lO· «η o
    o
    V*
    5 rc : ro r[
    29. Protilátka podle nároku 28, kteTTTů je monoklonální proti látka.
    30. Farmaceutický přípravek, obsahující účinné množství f113—L polypeptidu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič, přísadu nebo ředidlo,
    31. Farmaceutický přípravek, obsahující účinné množství flt3-L polypeptidu podle nároku 3 a farmaceuticky přijatelný nosič, přísadu nebo ředidlo,
    32. Farmaceutický přípravek, obsahující účinné množství flt3—L polypeptidu podle nároku 5 a farmaceuticky přijatelný nosič, přísadu nebo ředidlo·,
    33. Přípravek pro provedení autologní transplantace u pacienta, dostávajícího cytoreduktivní terapii, vyznačuj í cí seti m,že obsahuje účinné množství f1t3-L pro zvýšení počtu cirkulujících progenitorových buněk nebo kmenových buněk u takového pacienta a farmaceuticky přijatelné ředidlo.
    34. Přípravek podle nároku 33, vyznač u j í c í ”s é t í m,že se flt3—L je v kombinaci s cytokinem vybraným ze skupiny, zahrnující CSF-1, GM-CSF,' SF, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7., IL-8, IL-9, IL-10, IL-11♦ XL-12, IL—13, IL—16, IL-15, GM-CSF/IL-3 fuzních proteinů, LIF a FGF.
    35. Přípravek podle nároku 34, v y z n a č u j í c í se 'ή; t í ro, že flt3-L je v kombinaci s cytokinem vybraným ř ze skupiny, zahrnu jící GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-3 a ' GM-CSF/IL-3 fuzni protein.
    36. Hematopietická buněčná expanzní media, t f vyznačuj ícísetím, že obsahují buněčná růstová media a účinné množství flt3-L polypeptídu podle nároku 1.
    37. Způsob transfekce exogenního genu do časné hecnatopoietické buňky, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (a) kultivace časných hematopoietických buněk v mediu, obsahujícím účinné množství f113-L polypeptidu a (b) transfekci kultivovaných buněk ze stupně (a) genem.
    38. Sloučenina pro stimulaci proliferace T buněk v savci,kterou je flt3-L polypeptid podle nároku 1.
    39. Přípravek pro léčení pacienta, majícího symptomy myelodysplastického syndromu,, vyznačující se':· tím, že obsahuje účinné množství f1t3-L polypeptidu podle nároku 1 a popřípadě účinné množství jednoho nebo více růstových faktorů vybraných ze skupiny, zahrnující CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2,
    IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-16, IL-15, GM-CSF/IL-3 fuzních proteinů, LIF a FGF.
    40. Přípravek'pro léčení pacienta, majícího symptomy anemie, vyznačující se t í m, že obsahuje účinné množství f1t3-L polypeptidu podle nároku 1 a popřípadě účinné množství . jednoho nebo více růstových faktoru- vybraných ze skupiny, zahrnující CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2,
    IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-16, IL-15, GM-CSF/IL-3 fuzních proteinů, LIF a FGF.
    41. Přípravek pro léčení pacienta, majícího symptomy syndromu získané imunonedostatečnosti, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství flt3-L polypetidu podle nároku a popřípadě účinné množství jednoho nebo více růstových faktorů vybraných ze skupiny, zahrnující CSF-1, GM-CSF, SF, G—CSF, EPO, IL—1, IL-2, IL—3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-Π, IL-12,
    IL-13, IL-16, IL-15, GM-CSP/IL-3. fuzních proteinů, LIF a FGF.
    42. Přípravek podle nároku 41, pro léčení pacienta s AZT 1 .
    terapií, vyznačující se t ím, Ze obsahuje účinné množství f1t3-L polypeptidu podle nároku 1 a popřípadě účinné množství jednoho nebo více růstových faktorů vybraných t ze skupiny, zahrnující CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1,
    IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, IL-13 IL-16, IL—15, GM-CSF/IL-3 fuzních proteinů., LIF
    43. Způsob oddělování buněk, majících flt3-L receptor na svém povrchu ze směsi buněk v^suspenzi, vyznačuj ící s e t í m, že zahrnuje kontakt buněk ve směsi s kontaktním povrchem, majícím na sobě flt3—L vazebný protein, a odděleni kontaktního povrchu a suspenze.
    44. Způsob podle nároku 43, v .y z n a č u j í c í se t í m, Že f1t3-vazebným proteinem je f1t3-L.
CZ953079A 1993-05-24 1994-05-12 Ligands for flt3 receptors CZ307995A3 (en)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6839493A 1993-05-24 1993-05-24
US10646393A 1993-08-12 1993-08-12
US11175893A 1993-08-25 1993-08-25
US16240793A 1993-12-03 1993-12-03
US20950294A 1994-03-07 1994-03-07
US08/243,545 US5554512A (en) 1993-05-24 1994-05-11 Ligands for flt3 receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ307995A3 true CZ307995A3 (en) 1996-10-16

