ES2232814T3 - Ligandos para receptores de flt3. - Google Patents

Ligandos para receptores de flt3.

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ES2232814T3
ES2232814T3 ES94303575T ES94303575T ES2232814T3 ES 2232814 T3 ES2232814 T3 ES 2232814T3 ES 94303575 T ES94303575 T ES 94303575T ES 94303575 T ES94303575 T ES 94303575T ES 2232814 T3 ES2232814 T3 ES 2232814T3
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cell
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ES94303575T
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Stewart D. Lyman
M. Patricia Beckmann
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Immunex Corp
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Abstract

Un polipéptido ligando de flt3 (flt3-L) humano aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de los restos 28182 de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia variante de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con esta secuencia, en el que el ligando de flt3 une flt3.

Description

Ligandos para receptores flt3.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a ligandos de flt-3 mamífero, ácidos nucleicos que codifican tales ligandos, procedimientos para la producción de ligandos flt-3 recombinantes, composiciones farmacéuticas que contienen tales ligandos y a su uso en varias terapias.
Antecedentes de la invención
Las células de la sangre proceden de células madre hematopoiéticas que tienen el cometido de diferenciar entre ciertos linajes, esto es, eritroide, megacariocítico, granulocítico, monocítico y linfocítico. Las citoquinas que estimulan la proliferación y maduración de precursores de células se denominan factores estimulantes de colonias ("CSFs"). Los T-linfocitos producen varios CSFs, entre los que están incluidos interleuquina-3 ("IL-3"), CSF de granulocitos-monocitos (GM-CSF), CSF de granulocitos (G-CSF) y CSF de monocitos (M-CSF). Estos CSFs afectan a células maduras y células madre. Hasta el momento, no se han descubierto factores que sean capaces de afectar prodominantemente a células madre.
Los receptores de tirosina quinasa ("TKRs") son receptores de factores de crecimiento que regulan la proliferación y diferenciación de un número de células (Yarden, Y. y Ullrich, A. Annu. Rev. Biochem., 57, 443-478, 1988; y Cadena, D.L. y Gill, G.N., FASEB J., 6, 2332-2337, 1992). Ciertos TKRs funcionan dentro del sistema hematopoiético. Por ejemplo, señalizando mediante el factor de tipo 1 estimulador de colonias ("CSF-1"), el receptor c-fms regula la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación de monocitos (Stanley y otros, J. Cell Biochem., 21, 151-159, 1983). El factor de Steel ("SF"), conocido también como factor de crecimiento de células cebadas, factor de crecimiento de células madre o ligando kit), que actúa a través de c-kit, estimula la proliferación de células en los compartimientos mieloide y linfoide.
Flt3 (Rosnet y otros, Oncogene, 6, 1641-1650, 1991) y flk-2 (Matthews y otros, Cell, 65, 1143-1152, 1991) son formas variantes de TRK que están relacionadas con los receptores de c-fms y c-kit. El producto de gen de flk-2 se expresa en células hematopoiéticas y de progenitor, mientras que el producto de gen de flt3 tiene una distribución en tejidos más general. Las proteínas de receptores de flt3 y flk-2 son similares en cuanto a la secuencia de aminoácidos y varían en dos restos de aminoácidos en el dominio extracelular y divergen en un segmento de 31 aminoácidos localizado cerca de los términos C (Lyman y otros, Oncogene, 8, 815-822, 1993).
Lyman y otros, Cell, 75, 1157-1167, (17 de diciembre de 1993) dan cuenta de la clonación molecular de un ligando para el receptor de tirosina quinasa flt3/flk-2, El documento WO 94/26891, publicado el 24 de noviembre de 1994, describe ligandos de flt3 mamífero y fragmentos de él.
Se ha encontrado que el ligando de flt3 ("flt3-L") regula el crecimiento y diferenciación de células de progenitor y células madre y que probablemente tiene utilidad clínica en el tratamiento de trastornos hematopoiéticos, en particular, anemia aplásica y síndromes mielodisplásicos. Además, flt3-L puede ser útil en trasplantes de médula ósea singénicos o autólogos en pacientes sometidos a terapias citorreductoras así como la expansión de células. El flt3-L será también útil en terapia de genes y sistemas de movilización de células madre y de progenitor.
El cáncer se trata con terapias citorreductoras que implican la administración de radiación ionizante o toxinas químicas que matan rápidamente las células que se dividen. Típicamente, de los efectos citóxicos sobre las células normales resultan efectos secundarios que pueden limitar el uso de terapias reductoras. Un efecto secundario frecuente es la mielosupresión o lesión de células de la médula ósea que dan origen a leucocitos y hematíes y plaquetas. Como resultado de la mielosupresión, los pacientes desarrollan citopenia, o déficits de células de la sangre, que aumentan el riesgo de infección o trastornos hemorrágicos.
Las citopenias aumentan la morbosidad, mortalidad, y conducen a una subdosificación en el tratamiento del cáncer. Muchos investigadores clínicos han manipulado la terapia citorreductora dosificando regímenes y programas para aumentar la dosificación en la terapia del cáncer, si bien limitando la lesión de la médula ósea. Un enfoque implica el trasplante de células de médula ósea o sangre periférica en el que las células de médula ósea o las células de progenitor hematopoiético circulante o células madre se eliminan antes de la terapia citorreductora y luego se reinfunden, después de la terapia, para restaurar la función hematopoiética. La patente U.S. nº. 5.199.942, que se incorpora aquí por referencia, describe un método para usar GM-CSF, IL-3, SF, proteínas de fusión GM-CSF/IL-3, eritropoietina ("EPO") y sus combinaciones en regímenes de trasplante autólogo.
La quimioterapia a dosis altas es terapéuticamente beneficiosa porque puede producir una frecuencia incrementada de respuesta objetiva en pacientes con cánceres metastásicos, en particular cáncer de mama, comparativamente con terapias en las que se emplean dosis estándar. Esto puede dar por resultado una remisión extensa exenta de enfermedad para algunos de los pacientes con pronóstico malo. Sin embargo, la quimioterapia a dosis altas es tóxica y muchas complicaciones clínicas resultantes están relacionadas con infecciones, trastornos en la coagulación de sangre y otros efectos asociados con prolongados períodos de inmunosupresión.
Los síndromes mielodisplásicos son trastornos de células madre caracterizados por una maduración celular deteriorada. Se han caracterizado también por grados variables de citopenia, eritripoiesis inefectiva y mielopoiesis con células de médula ósea que son normales o cuyo número ha aumentado y que tienen una morfología peculiar. Bennett y otros (Br. J. Haematol., 1982, 51, 189-199) dividieron estos trastornos en cinco subtipos: anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación, y leucemia mielomonocítica crónica. Aunque un porcentaje significativo de estos pacientes desarrolla leucemia aguda, una mayoría muere de complicaciones infecciosas o hemorrágicas. La mayoría de los pacientes aquejados de estos síndromes son mayores de edad y no son candidatos adecuados para trasplantes de médula ósea o terapia antileucémica agresiva.
La anemia aplásica es otra entidad de enfermedad que se caracteriza por fallo de la médula ósea o pancitopenia severa. A diferencia del síndrome mielodisplásico, la médula ósea es acelular o hipocelular en este trastorno. Los tratamientos corrientes incluyen el trasplante de médula ósea de un donante histocompatible o un tratamiento inmunosupresor con globulina antitimocítica (ATG). Análogamente al síndrome mielodisplásico, la mayoría de pacientes aquejados con este síndrome son mayores y son inadecuados para un trasplante de médula ósea o una terapia antileucémica agresiva. Las mortalidad en estos pacientes es muy alta por infecciones o complicaciones hemorrágicas.
La anemia es común en pacientes con síndrome deinmunodeficiencia adquirida (SIDA). Usualmente, la anemia es más severa en pacientes que reciben terapia con zidovudina. Muchos agentes retrovirales, antiinfecciosos y antineoplásicos importantes suprimen la eritropoiesis. La EPO recombinante ha revelado que normaliza los niveles de hematocrito y hemoglobina del paciente; pero usualmente se requieren dosis muy altas. Se podría usar un factor de crecimiento que estimule la proliferación del linaje eritroide, solo o en combinación con EPO u otros factores de crecimiento, para tratar tales pacientes y reducir el número de transfusiones requeridas. En el tratamiento de pacientes de SIDA podría encontrar un uso particular un factor de crecimiento que pudiera aumentar también el número de células T.
Sumario de la invención
La presente invención trata de ligando de flt3 (flt3-L) biológicamente activo como una proteína aislada según se define en las reivindicaciones. Además, la invención está dirigida a DNAs que codifican flt3-L y a vectores de expresión que comprenden cDNA que codifica flt3-L según se define en las reivindicaciones. Dentro del ámbito de la invención están células huésped que han sido transfectadas o transformadas con vectores de expresión que comprenden un cDNA que codifica flt3-L según se define en las reivindicaciones, y procedimientos para producir flt3-L por cultivo de tales células huésped en condiciones que conducen a la expresión de flt3-L y mamíferos transgénicos no humanos cuyas células contienen tales secuencias de DNA aisladas definidas en las reivindicaciones.
El flt3-L de acuerdo con la presente invención se puede usar para preparar composiciones farmacéuticas a usar en métodos de trasplante alogénicos, singénicos o autólogos. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender flt3-L solo o en combinación con otros factores de crecimiento tales como interleuquinas, factores estimuladores de colonias, tirosina quinasas de proteína y citoquinas.
La invención incluye el uso de tales composiciones de flt3-L en la manufactura de medicamentos para el tratamiento de pacientes que adolecen de síndrome mielodisplásico, anemia aplásica, infección por HIV (SIDA) y cánceres tales como cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, mieloma múltiple, neuroblastoma, leucemia aguda, tumores testiculares y cáncer de ovario, según se define en las reivindicaciones.
La presente invención concierne también a anticuerpos y, en particular, anticuerpos monoclonales que son inmunorreactivos con flt3-L según se define en las reivindicaciones. Las proteínas de fusión que comprenden una proteína de fusión soluble de ftl3-L según se define en las reivindicaciones y el dominio constante de una proteína inmunoglobulínica están también comprendidas en la invención.
Los usos descritos antes se extienden a la manufactura de medicamentos útiles en los procedimientos de trasplante de células madre o de progenitores de sangre periférica. Típicamente, las células de progenitor de sangre periférica o células madre se eliminan de un paciente antes de la terapia citorreductora mielosupresora y luego se vuelven a administrar al paciente para contrarrestar los efectos mielosupresores de tal terapia. La presente invención proporciona el uso de una cantidad efectiva de flt3-L en la manufactura de un medicamento para uso en alguno de los siguientes procesos: (i) antes de recoger las células de progenitor o las células madre, para expandir tales células ex vivo; (ii) después de recoger las células de progenitor o las células madre del paciente, para facilitar su injerto. Tales usos de la invención pueden comprender, además, una cantidad efectiva de una citoquina en combinación secuencial o concurrente con flt3-L. Entre tales citoquinas están incluidas, aunque no únicamente, las interleuquinas ("IL") IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 o IL-15, un CSF seleccionado entre el grupo constituido por G-CSF, GM-CSF, M-CSF o fusiones de GM-CSF/IL-3, u otros factores de crecimiento tales como CSF-1, SF, EPO, factor inhibidor de leucemia ("LIF") o factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF"). El flt3-L es también útil, de la misma manera, para trasplantes singénicos o alogénicos.
Además, la invención incluye un medio de expansión de células hematopoiéticas que comprende un medio de crecimiento y flt3-L según se define en las reivindicaciones.
La invención incluye, además, el uso de flt3-L en terapia de genes. El flt3-L permite la proliferación y cultivo de células hematopoiéticas precoces de progenitor o células madre que se han de transfectar con DNA exógeno para uso en terapia de genes. Alternativamente, se puede transfectar un cDNA que codifica flt3-L en células con el fin de suministrar finalmente su producto de genes a la célula o tejido diana,
Adicionalmente, la invención incluye un kit de partes que comprende un polipéptido de flt3-L según se define en las reivindicaciones y un factor de crecimiento según se ha definido antes y combinaciones secuenciales o concurrentes de ellos según se define en las reivindicaciones.
Por otra parte, el flt3-L se puede unir a una matriz en fase sólido y usar para purificar por afinidad o separar células que expresan flt3 en su superficie celular. La invención abarca la separación de células que tienen el receptor flt3 sobre su superficie de una mezcla de células en solución, que comprende poner las células en contacto con una superficie de contacto que tiene sobre ella una molécula de unión de flt3 y separar la superficie de contacto y la solución. Una vez separadas, las células se puede expandir ex vivo usando flt3-L.
Descripción detallada de la invención
Se ha aislado un cDNA que codifica flt3-L humano, que se describe en la SEQ ID NO: 5. Este descubrimiento de cDNAs que codifica flt3-L murino y humano permite la construcción de vectores de expresión que comprenden cDNAs que codifican flt3-L según se define en las reivindicaciones; células huésped transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; flt3-L murino o humano biológicamente activo como proteínas homogéneas; y anticuerpos inmunorreactivos con el flt3-L humano según se define en las reivindicaciones.
El flt3-L es útil para la potenciación, estimulación, proliferación o crecimiento de células que expresan el receptor flt3, incluidas células no hematopoiéticas. Puesto que el receptor flt-3 se encuentra en cerebro, placenta y tejidos de origen nervioso y hematopoiético y se distribuye en testículos, ovarios, nodo linfático, timo e hígado fetal, es posible el tratamiento de una variedad de dolencias asociadas con lesiones de sus tejidos. Si bien no está limitado a los usos que se mencionan, los usos particulares del flt3-L son los que se describen más adelante.
Tal como se usa aquí, el término "flt3-L" es refiere a un género de polipéptidos que fijan y complejan independientemente un receptor flt3 que se encuentra en células madre o de progenitor. El término "flt3-L" abarca proteínas, definidas en las reivindicaciones, que tienen la secuencia de aminoácidos 1 a 235 de la SEQ ID NO: 6, así como proteínas que tienen un grado de analogía alto con la secuencia de aminoácidos 1 a 235 de la SEQ ID NO: 6, proteínas que son biológicamente activas y se unen al receptor flt3. Además, el término se refiere a productos de genes biológicamente activos del DNA de la SEQ ID NO: 5. El término "flt3-L" abarca también proteínas unidas a membrana (que incluyen una región intracelular, una región de membrana y una región extracelular) y proteínas solubles o truncadas que principalmente comprenden la porción extracelular de la proteína, retienen la actividad biológica y son capaces de ser secretadas. Son ejemplos específicos de tales proteínas solubles, las que comprenden la secuencia de aminoácidos 28-160 de la SEQ ID NO: 6, según se define en las reivindicaciones.
El término "biológicamente activo" en lo que se refiere a flt3-L significa que el flt3-L es capaz de unirse a flt3. Alternativamente, "biológicamente activo" significa que el flf3-L es capaz de transducir una señal estimuladora a la célula a través de un flt3 unido a membrana.
"Aislado" significa que el flt3-L no está asociado con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de un cultivo de células huésped recombinantes o como extracto purificado.
Una "variante de flt3-L", significa aquí, un polipéptido sustancialmente homólogo a flt3-L nativo pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de flt3-L nativo a causa de una o más supresiones, inserciones o sustituciones. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos es como mínimo 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos nativa de flt3-L, muy preferiblemente como mínimo 90% idéntica. La identidad porcentual se puede determinar, por ejemplo, comparando información de secuencias usando un programa GAP de ordenador, versión 6.0, descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res., 12:387, 1984) y adquirible del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443, 1970) revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP son: (1) una matriz de comparación numérica (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) de nucleótidos y la matriz de comparación ponderal de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, descrita por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979); (2) una sanción de 3,0 para cada brecha y una sanción adicional de 0,10 para cada símbolo de cada brecha; y (3) ninguna sanción para grupos terminales. Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservadoramente, lo que significa que un resto aminoácido dado está reemplazado por un resto que tiene unas características fisicoquímicas similares. Entre los ejemplos de sustituciones conservadoras están incluidas la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un resto polar por otro, como entre Lys y Arg, Glu y Asp, o Gln y Asn. Otras de estas sustituciones conservadoras, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen similares características hidrófobas, son bien conocidas. La invención abarca también las variantes naturales de flt3-L. Son ejemplos de tales variantes, proteínas que resultan de episodios de escisión alternada de mRNA o de la escisión proteolítica de la proteína de flt3-L, en la que se retiene la propiedad de unión del flt3-L. La escisión alternada de mRNA puede dar una proteína de flt3-L truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble natural de la proteína, por ejemplo. Entre las variaciones atribuibles a proteolisis están incluidas, por ejemplo, diferencias en los términos N o C de expresión de diferentes tipos de células huésped debida a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína de flt3-L (generalmente de 1-6 aminoácidos terminales).
El termino "trasplante autólogo" se describe en la patente U.S. nº. 5.199.942, que se incorpora aquí por referencia. En resumen, el término significa un método para trasplantar un progenitor hematopoiético autólogo o célula madre, que comprende: (1) recoger células hematopoiéticas de progenitor o células madre de un paciente antes de la terapia citorreductora; (2) expandir las células hematopoiéticas de progenitor o células madre ex vivo con flt3-L para obtener una preparación celular que comprende un número mayor de células hematopoiéticas de progenitor o células madre; y (3) administrar la preparación celular al paciente junto con la posterior terapia citorreductora. Las células de progenitor y las células madre se pueden obtener de cosechas de sangre periférica o explantes de médula ósea. Opcionalmente, se pueden combinar una o más citoquinas, seleccionadas entre el grupo indicado antes, con flt3-L para coadyuvar en la proliferación de tipos particulares de células hematopoiéticas o afectar a la función celular de la población de células hematopoiéticas proliferadas resultante. De los anteriores, se prefieren SF, IL-1, IL-3, EPO, G-CSF, GM-CSF y fusiones GM-CSF/IL-3, siendo espacialmente preferidos G-CSF, GM-CSF y fusiones GM-CSF/IL-3. El término "transplante alogénico" significa un método en el que se eliminan de un mamífero células de médula ósea o de progenitor de sangre periférica, o células madre y se administran a un mamífero diferente de la misma especie. El término "trasplante singénico" significa el trasplante de médula ósea entre mamíferos genéticamente idénticos.
Esta invención incluye además un medio de expansión de células hematopoiéticas que comprende un medio de crecimiento de células, suero autólogo y flt3-L según se define en las reivindicaciones o en combinación con un factor de crecimiento de citoquinas de la lista anterior. Los factores de crecimiento preferidos son SF, GM-CSF, IL-3, G-CSF, EPO y fusiones GM-CSF/IL-3.
El flt-3-L es útil en terapia de genes debido a su especifidad para células de progenitor y células madre. La terapia de genes implica la administración de células exógenas transfectadas con DNA a un huésped, y se deja que se injerten. Véase Boggs, International J. Cell Cloning, 8:80-96 (1990); Kohn y otros, Cancer Invest. 7(2):172-192 (1989); Lehn, Bone Marrow Transpl., 5:287-293 (1990); y Verma, Scientific American, págs. 68-84 (1990). Usando los métodos de terapia de genes conocidos en la técnica, un método para transferir un gen exógeno a una célula hematopoiética precoz comprende las etapas de (a) cultivar células hematopoiéticas precoces en un medio que comprende flt3-L y (b) transfectar las células cultivadas de la etapa (a) con el gen exógeno. Además, usando el mismo método o uno similar, el cDNA que codifica flt3-L se puede transfectar en tales células de suministro para suministrar el producto de gen de flt3-L al tejido diana.
El Ejemplo 1 describe la construcción de una nueva proteína de fusión de flt3:Fc utilizada en la exploración de flt3-L. Se pueden sustituir otras regiones Fc de anticuerpo para la región Fc de IgGI humano, descrita en el Ejemplo 1. Otras regiones Fc adecuadas son las que se pueden combinar con una afinidad alta a proteína A o proteína G, e incluyen la región Fc de IgGI humano o fragmentos de la región Fc de igGI humano o de murino, por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos una región de articulación de manera que se formarán enlaces disulfuro de intercambio. La proteína de fusión flt3:Fc ofrece la ventaja de una fácil purificación. Además, los enlaces disulfuro se forman entre regiones de Fc de dos cadenas separadas de proteína de fisión creando dímeros. El receptor dímero de Fl3:Fc es escogió por la ventaja potencial de una unión de flt3-L de mayor afinidad, vista la posibilidad de que el ligando que se buscaba fuera multímero.
Como se ha descrito antes, un aspecto de la invención concierna a polipéptidos de flt3-L solubles según se definen en las reivindicaciones. Los polipéptidos de flt3-L solubles comprenden la totalidad o parte del dominio extracelular de flt3-L nativo, pero falta la región de transmembrana que causaría la retención del polipéptido sobre una membrana celular. Ventajosamente, los polipéptidos de flt3-L solubles comprenden el péptido señal nativo (o uno heterólogo) cuando se sintetiza inicialmente para promover la secreción, pero el péptido señal se escinde después de la secreción de flt3-L de la célula. Los polipéptidos de flt3-L solubles de la invención retienen la capacidad de unirse al receptor flt3. Ciertamente, el flt3-L soluble puede incluir, también, parte de la región de transmembrana o parte del dominio citoplasmático u otras secuencias, con tal de que pueda secretar la proteína de flt3-L soluble.
El flt3-L soluble se puede identificar (y distinguir de sus conjugados unidos a membrana no solubles) separando células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo por centrifugación, y analizando la presencia de la proteína deseada en el medio (material sobrenadante). La presencia de flt3-L en el medio indica que la proteína se se secreta de las células y es así una forma soluble de la proteína deseada.
La forma soluble de flt3-L tiene muchas ventajas sobre la proteína de flt3-L nativa unida. Es factible la purificación de las proteínas a partir de células huésped recombinantes, puesto que las proteínas solubles se secretan de las células. Además, por lo general, las proteínas solubles son más adecuadas para administración intravenosa.
Los ejemplos de polipéptidos de flt3-L solubles incluyen los que comprenden una porción sustancial del dominio extracelular de una proteína de flt3-L nativo. Tales proteínas de flt3-L solubles comprenden los aminoácidos 28 a 182 de la SEQ ID NO: 6 según se define en las reivindicaciones. Además, en la invención están incluidas las proteínas de flt3-L solubles truncadas que comprenden menos del dominio extracelular entero. Tales proteínas solubles truncadas están representadas por la secuencia de aminoácidos 28-160 de SEQ ID NO: 6 según se define en las reivindicaciones. Cuando se expresa inicialmente dentro de una célula huésped, el flt3-L puede comprender, adicionalmente, uno de los péptidos señal heterólogos descrito más adelante que es funcional dentro de las células huésped empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender el péptido señal nativo tal como el flt3-L, que comprende los aminoácidos 1 a 182 de la SEQ ID NO: 6 según se define en las reivindicaciones. En un ejemplo comparativo de la invención, el flt3-L soluble se expresó como proteína de fusión que comprende (del término N al C) el péptdo señal del factor \alpha de levadura, un péptido FLAG® que se describe más adelante y en la patente U.S. nº. 5.011.912 y un flt3-L soluble que consta de los aminoácidos 28 a 188 de la SEQ ID NO: 2. Esta proteína de fusión recombinante se expresa y secreta de células de levadura. El péptido FLAG® facilita la purificación de la proteína y posteriormente se puede escindir del flt3-L soluble usando enteroquinasa mucosa bovina. La invención abarca las secuencias de DNA aisladas que codifican proteínas de flt3-L solubles.
Los polipéptidos de flt3-L truncados, incluidos los solubles, se pueden preparar por cualquiera de varias técnicas convencionales. Se puede sintetizar químicamente una secuencia de DNA que se desee usando técnicas conocidas en sí. Los fragmentos de DNA se pueden producir también por digestión de endonucleasa con restricción de una secuencia clonada de DNA de longitud entera y aislar por electroforesis sobre geles de agarosa. Se pueden emplear conectores que contienen sitio(s) de escisión de endonucleasa con restricción para insertar el fragmento de DNA deseado en un vector de expresión, o el fragmento se puede digerir a los sitios de escisión naturalmente presentes en él. Para amplificar una secuencia de DNA que codifica el fragmento de proteína deseado, también se puede emplear el procedimiento bien conocido de reacción en cadena de polimerasa. Como otra alternativa, se pueden emplear técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de parada en el punto deseado, por ejemplo, inmediatamente corriente abajo del codón para el último aminoácido del dominio extracelular.
En otro enfoque, para suprimir nucleótidos terminales de un fragmento de DNA con el fin de obtener un fragmento que tiene un término particular deseado, se puede emplear un tratamiento enzimático (por ejemplo, usando Bal 31). Entre los conectores disponibles comercialmente están los que se pueden ligar a los extremos embotados producidos por digestión con Bal 31 y que contienen sitio(s) de escisión de endonucleasa con restricción. Alternativamente, se pueden sintetizar y ligar al fragmento de DNA oligonucleótidos que reconstruyen los términos N o C de un fragmento de DNA al punto deseado. El oligonucleótido sintetizado puede contener un sitio de escisión de endonucleasa con restricción corriente arriba de la secuencia de codificación deseada y situar un codón de iniciación (ATG) en el término N de la secuencia de codificación.
Como se ha señalado antes, la invención proporciona polipéptidos de flt3-L aislados u homogéneos, recombinantes y no recombinantes. Se pueden obtener variantes y derivados de proteínas de flt3-L natural que retienen la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad para fijar flt3) por mutaciones de las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de flt3-L nativo. Las alteraciones de la secuencia nativa de aminoácidos se pueden realizar por cualquiera de varios métodos convencionales. Las mutaciones se pueden introducir en puntos particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Hecha la restricción, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o supresión de aminoácidos deseada.
Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específicos al sitio, dirigidos a oligonucleótidos para que resulte un gen alterado en el que se pueden alterar por sustitución, supresión o inserción codones predeterminados. Discuten ejemplos de métodos para hacer las alteraciones indicadas Walder y otros (Gene, 42:133, 1986); Bauer y otros (Gene 37:73, 1985), Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith y otros (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488, 1985), Kunkel y otros (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) y patentes U.S. nº. 4.518.584 y nº. 4.737.462, incorporándose aquí por referencia todas estas publicaciones.
El flt3-L se puede modificar para crear derivados de flt3-L formando conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfatos, grupos acetilo, etc. Se pueden preparar derivados covalentes de flt3-L uniendo los restos químicos a grupos funcionales sobre las cadenas laterales de aminoácidos de flt3-L, o en el término N o el término C de un polipéptido de flt3-L o en su dominio extracelular. Entre otros derivados de flt3-L dentro del ámbito de esta invención están incluidos conjugados covalentes o agregativos de flt3-L o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, como puede ser por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia señal o líder (por ejemplo, el líder del factor \alpha de Saccharomyces) en el término N de un polipéptido de flt3-L. El péptido señal o líder dirige cotranslacionalmente o postransacionalmente la transferencia del conjugado de su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana de la célula o la pared de la célula.
Las fusiones de polipéptidos de flt3-L pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de flt3-L. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos antigénicos de identificación descritos en la patente U.S. nº. 5.011.912 y por Hopp y otros en BioTechnology, 6, 1204, 1988.
La invención incluye además polipéptidos de flt3-L con o sin glicosilación asociada de configuración nativa. El flt3-L expresado en levadura o sistemas mamíferos de expresión (por ejemplo, células COS-7) pueden ser similares a un polipéptido de flt3-L nativo o significativamente diferentes de él en cuanto al peso molecular o la configuración de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de flt3-L en sistemas de expresión bacteriana, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicoladas.
La invención abarca construcciones de DNA equivalentes que codifican varias adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o supresiones de restos terminales o internos, o secuencias no necesarias para la actividad biológica o la unión. Por ejemplo, se pueden modificar los sitios de N-glicosilación del dominio extracelular de flt3-L para excluir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo reducido de un carbohidrato en sistemas de expresión de mamíferos y levaduras. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. Las proteínas de flt3-L humano pueden comprender dos de estos tripletes en los aminoácidos 126-128 y 150-152 de la SEQ ID NO: 6, respectivamente. Unas sustituciones, adiciones o supresiones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes dará por resultado la prevención de la fijación de restos de carbohidrato a la cadena lateral de Asn. La alteración de un nucleótido individual, escogido de manera que Asn sea reemplazado por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Entre los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas están incluidos los descritos en la patente U.S. nº. 5.071.972 y la patente EP 276.846, que se incorporan aquí por referencia.
En otro ejemplo, las secuencias que codifican restos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica se pueden alterar para hacer que los restos de Cys sean suprimidos y reemplazados con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes intramoleculares disulfuro incorrectos después de renaturalización. Otros equivalentes se preparan por modificación de restos divalentes de aminoácidos para potenciar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad de la KEX2 proteasa. La patente EP 212.914 describe el uso de mutagénesis específica para el sitio para inactivar en una proteína los sitios de procesamiento de la KEX2 proteasa. Los sitios de procesamiento de la KEX2 proteasa se inactivan por supresión, adición o sustitución de restos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la presencia de estos restos básicos adyacentes. Los pares Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión de la KEX2 proteasa, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un medio conservador y preferido para inactivar los sitios de KEX2. El flt3-L humano contiene dos sitios de procesamiento de la KEX2 proteasa en los aminoácidos 211-212 y 212-213 de la SEQ ID NO: 6, respectivamente.
Las secuencias de ácidos nucleicos dentro del ámbito de la invención incluyen secuencias aisladas de DNA y RNA que se hibridan con las secuencias de nucleótidos de flt3-L nativo descritas aquí en condiciones de estrictez moderada o severa y que codifican flt3-L biológicamente activo. Las condiciones de estrictez moderada, definidas por Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1, págs. 1.101-1.104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), incluyen el uso de una solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de aproximadamente 55ºC x SSC, durante la noche. Las condiciones de estrictez severa incluyen temperaturas de hibridación y lavado más altas. El experto sabrá que la temperatura y la concentración de sales de la solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.
Debido a la conocida degeneración del código genético en el que más de un codón pueden codificar el mismo aminoácido, una secuencia de DNA puede variar de la de la SEQ ID NO: 5 y seguir codificando una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, respectivamente. Tales secuencias variantes de DNA pueden resultar de mutaciones silentes (por ejemplo, las que se presentan en la amplificación por PCR), o pueden ser el producto de una mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.
La invención proporciona secuencias de DNA equivalentes aisladas, definidas en las reivindicaciones, que codifican flt3-L biológicamente activo seleccionado entre: (a) DNA derivado de la región codificadora de un gen de flt3-L nativo; (b) cDNA que comprende la secuencia de nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 5; (c) DNA capaz de hibridación con un DNA de (a) en condiciones de estrictez moderada que codifica flt3-L biológicamente activo; y (d) DNA que se degenera como consecuencia del código genético a un DNA definido en (a), (b) o (c) y que codifica flt3-L biológicamente activo. La invención abarca proteínas de flt3-L codificadas por tales secuencias equivalentes de
DNA.
Los DNA que con equivalentes a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO: 5 hibridarán en condiciones moderadas de estrictez con la secuencia de DNA nativo que codifica polipéptidos que comprenden secuencias de los aminoácidos 28-160 de SEQ ID NO: 6. Los ejemplos de proteínas de flt3-L codificadas por tales DNA incluyen, aunque no únicamente, fragmentos de flt3-L (solubles o unidos a membrana) y proteínas de flt3-L que comprenden sitio(s) inactivados de N-glicosilación, sitio(s) inactivados de procesamiento de KEX2 proteasa, o sustituciones conservadoras de aminoácidos, según se ha descrito antes. También se abarcan proteínas de flt3-L codificadas por DNA derivado de otras especies mamíferas, en las que el DNA hibridará con cDNA de SEQ ID NO: 5.
Las variantes que poseen la capacidad requerida de unirse a receptores flt3 pueden identificarse por cualquier ensayo adecuado. La actividad biológica de flt3-L se puede determinar, por ejemplo, mediante competición para unirse al dominio de unión del ligando del receptor flt3 (esto es, ensayos competitivos de unión).
Un tipo de un ensayo competitivo de unión para un polipéptido de flt3-L usa un receptor flt3 soluble humano radiomarcado y células intactas que expresan receptores flt3 de superficie celular. En vez de células intactas, se podrían usar receptores flt3 solubles sustituidos (tales como una proteína de fusión flt3:Fc) unidas a una fase sólida por interacción de una proteína A, proteína G o un anticuerpo a las porciones de flt3 o Fc de la molécula, con la región Fc de la proteína de fusión. Otro tipo de ensayo competitivo de unión utiliza receptores flt3 solubles marcados tales como una proteína de fusión flt3:Fc y células intactas que expresan flt3-L. Alternativamente, se podría unir flt3-L soluble a una fase sólida para seleccionar positivamente células que expresan flt3.
Los ensayos competitivos de unión se pueden realizar siguiendo metodología convencional. Por ejemplo, se puede usar flt3-L radiomarcado para competir con un homólogo putativo de flt3-L para ensayar la actividad de unión frente a receptores flt3 unidos a superficie. Se pueden obtener resultados cualitativos por ensayos de unión de placas autorradiográficas, o se pueden utilizar trazados Scatchard para obtener resultados cuantitativos.
Alternativamente, se pueden unir proteínas de unión de flt3, tales como flt3-L y anticuerpos anti flt3, a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para identificar, separar o purificar células que expresan el receptor flt3 sobre su superficie. La unión de proteínas de fijación de flt3 a una superficie en contacto con una fase sólida se puede hacer por cualquier medio, por ejemplo, construyendo una proteína de fusión de flt3-L:Fc y uniéndola a la fase sólida mediante la interacción de proteína A o proteína G. En la técnica son conocidos varios otros métodos para fijar proteínas a una fase sólida, que son adecuados para su uso en la presente invención. Por ejemplo, se pueden revestir microesferas magnéticas con proteínas de unión de flt-3 y mantenerlas en el recipiente de incubación con un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células que contienen células madre o de progenitor hematopoiéticas se ponen en contacto con la fase sólida que tiene sobre ella proteínas de unión de flt3. Las células que tienen sobre su superficie el receptor flt3 se unen a la proteína de unión de flt3 fijada y, luego, las células no unidas se eliminan por lavado. El método de unión por afinidad es útil para purificar, explorar o separar de la solución tales células que expresan flt3. Los métodos para liberar de la fase sólida células seleccionadas positivamente son conocidos en la técnica y entre ellos figura, por ejemplo, el uso de enzimas. Preferiblemente, tales enzimas son no tóxicas y no perjudiciales para las células y, preferiblemente están dirigidas a la escisión del partícipe en la unión a la superficie. En el caso de interacciones de flt3:flt3-L, preferiblemente, la enzima escindiría el receptor flt3, con lo que la suspensión de células resultante se liberaría del material de flt3-L "extraño". Luego, la población de células purificadas se expandiría ex vivo antes de trasplantarla a un paciente en cantidad suficiente para reconstituir el sistema hematopoiético e inmune del paciente.
Alternativamente, se pueden incubar primeramente mezclas de células sospechosas de contener células de flt3^{+} con una proteína de unión de flt3 biotinilada. Típicamente, los períodos de incubación son de, como mínimo, una hora de duración para asegurar una unión suficiente a flt3. La mezcla resultante se pasa luego a través de una columna con relleno de perlas revestidas con avidina, con lo que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de la célula a las perlas. El uso de perlas revestidas con avidina es conocido en la técnica. Véase Berenson y otros, J. Cell. Biochem, 10D:239 (1986). El lavado del material no fijado y la liberación de las células fijadas se realizan por métodos convencionales.
En los métodos descritos en lo que antecede, las proteínas adecuadas de unión de flt3 son flt3-L, anticuerpos anti flt3 y otras proteínas que son capaces de unir por alta afinidad flt3. Una proteína de unión de flt3 preferida es flt3-L.
Como se ha descrito antes, el flt3-L de la invención puede usarse para separar células que expresan receptores flt3. En un método alternativo, se puede conjugar flt3-L o un dominio extracelular o fragmento de él a un resto detectable tal como ^{125}I para detectar células que expresan flt3. La marcación con ^{125}I se puede realizar por cualquiera de las metodologías estándar que den una molécula funcional ^{125}I-flt-3 marcada a una alta actividad específica. O se podría usar un anticuerpo yodado o biotinilado frente a la región de flt3 o Fc de la molécula. Se puede usar otro resto detectable tal como una enzima que pueda catalizar una reacción colorimétrica o fluorimétrica, biotina o avidina. Las células a ensayar en cuanto a la expresión del receptor flt3 se pueden poner en contacto con flt3-L marcado. Después de la incubación, se elimina el flt3-L marcado no unido y se mide la unión usando el resto detectable.
Las características de unión de flt3-L (incluidas variantes) también se pueden determinar usando los receptores flt3 solubles conjugados (por ejemplo, ^{125}I.flt3:Fc) en ensayos de competición similares a los descritos antes. En este caso, empero, para medir la cuantía a la que una variante putativa de flt3-L que contiene una muestra compite por unirse con un conjugado un flt3 soluble a flt3-L, se usan receptores flt3 que expresan células intactas o receptores flt3 solubles unidos a un sustrato sólido.
Entre otros medios para ensayar el flt3-L están incluidos el uso de anticuerpos anti flt3-L, líneas de células que proliferan en respuesta a flt3-L o líneas de células recombinantes que expresan el receptor flt3 y proliferan en presencia de flt3-L. Por ejemplo, la línea de células BAF/BO3 carece del receptor flt3 y depende de IL-3. (Véase Hatakeyama y otros, Cel, 59:837-845 (1989)). Las células BAF/BO3 trensfectadas con un vector de expresión que comprende el gen de receptor flt3 proliferan en respuesta a IL-3 o flt3-L. Un ejemplo de un vector de expresión adecuado para transfección de flt3 es el plásmido pCAV/NOT; véase Mosley y otros, Cell 59:335-348 (1989).
Los polipéptidos de flt3-L pueden existir como oligómeros tales como dímeros o trimeros unidos covalentemente o no covalentemente. Los oligómeros se pueden unir por enlaces disulfuro formados entre restos de cisteína en diferentes polipéptidos de flt3-L. En una realización de la invención, se crea un dímero de flt3-L fusionando flt3-L a la región de Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgGI) de manera que no interfiera con la unión de flt3-L al dominoo del ligando de flt3. Preferiblemente, el polipéptido de Fc se fusiona al término C de un flt3-L soluble (que comprende sólo el dominio extracelular). La preparación general de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluido el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi y otros (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn y otros (Nature 344:677, 1990), que se incorporan aquí por referencia. Se inserta una fusión de gen que codifica la proteína de fusión de flt3-L:Fc en un vector de expresión apropiado. Se deja que se unan proteínas de fusión de flt3-L:Fc a modo de moléculas de anticuerpo dando flt3-L divalente. Si se hacen proteínas de fusión con cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de flt3-L con hasta cuatro regiones extracelulares. Alternativamente, se pueden unir dos dominios de flt3-L solubles con un conector peptídico.
Se pueden preparar vectores de expresión recombinantes que contienen un DNA que codifica flt3-L usando métodos bien conocidos. Los vectores de expresión incluyen una secuencia de DNA de flt3-L unida operativamente a secuencias de nucleótidos de regulación transcripcional o translacional tales como las derivadas de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Los ejemplos de secuencias de regulación incluyen promotores transcripcionales, operadores o potenciadores, un sitio de unión ribosomal de mRNA y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de transcripción y translación. Las secuencias de nucleótidos están "operativamente unidas" cuando la secuencia de regulación funcionalmente se relaciona con la secuencia de DNA de flt3-L. Así, una secuencia de nucleótidos de promotor está operativamente unida a una secuencia de DNA de flt3-L si la secuencia de promotor de nucleótidos controla la transcripción de la secuencia de DNA de flt3-L. Adicionalmente se puede incorporar en el vector de expresión la capacidad de replicar en las células huésped deseadas, usualmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección por el que se identifican los transformantes.
Además, se pueden incorporar en vectores de expresión secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no están naturalmente asociados con flt3-L. Por ejemplo, una secuencia de DNA para un péptido señal (líder secretor) se puede fusionar en marco con la secuencia de flt3-L de manera que flt3-L se traduce inicialmente como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped deseadas potencia la secreción extracelular del polipéptido de flt3-L. El péptido señal de puede escindir del flt3-L después de la secreción de flt3-L de la célula.
Entre las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de flt3-L están incluidas células procariotes, de levadura o eucarióticas superiores. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares bacterianos, de hongos, levadura y mamíferos en, por ejemplo, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, de Pouwels y otros, Elsevier, New York, (1985). También se podrían emplear sistemas de translación exentos de células para producir polipéptidos de flt3-L usando RNAs derivado de construcciones de DNA descritas aquí.
Los procariotes incluyen organismos gram negativos y gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. El grupo de células huésped procarióticas adecuadas para transformación incluye, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias otras especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphilococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un polipéptido de flt3-L puede incluir un resto N-terminal de metionina para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. El Met N-terminal se puede escindir del polipéptido recombinante de flt3-L expresado.
Los vectores de expresión para uso en células huésped procarióticas comprenden, por lo general, uno o más genes marcadores fenotípicos seleccionables. Un gen marcador fenotípico seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia antibiótica o que suministra un requerimiento autotrópico. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procarióticas incluyen los derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona así un medio simple para identificar células transformadas. Para construir un vector de expresión usando pBR322, se insertan un promotor apropiado y una secuencia de DNA de flt3-L en el vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles son, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec. Madison, WI, USA).
Las secuencias de promotor comúnmente usadas para vectores de expresión de células huésped recombinantes procarióticas incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang y otros, Nature 275:615, 1978, y Goeddel y otros, Nature 281:544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucleic Acids Res., 8:4057, 1980), y documento EP-A-36776) y promotor de tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procarióticas particularmente útil emplea un promotor de fagos \lambda P_{L} y una secuencia de represión termolábil cI857ts. Entre los vectores de plásmidos disponibles de la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambda P_{L} está incluido el plásmido pHUB2 (que reside en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092) y pPLc28 (residente en la cepa RR1 de E. coli (ATCC 53082).
Los polipéptidos de flt3-L se pueden expresar, alternativamente, en células huésped de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de lavaduras, tales como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Frecuentemente, los vectores de levadura contendrán un origen de frecuencia de replicación de un plásmido de 2 \mu de levadura, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias de promotor adecuadas para vectores de levaduras incluyen, entre otros, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y otros, Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, 3-fosfatodeshidrogenasa de gliceraldehído, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfogliceraro mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Hitzeman, documento EP-A-73.657, Fleer y otros, Gene 107:285-195 (1991) y van den Berg y otros, BiolTechnology 8:135-139 (1990) describen otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levaduras. Otra alternativa es el promotor ADH2 represor de glucosa descrito por Russell y otros (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y otros (Nature, 300:724, 1982). Se pueden construir vectores lanzadera en levaduras y E. coli insertando secuencias de DNA de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levaduras antes descritos.
La secuencia líder del factor \alpha de lavadura se puede emplear para dirigir la secreción del polipéptido de flt3-L. A menudo, la secuencia líder del factor \alpha se inserta entre la secuencia del promotor y la secuencia del gen estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan y otros, Cell 30:933, 1982; Bitter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5330, 1984; patente U.S. nº. 4.546.082 y patente EP 324.274. Los expertos en la técnica conocen otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes de lavaduras. Una secuencia líder se puede modificar cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.
Los expertos en la técnica conocen protocolos para la transformación de levaduras. Uno de estos protocolos es el descrito por Hinnen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y otros selecciona transformantes de Trp^{+} en un medio selectivo, medio selectivo que consta de 0,67% de una base de nitrogenada de levadura, 0,5% de casinoaminoácidos, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracil.
Las células huésped de levadura transformadas por vectores que contienen la secuencia de promotor ADH2 se pueden hacer crecer en un medio "rico" para inducir la expresión. Un ejemplo de un medio rico es un medio que consta de 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa complementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracil. La derrepresión del promotor ADH2 se produce cuando se agota la glucosa del medio.
Los sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o insecto podrían emplearase también para expresar polipéptidos recombinantes de flt3-L. Luckow y Summers (BiolTecchnology 6:47 (1988) hacen una revisión de sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos. También se pueden emplear líneas establecidas de células de origen mamífero. Entre los ejemplos de líneas de células huésped mamíferas adecuadas están incluidas la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y otros, Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CL 163), células de ovario de hamster chino (CHO), células HeLa y BHK (ATCC CRL 10), y la línea de células CV-1/EBNA-1 derivada de la línea de células de riñón del mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) descrita por McMahan y otros (EMBO J., 10:281, 1991),
Las secuencias de control transcripcional y translacional para vectores de expresión de células huésped mamíferas se pueden extraer de genomas virales. Las secuencias de promotor y secuencias potenciadoras comúnmente usadas derivan de virus de polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV 40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, de origen SV40, promotor precoz o tardío, potenciador, sitios de reparación y poliadenilación se pueden usar para obtener otros elementos genéticos para expresión de una secuencia estructural de genes en una célula huésped mamífera. Son particularmente útiles los promotores virales precoces y tardíos porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como fragmento que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers y otros, Nature, 273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal de que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BglI localizado en el origen viral de SV40 del sitio de replicación.
Se pueden construir vectores de expresión ejemplares para uso en células huésped mamíferas como lo describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol., 3:280, 1983). Se puede construir sustancialmente como describen Cosman y otros (Mol. Immunol. 23:935, 1986) un sistema útil para expresión a alto nivel de cDNAs mamíferos en células epiteliales mamarias C127 de murino. Se ha depositado como ATCC 39890 un vector útil de alta expresión, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y otros, Nature, 312:678, 1984. En el documento EP-A-0367566 y en la solicitud de patente U.S. serial nº. 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991, que se incorporan aquí, por referencia, se describen más vectores de expresión de mamíferos útiles. Los vectores pueden derivar de retrovirus. En vez de la secuencia señal natural, se puede añadir una secuencia señal heteróloga tal como la secuencia señal para IL-7 descrita en la patente U.S. nº. 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de IL-2 descrita por Cosman y otros, Nature 312:768 (1094); el péptido señal de IL-4 descrito en la patente EP 367.566; el péptido señal del receptor del tipo I de IL-1 descrito en la patente U.S. nº. 4.968.607 y el péptido señal del receptor de IL-1 de tipo II descrito en la patente EP 460.846.
El flt3-L como proteína aislada u homogénea de acuerdo con la invención se puede producir por sistemas de expresión recombinantes descritos antes o se puede purificar partiendo de células naturales. El flt3-L se puede purificar hasta lograr homogeneidad sustancial, según lo indica una banda singular de proteína obtenida mediante análisis por electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida SDS-PAGE).
Un procedimiento para producir flt3-L comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica flt3-L, en condiciones suficientes para promover la expresión de flt3-L. Luego se recupera el flt3-L del medio de cultivo o .los extractos de células, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como lo saben los expertos experimentados, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleado y de si la proteína recombinante se secreta o no en el medio de cultivo.
Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, se puede concentrar primeramente el medio de cultivo usando un filtro comercial de concentración de proteínas, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Seguidamente a la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Entre los intercambiadores catiónicos adecuados están incluidas varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, para purificar más flt3-L se pueden emplear una o más etapas de cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) empleando medios hidrófobos de RP-HPLC (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos pendientes metilo un otros grupos alifáticos). Algunas o todas la etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, son bien conocidas y se pueden emplear para obtener una proteína recombinante sustancialmente homogénea.
Es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión de ligando de los receptores flt3 para purificar por afinidad polipéptidos de flt-3-L expresados. Los polipéptidos de flt3-L se pueden eliminar de la columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución muy salino, y dializarse luego en un tampón de un contenido salino menor para uso, o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un anticuerpo que fija flt3-L. El Ejemplo 6 describe un procedimiento para emplear flt3-L de la invención con el fin de generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra flt3-L.
Usualmente, la proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aísla desmoronando inicialmente las células huésped, a lo que sigue centrifugación, extracción de los pélets de células si se trata de un polipéptido insoluble, o de un fluido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble; y luego siguen una o mas etapas de concentración, desalación, intercambio iónico, purificación por afinidad o de cromatografía de exclusión por tamaños. Finalmente se puede emplear la RP-HPLC para las etapas de purificación final. Las células microbianas se pueden desmoronar por cualquier método conveniente, tal como por ciclos de congelación-descongelación, sonicación, desmoronamiento mecánico o usando agentes de lisado de células.
Preferiblemente, las células huésped de levadura transformadas se emplean para expresar flt3-L como polipéptido secretado con el fin de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de células huésped se puede purificar por mátodos análogos a los descritos por Urdal y otros (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal y otros describen dos etapas secuenciales de HPLC de fase inversa para la purificación de IL-2 recominante humano sobre una columna de HPLC preparativa.
Los oligonucleótidos antisentido o de sentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de cadena simple (RNA o DNA) capaz de unirse a una secuencia de mRNA de flt3-L diana (formando una hélice doble) o a una secuencia de flt3-L en la hélice de DNA de cadena doble (formando una hélice triple) se pueden hacer de acuerdo con la invención. Los oligonucleótidos antisentido o de sentido de acuerdo con la presente invención comprenden un fragmento de la región de codificadora de cDNA de flt3-L. Por lo general, tal fragmento comprende como mínimo aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad de crear un oligonuceótido de sentido o antisentido, basado en una secuencia de cDNA para una proteína dada la describen, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. , 48:2659, 1988, y van der Krol y otros, BioTechnics 6:958, 1988.
La unión de oligonucleótidos de sentido o antisentido a secuencias de ácidos nucleicos diana da por resultado la formación de complejos que bloquean la translación (RNA) o transcripción (DNA) por uno o varios medios, incluida la degradación potenciada de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o translación o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido se pueden usar así para bloquear la expresión de proteínas de flt3-L. Además, los oligonucleótidos antisentido o de sentido pueden comprender oligonucleótidos que tienen espinazos de fosfodiésteres de azúcar (u otros enlaces de azúcares tales como los descritos en el documento WO 1/06629) y cuyos enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar son estables in vivo (esto es, capaces de resistir la degradación enzimática), pero retienen la especifidad de secuencia para poder unirse a secuencias nucleotídicas diana. Entre otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido están incluidos los oligonucleótidos que están unidos covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad del nucleótido a favor de una secuencia de ácido nucleico diana, tal como poli-(L-lisina). Aún más, a los oligonucleótidos de sentido o antisentido se pueden unir otros agentes de intercalación tales como elipticina, y agentes de alquilación u otros complejos metálicos para modificar las especifidades de unión del oligonucleótido antisentido o de sentido a favor de la secuencia de nucleótidos diana.
Los oligonucleótidos antisentido o de sentido se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana por cualquier método de transferencia de genes, incluida, por ejemplo, transfección de DNA mediada por CaPO_{4}, electroporación, o usando vectores de transferencia de genes tales como el virus de Epstein-Barr. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido o de sentido se introducen en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana por inserción del oligonucleótido de sentido o antisentido en un vector retroviral adecuado, poniendo luego en contacto la célula con el vector de retrovirus que contiene la secuencia insertada, in vivo o ex vivo. Entre los vectores retrovirales adecuados están incluidos, aunque no únicamente, el retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MulV), o los vectores de doble copia designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase solicitud de PCT US 90/02656).
Los oligonucleótidos de sentido o antisentido se pueden introducir también en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana por formación de un conjugado con una molécula ligando de unión como se describe en el documento WO 91/04753. El grupo de moléculas ligando de unión adecuadas incluye, aunque no únicamente, receptores de superficie de células, factores de crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a receptores de superficie de células. Preferiblemente, la conjugación de la molécula ligando de unión no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula ligando de unión para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisetido,o su versión conjugada a la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o antisentido se puede introducir en una célula que contiene la secuencia de aminoácidos diana por formación de un complejo de oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. Preferiblemente, el complejo de oligonucleótido-lípido se disocia dentro de la célula por una lipasa endógena.
Los polipéptidos de flt3-L de la invención se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. El flt3-L se puede combinar en una mezcla, bien como único material activo o bien con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsivos, solubilizantes, coadyuvantes y/o vehículos. Se describen vehículos adecuados y sus formulaciones en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing Co. Además, tales combinaciones pueden contener flt3-L complejado con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o se pueden incorporar en compuestos polímeros tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc., o se pueden incorporar en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, membranas de eritrocitos o esferoblastos. Tales composiciones influirán sobre el estado físico, la solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo de flt3-L. El flt3-L también se puede conjugar a anticuerpos contra receptores específicos para tejidos, ligandos o antígenos, o acoplarse a ligandos de receptores específicos para tejidos. Cuando el receptor flt3 se encuentra en células neoplásicas, el flt3-L se puede conjugar a una toxina, por lo que el flt3-L se usa para suministrar la toxina al sitio específico, o se puede usar para sensibilizar tales células neoplásicas para administrar posteriormente agentes antineoplásicos.
El flt3-L se puede administrar tópicamente, parenteralmente o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, intramusculares, intracisternales o técnicas de infusión. Típicamente, estas inyecciones contendrán una cantidad efectiva del flt3-L solo o en combinación con una cantidad efectiva de cualquier otro material activo. Las dosis y las concentraciones deseadas de los fármacos contenidos en las composiciones pueden variar dependiendo de muchos factores, incluido el uso previsto, el peso corporal y la edad del paciente y la vía de administración. Las dosis preliminares se pueden determinar de acuerdo con ensayos con animales y la escalación de la dosificación para administración humana se puede realizar de acuerdo con prácticas establecidas. Teniendo en cuenta la descripción anterior, las dosis típicas de flt3-L pueden estar en el intervalo de aproximadamente 10 \mug por m^{2} a aproximadamente 1000 \mug por m^{2}. Un intervalo de dosificación preferido es del orden de aproximadamente 100 \mug por m^{2} a aproximadamente 300 \mug por m^{2}.
Además de lo anterior, se suministran los ejemplos siguientes para ilustrar realizaciones particulares de la presente invención, que no limitan el ámbito de la invención.
Ejemplo 1 Preparación del receptor flt3: proteína de fusión Fc
Este ejemplo describe la clonación de cDNA de flt3 murino y la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión receptor flt3:Fc para uso en la detección de clones de cDNA que codifican flt3-L. La clonación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) del cDNA de flt3 de células T de murino se realizó usando los cebadores de oligonucleótidos y los métodos descritos por Lyman y otros, Oncogene, 8:815-822, 1993, publicación que se incorpora aquí por referencia. La secuencia de cDNA y la secuencia de aminoácidos codificada para el receptor flt3 de ratón la presentan Rosnet y otros, Oncogene, 6:1641-1650 (1991), publicación que se incorpora aquí por referencia. La proteína de flt3 de ratón tiene un dominio extracelular de 542 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 21 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 437 aminoácidos.
Antes de de fusionar el cDNA de flt3 murino al término N de cDNA que codifica la porción Fc de una molécula de IgGl humano, el fragmento de cDNA de flt3 de ratón amplificado se insertó en el sitio Asp718-NotI de pCAV/NOT, descrito en la solicitud de PCT WO 90/05183. Se clonó DNA que codifica un polipéptido de cadena simple que comprende la región Fc de un anticuerpo de IgGI humano en el sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT SK®, asequible comercialmente de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Este vector plásmido es replicable en E. coli y contiene un segmento policonector que incluye 21 sitios singulares de restricción. Se introdujo un sitio singular Bg/II cerca del extremo 5' de la secuencia que codifica Fc insertada, de manera que el sitio Bg/II abarca los codones para los aminoácidos tres o cuatro del polipéptido Fc.
El polipéptido de Fc codificado se extiende desde la región de articulación N-terminal al término C nativo, esto es, esencialmente una región de Fc anticuerpo de longitud entera. También pueden emplearse fragmentos de regiones de Fc, por ejemplo, los que están truncados en el extremo C-terminal. Preferiblemente, los fragmentos contienen múltiples restos de cisteína (al menos los restos de cisteína de la reacción de articulación) para permitir que se formen enlaces disulfuro entre las porciones de poliéptido de Fc de dos proteínas de fusión de flt3:Fc separadas formando dímeros, como se ha discutido antes.
Se introdujo corriente arriba de la región de codificación de flt3 un sitio de escisión de endonucleasa de restricción de Asp718. Se aisló un fragmento de Asp 718-NotI de cDNA de flt3 de ratón (que comprende el dominio extracelular entero, la región transmembrana y una pequeña porción del dominio citoplasmático). El cDNA parcial de Asp 718-NotI flt3 descrito se clonó en el vector pBLUESCRIPT SK® que contiene el cDNA de Fc, de manera que el cDNA de flt3 quedara corriente arriba del cDNA de Fc. Con el fin de fusionar perfectamente el dominio extracelular entero de flt3 a la secuencia de Fc, se mutó DNA de cadena simple del gen de fusión resultante por el método descrito por Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985) y Kunkel y otros (Methods in Enzymol., 154:367, 1987). El DNA mutado se secuenció para confirmar que se habían eliminado los nucleótidos apropiados (esto es, se eliminaron la región transmembrana y el DNA de dominio citoplasmático parcial) y que las secuencias de flt3 y Fc estaban en el mismo marco de lectura. Se separó el cDNA de fusión y se insertó en el vector de expresión mamífero designado sfHAV-EO 409 que se cortó con SalI-NotI y los extremos embotados de SalI y Asp718. McMahan y otros (EMBO J., 10; Nº. 10:2821-2832 (1991)) describen el vector sfHAV-EO (también conocido como pDC406).
Preferiblemente, las proteínas de fusión de flt3:Fc se sintetizan en cultivo de células mamíferas recombinantes. El vector de expresión que contiene la proteína de fusión flt3:Fc se transfectó en células CV-1 (ATCC CCL 70) y células COST (ATCC CRL 1651), ambas derivadas de riñón de mono. El nivel de expresión de flt3:Fc era relativamente bajo tanto en células CV-1 como en células COS-7. Así, se intentó la expresión en células 293 (células embrionarias primarias humanas de riñón, transformadas, ATCC CRL 1573).
Las células 293 transfectadas con el vector sfHAV-EO/flt:Fc se cultivaron en botellas de rodillo para posibilitar la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se secreta en el medio de cultivo por la vía del péptido señal de flt3. La proteína de fusión se purificó en columnas de Sepharose de proteína A, se eluyó y se usó para explorar células en cuanto a su capacidad para unirse a flt3:Fc, según se describe en los Ejemplos 2 y 3.
Ejemplo 2 Células de exploración de la unión de flt3:Fc
Se ensayaron en cuanto a la unión a flt3:Fc aproximadamente 100 células y líneas de células primarias diferentes que pertenecen a las siguientes categorías generales: células primarias de cerebro fetal de murino, líneas de células fetales de hígado de murino, líneas de células fetales de cerebro de rata, líneas de células de carcinoma de pulmón humano (fibroblastoides), líneas de células linfoides y meloides humanas y de murino. Las líneas de células se incubaron con flt3:Fc, seguidamente con un anticuerpo de Fc antihumano biotinilado y luego con estreptavidina-ficoeritrina (Becton Dickinsonn). El anticuerpo biotinilado se compró a Jackson Immunoresearch Laboratories. La estrepravidina se fija a la molécula de biotina unida al anticuero de Fc antihumano que, a su vez, se une a la porción de Fc de la proteína de fusión flt3:Fc. La ficoeritrina es una ficobiliproteína fluorescente que actúa como marcador detectable. Para cada tipo de célula se midió el nivel de la señal fluorescente usando un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson). Se identificaron los tipos de células que se manifestaron positivamente en cuanto a la unión a flt3:Fc.
Ejemplo comparativo 1
Aislamiento y clonación de cDNA de flt3-L de una biblioteca de cDNA de células T de murino
Como posible fuente de cDNA de flt3-L se escogió una biblioteca de cDNA de células T de la línea de células P7B-0.3A4. P7B-0.3A4 es un clon de células T de murino que es Thyl1.2^{+}, CD4^{-}, CD8^{-}, TCRab^{\pm}, CD 44^{+}. Originalmente se clonó a una densidad de células de 0,33 células/pocillo en presencia de rHuIL-7 y MAb antiCD3 inmovilizado, y se hizo crecer en cultivo continuo durante más de 1 año haciendo que pasara una vez a la semana en un medio que contenía 15 ng/ml de rHuIL-7. La línea de células madre se derivó de células de nodo de linfa de ratones SJL/J inmunizados con 50 nmoles de péptido PLP_{139-151} y 100 \mug/ml de H37Ra de Mycobacterium tuberculosis en coadyuvante incompleto de Freund. PLP es el componente de proteína proteolipídica de la envoltura de mielina del sistema nervioso central. El péptido compuesto por los aminoácidos 139-151 previamente ha revelado ser el péptido encefalogénico en la encefalomielitis auntoinmune experimental (EAE), un modelo de murino para esclerosis múltiple en ratones SJL/J. (Touhy, V.K., Z. Lu, R.A. Sobel, R.A. Laursen y M.B. Lees, 1989.. Identification of an encephalitogenic determinant of myelin proteolipid protein for SLJL mice, J. Immunol., 142:1523). Después del cultivo inicial en presencia de antígeno, la línea madre de células, designada PLP7, había estado en cultivo continuo con rHuIL-7 (y sin antígeno) durante más de 6 meses antes de la clonación.
P7B -0.3A4 prolifera sólo en respuesta a concentraciones muy altas del péptido PLP_{139-151} en presencia de esplenocitos singénicos irradiados y no es encefalogénico ni alosensible. Este clon prolifera en respuesta a anti CD3 Mab, inmovilizado, IL-2 e IL-7, pero no a IL-4.
Se observó unión de flt3:Fc en células T de murino y células T humanas y, por tanto, se escogió una línea de células T de murino (0.3A4) debido a su facilidad de crecimiento Se preparó una biblioteca de cDNA de 0.3A4 de murino en sfHAV-EO como lo describen MaMahan y otros, (EMBO J., 10; nº:10; 2821-2832, 1991). sfHAV-EO es un vector de expresión mamífero que replica también en E. coli. El sfHAV-EO contiene orígenes de replicación derivados de SV40, virus de Epstein-Barr y pBR322 y es un derivado de HAV-EO descrito por Dower y otros, J. Immunol. 141:4314 (1989). El sfHAV-EO se diferencia de HAV-EO en la supresión del instron presente en la secuencia líder tripartita de adenovirus 2 en HAV-EO. En resumen, se clonó cDNA de células T de murino en el sitio SalI de sfHAV-EO por un método adaptador similar al descrito por Haymerle y otros (Nucleic Acids Res. 14:8615, 1986) usando el par adaptador de oligonucleótidos siguiente:
5' 
\hskip0.1cm
TCGACTGGAACGAGACGACCTGCT 3' 
\hskip0.2cm
SEQ ID NO: 3
3' 
\hskip0.7cm
GACCTTGCTCTGCTGGAACGA 
\hskip0.7cm
SEQ ID NO: 4
Se preparó cDNA cebado al azar, de cadena doble, con extremos romos, a partir de 0.3A4 poli(A)+RNA esencialmente como lo describen Gubler y Hoffman, Gene 25:263-269 (1983), usando un kit de DNA de Pharmacia, Los adaptadores se añadieron al cDNA como lo describen Haymerle y otros. El material de bajo peso molecular se eliminó haciendo que pasaran sobre Sephacryl S-1000 a 65ºC y el cDNA se ligó a sfHAV-EO 410, que previamente se había cortado con SalI y ligado al mismo par de nucleótidos. Este vector se designa sfHAV-EO410. El DNA se sometió a electroporación (Dower y otros, Nucleic Acids Res, 16:6127-6145, (1988) en DH10 B de E. coli y, después de una hora de crecimiento a 37ºC, las células transformadas se congelaron en partes alícuotas de 1 ml en medio SOC (Hanahan y otros, J. Mol. Biol., 166 :557-580, (1983) que contenía 20% de glicerol. Una parte alícuota se tituló para determinar el número de colonias resientes a la ampicilina. La biblioteca de 0.3A4 resultante tenía 1,84 millones de clones.
Se cultivaron células DH10B de cepa de E. coli transfectadas con la biblioteca de cDNA en sfHAV-EO410 para tener aproximadamente 1600 colonias por placa. Se extrajeron colonias de cada placa, se combinaron y de cada combinación se preparó DNA de plásmido. El DNA combinado, que representaba aproximadamente 1600 colonias, se usó luego para transfectar una capa subconfluente de células CV-1/EBNA-1 usando DEAE-dextrano por tratamiento con cloroquina, similar al descrito por Luthman y otros, Nucl. Acids Res., 11:1295, (1983) y McCutchan y otros, J. Natl. Cancer Inst., 41:35 (1986). La línea de células CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL10478) expresa constitutivamente el antígeno-1 nuclear de EBV guiado del potenciador/promotor precoz inmediato de CMV. El CV1-EBNA-1 se derivó de la línea de células CV-1 de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70), descrito por McMahan y otros (EMBO J., 10:281, 1991).
Con el fin de transfectar las células CV-1/EBNA-1 con la biblioteca de cDNA, las células se mantuvieron en un medio completo (medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) que contenía 10% (v/v) de suero fetal de ternera (FCS), 50 U/ml de penicilina, 50 U/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM) y se cultivaron a una densidad de aproximadamente 2 x 10^{5} células/pocillo sobre portaobjetos con cámara de pocillo individual. Los portaobjetos se sometieron a un tratamiento previo con 1 ml de fibronectina humana (10 \mug/ml en PBS) durante 30 min y seguidamente a lavado con PBS. Se eliminó el medio de la capa adherente de células y se reemplazó con 1,5 ml de medio completo que contenía 66,6 \muM de sulfato de cloroquina. Se añadieron luego a las células 0,2 ml de solución de DNA (2 \mug de DNA, 0,5 mg/ml de DEAE-dextrano en medio completo que contenía cloroquina) y se incubó durante 5 horas. Después de la incubación, se eliminó el medio y se colapsaron las células añadiendo un medio continuo que contenía 10% de DMSO durante 2,5-20 min, reemplazándose seguidamente la solución con medio completo fresco. Las células se cultivaron durante 2 a 3 días para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas.
Se ensayaron las monocapas transfectadas de células CV-1/EBNA-1 en cuanto a la expresión de flt3-L por autorradiografía esencialmente como lo describen Gearing y otros (EMBO J., 8:3667, 1989). Las células CV-1/EBNA-1 transfectadas (adheridas a portaobjetos de cámara) se lavaron una vez con medio de unión con leche seca no grasa (BM-NFDM) (medio RPMI 1640 que contenía 25 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA), 2 mg/ml de azida sódica, HEPES 20 mM, pH 7,2 y 50 mg/ml de leche seca no grasa). Las células se incubaron luego con flt3:Fc en BM-NFDM (1 \mug/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las monocapas de células de los portaobjetos se lavaron tres veces con BM-NFDM para eliminar la proteína de fusión flt3:Fc no unida y luego se incubó con 40 ng/ml de anticuerpo de Fc antihumano de ratón marcado con ^{125}I (descrito más adelante) (dilución 1:50) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con BM-NFDM y seguidamente dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar anticuerpo de Fc antihumano de ratón-^{125}I. Las células se fijaron por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en glutaraldehído al 2,% en PBS, pH 7,3, se lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Los portaobjetos de cámara que contenían las células se expusieron durante la noche en un Phophoimager (Molecular Dynamics), luego se sumergieron en una emulsión fotográfica GTNB-2 de Kodak (dilución en agua 6 x) y se mantuvieron durante 3-5 días a 4ºC en una cámara impermeable a la luz. Luego se revelaron los portaobjetos durante aproximadamente 4 minutos en el revelador Kodak D19 (40 g/500 ml de agua), se enjuagaron en agua y se fijaron en el fijador G433C de Agfa. Los portas se examinaron individualmente con un microscopio a 25-40 aumentos y las células que expresaban positivamente flt3-L se identificaron por la presencia de granos de plata autoradiogáficos frente a un fondo de luz.
El anticuerpo de Fc antihumano de ratón se obtuvo de Jackson Laboratories. Este anticuerpo presentó una mínima unión a proteínas de Fc unidas al receptor Fc\gamma. El anticuerpo se marcó usando el método de la cloramina T. En resumen, se preparó una columna Sephadex G-25 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La columna se trató previamente con 10 volúmenes de columna de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino para reducir la adsorción no específica de anticuerpo a la columna y resina. Luego se lavó de la columna la albúmina de suero bovino no unida usando 10 volúmenes de PBS exento de albúmina que suero bovino. En un tubo de microcentrifugadora se añadieron 10 \mug de anticuerpo (disueltos en 10 \mul de PBS) a 50 \mul de tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,2), 2,0 mCi de Na-^{125}I exento de vehículo y se mezcló bien la solución. Se añadieron luego 15 \mul de una solución recientemente preparada de cloromina-T (2 mg/ml en tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,2) y la mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente; inmediatamente después, la mezcla se aplicó a la columna de Sephadex G-25. El anticuerpo radiomarcado se eluyó luego de la columna recogiéndose fracciones de 150 \mul de eluido. A las fracciones eluidas que contenían el anticuerpo se añadió albúmina de suero bovino a una concentración final de 1%. La radioyodación dio actividades específicas en el intervalo de 5-10 x 10^{15} cpm/nmo de proteína.
Usando la técnica de autorradiografía de portaobjetos, se exploraron los aproximadamente 1.840.000 cDNAs en cúmulos de aproximadamente 1.600 cDNAs hasta que el ensayo de un cúmulo transfectante presentó múltiples células claramente positivas en cuanto a la unión de flt3:Fc. Este cúmulo se repartió en cúmulos de 500 y se exploró nuevamente por autorradiografía y se identificó un cúmulo positivo. Este cúmulo se repartió en cúmulos de 100 y se exploró nuevamente. Se exploraron colonias individuales de este cúmulo de 100 hasta que se identificó un clon (clon nº. 6C) que dirigía la síntesis de una proteína de superficie con actividad específica de unión de flt3:Fc. Se aisló este clon y se secuenció su inserto de cDNA de 0,88 kb.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos codificados de la región de codificación de cDNA del flt3-ligando de murino del clon nº. 6 se presentan en las SEQ ID NO: 1 y NO: 2. El inserto de cDNA tiene una longitud de 0,88 kb. El marco de lectura abierta dentro de esta secuencia podía codificar una proteína de 231 aminoácidos. Así, en las SEQ ID NO: 1 y NO: 2 se presentan el DNA y las secuencias de aminoácidos para el marco de lectura abierta de 231 minoácidos. La proteína de la SEQ. ID NO: 2 es una proteína de transmembrana de tipo I, con un péptido señal N-terminal (aminoácidos 1 a 27), un dominio extracelular (aminoácidos 28-188), un dominio transmembrana (aminoácidos 189-211) y un dominio citoplasmático (aminoácidos 212-231). El peso molecular predicho de la proteína nativa después de escisión de la secuencia señal es de 23.164 daltons. La proteína madura tiene un pI estimado de 9,372. Hay 56 bp de secuencia 5' no codificadora y 126 bp de secuencia 3' no codificadora que flanquea la región codificadora, incluidos los adaptadores de cDNA añadidos. El procedimiento de clonación descrito produjo también un clon nº. 5H de flt3-ligando de murino, que es idéntico al clon nº. 6 que comienza en el nucleótido 49 y que continúa hasta el nucleótido 545 (que corresponde al aminoácido 163) de la SEQ ID NO: 1. El clon nº. 5 difiere completamente del indicado antes y representa una construcción alternativa de reparación.
El vector sfHAV-EO410 que contiene el cDNA de flt3-L en células DH10B de E. coli se depositó el 20 de abril de 1993 en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) y se le asignó el número de acceso ATCC 69286. El depósito se hizo en los términos del Tratado de Budapest.
Ejemplo 3 Clonación de cDNA que codifica flt3-L humano
Se clonó un cDNA que codifica flt3-L humano partiendo de una biblioteca de cDNA cebado al azar \lambdagt10 de células T según describen Sims y otros, PNAS, 86:8946-8950 (1989). La biblioteca se exploró con un fragmento de Ple I de 413 bp que corresponde al dominio extracelular de flt3-L de murino (nucleótidos 103-516 de la SEQ ID NO: 1). El fragmento se cebó al azar, se hibridó durante la noche a los filtros de la biblioteca a 55ºC en tampón de oligoprehibridación. El fragmento se lavó luego con agua a 55ºC durante 1 hora y luego con 0,5 x SSC/0,1% de SDS durante 1 hora. Se extrajo el DNA de las placas de fagos positivos y los insertos se amplificaron por PCR usando oligonucleótidos específicos para los brazos de fagos. El DNA se secuenció luego y la secuencia para el clon nº. 9 se presenta en la SEQ ID NO: 5. Se aisló cDNA de flt3-L humano adicional de la misma biblioteca de cDNA cebada al azar de \lambdagt10 como se ha descrito antes explorando la biblioteca con un fragmento del dominio extracelular de cDNA del clon nº 5H de murino, que comprende una secuencia de cDNA que esencialmente corresponde a los nucleótidos 128-541 de la SEQ ID NO: 1.
La secuenciación del clon nº. 9 de cDNA de 988 bp reveló un marco de lectuta abierta de 705 bp rodeado por 29 bp de la secuencia 5' no codificadora y 250 bp de la secuencia 3' no codificadora. La región 3' no codificadora no contenía una cola poli A. No había codones de parada en el marco corriente arriba de la metionina iniciadora. El marco de lectura abierta codifica una proteína transmembrana de tipo I de 235 aminoácidos, como lo indican los aminoácidos 1-235 de la SEQ ID NO: 6. La proteína tiene un péptido señal N-terminal de una longitud de, alternativamente, 26 o 27 aminoácidos. Hay una probabilidad ligeramente mayor de que el péptido señal N-terminal tenga una longitud de 26 aminoácidos de que tenga una longitud de 27 aminoácidos. Al péptido señal sigue un dominio extracelular de 156 ó 155 aminoácidos (para los péptidos señal de 26 y 27 aminoácidos, respectivamente); un dominio transmembrana de 23 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 30 aminoácidos. El flt3-L humano comparte una identidad global de 72% de aminoácidos y una similaridad de 78% de aminoácidos con flt3-L de murino. El vector pBLUESCRIPT SK (-) que contiene cDNA de flt3-L humano del codón nº. 9 se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC) el 6 de agosto de 1993 y se le asignó el número de acceso ATCC 69382. El depósito se hizo en los términos del Tratado de Budapest.
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Ejemplo comparativo 2
Expresión de flt3-L en levadura
Para expresión de flt3-L soluble en levadura, se usaron cebadores oligonucleótidos sintéticos para amplificar por PCR (Mullis y Faloona, Meth. Enzymol., 155:335-350, 1987) el dominio extracelular codificador entero de flt3-L entre el extremo del péptido señal y el comienzo del segmento de transmembrana. El cebador 5' (5'-AATTGGTACCTTT
GGATAAAAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGACACCTGACTGTTACTTCAGCCAC-3'), SEQ ID NO: 7 codificaba una porción del líder del factor alfa y un octapéptido antigénico, la secuencia de FLAG fusionada en marco con el término N maduro predicho de flt3-L. El oligonucleótido 3' (5'-ATATGGATCCCTACTGCCTGGGCC
GAGGCTCTGGGAG-3') SEQ ID NO: 8 creó un codón de teminación después de Gln-189, justo en la región transmembrana putativa. El fragmento de DNA generado por PCR se ligó en un vector de expresión de levadura (para expresión en K. Lactis) que dirige la secreción del producto recombinante en el medio de levadura (Fleer y otros, Gene, 107:285-195 (1991); y van den Berg y otros, BiolTechnology, 8:135-139 (1990)). La proteína de fusión FLAG:flt3-L se purificó de un caldo de levadura mediante cromatografía por afinidad como se ha descrito previamente (Hopp y otros, Biotechnology, 6:1204-1210, 1988).
Ejemplo 4 Anticuerpos monoclonales frente a flt3-L
Este ejemplo ilustra un método para preparar anticuerpos monoclonales frente a flt3-L. Se expresa flt3-L en células huésped mamíferas tales como COS-7 o CV-1/EBNA-1 y se purifica usando cromatografía de afinidad de flt3:Fc. Para general anticuerpos monoclonales frente a flt3-L se puede usar flt3-L, un fragmento de él tal como el dominio extracelular, péptidos sintéticos o células que expresan flt3-L, usando técnicas convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la patente U.S. nº. 4.411.993. En resumen, se inmunizan ratones con flt3-L como inmunógeno emulsionado en coadyuvante de Freund completo y se les inyecta subcutánea o intraperiotonealmente cantidades de 10-100 \mug. De diez a doce días después, a los animales se les da una inmunización de recuerdo con más flt3-L emulsionado en coadyuvante de Freund incompleto. Los ratones se vuelven a inmunizar periódicamente después según un programa de inmunización semanal a bisemanal. Periódicamente se toman muestras de suero por sangrado retroorbital o excisión en la punta de la cola para determinar anticuerpos por ensayo de transferencia, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a una enzima) o inhibición de la unión de flt3.
Después de la detección de un título de anticuerpo apropiado, a los animales positivos se administra una última inyección intravenosa de flt3-L en solución salina. De tres a cuatro días después se sacrifican los animales y se cosechan células de bazo, y las células de bazo se fusionan a una línea de células de mieloma de murino, por ejemplo, NSI o, preferiblemente, P3x63Ag(.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se cultivan en placas múltiples de microtítulo en medio selectivo de HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma se exploran por ELISA en cuanto a la reactividad frente a flt3-L purificado por adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall y otros, Immunochem. 8:871, 1971 y en la patente U.S. nº. 4.703.004. Una técnica de exploración preferida es la técnica de captura de anticuerpo descrita por Beckman y otros (J. Immunol., 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivo se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones BAB/c singeneicos para producir ascites que contienen concentraciones altas de anticuerpos monoclonales anti flet3-L. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden hacer crecer en matraces o botellas rodillo por varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascites de ratón se pueden purificar por precipitación con sulfato amónico y seguidamente cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también se puede usar cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, como también por cromatografía de afinidad basada en la unión a flt3-L.
Ejemplo comparativo 3
Uso de flt3-L solo o en combinación con IL-7 o IL-3
Este ejemplo demuestra la estimulación y proliferación de células de hígado fetal AAA4.1^{+} por composiciones que contienen flt3-L e IL-7; así como la estimulación y proliferación de células c-kit positivo (c-kit^{+}) por composiciones que contienen flt3-L e IL-3.
Se aislaron células que expresan AA4.1 positivo (AA4.1^{+}) de los hígados de ratones C57BL/6 el día 14 por cromatografía de afinidad en placas Petri de plástico Optilux, de 100 mm (Falcon nº. 1001, Oxnard, CA). Las placas se cultivaron durante la noche a 4ºC en PBS más 0,1% de suero fetal bovino (FBS) que contenía 10 \mug/ml de anticuerpo de AA4.1 (McKearn y otros, J. Immunol. 132:332-339, 1984) y luego se lavaron extensamente con PBS más 1% de FBS antes de usarlas. Se añadió una suspensión de células solas de células de hígado a 10^{7} células/placa en PBS más 1% de FBS y se dejó que se adhirieran a las placas durante dos horas a 4ºC. Luego se lavaron extensamente las placas y las células adheridas se cosecharon raspando para posterior análisis o para usarlas en ensayos de hematopoiesis que se describen más adelante. El análisis de FACS usando anticuerpo de AA4.1 reveló una población mayor que 95% de células AA4.1^{+}.
Se purificaron células madre pluripotentes C-kit^{+} de médula ósea de ratón adulto (de Vries y otros, J. Exp. Med., 176:1503-1509, 1992; y Visser y de Vries, Methods in Cell Biol., 1993, presentado). Células de baja densidad (\leq 1,078 g/cm^{3}) positivas para la aglutinina de germen de trigo de lectina y negativas para los antígenos reconocidos por los anticuerpos monoclonales B220 y 15-1.4.1 (Visser y otros, Meth in Cell Biol. 33:451-468, 1990) se pudieron dividir en dos subpoblaciones de células que expresan y no expresan c-kit usando el factor de Steel biotinilado. Se ha demostrado que la fracción de c-kit^{+} contiene células madre hematopoiéticas pluripotentes (de Vries y otros, Science 255:989-991, 1992; Visser y de Vries, Methods in Cell Biol., 1993, presentado y Ware y otros, 1993, presentado).
Se cultivaron células AA4.1^{+} fetales de hígado en IL-7 recombinante (patente U.S. nº. 4.965.195) a 100 ng/ml y flt3-L recombinante a 250 ng/ml. En los experimentos se usó flt3-L en tres formas diferentes: (1) estando presente sobre células CV1/EBNA fijadas, transfectadas con flt3-L; (2) como material sobrenadante de cultivo concentrado de las mismas células CV1/EBNA transfectadas con flt3-L; y (3) como una preparación de polipéptidos purificados y aislados a partir del material sobrenadante de levadura como se describe en el Ejemplo 5.
Ensayos de hematopoiesis
La proliferación de células madre c-kit^{+}, células fetales AA4.1^{+} de hígado se ensayó en ensayos de incorporación de [3H]-timidina esencialmente como describen de Vries y otros, J. Exp. Med., 173:1205-1211, 1991. Células madre c-kit^{+} purificadas se cultivaron a 37ºC en una atmósfera totalmente humidificada de 6,5% de CO_{2} y 7% de O_{2} en aire durante 96 horas. Se usó IL-3 recombinante de murino a una concentración final de 100 ng/ml. Seguidamente, las células se pulsaron con 2 \muCi por pocillo de [^{3}H]-timidina (81 Ci/mmol; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) y se incubaron durante 24 horas más. Se incubaron células AA4.1^{+} (aproximadamente 20.000 células/pocillo) en IL-7, flt3-L y flt3-L + IL-7 durante 48 horas y seguidamente se pulsó con [^{3}H]-timidina durante 6 horas. Los resultados de flt3-L e IL-7 se presentan en la Tabla I, y los resultados de flt3-L e IL-3 se presentan en la Tabla II.
TABLA I Efecto de flt3-L e IL-7 sobre la proliferación de células fetales de hígado AA4.1^{+}
Factor
Control flt3-L IL-7 Flt3-L+IL-7
Incorporación de [^{3}H]-timidina (CPM) 100 1000 100 4200
La combinación de flt3-L e IL-7 produjo una respuesta que era aproximadamente cuatro veces mayor que la de flt3-L solo y aproximadamente 40 veces mayor que la de IL-7 solo.
TABLA II Efecto de flt3-L e IL-3 sobre la proliferación de células C-kit^{+}
Factor
Control flt3-L IL-7 Flt3-L+IL-7
Incorporación de [^{3}H]-timidina (CPM) 100 1800 3000 9100
El material sobrenadante del cultivo de células CV1/EBNA transfectadas con cDNA de flt3-L estimuló la proliferación de células madre c-kit^{+} aproximadamente 18 veces más que el material sobrenadante de células CV1/EBNA transfectadas con el vector de expresión solo. La adición de IL-3 al material sobrenadante que contenía flt3-L produjo un efecto sinérgico, con aproximadamente un grado de proliferación observado de aproximadamente dos veces el que sería de esperar si los efectos fueran aditivos.
Ejemplo 5 Construcción de la proteína de fusión flt3-L:Fc
Este ejemplo describe un método para construir una proteína de fusión que comprende una región extracelular del flt3-L y el dominio Fc de una inmunoglobulina humana. Los métodos son, esencialmente, los mismos descritos en el Ejemplo 1 para la construcción de la proteína de fusión flt3:FC.
Antes de fundir un cDNA de flt3-L al término N de cDNA que codifica la porción de Fc de una molécula de IgG1 humana, se insertó el fragmento de cDNA de flt3-L en el sitio Asp718-NotI de pCAV/NOT, descrito en la solicitud de PCT WO 90/05183. Se clona DNA que codifica un polipétido de cadena simple que comprende la región de Fc de un anticuerpo de IgG1 humana en el sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT SK®, que es asequible comercialmente de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Este vector plasmídico es replicable en E. coli y contiene un segmento policonector que incluye 21 sitios de restricción singulares. Se introduce luego un sitio singular Bg/II cerca del extremo 5' de la secuencia codificadora de Fc insertada, de manera que el sitio Bg/II abarca los codones para los aminoácidos 3 y 4 del polipéptido de Fc.
El polipéptido de Fc codificado se extiende desde la región de articulación N-terminal al término C nativo, esto es, es una región de Fc de anticuerpo de longitud esencialmente completa. También pueden emplearse fragmentos de las regiones de Fc, por ejemplo, los que están truncados en el extremo C-terminal. Preferiblemente, los fragmentos contienen múltiples restos de cisteína (al menos los restos de cisteína en la reacción de articulación) para permitir que se formen enlaces disulfuro entre las porciones de polipéptido de Fc de dos proteínas de fusión flt3:fc separadas, formando dímeros.
Un cDNA parcial Asp718-StuI de flt3-L en pCAV/NOR se puede clonar en un sitio Asp718-SpeI del vector pBLUESCRIPT SK® que contiene el cDNA de Fc, de manera que el cDNA de flt3-L esté situado corriente arriba del cDNA de Fc. La secuencia de DNA de cadena sencilla derivada de la fusión de gen resultante puede alterarse por mutagénesis dirigida por plantilla, descrita por Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488, 1985) y Kunkel y otros (Methods in Enzymol., 154:367, 1987) con el fin de fusionar perfectamente el dominio extracelular entero de flt3-L a la secuencia de Fc. El DNA resultante se puede secuenciar luego para confirmar que se han eliminado los nucleótidos apropiados (esto es, que se han suprimido la región transmembrana y el DNA de dominio citoplasmático parcial) y que las secuencias de flt3-L y Fc están en el mismo marco de lectura. Se separa el cDNA de fusión y se inserta luego usando métodos convencionales en el vector de expresión mamífero pCAV/NOT que se corta con Asp 718-NotI.
Las proteínas de fusión flt3-L:Fc se sintetizan, preferiblemente, en cultivos de células mamíferas recombinantes. El vector de expresión que contiene la proteína de fusión flt3-L:Fc se transfecta luego en células CV-1 (ATCC CCL 70) o células COS-7 (ATVV CRL 1651). También es factible la expresión en células 293 (células embrionarias primarias de riñón humano transformadas, ATCC CRL 1573).
Las células 293 transfectadas con el vector pCAV/NOT/flt3-L:Fc se cultivan en botellas rodillo para la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se secreta en el medio de cultivo mediante el péptido señal de flt3-L. La proteína de fusión se puede purificar en columnas Sepharose de proteína A.
Ejemplo comparativo 4
Generación de ratones transgénicos que hiperexpresan flt3-L
Este ejemplo describe un procedimiento usado para generar ratones transgénicos que hiperexpresan flt3-L. Se estudiaron ratones transgénicos que hiperexpresan flt3-L para determinar los efectos biológicos de la hiperexpresión. Se microinyectaron con DNA de flt3-L pronúcleos de ratón (B16/J) de acuerdo con el método de Gordon y otros, Science, 214:1244-1246, (1981). Generalmente, se pusieron primeramente en una cámara de inyección huevos de ratón fertilizados y se mantuvieron en su sitio con una pequeña pipeta. Se usó luego una pipeta de inyección para inyectar el flt3-L (clon nº. 6C) que codifica el gen en los pronúcleos del huevo. Luego, los huevos que habían sido inyectados, (i) se pasaron al oviducto de una hembra pseudopreñada el día 0,5 p.c., o (ii) se cultivaron in vitro a la fase de dos células (durante la noche) y se pasaron al oviducto de una hembra pseudopreñada el día 0,5 p.c,, o (iii) se cultivaron in vitro a la fase de blastocitos y se pasaron al útero de una hembra pseudopreñada el día 2,5 p.c. Preferiblemente, se puede usar una de las dos primeras opciones, puesto que evita un cultivo in vitro extendido y, preferiblemente, se deben pasar aproximadamente 20-30 huevos microinyectados para evitar camadas pequeñas.
Ejemplo comparativo 5
El flt3-L estimula la proliferación de células eritroides en el bazo
Este ejemplo describe el efecto de flt3-L sobre la producción de células eritroides en el bazo de ratones transgénicos. Loa ratones transgénicos se obtuvieron de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo Comparativo 4. Se sacrificaron los ratones y con cada bazo intacto se preparó una sola suspensión. Las células en suspensión se separaron por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 10 ml de un medio que contenía PBS + 1% de suero fetal bovino. Se hicieron recuentos de células con un hemocitómetro Para el recuento, cada muestra de células se tiñó con Tryptan Blue, obteniéndose un recuento total de células viables por milímetro de medio de acuerdo con la fórmula siguiente: (RBC + WBC)/ml, siendo RBC el número de glóbulos rojos y WBC el número de leucocitos. Se hizo luego el recuento de cada muestra tiñendo con tintura de Turk para obtener el número total de leucocitos por milímetro de medio. Se calculó el número total de glóbulos rojos por milímetro sustrayendo el número total de leucocitos por milímetro del número total de células viables por milímetro. Los resultados se recogen en la siguiente Tabla III.
TABLA III Proliferación de células eritroides en bazo de ratones transgénicos que hiperexpresan flt3-L
Ratón Total de células viables Total de leucocitos Total de glóbulos rojos
Millones de células/ml Millones de células/ml Millones de células/ml
Control I 29,7 27 2,7
Control 2 31 24,6 6,4
Transgénico 1 44,7 25,6 19,1
Transgénico 2 37,3 28,4 8,9
Según los datos de la Tabla 3, los recuentos de leucocitos por milímetro eran aproximadamente los mismos que para los ratones de control. Sin embargo, los recuentos de glóbulos rojos de los bazos de los dos ratones transgénicos eran aproximadamente de dos a tres veces mayores que los observados en los ratones de control. El flt3-L estimula un aumento de células del linaje de eritroides, posiblemente mediante estimulación de las células eritroides de progenitor, mediante la estimulación de células que producen eritropoietina o por bloqueo de un mecanismo que inhibe la eritropoiesis.
Ejemplo comparativo 6
El flt3-L estimula la proliferación de células T y células B precoces
Se exploró médula ósea de ratones transgénicos de 9 semanas de edad, generados de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 4, en cuanto a la presencia de varios marcadores de fenotipos de células T y B usando anticuerpos que son inmunorreactivos con tales marcadores. Se investigaron los marcadores siguientes: el marcador B220, que es específico para el linaje de células B; el marcador de superficie de IgM (sIgM), que es específico para células B maduras; el marcador S7 (CD43), que es un marcador de células B precoces; el marcador antígeno 1 de células madre (SCA-1), que es un marcador de células T y células B activadas; CD4, que es un marcador de células T cooperadoras y algunas células madre, y el marcador Mac-1, que es específico a macrófagos, explorándose anticuerpos bien conocidos frente a tales marcadores. La Tabla IV presenta los datos obtenidos para la exploración de médula ósea. Se analizaron dos ratones transgénicos de la misma camada frente a un ratón normal de la misma camada (control) y un ratón normal no relacionado (control).
TABLA IV Efecto de la hiperexpresión de flt3-L en ratones transgénicos
1
Los datos anteriores indican que la hiperexpresión de flt3-L en ratones conduce a un aumento de células B, como lo indica el aumento de células B220^{+} y células SCA-1^{+}. El análisis de las células B220^{+} por FACS indicó un aumento de células ProB (HSA^{-}, S7^{+}). El aumento de células CD4^{+} indicó un aumento de aproximadamente dos veces de células T y células madre. La disminución de células que tenían el marcador sIgM indicó que el flt3-L no estimula la proliferación de células B maduras. Estos datos indican que el flt3-L aumenta las células con una célula madre, célula T o un fenotipo precoz de célula B y no estimula la proliferación de células B maduras o macrófagos.
Ejemplo comparativo 7
Análisis del timo de ratones que hiperexpresan flt3-L
Este ejemplo describe el análisis del timo de ratones transgénicos generados por el procedimiento del Ejemplo Comparativo 4. Se sacrificaron 6 ratones adultos, cada uno de aproximadamente 3 meses de edad. Se extrajo el timo de cada ratón y se hizo una sola suspensión de células.
El análisis por FACS demostró que no se produjo un cambio total del número de células y que los ratones no presentaban cambios en las proporciones de timocitos que maduran usando los marcadores: CD4 frente a CD8; CD3 frente a \alpha\betaTCR (receptor de células B), y CD3 frente a \gamma\deltaTCR (receptor de células T). Sin embargo, se produjo un cambio en las proporciones de ciertos tipos de células dentro del compartimiento de CD4^{-} y CD8^{-} (esto es, las células más tempranas con respecto al desarrollo; que representan aproximadamente de 2% a 3% del total de células del timo). Específicamente, las células CD4^{-} y CD8^{-} del timo se desarrollan en tres fases. La fase I representa células que tienen los marcadores Pgp-I^{++}, HSA^{+} y el receptor negativo de IL-2 ("IL-2R^{-}"). Después de la fase 1, se desarrollan a la fase 2 células tímicas que constan de los marcadores Pgp-1^{+}, HSA^{++} e IL-2R^{++} y, luego, a la etapa 3, caracterizada por células que tienen marcadores Pgp-I^{+/-}, HSA^{++} e IL-2R^{-}. Las células tímicas en la fase 2 de los ratones transgénicos se redujeron en aproximadamente 50%, mientras que la población de células en la fase 3 aumentó proporcionalmente. Estos datos sugieren que el flt3-L conduce las células tímicas de la fase 2 a la fase 3 de desarrollo, lo que indica que el flt3-L es activo sobre células T precoces.
Ejemplo 6 Uso de flt3-L en trasplantes de células madre periféricas
Este ejemplo describe un método para usar flt3-L autólogo en el trasplante de células madre periféricas autólogas (PSC) o células de progenitor de sangre periférica (PBPC). Típicamente, el trasplante de PBPC y PSC se realiza en pacientes cuya médula ósea es inadecuada para ser usada debido, por ejemplo, a anormalidad de la médula o un desarrollo maligno.
Antes de tomar las células, puede ser deseable movilizar o aumentar el número de PBPC y PSC circulantes. La movilización puede mejorar la recogida de PBPC y PSC y se puede hacer por inyección de flr3-L a pacientes antes de la recogida de tales células. Se pueden administrar análogamente, en combinación secuencial o concurrente con flt3-L, otros factores de crecimiento tales como CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, proteínas de fusión GM-CSF/IL-3, LIF, FGF y combinaciones de ellos. Las PBPC y PSC movilizadas o no movilizadas se recogen usando procedimientos de aféresis conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bishop y otros, Blood, vol. 83, nº. 2, págs. 610-616 (1994). En resumen, se recogen PBPC y PSC usando dispositivos convencionales, por ejemplo, un dispositivo de aféresis Haemonetics Model V50 (Haemonetics, Braintree, MA). Típicamente se hacen recogidas de 4 horas no más de 5 veces a la semana hasta recoger aproximadamente 6,5 x 10^{8} células mononucleares (MNC)/kg del paciente. Con partes alícuotas de las PBPC y PBS recogidas se determina el contenido de unidades que forman colonias de granulocitos-macrófagos (CFU-GM) diluyendo aproximadamente en 1:6 con solución de Hank equilibrada sin calcio o magnesio (HBSS) y dejando en capas sobre un medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, Durham, Carolina del Norte). Después de centrifugar, se recogen las MNC en la interfaz, se lavan y se vuelven a poner en suspensión en HBSS. Se cultivan a 37ºC durante 14 días, en aire con 5% de CO_{2}, totalmente humidificado, partes alícuotas de 1 ml que contienen aproximadamente 300.000 MNC, medio 5A de McCoy modificado, 0,3% de agar, 200 U/ml de GM-CSF recombinate humano, 200 u/ml de IL-3 recombinante humano y 200 u/ml de C-CSF recombinante humano. Opcionalmente, a los cultivos se puede añadir flt3-L o moléculas de fusión de GM-CSF/IL-3 (PIXY 321). Estos cultivos se tiñen con tintura de Wright y se evalúan las colonias de CFU-GM usando un microscopio de disección (Ward y otros, Exp- Hematol., 16:358 (1988). Alternativamente, se pueden evaluar las colonias de CFU-GM usando el método de citometría de flujo de CD34/CD33 de Siena y otros, Blood, vol. 77, nº. 2, págs. 400-409 (1991) o cualquier otros método conocido en la técnica.
Los cultivos que contiene CFU-GM se congelan en un congelador de velocidad controlada (por ejemplo, Cryo-Med, Mt, Clemens, MI) y luego se almacenan en la fase vapor de nitrógeno líquido. Como citoprotector se usa 10 por ciento de dimetilsulfóxido. Después de haber hecho las tomas de células del paciente, se descongelan los cultivos que contienen CFU-GM y se combinan. La colección de células descongeladas se reinfunde intravenosamente al paciente o se expande ex vivo antes de reinfundirla. La expansión ex vivo de células combinadas se puede realizar usando flt3-L solo como factor de crecimiento, o combinado, secuencial o concurrentemente, con otras citoquinas mencionadas antes. Los métodos para expandir ex vivo son bien conocidos en la técnica. Las células, expandidas o no expandidas, se reinfunden intravenosamente al paciente. Para facilitar el injerto de las células trasplantadas, se administra flt3-L simultáneamente a la reinfusión o seguidamente. Esta administración de slt3-L se hace sola o en combinación secuencial o concurrente con otras citoquinas seleccionadas entre las mencionadas antes.
Ejemplo 7 Purificación de células madre o de progenitor hematopoiéticas usando flt3-L
Este ejemplo describe un método para purificar células hematopoiéticas de progenitor o células madre de una suspensión que contiene una mezcla de células. Se recogen células de médula ósea y de sangre periférica usando procedimientos convencionales. Las células se ponen en suspensión en un medio estándar y luego se centrifuga para eliminar los glóbulos rojos y los neutrófilos. Se separan las células situadas en la interfaz entre las dos fases (conocidas también en la técnica como piel de revestimiento) y se ponen nuevamente en suspensión. Estas células predominantemente son mononucleares y representan una porción sustancial de las células precoces hematopoiéticas de progenitos y células madre. La suspensión de células resultante se incuba luego con flt3-L biotinilado durante un tiempo suficiente para que haya una interacción sustancial de flt3:flt3-L: Típicamente, son suficientes tiempos de incubación de una hora como mínimo. Después de la incubación, la suspensión se hace pasar por gravedad a través de una columna con relleno de perlas revestidas con avidina. Tales columnas son bien conocidas en la técnica; véase Berenson y otros, J. Cell Biochem., 10D:239 (1986). La columna se lava con solución de PBS para eliminar el material no unido. De las perlas y de flt3-L se pueden liberar células diana usando métodos convencionales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Nombre: Immunex Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Calle: 51 University Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Ciudad: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Estado: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
País: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
Código postal (ZIP)l: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Título de la invención: Ligandos para receptores flt3/flk-2
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Número de secuencias: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
Forma legible del ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Tipo del medio: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Ordenador: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Soporte lógico: PatentIn Release nº 1.0. Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
Datos de la presente solicitud:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Número de la solicitud: pendiente de asignación
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Fecha de presentación: 24 de mayo de 1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
Datos de una solicitud anterior
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Número de la solicitud: pendiente de asignación
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Fecha de presentación: 11 de mayo de 1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
Datos de una solicitud anterior
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Número de la solicitud: 08/209.502
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Fecha de presentación: 7 de marzo de 1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
Datos de una solicitud anterior
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Número de la solicitud: 08/162.407
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Fecha de presentación: 3 de diciembre de 1993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
Datos de una solicitud anterior
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Número de la solicitud: 08/111.758
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Fecha de presentación: 25 de agosto de 1993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
Datos de una solicitud anterior
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Número de la solicitud: 08/106.463
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Fecha de presentación: 12 de agosto de 1993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
Datos de una solicitud anterior
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Número de la solicitud: 08/068.394
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Fecha de presentación: 24 de mayo de 1993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 879 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Carácter de la cadena: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
Anti sentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
Rasgos:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Nombre/clave: miscelánea de rasgos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Situación: 1..25
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
Rasgos:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Nombre/clave: miscelánea de rasgos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Situación: 855..879
\vskip0.800000\baselineskip
ix)
Rasgos:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Nombre/clave: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Situación: 57..752
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGACTGGA ACGAGACGAC CTGCTCTGTC ACAGGCATGA GGGGTCCCCG GCAGAG 
\hfill
56
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 231 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 24 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Carácter de la cadena: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Hipotética: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Carácter de la cadena: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Hipotética: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCAGGTCGT CTCGTTCCAG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 988 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Carácter de la cadena: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Molécula tipo: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Hipotética: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
Rasgos:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Nombre/clave: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Situación: 30..734
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 5:
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 235 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 71 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Carácter de la cadena: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Hipotética: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTGGTACC TTTGGATAAA AGAGACTACA AGGACGACGA TGACAAGACA CCTGACTGTT 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTTCAGCCA C 
\hfill
71 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 37 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Carácter de la cadena: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Molécula tipo: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATATGGATCC CTACTGCCTG GGCCGAGGCT CTGGGAG 
\hfill
37

Claims (23)

1. Un polipéptido ligando de flt3 (flt3-L) humano aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de los restos 28-182 de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia variante de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con esta secuencia, en el que el ligando de flt3 une flt3.
2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los aminoácidos 1-235 de la SEQ ID NO: 6.
3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que es un flt3-L soluble.
4. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende los aminoácidos 28-182 de la SEQ ID NO: 6.
5. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende los aminoácidos 28-160 de la SEQ ID NO: 6.
6. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, que está codificado por el inserto de cDNA del vector pBLUESCRIPT SK (-) que tiene el número de acceso ATCC 69382.
7. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, polipéptido de flt3-L que está conjugado a otra proteína o polipéptido.
8. Una secuencia de DNA aislada que codifica un polipéptido de flt3-L según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un DNA de acuerdo con la reivindicación 8, seleccionado entre el grupo constituido por:
(a) cDNA derivado de la región codificadora de un gen de flt3-L;
(b) secuencias de cDNA de SEQ ID NO: 5;
(c) secuencias de DNA que hibridan en condiciones moderadamente estrictas con el cDNA de (a) o (b), secuencias de DNA que codifican flt3-L;
(d) secuencias de DNA que, debido a la degeneración del código genético, codifican polipéptidos de flt3-L que tienen la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por la secuencias de DNA de (a), (b) o (c).
10. Un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9.
11. Una célula huésped transfectada o transformada con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un procedimiento para producir un polipéptido de flt3-L, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 en condiciones para promover la expresión, y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.
13. Un anticuerpo que es inmunorreactivo con el péptido de flt3-L según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
14. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13 que es un anticuerpo monoclonal.
15. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de flt3-L de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
16. Un polipéptido de flt3-L según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en medicina.
17. El uso de un polipéptido de flt3-L según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la manufactura de un medicamento para tratar trastornos hematopoiéticos tales como anemia aplásica y síndrome mielodisplásico, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, cáncer o cánceres tratados con terapia citorreductora y trasplantes autólogos o alogénicos de células hematopoiéticas de progenitor o células madre.
18. El uso según la reivindicación 17, en el que el medicamento comprende o se usa en combinación con una citoquina seleccionada entre el grupo constituido por CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, proteínas de fusión de GM-CSF/IL-3 LIF y FGF, y combinaciones secuenciales o concurrentes de ellas.
19. Un kit de partes que comprende un polipéptido de flt3-L según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un factor de crecimiento seleccionado entre CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, proteínas de fusión de GM-CSF/IL-3 LIF y FGF, y combinaciones secuenciales o concurrentes de ellos, como preparación combinada para uso simultáneo, secuencial o separado en el tratamiento de trastornos hematopoiéticos tales como anemia aplásica y síndrome mielodisplásico, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, cáncer o cánceres tratados con terapia citorreductora y trasplantes autólogos o alogénicos de células hematopoiéticas de progenitor o células madre.
20. Un medio de expansión de células hematopoiéticas que comprende un medio de crecimiento y una cantidad efectiva de polipéptido de flt3-L de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
21. Un método para transfectar un gen exógeno en una células hematopoiética precoz, que comprende las etapas de:
(a) cultivar las células hematopoiéticas precoces en un medio que comprende una cantidad efectiva de polipéptido de flet3-L según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
(b) transfectar las células cultivadas de la etapa (a) con el gen.
22. Un mamífero transgénico no humano del que la totalidad de sus células germinales y somáticas contienen una secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, o un mamífero transgénico no humano en el que la mencionada secuencia de DNA ha sido introducida en el mencionado mamífero, o en un antecesor del mencionado mamífero, en una fase embrionaria.
23. Un método para separar células que tienen el receptor de flt3 sobre su superficie de una mezcla de células en suspensión, que comprende poner en contacto las células de la mezcla con una superficie de contacto que tiene sobre ella un polipéptido de flt3-L de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y separar la superficie de contacto y la suspensión.
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