Family

ID=27556997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ953079A CZ307995A3 (en) 1993-05-24 1994-05-12 Ligands for flt3 receptors

Country Status (10)

Country Link
US (2) US6632424B1 (cs)
EP (2) EP1428834A1 (cs)
AT (1) ATE284442T1 (cs)
CZ (1) CZ307995A3 (cs)
DE (1) DE69434168T2 (cs)
DK (1) DK0627487T3 (cs)
ES (1) ES2232814T3 (cs)
IL (1) IL109677A (cs)
NZ (1) NZ314644A (cs)
PT (1) PT627487E (cs)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307995A3 (en) 1993-05-24 1996-10-16 Immunex Corp Ligands for flt3 receptors
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US6190655B1 (en) 1993-12-03 2001-02-20 Immunex Corporation Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
US7294331B2 (en) 1994-03-07 2007-11-13 Immunex Corporation Methods of using flt3-ligand in hematopoietic cell transplantation
WO1996034620A1 (en) * 1995-05-05 1996-11-07 Schering Corporation Restoration of progenitor cells after antiproliferative therapy treatments
US5824789A (en) * 1995-06-07 1998-10-20 Systemix, Inc. Human growth factors, nucleotide sequence encoding growth factors, and method of use thereof
JPH11509845A (ja) * 1995-07-21 1999-08-31 アメリカ合衆国 造血多分化性細胞移植のための放射線または放射線類似作用化学療法の減少方法
US7361330B2 (en) * 1995-10-04 2008-04-22 Immunex Corporation Methods of using flt3-ligand in the treatment of fibrosarcoma
US7150992B1 (en) 1995-10-04 2006-12-19 Innunex Corporation Methods of preparing dendritic cells with flt3-ligand and antigen
RO120579B1 (ro) * 1995-10-04 2006-04-28 Immunex Corporation Utilizarea ligandului flt3
US6967092B1 (en) 1996-10-25 2005-11-22 Mc Kearn John P Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
US6660257B1 (en) 1996-10-25 2003-12-09 Pharmacia Corporation Circular permuteins of flt3 ligand
AU751498B2 (en) * 1997-04-11 2002-08-15 G.D. Searle & Co. flt3 ligand chimeric proteins
IT1293827B1 (it) * 1997-08-07 1999-03-10 Dompe Spa Metodo per l'espansione ex vivo di cellule staminali emopoietiche
CA2318819A1 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 Novartis Ag Expanded and genetically modified populations of human hematopoietic stem cells
US6291661B1 (en) 1998-07-02 2001-09-18 Immunex Corporation flt3-L mutants and method of use
CA2346152A1 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Novartis Ag Promotion of self-renewal and improved gene transduction of hematopoietic stem cells by histone deacetylase inhibitors
WO2001011011A2 (en) * 1999-08-05 2001-02-15 Mcl Llc Multipotent adult stem cells and methods for isolation
US10638734B2 (en) 2004-01-05 2020-05-05 Abt Holding Company Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
US8609412B2 (en) 1999-08-05 2013-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mapc generation of lung tissue
US7015037B1 (en) 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
WO2002064748A2 (en) 2001-02-14 2002-08-22 Furcht Leo T Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
US8252280B1 (en) 1999-08-05 2012-08-28 Regents Of The University Of Minnesota MAPC generation of muscle
US6280718B1 (en) * 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
JP2003523398A (ja) * 2000-02-24 2003-08-05 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 樹状細胞のインビボ活性化によるアジュバント治療
SI1330468T1 (sl) * 2000-09-18 2007-10-31 Serono Lab Ĺ˝veplovi analogi 21-hidroksi-6,19-oksido-progesterona (21oh-6op) za zdravljenje preseĺ˝ka glukokortikoidov
EP1351707B9 (en) * 2001-01-09 2012-01-25 Baylor Research Institute Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays
WO2003040319A2 (en) * 2001-11-02 2003-05-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Endothelial cells derived from primate embryonic stem cells
DE10158680B4 (de) * 2001-11-30 2004-04-08 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Verfahren zur ex vivo-Expansion und -Differenzierung von multipotenten Stammzellen
US20050101576A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Novacea, Inc. Methods of using vitamin D compounds in the treatment of myelodysplastic syndromes
WO2005003320A2 (en) 2003-07-02 2005-01-13 Regents Of The University Of Minnesota Neuronal differentiation of stem cells
EP1697399B1 (en) 2003-12-12 2016-11-23 GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as repr. by THE SECR. OF THE DEPT. OF HEALTH AND HUMAN SERVICES AND HIS SUCCESSORS A human cytotoxic t-lymphocyte epitope and its agonist epitope from the non-variable number of tandem repeat sequence of muc-1
BRPI0611901A2 (pt) 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
US8921050B2 (en) 2006-03-17 2014-12-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of diagnosing renal cell carcinoma
WO2008063675A2 (en) 2006-11-24 2008-05-29 Regents Of The University Of Minnesota Endodermal progenitor cells
WO2010055900A1 (ja) 2008-11-14 2010-05-20 ディナベック株式会社 樹状細胞の製造方法
EP3268038B1 (en) 2015-03-09 2021-05-05 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (adc) that bind to flt3 proteins
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
EA201891753A1 (ru) 2016-02-03 2019-01-31 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкции антител к psma и cd3, вовлекающие т-клетки
CN109563481B (zh) 2016-07-13 2024-01-05 俄亥俄州创新基金会 用于优化宿主抗原呈递和宿主抗肿瘤和抗病原体免疫的平台和方法
WO2018191619A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy
WO2019147982A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer with dendritic cell mobilizing agents
AU2019359890B2 (en) 2018-10-17 2024-10-24 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy
US11419898B2 (en) 2018-10-17 2022-08-23 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5192553A (en) 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5399493A (en) 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5763266A (en) 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
US5437994A (en) 1989-06-15 1995-08-01 Regents Of The University Of Michigan Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5326558A (en) 1989-08-08 1994-07-05 Genetics Institute, Inc. Megakaryocytopoietic factor
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5367057A (en) 1991-04-02 1994-11-22 The Trustees Of Princeton University Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof
US5185438A (en) * 1991-04-02 1993-02-09 The Trustees Of Princeton University Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2
US5270458A (en) 1991-04-02 1993-12-14 The Trustees Of Princeton University Nucleic acids encoding fragments of hematopoietic stem cell receptor flk-2
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
ES2180539T3 (es) 1991-10-23 2003-02-16 Nexell Therapeutics Inc Metodos para expandir selectivamente celulas madre.
AU2882992A (en) 1991-11-06 1993-06-07 Arthur A. Axelrad Cell culture medium
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
ES2150495T5 (es) * 1993-05-19 2007-02-16 Schering Corporation Ligandos de flt3 purificados de mamifero y agonistas y antagonistas de los mismos.
US5554512A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
CZ307995A3 (en) 1993-05-24 1996-10-16 Immunex Corp Ligands for flt3 receptors
US5525708A (en) 1994-03-28 1996-06-11 Cytomed, Inc. Covalent dimer of kit ligand
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5627025A (en) 1994-08-12 1997-05-06 The Rockefeller University Method for the identification of compounds capable of abrogating human immunodeficiency virus (HIV) infection of dendritic cells and T-lymphocytes

Also Published As

Publication number Publication date
ES2232814T3 (es) 2005-06-01
EP1428834A1 (en) 2004-06-16
ATE284442T1 (de) 2004-12-15
PT627487E (pt) 2005-04-29
DE69434168T2 (de) 2006-01-26
DE69434168D1 (de) 2005-01-13
EP0627487A2 (en) 1994-12-07
US20020107365A1 (en) 2002-08-08
IL109677A (en) 2005-07-25
DK0627487T3 (da) 2005-04-18
US7041282B2 (en) 2006-05-09
EP0627487B1 (en) 2004-12-08
EP0627487A3 (en) 1996-08-21
IL109677A0 (en) 1994-10-07
US6632424B1 (en) 2003-10-14
NZ314644A (en) 2000-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU683472B2 (en) Ligands for FLT3 receptors
US7041282B2 (en) Ligands for flt3 receptors
US20110053863A1 (en) Methods of using flt3-ligand in the treatment of cancer
US8163520B2 (en) Nucleic acids encoding a chimeric polypeptide comprising IL-7 and HGF-beta chain and methods of use
US6558663B1 (en) Transgenic swine &amp; swine cells having human HLA genes
US6190655B1 (en) Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
US7045128B2 (en) Antibodies against flt3-ligand
US6630143B1 (en) Antibodies against flt3 ligand
JPH10507906A (ja) 遺伝子工学処理したブタ細胞
JP4251983B2 (ja) 造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るポリペプチドおよびそれをコードするｄｎａ
RU2220979C2 (ru) ПОЛИПЕПТИД ЛИГАНДА flt3 (ВАРИАНТЫ), ПОЛИНУКЛЕОТИД(ВАРИАНТЫ), ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР(ВАРИАНТЫ), ЛИНИЯ КЛЕТОК СНО (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ПОЛИПЕПТИДА ЛИГАНДА flt3 (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ)
Wermann et al. Human-mouse xenografts in stem cell research
MXPA94003806A (en) Ligands for receivers f
Friend Identification of a novel growth factor and the role of thymic stroma in hematopoiesis
JPWO2001034797A1 (ja) ヘマンジオブラストを含む細胞画分を調製する方法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic